專利名稱：北美豬生殖和呼吸綜合征(prrs)病毒及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物衛(wèi)生領(lǐng)域，涉及正的極性RNA病毒的感染性cDNA克隆和使用所述cDNA克隆構(gòu)建疫苗，尤其是豬疫苗。
豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)是豬的一種新疾病，1987年首次報道于北美，1990年歐洲對此病也有報道。此病已流傳至亞洲并影響到世界主要產(chǎn)豬國中的大多數(shù)。主要癥狀是大母豬和小母豬的生殖問題，包括晚期流產(chǎn)，死胎和干尸，弱小豬的小仔豬出生時即患病毒血癥，經(jīng)常不能存活。另外，在幼豬中，此綜合征表現(xiàn)為水平傳播的呼吸疾病，導(dǎo)致發(fā)燒、嗜睡、呼吸困難、食欲差、生長緩慢和偶發(fā)性死亡，經(jīng)常與其它呼吸性病原體相關(guān)。通過自然或人工受精，能經(jīng)過感染公豬的精液將此病傳染給大母豬和小母豬。由于這樣或那樣的原因，已證實PRRS是難以控制的疾病，因此對養(yǎng)豬業(yè)來說是經(jīng)濟上危害最大的疾病之一。
PRRS的致病因子是PRRS病毒，該病毒以兩個遺傳學(xué)和血清學(xué)完全不同的類型存在(Murtaugh，M.P等，1995，Arch-Virol，140，1451-1460；Suarez，P等，1996，病毒研究42159-165)。據(jù)信，本世紀80年代，這兩種類型最初是分開進入豬群體的，一個在北美，另一個在歐洲，其來源是未知的生物源，可能來源于嚙齒類動物或禽類。1991年荷蘭人分離得到以原型“Lelystad病毒”為代表的歐洲型并測定了該病毒的序列(Terpstra，C等，1991，Vet.Quart.13131-136；Wensvoort，G等，1991，Vet.Quart.13121-130；Wensvoort，G等，WO 92/213751992(PCT/NL92/00096)，1992；Meulenberg，J.J.M等，1993，病毒學(xué)，19262-72)。
在分類上，北美PRRS病毒和歐洲PRRS病毒都屬于馬動脈炎病毒科，該科中還包括馬動脈炎病毒，乳酸脫氫酶增高病毒和猿猴出血熱病毒。馬動脈炎病毒屬于Nidovirales目的病毒，該目中還包括冠狀病毒和torovirus。Nidovirus是包膜病毒，其基因組由單鏈正極性RNA組成，正鏈RNA病毒的基因組RNA起雙重作用，即遺傳信息的存儲和表達。Nidovirus的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄不涉及DNA，因此，Nidovirus基因組RNA的增殖是基因組復(fù)制和mRNA轉(zhuǎn)錄聯(lián)合的過程。另外，一些蛋白質(zhì)直接由Nidovirus基因組RNA翻譯而來。最近，Snijder和Meulenberg評述了馬動脈炎病毒科的分子生物學(xué)(Snijder，E.J和Meulenberg，J.J.M.，1998，普通病毒學(xué)雜志79961-979)。
目前，市售的抗PRRS疫苗或者是常規(guī)的經(jīng)修飾活病毒(減毒的細胞培養(yǎng)物)，或者是常規(guī)的滅活病毒(強毒病毒的無活性細胞培養(yǎng)物制品)。其中幾個疫苗的安全性和/或效力受到批評。因此，很有必要基于對PRRS基因組進行特異性添加、缺失和其它修飾開發(fā)第二代PRRS疫苗。然而，由于PRRS病毒在其復(fù)制過程中不涉及任何DNA中間體，因此，制備這種疫苗迫切需要構(gòu)建PRRS病毒的全長cDNA克隆，以通過分子生物學(xué)技術(shù)在DNA水平上進行操作。最近，已報道了歐洲PRRS病毒的全長感染性cDNA克隆(Meulenberg，J.J.M.，1998，文獻同上；Meulenberg，J.J.M.，1988，病毒學(xué)雜志，72，380-387)。
上述文獻以及本申請下文提及的所有其它參考文獻都全文列入本文作為參考。
本發(fā)明提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
本發(fā)明還提供了由上述分離的多核苷酸分子編碼的分離的感染性RNA分子，和與其同源的分離的感染性RNA分子，所述分離的感染性RNA分子各編碼北美PRRS病毒。
本發(fā)明還提供了載體(如質(zhì)粒)形式的上述分離的多核苷酸分子，所述分子編碼感染性RNA分子。
本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA的病毒載體，所述RNA分子編碼北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的轉(zhuǎn)染宿主細胞，所述RNA分子編碼北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ IDNO1或其同源序列，該轉(zhuǎn)染宿主細胞能表達所編碼的北美PRRS病毒。
本發(fā)明還提供了制備基因修飾型北美PRRS病毒的方法，所述方法包括突變本發(fā)明編碼感染性RNA分子的DNA序列，所述RNA分子編碼北美PRRS病毒，突變之后由該DNA序列表達基因修飾型北美PRRS病毒。
本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼基因修飾型北美PRRS病毒。在優(yōu)選的實施方案中，PRRS病毒經(jīng)基因修飾使得當其感染豬時，a)不能在動物體內(nèi)產(chǎn)生PRRS，和b)能在動物體內(nèi)產(chǎn)生抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答。在特定的實施方案中，該DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一個或多個突變，該突變在遺傳學(xué)上使得編碼的PRRS病毒不能產(chǎn)生PRRS。
本發(fā)明還提供了由上述分離的多核苷酸分子編碼的分離的感染性RNA分子，和與其同源的分離的感染性RNA分子，所述分離的感染性RNA分子各編碼經(jīng)基因修飾不能產(chǎn)生PRRS的北美PRRS病毒。
本發(fā)明還提供了由上述感染性RNA分子編碼的基因修飾型北美PRRS病毒，所述基因修飾型北美PRRS病毒被滅活，使得當其感染豬時，不能在動物體內(nèi)產(chǎn)生PRRS，但能激發(fā)動物體內(nèi)對PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答。
本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的病毒載體，所述RNA分子編碼上述基因修飾型北美PRRS病毒。
本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的轉(zhuǎn)染宿主細胞，所述RNA分子編碼上述基因修飾型北美PRRS病毒。
本發(fā)明還提供了保護豬免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能有效產(chǎn)生抗PRRS病毒感染之免疫保護的上述基因修飾型北美PRRS病毒；上述編碼基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子；質(zhì)粒形式的上述編碼基因修飾型北美PRRS病毒的分離的多核苷酸分子；或上述編碼基因修飾型北美PRRS病毒的病毒載體；和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明還提供了保護豬免受PRRS病毒感染的方法，所述方法包括用其量能有效產(chǎn)生抗PRRS病毒感染之免疫保護的上述疫苗免疫動物。
本發(fā)明還提供了另外含有編碼異源抗原性表位之核苷酸序列的上述任何多核苷酸分子，以及相應(yīng)的感染性RNA分子、載體、被感染的宿主細胞、基因修飾型北美PRRS病毒、疫苗和給哺乳動物和/或禽類施用該疫苗的方法。所述異源抗原性表位可得自目前已知的或?qū)泶_定的任何抗原性表位。在非限制性的實施方案中，所述抗原性表位得自能致病性感染禽類或非豬哺乳動物(如人)的病原體，并能誘導(dǎo)有效抗所述病原體的免疫保護性應(yīng)答。在另一個非限制性的實施方案中，所述抗原性表位得自豬病原體而不是北美PRRS病毒，并能誘導(dǎo)有效抗該豬病原體的免疫保護性應(yīng)答。在另一個非限制性的實施方案中，所述抗原性表位是可測的抗原性表位。
本發(fā)明還提供了缺乏一個或多個可測抗原性表位的上述任何多核苷酸分子，以及相應(yīng)的感染性RNA分子、載體、被感染的宿主細胞、基因修飾型北美PRRS病毒、疫苗和給哺乳動物和/或禽類施用該疫苗的方法。
本發(fā)明還提供了含有一個或多個編碼北美PRRS病毒所編碼之肽的核苷酸序列的分離多核苷酸分子，其中所述北美PRRS病毒的基因組序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
本發(fā)明還提供了含有一個或多個編碼北美PRRS病毒所編碼之肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)染宿主細胞，其中所述北美PRRS病毒的基因組序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
本發(fā)明還提供了基因修飾型Nidovirales病毒，該經(jīng)修飾病毒在被其免疫的哺乳動物或禽類中可引發(fā)有效免疫保護性應(yīng)答，通過得到含有編碼感染性RNA分子之DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼野生型Nidovirales病毒；對該DNA序列進行基因突變以得到含有編碼感染性RNA分子之DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼基因修飾型Nidovirales病毒，該病毒在哺乳動物或禽類中不能產(chǎn)生致病性感染，但能引發(fā)有效抗野生型Nidovirales病毒感染的免疫保護性應(yīng)答；由所得的分離的多核苷酸分子表達基因修飾型Nidovirales病毒，即可制備所述經(jīng)基因修飾型Nidovirales病毒。
本發(fā)明還提供了制備基因修飾型Nidovirales病毒的方法，所述經(jīng)修飾病毒在被其免疫的哺乳動物或禽類中能引發(fā)免疫保護性應(yīng)答，該方法包括得到含有編碼感染性RNA分子之DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼野生型Nidovirales病毒；對該DNA進行基因突變以得到含有編碼感染性RNA分子之DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼基因修飾型Nidovirales病毒，所述病毒在哺乳動物或禽類中不能產(chǎn)生致病性感染，但能引發(fā)有效抗野生型Nidovirales病毒感染的免疫保護性應(yīng)答；由所得的分離的多核苷酸分子表達基因修飾型Nidovirales病毒。
本發(fā)明還提供了能保護哺乳動物或禽類免受Nidovirales病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能在經(jīng)其免疫的哺乳動物或禽類中有效產(chǎn)生抗野生型Nidovirales病毒之有效免疫保護性應(yīng)答的上述基因修飾型Nidovirales病毒，和藥物學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。


圖1構(gòu)建北美PRRS病毒之全長感染性cDNA克隆，pT7P129A的克隆策略，箭頭表示T7啟動子序列。
圖2用P129A或重組PRRS病毒rP129A-1感染之后的血清病毒血癥，通過MARC-145細胞上的噬斑試驗測定。檢測的下限是5pfu/ml(或log 0.7)。
圖3用P129A或重組PRRS病毒rP129A-1感染之后的抗-PRRS病毒血清抗體，通過HerdChek PRRS ELISA試驗(IDEXX(Westbrook，Maine，USA))測定。
本文所述的分離的多核苷酸分子的制備和操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，也可根據(jù)其它文獻所述進行制備和操作，如Maniatis等，1989，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，分子生物學(xué)最新方法，Greene Publishing Associates &Wiley interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Innis等(編)，1995，PCR策略，Academic出版公司，San Diego；Erlich(編)，1992，PCR技術(shù)，牛津大學(xué)出版社，紐約，上述文獻皆列入本文作為參考。A.編碼北美PRRS病毒的分離的多核苷酸分子和RNA分子，和編碼基因修飾型北美PRRS病毒的分離的多核苷酸分子和RNA分子本發(fā)明提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼北美PRRS病毒。本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼基因修飾型北美PRRS病毒。
本發(fā)明特別提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1中從核苷酸1開始至核苷酸15,416的序列(包括核苷酸1和15,416)，不同的是對應(yīng)于SEQ ID NO1之核苷酸12,622的核苷酸是鳥嘌呤而不是腺嘌呤，對應(yīng)于SEQ ID NO1之核苷酸1,559的核苷酸是胸腺嘧啶而不是胞嘧啶。所述DNA序列編碼感染性RNA分子，該RNA分子是北美PRRS分離物P129的RNA基因組。
應(yīng)理解，除非特別說明，本文有關(guān)核酸分子的術(shù)語，如“分離的多核苷酸分子”，“核苷酸序列”，“開放閱讀框(ORF)”等包括DNA和RNA分子，并包括單鏈和雙鏈分子。除非特別說明，當提及本申請“序列表”部分的特定序列時，指的是“序列表”中的DNA以及與DNA序列對應(yīng)的RNA，包括與DNA和RNA序列互補的序列。在本申請的上下文中，“對應(yīng)于”是指DNA和RNA序列彼此相同，但事實上RNA序列含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶，RNA分子的骨架含有核糖而不是脫氧核糖。
例如，SEQ ID NO1是對應(yīng)于北美PRRS病毒之RNA基因組的DNA序列，因此，與SEQ ID NO1所示DNA序列互補的DNA序列是北美PRRS病毒之RNA基因組(即編碼北美PRRS病毒的RNA)的模板，即與該基因組互補或“編碼”該基因組。然而，本文提及的SEQ ID NO1包括對應(yīng)于SEQ ID NO1的RNA序列和與SEQ ID NO1互補的DNA序列。
另外，當本文提及序列表中序列的同源序列時，應(yīng)理解也包括序列表中序列之對應(yīng)序列的同源序列和序列表中序列之互補序列的同源序列。
本發(fā)明中的“感染性RNA分子”是編碼病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和在適當宿主細胞中翻譯成功能性病毒粒所必需之元件的RNA分子，宿主細胞需滿足的條件是必要時含有一個或多個肽以補償該RNA分子中的任何基因修飾，如序列缺失。
“分離的感染性RNA分子”指的是含有上述感染性RNA分子的物質(zhì)組分，如果所述RNA分子實際上存在于自然界，則其已由天然狀態(tài)純化為任何可測的水平。類似地，“分離的多核苷酸分子”指的是含有本發(fā)明多核苷酸分子的物質(zhì)組分，如果所述多核苷酸分子實際上存在于自然界，則其已由天然狀態(tài)純化為任何可測的水平。
