專利名稱：水稻胚乳組織中專－表達的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地涉及一種植物基因調控序列。更具體地說，本發(fā)明涉及在水稻胚乳組織中專一表達的5′調控序列及其在基因工程中的應用。
水稻是最主要的糧食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米為主食。隨著經濟的發(fā)展，全球范圍內對稻米產量和品質提出了越來越高的要求。因而，利用各種方法來提高水稻單產、改良稻米品質，有著極其重要的意義。將現(xiàn)代生物技術運用于水稻品種改良中，可以解決一些用常規(guī)方法難以解決的問題。自九十年代以來，水稻生物技術取得了很大的發(fā)展，一些控制重要農藝性狀基因的相繼分離(Song WY等，1995年，Science，2701804-1806)和水稻轉基因技術的不斷完善(Hiei Y，Otha等，1994年，Plant J.，6271-282；劉巧泉等1998年，植物生理學報，24(3)259-271)為用基因工程技術來改良水稻品種奠定了良好的基礎。
高產水稻品種的大面積推廣帶來我國水稻產量的大幅度提高。但這些高產水稻品種目前所存在的一個普遍問題是食味品質較差，遠不能適應城鄉(xiāng)人民生活水平的提高對水稻品質的要求。稻米品質差，售價相對也較低，增產不能增收，因而挫傷農民的種糧積極性。引起這些高產品種食味品質差的主要原因是米粒的直鏈淀粉含量偏高。水稻種子胚乳中的淀粉可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種，不同水稻品種稻米胚乳中的直鏈淀粉含量有所不同，秈稻品種一般為20％～30％，粳稻品種為15％～22％，糯稻為0～2％。直鏈淀粉含量偏高則往往會使飯質變硬、口感差。
Khush等于1984年在Genetics，107141-167中報道，水稻第3號染色體上的水稻蠟質基因(waxy基因)控制著胚乳中直鏈淀粉的合成。該基因編碼結合于淀粉粒上的淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase，GBSS)[EC.2.4.1.11]，從而控制水稻花粉、胚乳和胚囊中直鏈淀粉的合成(Okagaki和Wessler，1988年，Genetics，1201137-1143)，是影響水稻胚乳中淀粉組成的一個關鍵基因。由于該基因只在水稻的花粉、胚乳與胚囊中高效表達，因此它是時空專一性表達的基因。
目前，植物基因工程中常用35S啟動子構建工程質粒，該啟動子能使外源基因在雙子葉植物中獲得較高的表達。然而35S啟動子在單子葉植物中驅動基因表達的能力不強，并且它驅動的表達無明顯的組織與器官專一性。
因此，仍希望從水稻蠟質基因中分離出能在水稻胚乳與花粉中專一性表達的啟動子和表達調控元件，從而能在單子葉植物、特別是包括水稻在內的糧食作物中指導外源基因表達。
本發(fā)明的一個目的是提供一段指導水稻胚乳組織中專一表達的水稻蠟質基因5′調控序列的分離的DNA序列。
本發(fā)明另一個目的是提供含有本發(fā)明水稻蠟質基因5′調控序列的表達載體。
本發(fā)明另一個目的是利用水稻蠟質基因5′調控序列在水稻胚乳中專一性表達外源基因。
本發(fā)明還有一個目的是利用水稻蠟質基因5′調控序列來抑制水稻蠟質基因的表達。
一方面，本發(fā)明提供了一種分離的DNA序列，它是一段指導水稻胚乳組織專一性表達的水稻蠟質基因5′調控序列，該序列包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。在一個較佳的實例中，該水稻蠟質基因5′調控序列包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一個表達載體，該表達載體包含水稻蠟質基因5′調控序列以及與該調控區(qū)操作性相連的異源基因編碼序列或天然水稻基因反義序列。在一個較佳的實例中，與水稻蠟質基因5′調控序列操作性相連的所述天然水稻基因反義序列是水稻蠟質基因反義序列。
本發(fā)明還提供了一種生產在水稻胚乳中高效表達外源基因的水稻植株的方法，該方法是用本發(fā)明的表達載體轉化水稻，該表達載體含有本發(fā)明的水稻蠟質基因5′調控序列以及與該5′調控序列操作性相連的外源基因編碼序列。在一個較佳的實例中，所述外源基因選自水稻蛋白基因。
本發(fā)明還提供了一種生產水稻天然基因表達受抑制的水稻植株的方法，該方法是用本發(fā)明的表達載體轉化水稻，該表達載體含有本發(fā)明的水稻蠟質基因5′調控序列以及與該5′調控序列操作性相連的天然水稻基因反義序列。在一個較佳的實例中，所述天然水稻基因反義序列是水稻蠟質基因的反義編碼序列。
本文所用的術語“5′調控序列”指在基因翻譯起始密碼子(ATG)5′上游的控制結構基因表達的序列。在本發(fā)明的一個較佳實例中，水稻蠟質基因5′調控序列包含

圖1的核苷酸-2100至+1300(SEQ ID NO2)。對SEQ ID NO2所示水稻蠟質基因5′調控序列所作的能維持指導水稻胚乳專一性表達特性的修飾也在本發(fā)明范圍內。這些修飾包括一個或多個核苷酸的插入、缺失和替代。
