專利名稱：基質(zhì)的定量方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及便于實施對試樣中的基質(zhì)的快速而且高精度的定量分析的定量方法。
背景技術(shù)：
蔗糖、葡萄糖等醣類的定量分析方法已經(jīng)研究出有光度計法、比色法、還原滴定法和使用各種色譜法的方法。但是這些方法都不是特別針對醣類的，精度也不高。這些方法中，采用光度計法則操作簡便，但是操作時受溫度的影響大。因此，光度計法不適合人們在家庭等場合中用作醣類的簡單定量分析方法。
但是，近年來利用酶具有的特異催化作用，研究出了各種類型的生物傳感器。
下面對試樣液中的基質(zhì)的定量方法的一個例子即葡萄糖的定量法進(jìn)行說明。作為電化學(xué)方式的葡萄糖定量法通常已知有使用葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4以下簡稱GOD)與氧電極或過氧化氫電極進(jìn)行的方法(例如日本講談社出版的，鈴木周一編寫的「生物傳感器」)。
GOD以氧作為電子傳輸體，有選擇地把作為基質(zhì)的β-D-葡萄糖氧化為D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯。在存在氧的情況下，在GOD引起的氧化反應(yīng)過程中，氧被還原為過氧化氫。利用氧電極測定氧的減少量，或利用過氧化氫電極測定過氧化氫的增加量。氧的減少量及過氧化氫的增加量與使用液中葡萄糖的含量成比例，因此，可以根據(jù)氧的減少量或過氧化氫的增加量對葡萄糖進(jìn)行定量。
這種方法，根據(jù)其反應(yīng)過程也可以推測到，存在著這樣的問題，即測定結(jié)果在很大程度上受到包含于試樣液中的氧濃度的影響。又，在試樣液中不存在氧的情況下是不可能進(jìn)行測定的。
因此，研究出了不使用氧作為電子傳輸體，而以使用鐵氰化鉀、二茂鐵衍生物、醌衍生物等有機(jī)化合物或金屬絡(luò)合物作為傳遞體的新型的葡萄糖傳感器。這種類型的傳感器利用在電極上將作為酶反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生的電子傳輸體的還原體加以氧化的方法，根據(jù)其氧化電流量求出試樣液中含有的葡萄糖濃度。這樣使用有機(jī)化合物或金屬絡(luò)合物代替氧作為電子傳輸體的方法，能夠使已知數(shù)量的GOD和那些電子傳輸體以穩(wěn)定的狀態(tài)正確地支承在電極上形成反應(yīng)層。在這種情況下，可以使反應(yīng)層在接近干燥的狀態(tài)下與電極系統(tǒng)形成一體，因此，以這種技術(shù)為依據(jù)的一次性的葡萄糖傳感器，近年來很受人們的關(guān)注。
在一次性的葡萄糖傳感器中，只要把試樣液引入可裝卸地連接于測定器的傳感器，就能夠用測定器容易地測出葡萄糖濃度。這樣的方法不限于葡萄糖的定量分析，也能夠使用于包含在試樣液中的其他基質(zhì)的定量分析。
利用上述傳感器的測定，能夠在作用電極上將還原型電子傳輸體加以氧化，根據(jù)當(dāng)時流過的氧化電流值求出基質(zhì)濃度。但是在試樣為血液或果汁等的情況下，包含于該試樣中的抗壞血酸、尿酸等易氧化物質(zhì)也與還原型電子傳輸體同時在電極上氧化。有時候該易氧化物質(zhì)的氧化反應(yīng)對測定的結(jié)果有影響。
又，使用上述傳感器的測定中，支承與反應(yīng)層的電子傳輸體被還原，同時發(fā)生將溶解的氧作為電子傳輸體生成過氧化氫的反應(yīng)。而且在該反應(yīng)中產(chǎn)生的過氧化氫又再次將還原型電子傳輸體氧化。結(jié)果是，在根據(jù)還原型電子傳輸體的氧化電流對基質(zhì)濃度進(jìn)行測定時，有時溶解的氧會給測定結(jié)果帶來負(fù)誤差。