為了本發(fā)明目的，當根據(jù)遺傳密碼的簡并性，第二個多核苷酸分子的核苷酸序列編碼的多氨基酸與第一個多核苷酸分子的核苷酸序列所編碼的相同，或第二個多核苷酸分子的核苷酸序列編碼的多氨基酸與第一個多核苷酸分子的核苷酸序列所編碼的多氨基酸足夠類似，從而可用于本發(fā)明實踐時，則第二個多核苷酸分子(RNA或DNA)的核苷酸序列與第一個多核苷酸分子的核苷酸序列“同源”。為了本發(fā)明目的，當多核苷酸分子可用作診斷探針，通過例如標準雜交或擴增技術(shù)檢測被感染的豬的體液或組織樣品中北美PRRS病毒的存在時，則它可用于本發(fā)明實踐。應(yīng)理解由多核苷酸分子的核苷酸序列編碼的多氨基酸可含有兩個或多個多氨基酸的一個組。一般而言，根據(jù)BLASTN算法(國家生物技術(shù)信息中心，也稱之為美國國立衛(wèi)生研究院的NCBI(Bethesda，Maryland，USA))，如果第二個多核苷酸分子與第一個多核苷酸分子至少約有70％的核苷酸序列相同，則第二個多核苷酸分子的核苷酸序列與第一個多核苷酸分子的核苷酸序列同源。優(yōu)選同源的核苷酸序列至少約有75％的核苷酸序列相同，甚至更優(yōu)選至少約有85％的核苷酸序列相同。由于遺傳密碼存在簡并性，同源的核苷酸序列可包括任何數(shù)目的“沉默”堿基變化，即仍編碼相同氨基酸的核苷酸取代。同源的核苷酸序列還可包括非沉默突變，即導(dǎo)致所編碼的多氨基酸中有氨基酸差異的堿基取代、缺失或添加，只要序列保持與第一個核苷酸序列所編碼的多氨基酸至少約70％相同，或可用于本發(fā)明實踐即可。通過例如使用上述BLASTN比較核苷酸序列可測定同源的核苷酸序列?；蛘?，可通過在選定條件下進行雜交來測定同源的核苷酸序列。例如，如果在中度嚴緊的條件下，如于65℃在0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA中與結(jié)合于濾膜上的DNA雜交，并于42℃在0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌(見Ausubel等，文獻同上)，或在導(dǎo)致與如下文所限定的編碼北美PRRS病毒之序列發(fā)生雜交的條件下，第二個多核苷酸分子的核苷酸序列能與SEQ ID NO1的互補物雜交，則該核苷酸序列與SEQ ID NO1同源。在另一個實施方案中，如果在高度嚴緊的條件下，如于65℃在0.5M NaHPO4，7％SDS，1mM EDTA中與結(jié)合于濾膜上的DNA雜交，并于68℃在0.1×SSC/0.1％SDS中洗滌(見Ausubel等，文獻同上)，第二個多核苷酸分子的核苷酸序列能與SEQ ID NO1的互補物雜交，則該核苷酸序列與SEQ ID NO1同源。
另外，應(yīng)理解本發(fā)明分離的多核苷酸分子和分離的RNA分子包括合成的分子和通過重組技術(shù)，如體外克隆和轉(zhuǎn)錄得到的分子。
本文所用術(shù)語“PRRS”包括由PRRS病毒感染導(dǎo)致的豬疾病綜合征。這種綜合征的例子包括但不限于懷孕母豬的流產(chǎn)，生長緩慢，呼吸困難，食欲差和幼豬的死亡。本文所用的“不能產(chǎn)生PRRS”的PRRS病毒指的是能感染豬，但不會在豬中產(chǎn)生任何與PRRS感染相關(guān)的疾病綜合征，或產(chǎn)生較低程度的所述綜合征，或產(chǎn)生較少的所述綜合征，或產(chǎn)生較少且程度較低的綜合征的病毒。
術(shù)語“豬”指的是身為豬科中一員的任何動物，如豬?！安溉閯游铩卑ú溉榫V的任何恒溫脊椎動物，包括人。
除非特別說明，本文所用術(shù)語“PRRS病毒”指的是北美或歐洲PRRS病毒的任何病毒株。
術(shù)語“北美PRRS病毒”指的是具有與北美PRRS病毒分離物相關(guān)之遺傳特征的任何PRRS病毒，例如，但不限于90年代初首次在美國分離的PRRS病毒(例見Collins，J.E等，1992，J.Vet.Diagn.Invest，4117-126)；北美PRRS病毒分離物MN-1b(Kwang，J等，1994，J.Vet.Diagn.Invest，6293-296)；PRRS的Quebec IAF-exp91毒株(Mardassi，H等，1995，Arch.Virol.1401405-1418)；和北美PRRS病毒分離物VR 2385(Meng.X.J等，1994，普通病毒學(xué)雜志，751795-1801)。遺傳特征指的是諸北美PRRS病毒株共有的基因組核苷酸序列相似性和氨基酸序列相似性。為了本發(fā)明目的，北美PRRS病毒是由與SEQ ID NO1相同或與其同源的RNA序列編碼的病毒，其中術(shù)語“同源”如上文所定義。因此，優(yōu)選北美PRRS病毒株具有與SEQID NO1至少約70％的基因組核苷酸序列同一性，更優(yōu)選具有與SEQ IDNO1至少約75％的基因組核苷酸序列同一性，甚至更優(yōu)選具有與SEQID NO1至少約85％的基因組核苷酸序列同一性。
術(shù)語“歐洲PRRS病毒”指的是具有與1991年首次在歐洲分離的PRRS病毒(例見Wensvoort，G等，1991，Vet.Q.13121-130)相關(guān)之遺傳特征的任何PRRS病毒株。在本領(lǐng)域中，“歐洲PRRS病毒”有時也指“Lelystad病毒”。
除非特別說明，如果北美PRRS病毒的特征在上文所述北美PRRS病毒的定義范圍內(nèi)，該北美PRRS病毒即可“用于本發(fā)明實踐”。例如，如果由本發(fā)明分離的多核苷酸分子之一編碼的病毒具有與北美PRRS病毒相關(guān)的遺傳特征，那么該病毒是“可用于本發(fā)明實踐的北美PRRS病毒”。
如果其它多氨基酸，如與北美PRRS病毒ORF同源的多核苷酸序列所編碼的肽，可以在轉(zhuǎn)染的宿主細胞中補償編碼基因修飾型PRRS病毒的RNA分子(所述RNA分子表達功能性PRRS毒粒所必需的基因缺損)以使細胞能產(chǎn)生功能性的PRRS毒粒，那么這些多氨基酸可“用于本發(fā)明實踐”。
本文所用術(shù)語“開放閱讀框”或“ORF”指的是編碼特定PRRS病毒蛋白所需的無間插終止密碼子的最短的核苷酸序列。
除非特別說明，術(shù)語“適當?shù)乃拗骷毎敝傅氖强杀槐景l(fā)明RNA分子(或含有編碼所述RNA分子之DNA序列的分離的多核苷酸分子或病毒載體)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞?？杀凰鯮NA分子、分離的多核苷酸分子或病毒載體轉(zhuǎn)染的“適當?shù)乃拗骷毎卑ú溉閯游?尤其是豬)的細胞和禽細胞，下文中將更詳細地描述這些細胞。
“功能性毒粒”是能進入可作為PRRS病毒宿主的細胞，并能在細胞內(nèi)表達特定RNA基因組(未經(jīng)修飾的基因組或如本文所述的基因修飾型基因組)之基因的病毒顆粒?？勺鳛镻RRS病毒宿主的細胞包括豬塵細胞和MARC 145猴腎細胞。其它哺乳動物或禽細胞，尤其是其它豬細胞，也可用作PRRS毒粒的適當宿主細胞。
本發(fā)明分離的多核苷酸分子編碼北美PRRS病毒，下文中將要詳細描述的是使用本領(lǐng)域已知的方法，用北美PRRS病毒制備活的，滅活的或減毒的疫苗，以用于保護豬免受PRRS病毒的感染。這些分離的多核苷酸分子也可用作載體將異源基因傳遞至包括豬的哺乳動物或禽內(nèi)，這一點將在下文中描述。另外，由于使用分子生物學(xué)技術(shù)可突變這些分離的多核苷酸分子，使其編碼可特別地用作保護豬免受PRRS病毒感染之疫苗的基因修飾型北美PRRS病毒，因此，這些分離的多核苷酸分子是有用的。所述基因修飾型北美PRRS病毒以及含有所述病毒的疫苗將在下文中詳細描述。
因此，本發(fā)明還提供了制備基因修飾型北美PRRS病毒的方法，所述方法包括按上述突變編碼感染性RNA分子的DNA序列，所述RNA分子編碼北美PRRS病毒，并使用適當?shù)谋磉_系統(tǒng)表達基因修飾型北美PRRS病毒。使用本領(lǐng)域已知的適當表達系統(tǒng)，由分離的多核苷酸分子可表達野生型或基因修飾型北美PRRS病毒，其實施例描述于本申請中。例如，該分離的多核苷酸分子可以是能在體外在適當宿主細胞中表達所編碼病毒的質(zhì)粒形式，有關(guān)內(nèi)容將在下文中描述。
除非特別說明，本文所用術(shù)語“經(jīng)基因修飾”指的是發(fā)生了基因突變，即有一個或多個核苷酸被取代、缺失和/或添加。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組技術(shù)，包括定點誘變或隨機誘變，如暴露于化學(xué)誘變劑或放射線中，可對多核苷酸分子進行基因突變，這在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的。在一個實施方案中，對本發(fā)明之北美PRRS病毒的基因修飾使得該病毒不能在本來可以使野生型病毒在其中有效復(fù)制的禽或哺乳動物中有效復(fù)制，或降低了其有效復(fù)制的能力。在另一個實施方案中，本發(fā)明之基因修飾型北美PRRS病毒能在被其感染的禽或哺乳動物中有效復(fù)制?！坝行?fù)制”指的是在被感染的動物體內(nèi)復(fù)制和產(chǎn)生子代病毒(毒粒)的能力，即“生產(chǎn)性感染”動物的能力。
本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子之DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼不能在豬體內(nèi)產(chǎn)生PRRS的基因修飾型北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一個或多個突變，在遺傳學(xué)上使得編碼的PRRS病毒失去產(chǎn)生PRRS的能力?！斑z傳學(xué)上失活”指的是PRRS病毒不能在被其感染的豬中產(chǎn)生PRRS。
在一個實施方案中，不能導(dǎo)致PRRS的基因修飾型北美PRRS病毒在豬中能引發(fā)抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答。因此，本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼基因修飾型北美PRRS病毒，所述基因修飾型北美PRRS病毒感染豬時，a)不能在動物體內(nèi)產(chǎn)生PRRS，和b)能在動物體內(nèi)引發(fā)抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答，其中編碼所述北美PRRS病毒的DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一個或多個突變，該突變在遺傳學(xué)上使得編碼的PRRS病毒不能產(chǎn)生PRRS。
本發(fā)明所用術(shù)語“免疫應(yīng)答”指的是產(chǎn)生針對一個或多個特定抗原性表位或有助于其分解或受抑制的抗體和/或細胞(如T淋巴細胞)。本發(fā)明所用的短語“有效免疫保護性應(yīng)答”、“免疫保護”和類似術(shù)語，指的是抗病原體的一個或多個抗原性表位，從而保護經(jīng)免疫動物免受病原體感染的免疫應(yīng)答。對本發(fā)明而言，抗病原體感染的保護作用不僅包括絕對防止感染，也包括與未經(jīng)免疫的感染動物相比，經(jīng)免疫的動物中病原體感染的程度或速度有任何可測的降低，或由病原體感染引起的疾病或任何綜合征或狀況的嚴重程度有任何可測的降低。在以前未被該病原體感染和/或免疫時未被該病原體感染的動物中可誘導(dǎo)有效免疫保護性應(yīng)答。也可以在免疫時已被病原體感染的動物中誘導(dǎo)有效免疫保護性應(yīng)答。
除非特別說明，“抗原性表位”指的是能在特定動物或物種中引發(fā)免疫應(yīng)答的分子。抗原性表位是含蛋白質(zhì)的分子，即多氨基酸序列，任選含有非蛋白質(zhì)基團，如碳水化合物組成成分和/或脂質(zhì)組成成分的多氨基酸序列。
本文所用術(shù)語“致病性感染”指的是病原體感染動物并導(dǎo)致動物患病的能力。例如，PRRS病毒能致病性感染豬，因為它可導(dǎo)致豬患PRRS。然而，盡管PRRS病毒或許能夠生產(chǎn)性地或非生產(chǎn)性地感染禽或其它哺乳動物，如人，但它不會致病性地感染除豬以外的任何動物，因為它在除豬以外的動物中不會導(dǎo)致任何疾病。
在一個實施方案中，由上述分離的多核苷酸分子編碼的基因修飾型北美PRRS病毒能引發(fā)抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答。優(yōu)選這種基因修飾型北美PRRS病毒能引發(fā)抗任何PRRS病毒株，包括歐洲和北美病毒株的有效免疫保護性應(yīng)答。
在一個實施方案中，編碼遺傳學(xué)上失活的北美PRRS病毒的分離多核苷酸分子中所含一個或多個突變是非沉默的，出現(xiàn)在編碼北美PRRS病毒之核苷酸序列的一個或多個開放閱讀框中；即這個(些)突變出現(xiàn)在編碼北美PRRS病毒之核苷酸序列內(nèi)與SEQ ID NO1之ORF 1a，1b，2，3，4，5，6或7相同或同源的一個或多個序列中。在一個實施方案中，這個(些)突變出現(xiàn)在北美PRRS病毒基因組的一個或多個非編碼區(qū)中，如北美PRRS病毒基因組的前導(dǎo)序列中；即這個(些)突變出現(xiàn)在與SEQ ID NO1之核苷酸1-191序列相同或同源的序列中。在相同的分離的多核苷酸分子中，突變可出現(xiàn)在編碼區(qū)和非編碼區(qū)。
除非特別說明，本文所用的編碼北美PRRS病毒之核苷酸序列的“非編碼區(qū)”指的是不翻譯成蛋白質(zhì)的RNA序列和編碼這種RNA序列的cDNA序列。編碼區(qū)指的是由其表達北美PRRS病毒蛋白質(zhì)的RNA序列，也指編碼這種RNA序列的cDNA。類似地，“ORF”指的是編碼北美PRRS病毒之蛋白質(zhì)的RNA序列，也指編碼這種RNA序列的cDNA序列。
根據(jù)本文提供的SEQ ID NO1可測定出編碼在遺傳學(xué)上失活、使得不能產(chǎn)生PRRS但仍能引發(fā)抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答的北美PRRS病毒之一個或多個突變的適當位置。本領(lǐng)域技術(shù)人員參照本發(fā)明提供的北美PRRS病毒之感染性cDNA克隆的序列，可制備導(dǎo)致突變的序列變化，并檢測所編碼的病毒在豬中產(chǎn)生PRRS和引發(fā)抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答的能力。為此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照本領(lǐng)域已知的技術(shù)和本文所述和/或例舉的技術(shù)。
例如，可突變編碼北美PRRS病毒之感染性RNA分子的編碼序列的ORF，并檢測所得的基因修飾型北美PRRS病毒導(dǎo)致PRRS的能力。北美PRRS病毒的ORF編碼下列蛋白質(zhì)ORF 1a編碼含有蛋白酶功能的多蛋白；ORF 1b編碼含有復(fù)制酶(RNA聚合酶)和解旋酶功能的多蛋白；ORF2，3和4編碼小的膜糖蛋白；ORF 5編碼主要包膜糖蛋白；ORF 6編碼未糖基化的膜內(nèi)在蛋白；ORF 7編碼核殼蛋白。其中一個或多個ORF的基因突變可用于制備本文所述的基因修飾型北美PRRS病毒。
本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子之DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼經(jīng)基因修飾而含有一個或多個異源抗原性表位的北美PRRS病毒，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，該多核苷酸分子進一步含有一個或多個各編碼并源抗原性表位的其它核苷酸序列，其中各個異源抗原性表位能在哺乳動物或禽類中誘導(dǎo)抗特定病原體的有效免疫保護性應(yīng)答。
利用本發(fā)明上述方面可以誘導(dǎo)針對其的有效免疫保護性應(yīng)答的病原體是能導(dǎo)致哺乳動物或禽類患病的任何病原體，如病毒，細菌，真菌或原生動物，所述病原體含有或具有一個或多個相關(guān)的抗原性表位，可使用該表位在哺乳動物或禽類中誘導(dǎo)抗該病原體的有效免疫保護性應(yīng)答。
本發(fā)明所用術(shù)語“異源抗原性表位”指的是上文所定義的一般不存在于野生型北美PRRS病毒中的抗原性表位。可使用已知的重組技術(shù)將編碼異源抗原性表位的核苷酸序列插入北美PRRS病毒的基因組中。可用作本發(fā)明異源抗原性表位的抗原性表位包括其它北美PRRS病毒抗原性表位，歐洲PRRS病毒的抗原性表位，除PRRS病毒外的豬病原體的抗原性表位，或能致病性感染除豬以外的禽類或哺乳動物(包括人)之病原體的抗原性表位。編碼所述抗原性表位的序列是本領(lǐng)域已知的或由本文提供。例如，可將由本文所述北美PRRS ORF 5編碼的第二個北美PRRS病毒包膜蛋白插入本發(fā)明編碼北美PRRS病毒之RNA分子的DNA編碼序列中，以產(chǎn)生基因修飾型北美PRRS病毒，該病毒含有其它包膜蛋白作為異源抗原性表位?？墒褂眠@種基因修飾型北美PRRS病毒在經(jīng)其免疫的豬中誘導(dǎo)抗PRRS病毒的更有效免疫保護性應(yīng)答。
