專利名稱：逆流透析式空間細胞培養(yǎng)器及培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及空間生物技術，特別是涉及采用逆流透析方式進行組織培養(yǎng)的方法和培養(yǎng)器。
空間微重力環(huán)境下，重力沉降趨于消失，為細胞三維生長和細胞高密度培養(yǎng)創(chuàng)造了前所未有的條件和機會，為內源性藥物(來源于哺乳動物和／或高等植物細胞的分泌)的開發(fā)和生產開辟了誘人的前景，故80年代以來，空間制藥一直是美歐諸國空間計劃的重要組織部分。但空間微重力環(huán)境下在重力對流亦趨于消失。單純靠擴散來維持細胞生長所必需的化學微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)是不可能的。必須對傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法作根本性的改變——進行動態(tài)培養(yǎng)(培養(yǎng)液流動更新，氧和二氧化碳動態(tài)交換)。另一方面，普遍應用于發(fā)酵工業(yè)(微生物培養(yǎng))的攪拌方法，(包括機械攪拌、氣升法，而且氣升法在微重力環(huán)境里無效)所造成的機械和流動應力很容易損毀哺乳動物(或高等植物)細胞，造成局部壞死，因而不適用于空間細胞培養(yǎng)。因此，空間韁胞動態(tài)培養(yǎng)方法技術和裝置的研究成了空間細胞培養(yǎng)的關鍵技術之一。
與本發(fā)明關系較為接近的技術如文獻1．美國的薄膜生物反應器(Thin FilmBioreactor，Adv．Space Res．1989，P．111)，它實際上是一個雙層薄膜袋，內囊為細胞培養(yǎng)室，壁面可透析，代謝產物進入夾層間流走。培養(yǎng)室內有新鮮培養(yǎng)液入口，可間歇性噴注新鮮培養(yǎng)液。該方法的主要缺陷是培養(yǎng)液間歇性的噴注本身破壞了空間微力環(huán)境(對所培養(yǎng)細胞來說)，而且培養(yǎng)器內流動比較紊亂，這將不可預測地影響細胞的代謝，甚至引起質變，因而這一技術對以空間制藥為目標的細胞培養(yǎng)來說是不適宜的。
另一種可以考慮的技術是中空纖維細胞培養(yǎng)器，這在地面上也已廣為使用。在這種培養(yǎng)器里，氣體或培養(yǎng)液從中孔纖細管中流過，管間間隙為細胞培養(yǎng)空間。該方法的根本缺陷是營養(yǎng)液和O2的供給(相應的CO2和代謝產物的排出)在空間內很不均勻，在終端附近很容易造成傳質‘死區(qū)’并導致細胞壞死。合理地選擇中孔纖維直徑與長度比(λ=d／1)，情況會有所改善。但實際上，合理的λ不僅因培養(yǎng)細胞而異，而且在細胞培養(yǎng)過程中是隨時間變化的。此外，(i)氧和營養(yǎng)的供給不僅沿縱向(順中空纖維管軸)很不均勻，而且在培養(yǎng)空間橫斷面(凹弧三角形和／或凹弧菱形)上也很不均勻，易于形成‘死區(qū)’；(ii)中空纖維管內的流動阻力與管(內)徑平方成反比。為了提高傳質效率，在一定的總容積下，希望增加中空纖維數量，這必然導致流動阻力劇增。由于空間飛行成本高昂，要求空間細胞培養(yǎng)器有效載荷高，而功耗低。顯然，中空纖維式細胞器不適宜于空間實驗。
