專利名稱：一種非還原性糖形成酶、一種海藻糖釋放酶以及用這些酶制備糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非還原性糖形成酶、一種海藻糖釋放酶以及用這些酶制備糖的方法。
海藻糖是由2摩爾在其還原性殘基上結(jié)合的葡萄糖所組成的二糖，并且廣泛見(jiàn)于自然界中，例如在微生物、真菌、藻類、昆蟲、甲殼類等。由于該糖長(zhǎng)期以來(lái)被看作是基本上無(wú)還原性并具有滿意的保濕功能的糖，所以預(yù)計(jì)其可用于廣泛的領(lǐng)域。包括食品、化妝品及藥品。然而，盡管其杰出的預(yù)期功能，但沒(méi)有建立該糖有效的制備方法，故這限制了海藻糖的用途。因而，強(qiáng)烈期待能夠廉價(jià)供應(yīng)海藻糖。
作為對(duì)這種期待的建議，本發(fā)明者通過(guò)他們的深入研究已經(jīng)建立了從原料淀粉酶促制備海藻糖的方法。該方法特征在于以下的步驟，即將還原性的部分淀粉水解物經(jīng)過(guò)非還原性糖形成酶的作用，這將由還原性的部分淀粉水解物形成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性糖，并且還原性的部分淀粉水解物經(jīng)海藻糖釋放酶的作用，該酶作用于具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性糖從而水解海藻糖結(jié)構(gòu)部分與其余部分之間的位點(diǎn)。這些酶及其方法公開于由與本發(fā)明相同的申請(qǐng)者申請(qǐng)的日本專利公開No.143,876/95，213,283/95，322,883/95，298,880/95，66,187/96，66,188/96，73,504/96，84,586/96，和336,388/96中。因此，獲得了海藻糖的廉價(jià)制備。
在研究期間，他們獲得了獨(dú)到的發(fā)現(xiàn)，即該非還原性糖形成酶可用于新制備非還原性糖，這種方法克服了傳統(tǒng)的存在于還原性部分淀粉水解物中的缺陷。作為問(wèn)題，還原性部分淀粉水解物如糊精和麥芽糖寡糖具有可用作增甜劑及能量補(bǔ)充糖源的優(yōu)勢(shì)，但作為其缺點(diǎn)，由于其還原性而與其他物質(zhì)具有高度反應(yīng)性和當(dāng)與氨基酸和/或蛋白共存時(shí)易于褐變反應(yīng)以及容易損壞其質(zhì)量。為了克服此問(wèn)題，僅僅知道用高壓氫化作用方法等將還原性部分淀粉水解物轉(zhuǎn)換成糖醇的方法。然而，在實(shí)際使用中，該方法需要較多的熱量和鑒于使用氫的安全性考慮而建立的裝備，這樣便導(dǎo)致了更高的成本及較多的勞動(dòng)力消耗。相反，前述的非還原性糖形成酶按照前面所述作用于還原性部分淀粉水解物，形成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性糖，并且此反應(yīng)由于為酶促反應(yīng)而在相對(duì)較為溫和的條件下進(jìn)行。利用該酶的作用，本發(fā)明者建立了用該酶制備非還原性糖的有效新方法，其可克服存在于還原性部分淀粉水解物中的傳統(tǒng)缺陷。由于這些發(fā)現(xiàn)，開發(fā)海藻糖及非還原性糖的適當(dāng)用途充斥于多個(gè)領(lǐng)域。并因此擴(kuò)大了這些糖的用途且現(xiàn)在顯著增加了這些糖在多個(gè)領(lǐng)域中的需求。
在這些條件下，在該領(lǐng)域中更加期望制備。海藻糖及具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖的更為有效的方法。這種期望的關(guān)鍵是建立具有各種最佳條件的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶，并且提供各種可用于這些糖制備的這些酶的來(lái)源。因此，根據(jù)可與上述酶聯(lián)合使用以制備所需糖的另一種酶的最佳條件以及設(shè)備和制備糖的最終用途，最佳的酶可選自各種類型的酶，從而導(dǎo)致有效制備這些糖。通常已知的非還原性糖形成酶可分成具有相對(duì)較低的大約40℃或更低最適溫度的那些種類和具有相對(duì)較高的大約60℃或更高最適溫度的那些種類。盡管通常已知的海藻糖釋放酶可分成具有相對(duì)較低的大約45℃或更低最適溫度的那些種類和具有相對(duì)較高的大約60℃或更高最適溫度的那些種類。然而，至今還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)具有大約50℃適中溫度范圍最適溫度的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶。
在用于從淀粉原料制備糖的糖相關(guān)性酶中，主要的一組酶具有適中溫度范圍的最適溫度。在制備前述海藻糖和非還原性糖的方法中需要這些酶；至今還沒(méi)有建立具有適中溫度范圍的最適溫度的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶，從而還沒(méi)有認(rèn)識(shí)到用這2種酶中任意一種或同時(shí)用此二者以及上述糖相關(guān)性酶以充足的產(chǎn)量制備這些糖的方法。根據(jù)用于制備這些糖的設(shè)備及其最終用途，需要有在其酶促反應(yīng)中具有適中溫度范圍的最適溫度的酶。還遠(yuǎn)不能說(shuō)已經(jīng)建立了用非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶以滿意的高產(chǎn)量制備糖的方法。如上述，還強(qiáng)烈需要建立具有適中溫度范圍的最適溫度的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶和用于制備包括非還原性糖在內(nèi)的糖的方法。
鑒于此，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供具有適中溫度范圍的最適溫度的非還原性糖形成酶。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼該非還原性糖形成酶的DNA。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供用于制備該非還原性糖形成酶的方法。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供具有適中溫度范圍的最適溫度的海藻糖釋放酶。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供編碼該海藻糖釋放酶的DNA。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供用于制備該海藻糖釋放酶的方法。
本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供能夠產(chǎn)生非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶的微生物。
本發(fā)明的第八個(gè)目的是提供用該非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶制備包括非還原性糖的糖的方法。
為了達(dá)到上面的目的，本發(fā)明者廣泛地篩選了土壤中能夠?qū)崿F(xiàn)這些目的的微生物。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)，一種從日本Ako-Shi，Hyogo的土壤中新分離的微生物，產(chǎn)生的酶能夠解決上面的問(wèn)題。本發(fā)明者從該微生物中單獨(dú)分離出了所需的非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶，并鑒定了其特性，揭示這兩種酶均具有適中溫度范圍的最適溫度。對(duì)該微生物的鑒定證實(shí)其為節(jié)桿菌屬的一種新的微生物，命名為節(jié)桿菌屬的種S34。該微生物于1998年8月6日保藏于國(guó)立工業(yè)科技與人類技術(shù)研究所，Higashi 1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，并被接受且以許可號(hào)FERM BP-6450由該研究所保存。
本發(fā)明者繼續(xù)研究，從該微生物，節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERMBP-6450中分離編碼上面鑒定酶的DNA，破譯核苷酸序列，并測(cè)定該酶的氨基酸序列。本發(fā)明者證實(shí)節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450以及其中以常規(guī)方式導(dǎo)入了上面所得DNA的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生了所需量的酶。同時(shí)證實(shí)，這樣得到的酶可有利地用于在適中溫度范圍內(nèi)制備包含海藻糖和具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖的糖類。本發(fā)明根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)得以完成。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)新的非還原性糖形成酶加以解決，該酶可以從還原性部分淀粉水解物形成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元，并具有適中溫度范圍的最適溫度。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)編碼非還原性糖形成酶的DNA加以解決。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過(guò)制備非還原性糖形成酶的方法加以解決，該方法特征在于包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生該酶的微生物和從培養(yǎng)物中收集所產(chǎn)生的酶的步驟。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是通過(guò)一種新的海藻糖釋放酶加以解決，該酶特異性地水解具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元并且在海藻糖部分和其余部分之間的一個(gè)位點(diǎn)葡萄糖聚合程度至少為了的非還原性糖，并且具有適中溫度范圍內(nèi)的最適溫度。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是通過(guò)編碼海藻糖釋放酶的DNA解決。
本發(fā)明的第六個(gè)目的是通過(guò)制備海藻糖釋放酶的方法解決，該方法的特征在于包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生該酶的微生物和從培養(yǎng)物中收集所產(chǎn)生的酶的步驟。
本發(fā)明的第七個(gè)目的是通過(guò)選自節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450及其突變體的微生物加以解決。
本發(fā)明的第八個(gè)目的是通過(guò)制備糖的方法加以解決，包括以下步驟，即讓上面2種酶中任意一種或2種作用于還原性部分淀粉水解物以制備非還原性糖，并收集非還原性糖或具有相對(duì)較低還原性且含有非還原性糖的糖組合物。


圖1顯示溫度對(duì)來(lái)自本發(fā)明節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的非還原性糖形成酶活性的影響。
圖2顯示pH對(duì)來(lái)自本發(fā)明節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的非還原性糖形成酶活性的影響。
圖3顯示溫度對(duì)來(lái)自本發(fā)明節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的非還原性糖形成酶穩(wěn)定性的影響。
圖4顯示pH對(duì)來(lái)自本發(fā)明節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的非還原性糖形成酶穩(wěn)定性的影響。
圖5為本發(fā)明重組DNA pGY1的限制性圖譜。粗體線顯示來(lái)自節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的核苷酸序列。粗體線內(nèi)的黑箭頭顯示編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的核苷酸序列，而斜箭頭顯示編碼本發(fā)明海藻糖釋放酶的核苷酸序列。
圖6為本發(fā)明重組DNA pGY2的限制性圖譜。粗體線顯示來(lái)自節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的核苷酸序列。粗體線內(nèi)的黑箭頭顯示編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的核苷酸序列。