除北美PRRS病毒以外的豬病原體抗原性表位的例子包括但不限于選自下列的豬病原體的抗原性表位歐洲PRRS，豬細小病毒，豬circovirus，豬輪狀病毒，豬流感病毒，假狂犬病病毒，傳染性胃腸炎病毒，豬呼吸冠狀病毒，典型的豬熱病毒，非洲豬熱病毒，腦心肌炎病毒，豬副粘病毒，大葉性肺炎放線桿菌，炭疽芽孢桿菌，支氣管炎博德特氏菌，溶血梭菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，破傷風(fēng)梭菌，大腸桿菌，豬紅斑丹毒絲菌，副豬嗜血菌，鉤端螺旋體，豬肺炎枝原體，豬鼻枝原體，溶血巴斯德氏菌，多殺巴斯德氏菌，豬霍亂沙門氏菌，鼠傷寒沙門氏菌，似馬鏈球菌和豬鏈球菌。編碼上述豬病原體之抗原性表位的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的，并可得自公開的基因數(shù)據(jù)庫，如NCBI提供的GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.html)。
如果異源抗原性表位是一種或多種其它豬病原體的抗原性表位，那么分離的多核苷酸分子可進一步含有一個或多個突變，該突變在遺傳學(xué)上使得編碼的PRRS病毒失去產(chǎn)生PRRS的能力。所述分離的多核苷酸分子及其編碼的病毒可用于制備疫苗，該疫苗可保護豬使其免受衍生得到該異源抗原性表位的諸豬病原體的感染。
在優(yōu)選的實施方案中，基因修飾型北美PRRS病毒能在豬中引發(fā)抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答。所述分離的多核苷酸分子及其編碼的病毒可用于制備雙重功能的疫苗，該疫苗可保護豬免受北美PRRS病毒和衍生得到該異源抗原性表位的諸豬病原體的感染。在另一個優(yōu)選的實施方案中，可用于雙重功能疫苗的基因修飾型北美PRRS病毒在遺傳學(xué)上是失活的。
使用分子生物學(xué)的已知技術(shù)，根據(jù)本文所述的編碼北美PRRS病毒的序列，可按上述制備含有編碼異源抗原性表位之核苷酸序列的本發(fā)明分離的多核苷酸分子。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明基因修飾型北美PRRS病毒的異源抗原性表位是可測的抗原性表位。所述分離的多核苷酸分子及其編碼的北美PRRS病毒可特別地用于研究PRRS病毒對豬的感染，成功確定經(jīng)免疫的豬，和/或?qū)⒔?jīng)免疫的豬與被野生型PRRS病毒感染的豬區(qū)分開。優(yōu)選所述分離的多核苷酸分子還含有一個或多個突變，該突變在遺傳學(xué)上使得編碼的PRRS病毒失去產(chǎn)生PRRS的能力，更優(yōu)選該突變能在豬中引發(fā)抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答。
可測的異源抗原性表位及其編碼序列是本領(lǐng)域已知的，檢測所述抗原性表位的技術(shù)也是本領(lǐng)域已知的，包括利用例如Western印跡，ELISA或熒光標記的能與特異于該異源抗原性表位的抗體結(jié)合的抗體血清學(xué)檢測特異于異源抗原性表位的抗體?？捎糜诒景l(fā)明實踐的血清學(xué)檢測技術(shù)描述于本領(lǐng)域公知的文獻中，如Coligan，J.E等(編)，1998，免疫學(xué)最新方法，John Willey & Sons公司，該文獻全文列入本文作為參考?；蛘?，通過例如將潛在含有該抗原性表位的樣品與能異性結(jié)合抗原性表位的熒光標記抗體或放射性標記抗體接觸，可檢測異源抗原性表位自身。
本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子的DNA序列的分離的多核苷酸分子，所述RNA分子編碼基因修飾型北美PRRS病毒，所述病毒可測地缺乏北美PRRS病毒抗原性表位，其中編碼所述北美PRRS病毒之RNA分子的DNA編碼序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它缺乏一個或多個編碼可測的北美PRRS病毒抗原性表位的核苷酸序列。這種分離的多核苷酸分子可用于區(qū)分被本發(fā)明重組北美PRRS病毒感染的豬和被野生型PRRS病毒感染的豬。例如，根據(jù)特異于缺失抗原性表位的抗體的缺乏，或根據(jù)該抗原性表位自身的缺乏，可區(qū)分被滅活的、活的或減毒的由這種分離的多核苷酸分子編碼的北美PRRS病毒免疫的動物與被野生型PRRS感染的動物如果在動物中檢測到特異于該缺失抗原性表位的抗體，或該抗原性表位自身，則該動物接觸過并感染了野生型PRRS病毒。如上文所述，檢測抗原性表位和特異于抗原性表位之抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選所述分離的多核苷酸分子還含有一個或多個突變，該突變在遺傳學(xué)上使得編碼的PRRS病毒失去產(chǎn)生PRRS的能力，更優(yōu)選編碼的病毒能引發(fā)抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答。B.編碼北美PRRS病毒或基因修飾型北美PRRS病毒的質(zhì)粒本發(fā)明還提供了質(zhì)粒形式的任何上述分離的多核苷酸分子，所述質(zhì)粒能表達由其編碼的北美PRRS病毒。
本發(fā)明質(zhì)?？稍诨钌矬w外表達所編碼的北美PRRS病毒，產(chǎn)生可特別地用于制備疫苗的本發(fā)明北美PRRS病毒。在一個實施方案中，可在活生物體外表達北美PRRS病毒的本發(fā)明質(zhì)粒是其中病毒RNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在體外(即細胞外)的質(zhì)粒；使用已知的轉(zhuǎn)染機理，如電穿孔，脂轉(zhuǎn)染(有時使用可商購試劑，如LipofectinTM(Life Technologies公司，Rockville，Maryland，USA))或DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，將所得病毒RNA分子轉(zhuǎn)染至適當?shù)乃拗骷毎小Ｆ渌D(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域已知的，可用于本發(fā)明中。可體外轉(zhuǎn)錄北美PRRS病毒RNA的質(zhì)粒的例子是質(zhì)粒pT7P129A(ATCC登記號203488)。在本發(fā)明質(zhì)粒中可使用對體外轉(zhuǎn)錄有用的任何啟動子。T7是這樣一個啟動子，但也可以使用其它啟動子，如SP6啟動子或T3啟動子。所述啟動子的序列可以人工合成或克隆自商購質(zhì)粒?？捎糜谥苽淠鼙磉_北美PRRS病毒之質(zhì)粒的適當質(zhì)粒包括但不限于通用的克隆載體質(zhì)粒，如pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)，pBR322和pUC18?？墒褂靡阎亟M技術(shù)將編碼北美PRRS病毒的本發(fā)明核苷酸序列插入上述任何質(zhì)粒中。可插入本發(fā)明多核苷酸分子的其它質(zhì)粒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
由含有編碼北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的上述任何重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄病毒RNA的適當條件取決于質(zhì)粒的類型，例如其特定的啟動子，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定此條件。例如，如果本發(fā)明質(zhì)?；诘氖呛蠺7啟動子的pCR2.1質(zhì)粒，那么體外轉(zhuǎn)錄的適當條件包括例如在標準緩沖液中將質(zhì)粒與T7 RNA聚合酶和核糖核苷酸反應(yīng)，并在37℃將反應(yīng)物保溫約30分鐘。有時可使用能由特定質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄RNA的商購試劑盒，本發(fā)明中即可使用這種試劑盒?？蓪⑽唇?jīng)純化的轉(zhuǎn)錄后反應(yīng)混合物直接轉(zhuǎn)染至適當?shù)乃拗骷毎校蛘呖稍谵D(zhuǎn)染前通過已知的RNA純化技術(shù)，例如有機(如苯酚)提取和醇(如乙醇或異丙醇)沉淀純化轉(zhuǎn)錄的北美PRRS病毒RNA。
實踐中，可用按上述得到的北美PRRS病毒RNA轉(zhuǎn)染任何哺乳動物或禽類細胞培養(yǎng)物，以產(chǎn)生第一代北美PRRS毒粒。因其易于得到并易于使用而特別有用的細胞例子是BHK(幼倉鼠腎)細胞。然而，如果希望產(chǎn)生能持續(xù)生產(chǎn)北美PRRS毒粒的細胞培養(yǎng)物，則優(yōu)選使用豬塵細胞或MARC-145細胞(Kim，H.S等，文獻同上)，因為這些細胞在經(jīng)PRRS病毒感染之后可分泌高水平的新一代PRRS毒粒。也可使用衍生自MA-104細胞系的其它細胞系以持續(xù)產(chǎn)生本發(fā)明北美PRRS毒粒。通過對豬進行肺灌洗可得到原代豬塵細胞，從國家獸醫(yī)部門實驗室(另稱為NVSL)(Ames，Iowa，USA)可得到MARC-145猴腎細胞系。
在另一個實施方案中，可在活生物體外表達本發(fā)明北美PRRS病毒的質(zhì)粒是通過例如電穿孔或脂轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染至適當?shù)乃拗骷毎械馁|(zhì)粒，該質(zhì)粒對感染性RNA分子的轉(zhuǎn)錄和對北美PRRS病毒的表達發(fā)生在轉(zhuǎn)染的宿主細胞中，因此，經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細胞產(chǎn)生了北美PRRS毒粒。迄今為止尚未公開或暗示過Nidovirales目內(nèi)任何病毒可以使用這種完全細胞法。由于Nidovirales目病毒之RNA基因組中可能存在隱蔽剪接和終止序列，據(jù)信表達Nidovirales病毒的完全細胞法是不可能的。隱蔽序列包括RNA剪接供體和剪接受體序列(它可導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄物的不適當剪接)以及聚腺苷酸化序列，從而導(dǎo)致細胞RNA聚合酶II在成熟前終止。然而，本發(fā)明闡明當將含有Nidovirus之cDNA克隆的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染至適當?shù)乃拗骷毎麜r，該質(zhì)粒中這種序列的存在不會抑制質(zhì)粒表達Nidovirus的能力。
因此，本發(fā)明還提供了質(zhì)粒和表達Nidovirales病毒的完全的細胞法，其中質(zhì)粒含有a)編碼Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列；和b)能在細胞中轉(zhuǎn)錄所述編碼序列的啟動子，其中所述啟動子與編碼感染性RNA分子的DNA序列可操作地連接。該方法包括用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染適當?shù)乃拗骷毎?，將?jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細胞置于適于表達轉(zhuǎn)染至細胞中的基因序列的條件下，和從細胞中收集表達的Nidovirales病毒。適于在活生物體外完全用細胞表達北美PRRS病毒的質(zhì)粒例子是質(zhì)粒pCMV-S-P129(ATCC登記號203489)。在優(yōu)選的實施方案中，這種質(zhì)粒的啟動子是CMV啟動子。在優(yōu)選的實施方案中，適于表達Nidovirales病毒之完全細胞法的本發(fā)明質(zhì)粒含有真核啟動子，如CMV啟動子，該啟動子直接位于編碼Nidovirales病毒之核苷酸序列的上游并與其相鄰。在優(yōu)選的實施方案中，編碼Nidovirales病毒的核苷酸序列編碼歐洲或北美PRRS病毒?？衫蒙鲜鐾耆毎ū磉_的其它Nidovirales病毒的例子包括其它馬動脈炎病毒科成員，例如馬動脈炎病毒，乳酸脫氫酶升高病毒和猿猴出血熱病毒；冠狀病毒屬病毒，例如但不限于豬傳染性腹膜炎病毒，豬腸冠狀病毒，犬冠狀病毒，牛冠狀病毒，豬呼吸冠狀病毒，火雞冠狀病毒，豬傳染性胃腸炎病毒，人冠狀病毒，鼠肝炎病毒和禽傳染性支氣管炎病毒；和Toroviridae屬的成員，例如但不限于Berne病毒，Breda病毒和人torovirus。因此，本發(fā)明還包括含有編碼上述病毒之一的核苷酸序列并適用于完全細胞表達的質(zhì)粒。
可用于制備在活生物體外完全細胞表達Nidovirales病毒，如PRRS病毒的本發(fā)明重組質(zhì)粒的適當質(zhì)粒實際上包括可用于在真核細胞中轉(zhuǎn)染和表達的任何質(zhì)粒。適于制備完全細胞表達Nidovirales病毒的本發(fā)明重組質(zhì)粒的質(zhì)粒例子是質(zhì)粒pCMVbeta(C1ontech，Palo Alto，California，USA)。能在真核細胞中轉(zhuǎn)染和表達基因并能用于制備本發(fā)明質(zhì)粒的其它質(zhì)粒包括但不限于pcDNA3.1，pRc/RSV和pZeoSV2(皆得自Invitrogen)；和pCMV-Sport3和pSV-Sport1(皆得自LifeTechnologies公司)。然而，任何真核表達載體幾乎都可以用于本發(fā)明?；谡沉５臉?gòu)建體也可用于在體內(nèi)完全細胞表達Nidovirales病毒。
可用于本發(fā)明表達PRRS病毒之完全細胞法的適當宿主細胞包括上述豬塵細胞和MARC 145細胞。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染這些細胞的方法與用上述病毒RNA轉(zhuǎn)染細胞的方法基本上相同。所述方法包括但不限于電穿孔，脂轉(zhuǎn)染，DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染和磷酸鈣共沉淀。
一旦根據(jù)本發(fā)明用病毒RNA或含有編碼病毒的核苷酸序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了宿主細胞，如豬塵細胞或MARC 145細胞，即可將細胞置于-80℃或以下冷凍儲存幾年。為儲存更長一段時間，即幾十年，優(yōu)選在液氮中儲存。如果要比較頻繁地使用編碼的病毒，則可使用已知技術(shù)將攜有病毒的細胞在培養(yǎng)物中維持(非冷凍)較短一段時間。另外，可在-80℃或以下冷凍儲存由所述細胞分泌的病毒顆粒作為病毒來源。必要時，可通過例如使用免疫熒光抗體試驗檢測細胞系分泌的耗盡介質(zhì)中的PRRS病毒抗原來證實編碼病毒的多核苷酸分子對該細胞系的轉(zhuǎn)染。特異于PRRS病毒抗原的抗體是本領(lǐng)域已知的(例見Collins，E，J等，WO 93/03760，1993年3月4日)。
在另一個實施方案中，含有編碼北美PRRS病毒的核苷酸序列的本發(fā)明質(zhì)粒適于體內(nèi)表達，即在活生物體中表達北美PRRS病毒?？捎糜谥苽潴w內(nèi)表達北美PRRS病毒的重組質(zhì)粒的質(zhì)粒包括但不限于能轉(zhuǎn)染上述真核細胞的質(zhì)粒，如pCMVbeta。
可被本發(fā)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的動物包括哺乳動物和禽類。如果動物是非豬動物，例如野鴨，則質(zhì)?？珊芯幋a下述北美PRRS病毒的核苷酸序列，所述病毒含有得自能致病性感染動物之病原體的其它抗原性表位；此時，質(zhì)粒編碼北美PRRS病毒，用作將表位轉(zhuǎn)運至動物的載體。如果動物是豬，則質(zhì)?？捎杏玫鼐幋a本文所述的任何北美PRRS病毒，包括本文所述的基因修飾型北美PRRS病毒。C.編碼北美PRRS病毒的病毒載體，包括編碼基因修飾型北美PRRS病毒的病毒載體本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子之DNA序列的病毒載體，所述RNA分子編碼本文所述的任何北美PRRS病毒，包括本文所述的基因修飾型北美PRRS病毒。所述病毒載體可用于轉(zhuǎn)染真核細胞以在活生物體外產(chǎn)生本發(fā)明PRRS病毒，或可用于將編碼北美PRRS病毒的序列轉(zhuǎn)染豬，或其它哺乳動物或禽類，以在體內(nèi)表達北美PRRS病毒。