本文所用的術語“分離的”核酸是指，該DNA序列已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來。編碼水稻蠟質基因5′調控序列的分離的核酸通?？捎孟率鰩追N方式獲得(1)從含有序列的基因組DNA文庫中分離出DNA序列；(2)用化學方法或酶方法合成；和(3)用聚合酶鏈反應合成DNA序列。
本文所用的術語“操作性相連”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。
水稻蠟質基因5′調控序列及其修飾或缺失片段指導胚乳專一性表達的活性可以這樣來鑒定使該調控序列與異源基因的編碼序列轉錄融合，將該融合基因轉移到合適宿主中，并檢測異源基因的表達。例如，通常用報道基因(典型的是氯霉素乙酰轉移酶和β-葡糖醛酸酶(GUS))來評價嵌合構建物的轉錄和翻譯能力。轉基因生物體中的報道物可用標準試驗來靈敏地檢測。β-葡糖醛酸酶基因可用作轉基因植物中的啟動子活性報道物，因為該酶在植物細胞中高度穩(wěn)定，高等植物中沒有內在的β-葡糖醛酸酶活性，該酶能用定量熒光試驗和組織化學定位技術來測定。Jerfferson等人(1987 EMBO J 63901)已經建立了檢測植物組織中GUS活性的生物化學和組織化學標準程序。
構建本發(fā)明的表達載體的技術是本領域普通技術人員所熟知的，并可在諸如Sambrook等人(1989年，《分子克隆實驗指南》)的參考文獻中找到?？刹捎酶鞣N策略來連接DNA片段，策略的選擇取決于DNA片段末端的性質。
本領域普通技術人員知道，為了使異源基因表達，構建物需要啟動子元件和使轉錄物有效聚腺苷酸化的信號。因此，含有共有啟動子序列(TATA盒)的水稻蠟質基因5′調控序列可與無啟動子異源編碼序列直接連接。
為了使異源基因或天然基因在水稻胚乳中專一性表達，可用本發(fā)明的融合基因構建物轉化植物?；蜣D移的方法是本領域中熟知的?？赏ㄟ^葉圓片轉化-再生程序(如Horsch等人(1985)Science 2271229所述)將融合基因導入植物內。也可采用其它轉化方法，如PEG法、基因槍法、電激法(Horsch等人，1984，Scienc223496，Barton等人，1983，Cell 321033，Liu等人，Acta Phytophysiol Sin，21195-205)，這也在本發(fā)明范圍內。但是這些方法有操作復雜、外源基因插入的多拷貝性和不完整性以及較高比例的不育植株等缺點(Potrykus 1990，Bio/Technol，8535-542；Finnegan和McElroy，1994，Bio/Technol.12883-888)。在一個較佳的實例中，按照例如Hiei等人(1994)Plant J，6271-6282中描述的方法，利用根癌農桿菌來轉化植物。當轉化方法需要時，本發(fā)明的融合基因可以插入植物轉化載體中，例如雙元載體pCAMBIAI300(Jefferson教授提供)的T-DNA區(qū)內中。
本發(fā)明的水稻蠟質基因5′調控序列是能使外源基因在水稻胚乳和花粉中組織專一性、高效表達的調控序列。它在植物基因工程中具有以下潛在的應用價值(一)增加稻米中維生素A的營養(yǎng)成份現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，缺乏維生素A是影響嬰幼兒身體健康發(fā)育的重要因素。維生素A的前體一胡蘿卜素是綠色植物光合系統(tǒng)中均存在的一種色素，對它的生物合成途徑已經進行了詳細研究。水稻種子中不能合成胡蘿卜素可能是因為合成途徑中某一個或幾個酶的基因沒有打開、或者與某些玉米中的情況相似，是由于某個起調控作用的基因失去活性。因此可以通過基因工程方法，利用蠟質基因啟動子引入失去活性的基因，克服這一自然障礙，就能培育出稻米中富含胡蘿卜素的水稻新品種。
(二)提高稻米中蛋白質的含量水稻是我國的主要糧食作物，雖然在谷類作物中稻米所含蛋白質的質量是較好的，但必需氨基酸中賴氨酸和蘇氨酸的含量仍偏低，與小麥、玉米比較稻米中的蛋白質含量也較低。為了提高稻米中的蛋白質含量，利用蠟質基因啟動子以基因工程方法引入一些高質量的儲藏蛋白基因，以提高稻米中優(yōu)質蛋白質的含量。
(三)培育雜交水稻新品系水稻蠟質基因也是花粉粒組織中表達的基因，用蠟質基因啟動序列和某些毒性基因構成嵌合質粒，就可以通過基因工程方法培育出可控制育性的水稻品種，建立新的雜交稻品系。
(四)改善稻米的食用品質目前水稻育種工作中遇到一個問題是，有些產量很高的新品種，由于它們的食用品質和蒸煮加工特性不理想，因而不受人們的歡迎。研究表明直鏈淀粉的含量是影響稻米食用品質的主要因素。因此，通過本發(fā)明的水稻蠟質基因啟動序列利用反義克隆技術降低這些高產品種中蠟質基因的表達，就能在不影響其它栽培特征的情況下達到降低直鏈淀粉含量的目的，從而改善稻米的食用品質。
(五)增加水稻結實率和充實度用蠟質基因啟動序列使某些植物激素合成中的關鍵酶基因在水稻種子中表達，來調節(jié)水稻種子的灌漿，這將對提高稻米產量有深遠的影響。
在附圖中，圖1是秈稻232(O.sativaindica 232)蠟質基因-2100到+1300bp的3.4kb DNA序列。
圖2是秈稻232中蠟質基因的物理圖譜，其中TSS，轉錄起始位點；AATAAA，加多聚A位點；ATG，翻譯起始密碼子；TGA，翻譯終止密碼子；B，BamHⅠ；Bg，BglⅡ；E，EcoRⅠ；H，HinfⅠ；P，PstⅠ；R，RsaⅠ；S，SaiⅠ；X，XhoⅠ。