在上述方法中，在為了得到電流響應(yīng)而在作用電極與對電極之間施加電壓之前，往往在作用電極與對電極之間施加電壓，根據(jù)該兩極之間的電學(xué)上的變化檢測液體接界，也就是說，檢測試樣液提供的情況。這時，在充分向電極系統(tǒng)提供試樣液之前，有時上述作用電極一對電極之間的電阻值發(fā)生變化后開始測定，有時對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。
還有，在二電極式的測定方法中，將對電極通用作為參照電極。因此，由于作為基準(zhǔn)的對電極電位隨著在作用電極發(fā)生的氧化還原反應(yīng)而發(fā)生變動，所以存在影響測定結(jié)果的情況。
本發(fā)明的目的在于提供消除上述不良情況，消除易氧化物質(zhì)造成的影響，能夠正確測定基質(zhì)濃度的定量方法。
本發(fā)明的目的還在于提供響應(yīng)波動更小的基質(zhì)定量方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的基質(zhì)的定量方法，使用電絕緣基板、具有形成于所述基板上的作用電極和對電極以及用作有害物質(zhì)檢測電極使用的第3電極的電極系統(tǒng)、設(shè)置于除第3電極以外的電極系統(tǒng)上的，至少包含氧化還原酶與電子傳輸體的反應(yīng)層構(gòu)成的生物傳感器，利用使包含于試樣液中的基質(zhì)與氧化還原酶反應(yīng)時生成的電子還原電子傳輸體，利用對該電子傳輸體的還原量進(jìn)行電化學(xué)測定的方法，對試樣液中基質(zhì)的濃度進(jìn)行定量分析，其特征在于，包含
(a)在對電極與第3電極之間施加電壓的工序，(b)將試樣液提供給反應(yīng)層的工序，(c)借助于將試樣液提供給反應(yīng)層而產(chǎn)生的、對電極與第3電極之間的電化學(xué)變化的檢測工序，(d)在進(jìn)行所述檢測工序(c)之后，測定對電極與第3電極之間產(chǎn)生的電流的工序，(e)在上述測定工序(d)之后，解除施加于對電極與第3電極之間的電壓的工序。
(f)在作用電極與對電極之間施加電壓的工序，以及(g)其后，測定對電極與作用電極之間產(chǎn)生的電流的工序。
本發(fā)明的基質(zhì)的定量方法，又是使用電絕緣基板、具有形成于所述基板上的作用電極和對電極以及用作有害物質(zhì)檢測電極的第3電極的電極系統(tǒng)、設(shè)置于第3電極以外的電極系統(tǒng)上的，至少包含氧化還原酶與電子傳輸體的反應(yīng)層、以及在所述基板上形成將試樣液從試樣液供給口引向所述反應(yīng)層的試樣液供給路線的蓋構(gòu)件構(gòu)成，第3電極配置于比反應(yīng)層更靠近試樣液供給路線的上游側(cè)的生物傳感器，利用使包含于試樣液中的基質(zhì)與氧化還原酶反應(yīng)時生成的電子還原電子傳輸體，利用對該電子傳輸體的還原量進(jìn)行電化學(xué)測定的方法，對試樣液中基質(zhì)的濃度進(jìn)行定量分析，其特征在于，包含(a)在對電極與第3電極之間施加電壓的工序，(b)將試樣液提供給反應(yīng)層的工序，(c)借助于將試樣液提供給反應(yīng)層而產(chǎn)生的、對電極與第3電極之間的電化學(xué)變化的檢測工序，(d)在進(jìn)行所述檢測工序(c)之后，測定對電極與第3電極之間產(chǎn)生的電流的工序，(e)在上述測定工序(d)之后，解除施加于對電極與第3電極之間的電壓的工序。
(f)在作用電極與對電極之間施加電壓的工序，以及(g)其后，測定對電極與作用電極之間產(chǎn)生的電流的工序。
在本發(fā)明的定量方法中，最好把第3電極作為參照電極使用。也就是說，在上述工序(f)中，在作用電極與對電極之間也施加電壓。
又，在使用將蓋構(gòu)件與所述基板加以組合的生物傳感器的情況下，最好是在露出于試樣液供給路線的蓋構(gòu)件的壁面上配置有卵磷脂的層。
還有，最好是所述反應(yīng)層含有親水性高分子。
附圖概述

圖1是本發(fā)明一實施例的葡萄糖傳感器的去除反應(yīng)層的狀態(tài)的平面圖。
圖2是本發(fā)明另一實施例的葡萄糖傳感器的去除反應(yīng)層的狀態(tài)的分解立體圖。
