專利名稱：：具有間斷的atf2基因的酵母菌株及其用途的制作方法在哺乳動物中，在所有類型的類固醇激素的生物合成中，由3β-羥基-Δ5前體生成3-氧-Δ4類固醇的過程是由被命名為3β-HSD的酶系統(tǒng)3β-羥基-Δ5類固醇脫氫酶(EC1.1.1.145)和Δ5-Δ4類固醇異構酶(EC5.3.3.1)催化的。例如，3β-HSD可以催化孕烯醇酮轉化成孕酮，催化17α-羥基孕烯醇酮轉化成17α-羥基孕酮，催化脫氫表雄酮轉化成Δ4-雄烯二酮或催化5-雄烯-3β-17β-二醇轉化成睪酮(Simard等，1996)。因此，3β-HSD是由哺乳動物腎上腺皮質中的膽甾醇開始，生物合成皮質醇的途徑中的一種關鍵酶(圖1)。重組微生物，特別是修飾過的酵母的使用，可以對上述生物合成途徑的一種或幾種哺乳動物的酶進行異源表達，以便產生皮質醇或所述生物合成的中間產物，例如，以上內容披露在歐洲專利申請EP340878，US5,137,822中，Dumas等，1994，和Cauet等，1994。當功能性3β-HSD是在酵母中表達時，轉化過的酵母細胞不能將3β-羥基類固醇完全轉化成相應的3-氧類固醇，例如，由孕烯醇酮轉化成孕酮，而是積累一種化合物，這種化合物也存在于未轉化過的酵母細胞中。在本申請中披露了以所述起始類固醇的3β-乙酸酯的形式積累的化合物的鑒定，和具有決定該酯化作用的乙酰轉移酶活性的酶的鑒定(以下將“乙酰-輔酶A孕烯醇酮乙酰轉移酶”稱為APAT)。另外，在歐洲專利申請EP727489中披露了產孕烯醇酮的轉化酵母細胞能積累乙酸孕烯醇酮。根據以上觀察可以認為，由酵母所產生的3β-羥基類固醇是不希望的，因為它所決定的二級反應和副產物可導致積累的3β-羥基類固醇，例如孕烯醇酮的產量的降低，或降低由3β-羥基-Δ5-類固醇轉化成3-氧-Δ4-類固醇的生物轉化的產率，特別是在孕酮或17α-羥基-孕烯醇酮的生產過程中，導致在隨后的通過上述生物合成途徑生產皮質醇的減弱。根據上面所提到的所獲得的結果，本發(fā)明披露了酵母菌株的構建，該菌株通過改變編碼有關活性的基因而喪失了不希望的APAT活性，導致了在有該基因存在的條件下3β-羥基類固醇的穩(wěn)定化。因此，所述菌株可被用作構建重組菌株的出發(fā)菌株，所述重組菌株能夠以較高的產率將3β-羥基類固醇轉化成其它產物。本發(fā)明還披露了酵母菌株的構建，該菌株通過改變編碼APAT活性的基因而喪失了APAT活性，并能表達由膽甾醇生物合成皮質醇的途徑的3β-HSD或細胞色素P45017α，或同時表達3β-HSD和細胞色素P45017α。表達諸如3β-HSD的菌株可以提高3β-羥基-Δ5-類固醇轉化成3-氧-Δ4-類固醇的生物轉化的產率，因此，可被用于提高在酵母中生產皮質醇或其中間產物產率的方法。因此，本發(fā)明的一個主題是一種修飾的酵母菌株，其中，通過改變編碼乙酰-輔酶A孕烯醇酮乙酰轉移酶(APAT)活性的基因，消除了APAT活性，并導致了3β-羥基類固醇的穩(wěn)定化。改變編碼APAT活性的基因，可以通過諸如在所述基因的功能因子，如啟動子或編碼具有APAT活性的蛋白的序列中插入、缺失或取代一個DNA序列而實現，然后可以通過同源重組的方法，將以上述方式改變的DNA序列整合到酵母宿主菌株中，并導致相當于本發(fā)明的修飾菌株的酵母染色體突變型的產生，其中，按照在以下的實驗部分所披露的操作條件，通過在有孕烯醇酮的條件下進行細胞培養(yǎng)和通過測定孕烯醇酮含量隨時間的變化，證實了APAT活性的消失，以及3β-羥基類固醇的穩(wěn)定化。以下菌株可以作為用于本發(fā)明的宿主酵母菌株諸如釀酒酵母(S.cerevisiae)的酵母屬菌株，諸如麥芽糖念珠菌(C.maltosa)的念珠菌屬菌株，諸如乳克魯維菌(K.lactis)的克魯維屬菌株，或諸如巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)的畢赤酵母屬菌株。本發(fā)明的一種具體主題是按上述方法修飾過的酵母菌株，其中，改變過的基因是釀酒酵母的ATF2基因，或該基因的同系物。我們所說的ATF2基因是指在酵母基因組的基因座ATF2或YGR177c上鑒定的釀酒酵母的基因，“酵母屬基因組數據庫”(SGD)；(Cherry等，http//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)，其中，被命名為YGR177c的開放讀框(ORF)被翻譯成Mips數據庫中的氨基酸序列，該序列以保藏號S64491保藏(HeblingU.，HofmannB.和DeliusH.(1996年5月))，該序列顯示在圖4中。該基因編碼一種具有APAT活性的蛋白，正如在下面的實驗部分所證實的。至于作為ATF2基因同系物的基因，我們是指編碼一種具有APAT活性并與蛋白YGR177c的序列有大約60％或更高序列相同性的基因。本發(fā)明的一種更具體的主題是一種如上文所述的修飾過的酵母菌株，其中，所述改變了的基因是釀酒酵母的ATF2基因，以下被命名為atf2突變型菌株。本發(fā)明的一個十分具體的主題是一種如上文所述的修飾過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過將一個具有至少一個核苷酸的DNA序列插入而改變過的。例如，被插入ATF2基因的以便喪失所有APAT活性的DNA序列，可以是提供所述宿主菌株的營養(yǎng)需要的營養(yǎng)缺陷型選擇基因，如基因URA3，基因LEU2，基因TRP1，基因HIS3或基因ADE2，例如，一個顯性選擇基因，如抗諸如G418、腐草霉素或潮霉素B的抗生素的基因，或諸如βGAL基因的報導基因。插入ATF2基因中的DNA序列還可以是酵母表達嵌合體(block)，該嵌合體由一個啟動子和一個轉錄終止子組成，例如，一個諸如PGK、TDH3、CYC1或TEF1的酵母啟動子，例如，諸如CYC1、TDH3、TEF1或PGK的酵母終止子。所述表達嵌合體可以是上文提到的元件的組合，例如，嵌合的TEF1啟動子/PGK終止子。本發(fā)明的一個更具體的主題是一種如上文所述的修飾過的酵母菌株，其中，通過插入URA3選擇基因或表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子改變了ATF2基因。本發(fā)明的一個具體主題是一種如上文所述的修飾過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入URA3選擇基因改變過的。本發(fā)明的atf2突變菌株缺少APAT活性，而且業(yè)已將URA3基因插入其中，以下稱之為atf2-ΔURA3，因此可以利用尿嘧啶通過原養(yǎng)型進行選擇。本發(fā)明的一個具體的主題是被命名為TGY156和TGY158的修飾過的釀酒酵母菌株，以上菌株的詳細結構在以下的實驗部分給出。本發(fā)明的一個具體主題是一種如上文所述的修飾過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子而改變過的。本發(fā)明的atf2突變菌株缺少APAT活性，而且業(yè)已將表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子插入其中，以下稱之為atf2-ΔTEF1啟動子/PGK終止子，可以通過其對5-氟-乳清酸(5-FO)的抗性，篩選由于被一個表達嵌合體取代而造成的功能性URA3基因的缺乏。本發(fā)明的一個具體主題是，被命名為TGY186的釀酒酵母的修飾過的菌株，該菌株的詳細結構在以下的實驗部分中給出。本發(fā)明的一個主題是一種轉化過的酵母菌株，其中，通過改變編碼乙酰-輔酶A孕烯醇酮乙酰轉移酶(APAT)活性的基因，消除了該活性，并表達由膽甾醇開始的皮質醇生物合成途徑的至少一種哺乳動物酶，所述酶選自-膽甾醇側鏈裂解酶(P450SCC)，-3β-羥基-Δ5-類固醇脫氫酶/Δ5-Δ4-類固醇異構酶(3β-HSD)和-17α-類固醇羥化酶(P45017α)。例如，本發(fā)明的轉化過的酵母菌株可以通過已知方法轉化本發(fā)明的atf2突變菌株而得到，例如，通過用表達載體P450SCC以及ADX和ADR進行轉化，通過表達載體3β-HSD或通過表達載體P45017α進行轉化。如果必要，atf2也可以是共轉化的，例如，通過表達載體3β-HSD和通過表達載體P45017α共轉化或通過共表達載體3β-HSD和P45017α進行轉化，并用于諸如將孕烯醇酮轉化成17α-羥基孕酮的生物轉化過程中。例如，為了在酵母菌株中表達源于牛或人的P450SCC以及ADX和ADR，3β-HSD或P45017α而構建的載體披露于以下專利文獻中Dumas等，1994，歐洲專利申請EP340878或US5,137,822。