圖3是水稻蠟質基因5′上游調控區(qū)缺失克隆經限制性內切酶EcoRⅠ酶切后的瓊脂糖凝膠電泳分析。
圖4是一系列waxy-gus融合基因的結構示意圖以及它們的GUS相對酶活力。
圖5是雙元表達載體p13W4T-DNA的結構。其中Xh，XhoⅠ；E，EcoRⅠ；Sa-SacⅠ，H，HindⅢ；B，Bam HⅠ；LB，左邊界；RB，右邊界；TSS，轉錄起始位點；ATG，翻譯起始位點；Wx-pro，水稻蠟質基因的3.1kb的5′上游區(qū)；Wx-frag，反義waxy基因片段；HYGr，潮霉素抗性基因；Kmr，卡那霉素抗性基因。
圖6是轉基因水稻植株的分子鑒定。A為PCR分析結果；B為Southern印跡分析，所有DNA用Eco RⅠ消化；C為Southern印跡分析，所有DNA用HindⅢ消化。泳道1含有p13W4質粒DNA；泳道2含有未轉化植物的DNA；泳道3至8分別含有6株轉基因植物的DNA。DNA分子量標記(kb)顯示在左側。
下面將結合附圖描述本發(fā)明的實施例。
實施例1水稻蠟質基因的分子克隆秈稻(Oryza sativa subsp.indica)232(Wx+)(云南省地方品種，按Williams等人Cereal Chemistry，47(4)410-415，1983所述方法測得含直鏈淀粉21％)的種子萌發(fā)后，25℃人工光照條件下生長三星期，收取葉組織用液氮速凍，在液氮中研磨成細粉，然后按Schwarz-Sommer等人(“The EMBO J”3(6)1021-1028，1984)的方法抽提水稻總DNA。按Maniatis等人(分子克隆，1989年)的方法用MboⅠ部分酶解總DNA，用10-40％蔗糖密度梯度超離心回收15-20kb DNA片段。
按Maniatis等人(分子克隆，1989年)的方法抽提出噬菌體λEMBL3的DNA。參照Frishauf等人(J.Mol.Biol.，170827-842，1983)的方法用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶解載體DNA，異丙醇沉淀除去EcoRⅠ和BamHⅠ之間的DNA小片段。
將上述DNA片段與雙酶解的λEMBL3載體DNA混合(1∶1)，DNA濃度不小于200微克/毫升。加入氯化鎂至10毫摩爾/升，42℃保溫60分鐘，再慢慢冷卻至12℃。加入緩沖液和T4DNA連接酶(BRL公司)，12℃連接過夜。連接好的DNA用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，氯仿抽提一次，乙醚抽提一次。乙醇沉淀DNA，最后溶于少量TE緩沖液(10毫摩爾/升Tris，1毫摩爾/升EDTA)備用。取3微升按Gigpack公司體外包裝盒說明書進行體外包裝，用P2噬菌體的溶源菌Q359測定，體外包裝混合物中含有4×105個重組噬菌體。根據(jù)Clarke(Cell 991-93，1976)基因文庫覆蓋率的計算公式(P值選99％)計算F值為15/(3×105)，即克隆片段平均長度為15kb時，只要有1×105個重組噬菌體即能覆蓋整個水稻基因組。
用EcoRⅠ酶解含有玉米Wx基因的pWx質粒DNA(Dr.N.Fedoroff等人，Cell，25225-230，1983)，從低融點瓊脂糖凝膠中回收帶有Wx基因的10.6kb DNA片段。用BRL公司的缺口平移反應盒按照說明書略作修改來標記成為有放射性活性的探針。每一反應體積為30微升，內含探針DNA 0.1-0.2微克、同位素α-32P-dATP 30μCi、3微升反應盒試劑(含dCTP，dGTP，dTTP各0.2毫摩爾/升)、2.5微升酶(PolⅠ和DNase)，15℃保溫60分鐘。加入3微升0.5摩爾/升EDTA終止反應，通過Sephadex G-50柱收集第一個放射性洗脫峰。
按Maniatis等人(分子克隆，1989年)的噬斑原位雜交方法，將噬斑轉移到硝酸纖維素膜上，進行分子雜交和放射自顯影，找出陽性克隆。每一個陽性克隆均經過三次單噬斑純化。為了證實所得為水稻的Wx基因，對其中一個陽性克隆λWx25進行Southern分析，結果表明其與玉米Wx基因編碼區(qū)雜交。將λWx25中帶有玉米Wx基因同源順序的0.4kb的BamHⅠ/SalⅠ片段克隆到噬菌體M13mp18和M13mp19上，按Sanger，Proc.Acad.Sci.USA，745466-5468(1977)中所述的雙脫氧末端終止法，用同位素標記和ABI公司的DNA序列分析儀測定其序列并與玉米基因的相應區(qū)域比較，結果表明兩者具有高度的同源性。
