專利名稱：一種能特異性殺滅eb病毒相關(guān)腫瘤的重組病毒及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種能在Epstein-Barr病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖及表達(dá)晚期基因，而在Epstein-Barr病毒陰性正常細(xì)胞內(nèi)不增殖及不表達(dá)晚期基因的重組溶細(xì)胞性病毒，及其構(gòu)建和增殖的方法。
惡性腫瘤嚴(yán)重危及人類的生命健康。目前對(duì)惡性腫瘤的常規(guī)治療仍為手術(shù)及放、化療，這種常規(guī)治療對(duì)極大多數(shù)腫瘤的療效仍不十分理想，對(duì)于極大多數(shù)化療藥物而言，其治療指數(shù)仍較低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故這種治療方案通常伴有明顯的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞而不影響正常細(xì)胞的方法對(duì)腫瘤治療非常重要，這種選擇性殺滅腫瘤細(xì)胞的方法主要依賴于腫瘤細(xì)胞的特異性標(biāo)記，其療效也決定于該腫瘤標(biāo)記是否嚴(yán)格限制于腫瘤細(xì)胞內(nèi)。
人類腫瘤大約15％與病毒有關(guān)，數(shù)種與人腫瘤相關(guān)的病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)潛伏感染，而在正常細(xì)胞中則潛伏感染率非常低及病毒負(fù)荷很小。如Epstein-Barr病毒(按常規(guī)簡(jiǎn)稱EB病毒，記為EBV，下同)在Barkitt’s淋巴瘤和未分化鼻咽癌所有細(xì)胞內(nèi)均可潛伏感染，其病毒基因EBNA-1在上述腫瘤細(xì)胞中均表達(dá)，而在正常細(xì)胞中則非常低，其外周血中單個(gè)核細(xì)胞中陽(yáng)性率為10-5-10-6，在成人其它正常細(xì)胞中幾乎均呈陰性。又如HPV病毒在90％宮頸癌細(xì)胞均可潛伏感染，其宮頸癌細(xì)胞通常均表達(dá)HPV病毒的E6及E7基因，而這種基因在正常細(xì)胞中表達(dá)率極低或陰性。因此，在與這種病毒相關(guān)的腫瘤病人中，其病毒蛋白可作為非常好的腫瘤標(biāo)記。人們已將這些腫瘤細(xì)胞上的病毒蛋白已作為免疫治療的特異性靶目標(biāo)，但由于在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，為逃避免疫監(jiān)控，腫瘤細(xì)胞發(fā)生很多變化，如很多腫瘤細(xì)胞MHC 1類基因表達(dá)及抗原提呈能力下調(diào)，缺乏免疫細(xì)胞刺激的第二信號(hào)，因而不能有效激活細(xì)胞毒T細(xì)胞來(lái)殺滅腫瘤細(xì)胞，因此在臨床上免疫治療療效并十分不理想。
基因治療是近年興起的一種新的治療惡性腫瘤方法。其基因轉(zhuǎn)染方法分病毒法及非病毒法兩種。病毒法通常采用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒及痘苗病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外具有較高的轉(zhuǎn)染率，但病毒滴度偏低，在體內(nèi)轉(zhuǎn)染率較低，而且只能感染分裂期的細(xì)胞，同時(shí)具有整合至染色體，存在癌變的可能性的缺點(diǎn)。腺相關(guān)病毒具有轉(zhuǎn)染分裂及靜止細(xì)胞的能力，能持久的表達(dá)。非病毒法包括脂質(zhì)體及基因槍等方法，其轉(zhuǎn)染基因表達(dá)時(shí)間較短，轉(zhuǎn)染率較低。腺病毒是目前腫瘤基因治療中最常見(jiàn)病毒載體，已廣泛地應(yīng)用于人體基因治療方案中，具有容易生產(chǎn)及純化的特點(diǎn)，它在體內(nèi)及體外均能有效轉(zhuǎn)染分裂及靜止細(xì)胞，無(wú)致癌性。
目前腫瘤基因治療的主要障礙是不能有效地將目的基因特異性轉(zhuǎn)染所有的腫瘤細(xì)胞，而基因治療的療效與腫瘤細(xì)胞受基因轉(zhuǎn)染的數(shù)量密切相關(guān)，因此，研究與發(fā)展特異性轉(zhuǎn)染所有腫瘤細(xì)胞的病毒載體系統(tǒng)在腫瘤基因治療中至關(guān)重要。
近年來(lái)，國(guó)際上興起了腫瘤特異性增殖的病毒的研究，根據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞某些生物學(xué)特性的差異，經(jīng)過(guò)改造的病毒只能特異性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖、裂解腫瘤細(xì)胞，然后釋放出病毒顆粒，再次感染其它腫瘤細(xì)胞，再次增殖、裂解，如此產(chǎn)生放大效應(yīng)，由于病毒能夠彌散到全身各個(gè)組織及臟器，因而能感染所有腫瘤細(xì)胞，從而殺滅局部及轉(zhuǎn)移的腫瘤，而不影響正常細(xì)胞。
典型的例子有三個(gè)，第一個(gè)為E1B 55Kda蛋白失活的腺病毒ONYX-015，其主要機(jī)理為很多研究者發(fā)現(xiàn)P53在腫瘤癌變過(guò)程中起很大作用，P53突變或失活可使DNA損傷的細(xì)胞繼續(xù)分裂及復(fù)制，當(dāng)其它基因也產(chǎn)生突變時(shí)就可能發(fā)生癌變。P53也是宿主細(xì)胞抗病毒的主要蛋白，在正常細(xì)胞中病毒感染細(xì)胞后即可激活P53，如腺病毒增殖所必需的基因E1A區(qū)可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖并同時(shí)激活P53，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，使病毒復(fù)制終止。然而在極大多數(shù)情況下，正常細(xì)胞感染腺病毒后并沒(méi)有出現(xiàn)立即凋亡，主要原因腺病毒尚存在著關(guān)閉激活P53功能的蛋白即E1B 19Kda和55Kda兩個(gè)蛋白，前者作用于P53下游，阻止細(xì)胞凋亡，后者與P53結(jié)合阻止P53激活，因此野生型腺病毒能在正常細(xì)胞內(nèi)生存并復(fù)制增殖。