本發(fā)明的一個具體主題是一種如上文所述的轉化過的酵母菌株，其中，所述改變過的基因是釀酒酵母的ATF2基因或該基因的同系物。本發(fā)明的一個更具體的主題是一種如上文所述的轉化過的酵母菌株，所述改變過的基因是釀酒酵母的ATF2基因，并相當于轉化過的atf2菌株。本發(fā)明的一個具體的主題是上文所述的轉化過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入一個具有至少一個核苷酸的DNA序列而改變過的，特別是一種轉化過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入URA3選擇基因而改變的，并相當于修飾過的atf2-ΔURA3菌株。改變所述基因以便喪失所有APAT活性，所述ATF2基因或該基因的同系物以及宿主菌株具有上文所述的含義。本發(fā)明的一個具體主題是一種如上文所述的表達3β-HSD的轉化過的酵母菌株atf2-ΔURA3，特別是被命名為TGY158/pTG10862的轉化過的釀酒酵母菌株，其具體構建在以下的實驗部分披露。本發(fā)明的一個具體的主題是一種如上文所述的轉化過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子而改變的，并相當于轉化過的菌株atf2-ΔTEF1啟動子/PGK終止子。本發(fā)明的一個具體主題是一種如上文所述的表達P45017α的轉化過的菌株atf2-ΔTEF1啟動子/PGK終止子，特別是被命名為TGY186/pTG10435的轉化過的釀酒酵母菌株。本發(fā)明的一個具體主題是一種如上文所述共表達3β-HSD和P45017α的修飾過的酵母菌株atf2-ΔTEF1啟動子/PGK終止子，特別是被命名為TGY186/pTG10417的轉化過的釀酒酵母菌株。本發(fā)明的一個主題是一種在活體內氧化選自內源固醇、外源固醇或外源類固醇的底物的方法，其中，使用了上文所述的轉化過的酵母菌株，當該菌株產生所述內源固醇時，單獨培養(yǎng)該菌株，或者與固醇或外源類固醇一起培養(yǎng)，如果需要的話，提取所獲得的氧化的化合物。我們所說的內源固醇是指積累于酵母菌株中的固醇，而且當所述酵母在通過諸如表達載體P450SCC、ADX和ADR轉化之后在缺乏內源固醇的條件下進行培養(yǎng)時，是側鏈裂解酶(P450SCC)的底物。例如，用于實施本發(fā)明方法的內源固醇可以是麥角-5-烯-3-醇，麥角-5，24(28)-二烯-3-醇或麥角-5，22-二烯-3-醇。歐洲專利申請EP727489披露了以上固醇在酵母菌株中的積累，以及在利用表達載體P450SCC、ADX和ADR轉化之后在所述菌株的培養(yǎng)物中對其側鏈的裂解。這樣的酵母菌株其中也存在著APAT活性，可以事先進行修飾，以便獲得本發(fā)明的atf2突變菌株，然后通過表達載體P450SCC、ADX和ADR進行轉化，以獲得按本發(fā)明方法轉化過的atf2突變菌株。我們所說的外源固醇是指P450SCC裂解酶的底物，例如，膽固醇或谷固醇，所述裂解是通過培養(yǎng)用表達載體P450SCC、ADX和ADR轉化過的酵母菌株進行的。例如，所述菌株可以是用表達載體P450SCC、ADX和ADR轉化過的atf2突變菌株。通過裂解被用作底物的內源或外源固醇的側鏈所獲得的3β-羥基類固醇，完全是游離形式的，即在能表達P450SCC、ADX和ADR的轉化過的atf2菌株的培養(yǎng)物中沒有伴隨的相應3β-乙酸酯。我們所說的類固醇是指在培養(yǎng)一種用表達載體3β-HSD轉化過的酵母菌株時作為3β-HSD酶的底物的類固醇，如孕烯醇酮、17α-羥基孕烯醇酮或脫氫表雄酮，或在培養(yǎng)用諸如表達載體P45017α轉化過的酵母菌株時作為P45017α酶的底物的類固醇，如孕酮或孕烯醇酮。例如，所述菌株可以是按照本發(fā)明方法用表達載體3β-HSD或表達載體P45017α轉化過的atf2突變菌株。本發(fā)明的一個具體主題是如上文所述的體內氧化方法，其中，所述底物是3β-羥基類固醇，其中，使用能表達3β-HSD的轉化過的酵母菌株atf2-ΔURA3，如果必要的話，提取所獲得的3-氧-Δ4-類固醇，特別是這樣一種方法，其中所述3β-羥基類固醇選自孕烯醇酮或17α-羥基孕烯醇酮。被用作底物的3β-羥基類固醇在與本發(fā)明的用表達載體3β-HSD轉化過的atf2-ΔURA3菌株一起培養(yǎng)時是穩(wěn)定的。因此，本發(fā)明提供了一種在酵母中生產3-氧-Δ4-類固醇的改進方法，因為所有的3β-羥基底物都能被氧化成3-氧-Δ4-類固醇，正如在以下的實驗部分所證實的。本發(fā)明的一個具體主題是，如上文所述的體內氧化方法，其中，所述底物是一種類固醇，其中，使用了能表達P45017α的轉化酵母菌株atf2-ΔTEF1啟動子/PGK終止子，而且如果必要的話，提取所獲得的17α-羥基類固醇，特別是這樣一種方法，其中，所述類固醇底物是孕烯醇酮或孕酮。被用作底物的孕烯醇酮在與用表達載體P45017α轉化過的菌株atf2-ΔTEF1啟動子/PGK終止子一起培養(yǎng)時是穩(wěn)定的。因此，本發(fā)明還提供了一種由3β-羥基類固醇生產17α-羥基類固醇的改進方法，因為所有的3β-羥基底物均可以被17α-羥基化。本發(fā)明的一個具體主題是上述體內氧化方法，其中，所述底物是3β-羥基類固醇，其中，使用能共表達3β-HSD和P45017α的轉化過的酵母菌株atf2-ΔTEF1啟動子/PGK終止子，如果必要的話，提取所獲得的17α-羥基3-氧-Δ4-類固醇。本發(fā)明的一個具體主題是上述方法，其中，所述類固醇底物是孕烯醇酮。本發(fā)明的轉化過的atf2突變酵母菌株以及所述方法表明，它們在利用酵母進行皮質醇或其中間產物的生產中具有優(yōu)勢。構建本發(fā)明菌株和利用本發(fā)明方法的例子披露于以下的實驗部分。一般材料和方法1.菌株和培養(yǎng)基用于實施本發(fā)明的釀酒酵母菌株是由Achstetter等(1992)披露的c13ABYS86的同基因衍生物Leu+菌株TGY73.4(MATα，URA3-Δ5，pral-1，prb1-1，prc1-1，cps1-3，his)，和由Thierry等(1990)披露的菌株Fy1679(MATα，URA3-52，trp1-Δ63，leu2-Δ1，his3-Δ200，fen1，GAL)。在28℃下按照由F.Sherman(1991)披露的條件，讓所述菌株生長在含有2％葡萄糖的完全培養(yǎng)基(DifcoLaboratories)申。為了轉化釀酒酵母，通過乙酸鋰方法(Ito等，1983)使所述細胞變成感受態(tài)。按常規(guī)方法在含有2％葡萄糖的合成基本培養(yǎng)基SD(S.Sherman，1991)上培養(yǎng)所述酵母，所述培養(yǎng)基中添加了濃度為100μg/ml的所需養(yǎng)分。將大腸桿菌菌株BJ5183(D.Hanahan，1983)用于體內重組，并將大腸桿菌C600，hsdR(Hubacek等，1970)用作經典連接反應的受體菌株。2.DNA操作和在大腸桿菌中進行體內重組所使用的一般分子生物學方法由Sambrook等披露(1989)。用于在體內進行重組的方法由E.Degryse(1995)和E.Degryse(1996)披露。3.測定APAT酶活性通過測定由[3H]乙酰輔酶A(NewEnglandNuclear)摻入孕烯醇酮中的[3H]乙酸確定APAT乙酰轉移酶活性。反應培養(yǎng)基(500μl)含有[3H]乙酰輔酶A(20μM，25Ci/mol)和孕烯醇酮(Sigma)(30μM)。將孕烯醇酮加入用pH7.0磷酸鉀緩沖液(20mM)配制的2μl泰洛沙泊(Sigma)/乙醇混合物(1∶1)溶液中。在30℃下溫育15分鐘，然后通過添加2ml二氯甲烷終止反應。用二氯甲烷萃取所述類固醇，然后通過反相高效液相層析(以下稱之為RP-HPLC)進行分離，以上分離是在45℃下，在HP1090色譜儀(Hewlett-Packard)上，在UltrasphereODS柱(Beckman)中，在等度洗脫條件下用乙腈進行的，所述色譜儀與FLO-One500放射性檢測儀(Packard)連接，該檢測儀可以測定所形成的孕烯醇酮[3H]乙酸的量。一個APAT單位被定義為在上述條件下，在30℃下每分鐘產生1nmol乙酸孕烯醇酮的酶量。4.測定蛋白濃度用牛血清白蛋白作為標準物，利用“蛋白測定試劑盒”(Bio-Rad)測定蛋白濃度。本發(fā)明的某些方面是通過本文所附的的。