本發(fā)明目的在于克服上述問題，為了降低整個系統(tǒng)流動阻力和功耗，以符合空間使用需要，來提高在空間細胞培養(yǎng)的產率；從而提供一種培養(yǎng)區(qū)內細胞能夠得到比較均勻(空間上)的營養(yǎng)和氧供應，并能及時帶走代謝產物，以維持細胞化學微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)；以及培養(yǎng)液的流動不干擾空間微重力環(huán)境，且培養(yǎng)細胞所受的機械力保持低水平的逆流透析式空間細胞培養(yǎng)器及培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現的本發(fā)明基于魚類鰓呼吸氣(溶于水)——血交換的生物力學原理。如附

圖1．所示，鰓內溶氧水流動方向和血管內血液流動方向相反，這樣，右端水含氧量低，但相應的血液含氧量亦低；左端血液含氧量高，而相應的水的氧量亦高。因而，沿著流動方向，毛細血管壁(半透膜)兩側氧濃度差趨于均勻，所以，魚類能充分利用水中的溶氧，氣／血交換效率高。這是自然選擇的結果。
本發(fā)明的逆流透析式空間細胞培養(yǎng)器包括以下幾部分n個細胞培養(yǎng)器和n+1個培養(yǎng)液流動室組成，其中每個細胞培養(yǎng)室與培養(yǎng)液流動室之間用氣／液半透膜隔開，并且連接成一層狀整體，要求每層高(H)與寬(W)之比為H／W＜＜1；當第一層培養(yǎng)液流動室的培養(yǎng)液進口開在右側，流動出口端開在左側，反之也可以；第二層培養(yǎng)液流動室的培養(yǎng)液出口開在右側，進口開在左側，而與第一層相反，當培養(yǎng)器有多層時依次類推。要求培養(yǎng)液流動室進口和出口截面形成均為矩形(H×W)；還可以把細胞培養(yǎng)室、培養(yǎng)液流動室作成多層同心圓筒套裝成一體，細胞培養(yǎng)室的內外同心圓筒為供給培養(yǎng)液的培養(yǎng)液流動室，兩圓筒之間均用液／液半透膜固定在一鏤空支架上的復合結構隔開；也可以在細胞培養(yǎng)室內、外層同心圓筒中分別流過新鮮培養(yǎng)液和氣體，相鄰圓筒間分別用液／液半透膜和氣／液交換膜隔開。
培養(yǎng)液輸運部分結構如下分流閥與培養(yǎng)液流動室的進口連通，分流閥另一出口通過氣／液分離器連接氣／液交換器氣／液交換器的兩出口分別與穩(wěn)壓調壓閥和余氣收集器連通；穩(wěn)壓調壓閥再與氣源。匯流器通過兩根管道分別與阻尼器連通到培養(yǎng)液流動室的進口；匯流器另一出口通過管道連通透析分離器和代謝物收集器；透析分離器與培養(yǎng)液儲存器和恒流泵連通再與氣／液交換器相連通。
本發(fā)明的逆流透析式空間細胞培養(yǎng)方法的原理如圖2和圖3所示。圖-2為人和哺乳動物微循環(huán)流動中，血液和周圍組織進行物質交換的三種類型。(a)類稱為流量限止，O2、CO2等物質的輸運屬于此類，在圖中用——表示；(c)類稱為擴散限止，大分子輸運大多屬此，圖中用-×-×-表示；(b)類為理想情況，用-·-·-表示(圖中Cα／Cα0為α組元的相對濃度，Cα0為進口濃度；x為離進口的距離，1為流道總長)。不論哪種類型，流動出口端(末端)細胞培養(yǎng)室——培養(yǎng)液培養(yǎng)液流動室之間物質交換的狀況均不佳，(a)類尤其如此，形成了死區(qū)。
本發(fā)明采用逆流式雙向灌流，如圖-3所示，圖中2、3為培養(yǎng)液流動區(qū)，二者流動方向相反，流量相等，故稱為逆流式。1為細胞培養(yǎng)區(qū)，它和2、3之間均用半透膜隔開；氧、CO2、小分子、蛋白質分子等能透膜輸運，但細胞不能通過。相對于細胞培養(yǎng)室來說，培養(yǎng)液培養(yǎng)液流動室Ⅰ的進口與培養(yǎng)液流動室Ⅱ的出口處于同一空間位置，而Ⅰ的出口與Ⅱ的進口處于培養(yǎng)室另一末端同一空間位置。這樣，如圖-3所示(以均衡狀態(tài)(b)為例)，培養(yǎng)室內O2和營養(yǎng)的供應沿縱向趨于均勻，避免了死區(qū)的發(fā)生(對于(a)類，即流量限定型，只要調節(jié)培養(yǎng)液流動室內培養(yǎng)液的流量，就可以使它趨于(b)類，乃至(c)類，如果需要的話)。至于培養(yǎng)室內CO2和代謝產物的排出，情況亦然。這樣，使得培養(yǎng)金內細胞生長所必需要氧和營養(yǎng)供應得到了根本的改善，在空間分布上趨于均勻，避免了‘死區(qū)’。