當(dāng)腺病毒缺乏E1B區(qū)55Kda的蛋白，在正常細(xì)胞內(nèi)由于P53具有正常功能，因此，很快被激活，從而使細(xì)胞凋亡，使腺病毒不能得到有效的復(fù)制及增殖，從而使感染終止，而在P53突變或失活的腫瘤細(xì)胞中，病毒感染后，P53不能被激活，因此缺乏E1B的腺病毒，仍能復(fù)制及增殖，使病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞溶解死亡，并釋放新的病毒感染其它腫瘤細(xì)胞，這使所有腫瘤細(xì)胞均受感染并死亡。在體內(nèi)及體外ONYX-015對(duì)P53突變與功能異常的腫瘤均具有明顯療效，同時(shí)發(fā)現(xiàn)ONYX-015和化療藥物5-氟脲嘧啶(5-Fu)順鉑具有明顯的協(xié)同作用。1999年3月已結(jié)束II期臨床試驗(yàn)，對(duì)于30例常規(guī)治療后無(wú)效的頭頸部腫瘤病人，應(yīng)用該病毒聯(lián)合常規(guī)化療，結(jié)果表明19例腫瘤縮小一半以上(占63％)，其中8例腫瘤完全消退(占27％)，僅有17％病人無(wú)效，到目前已隨訪1-11月，無(wú)一例復(fù)發(fā)，且無(wú)明顯的毒性作用(1.Bischoff JR，Kim DH，Williams A，et al.Anadenovirus mutant that replicaties selective in p53-deficientes humancells.Science 1996，274，373-376.2.Heise C，Sampson-Johannes A，Williams A，et al.Onyx-015，an E1b gene-attenuated adenovirus，causestumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmentedby standard chemotherapeutic agents.Nature Medicine，1997，3，639-645.3.McCormick.Cytopathic for therapy and prophylaxis of neoplasia.1998，United States Patent 5,801,029.4.McCormick.Cytopathic for therapyand prophylaxis of neoplasia.1997，United States Patent 5,677,178.5.McCormick.Cytopathic for therapy and prophylaxis of neoplasia.1998，United States Patent 5,846,945.6.McCormick.Cytopathic fortherapy and prophylaxis of neoplasia.1999，United States Patent5,856,181)。
另一個(gè)成功的例子來(lái)自對(duì)單純瘡疹病毒的研究。單純瘡疹病毒具有明顯的嗜神經(jīng)細(xì)胞特性，在靜止細(xì)胞中其核糖核苷酸還原酶和胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(HSV-TK)為病毒DNA復(fù)制所必需的基因，這在快速生長(zhǎng)的細(xì)胞中如腫瘤細(xì)胞病毒DNA復(fù)制則不需要上述兩個(gè)基因，這是因?yàn)樵诳焖偕L(zhǎng)的細(xì)胞存在著足夠數(shù)量的核苷酸，因此，在缺乏HSV-TK的情況下也可以使病毒復(fù)制，由于正常中樞神經(jīng)細(xì)胞處于靜止期，顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞則處于生長(zhǎng)期。因此，Martuza RL等人應(yīng)用缺失HSV-TK的單純性瘡疹病毒來(lái)治療膠質(zhì)瘤，其在體外也有效溶解生長(zhǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。在裸鼠體內(nèi)應(yīng)用該病毒直接注射膠質(zhì)瘤細(xì)胞或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤可使病毒明顯繁殖，并抑制腫瘤生長(zhǎng)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)隨后被其它研究組在免疫功能正常的大鼠9L膠質(zhì)癌模型中證實(shí)。1998年開(kāi)始進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)(Mineta T，Rabkin SD，YazakiT，ea al.Attenuated multi-mutated herpes simplex virus-1 for thetreatment of malignant gliomas.Nature Med，1995，1，938-943)。第三個(gè)例子來(lái)自Rodriguez R等報(bào)告，應(yīng)用前列腺特性抗原(PSA)啟動(dòng)子插入腺病毒5型增殖所必需基因(E1A)上游區(qū)，命名為CN706，該病毒的E1A基因表達(dá)受PSA起動(dòng)子的嚴(yán)格控制，在分泌PSA的前列腺癌的細(xì)胞株LNCaP中，E1A基因表達(dá)下降99％，其腺病毒則增殖能力明顯減少，所產(chǎn)生的病毒滴度比分泌PSA的前列腺癌細(xì)胞株LNCaP低150倍，這表明腺病毒CN706能相當(dāng)特異性地在分泌PSA的細(xì)胞株中復(fù)制及增殖。用該病毒一次性注射給裸鼠體內(nèi)能有效殺死1×109個(gè)分泌PSA的LNCaP腫瘤細(xì)胞并使PSA分泌消失，而對(duì)不分泌PSA的DU145則無(wú)效，目前該研究已在美國(guó)進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)。該研究應(yīng)用真核細(xì)胞某些組織特異性激活順式作用元件控制病毒早期基因的增殖腺病毒(1.Rodriguez R，Schuur ER，Lim HY，et al.Prostate attenuated replication competent adenovirus(ARCA)CN706Aselective cytotoxic for prostate-specific antigen-positive prostate cancercells.Cancer Res，1997，57，2559-2563.2.Henderson，et al.Tissue specificand tumor growth supperssion by adenovirus comprising prostate specificantigen.1999，Umted States Patent 5,871,726.3.Henderson，et al.Tissuespecific viral vectors.1997，United States Patent 5,698,443)。