本發(fā)明的最佳實施方式下面對使用于本發(fā)明的定量方法的生物傳感器的結(jié)構(gòu)加以說明。
首先，利用圖1對第1種類型的生物傳感器加以說明。
這種傳感器是在聚對苯二甲酸乙二醇酯等構(gòu)成的絕緣基板1上設(shè)置對電極6、作用電極7以及第3電極8，再分別設(shè)置電氣連接于這些電極的導(dǎo)線2、3、4。碳層是為了易于制作反應(yīng)層而設(shè)置的層，不起電極的作用。除了第3電極8外，對電極6、作用電極7以及碳層9上設(shè)置包含氧化還原酶和電子傳輸體的圓形反應(yīng)層(未圖示)。圖中5是絕緣層。
下面根據(jù)圖2對第2種類型的生物傳感器加以說明。
這種傳感器是將蓋10及隔板11構(gòu)成的蓋構(gòu)件組合于圖1的基板1上形成的。這些零件以圖2中的點劃線所示的位置關(guān)系連接構(gòu)成傳感器。
在隔板11上設(shè)有形成試樣液供給路線的切口12，而且在蓋10上形成空氣孔13。通過隔板11把蓋10疊層連接于基板1上，即由基板1、隔板11及蓋10在隔板11的切口12處形成作為試樣液提供路線的空間。該空間的終端與空氣孔13連通。
在該生物傳感器中，作用電極7配置于比半月狀對電極6更接近試樣液供給口12a(相當(dāng)于切口12的開口端)的位置，第3電極8配置于比作用電極7還接近試樣液供給口12a的位置。這些電極6、7和8分別露出于上述空間。
為使用上述生物傳感器進(jìn)行基質(zhì)濃度測定，首先把傳感器的具有引線2、3、4的一側(cè)的端部固定于測定器上，以對電極6為基準(zhǔn)在第3電極8施加規(guī)定的電位。在施加這一電位的狀態(tài)下，把包含有害物質(zhì)、例如抗壞血酸的試樣液滴在反應(yīng)層上，使反應(yīng)層溶解于試樣液中。
在提供試樣液的同時，根據(jù)電極系統(tǒng)的對電極6和第3電極8之間的電學(xué)變化，檢測試樣液供給情況的系統(tǒng)操作，由此測定定時器開始動啟動。這時，在對電極與第3電極之間預(yù)先施加了電位，在檢測出提供了試樣液并經(jīng)過一定的時間之后，測定對電極6與第3電極8之間的電流值。由于沒有在第3電極8上配置反應(yīng)層，作為酶反應(yīng)的結(jié)果生成的電子傳輸體的還原體到達(dá)第3電極8的近旁，需要一定的時間。因此，上述電流值是由所包含的有害物質(zhì)抗壞血酸的氧化反應(yīng)引起的。
接著，解除施加于對電極6與第3電極8之間的電壓。
然后以對電極6為基準(zhǔn)，在作用電極7施加將上述電子傳輸體的還原體氧化的電位，測定對電極6與作用電極7之間的電流值。這一電流是由電子傳輸體的還原體以及預(yù)先存在的有害物質(zhì)抗壞血酸的氧化反應(yīng)引起的。也就是說，抗壞血酸給測定的結(jié)果帶來正誤差。而上述對電極6和第3電極8之間的電流值主要只是反映抗壞血酸的濃度，因此可以根據(jù)該電流值對測定結(jié)果進(jìn)行修正，以消除抗壞血酸的影響，求得正確的基質(zhì)濃度。
用第2種類型的傳感器，為了檢測在對電極6與第3電極8之間試樣液的供給情況，作用電極7的露出部分全部用試樣液可靠地淹沒。借助于此，可以更加可靠地判定試樣液的供給情況。
下面利用實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
實施例1下面對葡萄糖的定量方法進(jìn)行說明。葡萄糖傳感器的基板使用圖1所示的基板。這種葡萄糖傳感器采用下述方法制作。
在聚對苯二甲酸乙二醇酯構(gòu)成的絕緣基板1上利用絲網(wǎng)印刷方法印刷銀膠，分別形成導(dǎo)線2、3、4。接著，把包含樹脂粘合劑的導(dǎo)電性碳膠印刷在基板上，形成對電極6、作用電極7、第3電極8以及碳層9，對電極6、作用電極7及第3電極8分別與導(dǎo)線2、3、4電氣接觸。