可用作載體以制備本發(fā)明病毒載體的病毒例子包括豬病毒，例如豬痘病毒，豬α皰疹病毒1型或非洲豬瘟病毒，但并不限于此。所述豬病毒可得自美國農(nóng)業(yè)部的國家獸醫(yī)部門實驗室(Ames，lowa，USA)；美國典型培養(yǎng)物保藏中心，也稱ATCC(Manassas，Virginia，USA)；和其它已知來源?；谶m當豬病毒，如上述豬病毒的重組病毒載體適用于用編碼本發(fā)明北美PRRS病毒的核苷酸序列轉(zhuǎn)染豬。
使用如本申請上文所提及的文獻中所述的已知重組技術(shù)可制備基于這些和其它病毒的病毒載體，所述載體含有編碼本發(fā)明北美PRRS病毒的感染性RNA分子的DNA編碼序列。D.編碼北美PRRS病毒或基因修飾型北美PRRS病毒的轉(zhuǎn)染宿主細胞本發(fā)明還提供了含有編碼感染性RNA分子之DNA序列的轉(zhuǎn)染宿主細胞，所述RNA分子編碼本文所述的任何北美PRRS病毒，包括本文所述的基因修飾型北美PRRS病毒，其中所述轉(zhuǎn)染宿主細胞能表達北美PRRS病毒。所述轉(zhuǎn)染宿主細胞可用于產(chǎn)生本發(fā)明北美PRRS病毒。本發(fā)明轉(zhuǎn)染宿主細胞的例子包括上述轉(zhuǎn)染的豬塵細胞和轉(zhuǎn)染的MARC-145細胞。
本發(fā)明其它的轉(zhuǎn)染宿主細胞包括但不限于轉(zhuǎn)染的MA-104細胞和轉(zhuǎn)染的MA-104細胞其它衍生物；轉(zhuǎn)染的幼倉鼠腎(BHK)細胞；轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞；和轉(zhuǎn)染的非MA-104細胞或MARC-145細胞的非洲綠猴腎細胞，如VERO細胞。E.北美PRRS病毒，包括基因修飾型北美PRRS病毒本發(fā)明還提供了由上述任何一種分離的多核苷酸分子、RNA分子、質(zhì)粒、病毒載體或轉(zhuǎn)染宿主細胞表達和/或編碼的本文所述北美PRRS病毒，包括本文所述的基因修飾型北美PRRS病毒。
在某些情況下，例如北美PRRS病毒將用于豬疫苗，且未按上文所述對北美PRRS病毒進行基因修飾以使其不能導(dǎo)致PRRS時，需要通過例如滅活或減毒來處理該北美PRRS病毒，以使其不能在施用所述病毒的豬中導(dǎo)致PRRS?？墒褂靡阎椒缁畋景l(fā)明北美PRRS病毒以使其不能在動物中導(dǎo)致PRRS。所述方法的例子包括但不限于用甲醛，BEI(二吖丙啶)或BPL(β-丙醇酸內(nèi)酯)處理。減毒方法也是本領(lǐng)域已知的，可使用這種方法使本發(fā)明北美PRRS病毒減毒。通過例如在細胞培養(yǎng)物中連續(xù)傳代可使本發(fā)明北美PRRS病毒減毒。
如果本發(fā)明北美PRRS病毒是用于非豬動物，或如果已按上文所述對它進行了基因修飾使其不能在豬中產(chǎn)生PRRS，則不必在用作疫苗之前按上一節(jié)所述處理病毒。F.疫苗及其使用本發(fā)明還提供了疫苗，該疫苗含有本文所述的北美PRRS病毒，包括本文所述的經(jīng)基因修飾失去在豬中產(chǎn)生PRRS之能力的北美PRRS病毒；本文所述的編碼上述北美PRRS病毒的感染性RNA分子和質(zhì)粒；和本文所述的編碼上述北美PRRS病毒和分離的RNA分子的病毒載體。本發(fā)明還提供了保護動物免受感染的方法，所述方法包括用所述疫苗免疫接種。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了疫苗，該疫苗含有本文所述的含有一個或多個異源抗原性表位的基因修飾型北美PRRS病毒，編碼所述基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子，或本文所述的編碼基因修飾型北美PRRS病毒的質(zhì)粒，其量能有效引發(fā)抗衍生得到上述異源抗原性表位的病原體感染之免疫保護性應(yīng)答，該疫苗還含有藥物學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
可使用這種疫苗保護能被衍生得到異源抗原性表位的所述病原體致病性感染的哺乳動物或禽類免受感染。因此，本發(fā)明還提供了保護哺乳動物或禽類免受病原體感染的方法，所述方法包括用其量能有效引發(fā)哺乳動物或禽類抗該病原體感染之免疫保護性應(yīng)答的上一節(jié)所述疫苗免疫哺乳動物或禽類。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，疫苗含有基因修飾型北美PRRS病毒或編碼所述基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子或質(zhì)粒，所述病毒含有或編碼一個或多個得自非北美PRRS病毒之豬病原體的異源抗原性表位。這些疫苗可用于保護豬免受衍生得到上述異源抗原性表位的諸豬病原體的感染。如果這種疫苗含有基因修飾型北美PRRS病毒，優(yōu)選北美PRRS病毒的基因修飾使得病毒不能在豬中導(dǎo)致PRRS。在另一個優(yōu)選的實施方案中，疫苗中基因修飾型北美PRRS病毒能引發(fā)抗PRRS病毒感染的免疫保護性應(yīng)答，因此，本發(fā)明提供了雙重功能的豬疫苗，它可以保護豬免受可衍生得到上述異源抗原性表位的諸豬病原體的感染，也可保護豬免受PRRS病毒感染。如果疫苗含有編碼基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子或質(zhì)粒，所述病毒含有一個或多個得自其它豬病原體的異源抗原性表位，那么編碼基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子的編碼序列優(yōu)選含有一個或多個其它突變，所述突變在遺傳學(xué)上使得編碼的北美PRRS病毒失活，使其不能導(dǎo)致PRRS。在另一個優(yōu)選的實施方案中，編碼的基因修飾型失活北美PRRS病毒能在豬中引發(fā)抗PRRS感染的免疫保護性應(yīng)答，因此提供了雙重功能的豬疫苗，它可以保護豬免受衍生得到上述異源抗原性表位的諸豬病原體的感染，也可保護豬免受PRRS病毒感染。所有這些疫苗都另外含有獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明還提供了保護豬免受一種或多種非北美PRRS病毒的豬病原體感染，任選同時也可保護豬免受PRRS病毒感染的方法，所述方法包括用其量能有效引發(fā)豬抗所述各豬病原體感染和任選地抗PRRS病毒感染之免疫保護性應(yīng)答的上一節(jié)所述疫苗免疫動物。
可根據(jù)公知的常規(guī)方法，將本發(fā)明疫苗配制成包括動物(適當時包括人)可接受的載體，如標準的緩沖液，穩(wěn)定劑，稀釋劑，防腐劑和/或增溶劑，也可配制成便于緩釋。稀釋劑包括水，鹽水，葡萄糖，乙醇，甘油等。等滲添加劑包括氯化鈉，葡萄糖，甘露糖醇，山梨糖醇和乳糖等。穩(wěn)定劑包括白蛋白等。其它適當?shù)囊呙巛d體和添加劑包括對配制經(jīng)修飾的活疫苗特別有用的那些試劑，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或顯而易見的，例見Remington’s Pharmaceutical Science，第18版，1990，Mack Publishing，該文獻列入本文作為參考。
本發(fā)明疫苗還可含有一種或多種其它的免疫調(diào)節(jié)成分，如佐劑或細胞因子等?？捎糜诒景l(fā)明疫苗之佐劑的非限制性例子包括RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi公司，Hamilton，MT)，明礬，如氫氧化鋁凝膠的礦物凝膠，水包油乳劑，油包水乳劑，如弗式完全佐劑和不完全佐劑，嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)，QS-21(Cambridge Biotech公司，CambridgeMA)，SAF-M(Chiron，Emeryville CA)，AMPHIGEN佐劑，皂苷，QuilA或其它皂苷組分，單磷酰脂質(zhì)A和Avridine脂質(zhì)-胺佐劑?？捎糜诒景l(fā)明疫苗的水包油溶劑的非限制性例子包括經(jīng)改良的SEAM62和SEAM 1/2制劑。經(jīng)改良的SEAM62是含有5％(v/v)角鯊烯(Sigma)，1％(v/v)SPAN85去污劑(ICI表面活性劑)，0.7％(v/v)TWEEN80去污劑(ICI表面活性劑)，2.5％(v/v)乙醇，200μg/ml Quil A，100μg/ml膽固醇和0.5％(v/v)卵磷脂的水包油乳劑。經(jīng)改良的SEAM1/2是含有5％(v/v)角鯊烯，1％(v/v)SPAN85去污劑，0.7％(v/v)TWEEN80去污劑，2.5％(v/v)乙醇，100μg/ml Quil A和50μg/ml膽固醇的水包油乳劑?？砂ㄔ谝呙缰械钠渌庖哒{(diào)節(jié)劑包括例如一種或多種白細胞介素，干擾素或其它已知的細胞因子。
任選將本發(fā)明疫苗配制成可以緩釋本發(fā)明病毒，感染性RNA分子，質(zhì)?；虿《据d體。所述緩釋制劑的例子包括與生物相容性聚合物復(fù)合材料混合的病毒、感染性RNA分子、質(zhì)?；虿《据d體，所述聚合物如聚(乳酸)，乳酸乙醇酸共聚物，甲基纖維素，透明質(zhì)酸，膠原等。藥物傳遞載體中可降解聚合物的結(jié)構(gòu)、選擇和使用可參見幾篇文獻，包括A.Domb等，1992，Polymers for Advanced Technologies3279-292(列入本文作為參考)。選擇和使用藥物制劑中的聚合物的其它指導(dǎo)例見本領(lǐng)域已知的課本，如M.Chasin和R.Langer(編)，1990，“用作藥物傳遞系統(tǒng)的生物降解性聚合物”藥物與藥學(xué)，第45卷，M.Dekker，NY(列入本文作為參考)?；蛘撸蛄硗猓蓪⒉《?、質(zhì)?；虿《据d體裝入微膠囊中以改善給藥和效力。使抗原微膠囊化的方法是本領(lǐng)域已知的，包括例如美國專利3,137,631；3,959,457；4,205,060；4,606,940；4,744,933；5,132,117；國際專利申請WO 95/28227中所述的技術(shù)(皆列入本文作為參考)。
也可使用脂質(zhì)體緩釋病毒、質(zhì)?；虿《据d體。制備和使用脂質(zhì)體制劑的有關(guān)細節(jié)例見美國專利4,016,100；4,452,747；4,921,706；4,927,637；4,944,948；5,008,050和5,009,956(皆列入本文作為參考)。
通過常規(guī)方法，先從低劑量的病毒、質(zhì)?；虿《据d體開始，然后增加劑量同時監(jiān)測藥效即可確定上述任何疫苗的有效量。單次施用疫苗或多次施用疫苗之后可得到有效量。當確定每只動物的最適劑量時需考慮已知因素，包括動物的物種、大小、年齡和身體狀況，動物中其它藥物的存在等。優(yōu)選考慮其它動物的研究結(jié)果之后選定實際的劑量。
檢測是否得到足夠的免疫應(yīng)答的一個方法是測定免疫后的動物中的血清轉(zhuǎn)變和抗體滴度。優(yōu)選由醫(yī)生或獸醫(yī)根據(jù)所有相關(guān)因素(其中一些如上所述)的分析結(jié)果確定免疫的時間安排和加強免疫的次數(shù)(如果需要的話)。
使用已知技術(shù)，并考慮本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定的因素，如免疫動物的體重等，可確定本發(fā)明病毒、感染性RNA分子、質(zhì)?；虿《据d體的有效劑量。本發(fā)明疫苗中本發(fā)明病毒的劑量范圍優(yōu)選為約101至約109pfu(噬斑形成單位)，更優(yōu)選為約102至約108pfu，最優(yōu)選為約103至約107pfu。本發(fā)明疫苗中本發(fā)明質(zhì)粒的劑量范圍優(yōu)選為約0.1μg至約100mg，更優(yōu)選為約1μg至約10mg，甚至更優(yōu)選為約10μg至約1mg。本發(fā)明疫苗中本發(fā)明感染性RNA分子的劑量范圍優(yōu)選為約0.1μg至約100mg，更優(yōu)選為約1μg至約10mg，甚至更優(yōu)選為約10μg至約1mg。本發(fā)明疫苗中本發(fā)明病毒載體的劑量范圍優(yōu)選為約101至約109pfu，更優(yōu)選為約102至約108pfu，最優(yōu)選為約103至約107pfu。適當?shù)膭┝看笮》秶鸀榧s0.5ml至約10ml，更優(yōu)選約為1ml至5ml。
本發(fā)明還提供了含有本文所述北美PRRS病毒、感染性RNA分子、質(zhì)?；虿《据d體的疫苗的制備方法，所述方法包括將有效量的本發(fā)明北美PRRS病毒、感染性RNA分子、質(zhì)粒或病毒載體之一與藥物學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體混合。
應(yīng)理解除非特別說明，術(shù)語“本發(fā)明北美PRRS病毒”和類似術(shù)語包括本文所述的任何基因修飾型北美PRRS病毒以及由SEQ ID NO1或其同源序列編碼的本文所述未修飾的北美PRRS病毒。G.編碼北美PRRS病毒肽的分離的多核苷酸分子和轉(zhuǎn)染的宿主細胞，和制備功能性北美PRRS毒粒的方法本發(fā)明還提供了含有一個或多個核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，所述核苷酸序列編碼由北美PRRS病毒編碼的肽，其中所述北美PRRS病毒的基因組序列與對應(yīng)于SEQ ID NO1的RNA分子相同或同源。本文所用術(shù)語“北美PRRS病毒肽”指的是由北美PRRS病毒表達的肽。所述肽可以但不是必需特異于北美PRRS病毒。
在優(yōu)選的實施方案中，編碼北美PRRS病毒肽的本發(fā)明分離的多核苷酸分子含有獨立地選自下列序列中的一個或多個序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9和與任何所述序列同源的序列。所述分離的多核苷酸分子可用于質(zhì)粒中或用于制備病毒載體以轉(zhuǎn)染適當?shù)乃拗骷毎?，產(chǎn)生含有一個或多個編碼由北美PRRS病毒所編碼之肽的核苷酸序列的“輔助”細胞，其中所述北美PRRS病毒的基因組序列與對應(yīng)于SEQ ID NO1的RNA序列相同或同源，所述輔助細胞可用于制備本發(fā)明基因修飾型北美PRRS病毒的功能性毒粒，該病毒已按上文所述進行了基因修飾使得病毒RNA基因組中失去編碼輔助細胞所編碼的一個或多個肽的序列。
因此，本發(fā)明還包括含有一個或多個核苷酸序列的質(zhì)粒和病毒載體，所述核苷酸序列編碼由北美PRRS病毒編碼的肽，其中所述北美PRRS病毒的基因組序列與對應(yīng)于SEQ ID NO1的RNA序列相同或同源。本發(fā)明這種質(zhì)?？苫谏衔乃隹捎糜谥苽浜芯幋a北美PRRS病毒之核苷酸序列的質(zhì)粒的那些質(zhì)粒。本發(fā)明病毒載體可基于例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺伴隨病毒載體。這些質(zhì)粒和病毒載體可用于制備上一節(jié)所述的輔助細胞。
因此，本發(fā)明還提供了輔助細胞，即含有一個或多個核苷酸序列的轉(zhuǎn)染宿主細胞，所述核苷酸序列編碼由北美PRRS病毒編碼的肽，其中所述北美PRRS病毒的基因組序列與對應(yīng)于SEQ ID NO1的RNA序列相同或同源。在優(yōu)選的實施方案中，轉(zhuǎn)染的宿主細胞含有獨立地選自下列序列的一個或多個核苷酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9和與任何所述序列同源的序列。如上所述，這些輔助細胞可用于提供肽，該肽可補償缺乏輔助細胞所編碼之肽的編碼序列的感染性RNA分子，使得細胞可產(chǎn)生基因修飾型北美PRRS病毒的功能性毒粒。
可用于本發(fā)明此方面的適當細胞包括上述適于表達北美PRRS病毒的細胞，如豬塵細胞和MARC-145細胞。然而，實際上可使用任何哺乳動物或禽類細胞。如上所述，如果希望得到能被PRRS毒粒再次感染因而能產(chǎn)生多代基因修飾型北美PRRS病毒之功能性毒粒的轉(zhuǎn)染宿主細胞，則優(yōu)選使用豬塵細胞和MARC-145細胞。