本發(fā)明的方法按以下步驟進行，按常規(guī)滅菌消毒后，裝配成型。(1)讓細胞培養(yǎng)室和兩側培養(yǎng)液流動室均充滿新鮮培養(yǎng)液。排除其中的氣泡后，接種細胞，并密封培養(yǎng)室；(2)啟動供液系統(tǒng)，兩側培養(yǎng)室內新鮮培養(yǎng)液(氧飽和)以相同的流量，作逆向灌流。流量的大小則因所培養(yǎng)細胞的氧耗率，生長速率而異；(3)根據具體培養(yǎng)的細胞的種類，在培養(yǎng)過程中，調節(jié)培養(yǎng)液流動室的流量和壓力分布。(3)培養(yǎng)室流量和壓力分布由圖5所示，培養(yǎng)液流動系統(tǒng)中的恒流泵(12)和阻尼器(16)、(17)調控。(4)培養(yǎng)液組分因細胞而異(常規(guī))，只是強調要讓新鮮培養(yǎng)液的溶氧量達到飽和程度；本發(fā)明的優(yōu)點和效果1逆流供液(含供氣)使得細胞培養(yǎng)區(qū)內的細胞能得到比較均勻(空間上)的營養(yǎng)和氧供應，并能及時帶走代謝產物，以利于維持細胞生長所需的化學微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。與已有技術相比，培養(yǎng)區(qū)傳質情況有質的改善。
2培養(yǎng)區(qū)內流動緩慢流體應力比培養(yǎng)液流動室低3個量級左右，不干擾微重力環(huán)境，且不損壞細胞。
3整個系統(tǒng)流動阻力低，在培養(yǎng)空間容相同的條件下，比中空纖維培養(yǎng)器功耗低2～3個數量級。
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細地說明圖1為魚類鰓呼吸氣／血交換生物力學模型；圖中■表示血流動路徑，□表示氣流動路徑。
圖2為微循環(huán)傳質三種類型；圖中a--表示流量限止；b-·-·-表示均衡；c--X--X-表示擴散限止。
圖3a、b為逆流透析式細胞培養(yǎng)器原理4為二維逆流透析式細胞培養(yǎng)器示意5為逆流透析式細胞培養(yǎng)器的培養(yǎng)液輸運部分路徑6為二維逆流透析式細胞培養(yǎng)器結構示意7(a)為雙室三通道片層式逆流透析式細胞培養(yǎng)器結構示意圖(b)雙室三通道層式逆流透析式細胞培養(yǎng)器培養(yǎng)液流動示意8(a)為軸對稱逆流透析式細胞培養(yǎng)器結構示意圖(b)表示圖8(a)中半徑為R1、R2、R3的三個同心園筒示意圖逆流式細胞培養(yǎng)器原理可以通過多種方案實施，下述三種方案尤為簡單、實用。
本實施例的培養(yǎng)液輸運部分路徑圖如5所示，在圖中包括(12)恒流泵；(13)氣／液交換器；(14)氣／液分離器(15)分流閥； (16)(17)阻尼器；
(18)匯流器； (19)透析分離器；(20)培養(yǎng)液儲存器；(21)氣源；(22)穩(wěn)壓調壓閥； (23)余氣收集器；(24)代謝物收集器；連接路徑如圖5所示。