接著，在該基板1上印刷絕緣膠，形成絕緣層5。絕緣層5覆蓋對電極6、作用電極7、第3電極8以及碳層9的外圍，借助于此，使對電極6、作用電極7、第3電極8以及碳層9的露出部分的面積保持一定。絕緣層5覆蓋著導(dǎo)線2、3、4的一部分。
接著，在除了第3電極8的對電極6、作用電極7及碳層9上滴下羧甲基纖維素(下稱CMC)的水溶液，使其干燥，形成CMC層。在該CMC層上，滴下包含作為酶的GOD和作為電子傳輸體的鐵氰化鉀的水溶液，則由親水性高分子構(gòu)成的CMC層一次溶解，在其后的烘干過程中以與酶等混合的形式形成反應(yīng)層。但是，由于沒有接著進(jìn)行攪拌，未能形成完全的混合狀態(tài)，電極系統(tǒng)表面處于只是由CMC覆蓋的狀態(tài)。也就是說，由于酶及電子傳輸體等不與電極系統(tǒng)表面接觸，可以防止電極系統(tǒng)表面蛋白質(zhì)等的吸附。
為了使用這種傳感器測定葡萄糖濃度，首先把具有導(dǎo)線2、3、4的一側(cè)的端部配置于測定器上，以對電極6為基準(zhǔn)，在第3電極8施加500mV的電位。在施加這一電位的狀態(tài)下，把包含有害物質(zhì)抗壞血酸的葡萄糖水溶液30微升作為試樣液滴在反應(yīng)層上，電極系統(tǒng)上的反應(yīng)層溶解于滴下的試樣液中。
在提供試樣液的同時，根據(jù)電極系統(tǒng)的對電極6和第3電極8之間的電學(xué)變化，起動檢測試樣液供給的系統(tǒng)，因此測定定時器也開始動作。這時，在對電極6與第3電極8之間持續(xù)施加電位，在檢測出提供了試樣液并經(jīng)過一定的時間之后，測定對電極6與第3電極8之間的電流值。該電流值是由所包含的有害物質(zhì)抗壞血酸的氧化反應(yīng)引起的，與其濃度存在著比例關(guān)系。在測定了對電極6與第3電極8之間的電流值之后，解除施加于兩個電極之間的電壓。
如上所述，在第3電極8上沒有配置反應(yīng)層。因此，作為酶反應(yīng)的結(jié)果生成的亞鐵氰化物離子到達(dá)第3電極8的近旁需要一定的時間。也就是說，在亞鐵氰化物離子到達(dá)之前的時間內(nèi)的對電極6與第3電極8之間的電流值主要只是反映抗壞血酸的濃度。
還有，對試樣液檢測25秒鐘之后，以對電極6為基準(zhǔn)在作用電極7施加500mV的電壓，測定對電極6與作用電極7之間5秒鐘之后的電流值。
液體中的鐵氰化物離子、葡萄糖及GOD發(fā)生反應(yīng)，其結(jié)果是，葡萄糖被氧化為葡萄糖酸內(nèi)酯，鐵氰化物離子被還原為亞鐵氰化物離子。這種亞鐵氰化物離子的濃度與葡萄糖濃度成比例。對試樣液檢測30秒之后對電極6與作用電極7之間的電流是由亞鐵氰化物離子和預(yù)先存在的抗壞血酸的氧化反應(yīng)引起的。也就是說，抗壞血酸給測定的結(jié)果帶來正誤差。但是，如上所述，對電極6和第3電極8之間的電流值主要只是反映抗壞血酸的濃度，因此可以根據(jù)該結(jié)果對測定結(jié)果進(jìn)行修正，以消除抗壞血酸的影響，求得正確的葡萄糖濃度。
實施例2與實施例1相同，在基板1上形成電極6、7、8及碳層9。接著，除了第3電極8外，在對電極6、作用電極7及碳層9上滴下CMC水溶液，使其干燥，形成CMC層，在該CMC層上，滴下包含作為酶的GOD和作為電子傳輸體的鐵氰化鉀的水溶液，在其后利用烘干方法形成反應(yīng)層。
為了使得向反應(yīng)層提供試樣液更加順利，接著使卵磷脂溶解在有機(jī)溶劑中的溶液、例如卵磷脂的甲苯溶液從試樣液供給口12a流向反應(yīng)層，覆蓋在上述反應(yīng)層上，再進(jìn)行烘干形成卵磷脂層。接著在基板1上以圖2中的點劃線所示的位置關(guān)系粘接蓋10與隔板11，制作葡萄糖傳感器。
將這種傳感器配置于測定器上，以對電極6為基準(zhǔn)在第3電極8上施加500mV的電位。在施加這一電位的狀態(tài)下，由試樣液供給口12a提供3微升包含作為有害物質(zhì)的抗壞血酸的葡萄糖水溶液作為試樣液。試樣液通過試樣液供給路線到達(dá)空氣孔13，電極系統(tǒng)上的反應(yīng)層發(fā)生溶解。