因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生基因修飾型北美PRRS病毒之功能性毒粒的方法，所述病毒由對應(yīng)于SEQ ID NO1或其同源序列的RNA序列編碼，其中含有一個或多個突變使得一個或多個肽編碼序列失活，所述方法包括用編碼基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子、質(zhì)?；虿《据d體轉(zhuǎn)染上一節(jié)所述的輔助細胞，所述輔助細胞含有編碼基因修飾型北美PRRS病毒的失活肽編碼序列的一個或多個北美PRRS病毒肽的一個或多個核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生基因修飾型北美PRRS病毒之功能性毒粒的方法，所述病毒由對應(yīng)于SEQ ID NO1或其同源序列的RNA序列編碼，其中在一個或多個肽編碼序列中含有一個或多個突變，所述方法包括用編碼基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子、質(zhì)?；虿《据d體以及在細胞中表達所述經(jīng)修飾的北美PRRS病毒之一個或多個突變肽編碼序列的一個或多個北美PRRS病毒肽的輔助病毒轉(zhuǎn)染適當細胞，將基因修飾型北美PRRS毒粒與輔助病毒分開。分離方法是本領(lǐng)域已知的，包括使用條件致死輔助病毒，該方法可在某些條件下區(qū)分(殺死)輔助病毒，而不殺死表達的北美PRRS病毒。其它已知的分離方法包括在表達輔助病毒毒粒和北美PRRS病毒毒粒之后使用物理分離方法，如密度梯度離心?？捎糜诒景l(fā)明此方法的適當細胞包括能被PRRS病毒感染的細胞，如豬塵細胞和MARC-145細胞。本申請上文中描述了能被PRRS病毒感染的其它細胞，例如MA-104細胞系或衍生自MA-104細胞系的其它細胞系。輔助病毒的例子是PRRS病毒，優(yōu)選為北美PRRS病毒分離物，如P129。任何能表達PRRS肽的野生型分離的或重組的病毒都可用作輔助病毒。
編碼基因修飾型北美PRRS病毒，可用于產(chǎn)生基因修飾型北美PRRS病毒之功能性毒粒的上述任一方法的感染性RNA分子、質(zhì)粒和病毒載體是本申請所述的那些感染性RNA分子、質(zhì)粒和病毒載體。H.免疫保護性的基因修飾型Nidovirales病毒和含有所述病毒的疫苗本發(fā)明還提供了能在被其免疫的哺乳動物或禽類中引發(fā)免疫保護性應(yīng)答的基因修飾型Nidovirales病毒，制備該基因修飾型Nidovirales病毒的方法是得到含有編碼野生型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子；對所述DNA序列進行基因突變以得到含有編碼基因修飾型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，所述修飾病毒能在哺乳動物或禽類中引發(fā)抗野生型Nidovirales病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答；由所得的分離的多核苷酸分子表達基因修飾型Nidovirales病毒。
本發(fā)明還提供了制備能在被其免疫的哺乳動物或禽類中引發(fā)免疫保護性應(yīng)答的基因修飾型Nidovirales病毒的方法，所述方法包括得到含有編碼野生型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子；對所述DNA序列進行基因突變以得到含有編碼基因修飾型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，所述修飾病毒能在哺乳動物或禽類中引發(fā)抗野生型Nidovirales病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答；由所得的分離的多核苷酸分子表達基因修飾型Nidovirales病毒。
編碼Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列包括與本文所述的編碼北美PRRS病毒的SEQ ID NO1相同或同源的DNA序列。編碼非北美PRRS病毒的Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列是本領(lǐng)域已知的，并可得自已知來源，例如上文提及的基因數(shù)據(jù)庫。編碼可用于本發(fā)明Nidovirales病毒之感染性RNA分子的其它一些DNA編碼序列的例子包括Meulenberg，J.J.M等(1993，文獻同上)所述編碼歐洲PRRS病毒的DNA序列；van Dinten，L.D等(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(3)991-6)所述編碼馬動脈炎病毒的DNA序列；和den Boon，J.A等(1991，病毒學(xué)雜志，65(6)2910-20)所述編碼馬動脈炎病毒的DNA序列(上述文獻皆列入本文作為參考)?？赏ㄟ^本發(fā)明進行基因修飾的Nidovirales病毒可以是已得到其DNA編碼序列的任何Nidovirales病毒，本申請上文中描述了一些Nidovirales病毒的例子。
一旦得到編碼Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列，可使用上述重組技術(shù)合成含有編碼Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，例如質(zhì)粒。
可按上文突變北美PRRS病毒的技術(shù)對編碼Nidovirales病毒之感染性RNA分子的編碼序列進行基因突變，以得到含有基因修飾的Nidovirales病毒，所述基因修飾例如是不能在被其感染的動物中導(dǎo)致疾病，包含能在動物中引發(fā)免疫保護性應(yīng)答的異源抗原性表位，包含可測的異源抗原性表位，和缺失可測的抗原性表位。所述基因修飾如上文所述。用于編碼基因修飾型Nidovirales病毒的基因突變可發(fā)生在編碼Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列中的編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)。在一個實施方案中，一個或多個基因突變發(fā)生在編碼Nidovirales病毒之病毒肽的ORF中。
本文所用術(shù)語“野生型Nidovirales病毒”指的是其基因組未經(jīng)有意地基因突變的Nidovirales病毒，如天然的Nidovirales病毒及其分離物。
本發(fā)明還提供了保護哺乳動物或禽類免受Nidovirales病毒感染的疫苗，該疫苗中含有其量能在被其免疫的哺乳動物或禽類中引發(fā)抗野生型Nidovirales病毒之有效免疫保護性應(yīng)答的上述基因修飾型Nidovirales病毒，以及藥物學(xué)和獸醫(yī)學(xué)可接受的載體?？墒褂蒙鲜雠渲埔呙绲募夹g(shù)來配制本發(fā)明這些疫苗。
提供下列實施例僅僅是為了闡明本發(fā)明多個方面，這些實施例并非旨在，也不應(yīng)被解釋為是對權(quán)利要求書中所示的和本文更全面描述的本發(fā)明范圍的限制。實施例I.制備北美PRRS病毒分離物的感染性cDNA克隆PRRS病毒和MARC-145細胞的來源被稱為P129的北美PRRS病毒分離物得自Purdue大學(xué)動物疾病診斷實驗室(West Lafayette，Indiana)的Gregory W.Stevenson，William G.Van Alstine和Charles L.Kanitz博士。1995年秋首次從印第安那州南部遭受PRRS嚴重大暴發(fā)的豬群中分離得到P129病毒。該農(nóng)場以前沒有PRRS病毒感染或PRRS免疫史。P129分離物比同期在同一地理區(qū)域分離得到的幾個其它野生型分離物的毒力更強，因為它在幼豬中產(chǎn)生了更嚴重和持續(xù)時間更強的呼吸疾病。最初在豬原代塵細胞(天然宿主細胞)上分離得到該病毒，隨后在MARC-145細胞上傳代(Kim，H.S等，1993，Arch.Virol.133477-483)。編碼P129結(jié)構(gòu)蛋白的基因與相應(yīng)的已知北美PRRS基因序列同源。
用于增殖PRRS病毒的MARC-145細胞系是MA-104羅猴腎細胞系的一個克隆。MARC-145細胞得自USDA的國家獸醫(yī)部門實驗室(NVSL，Ames，lowa)。對這些細胞進行檢測，發(fā)現(xiàn)它們中不含支原體和常見的豬外部因子。于37℃，在添加有2％胎牛血清和抗生素的OptiMEM(LifeTechnologies公司)中常規(guī)培養(yǎng)MARC-145細胞。
從P129病毒原種中噬斑純化出5個生物學(xué)克隆，并稱之為P129A至P129E。通過用P129病毒感染MARC-145細胞單層，加入含1.25％SeaPlaque瓊脂糖(FMC BioProducts)、2％胎牛血清和抗生素的OptiMEM上層，進行噬斑純化。保溫7天后可清楚地看見噬斑，此時挑選5孔分離的噬斑并傳代到新鮮的MARC-145單層上。當致細胞病變效應(yīng)(病毒誘導(dǎo)的細胞死亡)變得明顯時，對這些培養(yǎng)物的子代病毒各進行另一輪噬斑純化。從5個克隆中各挑選1孔分離的噬斑，擴展該噬斑以產(chǎn)生大量原種。單獨(克隆A和E)或聯(lián)合(克隆B-D，或克隆A-E)檢測5個克隆對幼豬的毒力。在所有情況下，經(jīng)噬斑純化的病毒在豬中能良好地復(fù)制并導(dǎo)致臨床疾病。臨床癥狀的嚴重程度比未經(jīng)克隆的P129病毒弱，甚至當同時使用所有5個克隆時也是如此。選定P129A進行測序并用于隨后的分子操作。
測定P129A的基因組序列從豬開始10次連續(xù)傳代(包括兩次噬斑純化和隨后的一次傳代)之后，使用經(jīng)噬斑純化的P129A病毒進行測序。SEQ ID NO1表示對應(yīng)于P129A RNA基因組的cDNA序列。基因組長度為15,395個核苷酸(不包括聚腺苷尾)，由ATGACGTA開始，CCGCAATT結(jié)束。SEQ ID NO1中還提供了55個殘基長的典型的聚腺苷尾。
對于含有3’端20％基因組的P129A結(jié)構(gòu)基因(ORF 2至7)而言，根據(jù)可得自公用DNA序列數(shù)據(jù)庫GenBank的其它北美PRRS病毒分離物的幾個部分cDNA序列(如PRU00153)選擇多個PCR引物。使用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機的六聚體引物將純化的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后在具有基因特異性引物的PCR中使用該cDNA。從凝膠上切下PCR產(chǎn)物，并T/A克隆至質(zhì)粒pCR2.1(Invitrogen)中。對各個引物對而言，測定多個質(zhì)粒(來自獨立的PCR反應(yīng))的DNA序列。使用Lasergene程序包(DNASTAR公司)中的Seqman程序組裝序列。從而完成P129A基因組中第11,992至15,347位的序列。
GenBank數(shù)據(jù)庫中還有一系列短序列(總共約218個核苷酸)，它們含有幾個PRRS病毒分離物之ORF 1b基因的部分。使用其中一個(PPSSEQB)設(shè)計PCR引物(正向引物5’-ACAGTTTGGTGATCTATG-3’(SEQID NO10)，對應(yīng)于第9063至9080位；反向引物5’-CAGATTCAGATGTTCAA-3’(SEQ ID NO11)，對應(yīng)于第9252至9268位)。這些引物擴增206個核苷酸的片段，其中包括得自P129A ORF1b基因的171個核苷酸的新序列，對應(yīng)于第9081至9251位。在此區(qū)域內(nèi)設(shè)計一個新的正向引物(5’-ACCTCGTGCTGTATGCCGAATCTC-3’(SEQ ID NO12)，第9201-9224位)，在ORF1b內(nèi)緊接ORF2的上游設(shè)計一個匹配的引物(5’-TCAGGCCTAAAGTTGGTTCAATGA-3’(SEQ ID NO13)，第12,027-12,050位)。在RT-PCR中使用這些引物擴增ORF1b之2850個核苷酸的片段，對應(yīng)于P129A基因組的第9201-12,050位。
在對PRRS病毒之另一個北美野生型分離物的ORF5進行RT-PCR擴增的過程中，看見小于預(yù)期大小的弱帶。對其進行測序，發(fā)現(xiàn)它與Lelystad病毒的ORF 1a具有有限的同源性(由錯誤引發(fā)引起)。選定此區(qū)域內(nèi)的新引物來擴增P129A(正向引物5’-GATGACTGGGCTACTGACGAGGAT-3’(SEQ ID NO14)，對應(yīng)于第1587-1610位；反向引物5’-AGAGCGGCTGGGATGACACTG-3’(SEQ ID NO15)，對應(yīng)于第1877-1897位)。除了311個核苷酸(引物之間266個核苷酸的新P129A序列，對應(yīng)于第1611-1876位)的產(chǎn)物外，克隆并測序了701個核苷酸長的較大的次要PCR產(chǎn)物(引物之間656個核苷酸的新P129A序列，對應(yīng)于第1611-2264位)。第2265-2269位的逆轉(zhuǎn)錄引物錯誤引發(fā)導(dǎo)致了該較大的帶。
使用商購試劑盒(Life Technologies公司)，通過5’RACE(快速擴增cDNA末端)測定P129A基因組的5’最末端。從已知的ORF 1a序列中選定兩個嵌套的反向引物(“RACE2”5’-CCGGGGAAGCCAGACGATTGAA-3’(SEQ ID NO16)，第1917-1938位；和“RACE3”5’-AGGGGGAGCAAAGAA GGGGTCATC-3’(SEQ ID NO17)，第1733-1756位)。使用RACE2引發(fā)cDNA合成，而在PCR中使用RACE3?？寺〔y序所得PCR產(chǎn)物。兩個最長的產(chǎn)物在完全相同的堿基處結(jié)束(SEQ ID NO1中的第1位)。
使用長RT-PCR在ORF1a和ORF1b已知序列之間的大缺口上駕橋。使用兩個新引物(正向引物5’-AGCACGCTCTGGTGCAACTG-3’(SEQ IDNO18)，第1361-1380位；反向引物5’-GCCGCGGCGTAGTATTCAG-3’(SEQID NO19)，第9420-9438位)。克隆并測序所得8078個核苷酸的RT-PCR產(chǎn)物。
通過將病毒RNA的3’和5’端連接在一起，并使用RT-PCR擴增連接片段，測定P129A基因組的3’最末端?？寺〔y序所得的連接片段。簡單地說，用煙草焦磷酸酶處理由沉淀毒粒提取的RNA(以除去5’帽結(jié)構(gòu))，然后用T4 RNA連接酶自身連接(兩種酶都得自EpicentreTechnologies)。所用引物是5’-CGCGTCACAGCATCACCCTCAG-3’(SEQ IDNO20)(正向引物，第15,218-15,239位)和5’-CGGTAGG TTGGTTAACACATGAGTT-3’(SEQ ID NO21)(反向引物，第656-680位)或5’-TGGCTCTTCGGGCCTATAAAATA-3’(SEQ ID NO22)(反向引物，第337-359位)。所有所得克隆均在基因組的5’末端截短(通過5’RACE揭示出最完整的片段位于實際5’末端的57個核苷酸內(nèi))，然而，其中兩個克隆含有包括聚腺苷尾的整個基因組3’末端(長度為42和55個腺苷殘基)。這樣就完成了PRRS分離物P129A之cDNA 15,450個堿基(包括polyA尾)基因組的測序，結(jié)果示于SEQ ID NO1。
