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含有兩拷貝以不同方向轉(zhuǎn)錄之基因的原核細(xì)胞的制作方法

文檔序號(hào):454182閱讀:465來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:含有兩拷貝以不同方向轉(zhuǎn)錄之基因的原核細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
表達(dá)所需基因,且染色體上含有至少兩拷貝所述基因的原核細(xì)胞。
背景技術(shù)
原核多拷貝生產(chǎn)細(xì)胞,即含有1拷貝以上所需基因的細(xì)胞已被用于在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)。
優(yōu)選的多拷貝生產(chǎn)細(xì)胞是在發(fā)酵過(guò)程中能穩(wěn)定維持各個(gè)所需基因拷貝的細(xì)胞。
另外,由于環(huán)境的關(guān)系,迫切需要生產(chǎn)細(xì)胞染色體上不含任何整合的抗生素抗性基因,也即生產(chǎn)細(xì)胞在不合抗生素的發(fā)酵培養(yǎng)基中能穩(wěn)定維持所需基因拷貝。
EP 284126描述了解決上述穩(wěn)定性問(wèn)題的方案,即提供了構(gòu)建原核細(xì)胞的方法,所述細(xì)胞的染色體上含有至少兩拷貝被內(nèi)源性DNA分開的所需基因,該內(nèi)源性DNA對(duì)宿主細(xì)胞而言是至關(guān)重要的(必需的)(見EP 284126的權(quán)利要求1)。
由于必需DNA的存在,使得發(fā)酵的細(xì)胞群體能穩(wěn)定維持所需基因的各個(gè)拷貝。如果細(xì)胞通過(guò)兩拷貝所需基因之間的同源重組除去此必需DNA,細(xì)胞失去必需DNA,此特異性細(xì)胞將會(huì)死亡。
籍此可以維持含有所需基因拷貝的穩(wěn)定細(xì)胞群體。
此方法需要知道哪個(gè)DNA區(qū)域?qū)?xì)胞而言是必需的?;蛘?,基因整合于染色體上很遠(yuǎn)的位置,所以必需DNA很可能位于拷貝之間(見EP 284126的圖2)。這是相對(duì)費(fèi)力和不可靠的方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明解決的問(wèn)題是提供了表達(dá)所需基因,且染色體上含有至少兩拷貝所述基因的原核細(xì)胞。
另外,所述原核細(xì)胞應(yīng)該a)是穩(wěn)定的,也即在發(fā)酵過(guò)程中,其染色體上可維持兩拷貝基因;和b)能穩(wěn)定維持兩拷貝基因,這兩拷貝基因之間不具有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的DNA區(qū)段(如EP 284126所述)。
解決方案的基礎(chǔ)是本發(fā)明人鑒定出發(fā)酵過(guò)程中,細(xì)胞染色體上可以穩(wěn)定維持兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的基因拷貝(見

圖1),這兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄基因可以被穩(wěn)定維持,甚至這兩拷貝基因之間不具有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的DNA區(qū)段。
因此,本發(fā)明的第一方面涉及表達(dá)所需基因的原核細(xì)胞,其特征在于i)細(xì)胞染色體上含有兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的所需基因拷貝;和ii)位于i)中所述的兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的所需基因拷貝之間的任何DNA區(qū)段僅含有細(xì)胞生長(zhǎng)非必需的DNA序列。
本發(fā)明的第二方面涉及構(gòu)建表達(dá)所需基因的原核細(xì)胞的方法,所述方法包括構(gòu)建細(xì)胞,其中i)細(xì)胞染色體上含有兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的所需基因拷貝;和ii)位于i)中所述的兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的所需基因拷貝之間的任何DNA區(qū)段僅含有細(xì)胞生長(zhǎng)非必需的DNA序列。
本發(fā)明的第三方面涉及生產(chǎn)和分離所需多肽的方法,所述方法包括i)在允許表達(dá)由所需基因編碼之所需多肽的適當(dāng)條件下培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的第一方面的原核細(xì)胞;和ii)分離所需多肽。
如本文所述,原核細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是所述兩拷貝基因是反平行轉(zhuǎn)錄的(即趨同或趨異轉(zhuǎn)錄),與平行轉(zhuǎn)錄基因時(shí)相比,它將因同源重組而使細(xì)胞丟失1拷貝所述基因的風(fēng)險(xiǎn)降至最低(見圖1)。