與提供試樣液同時，根據(jù)電極系統(tǒng)的對電極6與第3電極8之間的電學(xué)上的變化，起動檢測液體供給的系統(tǒng)，測定定時器因此開始起動。這時，在對電極6與第3電極8之間持續(xù)施加電位，在檢測出提供了試樣液并經(jīng)過一定的時間之后，測定對電極6與第3電極8之間的電流值。該電流值是由所包含的有害物質(zhì)抗壞血酸的氧化反應(yīng)引起的，與其濃度存在著比例關(guān)系。在測定了對電極6與第3電極8之間的電流值之后，解除施加于兩個電極之間的電壓。
如上所述，在第3電極8上沒有配置反應(yīng)層。因此，作為酶反應(yīng)的結(jié)果生成的亞鐵氰化物離子到達(dá)第3電極8的近旁需要一定的時間。也就是說，在亞鐵氰化物離子到達(dá)之前的時間內(nèi)的對電極6與第3電極8之間的電流值主要只是反映抗壞血酸的濃度。
還有，對試樣液檢測25秒鐘之后，以對電極6為基準(zhǔn)在作用電極7施加500mV的電壓，測定對電極6與作用電極7之間5秒鐘之后的電流值。
液體中的鐵氰化物離子、葡萄糖及GOD發(fā)生反應(yīng)，其結(jié)果是，葡萄糖被氧化為葡萄糖酸內(nèi)酯，鐵氰化物離子被還原為亞鐵氰化物離子。這種亞鐵氰化物離子的濃度與葡萄糖濃度成比例。對試樣液檢測30秒鐘之后對電極6與作用電極7之間的電流是由亞鐵氰化物離子和預(yù)先存在的抗壞血酸的氧化反應(yīng)引起的。也就是說，抗壞血酸給測定的結(jié)果帶來正誤差。但是，如上所述，對電極6和第3電極8之間的電流值主要只是反映抗壞血酸的濃度，因此，可以根據(jù)該結(jié)果對測定結(jié)果進(jìn)行修正，以排除抗壞血酸的影響，求得正確的葡萄糖濃度。
在本實施例中，為了檢測在對電極6與第3電極8之間試樣液的供給情況，作用電極7的露出部分全部用試樣液可靠地淹沒。借助于此，可以更加可靠地判定試樣液的供給情況。
實施例3與實施例2一樣制作葡萄糖傳感器。
在測定器上配置傳感器，以對電極6為基準(zhǔn)，在第3電極8施加500mV的電位。在施加這一電位的狀態(tài)下，由試樣液供給口12a提供3微升包含作為有害物質(zhì)的抗壞血酸的葡萄糖水溶液作為試樣液。試樣液通過試樣液供給路線到達(dá)空氣孔13，電極系統(tǒng)上的反應(yīng)層發(fā)生溶解。
與提供試樣液同時，根據(jù)電極系統(tǒng)的對電極6與第3電極8之間的電學(xué)上的變化檢測液體供給情況的系統(tǒng)動作，測定定時器因此開始起動。這時，在對電極6與第3電極8之間持續(xù)施加電位，在檢測出提供了試樣液并經(jīng)過一定的時間之后，測定對電極6與第3電極8之間的電流值。該電流值是由所包含的有害物質(zhì)抗壞血酸的氧化反應(yīng)引起的，與其濃度存在著比例關(guān)系。在測定了對電極6與第3電極8之間的電流值之后，解除施加于兩個電極之間的電壓。
如上所述，在第3電極8上沒有配置反應(yīng)層。因此，作為酶反應(yīng)的結(jié)果生成的亞鐵氰化物離子到達(dá)第3電極8的近旁需要一定的時間。也就是說，在亞鐵氰化物離子到達(dá)之前的時間內(nèi)的對電極6與第3電極8之間的電流值主要只是反映抗壞血酸的濃度。
實施例4與實施例2相同，除了第3電極8外，在對電極6、作用電極7及碳層9上形成反應(yīng)層。
接著，在用于形成試樣液供給路線的蓋構(gòu)件上形成的槽部，為了使得向反應(yīng)層提供試樣液更加順利，使卵磷脂溶解在有機(jī)溶劑中的溶液、例如卵磷脂的甲苯溶液流動、擴(kuò)展開來，再進(jìn)行烘干形成卵磷脂層。接著在基板1上以圖2中的點劃線所示的位置關(guān)系粘接蓋10與隔板11，制作葡萄糖傳感器。
在從反應(yīng)層到第3電極8配置卵磷脂層的情況下，第3電極8的表面上由于卵磷脂層而帶來變化，有時其響應(yīng)特性的偏差變大。如上所述在蓋構(gòu)件一側(cè)配置卵磷脂層，則上述偏差受到抑制，可以發(fā)現(xiàn)響應(yīng)特性有提高。