圖1表示在哺乳動物體內由膽甾醇生物合成皮質醇的途徑。圖2A和2B表示在釀酒酵母中進行的由孕烯醇酮到孕烯醇酮乙酸酯的生物轉化。在205nm波長下進行RP-HPLC分析圖2A表示孕烯醇酮乙酸酯生成的動力學，和以12小時溫育為間隔的孕烯醇酮的消失。圖2B表示當t＝0和t＝10小時時，類固醇的曲線與孕烯醇酮和孕烯醇酮乙酸酯標準物的曲線的比較。圖3表示通過在MonoPHR5/20上層析進行的APAT純化。(A)表示存在于組分10-20中的APAT活性的曲線。(B)表示合并濃縮的組分14、15和16的SDS-PAGE分析，在有分子量標記(第1道)存在的條件下，用考馬斯蘭染色(第2道)進行。箭頭表示表觀分子量為62kDa的帶。圖4表示YGR177c的單字母代碼的氨基酸序列。在基于純化的APAT蛋白的并用胰蛋白酶消化過的肽序列下面畫線。圖5表示破壞ATF2基因的方案，該方案是通過雙融合PCR技術通過與URA3基因結合而實現的?？招木€條和實心線條分別表示ATF2序列和URA3序列。圖6表示在釀酒酵母中破壞ATF2基因對孕烯醇酮乙?；挠绊?。孕烯醇酮乙酸酯的存在是通過在205nm波長下進行RP-HPLC檢測的，檢測是基于親代菌株TGY73.4(A)或突變菌株TGY158(B)的16小時培養(yǎng)物進行的。圖7A、7B和7C表示在酵母中構建人3β-HSD表達質粒pTG10832和pTG10862的方案。圖7A說明了含有編碼人3β-HSD序列的MscI-MluI片段的制備。圖7B說明了含有CYClp/3β-HSD/PGKt表達嵌合體的NotI片段的制備。圖7C說明了pTG10832質粒和pTG10862質粒的制備。圖8表示質粒pTG10832的限制圖。圖9表示質粒pTG10862的限制圖。圖10表示構建表達質粒pTG10435的示意圖。圖11表示構建表達質粒pTG10058的示意圖。圖12表示質粒pTG10058的限制圖。圖13表示質粒pTG10293的限制圖。圖14表示質粒pTG10435的限制圖。圖15A和15B表示構建質粒pTG10274的方案。圖15A表示質粒pTG10214的制備。圖15B表示質粒pTG10274的制備。圖16表示質粒pTG10274的限制圖。圖17表示質粒pTG10401的限制圖。圖18表示構建表達載體pTG10262的方案。圖19表示質粒pTG10262的限制圖。圖20表示質粒pTG10403的限制圖。圖21表示質粒pTG10417的限制圖。(限制酶的簡稱S，SalI；N，NotI；BII，BglII；M，MluI；C，ClaI；N°，喪失的NcoI位點；XbaI°，喪失的XbaI位點；E，EcoRI)。例1鑒定酵母的APAT活性A-由酵母進行的孕烯醇酮的體內乙?；?。在28℃下，在10mlYPD培養(yǎng)基(Difco)中培養(yǎng)TGY73.4菌株，所述菌株用24小時的預培養(yǎng)物以A600＝0.1的密度接種，向所述預培養(yǎng)物中添加了100μl孕烯醇酮溶液，孕烯醇酮以10mg/ml的濃度溶解在tergitol(Sigma)/乙醇混合物(1∶1)中。用250μl的培養(yǎng)液等分試樣鑒定所生成的類固醇，所述試樣是以10小時為間隔取樣的。用2ml二氯甲烷萃取，然后在氮氣下蒸發(fā)有機相，再將所獲得的殘余物重新溶解在乙腈中。在UltrasphereODS柱(Beckman)上通過RP-HPLC對類固醇進行分析，連續(xù)使用以下洗脫劑溶于水中的60％的乙腈10分鐘，然后用溶于水中的60到80％變化的乙腈5分鐘，然后用80％的乙腈5分鐘，流速為1ml/分鐘，在45℃下進行，并在205nm下檢測。所獲得的層析譜(圖2B)表明，孕烯醇酮被代謝成一種極性更弱的產物，該產物所具有的TR與孕烯醇酮乙酸酯標準物的TR相同。圖2A表明所述孕烯醇酮被酵母迅速轉化成其代謝物。在用堿(6％KOH，溶于甲醇中)處理之后，所觀察到的代謝產物釋放出一種其TR與孕烯醇酮的TR相同的產物。然后通過質譜法鑒定所述代謝產物是孕烯醇酮乙酸酯。B-純化具有APAT活性的酶。在30℃下，在裝有Kappeli培養(yǎng)基(Fiechter等，1981)的10ml發(fā)酵罐中培養(yǎng)TGY73.4菌株至A600＝30，所述培養(yǎng)基含有160g/l的葡萄糖。通過離心分離所述細胞，用水洗滌，然后重新懸浮在含有1mMPMSF的溫度為4℃pH8.0的4mlTris-HCl緩沖液20mM(緩沖液A)中。在MantonGaulin勻漿器中以1000psi的壓力破碎所述細胞。在40℃下以12,000xg的速度離心所獲得的細胞裂解物15分鐘，然后以40mM的終濃度將ZnCl2加入上清液中。用1NHCl將pH調至5.5，并在4℃下進行沉淀30分鐘。在4℃下以10,000xg的速度離心10分鐘，分離沉淀物并重新懸浮在含有100mMEDTA和1mMPSFM的3ml緩沖液A中。通過在Y10S10柱體(Amicon)上用30ml緩沖液A進行滲濾除去EDTA，然后在4℃下將保留物以35ml/分鐘的流量加樣到預先用緩沖液A平衡過的1.5升DEAE-Sephacel(Pharmacia)柱中。用緩沖液A洗滌所述柱，再用含有0.15MNaCl的緩沖液A洗滌，然后用含有0.4MNaCl的緩沖液A洗脫APAT活性。合并通過在“一般材料和方法”部分所述的方法測定其含有APAT活性的DEAE-Sephacel的組分，加入NaCl至終濃度為2M，然后在4℃下以15ml/分鐘的速度將其加樣到預先用含有2MNaCl的緩沖液A平衡過的500ml苯基-瓊脂糖凝膠柱中(Pharmacia)。在用含有0.5M的NaCl洗滌所述柱之后，APAT活性被1.5升的線性梯度的膽酸鈉洗脫，所述膽酸鈉以0-1％的濃度溶解在緩沖液A中。合并含有APAT活性的組分，然后通過在YM10膜(Amicon)上超濾進行濃縮，然后在-80℃下保存待用。將整個過程重復一次，以便制備足夠數量的材料進行純化。將以上兩次制備的純化材料解凍，然后在4℃下以4ml/分鐘的流量加樣到預先用緩沖液A平衡過的Q-瓊脂糖凝膠速流柱(Pharmacia)。用相同的緩沖液洗滌該柱之后，用500ml的線性梯度的NaCl洗脫APAT活性，所述線性梯度的NaCl以0-1M的濃度溶解在相同的緩沖液中。合并含有APAT活性的Q-瓊脂糖凝膠組分，然后在4℃下以2.5ml/分鐘的流量直接加樣到固定在瓊脂糖凝膠珠(Pharmacia)上的7ml膽酸鈉柱中，所述瓊脂糖凝膠珠預先用含有0.5MNaCl的緩沖液A平衡過，在用相同的緩沖液洗滌該柱之后，APAT被100ml的線性梯度膽酸鈉洗脫，所述線性梯度膽酸鈉以0-1％的濃度溶解在相同的緩沖液中。合并含有APAT活性的組分，通過在YM10膜(Amicon)上超濾濃縮至蛋白濃度為1.8mg/ml，然后在-80℃下保存。然后根據其比活性將APAT活性純化大約500倍，產率為大約16％，如下面的表1所示表1然后將上面所獲得的半純化材料的一半(大約6mg蛋白)解凍，并加入PEG4000(Prolabo)至終濃度為20％(w/v)，消除膽酸鈉和氯化鈉。在4℃下攪拌30分鐘，然后通過在4℃下以12,000xg的速度離心30分鐘收集沉淀，再將沉淀重新溶解在4ml緩沖液A中。然后將所獲得的溶液以1ml/分鐘的流量加樣到預先用pH6.3的緩沖液bis-Tris25mM平衡過的MonoPHR5/20柱(Pharmacia)中。用pH4.0的緩沖液Polybuffer74(Pharmacia)洗脫APAT活性。收集1ml的組分，其中均含有50μlpH8.0的緩沖液Tris-HCl2M，以便在酸性pH下限制所述酶的失活。合并按上述方法測定的含有最大APAT活性的組分14、15和16(圖3(A))，通過在YM10膜上超濾進行濃縮，然后在-80℃下保存待用。由此獲得的活性組分在10％的聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE。通過考馬斯蘭染色發(fā)現了若干條帶，其主要帶的表觀分子量為62kDa(圖3(B))，與通過Superose6凝膠(Pharmacia)過濾所測定的分子量相同，并相應于APAT活性。C-APAT特性。a)底物專一性按照上述用于乙酰-輔酶A和孕烯醇酮的方法，使用不同的乙酰供體或不同的類固醇底物，所述半純化的APAT能以相當的效率轉移位于3β-醇、Δ4或Δ5-類固醇上的乙酸酯，而在雌激素上很微弱，并且在固醇上是不可檢測的，而且優(yōu)選將乙酰-輔酶A作為乙酰供體。下面的表2顯示了所獲得的結果，其中，a)用每一種測試的類固醇30μM和100μM[3H]乙酰-輔酶A進行測試，b)用每一種乙酰供體100μM和30μM[3H]孕烯醇酮進行試驗表2</tables>b)抑制所述APAT活性受到諸如NEM和DTNB的巰基試劑的有效抑制。