專利名稱：編碼使大腸桿菌具有l(wèi)－高絲氨酸抗性的蛋白質(zhì)的dna以及用于生產(chǎn)l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)氨基酸的方法，尤其涉及一種使用屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌來生產(chǎn)L-高絲氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸或L-蘇氨酸的方法。
根據(jù)大腸桿菌K-12，本發(fā)明人得到了一種具有thrR突變的突變體(本文稱作rhtA23)，該突變體與基本培養(yǎng)基(Astaurova，O.B.等，《應(yīng)用生物化學(xué)與微生物學(xué)》21，611-616(1985))中高濃度的蘇氨酸(＞40mg/ml)或高絲氨酸(＞5mg/ml)有關(guān)。在rhtA23突變的基礎(chǔ)上，得到了改進(jìn)的蘇氨酸生產(chǎn)菌株(蘇聯(lián)專利974817)、高絲氨酸和谷氨酸的生產(chǎn)菌株(Astaurova等，《應(yīng)用生物化學(xué)與微生物學(xué)》27，556-561(1991))。
而且，本發(fā)明人已經(jīng)揭示出rhtA基因存在于大腸桿菌染色體的18min處，并且rhtA基因與介于pexB和ompX基因之間的ORF1是相同的。已經(jīng)把表達(dá)由ORF1編碼的蛋白質(zhì)的單元命名為rhtA(rht對高絲氨酸和蘇氨酸的抗性)基因。rhtA基因包括包含SD序列、ORF1和一個終止子在內(nèi)的5’-非編碼區(qū)。另外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如果以多拷貝的狀態(tài)進(jìn)行克隆的話，野生型rhtA基因帶有抗蘇氨酸和高絲氨酸抗性，并且rhtA基因表達(dá)的增強(qiáng)提高了屬于埃希氏桿菌屬的具有生產(chǎn)L-賴氨酸、L-纈氨酸或L-蘇氨酸能力的細(xì)菌的氨基酸生產(chǎn)率(第17屆國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)會議暨1997年美國生物化學(xué)與分子生物學(xué)協(xié)會年會文摘，舊金山，加利弗尼亞，1997年8月24-29日，1997，文摘號為457)。
據(jù)發(fā)現(xiàn)在克隆rhtA基因的過程中，在大腸桿菌中存在著至少兩種以多拷貝的狀態(tài)賦予了高絲氨酸抗性的不同的基因。其中的一個基因?yàn)閞htA基因，但另一個基因仍未闡明。
本發(fā)明的一個目的是提供一種參與高絲氨酸抗性的新的基因，以及用于以高產(chǎn)率生產(chǎn)氨基酸，尤其是L-高絲氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-蘇氨酸的方法。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過多拷貝載體進(jìn)行克隆時，位于大腸桿菌染色體86min處的區(qū)域給大腸桿菌的細(xì)胞賦予了L-高絲氨酸抗性，并且當(dāng)擴(kuò)增該區(qū)域時，與rhtA基因相仿，大腸桿菌的氨基酸的生產(chǎn)率得以提高。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，已經(jīng)完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供了(1)一種編碼如下列(A)或(B)中定義的蛋白質(zhì)的DNA(A)包含序列表中SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或者(B)包括在序列表SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的缺失、取代、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且所述的蛋白質(zhì)具有使細(xì)菌具備蛋白質(zhì)L-高絲氨酸抗性之活性，(2)一種根據(jù)(1)的DNA，它是一種如下列(a)或(b)中定義的DNA(a)包含與序列表SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列的編號為第557-1171位核苷酸對應(yīng)的核苷酸序列的DNA；或者(b)在嚴(yán)格條件下與對應(yīng)于序列表SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列的編號為第557-1171位核苷酸的核苷酸序列雜交的DNA，并且所述的DNA編碼具有使所述的細(xì)菌具備蛋白質(zhì)L-高絲氨酸抗性之活性的蛋白質(zhì)，(3)一種屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌的L-高絲氨酸抗性通過在細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增(1)的DNA的拷貝數(shù)得到增強(qiáng)，(4)(3)的細(xì)菌，其中在細(xì)菌細(xì)胞中的多拷貝載體上攜帶了(1)的DNA，(5)(3)的細(xì)菌，其中在細(xì)菌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)座子上攜帶了(1)的DNA，(6)一種用于生產(chǎn)氨基酸的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)氨基酸能力的(3)至(5)之任一的細(xì)菌以便在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累氨基酸，以及從培養(yǎng)基中回收氨基酸的步驟，以及(7)(6)的方法，其中所述的氨基酸為至少一種選自由下列氨基酸組成的組的氨基酸L-高絲氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-蘇氨酸。