圖7為本發(fā)明重組DNA pGY3的限制性圖譜。黑箭頭顯示來(lái)自節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的核苷酸序列。
圖8顯示溫度對(duì)來(lái)自本發(fā)明節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的海藻糖釋放酶活性的影響。
圖9顯示pH對(duì)來(lái)自本發(fā)明節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的海藻糖釋放酶活性的影響。
圖10顯示溫度對(duì)來(lái)自本發(fā)明節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的海藻糖釋放酶穩(wěn)定性的影響。
圖11顯示pH對(duì)來(lái)自本發(fā)明節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的海藻糖釋放酶穩(wěn)定性的影響。
圖12為本發(fā)明重組DNA pGZ2的限制性圖譜。粗體線顯示來(lái)自節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的核苷酸序列。粗體線內(nèi)的斜箭頭顯示編碼本發(fā)明海藻糖釋放酶的核苷酸序列。
圖13為本發(fā)明重組DNA pGZ3的限制性圖譜。斜箭頭顯示來(lái)自節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的核苷酸序列。
本發(fā)明涉及一種非還原性糖形成酶和一種海藻糖釋放酶，以及用這2種酶中任意1種或同時(shí)用這二者制備糖的方法。本發(fā)明中所稱的詞語(yǔ)“非還原性糖形成酶”代表具有從還原性部分淀粉水解物形成具海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性糖這種作用的酶。本發(fā)明中所稱的詞語(yǔ)“海藻糖釋放酶”代表能夠特異性地水解具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元、葡萄糖聚合程度至少為3的非還原性糖、并且水解位點(diǎn)位于海藻糖部分和其余部分之間的酶。本發(fā)明中所稱的詞語(yǔ)“適中溫度范圍”代表通常用于從淀粉物質(zhì)通過(guò)酶促反應(yīng)而制備糖的反應(yīng)溫度中的適中溫度范圍。在這些方法的大多數(shù)情況下，使用大約10℃到100℃及其周圍溫度的不同反應(yīng)溫度。本發(fā)明的非還原性糖形成酶具有這種酶的功能，并且具有適中溫度范圍的最適溫度，優(yōu)選具有高于40℃低于60℃的溫度范圍，且更為優(yōu)選地，除了最適溫度外，其具有酸性pH范圍內(nèi)的最適pH。本發(fā)明的海藻糖釋放酶具有這種酶的功能，并且具有適中溫度范圍內(nèi)的最適溫度，優(yōu)選高于45℃低于60℃的溫度范圍，且更為優(yōu)選地，除了最適溫度外，其具有酸性pH范圍內(nèi)的最適pH。本發(fā)明的這些酶不應(yīng)限制其出處和來(lái)源。
按照如下測(cè)定本發(fā)明非還原性糖形成酶的活性將1ml酶溶液加入到4ml于20mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中作為底物的1.25w/v％的麥芽糖五糖中，并將混合物于50℃培養(yǎng)60分鐘。將此反應(yīng)混合物加熱至100℃ 10分鐘從而終止酶促反應(yīng)，用去離子水將反應(yīng)混合物準(zhǔn)確稀釋10倍，然后根據(jù)Somogyi-Nelson方法測(cè)定稀釋液的還原能力。作為對(duì)照，按上述類似地處理已經(jīng)于100℃加熱10分鐘而使酶失活的酶溶液。本發(fā)明酶的1單位活性定義為，當(dāng)按上述測(cè)定方法測(cè)定時(shí)，每分鐘去除1μmol麥芽糖五糖還原能力的酶量。根據(jù)此測(cè)定方法測(cè)定本發(fā)明中所稱的酶的最適溫度。通過(guò)以下方法加以測(cè)定，即在不同的溫度包括50℃時(shí)調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)溫度，使預(yù)定量的酶在測(cè)定的不同溫度作用于底物，根據(jù)測(cè)定中的不同溫度測(cè)定還原能力的降低水平，然后對(duì)測(cè)得的降低水平進(jìn)行相互比較，確定顯示最高活性的本發(fā)明酶的最適溫度。
按照如下測(cè)定本發(fā)明海藻糖釋放酶的活性將1ml酶溶液加入到4ml于20mM磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中作為底物的1.25w/v％麥芽三糖基海藻糖，即α-maltotetraosyl-α-D-葡萄糖苷中，并將混合液于50℃培養(yǎng)30分鐘，然后通過(guò)加熱Somogyi銅溶液而終止酶促反應(yīng)，并且根據(jù)Somogyi-Nelson方法測(cè)定還原能力。作為對(duì)照，用已經(jīng)于100℃加熱10分鐘而失活的酶溶液，按上述類似地進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明酶的1單位活性定義為，當(dāng)按上述測(cè)定方法測(cè)定時(shí)，每分鐘增加1μmol葡萄糖還原能力的酶量。根據(jù)此測(cè)定方法測(cè)定本發(fā)明中所稱的酶的最適溫度。通過(guò)以下方法加以測(cè)定，即在不同的溫度包括50℃時(shí)調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)溫度，使預(yù)定量的酶在測(cè)定的不同溫度作用于底物，并且根據(jù)測(cè)定中的不同溫度測(cè)定還原能力的增加水平，然后對(duì)測(cè)得的增加水平進(jìn)行比較，確定顯示最高活性的本發(fā)明酶的最適溫度。
解釋基于此氨基酸序列的本發(fā)明非還原性糖形成酶，總體上，該酶具有SEQID NO1的氨基酸序列，并且在有些情況下具有SEQ ID NO2到6的氨基酸序列作為其部分序列。除了具有上述整個(gè)氨基酸序列的這些酶之外，本發(fā)明還包括另幾種酶，其包括選自其中任何一種氨基酸序列中的一部分，或同時(shí)具有本發(fā)明非還原性糖形成酶功能和上述最適溫度。這些酶的氨基酸序列的實(shí)例有這些，它們?cè)谄浒被嵝蛄袃?nèi)含有與本發(fā)明非還原性糖形成酶特性的表達(dá)有關(guān)的部分氨基酸序列或氨基酸殘基，并且其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸被不同的氨基酸所取代或向其中添加了氨基酸和/或缺失了除上述氨基酸序列或氨基酸殘基外的其它氨基酸。在本發(fā)明中所稱的被不同的氨基酸所取代的氨基酸序列實(shí)例包括這些，其中組成SEQ ID NO1氨基酸序列不到30％并且優(yōu)選不到20％的氨基酸序列被具有類似特性和結(jié)構(gòu)的其它氨基酸所取代。這種氨基酸分組的實(shí)例有作為酸性氨基酸組的天冬氨酸與谷氨酸，作為堿性氨基酸的賴氨酸、精氨酸與組氨酸之一，作為酰胺型氨基酸的天冬酰胺與谷氨酰胺之一，作為羥基氨基酸的絲氨酸與蘇氨酸之一，作為支鏈氨基酸的纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸之一。含有選自SEQ ID NO1到6的氨基酸序列中任何一種的一部分的本發(fā)明酶其它氨基酸序列的實(shí)例有這些，即它們可能與SEQ ID NO1氨基酸序列具有基本上類似的立體結(jié)構(gòu)，即氨基酸的替代、缺失和/或添加被導(dǎo)入到SEQ ID NO1氨基酸序列中。該蛋白的立體結(jié)構(gòu)可通過(guò)以下方法加以估計(jì)，即對(duì)市售數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，以獲得具有與目的序列有關(guān)的氨基酸序列并且已揭示了其立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，參照選出的立體結(jié)構(gòu)，并且用商業(yè)上可得到的軟件觀看立體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明非還原性糖形成酶的上述氨基酸序列與SEQ ID NO1具有至少57％，優(yōu)選至少70％，更為優(yōu)選至少80％的同源性。
如上所述，該非還原性糖形成酶不應(yīng)限于特定的出處/來(lái)源。這些酶的實(shí)例有源自微生物，即節(jié)桿菌屬微生物，節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450，及其變異體的那些酶。這些變異體可通過(guò)以下方法獲得，即用已知的誘變劑，如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、甲基磺酸乙酯、紫外線和轉(zhuǎn)座子，以常規(guī)方式處理節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450；篩選能夠產(chǎn)生非還原性糖形成酶并且具有適中溫度范圍的最適溫度、通常在高于40℃而低于60℃溫度范圍的溫度具有最適溫度的所需突變體。源自節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的酶通常具有SEQ IDNO1到6的氨基酸序列。源自突變體節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450微生物以及其它微生物的其它非還原性糖形成酶包含SEQ ID NO1到6的氨基酸序列中任意一種的全部或部分序列。其它酶的具體實(shí)例包括作為本發(fā)明非還原性糖形成酶起作用、最適溫度在適中溫度范圍中、通常在高于40℃而低于60℃的溫度范圍中的重組酶。此重組酶可通過(guò)對(duì)編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的DNA應(yīng)用重組DNA技術(shù)而得到，可具有SEQ ID NO1到6的氨基酸序列中任意一種的全部或部分序列。
本發(fā)明大多數(shù)非還原性糖形成酶具有以下的理化特性(1)作用從葡萄糖聚合程度為3或更高的還原性部分淀粉水解物形成具海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性糖；(2)分子量根據(jù)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)約為75,000±10,000道爾頓；(3)等電點(diǎn)(pI)
用兩性電解質(zhì)等電點(diǎn)電泳，約為4.5±0.5；(4)最適溫度當(dāng)于pH6.0溫育60分鐘時(shí)大約為50℃；(5)最適pH當(dāng)于50℃溫育60分鐘時(shí)大約為pH6.0；(6)熱穩(wěn)定性當(dāng)于pH7.0溫育60分鐘時(shí)，在高達(dá)約55℃的溫度下穩(wěn)定；和(7)pH穩(wěn)定性當(dāng)于4℃溫育24小時(shí)時(shí)，在大約pH5.0至10.0的pH穩(wěn)定。
通過(guò)下述的制備方法，本發(fā)明非還原性糖形成酶可以預(yù)定的量獲得。
本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的DNA。這樣的DNA在制備重組蛋白形式的酶時(shí)十分有用。一般地，此DNA包括編碼與本發(fā)明非還原性糖形成酶不同出處/來(lái)源的酶的那些DNA。這些DNA的實(shí)例有含有全部或部分SEQ ID NO7的核苷酸序列或與其互補(bǔ)序列的那些DNA。包括全部SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA編碼SEQ ID NO1的氨基酸序列。含有全部或部分SEQ ID NO7的核苷酸序列的DNA包括以下DNA，它們具有與本發(fā)明非還原性糖形成酶的特性表達(dá)有關(guān)的氨基酸序列、并且具有相應(yīng)于該氨基酸序列的核苷酸序列，以及導(dǎo)入了一個(gè)或更多個(gè)堿基替代、缺失和/或添加而仍然維持與本發(fā)明非還原性糖形成酶的特性表達(dá)有關(guān)的核苷酸序列的SEQ ID NO7核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的DNA應(yīng)該包括根據(jù)遺傳密碼子的簡(jiǎn)并而以不同堿基替代一個(gè)或更多個(gè)堿基的那些DNA。根據(jù)本發(fā)明的DNA也包括那些含有編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的核苷酸序列并且進(jìn)一步包括選自以下的一個(gè)或多個(gè)其它附加核苷酸序列的DNA核糖體結(jié)合序列，如起始密碼子，終止密碼子和Shine-Dalgarno序列；編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，適當(dāng)限制酶的識(shí)別序列；調(diào)節(jié)基因表達(dá)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子核苷酸序列；以及終止子，所以這些序列都常用于重組DNA技術(shù)中而用于制備重組蛋白。例如，由于部分及全部的SEQ ID NO8核苷酸序列作為核糖體結(jié)合序列而起作用，故可任意地將部分及全部SEQ ID NO8核苷酸序列連接到編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的核苷酸序列上游的DNA用于制備重組蛋白形式的酶。