抑制作用是在有ZnCl2(1mM)的條件下實現的。D-部分氨基酸序列。按照由Rosenfeld等(1992)所披露的方法用胰蛋白酶消化凝膠切片，然后測定部分氨基酸序列。通過SDS-PAGE分離三分之二的上文所獲得的濃縮物，切除62kDa的帶，并與胰蛋白酶(Promega)一起培養(yǎng)。然后通過在Vydac218TP柱(1.5×125mm)上以100μl/分鐘的流量進行RP-HPLC分離所產生的肽，用80分鐘時間使用濃度為0-60％的線性梯度乙腈，然后用20分鐘時間使用60-100％的乙腈，所述乙腈溶液是用0.1％TFA水溶液配制的，然后進行氨基酸測序。在一臺與PTH-氨基酸的HPLC分析儀連接的Model477A蛋白測序儀(AppliedBiosystems)上測定N-末端序列。在進行測序的樣品中，兩個峰x和y提供了一種明確的序列，該序列分別由下面的10個和16個氨基酸組成峰xISEQFKKDDF峰yLIELISPVIIPLGNPK將由此所獲得的兩個肽序列用于篩選釀酒酵母基因組的數據庫。鑒定了一種其序列中恰好含有以上兩種肽序列的62kDa蛋白(Mips，保藏號S64491，Hebling，1996年5月)。該蛋白的序列如圖4所示，其功能尚未披露，該蛋白是由位于基因座YGR177c上的一個基因編碼的?；诰哂幸阴＾D移酶活性的本發(fā)明蛋白和由Fujii等(1994)所披露的釀酒酵母中ATF1基因產物的氨基酸序列的相同性大約為37％，而且它構成一種醇乙酰轉移酶，我們將ATF2的名稱用于編碼釀酒酵母中決定APAT活性的蛋白的基因。例2構建具有被URA3基因中斷的ATF2基因的酵母菌株，該菌株喪失了APAT活性(atf2-ΔURA3)。A)ATF2基因的定向。通過取代釀酒酵母ATF2基因的特定部分，導入釀酒酵母的URA3基因，以便隨后可以用尿嘧啶通過原養(yǎng)型篩選突變菌株。通過由Amberg等(1995)所披露的雙融合PCR將URA3選擇標記與ATF2基因結合。所采用的方法如圖5所示，共包括4個PCR反應。頭兩個反應(命名為PCR1)分別能夠擴增位于URA3標記在受到破壞的ATF2靶基因上的插入位點旁側的5’和3’區(qū)，而第三個反應(被命名為PCR2)能夠擴增URA3標記基因。雙融合(命名為PCR3)最終能結合ATF2靶基因的5’和3’區(qū)和URA3標記基因(命名為5’ATF2-URA3-3’ATF2)。首先，在含有2mMdNTP(Pharmacia)的PCR緩沖液中擴增被用作ATF2靶基因的DNA來源的Fy1679菌株的完整細胞樣品25輪；93℃，30秒；54℃，2分鐘；68℃，3分鐘，然后在72℃下延伸5分鐘；聚合酶AmpliTaq(PerkinElmer)。另一方面，通過PCR擴增ATF2基因的5’區(qū)，將具有以下序列的寡核苷酸用作直接和間接引物OTG10841AAAAGTCGACAAAATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATATCACTC(序列1)和OTG10844ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC(序列2)該序列含有一個與ATF2基因序列的5’區(qū)同源的片段(SGDYGR177c)，并為OTG10841增加一個限制位點SalI。另一方面，通過PCR擴增ATF2基因的3’區(qū)，將具有以下序列的寡核苷酸用作直接和間接引物OTG10846CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG(序列3)和OTG10842AAAAACGCGTAACTATTAAAGCGACGCAAATTCGCCGATGGTTTGG(序列4)該引物含有一個與ATF2基因序列的3’區(qū)同源的片段(SGDYGR177c)，并為OTG10842增加一個限制位點MluI。其次，通過PCR擴增釀酒酵母的URA3基因，將具有以下序列的寡核苷酸用作直接引物OTG10843GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATTGGAGATTGATAAGCTTTTCAATTCAATTCATCATTTTTTTTTTATTCTTTTTTTTG(序列5)該引物含有一個與公開的URA3基因序列的5’區(qū)(Rose等，1984；GenBankYSCODCD保藏號K02207；SGDYEL021w)同源的序列，將其與一個ATF2基因的5’區(qū)同源的序列(互補于OTG10844)結合，而作為間接引物的寡核苷酸具有以下序列OTG1085CTTGTCATTGTCACATTCGGGAATGTCGAATGGGGTAATAACTGATATAATTAAATTGAACTC(序列6)，該引物含有一個與URA3基因的3’區(qū)同源的序列，該序列與一個和ATF2基因的3’區(qū)同源的序列結合(互補于OTG10846)。通過用限制酶HindIII消化從穿梭載體大腸桿菌-酵母pTG10021(Degryse等，1995)中提取20ngURA3基因的DNA樣品，在上述條件下進行擴增。用“Geneclean試劑盒”(Bio101公司，LaJolla，美國)純化分別獲得的PCR產物，然后進行雙融合反應，將上文所述的寡核苷酸OTG10841和OTG10842用作引物，在前面的PCR反應所使用的擴增條件下進行20個輪次的擴增。純化最終的融合產物，該產物含有與功能性URA3基因融合的ATF2基因的旁側區(qū)，然后通過用EcoRV限制酶消化證實URA3基因的存在，它證實了該位點在擴增材料中的存在。B)制備酵母菌株atf2-ΔURA3。將上面所獲得的融合產物直接轉化到菌株Fy1679或菌株TGY73.4的感受態(tài)細胞中，并通過在有所述菌株需要的養(yǎng)分的條件下，和在缺少尿嘧啶的條件下在SD培養(yǎng)基(F.Sherman，1991)上篩選轉化體。從所分離的克隆出發(fā)，通過利用上述引物OTG10841和OTG10845對完整細胞進行的PCR擴增證實了ATF2基因的5’區(qū)和URA3基因之間的新的組合(5’ATF2-URA3-3’ATF2)。根據所披露的實驗用細胞勻漿物在體外證實了APAT活性的缺乏，與具有顯著APAT活性的親代菌株進行比較。將符合以上標準的菌株鑒定為atf2突變菌株，命名為atf2-ΔURA3。通過以上方法由親代菌株Fy1679出發(fā)獲得的突變菌株被命名為TGY156，而由親代菌株TGY73.4出發(fā)獲得的突變菌株被命名為TGY158。菌株TGY156的樣品于1998年2月2日保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，RueduDocteurRoux75724PARISCEDEX15法國，保藏號為I-1977。菌株TGY158的樣品于1998年2月2日保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，RueduDocteurRoux75724PARISCEDEX15法國，保藏號為I-1976。C)在酵母菌株atf2-ΔURA3培養(yǎng)物中體內穩(wěn)定孕烯醇酮。將上面所獲得的菌株TGY158的細胞以A600＝0.1的密度接種到含有100μg/ml的孕烯醇酮的YPD培養(yǎng)基(Difco)中。在28℃下培養(yǎng)16小時，然后用二氯甲烷萃取類固醇，并按照上述方法通過RP-HPLC進行分析。圖6(B)表示突變TGY158已喪失了酯化孕烯醇酮的能力，而在相同的培養(yǎng)條件下，親代菌株TGY73.4能將孕烯醇酮轉化成孕烯醇酮乙酸酯(圖6(A))。根據以上結果可以得出這樣的結論，ATF2基因的產物決定酵母對孕烯醇酮的酯化，而中斷ATF2基因不會導致在正常條件下細胞生長的明顯變化。例3構建具有被URA3基因中斷的ATF2基因的并能表達3β-HSD的酵母菌株按照圖7A-7C中的方案構建2μ質粒，該質粒具有編碼人3β-HSD的cDNA序列，該序列受釀酒酵母CYC1啟動子或釀酒酵母TEF1啟動子的控制，并具有G418抗性基因，然后轉化到突變酵母菌株atf2-ΔURA3。首先，按如下方法制備轉移載體pTG10095，該載體含有編碼由E.Rheaume等(1991)披露的II型人3β-HSD的cDNA序列，其旁側為SalI和MluI位點，該基因位于酵母啟動子GAL10/CYC1下游E.Rheaume等(1991)將編碼3β-HSD的序列以限制片段SalI-NotI的形式克隆到載體BluescriptII(Stratagene)上的相同位點。