實施例2水稻蠟質基因5′上游調控區(qū)一系列缺失片段的克隆及測序通過PCR方法將擴增獲得的水稻蠟質基因翻譯起始密碼子上游3.4kb片段亞克隆到BamHⅠ和HindⅢ消化的pUC18中，得到質粒pWx3.4。用kpnⅠ和BamHⅠ消化此質粒DNA，用酚∶氯仿(1∶1)和等體積氯仿各抽提一次，在上清DNA溶液中加入0.1體積NaAc3摩爾/升及2體積無水乙醇，-70℃放置30分鐘，10000×g離心15分鐘，沉淀用70％乙醇洗滌后真空抽干，將DNA溶解在1×ExoⅢ緩沖液(Tris-HCl66毫摩爾/升，pH8.0，MgCl20.66毫摩爾/升)中，最終濃度為0.1微克/微升，37℃保溫5分鐘后，加入外切核酸酶ExoⅢ(反應濃度為5單位/微升)，分別在反應0.25，0.5，1，2，4，8，16，32和48分鐘后，取出10微升反應液加到預先放置在冰浴上的25微升無水乙醇、0.5微升EDTA 0.2摩爾/升、1微升NaAc3摩爾/升的混合液中終止反應并沉淀DNA，離心干燥后將DNA溶于50微升×S1核酸酶緩沖液(NaAc16毫摩爾/升，pH4.6，NaCl400毫摩爾/升，ZnSO41.6毫摩爾/升，8％甘油)中，加入核酸酶S1(反應濃度0.2單位/微升)室溫反應30分鐘，加入1微升S1核酸酶終止緩沖液(Tris堿0.3摩爾/升，EDTA50毫摩爾/升)，70℃中放置10分鐘使核酸酶S1失活，DNA經乙醇沉淀后，真空抽干，溶解于TE緩沖液(Tris-HCl10毫摩爾/升pH8.0，EDTA1毫摩爾/升)中，最終濃度為0.1微克/微升。取0.2微克DNA樣品經T4DNA聚合酶修補成平頭后，再經T4DNA連接酶連接環(huán)化，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，鑒定轉化子中質粒DNA的分子量，挑選分別缺失了0.3、0.6、0.7、0.8、0.95、1.3、1.5、1.6、1.8、2.1和2.4kb的克隆(圖3)。這些缺失克隆分別命名為pWx3.1、pWx2.8、pWx2.7、pWx2.6、pWx2.45、pWx2.1、pWx1.9、pWx1.8、pWx1.6、pWx1.3和pWx1.0。另外一個缺失的克隆pWx1.4是從pWx3.4質粒DNA中切除BamHⅠ和SalⅠ之間2.0kb片段后補平自連而得到。
為了確定一些pWx質粒中DNA序列缺失的精確位置，將這些質粒DNA經SacⅠ和EcoRⅠ消化后插入載體M13mp19相應位點，連接后轉染大腸桿菌MV1190感受態(tài)細胞，酶切消化和電泳鑒定后從轉化子中抽出單鏈DNA，用末端熒光標記法進行DNA序列分析(用ABⅠ公司373型DNA測序儀)，結果表明pWx2.1缺失到-861bp處，pWx1.9缺失到-640bp處，pWx1.4缺失到-119bp處，pWx1.3缺失到-27bp處。測序分析與凝膠電泳中DNA長度測量結果十分吻合。
實施例3水稻蠟質基因5′上游調控區(qū)與GUS基因編碼區(qū)融合質粒的構建為便于構建融合質粒，用限制性內切酶EcoRⅠ和HindⅢ從質粒pBⅠ101.1DNA(Jefferson 1987 Plant Molecular Biology Report，5387)中切出含GUS基因編碼區(qū)以及NOS 3′末端區(qū)的片段，插入pUC18載體的相應位點中，構成質粒pGN。用EcoRⅠ消化該質粒，切口的粘性末端經klenow片段補平后，加HindⅢ接頭，再用T4連接酶自連環(huán)化，轉化宿主菌，得到質粒pGNH。質粒pGNH經HindⅢ酶切后可以得到含有GUS基因編碼區(qū)以及NOS末端區(qū)的DNA片段，將它插入實施例2所述一系列pWx缺失克隆的HindⅢ位點中，經酶切鑒定，選取順向連接的一系列pWG質粒(圖4)。
實施例4waxy-gus融合基因在水稻原生質體中的瞬間表達及定量測定收集對數(shù)期生長的水稻懸浮細胞約2克，加入20毫升原生質體酶解液[CPW溶液(Zhang和Wu，1988年，Theor Appl Genet，78835)中加入1％纖維素酶RS，0.1％果膠酶Y-23]，26℃避光酶解2小時，用300目篩網過濾酶解液，濾液經100×g離心5分鐘，棄去上清，原生質體懸浮于10毫升MaMg溶液(甘露醇0.4摩爾/升，氯化鎂15毫摩爾/升，MES0.1％pH5.6)，80×g離心5分鐘，原生質體重懸于MaMg溶液中調節(jié)至1×106原生質體/毫升，取0.3毫升原生質體懸浮液，加入10微克pWG質粒DNA，10微克pMON 772i質粒DNA[含CaMV 35S啟動子，玉米Adh第一內含子及熒光素酶(LUC)基因，由N.Olszewski教授提供]，0.3毫升含30％PEG的MaMg溶液，緩慢混勻。26℃下避光放置30分鐘，緩慢加入15倍體積的CPW溶液，80×g離心去上清，原生質體沉淀懸浮于5毫升KPR培養(yǎng)液(Zhang和Wu，1988年，Theor Appl Genet，78835)中，26℃避光培養(yǎng)48小時。
轉化后的原生質體培養(yǎng)物，經100×g離心2分鐘，棄去上清，加入300微升GUS/LUC抽提緩沖液(KPO4100毫摩爾/升pH7.8，DTT 1毫摩爾/升，PMSF 0.8毫摩爾/升)懸浮原生質體，用超聲波(Soniprep 150型，MES公司)破碎原生質體(處理3秒，間隔30秒，重復3次)，5000×g離心5分鐘，收集上清液，即酶蛋白粗提液。以pGN為負對照，以pMON 772i為內對照，定量測定GUS酶活力和熒光素酶活力，校正后的GUS相對比活力以GUS/LUC比值pmol MU h-1/U(10s)-1表示，結果顯示在圖4中。
GUS酶活力的測定如下取100微升酶蛋白粗提液，加入4-甲基傘形花酮β-D-葡糖苷酸(4-MUG)至1毫摩爾/升，加甲醇至濃度為20％，37℃反應1小時，在熒光光度計HITACHI 650-10LC(激發(fā)波長455nm，吸收波長365nm)中，測定反應液中產物4-甲基傘形花酮(MU)的熒光強度，并根據(jù)MU的標準曲線換算出MU的產率(Jefferson，1987，Plant Molecular Biology Report，5387)，計算GUS的相對活性。