但迄今為止，尚未見(jiàn)到應(yīng)用EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活的順式作用元件控制病毒早期基因的增殖病毒的報(bào)告本發(fā)明的目的在于提供一類治療與EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒及其構(gòu)建方法，該病毒選擇性地在EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞內(nèi)的增殖，而在EB病毒陰性的正常細(xì)胞內(nèi)不增殖，從而特異性抑制或殺滅EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞。
基因轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)受反式作用因子(如轉(zhuǎn)錄因子)與順式作用元件相互作用的影響。當(dāng)缺乏或出現(xiàn)某些轉(zhuǎn)錄因子會(huì)影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。當(dāng)宿主細(xì)胞受病毒感染或潛伏感染后，病毒可使細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)生變化，從而有利于病毒的基因的表達(dá)、病毒的復(fù)制及增殖。本發(fā)明應(yīng)用病毒基因的某些順式作用元件控制目的基因，使該目的基因特異性在該病毒感染或潛伏感染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，而在病毒陰性的細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或低水平表達(dá)。應(yīng)用該病毒某些順式作用元件控制病毒增殖及復(fù)制的必需基因，從而使病毒增殖必需基因只能在上述病毒感染的細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)致病毒只能在上述病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)增殖，而在上述病毒陰性的細(xì)胞內(nèi)不增殖。這種修飾后的病毒載體可被用于在某些細(xì)胞混合物中殺滅被某種病毒感染或潛伏感染的特殊靶細(xì)胞，通過(guò)給予修飾后的病毒能選擇性地在該種靶細(xì)胞中增殖，從而使這種靶細(xì)胞被增殖的病毒選擇性的殺滅；在體外培養(yǎng)或在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)將修飾后的病毒與細(xì)胞復(fù)合物混合，病毒只能在靶細(xì)胞增殖，也就是說(shuō)除了靶細(xì)胞，其它細(xì)胞不能被這種病毒殺死。由于病毒在靶細(xì)胞內(nèi)增殖及擴(kuò)增，從而使混合細(xì)胞中的該靶細(xì)胞被殺滅，一旦靶細(xì)胞被破壞，病毒不再能夠再增殖。
本發(fā)明采用細(xì)胞專一的反應(yīng)元件是由EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活順式作用元件組成，其順式作用元件EB病毒0rip聯(lián)合Bam HI C-啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因，在EB病毒潛伏感染細(xì)胞(EBNA-1陽(yáng)性)細(xì)胞的表達(dá)量比在EB病毒陰性(EBNA-1陰性)表達(dá)量高大約1000倍，同樣應(yīng)用順式作用元件EB病毒Orip聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子(mini-HSV-TK)或SV40基本啟動(dòng)子(mini-SV40啟動(dòng)子)控制的報(bào)告基因，在EB病毒潛伏感染細(xì)胞(EBNA-1陽(yáng)性)細(xì)胞的表達(dá)量比在EB病毒陰性(EBNA-1陰性)表達(dá)量高100-1000倍。
本發(fā)明提出的能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒，它至少有一個(gè)病毒增殖所必需的基因的表達(dá)受EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活的順式作用元件控制。它由在病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種順式作用元件而構(gòu)成。該順式作用元件特異性在EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)激活，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性，而在EB病毒陰性的細(xì)胞內(nèi)不激活，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性。該順式作元件至少含有以下順序之一EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(記為FR)、EB病毒Bam HI C-啟動(dòng)子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒Bam HI C-啟動(dòng)子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子(mini-HSV-TK)或SV40基本啟動(dòng)子(mini-SV40啟動(dòng)子)以及在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。上述病毒增殖所必需的為病毒早期表達(dá)基因，如單純皰疹病毒早早期表達(dá)基因ICE4。
本發(fā)明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一個(gè)腺病毒的早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2、E4。
本發(fā)明提出的特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒與化學(xué)治療藥物(如順鉑、5-氟脲嘧啶絲裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、單克隆抗體(如抗鼻咽癌細(xì)胞抗體等)一起可以組成復(fù)合物，其作為抗腫瘤藥物效果更好。