本發(fā)明的DNA可以稱作“rhtB基因”，由rhtB基因編碼的蛋白質(zhì)可以稱作“RhtB蛋白質(zhì)”，參與細(xì)菌的L-高絲氨酸抗性的RhtB蛋白質(zhì)的活性(即使得細(xì)菌具有RhtB蛋白質(zhì)L-高絲氨酸抗性的活性)可以稱作“Rh活性”，并且在rhtB基因中編碼RhtB蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因稱作“rhtB結(jié)構(gòu)基因”。術(shù)語“增強(qiáng)了Rh活性”指的是給細(xì)菌賦予了高絲氨酸抗性，或者是通過增加RhtB蛋白質(zhì)的分子的數(shù)量、增加RhtB蛋白質(zhì)的比活或者針對RhtB蛋白質(zhì)等的表達(dá)或活性等降低的負(fù)調(diào)節(jié)的靈敏性來增強(qiáng)所述的抗性。術(shù)語“編碼蛋白質(zhì)的DNA”指的是當(dāng)所述的DNA為雙鏈時，其中的一條鏈編碼所述蛋白質(zhì)的DNA。L-高絲氨酸抗性指的是細(xì)菌在含有一定濃度的L-高絲氨酸的基本培養(yǎng)基上生長的性質(zhì)，其中在所述濃度下其野生型菌株無法生長(通常為10mg/ml)。生產(chǎn)氨基酸的能力指的是與其野生型菌株相比，細(xì)菌在培養(yǎng)基中更大量地生產(chǎn)和積累氨基酸的性質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，可以使屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌具有對高濃度高絲氨酸的抗性。屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌具有提高的高絲氨酸抗性以及在培養(yǎng)基中高產(chǎn)率地產(chǎn)生并積累氨基酸的能力，其中尤其是L-高絲氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸或L-蘇氨酸。
下面將詳細(xì)地解釋本發(fā)明。<1>本發(fā)明的DNA本發(fā)明的DNA編碼具有Rh活性并且具有序列表SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。更具體地講，可以舉出本發(fā)明DNA的實(shí)例為包含序列表中SEQ ID NO1中所示核苷酸序列的編號為第557-1171位核苷酸的核苷酸序列的DNA。
本發(fā)明的DNA包括編碼使大腸桿菌具有高絲氨酸抗性的RhtB蛋白質(zhì)的DNA片段，它包括rhtB基因的調(diào)節(jié)元件和rhtB基因的結(jié)構(gòu)部分、具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO1所示的核苷酸序列對應(yīng)于與GenBank登記號為M87049的序列互補(bǔ)的序列的一部分。SEQ ID NO1包括f138(GenBank登記號為M87049的編號為第61959-61543的核苷酸)及其5’-側(cè)翼區(qū)和3’-側(cè)翼區(qū)，所述的f138為存在于大腸桿菌染色體86min處是已知的、但功能卻未知ORF(開放讀框)。在5’-側(cè)翼區(qū)僅有160個核苷酸的f138不能賦予高絲氨酸抗性。在M87049的62160和61959之間(ORF f138的上游)不存在終止密碼子。因此，編碼區(qū)要長于201bp。因而，RhtB蛋白質(zhì)以及編碼所述蛋白質(zhì)的rhtB基因是新的。
例如通過根據(jù)其中使用了mini-Mu d5005噬菌粒的方法(Groisman，E.A.等，《細(xì)菌學(xué)雜志》168，357-364(1986))采用諸如K12或W3110這樣的大腸桿菌溶原菌株的溶胞產(chǎn)物感染大腸桿菌的Mucts溶原菌株、并從在含有卡那霉素(40μg/ml)和L-高絲氨酸(10mg/ml)的基本培養(yǎng)基上生長的菌落中分離出質(zhì)粒DNA，可以得到rhtB基因。正如下面所述的實(shí)施例中說明的那樣，將rhtB基因定位于大腸桿菌染色體的86min處。因此，通過菌落雜交或者PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，參考White，T.J.等，《遺傳學(xué)趨勢》5，185(1989))便可以從大腸桿菌的染色體中得到包括rhtB基因在內(nèi)的DNA片段，其中的PCR使用了具有與靠近大腸桿菌染色體86min處部分的區(qū)域?qū)?yīng)的序列的寡核苷酸。另一方面，可以根據(jù)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列設(shè)計寡核苷酸。通過使用具有與SEQID NO1中編號為第557位核苷酸的上游區(qū)以及編號為第1171位核苷酸的下游區(qū)對應(yīng)的核苷酸序列的寡核苷酸作為PCR的引物，便可以擴(kuò)增整個的編碼區(qū)。
通過使用市售的DNA合成儀(例如由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的380B型DNA合成儀)、通過諸如phosphoamidite方法(參見《四面體通訊》22，1859(1981))這樣的普通的方法可以進(jìn)行寡核苷酸的合成。此外，通過使用市售的PCR設(shè)備(例如，由Takara Shuzo有限公司生產(chǎn)的PJ2000型DNA熱循環(huán)儀)、使用Taq DNA聚合酶(由Takara Shuzo有限公司提供)并且根據(jù)由提供商指明的方法可以進(jìn)行PCR。
編碼本發(fā)明RhtB蛋白質(zhì)的DNA可以編碼包括在一個或多個位置上的一個或幾個氨基酸的缺失、取代、插入或者添加在內(nèi)的RhtB蛋白質(zhì)，條件是并不破壞由其編碼的RhtB蛋白質(zhì)的Rh活性。例如通過修飾所述的核苷酸序列可以得到編碼與上述RhtB蛋白質(zhì)基本相同的蛋白質(zhì)的DNA，例如通過定向誘變方法從而使得在具體位點(diǎn)上的一個或多個氨基酸的殘基涉及到缺失、取代、插入或者添加。通過常規(guī)公知的突變處理可以獲得如上所述進(jìn)行了修飾的DNA。突變處理包括一種用于在體外處理編碼所述RhtB蛋白質(zhì)的DNA的方法(例如用羥胺)，以及一種用紫外線照射或者諸如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸這樣的通常用于突變處理的突變劑來處理微生物(例如屬于埃希氏桿菌屬且具有編碼RhtB蛋白質(zhì)的DNA的細(xì)菌)的方法。