LUC酶活力的測定如下取100微升酶蛋白粗提液，加入100微升反應緩沖液(Tris-HCl 20毫摩爾/升，pH7.8，氯化鎂15毫摩爾/升)，反應液中加入ATP至5毫摩爾/升，放入TG-300型發(fā)光計中，加入100微克熒光素，測定發(fā)光強度，計算LUC酶活力。
圖4結果表明，從5′末端開始缺失824bp至轉錄起始位點上游-1294bp處，GUS酶的相對活力仍保持有85.6％，這表明在原生質體系統(tǒng)中，waxy基因5′上游區(qū)中-2100至-1294bp區(qū)段對基因表達影響不大。進一步缺失433bp至-861bp處，GUS酶相對活力下降至62.9％，表明在-1294至-861bp區(qū)域中，存在影響基因表達的順序。當繼續(xù)缺失221bp至-640bp處，GUS酶相對活力顯著下降1倍，從62.9％下降到31.6％。當繼續(xù)缺失到轉錄起點上游-119bp處時，由于仍然保留了TATA盒及其上游的最小啟動子區(qū)，GUS相對酶活力仍保持在25.4％左右。當缺失至轉錄起始位點上游-27bp處，TATA盒已被破壞時，GUS相對酶活力下降至與負對照水平一致(負對照中檢測到的GUS的相對活力11.5％代表了系統(tǒng)的背景水平)。
實施例5用反義waxy基因轉化水稻將waxy基因編碼區(qū)內的一段0.75kb長的DNA片段(來自秈稻品種232中waxy基因第2333位堿基到第3087位堿基)反向后插入pWG3.1融合基因中waxy基因5′上游區(qū)與GUS基因編碼區(qū)之間的Bam HⅠ位點中，構建成質粒pW4。將該反義融合基因克隆到雙元載體pCAMBIAⅠ300(Jefferson教授提供)中T-DNA區(qū)內，形成雙元表達載體p13W4(圖5)。
本試驗采用了2個粳稻品種95-2和中花11，兩者均為大面積推廣應用的品種。以95-22為例，將其栽種于人工氣候室或大田，取水稻開花后15天左右的未成熟胚在N6D2培養(yǎng)基[N6(Chu，1978，Proc Symp Plant Tissue Culture，43-50)，酪蛋白氨基酸500毫克/升，蔗糖30克/升，2，4-D2毫克/升，phytagel 2.5克/升，pH8.5]上預培養(yǎng)4至7天，再和農桿菌EHAl05/p13W4共培養(yǎng)(Hiei等，1994，Nucl AcidRes，169877)。在選擇培養(yǎng)基N6D2S1(N6D2，潮霉素50毫克/升)上選擇培養(yǎng)二代(2周/代)。結果可見從較多的幼胚上產生了生長旺盛的抗性愈傷組織。由表1可見，幼胚經共培養(yǎng)及篩選培養(yǎng)后，有38％的幼胚上可產生生長良好的抗性愈傷組織。不同試驗的轉化效率有所不同，但都能穩(wěn)定在30％左右的較高轉化頻率。將由此獲得的抗性愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基MSRCH(MS(Murashige和Skoog，1962，Physiol Plant，15473-479)，蔗糖30克/升，6-BA2毫克/升，NAA 0.2毫克/升，玉米素0.2毫克/升，phytagel 2.5克/升，潮霉素50毫克/升，pH5.8)，最后有26.3％的幼胚來源的抗性愈傷組織上可再生抗性小苗。共獲得了100多株再生小苗。由于從不同幼胚來源的抗性愈傷組織彼此屬于不同轉化體細胞的克隆(同一幼胚來源的抗性愈傷組織也有可能屬于不同轉化體細胞的克隆)，因此，由表1可知，至少已獲得了15個獨立轉化株系(再生于不同的轉化細胞)。再生小苗經生根壯苗后移栽入土，轉基因水稻植株在自然條件下生長正常，絕大多數(shù)植株能正常結實。我們對水稻品種95-22中獲得的13個獨立轉化的株系(RW1～RW13)進行分析。
表1根癌農桿菌介導將反義waxy-GUS融合基因導入粳稻品種的轉化效率
注意*在含有50毫克/升潮霉素的選擇培養(yǎng)基中選擇1個月后。
為了鑒定外源基因是否已整合進了水稻基因組，我們從來源于水稻品種95-22的RW1、RW2、RW5、RW7、RW8和RW11共6個獨立轉化子中各選擇一個單株提取葉片總DNA，進行PCR和Southern雜交分析。
在PCR分析中，以引物P1(5’-TGGCAAGAACAAGCATAGACC-3’，位于反義waxy基因編碼區(qū)片段內)，引物P2(5’-TAACATACGGCGTACATCG-3’，位于GUS基因偏碼區(qū)內)，從6個抗性植株的總DNA中特異性地擴增出626bp左右的DNA片段，與陽性對照(以質粒p13W4DNA為模板)相同；而在未轉化對照植株總DNA中沒有擴增出目的片段(圖6A)。用Eco RⅠ酶切總DNA，以[32p]dATP標記的GUS基因編碼區(qū)DNA為探針進行分子雜交，結果在所檢測的6個抗性植株總DNA中均有雜交條帶(圖6B)。由于在質粒p13W4 T-DNA區(qū)的GUS基因編碼區(qū)與左邊界之間無Eco RⅠ酶切位點，因此雜交條帶的多少即可表示外源基因的整合拷貝數(shù)。因此，由圖6B可知，有5個轉基因水稻植株總DNA中為該融合基因的單拷貝插入，而RW2中可能有三個拷貝。另外，為檢測所插入的反義waxy-GUS融合基因是否完整，又用HindⅢ酶切(在質粒p13W4T-DNA區(qū)有兩個HindⅢ切點，可切出2.8kb左右長的DNA片段，包括waxy基因反義片段和GUS基因編碼區(qū)片段及NOS基因終止子片段)總DNA進行雜交分析，結果顯示所有轉基因植株的雜交條帶大小與陽性對照相同(圖6C)，說明反義waxy基因片段與GUS基因編碼區(qū)在轉基因水稻基因組中是完整連接著的。