其中分流閥(15)與培養(yǎng)液流動室的進口(6)、(7)連通，分流閥(15)另一出口通過氣／液分離器(14)連接氣／液交換器(13)，氣／液交換器(13)的兩出口分別與穩(wěn)壓調壓閥(22)和余氣收集器(23)連通；穩(wěn)壓調壓閥(22)再與氣源(21)。匯流器(18)通過兩根管道分別與阻尼器(16)、(17)連通到培養(yǎng)液流動室的進口(8)、(9)；匯流器(18)另一出口通過管道連通透析分離器(19)和代謝物收集器(24)；透析分離器(19)與培養(yǎng)液儲存器(20)和恒流泵(12)連通再與氣／液交換器(13)相連通。
由于在同樣培養(yǎng)空間下，流動空間隙寬度H＞＞di(中孔纖維管內徑)，故在同樣粘度，同樣流量下，片層透析式細胞培養(yǎng)器的流動阻力遠遠小于同樣培養(yǎng)容積下中孔纖維細胞培養(yǎng)器的流動阻力小2-3個量級即，在同樣條件下，后者的功耗約比前者高2～3個數量級。故片層透析式細胞培養(yǎng)器能滿足空間培養(yǎng)低功耗的要求。細胞培養(yǎng)區(qū)內的流動是通過半透膜流體滲濾引起的，按Starling定律，單位面積上通過半透膜的滲濾流量m為m=k[(p(x)-pc(x))-(π-πc)]這里k是膜滲濾系數，決定于膜材料特性和微孔孔徑。p(x)是培養(yǎng)液流動室壓力，pc(x)是培養(yǎng)室壓力，π和πc為培養(yǎng)液流動室和培養(yǎng)室滲透壓。m(x)的存在將以極低的速度在培養(yǎng)室內形成流動(滲流)，由于其速度極低，速度梯度亦很小，故培養(yǎng)區(qū)內流體應力很小，但卻有利于培養(yǎng)室內的物質輸運，有利于細胞培養(yǎng)。
實施例2按圖-7制作一雙室三通道片層細胞培養(yǎng)器。即n=2的培養(yǎng)器。它實際上是由兩個片層細胞培養(yǎng)器和三個培養(yǎng)液流動室連接而成，示意如圖-7。圖中(1)、(25)為細胞培養(yǎng)室；(2)、(3)、(26)為培養(yǎng)液流動室。(29)為蓋板；(6)、(7)、(30)為培養(yǎng)液進口；(8)、(9)、(31)為培養(yǎng)液出口；其中培養(yǎng)液流動室(3)的兩側壁亦均為液／液半透膜(5)(4)和(28)(27)，通過它們同時為第一個細胞培養(yǎng)室(1)和第二個細胞培養(yǎng)室(25)供氣、供營養(yǎng)。其培養(yǎng)液供液輸運部分與實施例相同。
實施例3按圖8制作一軸對稱逆流透析式細胞培養(yǎng)器由三個同心園筒R1、R2、R3構成，三個同心園筒R1、R2、之間用液／液半透膜固定在鏤空支架上的復合結構隔開，即細胞培養(yǎng)室內、外壁均為液／液半透膜或液／氣交換膜-鏤空支架復合結構，如圖--8(a)，(b)所表示的。R1空間(3)和(R3--R2)空間(2)為培養(yǎng)液流動室，二者流動方向相反。(R2-R1)空間(1)為細胞培養(yǎng)室。(6)、(7)分別為培養(yǎng)液流動室(2)和(3)的進口；(8)、(9)分別為培養(yǎng)液流動室(2)和(3)的出口，(10)為細胞接種口，(11)是培養(yǎng)室培液溢流出口。其培養(yǎng)液供液輸運部分與實施例相同。
從傳質效果來說，軸對稱逆流透析式細胞培養(yǎng)器和二維逆流透析式細胞培養(yǎng)器等效的。對空間培養(yǎng)來說，后者空間利用效率高于前者，且有利于溫控；但前者(軸對稱型)在地基模擬方面優(yōu)于前者，而且可流動式(2)、(3)可以有多種安排，既可二者同時供液，亦可內筒為培養(yǎng)液流動室，外筒為氣體培養(yǎng)液流動室。
權利要求