據E.Rheaume等(1991)披露，所獲得的載體含有一個位于編碼3β-HSD的序列的3’末端的NotI位點。然后用NotI限制酶消化該載體，并在有dNTP的條件下用Klenow片段處理，以便補平粘性末端，然后在有具有下列序列的寡核苷酸的條件下重新連接OTG4461CACACGCGTGTG(序列7)預先對它本身進行磷酸化和雜交，以便引入一個MluI位點。由此獲得的載體pTG10082(圖7A)含有編碼3β-HSD的序列，該序列含有一個BglII位點，其兩端為SalI和MluI位點，而失去了NotI位點。該載體仍然含有天然非編碼區(qū)5’，這一點通過BglII位點的存在而得到證實。為了使SalI位點更接近其上游的起始密碼子ATG，我們希望引入GAL10-CYC1啟動子，用MscI限制酶消化載體pTG10082，其位點位于非編碼的5’區(qū)，正好位于起始密碼子ATG的上游，并通過MluI限制酶消化。提取含有編碼3β-HSD的序列的1.8kbMsc-MluI片段(圖7A)，然后連接在預先用SalI限制酶消化過的含有GAL10/CYC1啟動子的pTG10033質粒上(E.Degrys等，1995)，然后用MluI限制酶消化。由此獲得pTG10095載體(圖7B)。其次，構建重組載體pTG10268含有酵母的2μ質粒、大腸桿菌的復制子、CYC1啟動子/PGK終止子表達框和選擇標記LEU2(圖7B)。該載體與公開的載體pTG10159(E.Degryse等，1995)相同，所不同的是，2μ片段中所包含的XbaI位點被一個標記XbaI°所取代，這是通過在有Klenow片段的條件下補平天然XbaI位點，然后重新連接而實現的。然后，通過將含有啟動子GAL10/CYC1p的表達嵌合體引入預先用限制酶SalI和MluI消化過的質粒pTG10260，通過同源重組制備pTG10268表達質粒，表達嵌合體是通過用NotI限制酶消化上面所制備的質粒pTG10095獲得的。質粒pTG10268(圖7B)含有編碼II型人3β-HSD的序列，該序列受啟動子CYC1的控制。表達質粒pTG10862含有編碼3β-HSD的序列，該序列受啟動子TEF1的控制，該質粒是按以下方法構建的(圖7C)。通過同源重組首先構建質粒pTG10832(圖8)，所述同源重組是在獲自上面制備的質粒pTG10268的NotI片段(用NotI限制酶消化)和預先用限制酶SalI和MluI消化過的重組質粒pTG10164(E.Degryse等，1995)之間的同源重組構建的。然后，通過引入啟動子TEF1獲得表達質粒pTG10862，該啟動子包含在從質粒pTG10085(E.Degryse等，1995)中提取的ClaI-SalI片段中，用所述啟動子取代通過用限制酶ClaI和SalI消化上面所構建的質粒pTG10832而切除的啟動子CYC1。由此獲得的質粒pTG10862(圖9)含有編碼II型人3β-HSD的cDNA序列，分別將該質粒轉入親代菌株TGY73.4或其突變型atf2-ΔURA3(相當于在例2中所獲得的菌株TGY158)，和親代菌株FY1679或其突變型atf2-ΔURA3(相當于在例2中所獲得的菌株TGY156)。按上述方法在含有250μl/ml的G418的YPD培養(yǎng)基(Difco)上分離轉化體。然后在含有每一種菌株所必需的營養(yǎng)元素的SD培養(yǎng)基上預培養(yǎng)由此獲得的候選菌落(組氨酸和尿嘧啶為菌株TGY73.4所必需；組氨酸為TGY158所必需；色氨酸、組氨酸、亮氨酸和尿嘧啶為菌株FY1679所必需；色氨酸、組氨酸和亮氨酸為菌株TGY156所必需；每一種成分的濃度分別為100μg/ml)，然后接種到含有100μl/ml孕烯醇酮的培養(yǎng)基中。在28℃下生長和生物轉化24小時之后，提取類固醇，并按照上述方法通過RP-HPLC測定。通過測定一個菌株的三個克隆所獲得的結果在下面的表3中給出表3以上結果表明，在突變型菌株TGY156或TGY158中底物孕烯醇酮幾乎是定量回收的，其中，觀察到了孕烯醇酮向孕酮生物轉化的開始，而在親本菌株TGY73.4或FY1679中孕烯醇酮完全消失，它能產生極少(如果有的話)的孕酮，但會積累孕烯醇酮乙酸酯，如在例2中所證實的。將修飾過的菌株TYG158/pTG10862的樣品于1998年2月2日保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，RueduDocteurRoux75724PARISCEDEX15法國，保藏號為I-1978。例4構建具有被TEF1啟動子/PGK終止子中斷的ATF2基因的酵母菌株(atf2-ΔTEF1/PGK)按如下方法構建菌株TGY186，該菌株源于例2中所披露的菌株TGY156(atf2-ΔURA3)，其中，位于ATF2基因座上的URA3基因業(yè)已被表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子所取代首先，按照在例2中所披露的條件，通過雙融合PCR將表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子與ATF2基因結合，不過，使用由E.Degryse等，(1995)所披露的釀酒酵母的表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子取代URA3選擇標記。頭兩輪PCR反應(PCR1)可以分別擴增ATF2基因的5’和3’編碼區(qū)，所述編碼區(qū)位于ATF2中斷靶基因中TEF1啟動子/PGK終止子嵌合體插入位點的旁側，在進行擴增時，分別將具有以下序列的寡核苷酸用作5’區(qū)的直接和間接引物OTG11049CTCTCTGTCGACATGGAAGATATAGAAGGATACGAACCACATCTCACTC(序列8)和OTG10844ATCAATCTCCAATTAGGCCTCTTCGGATTACCC(序列9)對于3’區(qū)，使用具有以下序列的寡核苷酸OTG10846CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG(序列10)和OTG11050AACAACACGCGTAACTATTAAAGCGCAAATTCGCCGATGCTTTGG(序列11)。設計引物OTG11049和OTG11050是為了分別引入限制位點SalI和MluI。第三輪PCR反應(PCR2)可以擴增TEF1啟動子/PGK終止子嵌合體，該擴增反應是分別將具有下列序列的寡核苷酸用作直接和間接引物而進行的OTG11052GGGTAATCCGAAGAGGCCTAATGGAGATTGATATCGATCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTAC(序列12)和OTG11053CTTGTCATTGTCACCTTCGGGAATGTCGAATCTTCGAAACGCAGAATTTTCGAGTTATTAAACTTAA(序列13)它可以引入限制位點ClaI和HandII。最后，通過上面所獲得的PCR產物的雙組合實現結合，將具有上述序列OTG11049(序列8)和OTG11050(序列11)的寡核苷酸用作引物，該引物可以將限制位點SalI和MluI引入ATF2接合位點。在純化之后，將最終的融合產物與包含在質粒pTG10885中的ATF2基因重組，該質粒是按照下述方法構建的，并預先用限制酶BstI和StuI消化過。由此獲得質粒pTG10888，該質粒在ClaI和HandII位點含有TEF1啟動子/PGK終止子信號，其兩端為ATF2基因的旁側區(qū)。質粒pTG10885的制備包括由FY1679菌株開始擴增ATF2基因，并按照例2中所披露的條件進行，不過，分別將具有序列OTG11049(序列8)和OTG11050(序列11)的寡核苷酸用作直接和間接引物，該引物能引入限制位點SalI和MluI。在所獲得的PCR產物中，通過用限制酶SalI和MluI消化消除這些位點，然后用大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段處理，以便補平粘性末端。然后將所獲得的片段連接在E.Degryse等(1995)所披露的表達載體pTG10031上(該載體事先用酶ClaI和HandIII消化過)，然后用Klenow片段處理。通過在大腸桿菌上轉化，獲得質粒pTG10885，所述質粒是通過以下方法獲得的，連接所述PCR產物的SalI位點，用Klenow片段補平，以便獲得具有該載體的HandIII位點的序列GTCGA，用Klenow片段補平，以便獲得序列AGCTT，以便重建HandIII位點(GTCGAAGCTT)(序列14)，并失去ClaI位點。