通過在合適的細(xì)胞中以多拷貝表達(dá)經(jīng)歷了如上所述的體外誘變處理的DNA、研究其高絲氨酸抗性并選擇出增加了所述抗性的DNA，便可以獲得編碼與RhtB蛋白質(zhì)基本相同的蛋白質(zhì)的DNA。而且，眾所周知的是蛋白質(zhì)的氨基酸序列和編碼它的核苷酸序列可以在菌種、菌株、突變株或者變株之間略有不同，因此編碼基本上相同蛋白質(zhì)的DNA可以從屬于埃希氏桿菌屬的L-高絲氨酸抗性菌種、菌株、突變株和變株中得到。更具體地講，通過從經(jīng)歷了突變處理的屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌或者從屬于埃希氏桿菌屬細(xì)菌的自發(fā)突變株或變株中分離出在嚴(yán)格條件下與例如具有序列表SEQ ID NO1中所示核苷酸序列編號為第557-1171位核苷酸的核苷酸序列的DNA雜交并且編碼具有Rh活性的蛋白質(zhì)的DNA，便可以得到編碼與RhtB蛋白質(zhì)基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA。在本文中，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指這樣的一種條件，在該條件下形成了所謂的特異性雜交體、而不形成非特異性的雜交體。通過使用任何的數(shù)值來清楚地表達(dá)這一條件是困難的。但是，嚴(yán)格條件例如包括這樣的一種條件，在該條件下具有高度同源性的DNA(例如具有不低于70％的同源性的DNA)彼此雜交、而具有低于上述同源性的DNA彼此不雜交。<2>本發(fā)明屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌本發(fā)明屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌為增強(qiáng)了Rh活性的屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌。舉例來說，屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌為大腸桿菌。例如通過在細(xì)胞中擴(kuò)增rhtB結(jié)構(gòu)基因的拷貝數(shù)或者用重組DNA轉(zhuǎn)化屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌可以增強(qiáng)Rh活性，其中在重組的DNA中將包括編碼RhtB蛋白質(zhì)的rhtB結(jié)構(gòu)基因在內(nèi)的DNA片段與在屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌中高效發(fā)揮作用的啟動子序列相連。也可以通過用在屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌中高效發(fā)揮作用的啟動子序列代替染色體上rhtB基因的啟動子序列來增強(qiáng)Rh活性。
通過將攜帶有rhtB結(jié)構(gòu)基因的多拷貝載體引入屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞中便可以在細(xì)胞中進(jìn)行rhtB結(jié)構(gòu)基因的多拷貝數(shù)的擴(kuò)增。更具體地講，通過向?qū)儆诎ＯＪ蠗U菌屬的細(xì)菌細(xì)胞中引入攜帶有rhtB結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒、噬菌體或轉(zhuǎn)座子(Berg，D.E.與Berg，C.M.，《生物/技術(shù)》1，147，(1983))可以增加拷貝數(shù)。
舉例來說，多拷貝載體有諸如pBR322、pMW118、pUC19等的質(zhì)粒載體，以及諸如λ1059、λBF101、M13mp9等的噬菌體載體。舉例來說，轉(zhuǎn)座子為Mu、Tn10、Tn5等等。
例如可以通過D.M.Morrison的方法(《酶學(xué)中的方法》68，326(1979))或者其中用氯化鈣處理受體細(xì)菌細(xì)胞以增加DNA的滲透力的方法(Mandel，M.與Higa，A.，《分子生物學(xué)雜志》53，159(1970))等方法來將DNA引入屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌之中。
如果在如上所述的屬于埃希氏桿菌屬的氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌中增強(qiáng)了Rh活性的話，那么可以提高氨基酸的產(chǎn)量。作為待增強(qiáng)其Rh活性的屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌，使用了具有生產(chǎn)所需氨基酸能力的菌株。此外，可以將生產(chǎn)氨基酸的能力賦予其中增強(qiáng)了Rh活性的細(xì)菌。屬于埃希氏桿菌屬的氨基酸生產(chǎn)細(xì)菌的實(shí)例如下所述。(1)L-蘇氨酸生產(chǎn)菌舉例來說，屬于埃希氏桿菌屬的L-蘇氨酸產(chǎn)生細(xì)菌可以是菌株MG442(Guayatiner等，Genetika(俄語)14，947-956(1978))。(2)L-高絲氨酸生產(chǎn)菌舉例來說，屬于埃希氏桿菌屬的L-高絲氨酸產(chǎn)生細(xì)菌可以是菌株NZ10(thrB)。該菌株來源于作為Leu+回復(fù)體的已知菌株C600(thrB，leuB)(Appleyard R.K.，《遺傳學(xué)》39，440-450(1954))。
在rhtB DNA片段的基礎(chǔ)上得到了通過發(fā)酵用于生產(chǎn)氨基酸的新的氨基酸生產(chǎn)菌株大腸桿菌NZ10/pAL4，pRhtB；大腸桿菌MG422/pVIC40，pRhtB；以及大腸桿菌MG442/pRhtB。