實施例5除了從反應(yīng)層除去CMC層以外，以與實施例2完全相同的方法制作葡萄糖傳感器。
然后，與實施例2一樣進(jìn)行測定。結(jié)果表明，與配置CMC的情況相比，響應(yīng)特性的偏差有所增加，但是觀察到與抗壞血酸及葡萄糖的濃度的關(guān)系。
實施例6與實施例4一樣制作葡萄糖傳感器。
將傳感器配置于測定器，以對電極6為基準(zhǔn)，在第3電極8施加-1300mV的電位。在施加這一電位的狀態(tài)下，由試樣液供給口12a提供3微升空氣處于飽和狀態(tài)的葡萄糖水溶液作為試樣液。試樣液通過試樣液供給路線到達(dá)空氣孔13，電極系統(tǒng)上的反應(yīng)層發(fā)生溶解。
與提供試樣液同時，根據(jù)電極系統(tǒng)的對電極6與第3電極8之間的電學(xué)上的變化檢測液體供給情況的系統(tǒng)動作，測定定時器因此開始起動。這時，在對電極6與第3電極8之間持續(xù)施加電位，在檢測出提供了試樣液并經(jīng)過一定的時間之后，測定對電極6與第3電極8之間的電流值。該電流值是由溶解的氧的還原反應(yīng)引起的，在提供用氬脫氣的葡萄糖溶液的情況下，這種還原電流大大減少。在測定了對電極6與第3電極8之間的電流值之后，解除施加于兩個電極之間的電壓。
如上所述，在第3電極8上沒有配置反應(yīng)層。因此，包含于反應(yīng)層的鐵氰化物離子到達(dá)第3電極8的近旁需要一定的時間。也就是說，在鐵氰化物離子到達(dá)第3電極8之前的時間內(nèi)，對電極6與第3電極8之間的電流值主要只是反映溶解的氧的濃度。
還有，對試樣液檢測25秒鐘之后，以第3電極8為基準(zhǔn)在作用電極7施加500mV的電壓，測定對電極6與作用電極7之間5秒鐘之后的電流值。
液體中的鐵氰化物離子、葡萄糖及GOD發(fā)生反應(yīng)，其結(jié)果是，葡萄糖被氧化為葡萄糖酸內(nèi)酯，隨著這一反應(yīng)，鐵氰化物離子被還原為亞鐵氰化物離子。
另一方面，作為這種反應(yīng)的競爭反應(yīng)，試樣液中的溶解氧作為電子傳輸體起作用，隨著葡萄糖被氧化為葡萄糖酸內(nèi)酯，同時進(jìn)行著溶解氧被還原為過氧化氫的反應(yīng)。該反應(yīng)生成的過氧化氫再把亞鐵氰化物離子氧化為鐵氰化物離子。因此，在根據(jù)亞鐵氰化物離子的氧化電流值測定葡萄糖濃度時溶解氧給測定的結(jié)果帶來負(fù)誤差。
但是，如上所述，對電極6和第3電極8之間的電流值主要只是反映溶解氧的濃度。因此，可以根據(jù)該結(jié)果對測定結(jié)果進(jìn)行修正，去除溶解氧的影響，以求得正確的葡萄糖濃度。
實施例7與實施例4一樣制作葡萄糖傳感器。
在測定器上配置傳感器，以對電極6為基準(zhǔn)，在第3電極8施加500mV的電位。在施加這一電位的狀態(tài)下，由試樣液供給口12a提供3微升包含作為有害物質(zhì)的抗壞血酸的葡萄糖水溶液作為試樣液。試樣液通過試樣液供給路線到達(dá)空氣孔13，電極系統(tǒng)上的反應(yīng)層發(fā)生溶解。
與提供試樣液同時，根據(jù)電極系統(tǒng)的對電極6與第3電極8之間的電學(xué)上的變化檢測液體供給情況的系統(tǒng)動作，測定定時器因此開始起動。這時，在對電極6與第3電極8之間持續(xù)施加電位，再在檢測出提供了試樣液并經(jīng)過2秒鐘之后，將第3電極8上施加的電位調(diào)整到-1300mV。測定電位調(diào)整到-1300mV前的瞬間，以及電位調(diào)整到-1300mV 3秒鐘后，兩個時刻的對電極6與第3電極8之間的電流值。電位調(diào)整到-1300mV前的瞬間的電流值主要取決于抗壞血酸的濃度。而電位調(diào)整到-1300mV 3秒鐘后的電流值主要取決于試樣液中溶解氧的濃度。
在提供試樣液2秒鐘之后及5秒鐘后測定對電極6與第3電極8之間的電流值之后，解除施加于兩個電極之間的電壓。
還在對試樣液檢測25秒鐘之后，以第3電極8為基準(zhǔn)在作用電極7施加500mV的電壓，測定對電極6與作用電極7之間5秒鐘之后的電流值。