用Klenow片段補平該載體的ClaI位點，以便獲得在與PCR產物連接之后失去的序列ATCG。然后將TEF1啟動子/PGK終止子信號以1.8kbNotI片段的形式從質粒pTG10888中切除，然后與菌株TGY156(atf2-ΔURA3)上的URA3標記進行交換。將例2中制備的菌株TGY156用作宿主菌株用從質粒pTG10888上切除的DNA和含有ARS起點的被Struhl等(1979)命名為YRp7的酵母載體共同轉化，這樣可以滿足菌株TGY156對色氨酸的需求，并根據其對5-氟-乳清酸(5-FO)的抗性對菌落進行選擇性檢測。通過乙酸鋰方法(Ito等，1983)將通過用NotI限制酶消化從質粒pTG10888上切除的2-5μgDNA和從質粒YRp7上切除的DNA引入菌株TGY156。將所述菌株鋪平板于YNGB培養(yǎng)基(Difco)的瓊脂培養(yǎng)皿上，所述培養(yǎng)基富含組氨酸和亮氨酸(各為100μg/ml)，然后篩選補充了色氨酸需求的菌株。然后，將用牙簽收集到的候選菌落接種到按照Boeke等(1984)的方法制備的含有5-FO的培養(yǎng)基上，然后在相同的培養(yǎng)基上證實了對5-FO的抗性，在抗5-FO的菌株中YRp7載體的任何損失由對色氨酸的需要證實。在由此篩選的克隆中，通過PCR檢測ATF2基因與TEF1啟動子和PGK終止子的組合。由此獲得了菌株TGY186。例5構建具有被TEF1啟動子/PGK終止子中斷的ATF2基因的并能表達P45017α的酵母菌株。按照圖10所示方案構建一種質粒(pTG10435)，該質粒含有一個酵母復制起點ARSH4/CEN6，URA3選擇標記，并具有編碼牛細胞色素P45017α的cDNA序列，該序列受釀酒酵母TEF1啟動子的控制，然后轉化到突變酵母菌株atf2-ΔTEF1/PGK(TGY186)中。首先，按照圖11所示方案制備質粒pTG10058，該質粒含有編碼由Kuber等(1986)披露的牛細胞色素P45017α的cDNA序列，其旁側為SalI和MluI位點，并位于酵母啟動子CYC1的下游通過用XhoI限制酶消化打開在專利申請WO89/10963中所披露的質粒pGB17α-5，該質粒含有編碼牛細胞色素P45017α的序列，然后用堿性磷酸酶處理。在磷酸化和雜交之后，將具有以下序列的寡核苷酸引入其XhoI位點，以制備質粒pTG10104OTG4511TCGACGGACGCGTGG(序列15)和OTG4512TCGACCACGCGTCCG(序列16)然后用限制酶SalI和MluI處理質粒pTG10104，再導入由E.Degryse等(1995)所披露的酵母啟動子CYC1的質粒pTG10031中，該質粒預先用限制酶SalI和MluI消化過，并用堿性磷酸酶處理過。由此獲得了含有編碼牛細胞色素P45017α的cDNA的pTG10058載體(圖12)。然后用限制酶SalI和MluI消化質粒pTG10058，并用堿性磷酸酶處理。提取含有編碼牛細胞色素P45017α的1.7kb的SalI-MluI片段，然后連接到預先用酶SalI和MluI消化過的由E.Degryse等(1995)所披露的表達載體pTG10085上，該載體含有酵母啟動子TEF1。由此獲得了質粒pTG10293(圖13)，其中編碼細胞色素P45017α的序列受啟動子TEF1的控制。其次，通過由E.Degryse等(1995)披露的重組質粒pTG10434，與由質粒pTG10293出發(fā)按上述方法制備的2.8kb的NotI片段之間的同源重組，制備表達質粒pTG10435，所述pTG10434含有序列ARSH4/CEN6，該質粒預先用酶SalI和MluI消化過。由此獲得的質粒pTG10435(圖14)含有受啟動子TEF1控制的編碼P45017α的序列，分別將該質粒轉化到親代菌株FY1679或在例4中制備的菌株TGY186(atf2-ΔTEF1/PGK)。按上述方法在富含色氨酸、組氨酸和亮氨酸(各100μl/ml)的YNBG培養(yǎng)基(Difco)上分離轉化體。然后將由此獲得的菌落在含有2％葡萄糖和0.5％酪蛋白氨酸的YNB培養(yǎng)基(Difco)上預培養(yǎng)16小時，然后用新鮮培養(yǎng)基稀釋到A600＝0.2，生長6小時之后，加入100μg/ml的孕烯醇酮或孕酮。在28℃下進行48小時的生長和生物轉化之后，按照例1所述方法提取類固醇并通過RP-HPLC測定，分別使用孕烯醇酮和17α-羥基孕烯醇酮標準物或孕酮和17α-羥基孕酮的標準物。在下面的表4中給出了所獲得的以μg/ml為單位的結果表4以上結果表明，在野生型菌株(FY)或其突變型atf2(TGY186)中，在以孕酮為底物時，由載體pTG10435表達的細胞色素P45017α的生物轉化能力幾乎相同。另一方面，在以孕烯醇酮為底物時，僅在突變體atf2(TGY186)上獲得了與孕酮相同的生物轉化率。在野生型菌株FY中，底物和產物被乙?；?，并且不含游離羥基孕酮。1999年1月20日將修飾過的菌株TGY186/pTG10435的樣品保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，RueduDocteurRoux75724PARISCEDEX15法國，保藏號為I-2119。例6構建具有被TEF1啟動子/PGK終止子中斷的ATF2基因并共表達3β-HSD和P45017α的酵母菌株。依次按下文所述的步驟1-3(圖15A和B)、以及下文所述的步驟4-6構建質粒pTG10417(圖21)，該質粒含有酵母復制子2μ和兩個表達嵌合體，一個表達嵌合體編碼人3β-HSD，另一個編碼牛細胞色素P45017α，它們均受釀酒酵母啟動子CYC1的控制，并具有URA3-d選擇標記，然后將其轉入突變型酵母菌株atf2-ΔTEF1啟動子/PGK終止子(TGY186)。步驟1構建質粒pTGi0210由E.Degryse等(1995)披露的表達載體pTG10033含有雜合的酵母啟動子GAL10/CYC1，預先用限制酶PvuII消化該載體，用堿性磷酸酶處理，然后在有具有以下序列的寡核苷酸的條件下重新連接OTG1050CCCGAATTCGGG(序列17)該寡核苷酸本身預先進行磷酸化和雜交，以便在含有啟動子GAL10/CYC1的表達嵌合體的末端引入EcoRI位點。由此獲得載體pTG10210。步驟2構建質粒pTG10214將含有存在于載體pTG10210上的啟動子GAL10/CYC1的表達嵌合體引入由E.Degryse等(1995)披露的大腸桿菌-酵母穿梭載體pTG10013上，該載體含有選擇標記URA3-d。用EcoRI限制酶消化載體pTG10013，并用堿性磷酸酶處理，然后將其連接到預先用酶EcoRI消化過的、在步驟1中制備的載體pTG10210上。由此獲得的載體pTG10214所含有的表達嵌合體帶有針對2μ復制子的啟動子GAL10/CYC1。步驟3構建質粒pTG10274在質粒質粒pTG10214上通過用限制酶ClaI和SalI處理切除該質粒之后通過同源重組用啟動子CYC1置換啟動子GAL10/CYC1。用限制酶HindIII和FspI消化由E.Degryse等(1995)披露的含有啟動子CYC1的表達載體pTG10031，然后與在步驟2中制備的并且用限制酶ClaI和SalI消化過的質粒pTG10214進行重組，由此產生質粒pTG10274(16圖)。步驟4構建質粒pTG10401由含有啟動子CYC1的質粒pTG10274和含有受啟動子TEF1控制的細胞色素P45017α編碼序列的質粒pTG10293出發(fā)通過同源重組制備含有受啟動子TEF1控制的細胞色素P45017α編碼序列的新的質粒pTG10401。通過用限制酶MluI和DraI消化將啟動子CYC1和大腸桿菌復制子的一部分從在步驟3中制備的質粒pTG10274上切除。用限制酶HandIII和PvuII消化例5中制備的質粒pTG10293，然后與用限制酶M1uI和DraI消化過的質粒pTG10274重組，產生質粒pTG10401(圖17)。步驟5構建質粒pTG10403然后將編碼II型人3β-HSD的cDNA導入質粒質粒pTG10401，使其受啟動子CYC1的控制。首先，按照圖18所示的方案構建含有編碼II型人3β-HSD的cDNA的表達載體pTG10262，由例3中制備的轉移載體pTG10095和重組載體pTG10257開始構建，pTG10257含有酵母復制子2μ，源于大腸桿菌的復制子，酵母CYC1啟動子/PGK終止子表達框，和一個URA3-d選擇標記，該載體pTG10257與由E.Degryse等(1995)所披露的重組載體pTG10042相同，包含在2μ片段上的XbaI位點除外，該位點被標記XbaI°所取代，該標記是通過用Klenow片段補平天然XbaI位點并進行重新連接而獲得的。