這暗示了所述原核細(xì)胞的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn),因?yàn)樗梢苑€(wěn)定整合所述兩拷貝基因,而這兩拷貝基因之間不具有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的DNA區(qū)段。
因此,無(wú)需按EP 284126所述,將各個(gè)所需基因拷貝整合至染色體上很遠(yuǎn)的位置(見EP 284126圖2)。這使得構(gòu)建本文所述的原核細(xì)胞比構(gòu)建EP284126中的細(xì)胞相對(duì)簡(jiǎn)單一些。下文將進(jìn)一步詳細(xì)描述構(gòu)建本文所述原核細(xì)胞的優(yōu)選方法。
另外,在本領(lǐng)域中,所述細(xì)胞生長(zhǎng)必需的DNA區(qū)段是抗生素抗性標(biāo)記基因,該基因被用于構(gòu)建含有1拷貝以上所需基因的原核細(xì)胞(見EP 166 628和WO 94/14968)。
因此,本文所述構(gòu)建原核細(xì)胞的方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是提供了產(chǎn)生原核細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法,該細(xì)胞可表達(dá)兩拷貝所述基因中的基因,且不含導(dǎo)入的抗生素抗性基因。
定義在詳細(xì)描述本發(fā)明之前,先定義本發(fā)明獨(dú)立方面的術(shù)語(yǔ)。
術(shù)語(yǔ)“基因”在本文中表示能在所述細(xì)胞中表達(dá)成多肽的基因(DNA序列)。因此,所述基因序列被定義為從起始密碼子(通常為“ATG”,“GTG”或“TTG”)開始至終止密碼子(通常為“TAA”,“TAG”或“TGA”)結(jié)束的開放閱讀框。
為了表達(dá)所述基因,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知應(yīng)該將基因與在細(xì)胞中表達(dá)基因所必需的元件相連。這種標(biāo)準(zhǔn)的元件包括啟動(dòng)子,核糖體結(jié)合位點(diǎn),終止序列,也可以是本領(lǐng)域已知的其它元件。
術(shù)語(yǔ)“兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的所述基因拷貝”在本文中表示基因被趨同或趨異轉(zhuǎn)錄,即以彼此相反的方向存在,見圖1的圖解說(shuō)明。
對(duì)本發(fā)明的原核細(xì)胞而言,術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞染色體上含有兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的所述所需基因拷貝”表示所述原核細(xì)胞含有至少兩拷貝按本發(fā)明的第一方面所述進(jìn)行定位的所需基因。除了這兩拷貝所需基因外,所述原核細(xì)胞染色體上還可含有更多的所述基因拷貝。
所述更多拷貝可以是根據(jù)本發(fā)明位于染色體上獨(dú)特位置的另外兩個(gè)所述基因拷貝,或者是位于染色體另一部分的單個(gè)/多個(gè)所述基因拷貝。
術(shù)語(yǔ)“僅含有細(xì)胞生長(zhǎng)非必需的DNA序列的DNA區(qū)段”表示與上述DNA區(qū)段被缺失前相比,該DNA區(qū)段如果從所述細(xì)胞染色體上刪除(缺失),在類似的生長(zhǎng)條件下,細(xì)胞仍能以基本上相同的生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)。
與之相反,被稱為“細(xì)胞生長(zhǎng)必需的”DNA區(qū)段表示與上述DNA區(qū)段被缺失前相比,如果所述DNA區(qū)段從細(xì)胞中缺失,那么在類似的生長(zhǎng)條件下,所述細(xì)胞不能以基本上相同的生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)。
這種必需的DNA區(qū)段可以是親代(野生型)染色體序列(如EP 284126所述)的一部分,或者可以是選擇性標(biāo)記基因,如抗生素抗性標(biāo)記基因,其中所述選擇性標(biāo)記被導(dǎo)入染色體中(例見EP 166628;WO9414968)。
下文通過(guò)實(shí)施例描述本發(fā)明的實(shí)施方案。
1A部分表示位于細(xì)胞染色體上平行轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)基因。如交叉線所示,通過(guò)相同DNA序列的同源重組可從細(xì)胞中丟失1拷貝所述基因。
B部分表示位于細(xì)胞染色體上趨異轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)基因。在這種情況下,兩個(gè)基因沒有同向相同(direct identical)的序列,因此,兩個(gè)基因之間導(dǎo)致1個(gè)基因拷貝丟失的同源重組風(fēng)險(xiǎn)顯然最低。