如上所述，對電極6和第3電極8之間的電流值主要反映抗壞血酸及溶解氧的濃度，因此，可以根據(jù)該電流值求出兩種物質(zhì)的濃度。所以能夠根據(jù)該結(jié)果對測定結(jié)果進(jìn)行修正，去除抗壞血酸及溶解氧的影響，求得正確的葡萄糖濃度。
在上述實施例中，檢測了試樣液的供給情況，將用于檢測抗壞血酸或溶解氧的第3電極8上施加的電位定為500mV或-1300mV，但是并不限于這些數(shù)值。為了得到響應(yīng)電流而施加于作用電極7的電位取5O0mV，但是也不限于此，只要是能夠?qū)⒁贿B串的反應(yīng)結(jié)果生成的電子傳輸體的還原體氧化的電位即可。測定電流值的時間也不限于上述實施例。
在上述實施例中，親水性高分子使用羧甲基纖維素，但是形成親水性高分子層的親水性高分子可以使用各種各樣的高分子材料。例如，可以舉出有羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、羧甲基乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚賴氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸、明膠及其衍生物、聚丙烯酸及其鹽、聚甲基丙烯酸及其鹽、淀粉及其衍生物、無水馬來酸或其鹽的聚合物。其中最理想的是羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素。
反應(yīng)層中包含的氧化還原酶根據(jù)試樣液中包含的基質(zhì)選擇。作為氧化還原酶，可以舉出例如果糖脫氫酶、葡糖氧化酶、醇氧化酶、乳酸氧化酶、膽甾醇氧化酶、黃嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶等。
作為電子傳輸體，可以舉出有鐵氰化鉀、p-苯醌、吩嗪硫酸甲酯、亞甲藍(lán)、二茂鐵衍生物等。電子傳輸體使用其中的一種或2兩種以上?？梢允股鲜雒讣半娮觽鬏旙w溶解于試樣液中，也可以利用將反應(yīng)層固定于基板等上面的方法使其不溶解于試樣液中。在將酶及電子傳輸體加以固定的情況下，反應(yīng)層最好包含上述親水性高分子。
在上述實施例中，圖示出特定的電極系統(tǒng)的例子，但是電極的形狀、電極及導(dǎo)線的配置等并不限于此。
又，在上述實施例中，關(guān)于第3電極的電極材料敘述了碳，但是并不限于此，也可以使用其他導(dǎo)電性材料和銀/氯化銀電極等工業(yè)應(yīng)用性如上所述采用本發(fā)明，能夠進(jìn)行具有高可靠性的基質(zhì)定量分析。
權(quán)利要求
1.一種基質(zhì)的定量方法，是使用電絕緣基板、具有形成于所述基板上的作用電極和對電極以及用作有害物質(zhì)檢測電極的第3電極的電極系統(tǒng)、設(shè)置于第3電極以外的電極系統(tǒng)上的，至少包含氧化還原酶與電子傳輸體的反應(yīng)層構(gòu)成的生物傳感器，利用使包含于試樣液中的基質(zhì)與氧化還原酶反應(yīng)時生成的電子，以還原電子傳輸體，利用對該電子傳輸體的還原量進(jìn)行電化學(xué)測定的方法，對試樣液中基質(zhì)的濃度進(jìn)行定量分析，其特征在于，包含(a)在對電極與第3電極之間施加電壓的工序，(b)將試樣液提供給反應(yīng)層的工序，(c)借助于將試樣液提供給反應(yīng)層而產(chǎn)生的、對電極與第3電極之間的電化學(xué)變化的檢測工序，(d)在進(jìn)行所述檢測工序(c)之后，測定對電極與第3電極之間產(chǎn)生的電流的工序，(e)在上述測定工序(d)之后，解除施加于對電極與第3電極之間的電壓的工序。(f)在作用電極與對電極之間施加電壓的工序，以及(g)其后，測定對電極與作用電極之間產(chǎn)生的電流的工序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基質(zhì)的定量方法，其特征在于，在所述工序(f)中，作用電極與第3電極之間也施加電壓。