通過用限制酶NotI消化將II型人3β-HSD的表達嵌合體從轉移載體pTG100095上切除，然后導入預先用限制酶SalI和MluI消化過的重組載體pTG10257上，產生表達載體pTG10262(圖19)。應當指出的是，源于質粒pTG10095的嵌合體GAL10/CYC1-cDNA在含有啟動子CYC1的重組載體pTG10257中重組產生一種含有嵌合的CYC1-cDNA的表達載體。其次，用限制酶XmnI消化上面所制備的表達載體pTG10262。將所獲得的含有編碼3β-HSD的cDNA的片段與在步驟4中制備的質粒pTG10401的片段進行重組，后一種片段是通過用限制酶ScalI消化獲得的，它含有編碼細胞色素P45017α的cDNA。因此獲得的質粒pTG10403(圖20)含有兩個表達嵌合體，其中的一個編碼3β-HSDH，受啟動子CYC1的控制，另一個編碼細胞色素P45017α，受啟動子TEF1的控制。步驟6構建質粒pTG10417最后，在上述質粒pTG10403中，用啟動子CYC1取代啟動子TEF1。另一方面，用限制酶PvuII消化例5中所披露的的質粒pTG10058，這樣可以釋放出與啟動子CYC1結合的編碼細胞色素P45017α的序列的一部分和大腸桿菌復制子的大部分。另一方面，通過用限制酶DraI消化將大腸桿菌復制子的一部分從在步驟5中制備的質粒pTG10403上消除。通過重組用上述方法預先消化過的兩種質粒，最終獲得了質粒pTG10417。質粒pTG10417含有酵母復制子2μ，URA3-d選擇標記和兩個表達嵌合體，其中的一個編碼人3β-HSD，另一個編碼源于牛的細胞色素P45017α，這兩個表達嵌合體都受酵母啟動子CYC1的控制(圖21)。然后將質粒pTG10417分別轉化到親代菌株FY1679或在例4中制備的菌株TGY186(atf2-ΔTEF1啟動子/PGK終止子)中。在瓊脂處理過的YNB培養(yǎng)基(Difco)上分離轉化體，該培養(yǎng)基含有0.5％的葡萄糖，富含色氨酸、組氨酸和亮氨酸(各自100μg/ml)。然后在28℃下在含有0.5％的葡萄糖和0.1％的酪蛋白氨基酸的YNB培養(yǎng)基(Difco)中將所獲得的菌落預培養(yǎng)24小時，然后稀釋到A600＝0.1，并補充濃度為100μg/ml的孕烯醇酮，稀釋使用相同的新鮮培養(yǎng)基(培養(yǎng)基1)或含有0.1％的葡萄糖，2％甘油和0.2％的酪蛋白氨基酸的YNB培養(yǎng)基(Difco)(培養(yǎng)基2)。在進行48小時的生長和生物轉化之后，提取類固醇，并通過例1中所述的RP-HPLC進行測定，使用標準物孕烯醇酮、17α-羥基孕烯醇酮、孕酮和17α-羥基孕酮。在下面的表5(培養(yǎng)基1)和表6(培養(yǎng)基2)中給出了以μg/ml表示的結果表5</tables>表6</tables>以上結果表明，在用質粒pTG10417轉化過的野生型菌株(FY)中的生物轉化會導致孕烯醇酮乙酸酯和17α-羥基孕烯醇酮乙酸酯的積累，這些酯隨后不能被酶3β-HSDH或P45017α轉化，而且，其生物轉化的平衡低于在轉化atf2突變體(TGY186)中所觀察到的結果。轉化過的菌株TGY186/pTG10417的樣品于1999年1月20日保藏在國立微生物保藏中心(CNCM)，巴斯德研究所，25，RueduDocteurRoux75724PARISCEDEX15法國，保藏號為I-2118。參考文獻-AchstetterT.，Nguyen-JuilleretM.，FindeliA.，MerkammM.，和LemoineY.(1992)，基因110，25-31。-AmbergD.C.，BotsteinD.和BeasleyE.M.，(1995)，酵母111275-1280。-BoekeJefD.，LacrouteF.和FinkGR.，(1984)分子和普通遺傳學197345-346。-CauetG.，DumasB.，DegryseE.，SpagnoliR.和AchstetterT.(1994)見細胞色素p-450生物化學，生物物理和分子生物學(LechnerM.C.，等)pp.583-586，JohnLibbeyEurotext。-CherryJ.M.，AdlerC.，BallC.，DwightS.，JiaY.，JuvikG.，RoeT.，WengS.和BotsteinD.，"酵母屬基因組數據庫"http//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/-DegryseE.，生物技術雜志39(1995)181-187。-DegryseE.，DumasB.，DietrichM.，LaruelleL.和AchstetterT.(1995).酵母11629-640。-DegryseE.，(1996)，基因170，45-50。-DumasB.，CauetG.，DegryseE.，SpagnoliR.&AchtetterT(1994).細胞色素P450.第8屆國際會議M.C.Lechner.JohnLibbeyEurotext著，巴黎，pp.527-530。-FiechterA.，FuhrmannG.F.和KappeliO.，(1981).微生物生理學進展22，123-183。-FujiiT.，NagasawaN.，IwamatsuA.，BogakiT.，TamaiY.和HamachiM.(1994)應用與環(huán)境微生物學60，2786-2792。-HanahanD.，分子生物學雜志166(1983)557-580。-HubacekJ.和GloverS.W.，(1970)，分子生物學雜志50111-127。-ItoH.，FukudaY.，MurataK.和KimuraA.，1983，細菌學雜志，163-168。-RheaumeE.，LachanceY.，ZhaoH.-F.，BretonN.，DrmontM.，deLaunoitY.，TrudelC.，Luu-TheV.，SimardJ.&LabrieF.(1991).分子內分泌學5，1147-1157。-RoseM.，GrisafiP.和BotsteinD.，基因29，113-124(1984)。-RodenfeldJ.，CapdevielleJ.，GuillemotJ.C.和FerraraP.(1992)分析生物化學203，173-179。-SambrookJ.，FritschE.F.和ManiatesT.，(1989).分子克隆實驗室手冊，冷泉港大學出版社，第二卷，冷泉港。-ShermanF.(1991)酶學方法194，3-21。-SimardJ.，DurocherF.，MebarkiF.，TurgeonC.，SanchezR.，LabrieY.，CouetJ.，TrudelC.，RheaumeE.，MorelY.，Luu-TheV.和LabrieF.(1996)內分泌學雜志150，5189-5207。-StruhlK.，StinchombDT.，SchererS.和DayisRW.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.76，N°3，1035-1039。-ThierryA.，FairheadC.和DujonB.，酵母；Vol.6521-534(1990)。-ZuberMX.，SimpsonER.和WatermanMR.，(1986a)科學234，1258-1261.序列表<110>HoechstMarionRoussel<120>具有間斷的ATF2基因的酵母菌株及其用途<130>2482PCT序列<140><141><160>17<170>PatentInVer.2.1<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>1aaaagtcgacaaaatggaagatatagaaggatacgaaccacatatcactc50<210>2<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<220><221>miscfeature<222>互補((1)..(33))<400>2atcaatctccaattaggcctcttcggattaccc33<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>3cattcgacattcccgaaggtgacaatgacaag32<210>4<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<220><221>miscfeature<222>互補((1)..