如上所述，編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的DNA不應(yīng)限制其出處/來(lái)源，并且，它們可根據(jù)用包含編碼本發(fā)明酶至少一部分氨基酸序列，如SEQ ID NO1氨基酸序列的核苷酸序列的DNA進(jìn)行的雜交，通過(guò)篩選不同來(lái)源的DNA而加以制備。這些來(lái)源的實(shí)例有節(jié)桿菌屬的微生物，并且優(yōu)選為節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERMBP-6450及其突變體，所有這些來(lái)源均產(chǎn)生非還原性糖形成酶。為了篩選這些微生物，可以使用該領(lǐng)域中用于篩選或克隆DNA的常規(guī)方法，如篩選重組文庫(kù)的方法、PCR方法及其改進(jìn)的方法。篩選的結(jié)果是所需DNA可以通過(guò)按常規(guī)方式收集以預(yù)期方式雜交的DNA而獲得。一般地，這樣得到的DNA包括部分或全部SEQ IDNO7核苷酸序列。例如，包括全部SEQ ID NO7核苷酸序列的DNA一般從節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450獲得。包括部分SEQ ID NO7核苷酸序列的DNA可通過(guò)類似地從非上述菌株來(lái)源的能夠產(chǎn)生本發(fā)明非還原性糖形成酶的微生物中篩選DNA而獲得。通過(guò)從用一種或更多種常規(guī)突變導(dǎo)入技術(shù)而導(dǎo)入上述DNA中一個(gè)或更多個(gè)堿基替代、添加和/或缺失的DNA中篩選編碼具有本發(fā)明酶特性酶的DNA，可以制備這樣的DNA。也可根據(jù)編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO7的核苷酸序列，用常規(guī)化學(xué)合成法而得到此DNA。一旦獲得，便可應(yīng)用或使用PCR方法和可自主復(fù)制的載體將本發(fā)明DNA擴(kuò)增至所需的水平。
本發(fā)明編碼非還原性糖形成酶的DNA包括導(dǎo)入適當(dāng)載體中的重組形式的DNA。只要該DNA可以得到，那么一般可通過(guò)重組DNA技術(shù)而相對(duì)容易地制備重組DNA。只要其能夠在適當(dāng)?shù)乃拗髦凶灾鞯貜?fù)制，那么任何類型的載體均可用于本發(fā)明中。這些載體的實(shí)例有用大腸桿菌作為宿主的pUC18，pBluescript IISK(+)，pKK223-3，λgt.λC等；用芽孢桿菌屬微生物的pUB110，pTZ4，pC194，ρ11，φ1，φ105等；和用2種或更多種微生物作為宿主的pHY300PLK，pHV14，TRp7，YEp7，pBS7等。本發(fā)明中將該DNA插入載體中的方法可以是本領(lǐng)域中常用的方法。含有該DNA的基因及可自主復(fù)制的載體首先用限制酶消化和/或用超聲破碎儀處理，然后連接得到的DNA片段和載體片段。通過(guò)用特異性切割該DNA的限制酶，特別是kpnI，AccI，BamHI，BstXI，EcoRI，HindIII，NotI，PstI，SacI，SalI，SmaI，SpeI，XbaI，XhoI等來(lái)促進(jìn)連接。為了連接該DNA片段和載體，如果必要，首先將其退火，然后在體內(nèi)或體外用DNA連接酶作用。這樣得到的重組DNA可在適當(dāng)宿主中基本上不受限制地復(fù)制。
編碼非還原性糖形成酶的本發(fā)明DNA進(jìn)一步包括該DNA已導(dǎo)入適當(dāng)載體中的轉(zhuǎn)化子。通過(guò)將該DNA或上述獲得的重組DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦袑⑵滢D(zhuǎn)化，可容易地制備這些轉(zhuǎn)化子。作為宿主，可以使用來(lái)自植物和動(dòng)物的細(xì)胞以及微生物，它們?cè)诒绢I(lǐng)域中常用，并根據(jù)重組DNA中的載體而挑選。作為宿主的微生物包括埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬以及其它放線菌、酵母、真菌等。為了將此DNA導(dǎo)入這些宿主微生物，可以使用常規(guī)的感受態(tài)細(xì)胞方法和原生質(zhì)體方法。編碼非還原性糖形成酶并導(dǎo)入本發(fā)明轉(zhuǎn)化子中的DNA可存在于染色體外的分離形式中，或以摻入形式存在于染色體中。摻入宿主染色體中的DNA具有能在其中穩(wěn)定保持的特征，用于制備本發(fā)明重組蛋白比較有利。
本發(fā)明海藻糖釋放酶可以需要的量通過(guò)下面制備酶的方法而得到，該方法特征在于其包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生該酶的微生物和從所得培養(yǎng)物中收集產(chǎn)生的酶。只要其能夠產(chǎn)生酶，用于此方法中的微生物可不同于前面的屬或種。這些微生物的實(shí)例有節(jié)桿菌屬的微生物，節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450，其變異體以及可通過(guò)將編碼該酶的DNA導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗髦卸玫降霓D(zhuǎn)化子。
只要前述的微生物能在其中生長(zhǎng)并且產(chǎn)生此酶，則用于培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明非還原性糖形成酶的任何營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基均可使用。一般地，此營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有碳源和氮源，且如果必要，可加入礦物質(zhì)。碳源的實(shí)例有糖如糊精、淀粉、部分淀粉水解物、葡萄糖等，和如糖蜜和酵母提取物之類含有糖的物質(zhì)，以及有機(jī)酸如葡糖醛酸和琥珀酸。碳源的濃度根據(jù)所用的類型加以挑選，一般為30w/v％，并且優(yōu)選15w/v％或更低。適用于本發(fā)明中的氮源的實(shí)例有含有無(wú)機(jī)氮的物質(zhì)，如銨鹽、硝酸鹽等；含有有機(jī)氮的物質(zhì)，如尿素、玉米漿、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物等。根據(jù)用途，可選擇性使用無(wú)機(jī)成份，如鈣、鎂、鉀、鈉，磷酸，錳，鋅，鐵，銅，鉬，鈷的鹽等。
用于制備本發(fā)明酶的培養(yǎng)條件可選擇性地使用適用于培養(yǎng)相應(yīng)微生物的適當(dāng)條件。例如，用節(jié)桿菌屬的微生物，包括節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的情況時(shí)，培養(yǎng)溫度一般在20-50℃，優(yōu)選在25-37℃的范圍；培養(yǎng)pH一般在pH4-10，優(yōu)選在pH5-9的范圍；培養(yǎng)時(shí)間在10-150小時(shí)的范圍。用這些條件，在有氧條件下培養(yǎng)該微生物。當(dāng)使用通過(guò)將編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦卸苽涞霓D(zhuǎn)化子時(shí)，該轉(zhuǎn)化子在下面的有氧條件下培養(yǎng)，如20-65℃的培養(yǎng)溫度。pH2-9的培養(yǎng)pH和1-6天的培養(yǎng)時(shí)間，盡管它們依微生物的屬、種、品系或型以及載體而變化。這樣得到的培養(yǎng)物在細(xì)胞級(jí)分中一般含有本發(fā)明酶。在培養(yǎng)通過(guò)用芽孢桿菌屬微生物作為宿主而得到的轉(zhuǎn)化子時(shí)，根據(jù)用于轉(zhuǎn)化宿主的載體，得到的培養(yǎng)基在上清液中可能含有本發(fā)明酶。這樣得到的培養(yǎng)物中本發(fā)明酶的含量通常在每ml培養(yǎng)物中0.01-1,000個(gè)單位盡管其依據(jù)所用微生物的屬、種、品系以及培養(yǎng)條件而變化。
從得到的培養(yǎng)物中收集本發(fā)明非還原性糖形成酶。收集方法沒(méi)有限制。通過(guò)分離和收集任何一種發(fā)現(xiàn)具有該酶主要活性的細(xì)胞級(jí)分和培養(yǎng)物上清，并且如果必要?jiǎng)t對(duì)收集的級(jí)分進(jìn)行適當(dāng)?shù)募兓瘡亩占性撁傅募兓?jí)分，可以得到本發(fā)明酶。為了分離細(xì)胞級(jí)分與培養(yǎng)物上清，可以任意使用常規(guī)的固-液分離方法，如用預(yù)先覆蓋濾膜和平紋及中空纖維膜進(jìn)行離心和過(guò)濾。從分離的細(xì)胞級(jí)分和培養(yǎng)物上清中收集所需的級(jí)分。對(duì)于細(xì)胞級(jí)分，將細(xì)胞破碎成細(xì)胞碎片，然后將其分離成細(xì)胞提取物和不溶性細(xì)胞級(jí)分，再收集任意一種所需級(jí)分。如果必要，可通過(guò)常規(guī)方法將不溶性細(xì)胞級(jí)分溶解。作為裂解細(xì)胞的方法，可任意使用任何一種下面的技術(shù)，包括超聲處理、以細(xì)胞壁裂解酶如溶菌酶和葡聚糖酶處理以及機(jī)械壓力負(fù)荷。為了裂解細(xì)胞，可以用任何一種上述技術(shù)直接處理培養(yǎng)物，然后以任何一種上述的固-液分離方法處理所得混合物以收集液體級(jí)分。這樣可任意得到細(xì)胞提取物。
用于進(jìn)一步純化本發(fā)明非還原性糖形成酶的方法包括一般純化糖相關(guān)性酶的常規(guī)方法，如鹽析、透析、過(guò)濾、濃縮、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、疏水層析、反相層析、親和層析、凝膠電泳和等電點(diǎn)電泳。這些方法可根據(jù)目的聯(lián)合使用。從通過(guò)這些方法分離而得到的級(jí)分中，收集通過(guò)非還原性糖形成酶的方法測(cè)得具有所需活性的級(jí)分，從而獲得純化至所需水平的本發(fā)明非還原性糖形成酶。根據(jù)下述實(shí)施例中方法，本發(fā)明酶可純化至電泳純的水平。如上所述，該方法提供以下形式的本發(fā)明非還原性糖形成酶，包括培養(yǎng)物、細(xì)胞級(jí)分、培養(yǎng)物上清級(jí)分、細(xì)胞裂解物、細(xì)胞提取物、可溶和不溶的細(xì)胞級(jí)分、部分純化的酶級(jí)分和純化的酶級(jí)分形式。這些級(jí)分可能含有其它類型的本發(fā)明海藻糖釋放酶。使用前，這樣獲得的非還原性糖形成酶可用常規(guī)的方式加以固定。固定的方法有，例如結(jié)合至離子交換劑上的方法、共價(jià)結(jié)合/吸附到樹脂和膜上，用高分子量物質(zhì)的截流固定方法。這樣獲得的非還原性糖形成酶可任意用于制備糖的方法中，包括下述用于制備糖的本發(fā)明方法。特別地，由于本發(fā)明非還原性糖形成酶具有適中溫度范圍的最適溫度，并且優(yōu)選具有酸性pH范圍內(nèi)的最適pH，故當(dāng)其與本發(fā)明下述的海藻糖釋放酶、具有酸性pH范圍內(nèi)最適pH的淀粉脫支酶和在適中的溫度范圍中有效發(fā)揮作用的環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶聯(lián)合使用時(shí)，其可有利地用于制備糖。
解釋基于此氨基酸序列的本發(fā)明海藻糖釋放酶，總體上，該酶具有SEQ IDNO9的氨基酸序列，并且在有些情況下具有SEQ ID NO10到16的氨基酸序列作為其部分序列。除了具有上述整個(gè)氨基酸序列的這些酶之外，本發(fā)明還包括另幾種酶，其包括選自其中的任何一種氨基酸序列的一部分或同時(shí)具有本發(fā)明海藻糖釋放酶功能和上述最適溫度。這些酶的氨基酸序列的實(shí)例有這些，它們?cè)谄浒被嵝蛄袃?nèi)含有與本發(fā)明海藻糖釋放酶特性的表達(dá)有關(guān)的部分氨基酸序列或氨基酸殘基，并且其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸被不同的氨基酸所取代或向其中添加了氨基酸和/或缺失了除上述氨基酸序列或氨基酸殘基外的其它氨基酸。在本發(fā)明中所稱的被不同的氨基酸所取代的氨基酸序列實(shí)例包括這些，其中組成SEQ ID NO9氨基酸序列不到30％并且優(yōu)選不到20％的氨基酸序列被具有類似特性和結(jié)構(gòu)的其它氨基酸所取代。這種氨基酸分組的實(shí)例有作為酸性氨基酸的天冬氨酸與谷氨酸，作為堿性氨基酸的賴氨酸、精氨酸與組氨酸之一，作為酰胺型氨基酸的天冬酰胺與谷氨酰胺之一，作為羥基氨基酸的絲氨酸與蘇氨酸之一，作為支鏈氨基酸的纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸之一。含有選自SEQ ID NO9到16的氨基酸序列中任何一種的一部分的本發(fā)明酶其它氨基酸序列的實(shí)例有這些，即它們可能與SEQ ID NO9氨基酸序列具有基本上類似的立體結(jié)構(gòu)，即氨基酸的替代、缺失和/或添加被導(dǎo)入到SEQ ID NO9氨基酸序列中。蛋白的立體結(jié)構(gòu)可通過(guò)以下方法加以估計(jì)，即對(duì)市售數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選，以獲得具有與目的序列有關(guān)的氨基酸序列并且已揭示了其立體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，參照選出的立體結(jié)構(gòu)，并且用商業(yè)上可得到的軟件觀看立體結(jié)構(gòu)。本發(fā)明海藻糖釋放酶的上述氨基酸序列與SEQID NO9具有至少60％，優(yōu)選至少70％，更為優(yōu)選至少80％的同源性。