本發(fā)明提出的特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組腺病毒構(gòu)建方法如下，將兩個(gè)分別含有腺病毒左臂及右臂的載體共轉(zhuǎn)染給會(huì)產(chǎn)生重組腺病毒的細(xì)胞，這兩個(gè)腺病毒載體中至少有一個(gè)載體中腺病毒早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2及E4區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種順式作用元件，該順式作用元件特異性在EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)激活，產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性，而在EB病毒陰性的細(xì)胞內(nèi)不激活，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性。該順式作元件至少含有以下順序之一EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒Bam HI C-啟動(dòng)子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒Bam HI C-啟動(dòng)子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子(mini-HSV-TK)或SV40基本啟動(dòng)子(mini-SV40啟動(dòng)子)、以及在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。
將EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件插入腺病毒早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域可以通過(guò)以下方法完成通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在腺病毒早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域做一個(gè)酶切位點(diǎn)，通過(guò)酶切，將上述順式作用元件插入該位點(diǎn)，從而使腺病毒早期基因受控于EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活的順式作用元件。
人類腺病毒有6個(gè)不同亞屬，分為A、B、C、D、E及F。它們對(duì)宿主細(xì)胞的親嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。本發(fā)明以腺病毒C亞屬中的5型(Ad5)作為例證對(duì)本發(fā)明加以進(jìn)一步具體說(shuō)明，但不限于該例證。腺病毒基因分為兩類，早期基因與晚期基因，早期基因包括E1A、E1B、E2、和E4。E1a基因在病毒感染后即表達(dá)(0-2小時(shí))，是最早表達(dá)腺病毒蛋白，它作為反式激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是其它病毒早期基因蛋白表達(dá)所必需的，同時(shí)它反式激活其它病毒啟動(dòng)子。因此，缺乏E1A基因的表達(dá)，腺病毒DNA復(fù)制的必需基因產(chǎn)物不能產(chǎn)生，腺病毒不能有效復(fù)制及增殖。
E1b基因的轉(zhuǎn)錄受E1A蛋白的激活，其蛋白功能是晚期病毒基因mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞漿中所必需的，E1B基因表達(dá)缺失可導(dǎo)致病毒后期基因表達(dá)不佳及不能關(guān)閉宿主細(xì)胞蛋白的合成。
E4基因位于病毒基因組的右未端，其開(kāi)放閱讀框3(ORF3)和ORF6能提高腺病毒主要晚期基因mRNA的水平。缺乏ORF3及ORF6蛋白功能，其病毒滴度比野生滴度低106倍。
腺病毒系統(tǒng)是由兩個(gè)載體組成，一個(gè)載體提供腺病毒的左臂部分，另一個(gè)載體提供右臂，這兩個(gè)載體至少有500nt的同源重組區(qū)，然而其轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生重組腺病毒，載體系統(tǒng)質(zhì)粒pXC1(Mckinnon，Gene 1982，1939-42)，含有野生型Ad5左臂。pBHG10提供缺乏E3區(qū)Ad5右臂或pBHGE3提供Ad5右臂(含E3區(qū))。
Ad5 E1A的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)分別位于病毒基因組約560nt及610nt，在這個(gè)區(qū)域插入某種病毒順式作用元件，如EB病毒的Orip聯(lián)合BamH I C啟動(dòng)子。首先，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在這區(qū)域構(gòu)建一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，PCR引物將被限制于Ad5基因組或攜帶Ad5部分基因組的質(zhì)粒中，如有pBR322為背景的引物。應(yīng)用含有EcoR I位點(diǎn)pBR322序列及含有Xba I位點(diǎn)Ad5序列，通過(guò)二次疊加PCR方法，在該區(qū)域創(chuàng)建一個(gè)新的唯一個(gè)酶切位點(diǎn)，該確切位點(diǎn)將用于插入病毒順式作用元件。
相似的方案也被用于插入病毒順式作用元件，來(lái)調(diào)節(jié)E1b Ad5的E1B啟動(dòng)子，由一個(gè)對(duì)Sp1單一高親和為識(shí)別物和一個(gè)TATAbox組成這區(qū)域位于1636到Sub-1701nt。通過(guò)插入病毒順式作用元件在這個(gè)區(qū)域，將提供給E1B在細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。
本發(fā)明還提出前述增殖型重組病毒增殖方法，即將重組病毒(如重組腺病毒)感染EB病毒感染或潛伏感染的哺乳類細(xì)胞，從而使重組病毒特異性地在EB病毒感染或潛伏感染的哺乳類細(xì)胞中增殖。