(46))<400>4aaaaacgcgtaactattaaagcgacgcaaattcgccgatggtttgg46<210>5<211>79<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>5gggtaatccgaagaggcctaattggagattgataagcttttcaattcaattcatcatttt60ttttttattcttttttttg79<210>6<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<220><221>miscfeature<222>互補((1)..(63))<400>6cttgtcattgtcaccttcgggaatgtcgaatggggtaataactgatataattaaattgaa60ctc63<210>7<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>7cacacgcgtgtg12<210>8<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>8ctctctgtcgacaaaatggaagatatagaaggatacgaaccacatatcactc52<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<220><221>miscfeature<222>互補((1)..(33))<400>9atcaatctccaattaggcctcttcggattaccc33<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>10cattcgacattcccgaaggtgacaatgacaag32<210>11<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<220><221>miscfeature<222>互補((1)..(48))<400>11aacaacacgcgtaactattaaagcgacgcaaattcgccgatgctttgg48<210>12<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>12gggtaatccgaagaggcctaattggagattgatatcgatcacacaccatagcttcaaaat60gtttctac68<210>13<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<220><221>miscfeature<222>互補((1)..(67))<400>13cttgtcattgtcaccttcgggaatgtcggagcttcgaaacgcagaattttcgagttatta60aacttaa67<210>14<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>14gtcgaagctt10<210>15<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>15tcgacggacgcgtgg15<210>16<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<220><221>miscfeature<222>互補((1)..(15))<400>16tcgaccacgcgtccg15<210>17<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>寡核苷酸<400>14cccgaattcggg1權利要求1.一種修飾過的酵母菌株，其中，通過改變編碼乙酰輔酶A孕烯醇酮乙酰轉移酶(APAT)活性的基因而消除該活性，導致3β-羥基類固醇的穩(wěn)定化。2.如權利要求1的修飾過的酵母菌株，其中，所述改變了的基因是釀酒酵母的ATF2基因或該基因的同系物。3.如權利要求2的修飾過的酵母菌株，其中，所述改變過的基因是釀酒酵母的ATF2基因。4.如權利要求3的修飾過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入一個具有至少一個核苷酸的DNA序列而改變的。5.如權利要求4的修飾過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入URA3選擇基因或表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子而改變的。6.如權利要求5的修飾過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入URA3選擇基因而改變的。7.如權利要求6的修飾過的釀酒酵母菌株，被命名為TGY156和TGY158。8.如權利要求5的修飾過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子而改變的。9.如權利要求8的修飾過的釀酒酵母菌株，被命名為TGY186。10.一種轉化的酵母菌株，其中，通過改變編碼乙酰輔酶A孕烯醇酮乙酰轉移酶(APAT)活性的基因而消除該活性，并能表達由膽甾醇生物合成皮質醇的途徑中的至少一種酶，所述酶選自-膽甾醇的側鏈裂解酶(P450SCC)，-3β-羥基-Δ5-類固醇脫氫酶/Δ5-Δ4-類固醇異構酶(3β-HSD)和-17α-類固醇羥化酶(P45017α)。11.如權利要求10的轉化的酵母菌株，其中，所述改變了的基因是釀酒酵母的ATF2基因，或該基因的同系物。12.如權利要求11的轉化的酵母菌株，其中，所述改變了的基因是釀酒酵母的ATF2基因。13.如權利要求12的轉化的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入具有至少一個核苷酸的DNA序列而改變的。14.如權利要求12的轉化過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入URA3選擇基因而改變的。15.如權利要求14的轉化過的酵母菌株，它能表達3β-HSD。16.如權利要求15的轉化過的釀酒酵母菌株，被命名為TGY158/pTG10862。17.如權利要求12的轉化過的酵母菌株，其中，所述ATF2基因是通過插入表達嵌合體TEF1啟動子/PGK終止子而改變的。18.如權利要求17的轉化過的酵母菌株，它能表達P45017α。19.如權利要求18的轉化過的釀酒酵母菌株，被命名為TGY186/pTG10435。20.如權利要求17的轉化過的酵母菌株，它能共表達3β-HSD和P45017α。21.如權利要求20的轉化過的釀酒酵母菌株，被命名為TGY186/pTG10417。22.一種在活體內氧化選自內源固醇、外源固醇或外源類固醇的底物的方法，其中，使用了如權利要求10-21之一的轉化過的酵母菌株，當該菌株產生內源固醇時，對該菌株進行單獨培養(yǎng)，或者與外源固醇或類固醇一起培養(yǎng)，如果必要的話，提取所獲得的氧化的化合物。23.如權利要求22的體內氧化方法，其中，所述底物是3β-羥基類固醇，其中，使用如權利要求15的轉化過的酵母菌株，而且，如果必要的話提取所獲得的3-氧-Δ4-類固醇。24.如權利要求23的體內氧化方法，其中，所述3β-羥基類固醇選自孕烯醇酮或17α-羥基孕烯醇酮。25.如權利要求22的體內氧化方法，其中，所述底物是一種類固醇，其中，使用如權利要求18所述的轉化過的酵母菌株，而且，如果必要的話，提取所獲得的17α-羥基類固醇。26.如權利要求25的體內氧化方法，其中，所述類固醇底物是孕烯醇酮或孕酮。27.如權利要求22的體內氧化方法，其中，所述底物是3β-羥基類固醇，其中，使用如權利要求20所述的轉化過的酵母菌株，而且，如果必要的話，提取所獲得的17α-羥基3-氧-Δ4-類固醇。28.如權利要求27的體內氧化方法，其中，所述類固醇底物是孕烯醇酮。全文摘要本發(fā)明涉及一種修飾過的酵母菌株,其中,通過改變編碼乙?！o酶A孕烯醇酮乙酰轉移酶活性(APAT)的基因,消除了所述活性,并導致了3β－羥基類固醇的穩(wěn)定化。文檔編號C12N9/10GK1263558SQ9980046公開日2000年8月16日申請日期1999年2月4日優(yōu)先權日1998年2月5日發(fā)明者T·阿赫施泰特,G·孝厄特,E·德格里塞申請人:赫斯特·馬里恩·魯索公司