所述的新菌株已于1998年10月6日保藏(根據(jù)基于布達(dá)佩斯條約的國際保藏)在俄羅斯國家工業(yè)微生物保藏所(VKPM)。菌株大腸桿菌NZ10/pAL4，pRhtB已按照保藏號VKPM B-7658進(jìn)行了保藏；菌株大腸桿菌MG442/pRhtB已按保藏號VKPM B-7659進(jìn)行了保藏；且菌株大腸桿菌MG422/pVIC40，pRhtB已按保藏號VKPM B-7660進(jìn)行了保藏。
菌株大腸桿菌NZ10/pAL4，pRhtB(VKPM B-7658)顯示出下列培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。
細(xì)胞形態(tài)學(xué)。具有圓形末端的革蘭氏陰性游動性弱的桿菌?？v向尺寸為1.5-2μm。培養(yǎng)特征牛肉膏瓊脂。在37℃下生長24小時后，生成了直徑為1.5-3mm的圓形發(fā)白的半透明的菌落，特征為光滑的表面、規(guī)則或者略有波浪的邊緣、中央略微鼓起、結(jié)構(gòu)均勻、膏狀稠度、易于乳化。Luria’s瓊脂。在37℃下生長24小時后，發(fā)育成直徑為1.5-2.5mm的發(fā)白的半透明的菌落，它具有光滑的表面、均勻的結(jié)構(gòu)、膏狀的稠度、易于乳化?；经傊?濃液處理的(doped)培養(yǎng)基M9。在37℃下生長40至48小時后，形成直徑為0.5-1.5mm的菌落，其顏色為淺灰白色、半透明、略呈凸形、具有有光澤的表面。在牛肉膏肉湯中的生長。在37℃下生長24小時后，顯示出濃厚的均勻的混濁、具有特有的氣味。生理學(xué)與生物化學(xué)特征在牛肉膏瓊脂中在推進(jìn)(thrust)接種的過程中生長。在整個接種區(qū)域內(nèi)顯示出良好的生長。所述微生物證實(shí)為兼性厭氧菌。它不液化明膠。特點(diǎn)是在牛奶上生長良好，同時伴隨著牛奶的凝聚。不產(chǎn)生吲哚。溫度條件。在20-42℃下在牛肉膏肉湯上生長，最佳溫度位于33-37℃。培養(yǎng)基的pH值。在pH值為6-8的液體培養(yǎng)基上生長，最佳值為7.2。碳源。在葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、木糖、甘油以及甘露糖醇上顯示出生長良好，以便生成酸和氣體。氮源。同化呈銨鹽、硝酸鹽形式的氮以及來自一些有機(jī)化合物的氮?？拱逼S青霉酸、卡那霉素和L-高絲氨酸抗性。使用L-蘇氨酸作為生長因子。質(zhì)粒的內(nèi)含物。所述細(xì)胞含有確保了抗氨芐青霉素的抗性并且攜帶有蘇氨酸操縱子的thrA基因的多拷貝的雜交體質(zhì)粒pAL4，其編碼導(dǎo)致高絲氨酸的生物合成增加的天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶I。此外，所述的細(xì)胞含有確保了抗卡那霉素的抗性并攜帶有賦予了抗高絲氨酸(10mg/l)抗性的rhtB基因的多拷貝的雜交體質(zhì)粒pRhtB。
除了用L-異亮氨酸代替L-蘇氨酸作為生長因子之外，菌株大腸桿菌MG422/pRhtB(VKPM B-7659)與菌株NZ10/pAL4，pRhtB具有相同的培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。但是沒有異亮氨酸，所述菌株可以緩慢地生長。此外，所述菌株的細(xì)胞僅含有確保了抗卡那霉素的抗性并攜帶有賦予了抗高絲氨酸(10mg/l)抗性的rhtB基因的一個拷貝的雜交體質(zhì)粒pRhtB。
除了用L-異亮氨酸代替L-蘇氨酸作為生長因子之外，菌株大腸桿菌MG442/pVIC40，pRhtB(VKPM B-7660)與菌株NZ10/pAL4，pRhtB具有相同的培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。但是沒有異亮氨酸，所述菌株可以緩慢地生長。所述菌株的細(xì)胞含有確保了抗鏈霉素的抗性并攜帶有蘇氨酸操縱子基因的多拷貝的雜交體質(zhì)粒pVIC40。此外，它們含有確保了抗卡那霉素的抗性并攜帶有賦予了抗高絲氨酸(10mg/l)抗性的rhtB基因的多拷貝的雜交體質(zhì)粒pRhtB。<3>用于生產(chǎn)氨基酸的方法通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述通過擴(kuò)增rhtB基因的拷貝數(shù)來增強(qiáng)Rh活性并且具有生產(chǎn)氨基酸能力的細(xì)菌、在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累氨基酸并從培養(yǎng)基中回收氨基酸便可以高效地生產(chǎn)出氨基酸。舉例來說，所述的氨基酸優(yōu)選為L-高絲氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸。L-纈氨酸和L-蘇氨酸。
在本發(fā)明的方法中，可以按照與那些通過使用細(xì)菌發(fā)酵來生產(chǎn)氨基酸的常規(guī)方法類似的方式進(jìn)行屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌的培養(yǎng)以及從液體培養(yǎng)基中收集和純化所述的氨基酸。在培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可以是合成培養(yǎng)基或者天然培養(yǎng)基，只要所述的培養(yǎng)基包括碳源、氮源和無機(jī)物，以及如果需要的話還包括數(shù)量合適的所用細(xì)菌需要用于生長的營養(yǎng)物即可。碳源可以包括各種糖類(諸如葡萄糖和蔗糖)以及各種有機(jī)酸。取決于所用細(xì)菌的同化能力，可以使用包括乙醇和甘油在內(nèi)的醇。作為氮源，使用氨、各種銨鹽(諸如硫酸銨)、其它的氮化合物(諸如胺)、天然氮源(諸如胨、大豆水解質(zhì)以及消化了的發(fā)酵微生物)。作為無機(jī)物，使用磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、碳酸鈣。