使用只能在EB病毒感染或潛伏感染的特殊靶細(xì)胞內(nèi)增殖的腺病毒，在靶細(xì)胞允許腺病毒增殖并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在體外培養(yǎng)或在動(dòng)物體內(nèi)通過(guò)將修飾后的腺病毒與細(xì)胞復(fù)合物混合，腺病毒只能在EB毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)增殖，也就是說(shuō)除了EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞外，其他細(xì)胞不能被這種腺病毒殺死，由于腺病毒在EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞內(nèi)增殖及擴(kuò)增，從而使混合細(xì)胞中的該EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞被殺滅，一旦該EB病毒感染或潛伏感染的細(xì)胞被破壞，腺病毒不再能夠再增殖。
本發(fā)明提出上述重組病毒實(shí)際應(yīng)用。例如將該重組病毒(如重組腺病毒)用于體外感染EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性。將重組病毒(例如重組腺病毒)用于抑制EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。將重組病毒(例如重組腺病毒)用于體內(nèi)選擇性殺滅EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明提供一類治療EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，這種重組病毒可用于治療EB病毒相關(guān)腫瘤，包括鼻咽癌、何杰金氏淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、胃癌等。
2.本發(fā)明提供一類治療EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒的構(gòu)建方法。該方法簡(jiǎn)便易行可用于構(gòu)建多種治療EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒。
3.本發(fā)明提供一種在體內(nèi)及體外殺滅EB病毒潛伏感染或感染腫瘤細(xì)胞、而不影響EB病毒陰性的正常細(xì)胞的方法。
實(shí)施例1含有EB病毒順式作用元件的載體的構(gòu)建以pGEM-T-easy作為基礎(chǔ)載體，在多克隆位點(diǎn)中插入EB病毒順式作用元件Orip聯(lián)合BamH I C-啟動(dòng)子。pGEM-T-easy載體購(gòu)于Promega公司，該載體在3’-未端含有單個(gè)T，從而提高PCR片段插入的效率。EB病毒DNA從淋巴瘤細(xì)胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法參見(jiàn)QIAGEN公司QIAamp Blood試劑盒的操作說(shuō)明。EB病毒Orip(位于EB病毒B95-8株nt7337-9134)引物為015’-引物(含有Age I酶切位點(diǎn))GGG AAG CTT ACC GGT GCA TGCAGG AAA AGG ACA AGC023’-引物(含有部分EB病毒BamH I C-啟動(dòng)子序列) CAG GAAGGT TCA ATC AGA GGG GCC TGT GTAEB病毒BamH I C-啟動(dòng)子(位于EB病毒B95-8株nt10311-11337)035’-引物(含有部分EB病毒Orip序列)CCC TCT GAT TGA ACCTTC CTG TGT TCT CCC CA043’-引物(含有Age I酶切位點(diǎn))GGG GGG GTC GAC ACC GGT GATCTA AAA TTT GCA GCA GA應(yīng)用兩次疊加PCR技術(shù)(方法參見(jiàn)PCR Protools Current Methodsand Applications，White BA主編，Humana Press Inc.1993年出版-文獻(xiàn)1)將EB病毒Orip和BamH I C-啟動(dòng)子產(chǎn)生融合啟動(dòng)子，將其融合啟動(dòng)子PCR片段插入pGEM-T-easy載體中(方法參見(jiàn)Promega公司操作說(shuō)明書(shū))。將該片段進(jìn)行DNA測(cè)序，其融合啟動(dòng)子序列完全正確，記為CHEB1。
以pCAT-Basic為基礎(chǔ)載體，在其多克隆位點(diǎn)中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)聯(lián)合SV40基本啟動(dòng)子(mini-SV40)，pCAT-Basic購(gòu)自Promega公司。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40啟動(dòng)子。前者的模板為CHEB1，后者的模板為pCAT-Control(購(gòu)于Promega公司)。EB病毒Orip中的FR的引物為015’-引物(含有Hind III及Age I酶切位點(diǎn))GGG AAG CTT ACCGGT GCA TGC AGG AAA AGG ACA AGC053’-引物(含有部分mini-SV40啟動(dòng)子序列)GAG ATG CAG ATCAAT GGC ACC CCG GGG AAT ACCmini-SV40啟動(dòng)子的引物為065’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GTG CCA TTG ATC TGCATC TCA ATT AGT CAG073’-引物(含有Sal I及Age I酶切位點(diǎn))GCT AAA GTC GAC ACCTTT TTG CAA AAG CCT AGG CCT C應(yīng)用兩次疊加PCR技術(shù)(方法同前)將EB病毒Orip中的FR序列和mini-SV40啟動(dòng)子產(chǎn)生融合啟動(dòng)子，將其融合啟動(dòng)子PCR片段應(yīng)用Hind III及Sal I雙酶切插入pCAT-Basic載體Hind III及SalI位點(diǎn)中(方法參見(jiàn)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，科學(xué)出版1992出版)。將該片段進(jìn)行DNA測(cè)序，其融合啟動(dòng)子序列完全正確，記為CHEB2。