轉基因水稻植株移入人工室后，參照Jefferson等人1987年在Plnat Mol.Biol.Rep.，5387-405中所述的方法，在生長期取葉片等組織用組織化學染色法檢測GUS活性。結果發(fā)現(xiàn)，在所檢測的RW1～RW13十三個獨立轉化子共143株單株中，有102株的葉片和莖桿組織中可檢測到GUS活性，而41株的莖桿和葉片中未觀察到藍色反應。進一步對未成熟種子的胚乳進行組織化學法檢測，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)轉化植株的胚乳中可檢測到GUS活性(藍色)，只有少數(shù)幾個單株(RW6-1)的胚乳中未檢測到特有的藍色。同時在同一植株的胚乳間已檢測到GUS基因的分離，表2為部分轉基因水稻植株中GUS活性的檢測情況。
參照Juliano，1968，Cereal Sci.Today，16334-360中的方法，用I2-KⅠ比色法測定水稻成熟種子胚乳中直鏈淀粉的含量，測得本研究所用受體親本95-22的直鏈淀粉含量為17％左右。為了詳細了解反義waxy基因導入水稻后對轉直鏈淀粉含量的影響，我們重點對RW1-3等23個轉化單株上所結的T1代種子中的直鏈淀粉含量進行測定，結果列于表2中。在所分析的23個不同單株中，直鏈淀粉含量的變化情況有所不同，有11個單株部分成熟種子中的直鏈淀粉含量已有不同程度的下降。從同一單株上不同種子的直鏈淀粉含量的比較分析，表明反義waxy基因已在T1代中發(fā)生了分離。
對T1代植株上所結種子(T2代)用GUS組織化學法篩選轉化純合子，并對純合植株上所結種子按單株測定直鏈淀粉含量，結果顯示直鏈淀粉含量與T1代相符(表2)，說明轉反義waxy基因水稻植株中直鏈淀粉含量改變后可穩(wěn)定遺傳至T2代。
表2粳稻9522／p13W4轉基因水稻部份T0植株與T1、T2種子的性狀分析 nt未檢測本文公開和揭示的所有組合物與方法可通過借鑒本文公開內容無需進行過多試驗而制得和實施。盡管本發(fā)明的組合物和方法已經通過較佳實例進行了描述，但是本領域技術人員明顯能在不脫離本發(fā)明的內容、精神和范圍內對本文所述的組合物、方法、以及方法步驟和步驟次序作改動。更具體地，明顯可用化學和生理上相關的某些試劑代替本文所述的試劑來獲得相同或相似的結果。所有這些相似的替換和改動對于本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括附加權利要求定義的本發(fā)明精神、范圍和內容中。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)姓名中國科學院上海植物生理研究所(B)街道上海市楓林路300號(C)城市上海市(F)郵政編碼(郵編)200032(ⅱ)發(fā)明名稱水稻胚乳組織中專一表達的啟動子及其應用(ⅲ)序列數(shù)目2(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度121堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1GTCGACACCG GCCGGGGACC GCGTAAAATG TGTTGCGGGA GGGAGAGGGG GAGAGAGAGA 60TCGCGCGGGC TTCACGCAAC GGCGCTACAA ATAGCCACCC ACACCACCAC CCCCTCTCTC120A 121(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度3400堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2TGCCTCCTTG GCCGAGGCCT TGGTGGCCAA GGTCGAGATC ATCTCGGGGG GCACCGCGCT 60ACAAATGGCG TCAAGCGCCA TCCTATCCTC ATGAAGCACG ACGCCGCCTG GATCGATGGC 120GCCCCACAGG CACCGGGCTT GCAGTTTGAT CTTCATCAGC AAAGACCAAT CGTTGTAGTT 180AGTTCTTGTC AACAGCGGGT AGTTTGCCGC ACCTCCTGCT TCCTTGACCA CGCGGTGGAT 240CACCAGCCCA CGGTCGCTCC CGCCGCTGCC CGAGGCGCGG CCGCCGGAAC CTTGAAACAT 300GCACGGACGG TGACGCCGAC CGCCGGCGCC GGGGAAGTTC CGTGCGTCCT CGAGGCATGA 360AGACACCCTC AAGAGCGCGA TCTCGCAGCT