培養(yǎng)優(yōu)選是在諸如振蕩培養(yǎng)、通風(fēng)以及攪拌培養(yǎng)這樣的需氧條件下進(jìn)行的。培養(yǎng)的溫度通常為20-40℃，優(yōu)選30-38℃。培養(yǎng)的pH通常在5-9之間，優(yōu)選在6.5-7.2之間?？梢杂冒彼?、碳酸鈣、各種酸、各種堿以及緩沖溶液來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。通常，1-3天的培養(yǎng)導(dǎo)致目標(biāo)氨基酸在培養(yǎng)基中的積累。
通過在培養(yǎng)之后借助離心或膜過濾從培養(yǎng)基中除去諸如細(xì)胞這樣的固體、然后借助離子交換收集和純化目標(biāo)氨基酸、濃縮和結(jié)晶分離方法等，可以進(jìn)行氨基酸的回收。
圖1顯示rhtB基因的克隆、鑒定和失活。
圖2顯示RhtB蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
實(shí)施例下面參照實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。在所述實(shí)施例中，除非另有說明，氨基酸均為L-型的。實(shí)施例1獲得rhtB DNA片段(1)將rhtB基因克隆進(jìn)mini-Mu噬菌粒中使用mini-Mu d5005噬菌粒(Groisman，E.A.等，《細(xì)菌學(xué)雜志》168，357-364(1986))在體內(nèi)克隆野生型rhtB基因。菌株MG442的MuCts62溶原體用作供體。使用新鮮制備的溶胞產(chǎn)物感染菌株VKPMB-513的Mucts溶原性衍生物(Hfr K10 metB)。將細(xì)胞鋪在含有甲硫氨酸(50μg/ml)、卡那霉素(40μg/ml)和高絲氨酸(10mg/ml)的M9葡萄糖基本培養(yǎng)基上。挑選并分離出在48小時后出現(xiàn)的菌落。分離出質(zhì)粒DNA并且通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)將其用于轉(zhuǎn)化菌株VKPM B-513。在如上所述含有卡那霉素的L-肉湯瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。從那些抗高絲氨酸的菌落中分離出質(zhì)粒DNA，并通過對插入片段的結(jié)構(gòu)的限制酶切作圖進(jìn)行分析。似乎已經(jīng)從供體克隆出屬于不同染色體區(qū)域的兩種插入片段。因此，在大腸桿菌中存在著至少兩種呈多拷貝狀態(tài)并賦予了高絲氨酸抗性的不同的基因。兩種插入片段其中之一為已經(jīng)進(jìn)行了報道的rhtA基因(第17屆國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)會議暨1997年美國生物化學(xué)與分子生物學(xué)協(xié)會年會文摘，舊金山，加利弗尼亞，1997年8月24-29日)。在兩種插入片段的另一種當(dāng)中，賦予了高絲氨酸抗性的長度最短的片段為0.8kb(圖1)。(2)鑒定rhtB基因通過Sanger的雙脫氧鏈終止法對插入片段測序。全面地測定兩條DNA鏈的序列，并且重疊所有的接頭。測序表明插入片段包含f138(GenBank登記號為M87049的編號為第61543-61959的核苷酸)及其201bp的上游區(qū)(M87049序列中的下游區(qū))，所述的f138為存在于大腸桿菌染色體86min處是已知的、但功能卻未知ORF(開放讀框)。在5’-側(cè)翼區(qū)中僅有160個核苷酸的f138不能賦予高絲氨酸抗性。在M87049的第62160與61959個核苷酸之間、ORF f138的上游不存在終止密碼子。而且，在所述序列中存在一個緊跟著被預(yù)測為核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列的ATG。較大的ORF(編號為第62160-61546個核苷酸)命名為rhtB基因。由所述基因推導(dǎo)的RhtB蛋白質(zhì)高度疏水并且含有5個可能的跨膜節(jié)段。實(shí)施例2生產(chǎn)高絲氨酸生產(chǎn)菌株通過質(zhì)粒pAL4轉(zhuǎn)化大腸桿菌的NZ10菌株以得到菌株NZ10/pAL4，其中所述質(zhì)粒為pBR322載體并將編碼天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因插入所述載體中。菌株NZ10為從大腸桿菌菌株C600(thrB，leuB)(Appleyard，《遺傳學(xué)》39，440-452(1954))得到的leuB+-回復(fù)突變株(thrB)。
將rhtB基因插入質(zhì)粒pUK21中以得到pRhtB，所述的質(zhì)粒pUK21為一種其中卡那霉素抗性基因代替了氨芐青霉素抗性基因(Vieira，J.與Messing，J.，《基因》100，189-194(1991))的已知的質(zhì)粒pUC19。
用pUK21或pRhtB轉(zhuǎn)化菌株NZ10/pAL4，以得到菌株NZ10/pAL4，pUK21和NZ10/pAL4，pRhtB。
在37℃下、在含有50mg/l卡那霉素和100mg/l氨芐青霉素的營養(yǎng)肉湯中分別培養(yǎng)如此得到的轉(zhuǎn)化體18個小時，在20×200mm的試管中將0.3ml得到的培養(yǎng)物接種到3ml具有下列組成并含有50mg/l卡那霉素和100mg/l氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且在37℃下用旋轉(zhuǎn)振蕩器培養(yǎng)46小時。在培養(yǎng)之后，通過已知的方法測定培養(yǎng)基中高絲氨酸的積累量以及在560nm下培養(yǎng)基的吸光值。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/L)
葡萄糖80(NH4)2SO422K2HPO42NaCl 0.8MgSO4·7H2O 0.8FeSO4·7H2O 0.02MnSO4·5H2O 0.02鹽酸硫胺素 0.0002酵母提取物 1.0CaCO330(CaCO3是單獨(dú)進(jìn)行滅菌的。)結(jié)果示于表1。正如表1所示，菌株NZ10/pAL4，pRhtB積累高絲氨酸的數(shù)量大于其中未增強(qiáng)rhtB基因的菌株NZ10/pAL4和NZ10/pAL4，pUK21的量。
表1