產(chǎn)生P129A的感染性全長cDNA克隆由4個重疊的克隆RT-PCR產(chǎn)物裝配P129A的全長感染性cDNA克隆，該克隆被稱為pT7P129A。首先將4個RT-PCR產(chǎn)物T/A克隆至質(zhì)粒pCR2.1(Invitrogen)并轉(zhuǎn)染至大腸桿菌菌株DH5-α中。篩選細菌菌落，選擇含有以“T7至M13”方向插入的預(yù)期大小插入物的菌落供測序和進一步操作。所有4個克隆的RT-PCR產(chǎn)物含有一個或多個非沉默突變(與SEQ ID NO1的P129A共有核苷酸序列有偏差，可導(dǎo)致所編碼的ORF的氨基酸序列發(fā)生變化)。通過由其它克隆的RT-PCR產(chǎn)物亞克隆片段修復(fù)這些非沉默突變(補救ORF2中第12,622位的一個突變)。使用可利用的限制性位點逐步將4個修復(fù)的亞基因組克隆裝配成全長克隆(見圖1)。通過添加T7啟動子和適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點修飾對應(yīng)于pT7P129A中的P129A基因組的cDNA 5’和3’末端。下一段將更詳細地描述pT7P129A的構(gòu)建對通過5’-RACE產(chǎn)生并按上述克隆至pCR2.1的基因組5’末端(第1-1756位)進行修飾，以在緊接對應(yīng)于P129A基因組之cDNA的上游導(dǎo)入T7啟動子和PacI位點供隨后克隆。使用此質(zhì)粒1216 bp的DsaI-BseRI片段(含有P129A的堿基27-1242)，同一質(zhì)粒4407 bp的BseRI-XbaI片段(含有P129A的堿基1243-1756和直至XbaI位點的整個質(zhì)粒載體)，和下列合成的雙鏈銜接子(SEQ ID NO23和24)進行三方連接5′-CTAGATTAATTAATACGACTCACTATAGGGATGACGTATAGGTGTTGGCTCTATGC-3′3′-TAATTAATTATGCTGAGTGATATCCCTACTGCATATCCACAACCGAGATACGGTGC-5′XbaI＿＿＿＿＿ T7啟動子 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿DsaIPacIP129A 基因組推測的得自T7啟動子的轉(zhuǎn)錄物包括該啟動子緊接病毒基因組第一個“A”上游的單個“G”殘基。通過用另一個克隆的相同片段取代906bp的AatII-SacII片段(堿基740-1645)，以修復(fù)第1230位的非沉默突變(A變?yōu)镚)。將此質(zhì)粒稱為“pT7R3A-2”。
使用上述8078個核苷酸的PCR產(chǎn)物覆蓋P129A基因組的堿基1361-9438。通過亞克隆其它克隆的RT-PCR產(chǎn)物的片段，修正58bp缺失(第2535-2592位)和7個非沉默點突變，產(chǎn)生質(zhì)粒“pGAP10B-4”。將此質(zhì)粒中7837bp的Bsu36I-SpeI片段與pT7R3A-2中5482bp的Bsu36I-SpeI片段連接，所得質(zhì)?！皃T7RG”含有位于T7啟動子之后的P129A基因組的前9438個堿基。
修正上述ORF 1b的2850個核苷酸片段(基因組中的第9201-12,050位)以修復(fù)非沉默突變，并稱之為“p1B3A-2”。將此質(zhì)粒中2682bp的NdeI-SpeI片段與pT7RG中13,249 bp的NdeI-SpeI片段連接，產(chǎn)生質(zhì)?！皃T71A1B”，其含有P129A基因組的前12,050個堿基。
通過對ORF2至7進行RT-PCR，得到P129A基因組的第4個也即最后一個片段，包括3’非翻譯區(qū)和polyA尾一部分。正向引物是5’-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3’(SEQ ID NO25)(第11,504-11,530位)，反向引物是5’-GGGATTTAAATATGCATTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTAATTGCGGCCGCATGGTTCTCG-3’(SEQ ID NO26)。反向引物含有P129A基因組的最后22個堿基(第15,374-15,395位)，21個堿基的polyA尾，一個NsiI位點(ATGCAT)和一個SwaI位點(ATTTAAAT)。通過亞克隆其它克隆的片段修復(fù)非沉默突變和單個堿基缺失。在此階段非故意地在第12,622位導(dǎo)入另一個非沉默點突變(A變?yōu)镚)。這導(dǎo)致ORF2蛋白質(zhì)C末端附近的谷氨酰胺變?yōu)榫彼?ORF2之256個氨基酸中的氨基酸殘基189，所述突變不影響重疊的ORF3)。此突變對細胞培養(yǎng)物或豬中的病毒生長無明顯影響，故未被修復(fù)。此突變可作為遺傳標記用于將衍生自cDNA克隆的病毒和可能污染的親代P129A或其它PRRS病毒區(qū)分開。將此質(zhì)粒稱為“p2_7D-4”。通過將p2_7D-4 3678bp的Eco47III-SpeI片段與pT71A1B的15,635 bp Eco47III-SpeI片段連接，將P129A的結(jié)構(gòu)基因加入其余基因組中。
籍此產(chǎn)生最終的構(gòu)建體“pT7P129A”，其含有與克隆至pCR2.1載體中唯一限制性酶位點(PacI和SwaI)間位于T7啟動子后的整個P129A基因組幾乎完全對應(yīng)的cDNA(然而，它僅具有21個堿基的polyA尾，而不是55個堿基的polyA尾)。pT7P129A的總長度是19,313bp，它在大腸桿菌菌株DH5α中是穩(wěn)定的。pT7P129A在第12,622位含有A→G非沉默點突變，導(dǎo)致ORF2的第189位是精氨酸而不是谷氨酰胺(由SEQ ID NO1編碼)，在第1559位含有C→T沉默突變。在檢測條件下，這些突變都不影響細胞培養(yǎng)物和豬中病毒的生長。例如，將pT7P129A用于體外轉(zhuǎn)錄，當轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞時，所得RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生活的北美PRRS病毒，因此闡明此全長克隆是感染性的。
體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染RNA轉(zhuǎn)錄物在質(zhì)粒pT7P129A中，病毒基因組上游串聯(lián)有兩個T7啟動子。其中一個緊接病毒基因組的上游，按上述將其構(gòu)建于PCR引物中。另一個存在于pCR2.1克隆載體中，位于多克隆位點的外部(起始轉(zhuǎn)錄病毒基因組上游44個堿基)。體外轉(zhuǎn)錄之前用PacI在這兩個T)啟動子之間切割，產(chǎn)生與真正的病毒RNA較接近的轉(zhuǎn)錄物(單個額外的G緊接病毒基因組的上游，而不是從遠端T7啟動子起的額外44個堿基)。另外，體外轉(zhuǎn)錄之前用SwaI切割pT7P129A，所得失控轉(zhuǎn)錄物包括21個堿基長的polyA尾和9個非PRRS核苷酸，包括一個NsiI位點(不使用該位點使質(zhì)粒線性化，因為該位點在病毒基因組中只出現(xiàn)1次)。使用前通過苯酚提取和乙醇沉淀純化經(jīng)消化的質(zhì)粒。
使用商購試劑盒(T7 Cap-Scribe，Boehringer Mannheim)進行體外轉(zhuǎn)錄。將上文得到的約含有0.6μg PacI/SwaI消化的pT7P129A的DNA沉淀物重新懸浮于20μl T7 Cap-Scribe緩沖液/T7聚合酶中，于37℃保溫30分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分析部分反應(yīng)物，顯示出除了有15,445 bp和3868bp的預(yù)期DNA帶以外，還含有全長的RNA轉(zhuǎn)錄物。保溫后無需純化立即新鮮使用體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物。用OptiMEM(無血清)將新鮮鋪滿的MARC-145單層細胞洗滌1次，用1ml含500μg/ml DEAE葡聚糖(分子量約為500,000，Pharmacia Biotech)的OptiMEM(無血清)覆蓋每個35mm孔，立即加入體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物(15μl)。于37℃保溫1小時之后，除去轉(zhuǎn)染混合物，用PBS將單層洗滌1次，并用含1.25％SeaPlaque瓊脂糖(FMC公司)、2％胎牛血清和抗生素的OptiMEM覆蓋，37℃保溫5天后，可見單個噬斑。將此病毒稱為“rP129A-1”，在MARC-145細胞上擴展此病毒并在細胞培養(yǎng)物和豬中進行鑒定。隨后使用DEAE葡聚糖和電穿孔，用由pT7P129A體外轉(zhuǎn)錄的RNA轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生很多其它噬斑。
鑒定重組病毒rP129A-1衍生自cDNA的重組病毒rP129A-1及其非重組型親代P129A之間在生長動力學(xué)、產(chǎn)量或噬斑形態(tài)方面沒有明顯差異。如上所述，pT7P129A的編碼序列和P129A的共有序列(SEQ IDNO1所示)之間有兩個核苷酸序列差異，第一為第1559位，pT7P129A含有T，而P129A含有C(此為沉默突變)，第二為第12,622位，pT7P129A含有G，而P129A含有A(在上述ORF2中此為谷氨酰胺至精氨酸的變化)。為了排除rP129A-1實際上是非重組型PRRS病毒污染物的可能性，對這兩個差異周圍的區(qū)域進行RT-PCR和測序。在兩種遺傳標記情況下，rP129A-1與質(zhì)粒pT7P129A相同，但與親代病毒P129A不同，從而證實rP129A-1衍生自感染性cDNA克隆。
在豬中鑒定重組病毒rP129A-1比較衍生自cDNA的病毒rP129A-1與其非重組型親代P129A在感染幼豬并導(dǎo)致臨床疾病方面的能力。用P129A、rP129A-1感染或用細胞培養(yǎng)基模擬感染PRRS陰性的3組(每組10只)4周齡豬群。監(jiān)測臨床表現(xiàn)，直腸溫度和體重，在感染后0，2，6，10和13天采血，檢測血清病毒血癥(通過在MARC-145細胞上進行噬斑試驗，圖2)和血清抗體(通過使用IDEXX的HerdChek PRRS進行ELISA，圖3)。通過尸檢觀察到肉眼可見和顯微可見的肺損害，兩個病毒感染組之間沒有顯著的差異，表明rP129A-1能在豬中復(fù)制并導(dǎo)致質(zhì)和量上均類似于其非重組型親代病毒的臨床疾病。實施例II.缺失北美PRRS病毒的ORF7(核殼基因)；籍此制備負標記的復(fù)制缺損型疫苗從本發(fā)明PRRS病毒的感染性cDNA克隆中部分缺失病毒核殼基因(ORF7)。希望所得的重組經(jīng)修飾的PRRS病毒在豬中是復(fù)制缺損的。該重組經(jīng)修飾的PRRS病毒可用作疫苗以誘導(dǎo)針對其它PRRS病毒蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答，免除了患上會傳播至未經(jīng)免疫之動物的臨床疾病的危險，或回復(fù)突變成與減毒活疫苗相關(guān)之強毒力的危險。除了非常安全外，所述疫苗病毒也是“負標記的”，意思是它可暴露于待進行血清學(xué)測定的野生型PRRS病毒分離物中，甚至在疫苗病毒的抗體存在時也是如此。ORF7蛋白質(zhì)的抗體常見于被PRRS病毒感染的豬中，而被ORF7缺失的PRRSV免疫的豬缺乏ORF7蛋白質(zhì)的抗體。
按下述從感染性克隆中缺失ORF7將質(zhì)粒p2 7D-4(見圖1)用作PCR模板以擴增ORF7上游和下游的5’和3’側(cè)翼區(qū)。上游側(cè)翼區(qū)正向引物5’-ATTAGATCTTGCCACCATGGTGGGGAAATGCTTGAC-3’(SEQ ID NO27)(與ORF5開始處附近的基因組第13,776-13,791位結(jié)合，并含有與此次克隆不相關(guān)的其它限制性位點)和上游側(cè)翼區(qū)反向引物5’-CTTTACGCGTTTGCTTAAGTTATTTGGCGTATTTGACAAGGTTTAC-3’(SEQ ID NO28)(與ORF6和7連接處的第14,857-14,902位基因組結(jié)合)擴增1147bp的片段。反向引物導(dǎo)入了MluI和AflII位點和第14,874位單個堿基的變化，從而破壞了ORF7的ATG起始密碼子，但未改變重疊的ORF6內(nèi)所編碼的酪氨酸。對下游側(cè)翼區(qū)而言，正向引物5’-CAACACGCGTCAGCAAAAGAAAAAGAAGGGG-3’(SEQ ID NO29)(ORF7 5’末端附近的第14,884-14,914位，導(dǎo)入MluI位點)和反向引物5’-GCGCGTTGGCCGATTCATTA-3’(SEQ ID NO30)(pCR2.1質(zhì)粒中病毒基因組的下游)擴增462bp的片段。使用上游側(cè)翼區(qū)PCR產(chǎn)物的611bpBstEII-MluI片段，下游側(cè)翼區(qū)PCR產(chǎn)物的575bp MluI-SpeI片段和質(zhì)粒p2 7D-4的6653bp BstEII-SpeI片段(消化后，凝膠純化所有片段)進行3方連接。所得質(zhì)粒p2_7Dδ7+7023缺失了ORF7的前7個氨基酸，并缺失了功能性的ATG起始密碼子。插入病毒基因組和質(zhì)粒骨架中都缺乏的兩個新限制性位點AflII和MluI以便于將異源基因定向克隆至以前被ORF7的5’末端占據(jù)的空間。
通過連接p2_7Dδ7+7023的3683bp Eco47III-SpeI片段和pCMV-S-p129的15,214bp Eco47III-SpeI片段，將p2_7Dδ7+7023中的變化摻入全長基因組克隆。使用所得質(zhì)粒pCMV-S-p129δ7+7023轉(zhuǎn)染細胞。
由于核殼是病毒生長所必需的，因此必需提供此蛋白質(zhì)以產(chǎn)生和復(fù)制ORF7缺損的PRRS病毒。使用輔助病毒或互補細胞系可實現(xiàn)此目的。通過用含有P129A之ORF7基因和新霉素抗性基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞可產(chǎn)生表達ORF7的MARC-145細胞系。使用抗生素G418選擇新霉素抗性之后，擴增并鑒定單細胞集落。經(jīng)免疫熒光和RT-RCR檢測為ORF7表達陽性的衍生自MARC-145的克隆細胞系可被pT7P129δ7的RNA轉(zhuǎn)染以產(chǎn)生ORF7缺損的P129病毒。
可使用類似策略產(chǎn)生其它結(jié)構(gòu)基因(ORF2，3，4，5或6)缺損，或非結(jié)構(gòu)基因1a和1b之全部或部分缺損的PRRS病毒。另外，可在單個PRRS病毒中進行多處缺失，該病毒可在提供所有必需功能的互補細胞中生長。類似地，這種基因缺損的PRRS病毒可能在豬中部分或完全減毒，使其能用作抗PRRS的疫苗。它們也可用于區(qū)分經(jīng)免疫的動物和被上述野生型PRRS病毒感染的動物，并且/或者可用作載體以用其它豬病原體的表位免疫動物(見下文實施例III)。實施例III.將異源基因插入北美PRRS病毒基因組中；PRRS病毒作為載體的用途，和正標記的北美PRRS病毒在上文實施例II中，將AflII和MluI限制性位點插入以前被ORF7的5’末端占據(jù)的區(qū)域。P129A基因組和pCR2.1和pCMV質(zhì)粒中不存在這些位點，使用該位點可將異源基因定向克隆至病毒基因組中表達。缺失ORF7編碼序列不影響第14,744-14,749位(ATAACC)和14,858-14,863位(TAAACC)轉(zhuǎn)錄ORF7亞基因組RNA的潛在前導(dǎo)序列連接位點，所述位點可以在轉(zhuǎn)錄異源基因時起作用。異源基因包括其它PRRS病毒分離物或基因型的基因，和/或其它非PRRS病原體的基因，所述病原體為感染豬的病原體或感染非豬哺乳動物或禽類的病原體。
另外，這些異源基因(或其部分)可提供不常見于豬中的抗原性表位。所述表位可用于“正標記”疫苗，以使可通過血清學(xué)監(jiān)測成功的免疫，甚至存在抗PRRS病毒之野生型或常規(guī)疫苗株的抗體時也是如此。正標記無需是分離的表達盒，抗原性表位可與PRRS病毒的結(jié)構(gòu)基因融合。例如，可延伸上文實施例I所述的上游側(cè)翼區(qū)反向引物，以在ORF6膜蛋白中添加非PRRS病毒抗原性表位的羧基末端融合蛋白。豬中存在抗此表位的抗體說明免疫是成功的。實施例IV.通過將cDNA直接轉(zhuǎn)染至細胞中對PRRS病毒進行細胞表達真核表達載體pCMV-MC1(SEQ ID NO31)衍生自商購質(zhì)粒pCMVβ(Clontech)，后者的兩個NotI位點之間的lacZ編碼序列被含有NotI、EcoRV、AvrII、BglII、ClaI、KpnI、PacI、NheI、SwaI、SmaI、SpeI和NotI位點的接頭取代。通過用合成的接頭(見下文)取代pCMV-MC1中SacI和第二個NotI位點之間的序列以修飾人CMV立即早期啟動子。接頭含有SacI位點的一半，后面是PacI、SpeI和NotI位點的一半。將兩個單鏈寡核苷酸退火之后，將接頭克隆至pCMV-MC1中的SacI和NotI位點之間，將選定的克隆稱為pCMV-S1。pCMV-S1中的SpeI位點不能切開，這可能是寡核苷酸序列中的錯誤所致。因此，用pCMV-MC1中的PacI(第877位)-HindIII(第1162位)片段取代pCMV-S1中PacI和HindIII之間的片段，從而重新得到SpeI位點。使用最終的構(gòu)建體(pCMV-S)克隆全長的P129基因組。