3.一種基質(zhì)的定量方法，使用電絕緣基板、具有形成于所述基板上的作用電極和對電極以及用作有害物質(zhì)檢測電極的第3電極的電極系統(tǒng)、設(shè)置于第3電極以外的電極系統(tǒng)上的，至少包含氧化還原酶與電子傳輸體的反應(yīng)層、以及在所述基板上形成將試樣液從試樣液供給口引向所述反應(yīng)層的試樣液供給路線的蓋構(gòu)件構(gòu)成，第3電極配置于比反應(yīng)層更靠近試樣液供給路線的上游側(cè)的生物傳感器，利用使包含于試樣液中的基質(zhì)與氧化還原酶反應(yīng)時生成的電子還原電子傳輸體，利用對該電子傳輸體的還原量進(jìn)行電化學(xué)測定的方法，對試樣液中基質(zhì)的濃度進(jìn)行定量分析，其特征在于，包含(a)在對電極與第3電極之間施加電壓的工序，(b)將試樣液提供給反應(yīng)層的工序，(c)借助于將試樣液提供給反應(yīng)層而產(chǎn)生的、對電極與第3電極之間的電化學(xué)變化的檢測工序，(d)在進(jìn)行所述檢測工序(c)之后，測定對電極與第3電極之間產(chǎn)生的電流的工序，(e)在上述測定工序(d)之后，解除施加于對電極與第3電極之間的電壓的工序。(f)在作用電極與對電極之間施加電壓的工序，以及(g)其后，測定對電極與作用電極之間產(chǎn)生的電流的工序。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基質(zhì)的定量方法，其特征在于，在所述工序(f)中，作用電極與第3電極之間也施加電壓。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基質(zhì)的定量方法，其特征在于，使用在所述蓋構(gòu)件的、在試樣液供給路線露出的面上，配置以卵磷脂為主成份的層的生物傳感器。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基質(zhì)的定量方法，其特征在于，使用所述反應(yīng)層還包含親水性高分子的生物傳感器。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基質(zhì)的定量方法，其特征在于，使用所述反應(yīng)層還包含親水性高分子的生物傳感器。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基質(zhì)的定量方法。裝置方法使用包含形成于電絕緣基板上的作用電極及對電極的電極系統(tǒng)以及設(shè)置于電極系統(tǒng)上的至少包含氧化還原酶與電子傳輸體的反應(yīng)層,利用對反應(yīng)層中的酶反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生的電子傳輸體的還原量進(jìn)行電化學(xué)測定的方法,對試樣液中基質(zhì)的濃度進(jìn)行定量分析,這種方法與反應(yīng)層保持一定距離設(shè)定的第3電極,作為有害物質(zhì)檢測電極,根據(jù)對電極與第3電極之間的電學(xué)上的變化檢測試樣液的供給情況。然后測定對電極與第3電極之間產(chǎn)生的電流,以此為正誤差。其后,解除施加于對電極與第3電極之間的電壓,在作用電極與對電極之間施加使電子傳輸體的還原體氧化的電壓,測定兩個電極之間產(chǎn)生的電流。易氧化物等有害物質(zhì)的影響得以減小,能夠得到可靠性高的基質(zhì)的定量值。
文檔編號C12Q1/00GK1262739SQ99800436
公開日2000年8月9日 申請日期1999年3月31日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月2日
發(fā)明者池田信, 吉岡俊彥, 南海史朗 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社