實(shí)施例3用引入pRhtB的菌株生產(chǎn)丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸大腸桿菌MG442是一種已知的菌株(Gusyatiner等，1978，Genetika(俄文)14947-956)。
用質(zhì)粒pUK21和pRhtB轉(zhuǎn)化菌株MG442，以得到菌株MG442/pUK21和MG442/pRhtB。
在37℃下、在含有50mg/l卡那霉素的營養(yǎng)肉湯中分別培養(yǎng)如此得到的轉(zhuǎn)化體18個小時，在20×200mm的試管中將0.3ml得到的培養(yǎng)物接種到3ml實(shí)施例2中所述的并含有50mg/l卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且在37℃下用旋轉(zhuǎn)振蕩器培養(yǎng)40小時。在培養(yǎng)之后，通過已知的方法測定培養(yǎng)基中丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸的積累量以及在560nm下培養(yǎng)基的吸光值。
結(jié)果示于表2。正如表2所示，菌株MG442/pRhtB積累丙氨酸、纈氨酸和異亮氨酸的每一種的數(shù)量大于其中未增強(qiáng)rhtB基因的菌株MG442/pUK21的量。
表2<
實(shí)施例4生產(chǎn)蘇氨酸生產(chǎn)菌株通過普通的轉(zhuǎn)化方法引入已知的質(zhì)粒pVIC40(美國專利5,175,107(1992))來轉(zhuǎn)化菌株MG442(實(shí)施例3)。在含有0.1mg/ml鏈霉素的LB瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。從而得到了新的菌株MG442/pVIC40。
用pUK21或pRhtB轉(zhuǎn)化菌株MG442/pVIC40，以得到菌株MG442/pVIC40，pUk21和MG442/pVIC40，pRhtB。
在37℃下、在含有50mg/l卡那霉素和100mg/l鏈霉素的營養(yǎng)肉湯中分別培養(yǎng)如此得到的轉(zhuǎn)化體18個小時，在20×200mm的試管中將0.3ml得到的培養(yǎng)物接種到3ml實(shí)施例2中所述的并含有50mg/l卡那霉素和100mg/l鏈霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，并且在37℃下用旋轉(zhuǎn)振蕩器培養(yǎng)46小時。在培養(yǎng)之后，通過已知的方法測定培養(yǎng)基中蘇氨酸的積累量以及在560nm下培養(yǎng)基的吸光值。
結(jié)果示于表3。正如表3所示，菌株MG442/pVIC40，pRhtB積累蘇氨酸的數(shù)量大于其中未增強(qiáng)rhtB基因的菌株MG442/pVIC40以及MG442/pVIC40，pUk21的量。
表3
實(shí)施例5rhtB基因失活以及擴(kuò)增對大腸桿菌抗某些氨基酸及氨基酸類似物的抗性的影響為了失活染色體rhtB基因，在pUK21載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建質(zhì)粒pNPZ46(圖1)。它具有來自于大腸桿菌染色體86min處的DNA片段，以及rhtB基因及其5’-側(cè)翼區(qū)和3’-側(cè)翼區(qū)。然后，以pNPZ46質(zhì)粒rhtB基因的ClaI-Eco47III片段取代含有pACYC184質(zhì)粒的cat(CmR)基因(Chang與Cohen，《細(xì)菌學(xué)雜志》134，1141-1156，1978)的AsuII-BsrBI片段，以便提供pNPZ47質(zhì)粒(圖1)。為了把得到的插入且失活的rhtB基因引入大腸桿菌菌株N99(已知菌株W3350的鏈霉素抗性衍生物(Campbell，《病毒學(xué)》14，22-33，1961))的染色體中，使用了Parker和Marinus的方法(Parker，B.與Marinus，M.G.，《基因》73，531-535，1988)。通過噬菌體P1的轉(zhuǎn)導(dǎo)并通過Southern雜交(Southern，E.M.，《分子生物學(xué)雜志》98，503-517，1975)證實(shí)了野生型等位基因?qū)κЩ畹乃龌虻娜〈?br>
然后測試了如此獲得的大腸桿菌菌株N99 rhtB∷cat、原始菌株N99(rhtB+)及其用pRhtB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的衍生物N99/pRhtB對某些氨基酸及氨基酸類似物的易感性。將在37℃下在M9基本培養(yǎng)基中用旋轉(zhuǎn)振蕩器過夜培養(yǎng)的菌株的培養(yǎng)物(109cfu/ml)按1∶100進(jìn)行稀釋，并在相同的條件下培養(yǎng)5小時。然后稀釋如此得到的對數(shù)期的培養(yǎng)物，并將大約104個活細(xì)胞加入含有氨基酸或類似物加倍增加的M9瓊脂的干燥好的測試平板中。在培養(yǎng)40-46小時之后，檢測這些化合物的最小抑制濃度(MIC)。結(jié)果示于表4中。
表4
從表4得出了除高絲氨酸以外，多拷貝的rhtB還使得細(xì)胞具有對蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、α-氨基-β-羥戊酸(AHVA)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)和4-氮雜-DL-亮氨酸的抗性增加的性質(zhì)。相反地，rhtB基因的失活增加了細(xì)胞對高絲氨酸和AHVA的敏感性。結(jié)合有關(guān)RhtB蛋白質(zhì)與谷氨酸棒狀桿菌的LysE賴氨酸流出(efflux)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)(Vrljic等，《分子生物學(xué)》22，815-826，1996)的同源性的數(shù)據(jù)，這些結(jié)果表明針對rhtB基因產(chǎn)物的類似的功能。推測的流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、RhtB對幾種底物(氨基酸)具有特異性，或者作為擴(kuò)增的結(jié)果可能顯示出非特異性的效果。