如上所述，該海藻糖釋放酶不應(yīng)限于特定的出處/來(lái)源。這些酶的實(shí)例有源自微生物，即節(jié)桿菌屬微生物，節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450，及其變異體的那些酶。這些變異體可通過(guò)以下方法獲得，即用已知的誘變劑如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、甲基磺酸乙酯、紫外線和轉(zhuǎn)座子，以常規(guī)方式處理節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450；篩選能夠產(chǎn)生海藻糖釋放酶并且具有適中溫度范圍的最適溫度、通常在高于45℃而低于60℃溫度范圍的溫度具有最適溫度的所需突變體。源自節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的酶通常具有SEQ ID NO9到16的氨基酸序列。源自突變體節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450微生物以及其它微生物的其它海藻糖釋放酶包括SEQ ID NO9到16的氨基酸序列中任意一種的全部或部分序列。其它酶的具體實(shí)例包括作為本發(fā)明海藻糖釋放酶起作用、最適溫度在適中溫度范圍中、通常在高于45℃而低于60℃的溫度范圍中的重組酶。此重組酶可通過(guò)對(duì)編碼本發(fā)明海藻糖釋放酶的DNA應(yīng)用重組DNA技術(shù)而得到，可具有SEQ ID NO9到16的氨基酸序列中任意一種的全部或部分序列。
本發(fā)明大多數(shù)海藻糖釋放酶具有以下的理化特性(1)作用在海藻糖結(jié)構(gòu)與其余部分之間的位點(diǎn)特異性水解具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性糖；(2)分子量根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)約為62,000±5,000道爾頓；(3)等電點(diǎn)(pI)用兩性電解質(zhì)等電電泳約為4.7±0.5；(4)最適溫度當(dāng)于pH6.0溫育30分鐘時(shí)大約為50℃-55℃；(5)最適pH當(dāng)于50℃溫育30分鐘時(shí)大約為pH6.0；(6)熱穩(wěn)定性當(dāng)于pH7.0溫育60分鐘時(shí)，在高達(dá)大約pH50℃的溫度下穩(wěn)定；和(7)pH穩(wěn)定性當(dāng)于4℃溫育24小時(shí)時(shí)，在大約pH4.5至10.0時(shí)比較穩(wěn)定。
通過(guò)下述的制備方法，本發(fā)明海藻糖釋放酶可以預(yù)定的量獲得。
本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明海藻糖釋放酶的DNA。這樣的DNA在制備重組蛋白形式的酶時(shí)十分有用。一般地，此DNA包括編碼與本發(fā)明海藻糖釋放酶不同出處/來(lái)源的酶的那些DNA。這些DNA的實(shí)例有含有全部或部分SEQ ID NO17的核苷酸序列或與其互補(bǔ)的序列的那些DNA。包含全部SEQ ID NO17的核苷酸序列的DNA編碼SEQ ID NO9的氨基酸序列。含有全部或部分SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA包括以下DNA，它們具有相應(yīng)于與本發(fā)明海藻糖釋放酶的特性表達(dá)有關(guān)的氨基酸序列的核苷酸序列，以及導(dǎo)入了一個(gè)或更多個(gè)堿基替代、缺失和/或添加而仍然維持與本發(fā)明海藻糖釋放酶的特性表達(dá)有關(guān)的核苷酸序列的SEQ IDNO17核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的DNA應(yīng)該包括根據(jù)遺傳密碼子的簡(jiǎn)并而以不同堿基替代一個(gè)或更多個(gè)堿基的那些DNA。根據(jù)本發(fā)明的DNA也包括那些含有編碼本發(fā)明海藻糖釋放酶的核苷酸序列，并且進(jìn)一步包括選自以下的一個(gè)或多個(gè)其它附加核苷酸序列的DNA核糖體結(jié)合序列，如起始密碼子，終止密碼子和Shine-Dalgarno序列；編碼信號(hào)肽的核苷酸序列，適當(dāng)限制酶的識(shí)別序列；調(diào)節(jié)基因表達(dá)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子核苷酸序列；以及終止子，所以這些序列都常用于重組DNA技術(shù)中而用于制備重組蛋白。例如，由于部分及全部SEQ ID NO8的核苷酸序列作為核糖體結(jié)合序列而起作用，故可任意地將部分及全部SEQ ID NO8核苷酸序列連接到編碼本發(fā)明海藻糖釋放酶核苷酸序列上游的DNA用于制備重組蛋白形式的酶。
如上所述，編碼本發(fā)明海藻糖釋放酶的DNA不應(yīng)限制其出處/來(lái)源，并且，它們可根據(jù)用包含編碼本發(fā)明酶至少一部分氨基酸序列，如SEQ ID NO9氨基酸序列的核苷酸序列的DNA進(jìn)行的雜交，通過(guò)篩選不同來(lái)源的DNA而加以制備。這些來(lái)源的實(shí)例有節(jié)桿菌屬的微生物，并且優(yōu)選為節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450及其突變體，所有這些來(lái)源均產(chǎn)生海藻糖釋放酶。為了篩選這些微生物，可以使用該領(lǐng)域中用于篩選或克隆DNA的常規(guī)方法，如篩選重組文庫(kù)的方法、PCR方法及其改進(jìn)的方法。篩選的結(jié)果是所需DNA可以通過(guò)按常規(guī)方式收集以預(yù)期方式雜交的DNA而獲得。一般地，這樣得到的DNA包括部分或全部SEQ ID NO17核苷酸序列。例如，包括全部SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA一般從節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450獲得。包括部分SEQ ID NO17核苷酸序列的DNA可通過(guò)類似地從非上述菌株來(lái)源的能夠產(chǎn)生本發(fā)明海藻糖釋放酶的微生物中篩選DNA而獲得。通過(guò)從用一種或更多種常規(guī)突變導(dǎo)入技術(shù)而導(dǎo)入上述DNA中一個(gè)或更多個(gè)堿基替代、添加和/或缺失的DNA中篩選編碼具有本發(fā)明酶特性的酶的DNA，可以制備這樣的DNA。也可根據(jù)編碼本發(fā)明海藻糖釋放酶的核苷酸序列，如SEQ IDNO17的核苷酸序列，用常規(guī)化學(xué)合成法而得到此DNA。一旦獲得，便可應(yīng)用或使用PCR方法和可自主復(fù)制的載體將本發(fā)明DNA擴(kuò)增至所需的水平。
本發(fā)明編碼海藻糖釋放酶的DNA包括導(dǎo)入適當(dāng)載體中的重組形式的DNA。只要該DNA可以得到，那么一般可通過(guò)重組DNA技術(shù)而相對(duì)容易地制備重組DNA。只要其能夠在適當(dāng)?shù)乃拗髦凶灾鞯貜?fù)制，那么任何類型的載體均可用于本發(fā)明中。這些載體的實(shí)例有用大腸桿菌作為宿主的pUC18，pBluescript II SK(+)，pKK223-3，λgt.λC等；用芽孢桿菌屬微生物的pUB110，pTZ4，pC194，ρ11，φ1，φ105等；和用2種或更多種微生物作為宿主的pHY300PLK，pHV14，TRp7，YEp7，pBS7等。本發(fā)明中將該DNA插入載體中的方法可以是本領(lǐng)域中常用的方法。含有該DNA的基因及可自主復(fù)制的載體首先用限制酶消化和/或用超聲破碎儀處理，然后連接得到的DNA片段和載體片段。通過(guò)用特異性切割該DNA的限制酶，特別是kpnI，AccI，BamHI，BstXI，EcoRI，HindIII，NotI，PstI，SacI，SalI，SmaI，SpeI，XbaI，XhoI等來(lái)促進(jìn)連接。為了連接該DNA片段和載體，如果必要，首先將其退火，然后在體內(nèi)或體外用DNA連接酶作用。這樣得到的重組DNA可在適當(dāng)宿主中基本上不受限制地復(fù)制。
編碼海藻糖釋放酶的本發(fā)明DNA進(jìn)一步包括該DNA已導(dǎo)入適當(dāng)載體中的轉(zhuǎn)化子。通過(guò)將該DNA或上述獲得的重組DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦袑⑵滢D(zhuǎn)化，可容易地制備這些轉(zhuǎn)化子。作為宿主，可以使用來(lái)自植物和動(dòng)物的細(xì)胞以及微生物，它們?cè)诒绢I(lǐng)域中常用，并根據(jù)重組DNA中的載體而挑選。作為宿主的微生物包括埃希氏桿菌屬、芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬以及其它放線菌、酵母、真菌等。為了將此DNA導(dǎo)入這些宿主微生物，可以使用常規(guī)的感受態(tài)細(xì)胞方法和原生質(zhì)體方法。編碼海藻糖釋放酶并導(dǎo)入本發(fā)明轉(zhuǎn)化子中的DNA可存在于染色體外的分離形式中，或以摻入形式存在于染色體中。摻入宿主染色體中的DNA具有能在其中穩(wěn)定保持的特征，用于制備本發(fā)明重組蛋白比較有利。
前述用于獲得本發(fā)明DNA(包括重組DNA和轉(zhuǎn)化子)的技術(shù)以及用于獲得DNA和重組蛋白的技術(shù)常用于本領(lǐng)域中；例如，在J.Sambrook等編，由冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)出版的“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)”第2版中詳細(xì)公開了用于獲得所需DNA的方法和所獲得的DNA在制備中的應(yīng)用。例如，日本專利No.2,576,970公開了用目的基因缺陷的微生物作為宿主而穩(wěn)定轉(zhuǎn)化DNA的方法。日本專利公開No.157,987/88公開了可在芽孢桿菌屬微生物中有效表達(dá)目的DNA的一種載體。日本專利公表No.502,162/93公開了穩(wěn)定導(dǎo)入所需DNA至細(xì)菌染色體中的方法。日本專利公表No.506,731/96公開了用重組DNA技術(shù)有效制備淀粉水解酶的方法。日本專利公表No.500,543/97和500,024/98公開了用真菌有效制備重組蛋白的宿主一載體系統(tǒng)。常用于本領(lǐng)域中的這些方法可任意用于本發(fā)明中。