C部分表示位于細(xì)胞染色體上趨同轉(zhuǎn)錄的兩個(gè)基因。與B部分相同,兩個(gè)所述基因之間沒有同源重組。
圖2此圖表示構(gòu)建本文所述原核細(xì)胞的優(yōu)選策略。
A部分DNA區(qū)段“ABC”和“DEF”位于細(xì)胞染色體上。
DNA區(qū)段“ABC”,“123”,“456”,“XXX”(所需基因)和“DEF”被導(dǎo)入細(xì)胞,優(yōu)選位于溫度敏感型質(zhì)粒上被導(dǎo)入細(xì)胞。
B部分DNA區(qū)段“ABC”和“DEF”之間同源重組之后,染色體現(xiàn)含有“ABC”,“123”,“456”,“XXX”和“DEF”。
含有區(qū)段“123”,“XXX”和“456”的新質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化至細(xì)胞中,其中基因“XXX”被轉(zhuǎn)錄的方向與A部分中相反。
C部分DNA區(qū)段“123”和“456”之間同源重組之后,染色體現(xiàn)含有“ABC”,“123”,“XXX”,“456”,“XXX”和“DEF”,其中所需基因“ XXX”是反平行轉(zhuǎn)錄的。在本文所示的具體實(shí)施例中,它們是趨異轉(zhuǎn)錄的。
圖3-14這些圖表示工作實(shí)施例1至3中通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建原核細(xì)胞的方法制備本發(fā)明原核細(xì)胞所用的質(zhì)粒。
因此,可參照實(shí)施例1至3進(jìn)一步描述所述質(zhì)粒。
圖15-29這些圖描述了工作實(shí)施例4中通過(guò)本發(fā)明構(gòu)建原核細(xì)胞的方法制備本發(fā)明原核細(xì)胞所用的策略和質(zhì)粒。
因此,可參照實(shí)施例4進(jìn)一步描述這些圖。
發(fā)明詳述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明的所需基因是能表達(dá)多肽的基因,所述多肽可從細(xì)胞中分泌出來(lái)。
優(yōu)選該基因編碼含有信號(hào)肽和分泌的成熟多肽的融合多肽,這種信號(hào)肽是本領(lǐng)域眾所周知的。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述基因編碼酶,該酶可以是蛋白酶,淀粉酶,纖維素酶,脂肪酶,木聚糖酶,植酸酶和其它本領(lǐng)域已知的酶。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中,所述原核細(xì)胞是革蘭氏陽(yáng)性原核細(xì)胞,如芽孢桿菌屬細(xì)胞或鏈霉菌屬細(xì)胞。
優(yōu)選芽孢桿菌屬細(xì)胞是枯草芽孢桿菌,地衣芽孢桿菌,緩慢芽孢桿菌,嗜堿芽孢桿菌,解淀粉芽孢桿菌,Bacillus clausii,環(huán)狀芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。
另外,本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及位于兩拷貝所述基因之間的所述DNA區(qū)段,該區(qū)段至少為10bp長(zhǎng),更優(yōu)選為10bp-6000bp,甚至更優(yōu)選為75bp-4500bp長(zhǎng)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及位于兩拷貝所述基因之間的所述DNA區(qū)段,該區(qū)段也不含編碼可篩選蛋白質(zhì),如綠色熒光蛋白(GFP)的基因。可使用這種可篩選的蛋白質(zhì)構(gòu)建含有1拷貝以上所需基因的原核細(xì)胞(有關(guān)可篩選蛋白質(zhì)的詳細(xì)描述可參見DK 0792/97;和WO 99/01562)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及本發(fā)明第一方面的原核細(xì)胞或本發(fā)明第二方面的方法,其中所述的位于兩拷貝所述基因之間的DNA區(qū)段不含抗生素抗性標(biāo)記基因,如氨芐青霉素抗性基因;紅霉素抗性基因;卡那霉素抗性基因;新霉素抗性基因;或氯霉素抗性基因。
工作實(shí)施例3和4中例舉了不含抗生素抗性標(biāo)記基因的本發(fā)明的細(xì)胞。
可根據(jù)本領(lǐng)域已知的將DNA區(qū)段/片段導(dǎo)入原核細(xì)胞染色體的任何技術(shù),尤其是通過(guò)同源重組將所述DNA區(qū)段導(dǎo)入染色體的任何已知技術(shù)實(shí)施根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法以及本文所述的其實(shí)施方案。優(yōu)選的策略是用含有所需DNA區(qū)段和溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞,然后在不允許所述質(zhì)粒復(fù)制的溫度下培養(yǎng)細(xì)胞,質(zhì)粒通過(guò)同源重組與細(xì)胞染色體重組。