實(shí)施例2EB病毒順式作用元件控制E1A表達(dá)的減毒增殖腺病毒的構(gòu)建。
pXC.1載體購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在該載體中552bp處創(chuàng)立一個(gè)新的、唯一的Age I酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于E1A啟始密碼前12bp，其方法采用定位突變雙次PCR技術(shù)(方法參見(jiàn)前述文獻(xiàn)1)。其引物分別為085’-引物(含有EcoR I酶切位點(diǎn))TTC AAG AAT TCT CAT GTT TG093’-引物(插入一個(gè)A，從而產(chǎn)生一個(gè)Age I酶切位點(diǎn))CAG TCA CCGGTG TCG GAG C105’-引物(插入一個(gè)T，從而產(chǎn)生一個(gè)Age I酶切位點(diǎn))GCT CCG ACACCG GTG ACT GA113’-引物(含有Xba I酶切位點(diǎn))TTC TCT AGA CAC AGG TGA TG采用定位突變雙次PCR技術(shù)，PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T-easy載體中(方法參見(jiàn)Promega公司操作說(shuō)明書(shū))，命名為pGEM-T-E1a。將該片段進(jìn)行DNA測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果顯示在pXC.1質(zhì)粒bp552位點(diǎn)中插入T，從而產(chǎn)生一個(gè)新的Age I酶切位點(diǎn)，其它序列與pXC.1相同。應(yīng)用EcoR I與Xba I雙酶切pGEM-T-E1A及pXC.1質(zhì)粒，將pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1質(zhì)粒中EcoR I及BamH I位點(diǎn)中，從而使pXC.1中552插入一個(gè)T，從而產(chǎn)生一個(gè)Age I酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于E1A起始密碼前12bp，將該質(zhì)粒命名為pXC.1-Age I。
將CHEB1及CHEB2分別用Age I酶切，其酶切片段分別插入pXC-Age I質(zhì)粒中Age I酶切位點(diǎn)中，分別應(yīng)用引物03及11、06及11進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別擴(kuò)出1787bp及989bp，這表明EB病毒Orip聯(lián)合BamH I C-啟動(dòng)子及Orip中的family of 30bp repeats聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子已正向插入pXC.1質(zhì)粒Age I位點(diǎn)，即腺病毒5型E1A起始密碼子上游區(qū)12bp處，分別命名為pXC-EBVCa及pXC-EBVSV40a。
293細(xì)胞株購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而成，它含有及表達(dá)5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對(duì)其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-EBVCa與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHG10通過(guò)Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具體方法參見(jiàn)GIBCO BRL公司的操作說(shuō)明。PBHG10購(gòu)于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，但缺失E3區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過(guò)三次病毒空斑純化，即得E1A受EB病毒順式作用元件Orip聯(lián)合BamH I C-啟動(dòng)子控制的腺病毒，命名為EBV Orip-Bam HI-E1A，記為CNHK101，具體方法參見(jiàn)Gene Transfer and Expression Protocols，Murray EJ主編，Humana Press 1991出版-文獻(xiàn)2。相似的方案，我們將pXC-EBVSV40a與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGE3通過(guò)Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具體方法參見(jiàn)GIBCO BRL公司的操作說(shuō)明。PBHGE3購(gòu)于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，含有E3區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，過(guò)三次病毒空斑純化，即得E1A受EB病毒順式作用元件Orip中的FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子控制的腺病毒，命名為EBV Orip-SV40-E1A，記為CNHK102，具體方法參見(jiàn)上述文獻(xiàn)2。
實(shí)施例3EB病毒順式作用元件控制E1B表達(dá)的減毒增殖腺病毒的構(gòu)建。