在本領(lǐng)域中，當(dāng)所需的DNA可用上述方法得到時(shí)，通?？商峁┰揇NA被導(dǎo)入適當(dāng)植物和動(dòng)物中的轉(zhuǎn)化子，即轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物。以DNA形式導(dǎo)入適當(dāng)載體中、編碼非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶的本發(fā)明DNA也包括轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物。為了得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，大體上可通過(guò)以下方法獲得，即，將權(quán)編碼本發(fā)明任意一種酶的DNA或者與其它所需DNA(如啟動(dòng)子及增強(qiáng)子)一起，插入根據(jù)宿主動(dòng)物的種類而選擇的適當(dāng)載體中，通過(guò)如顯微注射和電穿孔方法，或通過(guò)用含有該重組DNA的重組病毒的感染方法，將得到的重組DNA導(dǎo)入宿主動(dòng)物的受精卵或胚胎干細(xì)胞。宿主動(dòng)物的實(shí)例有常規(guī)實(shí)驗(yàn)用嚙齒類，如小鼠、大鼠和倉(cāng)鼠；和常用作家養(yǎng)動(dòng)物的哺乳動(dòng)物，如山羊、綿羊、豬和母牛，所以這些均具有容易飼養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)。將得到的導(dǎo)入有該DNA的細(xì)胞移植到與細(xì)胞相同種的假孕雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)。之后，從自然產(chǎn)或破腹產(chǎn)新生動(dòng)物中獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，通過(guò)雜交或PCR方法證實(shí)其中導(dǎo)入有編碼本發(fā)明酶的DNA。這樣便獲得了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物形式的本發(fā)明DNA。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有關(guān)內(nèi)容詳細(xì)公開于由Masami MATSUMURA，HirotoOKAYAMA和Tadashi YAMMOTO編、由日本東京Yodosha有限公司出版的“Jikken-Igaku-Bessatsu-Shin-Idennshi-Kogaku-Handbook”(遺傳工程手冊(cè))第269-283頁(yè)(1996)中。獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法包括，例如，提供對(duì)植物具有感染性的農(nóng)桿菌屬微生物載體，將編碼本發(fā)明任一種酶的DNA導(dǎo)入該載體中，再將得到的重組DNA導(dǎo)入植物體中或原生質(zhì)體中，或者以包括編碼本發(fā)明任一種酶的核苷酸序列的DNA包被重金屬顆粒并且直接將包被的顆粒用粒子槍注射入植物體內(nèi)或原生質(zhì)體內(nèi)。盡管各種植物可用作宿主植物，但它們通常包括可食用植物，如土豆、大豆、小麥、大麥、水稻、玉米、番茄、萵苣、苜蓿、蘋果、桃、瓜等。通過(guò)對(duì)上面轉(zhuǎn)化的植物體或原生質(zhì)體應(yīng)用雜交或PCR方法，篩選出含有所需DNA的轉(zhuǎn)化子。此轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體可再生成植物體，作為轉(zhuǎn)基因植物形式的本發(fā)明DNA。轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)一般公開于由Jane K. Setlow編，美國(guó)紐約Plenum出版公司出版的《遺傳工程》(1994)16卷第93-113頁(yè)中。前述轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物形式的DNA可用作本發(fā)明非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶的來(lái)源，并可用作含有海藻糖或具有海藻糖結(jié)構(gòu)的非還原性糖的食用動(dòng)植物。
本發(fā)明海藻糖釋放酶可以需要的量通過(guò)下面制備酶的方法而得到，該方法特征在于其包括在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生該酶的微生物和從所得培養(yǎng)物中收集產(chǎn)生的酶。只要其能夠產(chǎn)生本發(fā)明海藻糖釋放酶，用于此方法中的微生物可為不同的屬或種。這些微生物的實(shí)例有節(jié)桿菌屬的微生物，節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERMBP-6450，其變異體以及可通過(guò)將編碼該酶的DNA導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗髦卸玫降霓D(zhuǎn)化子。
只要前述的微生物能在其中生長(zhǎng)并且產(chǎn)生此酶，則用于培養(yǎng)產(chǎn)生本發(fā)明海藻糖釋放酶的任何營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基均可使用。一般地，此營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含有碳源和氮源，且如果必要，可加入礦物質(zhì)。碳源的實(shí)例有糖如糊精、淀粉、部分淀粉水解物、葡萄糖等，和如糖蜜和酵母提取物之類含有糖的物質(zhì)，以及有機(jī)酸如葡糖醛酸和琥珀酸。碳源的濃度根據(jù)所用的類型加以挑選，一般為30w/v％，并且優(yōu)選15w/v％或更低。適用于本發(fā)明中的氮源的實(shí)例有含有無(wú)機(jī)氮的物質(zhì)，如銨鹽、硝酸鹽等；含有有機(jī)氮的物質(zhì)，如尿素、玉米漿、酪蛋白、蛋白胨、酵母提取物、牛肉提取物等。根據(jù)用途，可選擇性使用無(wú)機(jī)成份，如鈣、鎂、鉀、鈉，磷酸，錳，鋅，鐵，銅，鉬，鈷等的鹽。
用于制備本發(fā)明海藻糖釋放酶的培養(yǎng)條件可選擇性地使用適用于培養(yǎng)相應(yīng)微生物的適當(dāng)條件。例如，用節(jié)桿菌屬的微生物，包括節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERMBP-6450的情況時(shí)，培養(yǎng)溫度一般在20-50℃，優(yōu)選在25-37℃的范圍；培養(yǎng)pH一般在pH4-10，優(yōu)選在pH5-9的范圍；培養(yǎng)時(shí)間在10-150小時(shí)的范圍。用這些條件，在有氧條件下培養(yǎng)該微生物。當(dāng)使用通過(guò)將編碼本發(fā)明海藻糖釋放酶的DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦卸苽涞霓D(zhuǎn)化子時(shí)，該轉(zhuǎn)化子在下面的有氧條件下培養(yǎng)，如20-65℃的培養(yǎng)溫度，pH2-9的培養(yǎng)pH和1-6天的培養(yǎng)時(shí)間，盡管它們依微生物的屬、種、品系或型以及載體而變化。這樣得到的培養(yǎng)物在細(xì)胞級(jí)分中一般含有本發(fā)明酶。在培養(yǎng)通過(guò)用芽孢桿菌屬微生物作為宿主而得到的轉(zhuǎn)化子時(shí)，根據(jù)用于轉(zhuǎn)化宿主的載體，得到的培養(yǎng)基在上清液中可能含有本發(fā)明酶。這樣得到的培養(yǎng)物中本發(fā)明酶的含量通常在每ml培養(yǎng)物中0.01-3,000個(gè)單位，盡管其依據(jù)所用微生物的屬、種、品系以及培養(yǎng)條件而變化。
從得到的培養(yǎng)物中收集本發(fā)明海藻糖釋放酶。收集方法沒(méi)有限制。通過(guò)分離和收集任何一種發(fā)現(xiàn)具有該酶主要活性的細(xì)胞級(jí)分和培養(yǎng)物上清，并且如果必要?jiǎng)t對(duì)收集的級(jí)分進(jìn)行適當(dāng)?shù)募兓瘡亩占性撁傅募兓?jí)分，可以得到本發(fā)明酶。為了分離細(xì)胞級(jí)分與培養(yǎng)物上清，可以任意使用常規(guī)的固-液分離方法，如用預(yù)先覆蓋的濾膜和平紋及中空纖維膜進(jìn)行離心和過(guò)濾。從分離的細(xì)胞級(jí)分和培養(yǎng)物上清中收集所需的級(jí)分。對(duì)于細(xì)胞級(jí)分，將細(xì)胞破碎成細(xì)胞碎片，然后將其分離成細(xì)胞提取物和不溶性細(xì)胞級(jí)分，再收集任意一種所需級(jí)分。如果必要，可通過(guò)常規(guī)方法將不溶性細(xì)胞級(jí)分溶解。作為裂解細(xì)胞的方法，可任意使用任何一種下面的技術(shù)，包括超聲處理、以細(xì)胞壁裂解酶如溶菌酶和葡聚糖酶處理以及機(jī)械壓力負(fù)荷。為了裂解細(xì)胞，可以用任何一種上述技術(shù)直接處理培養(yǎng)物，然后以任何一種上述的固-液分離方法處理所得混合物以收集液體級(jí)分。這樣可任意得到細(xì)胞提取物。
用于進(jìn)一步純化本發(fā)明海藻糖釋放酶的方法包括一般純化糖相關(guān)性酶的常規(guī)方法，如鹽析、透析、過(guò)濾、濃縮、凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、疏水層析、反相層析、親和層析、凝膠電泳和等電點(diǎn)電泳。這些方法可根據(jù)目的聯(lián)合使用。從通過(guò)這些方法分離而得到的級(jí)分中，收集通過(guò)海藻糖釋放酶的方法測(cè)得具有所需活性的級(jí)分，從而獲得純化至所需水平的酶。根據(jù)下述實(shí)施例中方法，本發(fā)明酶可純化至電泳純的水平。如上所述，該方法提供以下形式的本發(fā)明海藻糖釋放酶，包括培養(yǎng)物、細(xì)胞級(jí)分、培養(yǎng)物上清級(jí)分、細(xì)胞裂解物、細(xì)胞提取物、可溶和不溶的細(xì)胞級(jí)分、部分純化的酶級(jí)分和純化的酶級(jí)分形式。這些級(jí)分中可能含有其它類型的本發(fā)明非還原性糖形成酶。使用前，這樣獲得的海藻糖釋放酶可用常規(guī)的方式加以固定。固定的方法有，例如結(jié)合至離子交換劑上的方法、共價(jià)結(jié)合/吸附到樹脂和膜上，用高分子量物質(zhì)的截流固定方法。這樣獲得的海藻糖釋放酶可任意用于制備糖的方法中，包括下述用于制備糖的方法。特別地，由于本發(fā)明海藻糖釋放酶具有適中溫度范圍中的最適溫度，并且優(yōu)選具有酸性pH范圍的最適pH，故當(dāng)其與本發(fā)明上述的非還原性糖形成酶、具有酸性pH范圍內(nèi)最適pH的淀粉脫支酶和在適中的溫度范圍中有效發(fā)揮作用的環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶聯(lián)合使用時(shí)，其可有利地用于制備糖。
本發(fā)明提供了通過(guò)用本發(fā)明前述的酶制備包含非還原性糖的糖類的方法；此方法包括以下步驟使非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶作用于還原性部分淀粉水解物以形成非還原性糖，以及收集得到的非還原性糖或具有較低還原性的非還原性糖組合物。在該方法中，一種或更多種其它非本發(fā)明非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶以及其它糖相關(guān)性酶的使用不應(yīng)該排除在本發(fā)明之外。用于本發(fā)明方法中的還原性部分淀粉水解物可以不依賴于其出處/來(lái)源而加以使用。本發(fā)明中所稱的非還原性糖包括一般的非還原性糖，如海藻糖和具有海藻糖結(jié)構(gòu)的糖。
用于本發(fā)明制備糖類的方法中的還原性部分淀粉水解物可以，例如通過(guò)常規(guī)方法液化淀粉或淀粉狀物質(zhì)而獲得。此淀粉包括地面淀粉，如玉米淀粉、水稻淀粉和小麥淀粉；以及地下淀粉，如土豆淀粉、甜菜淀粉和木薯淀粉。為了液化這些淀粉，一般將它們?cè)谒袘腋〕傻矸蹜乙海瑑?yōu)選為至少10w/w％的濃度，并且更為優(yōu)選具有大約20到50w/w％的濃度，并且以機(jī)械、酸和/或酶處理。使用相對(duì)較低程度的液化比較讓人滿意，優(yōu)選地，DE(葡萄糖當(dāng)量)低于15，更為優(yōu)選DE低于10。當(dāng)用酸液化時(shí)，用鹽酸、磷酸、草酸等處理淀粉，然后在使用前用碳酸鈣、氧化鈣、碳酸鈉等中和得到的混合物至所需的pH。用酶液化淀粉時(shí)，使用α-淀粉酶，特別是熱穩(wěn)定的α-淀粉酶比較讓人滿意。這樣得到的液化淀粉可進(jìn)一步用α-淀粉酶、形成麥芽三糖的淀粉酶、形成麥芽四糖的淀粉酶、形成麥芽五糖的淀粉酶、形成麥芽六糖的淀粉酶等處理，得到的反應(yīng)混合物可用作還原性部分淀粉水解物。淀粉相關(guān)性酶的特性詳細(xì)描述于由Pergamon出版社出版的《淀粉酶和相關(guān)酶手冊(cè)》，18-81和125-142頁(yè)(1988)中。
將這樣得到的還原性部分淀粉水解物用本發(fā)明非還原性糖形成酶和/或海藻糖釋放酶作用，并且如果必要，進(jìn)一步用一種或更多種淀粉相關(guān)性酶作用，如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、淀粉脫支酶如異淀粉酶和支鏈淀粉酶、環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(cyclomatodextrin glucanotransferase)、α-葡糖苷酶和β-呋喃果糖苷酶。用于酶促反應(yīng)的條件為適于所用酶的那些條件；一般地，酶促反應(yīng)條件選自pH4-10和20-70℃，并且優(yōu)選pH5-7和30-60℃。特別地，非還原性糖可通過(guò)在適中溫度范圍，即高于40℃但低于60℃或高于45℃但低于60℃的溫度下及微酸性或酸性pH條件通過(guò)酶促反應(yīng)而有效制備。使不同酶作用于還原性部分淀粉水解物的順序沒(méi)有限制，一種可在另一種酶之前或之后使用，或任意將多種酶同時(shí)作用于底物。