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>編碼使大腸桿菌具有L-高絲氨酸抗性的蛋白質(zhì)的DNA以及用于生產(chǎn)L-氨基酸的方法<130><140>RU 98118425<141>1998-10-13<160>2<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1200<212>DNA<213>大腸桿菌<220><221>CDS<222>(557)..(1171)<400>1agaaataatg tggagatcgc accgcccatc gaatgtgcca gtatatagcg tttacgccac 60ggaccgggct gaacctcctg ctgccagaat gccgccagat catcaacata atcattaaag 120cgattaacat gcccgagatg cggatcggct aacaggcgac cggaacgtcc ctgcccgcga 180tggtcgatga ttaagacatc aaaccccaaa tggaacaggt cataggccag ttccgcatat 240tttacgtagc tctcaatacg ccccgggcag atgactacca cccggtcatg gtgctgtgcg 300cgaaaacgga caaagcgcac cggaatgtca tccacaccag taaactctgc ttcatcacgc 360tgacgccaga aatcagtcag cggtcccatg gtaaaagcag caaacgcgtt ttctcttgtt 420tcccagtctt tttgctgctg aaacatcggg taatctgcct cttaaaccac gtaaaatcgt 480tttttttagc gtgcctgaca caacgctgcg acagtagcgt attgtggcac aaaaatagac 540acaccgggag ttcatc atg acc tta gaa tgg tgg ttt gcc tac ctg ctg aca 592Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr1 5 10tcg atc att tta acg ctg tcg cca ggc tct ggt gca atc aac act atg 640Ser Ile Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met15 20 25acc acc tcg ctc aac cac ggt tat ccg gcc ggt ggc gtc tat tgc tgg 688Thr Thr Ser Leu Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys Trp30 35 40gct tca gac cgg act ggc gat tca tat tgt gct ggt tgg cgt ggg gtt 736Ala Ser Asp Arg Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly Val45 50 55 60ggg acg cta ttt tcc cgc tca gtg att gcg ttt gaa gtg ttg aag tgg 784Gly Thr Leu Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp65 70 75gca ggc gcg gct tac ttg att tgg ctg gga atc cag cag tgg cgc gcc 832Ala Gly Ala Ala Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala80 85 90gct ggt gca att gac ctt aaa tcg ctg gcc tct act caa tcg cgt cga 880Ala Gly Ala Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg95 100 105cat ttg ttc cag cgc gca gtt ttt gtg aat ctc acc aat ccc aaa agt 928His Leu Phe Gln Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser110 115 120att gtg ttt ctg gcg gcg cta ttt ccg caa ttc atc atg ccg caa cag 976Ile Val Phe Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln125 130 135 140ccg caa ctg atg cag tat atc gtg ctc ggc gtc acc act att gtg gtc 1024Pro Gln Leu Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val145 150 155gat att att gtg atg atc ggt tac gcc acc ctt gct caa cgg att gct 1072Asp Ile Ile Val Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala160 165 170cta tgg att aaa gga cca aag cag atg aag gcg ctg aat aag att ttc 1120Leu Trp Ile Lys Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe175 180 185ggc tcg ttg ttt atg ctg gtg gga gcg ctg tta gca tcg gcg agg cat 1168Gly Ser Leu Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His190 