1. 一種逆流透析式空間細胞培養(yǎng)器，包括培養(yǎng)器主體、供液輸運部分，其特征在于培養(yǎng)器主體由n個細胞培養(yǎng)室和n+1個培養(yǎng)液流動室組成，其中每個細胞培養(yǎng)室與培養(yǎng)液流動室之間用氣／液半透膜隔開，并且連接成一層狀整體，當第一層培養(yǎng)液流動室的培養(yǎng)液進口開在右側，流動出口端開在左側，反之也可以；第二層培養(yǎng)液流動室的培養(yǎng)液出口開在右側，進口開在左側，而與第一層相反，當培養(yǎng)器有多層時依次類推；培養(yǎng)液輸運部分結構的分流閥與培養(yǎng)液流動室的進口連通，分流閥另一出口通過氣／液分離器連接氣／液交換器氣／液交換器的兩出口分別與穩(wěn)壓調壓閥和余氣收集器連通；穩(wěn)壓調壓閥再與氣源。匯流器通過兩根管道分別與阻尼器連通到培養(yǎng)液流動室的進口；匯流器另一出口通過管道連通透析分離器和代謝物收集器；透析分離器與培養(yǎng)液儲存器和恒流泵連通再與氣／液交換器相連通。
2. 按權利要求1所述的一種逆流透析式空間細胞培養(yǎng)器其特征在于所說的n個細胞培養(yǎng)室和n+1個培養(yǎng)液流動室的n為整數。
3. 按權利要求1所述的一種逆流透析式空間細胞培養(yǎng)器，其特征在于培養(yǎng)器主體每層高與寬之比為＜＜1。
4. 按權利要求1所述的一種逆流透析式空間細胞培養(yǎng)器，其特征在于培養(yǎng)液流動室進口和出口截面形成均為矩形。
5. 按權利要求1所述的一種逆流透析式空間細胞培養(yǎng)器，其特征在于還包括把培養(yǎng)器主體的細胞培養(yǎng)室、培養(yǎng)液流動室作成多層同心圓筒套裝成一體，細胞培養(yǎng)室的內外同心圓筒為供給培養(yǎng)液的培養(yǎng)液流動室，兩圓筒之間均用液／液半透膜固定在一鏤空支架上的復合結構隔開。
6. 一種應用權利要求1所述的逆流透析式空間細胞培養(yǎng)器進行空間細胞培養(yǎng)的方法，其特征在于按常規(guī)滅菌消毒后，裝配成型后依以下步驟進行(1)讓細胞培養(yǎng)室和兩側培養(yǎng)液流動室均充滿新鮮培養(yǎng)液。排除其中的氣泡后，接種細胞，并密封培養(yǎng)室；(2)啟動培養(yǎng)液輸運部分流動路徑，兩側培養(yǎng)室內新鮮氧飽和培養(yǎng)液以相同的流量，作逆向灌流；流量的大小則因所培養(yǎng)細胞的氧耗率，生長速率而異；(3)根據具體培養(yǎng)的細胞的種類，在培養(yǎng)過程中，由恒流泵和阻尼器調控調節(jié)培養(yǎng)液流動室的流量和壓力分布。
全文摘要
本發(fā)明涉及空間生物技術中采用逆流透析方式進行組織培養(yǎng)的培養(yǎng)器和方法。培養(yǎng)器包括n個細胞培養(yǎng)器和n+1個培養(yǎng)液流動室組成,其中每個細胞培養(yǎng)室與培養(yǎng)液流動室之間用氣/液半透膜隔開,并且連接成一層狀整體,當第一層培養(yǎng)液流動室的培養(yǎng)液進口開在右側,流動出口端開在左側,反之也可以;第二層培養(yǎng)液流動室的培養(yǎng)液出口開在右側,進口開在左側,而與第一層相反。培養(yǎng)方法其特征在于:按常規(guī)接種后啟動供液系統(tǒng),兩側培養(yǎng)室內新鮮培養(yǎng)液(氧飽和)以相同的流量,作逆向灌流。流量的大小則因所培養(yǎng)細胞的氧耗率,生長速率而異。
文檔編號C12M3/06GK1290744SQ9912591
公開日2001年4月11日 申請日期1999年12月9日 優(yōu)先權日1999年12月9日
發(fā)明者陶祖萊, 高克家, 唐澤眉, 王戰(zhàn)會, 高宇欣, 王翠茹 申請人:中國科學院力學研究所