pXC.1載體購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在該載體中1679bp處創(chuàng)立一個(gè)新的、唯一的Bcl I酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于E1B啟始密碼前34bp，其方法采用定位突變雙次PCR技術(shù)(方法參見(jiàn)上述文獻(xiàn)1)。其引物分別為125’-引物(含有Hpa I酶切位點(diǎn))CGT GTG TGG TTA ACG CCT TTG133’-引物(GGCG改為TGAT，從而產(chǎn)生一個(gè)Bcl I酶切位點(diǎn))ATT AGCCCA CTG ATC ATT ATA145’-引物(CGCC改為ATCA，從而產(chǎn)生一個(gè)Bcl I酶切位點(diǎn))TAT AATGATCAG TGG GCT AAT C153’-引物(含有Kpa I酶切位點(diǎn))GCG GGG GGT ACC TGC TGG A采用定位突變雙次PCR技術(shù)，PCR產(chǎn)物片段插入pGEM-T-easy載體中(方法參見(jiàn)Promega公司操作說(shuō)明書(shū))，命名為pGEM-T-E1B。將該片段進(jìn)行DNA測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果顯示在pXC.1質(zhì)粒bp1681-1684由CGCC改為ATCA，從而產(chǎn)生一個(gè)新的Bcl I酶切位點(diǎn)，其它序列與pXC.1相同。應(yīng)用Hpa I與Kpn I雙酶切pGEM-T-E1b及pXC.1質(zhì)粒，將pGEM-T-E1b中切出片段插入pXC.1質(zhì)粒中Hpa I及Kpn I位點(diǎn)中，從而使pXC.1中1681-1684由CGCC改為ATCA，從而產(chǎn)生一個(gè)Bcl I酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于E1b起始密碼前34bp，將該質(zhì)粒命名為pXC.1-Bcl I。
將CHEB2用含有Bcl I酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Bcl I酶切，其酶切片段插入pXC-Bcl I質(zhì)粒中Age I酶切位點(diǎn)中，分別應(yīng)用引物06及15進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)出580bp，這表明EB病毒Orip中的FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子已正向插入pXC.1質(zhì)粒Bcl I位點(diǎn)，即腺病毒5型E1b起始密碼子上游區(qū)34bp處，命名為pXC-EBVSV40B。
293細(xì)胞株購(gòu)于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞而成，它含有及表達(dá)5型腺病毒E1區(qū)，腺病毒DNA對(duì)其具有高轉(zhuǎn)染率。將含有5型腺病毒左臂的質(zhì)粒聯(lián)合含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)同源重組可產(chǎn)生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-EBVSV40b與含有5型腺病毒右臂的質(zhì)粒pBHGE3通過(guò)Lipofectamine共轉(zhuǎn)染至293細(xì)株，其具體方法參見(jiàn)GIBCO BRL公司的操作說(shuō)明。PBHGE3購(gòu)于加拿大Microbix Biosystems Inc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，含有E3區(qū)。共轉(zhuǎn)染后9-14天出現(xiàn)病毒空斑，過(guò)三次病毒空斑純化，即得E1b受EB病毒順式作用元件Orip中的FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子控制的腺病毒，命名為EBV Orip-SV40-E1B，記為CNHK103，具體方法參見(jiàn)前述文獻(xiàn)2。
由上述方法構(gòu)建的重組病毒的列表如下病毒 名稱 含Ad5左臂質(zhì)粒 含Ad5右臂質(zhì)粒EBVorip-BamHI C-E1A CNHK101pXC-EBVCa pBHG10EBV orip-SV40-E1ACNHK102pXC-EBVSV40a pBHGE3EBV orip-SV40-E1BCNHK103pXC-EBVSV40b pBHGE3腺病毒在293細(xì)胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(具體方法參見(jiàn)前述文獻(xiàn)2)。其CNHK101為E1A上游區(qū)插入EB病毒順式作用元件Orip聯(lián)合BamH I C啟動(dòng)子，從而使E1A受EB病毒順式作用元件Orip聯(lián)合BamH I C啟動(dòng)子控制；其CNHK102為E1A上游區(qū)插入EB病毒順式作用元件Orip中的FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子，從而使E1A受EB病毒順式作用元件Orip中的FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子控制；其CNHK103為E1b上游區(qū)插入EB病毒順式作用元件Orip中的FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子，從而使E1b受EB病毒順式作用元件Orip中的FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子控制。所有病毒均含有其本身DNA序列，其插入序列通過(guò)測(cè)序證實(shí)。
實(shí)施例4重組腺病毒體外在EB感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞增殖并特異性殺滅將CNHK101、CNHK102及CNHK103分別感染EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye、293及正常人成纖維細(xì)胞，細(xì)胞按2×105/孔接種6孔板，分別感染重組腺病毒CNHK101、CNHK102、CNHK103及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小時(shí)后應(yīng)用293細(xì)胞株測(cè)定其病毒滴度，具體方法參見(jiàn)前述文獻(xiàn)2，結(jié)果為293Jijoye 正常成纖維細(xì)胞野生型5型腺病毒 1×1057×1045×104CNHK101 1×1052×1052×10CNHK102 1×1052×1055×10CNHK103 1×1051×1051×102實(shí)施例5重組腺病毒在SCID小鼠體內(nèi)治療EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞移植瘤將4-5周齡的SCID小鼠皮下接種EB病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞株Jijoye細(xì)胞5×107，兩周后給予5×108pfu增殖型重組腺病毒CNHK101治療或用相同劑量的對(duì)照腺病毒Ad5-Lac Z，其未治療組及對(duì)照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加3倍以上，而治療組則腫瘤明顯縮小，部分腫瘤完全消失。