根據(jù)酶促條件和反應(yīng)時(shí)間以及非還原性糖或含有該糖的較低還原性的糖組合物的最終用途而適當(dāng)設(shè)定酶量。對(duì)于本發(fā)明非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶而言，前者以大約0.01到100單位/g固體還原性部分淀粉水解物的量使用，后者以大約1到10,000單位/g固體還原性部分淀粉水解物的量使用。環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶以大約0.05到500單位/g固體還原性部分淀粉水解物，d.s.b的量使用。用這些酶獲得的反應(yīng)混合物一般含有海藻糖、α-葡糖基海藻糖、α-麥芽糖基海藻糖、α-麥芽三糖基海藻糖、α-麥芽四糖基海藻糖或α-麥芽五糖基海藻糖。在上面方法中，當(dāng)聯(lián)合使用時(shí)，本發(fā)明非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶與淀粉脫支酶和環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶一起特征性更多地產(chǎn)生大量的海藻糖和具有海藻糖結(jié)構(gòu)的相對(duì)低分子量的非還原性糖。
從得到的反應(yīng)混合物中，收集非還原性糖和具有較低還原性的糖組合物。在這些制備步驟中，可適當(dāng)選擇通常加工糖的方法。將得到的反應(yīng)混合物經(jīng)過(guò)濾和離心從而去除不溶性物質(zhì)，然后用活性炭脫色而純化得到的溶液，用H-或OH-形式的離子交換劑脫鹽，并且濃縮成糖漿產(chǎn)物。如果必要，此糖漿產(chǎn)物可進(jìn)一步純化成具有較高純度的非還原性糖；在純化中，可以使用一種或更多種方法，例如，柱層析分級(jí)分離，如離子交換柱層析，用活性炭或硅膠的柱層析，用有機(jī)物如丙酮和乙醇的分離沉淀；用具有適當(dāng)分離能力的膜的分離；和堿處理以分解和去除剩下的還原性糖。特別地，離子交換柱層析可適當(dāng)?shù)赜糜诒景l(fā)明中作為工業(yè)規(guī)模制備目的糖。具有改進(jìn)純度的非還原性糖例如，可通過(guò)用在日本專利公開No.23,799/83和72,598/83中所述的強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂的柱層析以去除伴生的糖而任意地加以制備。在此情況下，可以利用任何固定床、移動(dòng)床和半移動(dòng)床方法。
如果必要，可用淀粉酶如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-葡糖苷酶水解得到的非還原性糖或含有非還原性糖的相對(duì)較低還原性的糖類，從而控制其甜度和還原能力或降低其粘度；這樣得到的產(chǎn)物可進(jìn)一步進(jìn)行以下的處理，其中將剩余的還原性糖氫化成糖醇從而降低其還原能力。特別地，通過(guò)使葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于非還原性糖或含有非還原性糖的相對(duì)較低還原性的糖類，可容易地制備海藻糖。通過(guò)使葡糖淀粉酶或α-葡糖苷酶作用于這些糖從而形成海藻糖和葡萄糖的混合物，并且對(duì)此混合物進(jìn)行前述的純化方法，如離子交換柱層析，以去去除葡萄糖，可獲得高海藻糖含量的級(jí)分。高海藻糖含量的級(jí)分可任意純化并且濃縮成糖漿產(chǎn)物。如果必要，此糖漿產(chǎn)物可濃縮成超飽和溶液，然后結(jié)晶水合或非水合的晶體海藻糖，并回收得到的晶體。
為了制備水合的晶體海藻糖，將純度大約60w/w％或更高的大約65-90w/w％溶液置于結(jié)晶儀中，如果必要，在0.1-20w/v％晶種存在下，在95℃或更低的溫度下，并且優(yōu)選在10-90℃的溫度下，逐漸冷卻同時(shí)攪拌，從而獲得含有水合的晶體海藻糖的糖膏?？扇我馐褂眠B續(xù)結(jié)晶方法，從而在真空濃縮條件下完成結(jié)晶。
常規(guī)方法如分離、大塊粉碎、流床顆?；蛧婌F干燥可用于本發(fā)明中，從而從糖膏水合晶體海藻糖或含有海藻糖晶體的晶體糖類中分離。
在分離的情況，通常對(duì)糖膏進(jìn)行桶式離心，從而將水合晶體海藻糖與母液分離，如果必要，通過(guò)噴灑少量冷水沖洗該水合晶體海藻糖，以利于制備具有較高純度的水合晶體海藻糖。在噴灑干燥的情況，不具有或基本上不具有吸水性的結(jié)晶糖類通過(guò)下面方法可容易制備，包括通過(guò)高壓泵噴頭噴灑具有70-85w/w％濃度(基于干燥固體，dsb)大約20-60％結(jié)晶度(基于干燥固體，dsb)的糖膏；用加熱至60-100℃而不會(huì)融化所得晶體粉末的空氣干燥得到的產(chǎn)物；并且老化得到的粉末大約1到20小時(shí)，同時(shí)向其中吹入熱至30-60℃的空氣。在大塊粉碎的情況，不具有或基本上不具有吸水性的結(jié)晶糖類通過(guò)下面方法可容易制備，包括使具有10-20％w/w濕度含量和大約10-60％結(jié)晶度(d.s.b)的糖膏靜置大約0.1到3天從而使全部組分結(jié)晶并固化成塊；并且粉碎或切割得到的固體塊。
為了得到無(wú)水結(jié)晶海藻糖，將上面得到的水化晶體海藻糖在70-160℃并且優(yōu)選在80-100℃的溫度于正?；驕p壓下干燥；或者將具有不到10％濕度的相對(duì)高濃度和含量的海藻糖溶液置于結(jié)晶儀中，在晶種存在下于50-160℃并且優(yōu)選在80-140℃的溫度攪拌，從而制備含有非水合晶體海藻糖的糖膏，并且用諸如塊粉碎、流床粒化和噴灑干燥之類方法在相對(duì)高溫和干燥條件下處理此糖膏。
這樣獲得的非還原性糖或含有該成份并具有相對(duì)低還原性的糖組合物具有低的還原性和滿意的穩(wěn)定性；當(dāng)與其它物質(zhì)如氨基酸、寡肽或蛋白混合并一起處理時(shí)，它們不變成棕色、不產(chǎn)生令人不快的氣味，并且不使后面的其它物質(zhì)變質(zhì)。即使具有相對(duì)低的還原性，但上述的糖仍具有相對(duì)低的粘度，并且那些具有平均相對(duì)較低葡萄糖聚合程度的糖類具有相對(duì)高的質(zhì)量和甜度。這些糖可任意用于食品、化妝品和藥品等領(lǐng)域中，如在以下的日本專利公開中所公開的領(lǐng)域，包括No.66,187/96，66,188/96，73,482/96，73,506/96，73,504/96，336,363/96，9,986/97，154,493/97，252,719/97，66,540/98，和168,093/98；以及日本專利申請(qǐng)No.236,441/97，256,219/97，268,202/97，274,962/97，320,519/97，338,294/97，55,710/98，67,628/98，134,553/98和214,375/98，所以這些均由與本發(fā)明相同的申請(qǐng)人申請(qǐng)過(guò)。
下面的實(shí)施例更為詳細(xì)地描述本發(fā)明實(shí)施例1能夠產(chǎn)生非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶的微生物本發(fā)明者廣范地篩選土壤，以分離能夠產(chǎn)生非還原性糖形成酶和海藻糖釋放酶的微生物。結(jié)果，他們從日本Ako，Hyogo的土壤中分離到具有該特性的微生物，并且根據(jù)在由Takeji Hasegawa編由日本東京科學(xué)學(xué)會(huì)出版社出版的“Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei”(微生物的分類和鑒定)(1985)中所述的方法加以鑒定。結(jié)果如下細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果(1)當(dāng)于37℃在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞特征通常以0.4-0.5×0.8-1.2um的桿狀形式存在；以單一形式存在，但極少數(shù)情況下以多態(tài)形式存在；無(wú)活動(dòng)性；不產(chǎn)芽孢；非酸性快速；及革蘭氏染色陽(yáng)性。
(2)當(dāng)于37℃在EYG營(yíng)養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞特征顯示出桿狀和球狀的生長(zhǎng)周期。
培養(yǎng)特性結(jié)果(1)當(dāng)于37℃在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)平板中培養(yǎng)時(shí)所形成菌落的特征形狀2天培養(yǎng)后具有大約1-2mm直徑的圓形菌落；邊緣完整；突出情況突出；光澤潮濕光澤表面平整；及顏色半透明或奶黃色。
(2)當(dāng)于37℃在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面中培養(yǎng)時(shí)形成菌落的特征生長(zhǎng)滿意；和形狀線樣。
(3)當(dāng)于37℃在具有酵母提取物和蛋白胨的瓊脂斜面中培養(yǎng)時(shí)形成菌落的特征生長(zhǎng)滿意；和形狀線樣。
(4)當(dāng)于27℃在營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基中穿刺培養(yǎng)時(shí)形成菌落的特征沒(méi)有液化明膠。
生理特性的結(jié)果(1)甲基紅測(cè)試陰性(2)VP測(cè)試陽(yáng)性(3)吲哚的形成陰性(4)硫化氫的形成陰性(5)淀粉的水解陽(yáng)性(6)明膠的液化陰性(7)檸檬酸的利用陽(yáng)性(8)無(wú)機(jī)氮源的利用利用硝酸鹽但不利用銨鹽(9)色素的形成無(wú)(10)脲酶陰性(11)氧化酶陰性(12)過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性(13)生長(zhǎng)范圍在pH4.5-8.0和20-50℃的范圍生長(zhǎng)；并且最適溫度30-45℃。
(14)氧氣需求需氧(15)碳源的利用L-阿拉伯糖同化D-葡萄糖同化D-果糖不同化D-半乳糖不同化L-鼠李糖不同化D-木糖不同化D-甘露糖同化棉籽糖不同化海藻糖不同化蔗糖不同化麥芽糖不同化乳糖不同化D-半乳糖醇不同化D-甘露糖醇不同化葡萄糖醛酸同化琥珀酸同化煙酸不同化L-馬來(lái)酸同化乙酸同化乳酸同化(16)從糖中形成酸L-阿拉伯糖略微形成D-葡萄糖略微形成D-果糖不形成D-半乳糖略微形成L-鼠李糖略微形成D-木糖略微形成甘油略微形成棉籽糖不形成海藻糖略微形成蔗糖略微形成麥芽糖略微形成乳糖不形成(17)氨基酸的利用不利用L-谷氨酸鈉、L-天冬氨酸鈉、L-組氨酸和L-精氨酸。(18)對(duì)氨基酸的脫羧酶測(cè)試對(duì)L-賴氨酸、L-鳥氨酸和L-精氨酸為陰性。(19)脫氧核糖核酸酶陰性(20)細(xì)胞壁的N-?；愋鸵阴；?21)細(xì)胞壁的主要二氨基酸賴氨酸(22)DNA的鳥嘌呤(G)加上胞嘧啶(C)的摩爾百分?jǐn)?shù)71.2％
參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(Borgey’s Manual of SystematicBactenioligy)第二卷(1984)，將這些細(xì)菌學(xué)特性與已知微生物的特性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示此微生物被鑒定為節(jié)桿菌屬的新種。根據(jù)這些結(jié)果，本發(fā)明者將此微生物命名為“節(jié)桿菌屬的種S34”(“Arthrobacter sp S34”)。該微生物于1998年8月6日以FERM BP-6450的許可號(hào)保藏于日本國(guó)際貿(mào)易與工業(yè)部工業(yè)科技署國(guó)立生物科學(xué)與人類技術(shù)研究所專利微生物保藏中心(1-3，Higashi，1chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566)并被接受。
根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第一卷(1984)中的DNA-DNA雜交方法，檢測(cè)此鑒定出的微生物與保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(美國(guó)的國(guó)際微生物保藏庫(kù))的節(jié)桿菌屬模式株DNA之間的同源性。示于下表1中的12種模式株分別以正常方式培養(yǎng)，并且從得到的培養(yǎng)物中收集增殖的細(xì)胞。通過(guò)下述實(shí)施例2-1中的種子培養(yǎng)物方法，培養(yǎng)節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450，然后收集增殖的細(xì)胞。根據(jù)常規(guī)方法，從每種模式株微生物中獲得DNA，將該DNA的2微克等分液用限制酶PstI消化。將得到的消化的混合物分別點(diǎn)于“Hybond-N+”(一種由Amersham International，Arlington Heights，IL，USA商業(yè)化的尼龍膜)上，并且以常規(guī)的方式用堿處理，中和并干燥，從而將此DNA固定于尼龍膜上。取從節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450獲得的1微克DNA并且用限制酶PstI消化。用由Amersham International，Arlington Heights，IL，USA商業(yè)化的[α-32P]dCTP，和“READY-TO-GODNA標(biāo)記試劑盒”(一種由Pharnacia LKBBiotechnology AB，Uppsala，Sweden商業(yè)化的DNA標(biāo)記試劑盒)，將消化產(chǎn)物用同位素標(biāo)記以獲得探針。將該探針與上述固定于尼龍膜上的DNA在振蕩條件下于65℃于“快速雜交緩沖液”(一種Amersham Corp.，Div.，AmershamInternational，Arlington Heights，IL，USA商業(yè)化的雜交緩沖液)中雜交2小時(shí)。雜交后的尼龍模以常規(guī)的方式?jīng)_洗、干燥并且以常規(guī)方式進(jìn)行放射自顯影。放射自顯影中觀察到的雜交信號(hào)于“IMAGE MASTER”(一種由Pharmacia LKBBiotechnology AB，Uppsala，Sweden商業(yè)化的圖形分析系統(tǒng)上)進(jìn)行分析，然后數(shù)字化表示雜交信號(hào)的強(qiáng)度。根據(jù)數(shù)字，通過(guò)以下方法計(jì)算來(lái)自模式株DNA的點(diǎn)的相對(duì)強(qiáng)度(％)，即將節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450的DNA點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度看作100，并且用作該微生物與模式株間DNA同源性的指標(biāo)。結(jié)果列于表1中。