ACTACTAGAT ACATCGTGTA AGGTTTATTT 420CCAACACGGC CGGCCGTGGC TTGTGGTCCT ACGCCTTACG CGCCCACCAT TTTTTATTAT 480TTATTTGTGA AACTGACATG TGGGTCCCAC GAGGTTTATT ATTTTTCAGA TCGAATTGCC 540ACATCAGTGC CACGTCAGAT CGAGACCAAG TCAAATTAGC CACGTAGGCG CACACGTCAG 600CCAAAACCGC CGTCAAAACT GCCGAGGGAT CTAATCTGCA CCGGTTTTAA TAGTTGTAGG 660GACCCGTTGT ATATGGTTTT GCGGTTGAAG GACGGTAAAT TGGATTCGTT GACAAGTTAA 720GGGACCTTAG ATGAACTTAT TCCTTTTATA TTTGCACAGG CCTAATTTCA AGTCCAGCCC 780AGCTTTCTTC AGCCTGTTTG ATAATTCTCT CTAGCTTATT ACAGCCGTGG GAGAGGAGAT 840ATACAGCTAC AAGATTACAA GTCGATGTAT ACAGCAAACC CATGAGCTGA TTGCCTGATT 900AGACGCGGTA AGAATGCATC CCTGAGAAGC AAATGCATCA CCAAATTTGT AGCTTAGATA 960AATGCTGTGA CCTGCAAGAA AACAAAATTA AAATCAAAAG AAAAGAAAAG CGCAGGTAAT 1020TGACACCCCA CGCATACAAG TGTAGATGCA TAACACGTTC ATCTAATCAT CTTAATTAGA 1080CTTAGGTAAA ACTACAATGA GGTTTATGTC CTACGGAATG ACGATAAGCT AGCAGCACAG 1140AGGCACAGAT CATATCGTCT CCAGACTCAA GTGCACGTTG ATCATTCGCT CACTGCTTCA 1200TCGATCATCC CTTTGTCGAG GCGTTAGTTG GCAGGCACTA ATAGCTACAG TAAAGTAAAG 1260AGCAACGTGC CAACGTACGC ACGCTAACGT GAGTCATGTA GCGTAATTCC AAGTTCTTTT 1320TTTTTTGTCA GCACGTACAA GCAGCCGCTA GCCTCGCCCT GCATGAGAAG CTCGCGGCGC 1380GCCACCAAAC TGGCAGGCAC TCAGCTCGCT GCTGGTCCCG CACGTCGCCA CACGATCGAC 1440GTACGCACGC GAGCGAGATC CACCGATGGT TTACGCGTAC GCGACGCTCA CACATCCCCC 1500GGTGCCCAAC AGAAACCACA CACCACCCGC ACGAAAAAAA CCGAACCGCA CGTGCGCGCG 1560CGCTCCACGC ACACCCCAAA CAGACGGCAC GGCGGGAGCG CGCGCGCGCA CGCGAGCCGA 1620GGAGAAAACA AACGGGGGAA ACAAGCTGGA AAAGCAAAAG GGGAAAAGAA CGGAGCGGAG 1680GCTTCACCCA CGGCCACCGC GACGGCCACC AGCGTGCGGT GCAATGCAAC GTACGCCAAG 1740CCGAAACGGC AGGCAGCATC GCGCACGCAC GCACACACAG GCCACAGCAC ACGCGAGCGA 1800CGTACGCGAG TGCATGCAGA TGCATGCGCG GGGCTCGCGC GAGACCGGCC GATGGGTTCG 1860CTTCTCTTCT CTCTCCCGTC CCGTTGCGTC GTCATGGACA AAAGTCGGTT TTGCTTTTGG 1920TTTTTTGGTT CTGAGACTGA CGTGCGGGCC AGCGTACGCC TGCGTGCCCC GCATGTCATC 1980GTCGACACCG GCCGGGGACC GCGTAAAATG TGTTGCGGGA GGGAGAGGGG GAGAGAGAGA 2040TCGCGCGGGC TTCACGCAAC GGCGCTACAA ATAGCCACCC ACACCACCAC CCCCTCTCTC 2100ACCATTCCTT CAGTTCTTTG TCTATCTCAA GACACAAATA ACTGCAGTCT CTCTCTCTCT 2160CTCTCTCTCT GCTTCACTTC TCTGCTTGTG TTGTTCTGTT GTTCATCAGG AAGAACATCT 2220GCAAGGTATA CATATATGTT TATAATTCTT TGTTTCCCCT CTTATTCAGA TCGATCACAT 2280GCATCTTTCA TTGCTCGTTT TTCCTTACAA ATAGTCTCAT ACATGCTAAT TTCTGTAAGG 2340TGTTGGGCTG GAAATTAATT AATTAATTAA