195 200gcg tgaaaaataa tgtcggatgc ggcgtaaac 1200Ala205<210>2<211>205<212>PRT<213>大腸桿菌<400> 2Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr Ser Ile Ile Leu1 5 10 15Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met Thr Thr Ser Leu20 25 30Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys Trp Ala Ser Asp Arg35 40 45Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly Val Gly Thr Leu Phe50 55 60Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala Ala65 70 75 80Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala Ile85 90 95Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe Gln100 105 110Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe Leu115 120 125Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Leu Met130 135 140Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Ile Val145 150 155 160Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile Lys165170 175Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu Phe180 185 190Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala195 200 20權(quán)利要求
1.一種編碼如下列(A)或(B)中定義的蛋白質(zhì)的DNA(A)包含序列表中SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或者(B)包含序列表中SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列中含有一個或幾個氨基酸的缺失、取代、插入或者添加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且其具有使細(xì)菌具備蛋白質(zhì)L-高絲氨酸抗性之活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，它是一種如下列(a)或(b)中定義的DNA(a)包含序列表中SEQ ID NO1中所示核苷酸序列的編號為第557-1171位核苷酸的核苷酸序列的DNA；或者(b)在嚴(yán)格條件下與序列表SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列的編號為第557-1171位核苷酸的核苷酸序列雜交的DNA，并且其編碼具有使所述的細(xì)菌具備蛋白質(zhì)L-高絲氨酸抗性之活性的蛋白質(zhì)。
3.一種屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌，其中所說細(xì)菌的L-高絲氨酸抗性通過在所說細(xì)菌的細(xì)胞中擴(kuò)增如權(quán)利要求1中定義的DNA的拷貝數(shù)得到增強(qiáng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)菌，其中在所說細(xì)菌細(xì)胞的多拷貝載體上攜帶有如權(quán)利要求1定義的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)菌，其中在所說細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)座子上攜帶有如權(quán)利要求1定義的DNA。
6.一種用于生產(chǎn)氨基酸的方法，該方法包括下列步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)所述氨基酸能力的如權(quán)利要求3至5之任一所定義的細(xì)菌，以便在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累所述的氨基酸，以及從培養(yǎng)基中回收所述的氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的氨基酸為至少一種選自由下列氨基酸組成的組的氨基酸L-高絲氨酸、L-丙氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-蘇氨酸。
全文摘要
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種細(xì)菌以便在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累氨基酸,并且從所述的培養(yǎng)基中回收氨基酸,所述的細(xì)菌具有生產(chǎn)氨基酸的能力,其中編碼一種蛋白質(zhì)的新基因(rhtB)得到增強(qiáng),所說的蛋白質(zhì)具有使細(xì)菌具備蛋白質(zhì)L－高絲氨酸抗性之活性。
文檔編號C12N15/31GK1254014SQ9912135
公開日2000年5月24日 申請日期1999年10月13日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月13日
發(fā)明者V·A·利夫希茨, N·P·扎卡塔瓦, V·V·阿勒奧希, A·V·巴拉雷奧瓦, I·L·托克馬科瓦 申請人:味之素株式會社