表1微生物菌株雜交信號(hào)強(qiáng)度黑藍(lán)節(jié)桿菌，ATCC 1375242.0金黃節(jié)桿菌，ATCC 1334412.4檸檬節(jié)桿菌，ATCC 1162436.2成晶節(jié)桿菌，ATCC 1548131.6球形節(jié)桿菌，ATCC 8010 55.1煙草節(jié)桿菌，ATCC 1523618.8氧化節(jié)桿菌，ATCC 1435828.3滋養(yǎng)節(jié)桿菌，ATCC 1334624.6原玻璃蠅節(jié)桿菌，ATCC 1927129.3分枝節(jié)桿菌，ATCC 1372798.6產(chǎn)脲節(jié)桿菌，ATCC 7562 42.3粘節(jié)桿菌，ATCC 19584 0.0節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450 100如表1中所示，來(lái)自分枝節(jié)桿菌模式菌株，ATCC 13727的DNA點(diǎn)的雜交信號(hào)強(qiáng)度高達(dá)98.6％。此數(shù)據(jù)顯示在此實(shí)施例中所用的12種模式菌株中，節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450與其中的分枝節(jié)桿菌模式菌株，ATCC 13727具有最高的同源性。上述結(jié)果顯示，節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450為與分枝節(jié)桿菌模式菌株，ATCC 13727密切相關(guān)的新的微生物。
實(shí)施例2非還原性糖形成酶實(shí)施例2-1酶的制備制備由以下成份所組成的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基1.0w/v％的“PINE-DEX#4”(一種由Matsutani Chemical Ind.，東京，日本所商業(yè)化的糊精)、0.5w/v％的蛋白胨、0.1％w/v％的酵母提取物、0.1w/v％的磷酸二氫鈉、0.06w/v％的磷酸氫二鉀、0.05w/v％的硫酸鎂和水，并將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH7.0。將大約100ml等分的培養(yǎng)基置于500-ml Erlenmeyer瓶中，然后于120℃高壓蒸汽滅菌20分鐘并且冷卻，然后接種節(jié)桿菌屬的種S34，F(xiàn)ERM BP-6450種子液，并且在260rpm的振蕩條件下于37℃培養(yǎng)48小時(shí)，以獲得種子培養(yǎng)物。
除了含有0.05w/v％的“KM-75”(一種由日本東京Shi-Etsu化工有限公司商業(yè)化的抗泡沫劑)外，將與用于種子培養(yǎng)物中的相同的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基大約20升置于30升的發(fā)酵罐中，滅菌，冷卻至37℃，并且用1v/v％的種子培養(yǎng)物接種至該培養(yǎng)基中，然后在有氧并攪拌的條件下于37℃，及5.5-7.5的pH培養(yǎng)大約72小時(shí)。
取樣得到的部分培養(yǎng)物并離心，從而分離成細(xì)胞和培養(yǎng)物上清。將細(xì)胞超聲破碎并且離心，從而從細(xì)胞提取物中收集上清。對(duì)每個(gè)培養(yǎng)物上清及細(xì)胞提取物中非還原性糖形成酶活性的測(cè)定顯示酶活性相對(duì)較低。后者相對(duì)于1毫升培養(yǎng)物中顯示出大約0.1單位。
實(shí)施例2-2酶的純化將按實(shí)施例2-1中方法獲得的大約80升培養(yǎng)物以8,000rpm離心30分鐘，從而獲得大約800克濕重細(xì)胞。將濕細(xì)胞懸浮于2升10M的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，并且用“MODEL UH-600”(一種日本東京SMT公司商業(yè)化的超聲勻漿器)處理。得到的培養(yǎng)物以10,000rpm離心30分鐘，從而獲得大約2升的培養(yǎng)物上清。向此培養(yǎng)物上清中加入硫酸銨并且使其溶解，從而得到0.7的飽和度，使該混合物在4℃靜置24小時(shí)并以10,000rpm離心30分鐘從而獲得沉淀物。將這樣獲得的沉淀物溶解于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，并且對(duì)與上述同樣的新鮮緩沖液制品透析48小時(shí)，然后將透析的內(nèi)部溶液以10,000rpm離心30分鐘從而去除不溶性物質(zhì)。將大約1升的所得溶液用裝入了大約1.3升“SEPABEADS FP-DA13 GEL”(一種由日本東京Mitsubishi化工有限公司商業(yè)化的陰離子交換劑)的柱進(jìn)行離子交換柱層析。用含有從0M增加到0.6M鹽的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)這種線性梯度緩沖液進(jìn)行洗脫步驟。分級(jí)分離柱中的洗脫物，分別分析這些級(jí)分的非還原性糖形成酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在用具有大約0.2M鹽濃度的緩沖液洗脫后收集到的級(jí)分中發(fā)現(xiàn)有異常高的酶活性。
將硫酸銨加入到得到的溶液中以得到1M的濃度，使該混合物在4℃靜置12小時(shí)，以10,000rpm離心30分鐘從而收集上清。將這樣得到的的上清用裝入了“BUTYL TOYOPEARL 650M GEL”(一種由日本東京Tosoh公司商業(yè)化的疏水凝膠)的柱進(jìn)行疏水柱層析。所用的凝膠體積大約300ml，用含有1M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡后使用。在進(jìn)樣過(guò)程中用含有從1M降低到0M硫酸銨的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)線性梯度緩沖液進(jìn)行洗脫步驟。分級(jí)分離柱中的洗脫物，并且分別分析這些級(jí)分的非還原性糖形成酶活性。結(jié)果，在以具有大約0.75M鹽濃度的緩沖液洗脫后收集到的級(jí)分中發(fā)現(xiàn)有異常高的酶活性，將這些級(jí)分合并在一起。
將獲得的溶液于10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中透析，將所得透析過(guò)的內(nèi)部溶液以10,000rpm離心30分鐘從而收集上清，然后將此上清用裝入大約40ml“DEAE TOYOPEARL 650S GEL”(一種由日本東京Tosoh公司商業(yè)化的陰離子交換劑)的柱進(jìn)行離子交換柱層析。在進(jìn)樣過(guò)程中用含有從0M增加到0.2M的線性鹽水溶液進(jìn)行洗脫步驟。分級(jí)分離柱中的洗脫物，并且分別分析這些級(jí)分的非還原性糖形成酶活性。結(jié)果，在以具有大約0.15M鹽濃度的緩沖液洗脫后收集到的級(jí)分中發(fā)現(xiàn)有異常高的酶活性。將這樣得到的溶液進(jìn)一步用裝入了大約380ml“ULTROGELR AcA44 GEL”(一種由法國(guó)Sepracor/IBF s.a. Villeneuve laGarenne商業(yè)化的用于凝膠柱層析的凝膠)的柱進(jìn)行凝膠柱層析，然后收集具有所需酶活性的級(jí)分。上述純化步驟中非還原性糖形成酶活性、比活性和產(chǎn)率的水平列于表2中。
表2純化步驟非還原性糖形 比活性 產(chǎn)率成酶活性(單位/mg蛋白) (％)細(xì)胞提取物 8,000 - 100以硫酸銨鹽析 7,500 0.2 94后透析內(nèi)部溶液來(lái)自SEPABEADS 5,200 0.7 65柱的洗脫物來(lái)自疏水柱的 2,600 6.3 33洗脫物來(lái)自TOYO 91067.411PEARL的洗脫物凝膠過(guò)濾洗脫物 59.0 168 0.7將從上面凝膠過(guò)濾層析中洗脫和收集的溶液以常規(guī)方式用7.5w/v％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，得到單一的蛋白條帶。該數(shù)據(jù)顯示來(lái)自此凝膠過(guò)濾層析的洗脫物為純化至電泳純形式的非還原性糖形成酶純化標(biāo)本。
實(shí)施例2-3酶的特性實(shí)施例2-3(a)作用制備含有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖或麥芽七糖的20％水溶液作為酶底物并且與利用實(shí)施例2-2方法獲得的非還原性糖形成酶純化標(biāo)本的2單位/克底物(d.s.b)混合，在50℃于pH6.0酶促反應(yīng)48小時(shí)。將此反應(yīng)混合物脫鹽，并且用日本東京Mitsubishi化工有限公司商業(yè)化的“MCI GEL CK04SS COLUMN”2根層析柱(它們串聯(lián)使用)進(jìn)行高效液相色譜(下文簡(jiǎn)稱“HPLC”)分析，然后測(cè)定反應(yīng)混合物的糖組成。用于HPLC的條件和儀器如下用“CO-8020”(一種由日本東京Tosoh公司商業(yè)化的柱烤爐)將柱維持于85℃。以0.4ml/min的流速送入水作為流動(dòng)相。洗脫結(jié)果于“RI-8020”(一種由日本東京Tosoh公司商業(yè)化的差動(dòng)式折射計(jì))上進(jìn)行分析。結(jié)果列于表3中。
表3底物反應(yīng)產(chǎn)物洗脫時(shí)間(分鐘) 百分?jǐn)?shù)(％)萄萄糖 葡萄糖 57.2 100.0麥芽糖 麥芽糖 50.8 100.0麥芽三糖葡糖基海藻糖43.2 36.2麥芽三糖46.2 63.8麥芽四糖麥芽糖基海藻糖 38.9 87.2麥芽四糖42.3 12.8麥芽五糖麥芽三糖基海藻糖35.4 93.0麥芽五糖38.4 7.0麥芽六糖麥芽四糖基海藻糖32.7 93.8麥芽六糖35.2 6.2麥芽七糖麥芽五糖基海藻糖30.2 94.2麥芽七糖32.4 5.8正如來(lái)自表3的結(jié)果證明，每個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物基本包括剩余的底物和新形成的非還原性糖α-葡糖基海藻糖，α-麥芽糖基海藻糖，α-麥芽三糖基海藻糖，α-麥芽四糖基海藻糖，或α-麥芽五糖基海藻糖(在表3，表示為葡糖基海藻糖，麥芽糖基海藻糖，麥芽三糖基海藻糖，麥芽四糖基海藻糖，或麥芽五糖基海藻糖)。在反應(yīng)混合物中基本沒(méi)有檢測(cè)到其它多糖。將非還原性糖占每個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物的百分?jǐn)?shù)認(rèn)為和評(píng)估為生產(chǎn)率，結(jié)果表明葡萄糖多聚化程度為3的α-葡糖基海藻糖的產(chǎn)量是相對(duì)低的，具有葡萄糖多聚化程度為4或更高的糖如麥芽糖基海藻糖，α-麥芽三糖基海藻糖，α-麥芽四糖基海藻糖，和α-麥芽五糖基海藻糖的產(chǎn)量高達(dá)約85％或更高。沒(méi)有觀察到從葡萄糖和麥芽糖形成非還原性糖。
實(shí)施例2-3(b)分子量以常用方法，與日本東京日本Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室出售的分子量標(biāo)記平行試驗(yàn)，利用10w/v％聚丙烯酰胺凝膠將按實(shí)施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶的純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE。在電泳后與分子量標(biāo)記的位置比較，該非還原性糖形成酶顯示分子量約為75,000±10,000道爾頓。
實(shí)施例2-3(c)等電點(diǎn)利用含有2w/v％可在Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，瑞典銷售的“AMPHOLINE”(一種兩性電解質(zhì))的聚丙烯酰胺凝膠，將按實(shí)施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶的純化樣品進(jìn)行等電點(diǎn)電泳。在等電點(diǎn)電泳后，測(cè)量凝膠的pH，表明非還原性糖形成酶具有約4.5±0.5的等電點(diǎn)。