TTAATTGACT TGCCAAGATC CATATATATG 2400TCCTGATATT AAATCTTCGT TCGTTATGTT TGGTTAGGCT GATCGATGTT ATTCTAGAGT 2460CTAGAGAAAC ATACCCAGGG GTTTTCCAGC TAGCTCCACA AGATGGTGGG CTAGCTGACC 2520TAGATTTAAG TCTCACTCTT TCTAATTATT TGATATTAGA TCATTTTCTA ATATTTGCGT2580CTTTTTTTAT TCTAGAGTCT AGATCTTGTG TTCAACTCTC GTTAAATCAT GTCTCTCGCC2640ACTGGAGAAA CAGATCAGGA GGGTTTATTT TGGGTATAGG TCAAAGCTAA GATTGAAATT2700CACAAATAGT AAAATCAGAA TCCAACCAAT TTTAGTAGCC GAGTTGGTCA AAGGAAAATG2760TATATAGCTA GATTTATTGT TTTGGCAAAA AAAAATCTGA ATATGCAAAA TACTTGTATA2820TCTTTGTATT AAGAAGATGA AAATAAGTAG CAGAAAATTA AAAAATGGAT TATATTTCCT2880GGGCTAAAAG AATTGTTGAT TTGGCACAAT TAAATTCAGT GTCAAGGCTT TGTGCAAGAA2940TTCAGTGTGA AGGAATAGAT TCTCTTCAAA ACAATTTAAT CATTCATCTG ATCTGCTCAA3000AGCTCTGTGC ATCTCCGGGT GCAACGGCCA GGATATTTAT TGTGCAGTAA AAAAATGTCA3060TATCCCCTAG CCACCCAAGA AACTGCTCCT TAAGTCCTTA TAAGCACATA TGGCATTGTA3120ATATATATGT TTGAGTTTTA GCGACAATTT TTTTAAAAAC TTTTGGTCCT TTTTATGAAC3180GTTTTAAGTT TCACTGTCTT TTTTTTTCGA ATTTTAAATG TAGCTTCAAA TTCTAATCCC3240CAATCCAAAT TGTAATAAAC TTCAATTCTC CTAATTAACA TCTTAATTCA TTTATTTGAA3300AACCAGTTCA AATTCTTTTA GGCTCACCAA ACCTTAAACA ATTCAATTCA GTGCAGAGAT3340CTTCCACAGC AACAGCTAGA CAACCACCAT GTCGGCTCTC3400
權利要求
1．一種分離的DNA序列，其特征在于，它是指導水稻蠟質基因在胚乳組織專一性表達的蠟質基因5′調控序列，該序列包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2．根據(jù)權利要求1所述的DNA序列，其特征在于，它包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
3．一種表達載體，其特征在于，該表達載體包含權利要求1所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的異源基因編碼序列或天然水稻基因反義序列。
4．根據(jù)權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述天然水稻基因反義序列是水稻蠟質基因反義序列。
5．一種生產在水稻胚乳中高效表達外源基因的水稻植株的方法，其特征在于，用權利要求3所述的表達載體轉化水稻，其中所述表達載體含有權利要求1所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的外源基因編碼序列。
6．根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于，所述外源基因為水稻蛋白基因。
7．一種生產水稻天然基因表達受抑制的水稻植株的方法，其特征在于，用權利要求3所述的表達載體轉化水稻，其中所述表達載體含有權利要求1所述的DNA序列以及與該核酸序列操作性相連的天然水稻基因反義序列。
8．根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，所述天然水稻基因反義序列是水稻蠟質基因的反義編碼序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離的DNA序列,它編碼指導水稻胚乳組織專一性表達的水稻蠟質基因5′調控序列,該序列包含SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了包含該序列的表達載體,以及用該表達載體來指導外源基因在胚乳組織專一性表達或阻斷天然水稻蠟質基因表達的方法。
文檔編號C12N15/29GK1298021SQ9912420
公開日2001年6月6日 申請日期1999年12月2日 優(yōu)先權日1999年12月2日
發(fā)明者洪孟民, 王宗陽, 張景六 申請人:中國科學院上海植物生理研究所