接頭序列(SEQ ID NO32和33)5′CGTTAATTAAACCGACTAGTGC 3′3′TCGAGCAATTAATTTGGCTGATCACGCCGG 5′＿＿PacI SpeI＿＿＿SacI NotI修飾緊接P129基因組5’末端上游的序列以使其含有適當?shù)拈g隔和方便的限制性酶位點(PacI)。通過設(shè)計適當?shù)腜CR引物(SEQ IDNO34和35)以從pT7P129擴增可以實現(xiàn)上述目的。用PacI和AatII消化之后，將此PCR片段亞克隆至pT7RG(圖1)的PacI和AatII位點，所得質(zhì)粒被稱為pT7RG-δT7。
通過將pT7RG-δT7中的病毒序列亞克隆至pT7P129的PacI和NdeI位點，產(chǎn)生pT7P129-δT7即可完成最終的構(gòu)建。用PacI和SpeI消化pT7P129-δT7中的全長P129基因組并轉(zhuǎn)移至pCMV-S的PacI和SpeI位點。此構(gòu)建體被稱為pCMV-S-P129。
pCMV-S-P129中CMV啟動子TATA盒和P129序列之5’末端之間的修飾區(qū)域的序列示于SEQ ID NO36并圖示如下TATATAAGCAGAGCTCGTTAATTAAACCGTCATGACGTATAGGTGTTGGC5′TATA box Sac I Pac I Start of P129 3′為了檢測CMV啟動子在細胞中啟動PRRS病毒感染的用途，通過使用LipofectamineTM(Life Technologies公司)進行脂轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒pCMV-S-P129的DNA(0.5或1.0μg)轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞中。轉(zhuǎn)染后觀察到PRRS病毒特異性的致細胞病變效應(yīng)，通過免疫熒光抗體試驗測定PRRS病毒抗原的存在。
由pCMV-S-P129有效產(chǎn)生了PRRS病毒，可在MARC-145細胞上傳代子代病毒，這表明PRRS病毒感染可直接由編碼PRRS病毒的質(zhì)粒cDNA啟動，而無需體外轉(zhuǎn)錄步驟。另外，與pCMV啟動子的3’末端未緊接編碼北美PRRS病毒之序列的起點的質(zhì)粒相比，pCMV-S-P129產(chǎn)生更大量的子代病毒。實施例V.缺失北美PRRS病毒的ORF4；籍此制備復(fù)制缺損型疫苗從本發(fā)明PRRS病毒的感染性cDNA克隆中缺失編碼膜糖蛋白的ORF4基因的一部分。預(yù)期所得重組經(jīng)修飾PRRS病毒在豬中是復(fù)制缺損的，并可誘導(dǎo)針對其它PRRS病毒蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答，而免除了患上會傳播至未經(jīng)免疫之動物的臨床疾病的危險，或回復(fù)突變成與減毒活疫苗相關(guān)之強毒力的危險。
按下述從感染性克隆中缺失ORF4將質(zhì)粒p2_7D-4(見圖1)用作PCR模板以擴增ORF4上游和下游的5’和3’側(cè)翼區(qū)。上游側(cè)翼區(qū)正向引物是5’-AGGTCGACGGCGGCAATTGGTTTCACCTAGAGTGGCTGCGTCCCTTCT-3’(SEQ ID NO37)，該引物與ORF4開始處附近的基因組第13,194-13,241位結(jié)合，并在第13225位導(dǎo)入突變，此突變破壞了ORF4的ATG起始密碼子，但未改變ORF3重疊的氨基酸序列。上游側(cè)翼區(qū)反向引物是5’-TCTTAAGCATTGGCTGTGATGGTGATATAC-3’(SEQ ID NO38)，該引物與處于ORF3下游的ORF4編碼區(qū)中基因組第13455-13477位結(jié)合，并導(dǎo)入AflII位點。對下游側(cè)翼區(qū)而言，正向引物是5’-CTTCTTAAGTCCACGCGTTTTCTTCTTGCCTTTTCTATGCTTCT-3’(SEQ ID NO39)，該引物與ORF4中間的基因組第13520-13545位結(jié)合，并導(dǎo)入AflII和MluI位點以定向克隆異源基因。反向引物是5’-TGCCCGGTCCCTTGCCTCT-3’(SEQ ID NO40)，該引物與ORF7編碼序列中的基因組第14981-14999位結(jié)合。使用上游側(cè)翼區(qū)PCR產(chǎn)物的SalI-AflII片段，下游側(cè)翼區(qū)PCR產(chǎn)物的AflII-BstEII片段和質(zhì)粒p2_7D-4的SalI-BstEII片段(消化后，凝膠純化所有片段)進行3方連接。所得質(zhì)粒p2_7D-4δ4N缺失了ORF4中間部分的42個堿基，取而代之的是15個堿基的人工克隆位點?？寺∥稽c含有病毒基因組和質(zhì)粒骨架中都缺乏的兩個限制性位點AflII和MluI，使用它們便于將異源基因定向克隆至以前被ORF4占據(jù)的空間。克隆位點還含有ORF4框內(nèi)的終止密碼子TAA，這可進一步保證不產(chǎn)生功能性的ORF4蛋白質(zhì)。
我們發(fā)現(xiàn)，更進一步地缺失ORF4編碼序列也不會干擾下游ORF5包膜基因的表達。此時，使用相同的模板和反向引物，并使用正向引物5’-GTTTACGCGTCGCTCCTTGGTGGTCG-3’(SEQ ID NO41)，通過PCR擴增較短的下游側(cè)翼區(qū)，該正向引物與ORF4 3’末端附近的基因組第13654-13669位結(jié)合并含有AflII位點。下游側(cè)翼區(qū)PCR產(chǎn)物的AflII-BstEII片段和質(zhì)粒p2_7D-4δ4N的AflII-BstEII片段之間的兩方連接產(chǎn)生了新的質(zhì)粒p2_7D-4δ4NS。該質(zhì)粒缺失了ORF4編碼序列的176個堿基，取而代之的是15個堿基的克隆位點。
通過用p2_7D-4δ4N和p2_7D-4δ4NS中經(jīng)修飾的BsrGI-SpeI片段取代pCMV-S-P129中的BsrGI-SpeI片段，將p2_7D-4δ4N和p2_7D-4δ4NS中的變化摻入全長基因組克隆中。使用所得質(zhì)粒pCMV-S-P129δ4N和pCMV-S-P129δ4NS轉(zhuǎn)染細胞。
與pCMV-S-P129形成對照的是，用質(zhì)粒pCMV-S-P129δ4N或pCMV-S-P129δ4NS轉(zhuǎn)染MARC-145細胞不會導(dǎo)致病毒噬斑或熒光病灶?？梢姼鱾€轉(zhuǎn)染細胞都產(chǎn)生ORF7核殼蛋白，這表明ORF4基因產(chǎn)物不是RNA復(fù)制或病毒基因表達所必需的，但它對感染性子代病毒的釋放是至關(guān)重要的。由于ORF4的缺失對病毒復(fù)制而言是致命的，因此必需提供此蛋白質(zhì)。通過使用互補的細胞系可做到這一點。通過用含有ORF4和新霉素抗性基因的質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞即產(chǎn)生了表達ORF4的MARC-145細胞系。使用抗生素G418選擇新霉素抗性之后，擴增并鑒定單細胞集落。用pCMV-S-P129δ4NS轉(zhuǎn)染后，3個表達ORF4的細胞克隆產(chǎn)生了活病毒，該病毒可在這些細胞中增殖但不能在MARC-145細胞中增殖。進一步鑒定其中一個細胞克隆MARC400E9，對用pCMV-S-P129δ4NS轉(zhuǎn)染的MARC400E9細胞中的病毒核殼進行免疫熒光染色，結(jié)果為陽性。實施例VI.使用基因缺失的PRRS病毒作為載體以表達異源基因為了測定是否可以用基因缺失的PRRS病毒表達異源基因，我們將1拷貝綠色熒光蛋白(GFP)基因插入質(zhì)粒pCMV-S-P129δ4N中ORF4缺失的位點。使用在基因5’末端導(dǎo)入AflII位點并在基因3’末端導(dǎo)入MluI位點的PCR引物，從商購質(zhì)粒載體中擴增GFP基因，使用所得質(zhì)粒pCMV-S-P129δ4N-GFP轉(zhuǎn)染MARC-145和MARC400E9細胞。正如所預(yù)期的，MARC-145不支持缺失ORF4的病毒進行復(fù)制。在紫外光顯微鏡下看見原代感染所致的單個綠色細胞，這表明GFP被表達，但病毒未擴散至相鄰細胞，未觀察到CPE。與之形成對照的是，在轉(zhuǎn)染的MARC400E9細胞中觀察到大的綠色病灶，形成可見的噬斑并連成一片，破壞了細胞單層。這些結(jié)果表明可用ORF4缺失的PRRS病毒表達異源基因，病毒基因組大小增加692個堿基(4.5％)不會干擾病毒RNA包裝成感染性顆粒。實施例VII.使用有復(fù)制能力的PRRS病毒作為載體以表達異源基因為了測定能否用有復(fù)制能力的PRRS病毒表達異源基因，我們將1拷貝GFP基因插入ORF1b和ORF2之間的區(qū)域。由于ORF2的前導(dǎo)序列/連接序列(L/J)位于ORF1b中，使用L/J序列驅(qū)動GFP基因的表達，并將1拷貝ORF6 L/J序列插入GFP下游以驅(qū)動ORF2表達。
將質(zhì)粒p2_7D-4(見圖1)用作PCR模板以擴增插入位點上游和下游的5’和3’側(cè)翼區(qū)。上游側(cè)翼區(qū)正向引物是5’-AACAGAAGAGTTGTCGGGTCCAC-3’(SEQ ID NO42)，該引物與ORF1b內(nèi)基因組第11699-11721位結(jié)合。上游側(cè)翼區(qū)反向引物是5’-GCTTTGACGCGTCCCCACTTAAGTTCAATTCAGGCCTAAAGTTGGTTCA-3’(SEQ ID NO43)，該引物與ORF1b內(nèi)基因組第12031-12055位結(jié)合，并導(dǎo)入AflII位點和MluI位點以將異源基因定向克隆至ORF1b和ORF2之間。下游側(cè)翼區(qū)正向引物是5’-GCGACGCGTGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGAGTTTCAGCGGAACAATGAAATGGGGTCTATA CAAAGCCTCTTCGACA-3’(SEQ ID NO44)，該引物與ORF2內(nèi)基因組第12056-12089位結(jié)合，并含有MluI位點，其后是ORF6起點前的40個堿基(含有ORF6 L/J序列)。下游側(cè)翼區(qū)反向引物是5’-AACAGAACGGCACGATACACCACAAA-3’(SEQ ID NO45)，該引物與ORF5內(nèi)基因組第13819-13844位結(jié)合。使用上游側(cè)翼區(qū)PCR產(chǎn)物的Eco47III-MluI片段，下游側(cè)翼區(qū)PCR產(chǎn)物的MluI-BsrGI片段和pCMV-S-P129的Eco47III-BsrGI片段進行3方連接。所得質(zhì)粒pCMV-S-P129-1bMCS2含有整個P129基因組，其中具有克隆位點以及ORF1b和ORF2之間額外的L/J位點。當轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞中時，該質(zhì)粒產(chǎn)生了功能性的正常病毒。
使用在基因5’末端導(dǎo)入AflII位點和在基因3’末端導(dǎo)入MluI位點的PCR引物，從商購質(zhì)粒載體中擴增GFP基因，用AflII和MluI消化PCR片段和pCMV-S-P129-1bMCS2之后，將插入物連接到載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒pCMV-S-P129-1bGFP2。當轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞中時，該質(zhì)粒產(chǎn)生了綠色的噬斑。在MARC-145細胞上傳代所得質(zhì)粒，當在紫外光顯微鏡下觀察時，發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒持續(xù)產(chǎn)生綠色噬斑。因此，可用有復(fù)制能力的PRRS病毒載體表達異源基因。P129-1bGFP2病毒含有比其親代P129病毒長774個堿基(5％)的基因組，然而它可正常地被包裝。
于1998年11月19日將下列生物材料保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 University Blvd.，Manassas，Virginia，20110-2209，USA)，其保藏號如下質(zhì)粒保藏號質(zhì)粒pT7P129A203488質(zhì)粒pCMV-S-P129 203489本文提及的所有專利、專利申請和文獻都全文列入本文作為參考。
本發(fā)明范圍不受本文所述具體實施方案的限制，這些實施方案只是為了闡明本發(fā)明各個方面，功能上等同的方法和成分都屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。實際上，除了本文所示和所述的那些外，對本發(fā)明多種修飾對參照上文描述和附圖的本領(lǐng)域技術(shù)人員而言都是顯而易見的。所述修飾包括在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表(110)Pfizer Products Inc.(120)北美豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)病毒及其用途(130)PC10278A(140)N/A(141)1998年12月22日(160)45(170)PatentIn Ver.2.0(210)1(211)15450(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述對應(yīng)于北美豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)病毒基因組的cDNA(400)1atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60ggcacagccc aaaacttgct gcacggaaaa cgcccttctg tgacagcctt cttcagggga 120gcttaggggt ctgtccctag caccttgctt ctggagttgc actgctttac ggtctctcca 180cccctttaac catgtctggg atacttgatc ggtgcacgtg cacccccaat gccagggtgt 240ttatggcgga gggccaagtc tactgcacac gatgtctcag tgcacggtct ctccttcctc 300tgaatctcca agttcctgag cttggggtgc tgggcctatt ttataggccc gaagagccac 360tccggtggac gttgccacgt gcattcccca ctgtcgagtg ctcccccgcc ggggcctgct 420ggctttctgc gatctttcca attgcacgaa tgaccagtgg aaacctgaac tttcaacaaa 480gaatggtgcg ggttgcagct gagatttaca gagccggcca actcacccct gcagttttga 540aggctctaca agtttatgaa cggggttgtc gctggtaccc cattgtcgga cctgtccctg 600gagtggccgt tcacgccaac tccctacatg tgagtgacaa acctttcccg ggagcaactc 660atgtgttaac caacctaccg 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gaattccaaa tttgaaacca 1560ctcttcccga gagagtgaga ccttcagatg actgggctac tgacgaggat cttgtgaata 1620ccatccaaat cctcaggctc cccgcggcct tggacaggaa cggtgcttgt gctggcgcca 1680agtacgtgct caagctggaa ggtgagcact ggaccgtctc tgtgacccct gggatgaccc 1740cttctttgct cccccttgaa tgtgttcagg gttgttgtga gcataagagc ggtcttggtt 1800tcccagacgt ggtcgaagtt tccggatttg accctgcctg tcttgaccga cttgctgaga 1860taatgcactt acctagcagt gtcatcccag ctgctctggc cgagatgtcc gacgacttca 1920atcgtctggc ttccccggcc gccactgtgt ggactgtttc gcaattcttt gcccgccaca 1980gaggaggaga gcatcctgac caggtgtgct tagggaaaat tatcaacctt tgtcaggtga 2040ttgaggaatg ctgctgttcc cggaacaaag ccaaccgggc taccccggaa gaggttgcgg 2100caaaagttga ccagtacctc cgtggtgcag caagccttgg agaatgcttg gccaagcttg 2160agagggctcg cccgccgagc gcgatggaca cctcctttga ttggaatgtt gtgcttcctg 2220gggttgagac ggcggatcag acaaccaaac agctccatgt caaccagtgc cgcgctctgg 2280ttcctgtcgt gactcaagag cctttggaca gagactcggt ccctctgacc gccttctcgc 2340tgtccaattg ctactaccct gcacaaggtg acgaggtccg tcaccgtgag 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82(210)45(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)(223)人工序列描述用于合成ORF1b和ORF2之間插入位點的下游側(cè)翼區(qū)的反向引物(400)45aacagaacgg cacgatacac cacaaa 2權(quán)利要求