實(shí)施例2-3(d)最適溫度和pH利用按實(shí)施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶的純化樣品，檢測(cè)溫度和pH對(duì)非還原性糖形成酶的活性的影響。當(dāng)檢測(cè)溫度的影響時(shí)，與酶活性的測(cè)試類似地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不同的是在不同溫度讓酶反應(yīng)。在pH的影響的檢測(cè)中，與酶活性的測(cè)試類似地進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，不同的是利用適當(dāng)?shù)?0毫摩爾/升緩沖液在不同pH與酶反應(yīng)。在每個(gè)檢測(cè)中，將每個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中底物還原能力降低水平的相對(duì)值(％)計(jì)算成它相應(yīng)的相對(duì)酶活性(％)。圖1顯示了溫度影響的結(jié)果，圖2顯示了pH影響的結(jié)果。圖1和2的橫軸分別顯示反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH。如圖1所示，當(dāng)在pH6.0溫育60分鐘時(shí)，酶的最適溫度約為50℃。也如圖2所示，當(dāng)在50℃溫育60分鐘時(shí)，酶的最適pH約為pH6.0。
實(shí)施例2-3(e)熱和pH穩(wěn)定性利用按實(shí)施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶的純化樣品，檢測(cè)酶對(duì)熱和pH的穩(wěn)定性。根據(jù)酶活性的測(cè)試的方法，通過(guò)利用20毫摩爾/升磷酸鹽緩沖液(pH7.0)稀釋樣品，在預(yù)定的溫度溫育稀釋液60分鐘，冷卻溫育的稀釋液，和確定稀釋液中剩余的酶活性，即可檢測(cè)熱穩(wěn)定性。根據(jù)酶活性的測(cè)試方法，通過(guò)利用具有適當(dāng)?shù)牟煌琾H的50毫摩爾/升緩沖液稀釋樣品，在4℃溫育稀釋液24小時(shí)，調(diào)節(jié)稀釋液pH到pH6，確定稀釋液中剩余的酶活性，即可檢測(cè)酶的pH穩(wěn)定性。圖3和4中分別顯示了酶的熱和pH穩(wěn)定性的結(jié)果。圖3和4的橫軸分別顯示了酶的溫育溫度和pH。如圖3所示，酶在高達(dá)約55℃的溫度下穩(wěn)定，如圖4所示，酶在約pH5.0-10.0的pH范圍是穩(wěn)定的。
這些結(jié)果證明，按實(shí)施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶是具有中等溫度范圍的最適溫度的本發(fā)明非還原性糖形成酶。
實(shí)施例2-4部分氨基酸序列對(duì)蒸餾水透析按實(shí)施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶純化樣品的部分，以便獲得蛋白質(zhì)重量約80微克的樣品用于分析N-末端氨基酸序列。利用美國(guó)，F(xiàn)oster市，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司出售的蛋白質(zhì)序列儀“473A型蛋白質(zhì)序列儀”，分析N-末端氨基酸序列直到N末端的20個(gè)氨基酸殘基。測(cè)序結(jié)果揭示出的N末端氨基酸序列是SEQ ID NO4的部分氨基酸序列。對(duì)10毫摩爾/升Tris-HCl緩沖液(pH9.0)透析按實(shí)施例2-2的方法獲得的非還原性糖形成酶純化樣品的部分，并且利用日本，東京，Tosoh公司出售的超濾膜“ULRACENT-30”，以常用的方法濃縮到約1毫克/毫升溶液。在0.2毫升濃縮物中加入10微克日本東京Wako純化化學(xué)工業(yè)公司出售的試劑胰蛋白酶“TPCK-TRYPSIN”，使其在30℃反應(yīng)22小時(shí)，以便消化該酶形成肽。通過(guò)利用直徑3.9毫米和長(zhǎng)度150毫米的美國(guó)，Milford，Millipore公司，Waters Chromatography Div.，的產(chǎn)品“μBONDASPHERE C18 COLUMN”，將反應(yīng)混合物進(jìn)行反相HPLC，以便分離肽。在大氣溫度下，利用含有0.1v/v％的三氟乙酸和在60分鐘內(nèi)從24v/v％增加到48v/v％的乙腈的水溶液加在柱中進(jìn)行洗脫步驟，加洗脫液期間的流速是0.9毫升/分鐘。通過(guò)在波長(zhǎng)210納米檢測(cè)吸光值，從而檢測(cè)從柱中洗脫下來(lái)的肽。與其它物質(zhì)很好分離開的兩個(gè)肽，即分離出了在約2小時(shí)保留時(shí)間洗脫的“S5”和在30分鐘保留時(shí)間洗脫的“S8”，分別真空干燥，在含有50微升0.1v/v％三氟乙酸的50v/v％乙腈水溶液中溶解。將肽溶液進(jìn)行蛋白質(zhì)序列分析，以便分析多達(dá)20個(gè)氨基酸殘基。從肽“S5”和“S8”，獲得了SEQ ID NO5和6的氨基酸序列。
實(shí)施例3編碼非還原性糖形成酶的DNA實(shí)施例3-1基因文庫(kù)的構(gòu)建和篩選除了設(shè)定培養(yǎng)的溫度和時(shí)間分別為27℃和24小時(shí)之外，與實(shí)施例2-1類似地培養(yǎng)節(jié)桿菌S34，F(xiàn)ERM BP-6450。
離心培養(yǎng)物以便取出細(xì)胞，然后懸浮于適當(dāng)量的Tris-EDTA-鹽緩沖鹽(下文中命名為“TES緩沖液”)(pH8.0)中。以占細(xì)胞懸浮液體積0.05w/v％的量混合溶菌酶，接著在37℃溫育30分鐘。在-80℃停留1小時(shí)以冷凍得到的混合物，然后與在60℃預(yù)熱的TES緩沖液和苯酚混合物混合和充分?jǐn)嚢?，冷卻和離心收集形成的上清液。在上清液中加入冷乙醇，然后收集形成的沉淀物，在適當(dāng)量的SSC緩沖液中溶解(pH7.1)，與7.5微克核糖核酸酶和125微克蛋白酶混合，并且在37℃溫育1小時(shí)?；旌系玫降幕旌衔锊⑶遗c氯仿/異戊醇混合攪拌，使其靜置，接著收集形成的上層，在該層中加入冷乙醇，并且收集形成的沉淀物。利用冷的70v/v％乙醇漂洗沉淀，真空干燥獲得DNA，接著在SSC緩沖液(pH7.1)中溶解，使?jié)舛燃s為1毫克/毫升，并且在-80℃冷凍。
取50微升的DNA，與約50單位的限制酶KpnI混合，在37℃溫育1小時(shí)以便消化DNA。根據(jù)試劑盒附帶的方案，將3微克消化的DNA和0.3微克美國(guó)，加里弗尼亞，Stratagene克隆系統(tǒng)銷售的質(zhì)粒載體“pBluescript II SK(+)”利用Takara Shuzo公司，東京，日本銷售的“DNA連接試劑盒”連接，稱重，反應(yīng)。根據(jù)常規(guī)的感受態(tài)細(xì)胞方法，利用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100微升美國(guó)，加里弗尼亞，StratageneCloning Systems銷售的大腸桿菌菌株“Epicurian(oli XL1-Blue”，由此獲得了基因文庫(kù)。
將這樣獲得的基因文庫(kù)接種到含有10克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取物，5克/升氯化鈉，75毫克/升氨芐青霉素鈉鹽，和50毫克/升，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷的瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板(pH7.0)上，并且在37℃溫育18小時(shí)。將培養(yǎng)基上形成的白色菌落約5000個(gè)以常用方法固定在Amersham公司，Div.Amersham Intermational，Arlington Heights，IL，美國(guó)銷售的尼龍膜“HYBOND-N-+”上。根據(jù)實(shí)施例2-4中顯示的SEQ ID N05氨基酸序列中的1-8個(gè)氨基酸殘基，化學(xué)合成具有SEQ ID NO18核苷酸序列的寡核苷酸，并且以常用方法，利用[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶標(biāo)記，以獲得探針。利用該探針，通過(guò)常規(guī)菌落雜交方法篩選已經(jīng)固定在尼龍薄膜上和前面獲得的菌落。在含有6×SSC，5×Denhalt溶液，和100毫克/升變性鯨精子DNA的雜交溶液中在65℃進(jìn)行雜交16小時(shí)。在雜交后，利用6×SSC，在65℃洗滌上面的尼龍薄膜30分鐘，利用含有0.1w/v％SDS的2×SSC在65℃進(jìn)一步洗滌2小時(shí)。以常用方法將得到的尼龍薄膜進(jìn)行放射自顯影，然后根據(jù)放射自顯影觀察到的信號(hào)，選擇與探針強(qiáng)烈雜交的菌落，并且命名為“GY1”，作為轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例3-2核苷酸序列的譯碼根據(jù)常用方法，在含有100微克/毫升鈉形式氨芐青霉素的L肉湯培養(yǎng)基(pH7.0)中接種轉(zhuǎn)化體GY1，并且在振搖條件下，在37℃培養(yǎng)24小時(shí)。在完成培養(yǎng)后，通過(guò)離心從培養(yǎng)物收集增殖細(xì)胞，并且利用常規(guī)堿性SDS方法處理以便提取重組DNA。將重組DNA命名為pGY1。利用上面的探針，在常規(guī)Southern印跡技術(shù)上分析重組DNA，pGY1，并且根據(jù)分析的數(shù)據(jù)，構(gòu)建了如圖5所示的限制圖譜。如圖5所示，表明了重組DNA，pGY1含有由包括黑線表示的來(lái)自節(jié)桿菌S34，F(xiàn)ERM BP-6450的約5,500個(gè)堿基對(duì)(bp)的堿基組成的一段核苷酸序列，并且該重組DNA在限制酶EcoRI的兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)之間的約4,000bp堿基的區(qū)域內(nèi)，含有黑線區(qū)域內(nèi)的黑箭頭表示的編碼本發(fā)明非還原性糖形成酶的核苷酸序列。根據(jù)這一結(jié)果，利用EcoRI完全消化重組DNA pGY1，然后利用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳分離和純化約4,000bp的DNA片段。利用常規(guī)連接方法連接已經(jīng)利用EcoRI消化的美國(guó)，加里弗尼亞Stratagene Cloning System銷售的質(zhì)粒載體“pBluescriptII SK(+)”和該DNA片段。利用連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化美國(guó)，加里弗尼亞，StratageneCloning System銷售的大腸桿菌菌株“XL1-BLUE”以便獲得轉(zhuǎn)化體。以常用方法，從轉(zhuǎn)化體提取重組DNA，以常規(guī)方法證實(shí)它含有色括約4000bp堿基的前面所述DNA片段，并且命名為“pGY2”。導(dǎo)入了“pGY2”的轉(zhuǎn)化體命名為“GY2”。
以常用的二脫氧方法分析重組DNA pGY2的核苷酸序列，表明它含有包括起源于節(jié)桿菌S34，F(xiàn)ERM BP-6450的3252個(gè)減基對(duì)的SEQ ID NO19核苷酸序列。核苷酸序列編碼如SEQ ID NO19平行所示的氨基酸序列。比較實(shí)施例2-4所證實(shí)作為本發(fā)明非還原性糖形成酶部分氨基酸序列的氨基酸序列SEQ ID NO4-6，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO4-6的氨基酸序列與SEQ ID NO19中的氨基酸2-21，619-638，和98-117完全一致。這些數(shù)據(jù)表明，實(shí)施例2中獲得的本發(fā)明非還原性糖形成酶包括SEQ ID NO19的氨基酸2-757，或具有SEQ ID NO1的氨基酸序列，并且SEQ ID NO19的堿基746-3013的核苷酸序列，或SEQ ID NO7的核苷酸序列編碼節(jié)桿菌S34，F(xiàn)ERM BP-6450的酶。重組DNA pGY2的結(jié)構(gòu)在圖6中。
根據(jù)Lipman，David J.在科學(xué)，227卷，1,435-1,441(1985)中介紹的方法，利用軟件開發(fā)公司，東京，日本銷售的計(jì)算機(jī)程序“GENETYX-MAC，VER.8”比較按上面實(shí)施例2的方法獲得的本發(fā)明非還原性糖類形成酶的氨基酸序列和具有非還原性糖類形成活性的已知酶的氨基酸序列，以便計(jì)算它們的同源性(％)。用作已知酶的酶是來(lái)自日本專利
發(fā)明者山本拓生, 丸田和彥, 久保田倫夫, 福田惠溫, 三宅俊雄 申請(qǐng)人:株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所