權(quán)利要求
1.一種能特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒，其特征在于它由要病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域插入某種順式作用元件構(gòu)成，該順式作用元件至少含有以下順序之一EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子或SV40基本啟動(dòng)子、在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件，病毒增殖必需基因?yàn)椴《驹缙诒磉_(dá)基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增殖型重組病毒，其特征在于所述病毒為腺病毒，該腺病毒增殖必需基因至少含有以下一個(gè)腺病毒的早期表達(dá)基因E1A、E1B、E2、E4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增殖型重組病毒，其特征在于該重組病毒為EBV Orip-Bam HI C-E1A，它由E1A上游區(qū)插入EB病毒順式作用元件Orip聯(lián)合Bam HI C啟動(dòng)子構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增殖型重組病毒，其特征在于該重組病毒為EBV Orip-SV40-E1A，它由E1A上游區(qū)插入EB病毒順式作用元件Orip中FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子構(gòu)成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增殖型重組病毒，其特征在于該重組病毒為EBV Orip-SV40-E1B，它由E1B上游區(qū)插入EB病毒順式作用元件Orip中FR聯(lián)合mini-SV40啟動(dòng)子構(gòu)成。
6.一種特異性殺滅EB病毒相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖型重組病毒的構(gòu)建方法，其特征在于將兩個(gè)分別含有腺病毒左臂及右臂的載體共轉(zhuǎn)染給會(huì)產(chǎn)生重組腺病毒的細(xì)胞，這兩個(gè)腺病毒載體中至少有一個(gè)載體中腺病毒早期基因E1A、E1B、E2、E4區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間表達(dá)區(qū)域插入某種順式作用元件，該順式作元件至少含有以下順序之一EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒Bam HI C-啟動(dòng)子、EB病毒中的Orip聯(lián)合EB病毒BamHI C-啟動(dòng)子、EB病毒Orip中的FR聯(lián)合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動(dòng)子(mini-HSV-TK)或SV40基本啟動(dòng)子(mini-SV40啟動(dòng)子)、以及在EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞中特異性激活的順式作用元件。
7.根據(jù)權(quán)利要求之6所述的增殖型重組病毒的構(gòu)建方法，其特征在于插入順式作用元件的方法為通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在腺病毒早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與編碼起始位點(diǎn)之間區(qū)域做一個(gè)酶切位點(diǎn)，通過(guò)酶切，將上述順式作用元件插入該位點(diǎn)，使腺病毒早期基因受控于EB病毒感染或潛伏感染細(xì)胞特異性激活的順式作用元件。
8.一種增殖型重組病毒的增殖方法，其特征在于將重組病毒感染EB病毒感染或潛伏感染的哺乳類細(xì)胞，使重組病毒特異性地在EB病毒感染或潛伏感染的哺乳類細(xì)胞中增殖。
9.一種如權(quán)利要求1所述的增殖型重組病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體外感染EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞毒性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的增殖型重組病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于抑制EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的增殖型重組病毒的應(yīng)用，其特征在于將該重組病毒用于體內(nèi)選擇性地殺滅EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一類治療EB病毒相關(guān)腫瘤的增殖型重組病毒及其構(gòu)建方法。通過(guò)在病毒早期基因上游區(qū)插入某種順式作用元件,該順式作用元件只能在EB病毒潛伏感染或感染細(xì)胞內(nèi)特異性激活,從而使該重組病毒能在而且僅限于在EB病毒潛伏感染或感染細(xì)胞內(nèi)增殖,而不在EB病毒陰性的正常細(xì)胞中增殖,從而特異性殺滅EB病毒潛伏感染或感染的腫瘤細(xì)胞,這種重組病毒可用于治療EB病毒相關(guān)腫瘤,包括鼻咽癌、何杰金氏淋巴瘤、Burkitt氏淋巴瘤、胃癌等。
文檔編號(hào)C12N15/861GK1261075SQ99124108
公開(kāi)日2000年7月26日 申請(qǐng)日期1999年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月25日
發(fā)明者錢其軍, 岑信棠, 吳孟超, 車小燕 申請(qǐng)人:錢其軍, 岑信棠, 吳孟超, 車小燕