1.含有編碼北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列。
2.由權(quán)利要求1的分離的多核苷酸分子編碼的分離的感染性RNA分子，或與其同源的分離的感染性RNA分子，所述感染性RNA分子編碼北美PRRS病毒。
3.質(zhì)粒形式的權(quán)利要求1的分離的多核苷酸分子。
4.含有編碼北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的轉(zhuǎn)染宿主細胞，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，轉(zhuǎn)染宿主細胞能表達所編碼的北美PRRS病毒。
5.能直接轉(zhuǎn)染適當宿主細胞并由所轉(zhuǎn)染的適當宿主細胞表達Nidovirales病毒的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有a)編碼Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列，和b)能在所述適當宿主細胞中轉(zhuǎn)錄所述感染性RNA分子的啟動子。
6.產(chǎn)生Nidovirales病毒的方法，所述方法包括用權(quán)利要求5編碼Nidovirales病毒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染適當?shù)乃拗骷毎⒌玫接赊D(zhuǎn)染宿主細胞產(chǎn)生的Nidovirales病毒。
7.含有編碼基因修飾型北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，該PRRS病毒經(jīng)基因修飾使得當其感染豬時不能在動物體內(nèi)產(chǎn)生PRRS，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一個或多個突變，該突變在遺傳學(xué)上使得編碼的PRRS病毒不能產(chǎn)生PRRS。
8.含有編碼基因修飾型北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的轉(zhuǎn)染宿主細胞，該PRRS病毒經(jīng)基因修飾使得當其感染豬時不能在動物體內(nèi)產(chǎn)生PRRS，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一個或多個突變，該突變在遺傳學(xué)上使得編碼的PRRS病毒不能產(chǎn)生PRRS，該轉(zhuǎn)染宿主細胞能表達所編碼的基因修飾型北美PRRS病毒。
9.保護豬免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能有效產(chǎn)生抗PRRS病毒感染之免疫保護的下列成員由權(quán)利要求7的多核苷酸分子編碼的感染性RNA分子所編碼的基因修飾型北美PRRS病毒，或所述感染性RNA分子，或質(zhì)粒形式的所述多核苷酸分子，或含有對應(yīng)于權(quán)利要求7的編碼北美PRRS病毒之核苷酸序列的病毒載體，所述病毒能引發(fā)抗PRRS病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答；該疫苗中還含有獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
10.含有編碼北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，該病毒經(jīng)基因修飾使其含有一個或多個異源抗原性表位，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一個或多個各編碼異源抗原性表位的其它核苷酸序列，其中各個異源抗原性表位能在哺乳動物或禽類中誘導(dǎo)抗特定病原體的有效免疫保護性應(yīng)答。
11.質(zhì)粒形式的權(quán)利要求10的分離的多核苷酸分子。
12.含有編碼北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的轉(zhuǎn)染宿主細胞，該病毒經(jīng)基因修飾使其含有一個或多個異源抗原性表位，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它含有一個或多個各編碼異源抗原性表位的其它核苷酸序列，其中各個異源抗原性表位能在哺乳動物或禽類中誘導(dǎo)抗特定病原體的有效免疫保護性應(yīng)答。
13.保護哺乳動物或禽類免受病原體感染的疫苗，所述疫苗含有由權(quán)利要求10的多核苷酸分子編碼的感染性RNA分子所編碼的基因修飾型北美PRRS病毒，或所述感染性RNA分子，或權(quán)利要求11的質(zhì)粒，其量能有效產(chǎn)生對抗衍生得到所述異源抗原性表位的病原體感染的免疫保護；該疫苗還含有藥物學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
14.權(quán)利要求10的分離的多核苷酸分子，其中編碼基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子的DNA編碼序列含有一個或多個其它突變，所述突變使得編碼的基因修飾型北美PRRS病毒不能在豬中產(chǎn)生PRRS。
15.質(zhì)粒形式的權(quán)利要求14的分離的多核苷酸分子。
16.保護豬免受PRRS病毒感染和非北美PRRS病毒的豬病原體感染的疫苗，所述疫苗含有由權(quán)利要求14的多核苷酸分子編碼的感染性RNA分子所編碼的基因修飾型北美PRRS病毒，或所述感染性RNA分子，或權(quán)利要求15的質(zhì)粒，其量能有效產(chǎn)生對抗PRRS病毒感染和對抗衍生得到或由其編碼該異源抗原性表位的病原體感染之免疫保護；該疫苗還含有獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
17.含有編碼北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，該病毒經(jīng)基因修飾使其含有一個或多個可測的異源抗原性表位，其中編碼感染性RNA分子的DNA序列是SEQ ID NO1或與其同源，或是其同源序列，不同的是它含有一個或多個各編碼可測異源抗原性表位的其它核苷酸序列。
18.保護豬免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能有效產(chǎn)生抗PRRS病毒感染之免疫保護的下列成員由權(quán)利要求17的多核苷酸分子編碼的感染性RNA分子所編碼的基因修飾型北美PRRS病毒，該病毒含有一個或多個可測的異源抗原性表位，經(jīng)處理或進一步地進行基因修飾后使其不能在豬中產(chǎn)生PRRS但仍能在豬中引發(fā)抗PRRS病毒的有效免疫保護性應(yīng)答；或所述感染性RNA分子，其中由其編碼的基因修飾型北美PRRS病毒含有一個或多個可測的異源抗原性表位，所述病毒還含有其它的基因修飾使其不能產(chǎn)生PRRS但仍能引發(fā)抗PRRS病毒的有效免疫保護性應(yīng)答；或質(zhì)粒形式的權(quán)利要求17的分離多核苷酸，其中由其編碼的基因修飾型北美PRRS病毒含有一個或多個可測的異源抗原性表位，所述病毒還含有其它的基因修飾使其不能產(chǎn)生PRRS但仍能引發(fā)抗PRRS病毒的有效免疫保護性應(yīng)答；或含有編碼感染性RNA分子之核苷酸序列的病毒載體，所述RNA分子編碼這種基因修飾型北美PRRS病毒，其中由其編碼的基因修飾型北美PRRS病毒含有一個或多個可測的異源抗原性表位，所述病毒還含有其它的基因修飾使其不能產(chǎn)生PRRS但仍能引發(fā)抗PRRS病毒的有效免疫保護性應(yīng)答；該疫苗中還含有獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
19.含有編碼北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，該病毒經(jīng)基因修飾使其缺失可測的抗原性表位，其中所述DNA序列是SEQ ID NO1或其同源序列，不同的是它缺失了一個或多個編碼可測抗原性表位的DNA序列。
20.保護豬免受PRRS病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能有效產(chǎn)生抗PRRS病毒感染之免疫保護的下述成員由權(quán)利要求19的多核苷酸分子編碼的感染性RNA分子所編碼的基因修飾型北美PRRS病毒，該病毒缺失了一個或多個可測的抗原性表位，經(jīng)處理或進一步地進行基因修飾后使其不能在豬中產(chǎn)生PRRS但仍能在豬中引發(fā)抗PRRS病毒的有效免疫保護性應(yīng)答；或所述感染性RNA分子，其中由其編碼的基因修飾型北美PRRS病毒缺失了一個或多個可測的抗原性表位，所述病毒還含有其它的基因修飾使其不能產(chǎn)生PRRS但仍能引發(fā)抗PRRS病毒的有效免疫保護性應(yīng)答；或質(zhì)粒形式的分離的多核苷酸分子，其中由其編碼的基因修飾型北美PRRS病毒缺失了一個或多個可測的抗原性表位，所述病毒還含有其它的基因修飾使其不能產(chǎn)生PRRS但仍能引發(fā)抗PRRS病毒的有效免疫保護性應(yīng)答；或含有編碼感染性RNA分子之核苷酸序列的病毒載體，所述RNA分子編碼這種基因修飾型北美PRRS病毒，其中由其編碼的基因修飾型北美PRRS病毒缺失了一個或多個可測的抗原性表位，所述病毒還含有其它的基因修飾使其不能產(chǎn)生PRRS但仍能引發(fā)抗PRRS病毒的有效免疫保護性應(yīng)答；該疫苗中還含有獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
21.含有一個或多個各編碼北美PRRS病毒所編碼之肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸分子，其中所述北美PRRS病毒的基因組序列與對應(yīng)于SEQ ID NO1的RNA分子相同或同源。
22.含有一個或多個各編碼北美PRRS病毒所編碼之肽的核苷酸序列的轉(zhuǎn)染宿主細胞，其中所述北美PRRS病毒的基因組序列與對應(yīng)于SEQ IDNO1的RNA分子相同或同源，該轉(zhuǎn)染細胞能表達所述肽。
23.產(chǎn)生基因修飾型北美PRRS病毒之功能性毒粒的方法，所述病毒由對應(yīng)于SEQ ID NO1或其同源序列的RNA序列編碼，不同的是在其一個或多個肽編碼序列中含有一個或多個突變，所述方法包括用編碼基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子、質(zhì)?；虿《据d體進一步轉(zhuǎn)染經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細胞，其中由所述轉(zhuǎn)染宿主細胞的所述核苷酸序列編碼的北美PRRS病毒肽含有所述基因修飾型北美PRRS病毒的諸突變肽編碼序列的肽。
24.產(chǎn)生基因修飾型北美PRRS病毒之功能性毒粒的方法，所述病毒由對應(yīng)于SEQ ID NO1或其同源序列的RNA序列編碼，不同的是其中一個或多個肽編碼序列中含有一個或多個突變，所述方法包括用編碼基因修飾型北美PRRS病毒的感染性RNA分子、質(zhì)?；虿《据d體以及表達所述基因修飾型北美PRRS病毒之諸突變肽編碼序列所編碼的諸北美PRRS病毒肽的輔助病毒轉(zhuǎn)染適當細胞，將細胞表達的基因修飾型北美PRRS毒粒與輔助病毒分開。
25.可在被其免疫的哺乳動物或禽類中引發(fā)免疫保護性應(yīng)答的基因修飾型Nidovirales病毒，它是通過下述方法制備的得到含有編碼野生型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子；對所述DNA序列進行基因突變以得到含有編碼基因修飾型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，所述病毒能在哺乳動物或禽類中引發(fā)抗野生型Nidovirales病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答；由所得的分離的多核苷酸分子表達基因修飾型Nidovirales病毒。
26.在被其免疫的哺乳動物或禽類中能引發(fā)免疫保護性應(yīng)答的基因修飾型Nidovirales病毒的制備方法，所述方法包括得到含有編碼野生型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子；對所述DNA序列進行基因突變以得到含有編碼基因修飾型Nidovirales病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子，所述病毒能在哺乳動物或禽類中引發(fā)抗野生型Nidovirales病毒感染的有效免疫保護性應(yīng)答；由所得的分離的多核苷酸分子表達基因修飾型Nidovirales病毒。
27.能保護哺乳動物或禽類免受Nidovirales病毒感染的疫苗，所述疫苗含有其量能在經(jīng)其免疫的哺乳動物或禽類中有效引發(fā)抗野生型Nidovirales病毒之有效免疫保護性應(yīng)答的權(quán)利要求25的基因修飾型Nidovirales病毒，和藥物學(xué)或獸醫(yī)學(xué)可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有編碼北美PRRS病毒之感染性RNA分子的DNA編碼序列的分離的多核苷酸分子,包括質(zhì)粒;病毒載體;和轉(zhuǎn)染的宿主細胞;還提供了由它們編碼的北美PRRS病毒。本發(fā)明還提供了編碼北美PRRS病毒的分離的感染性RNA分子。本發(fā)明還提供了編碼基因修飾型北美PRRS病毒的分離的多核苷酸分子、感染性RNA分子、病毒載體和轉(zhuǎn)染的宿主細胞;以及由它們編碼的基因修飾型北美PRRS病毒。本發(fā)明還提供了含有所述質(zhì)粒、RNA分子、病毒載體和北美PRRS病毒的疫苗,和在豬和其它動物中使用這些疫苗的方法。本發(fā)明還提供了含有編碼北美PRRS病毒肽之核苷酸序列的分離的多核苷酸分子、病毒載體和轉(zhuǎn)染的宿主細胞。這些病毒載體和轉(zhuǎn)染宿主細胞系可用于提供肽,以補償基因修飾型北美PRRS病毒之DNA編碼序列的突變肽編碼序列,從而能產(chǎn)生功能性的毒粒。
文檔編號C12N7/04GK1263945SQ9912650
公開日2000年8月23日 申請日期1999年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者J·G·卡爾沃特, M·G·謝帕德, S-K·W·韋爾奇 申請人:輝瑞產(chǎn)品公司