有關(guān)此方法的進(jìn)一步描述可參見EP 0284126;EP 166628;WO94/14968;Maniatis,T.,F(xiàn)ritsch,E.F.,Sambrook,J.“分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”,冷泉港實(shí)驗(yàn)室,1982;Ausubel,F(xiàn).M.等(編),“分子生物學(xué)最新方法”,John Wiley和Sons,1995;Harwood,C.R和Cutting,S.M(編),“芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”。
本文的工作實(shí)施例(見實(shí)施例3和4)中公開了實(shí)施根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法以及本文所述的其實(shí)施方案的一般策略。
本文圖2中顯示了基于同源重組的優(yōu)選策略,工作實(shí)施例4中描述了此策略的操作實(shí)施例。
本文工作實(shí)施例和圖2中所述方法的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)精確的機(jī)理將兩拷貝所需基因插入宿主染色體的相同基因座。如果已知該基因特別適合的基因座,那么該方法是優(yōu)選的。
因此,本發(fā)明構(gòu)建表達(dá)基因之原核細(xì)胞的方法實(shí)施方案中,通過(guò)精確的機(jī)理將兩拷貝所需基因插入宿主染色體的相同基因座。
可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施根據(jù)本發(fā)明第三方面生產(chǎn)和分離所需多肽的方法中步驟i)的具體培養(yǎng)條件和步驟ii)中分離所需多肽的具體方法。
如上所述,本文所述的原核細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)在于它是穩(wěn)定的,也即在發(fā)酵過(guò)程中能在染色體上維持兩拷貝所述基因。
因此,它特別適于大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵。
這種大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵的特征在于a)產(chǎn)生相對(duì)高產(chǎn)的所需多肽或b)使用了大規(guī)模發(fā)酵法。
因此,發(fā)明第三方面生產(chǎn)和分離所需多肽的方法實(shí)施方案中,在所需多肽的表達(dá)量為至少2g多肽(干重)/kg培養(yǎng)基;優(yōu)選為至少3g多肽(干重)/kg培養(yǎng)基;最優(yōu)選為至少5g多肽(干重)/kg培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)i)中所述的原核細(xì)胞。
另外,發(fā)明第三方面生產(chǎn)和分離所需多肽的方法實(shí)施方案中,在體積規(guī)模>10m3;優(yōu)選>25m3;更優(yōu)選>50m3;最優(yōu)選>100m3的發(fā)酵方法中培養(yǎng)i)中所述的原核細(xì)胞。
材料和方法使用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行體外DNA操作,轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌株等(Maniatis,T.,F(xiàn)ritsch,E.F.,Sambrook,J.“分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”,冷泉港實(shí)驗(yàn)室,1982;Ausubel,E.M.等(編),“分子生物學(xué)最新方法”,John Wiley和Sons,1995;Harwood,C.R和Cutting,S.M(編),“芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”,John Wiley和Sons,1990)。
除非特別說(shuō)明,根據(jù)廠商說(shuō)明使用DNA操作所用的酶。
所用培養(yǎng)基(TY,BPX和LB瓊脂)描述于EP 0506780。LBPSG瓊脂是添加有磷酸鹽(0.01M磷酸鉀),葡萄糖(0.4%)和淀粉(0.5%)的LB瓊脂。
實(shí)施例1.從地衣芽孢桿菌染色體上缺失α-淀粉酶(amyL)啟動(dòng)子1A.構(gòu)建質(zhì)粒如Jorgensen等,1990所述,將地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶(amyL)基因克隆至2.4kb的SphI-HindIII片段上,產(chǎn)生質(zhì)粒pDN1981(圖3)?!発an”表示衍生自pUB110的卡那霉素抗性基因,“PamyL”表示α-淀粉酶啟動(dòng)子區(qū)域。
(Jorgensen,P.L.,Hansen,C.K.,Poulsen,G.B.,Diderichsen,B.(1990),體內(nèi)基因工程以同源重組作為質(zhì)粒構(gòu)建的工具,基因96,37-41)。
pSJ2433(圖4)含有被克隆至pUC19的此序列的前450個(gè)堿基對(duì)(以UPS_PamyL表示)(Yanish-Perron等,1985(Yanish-Perron,C.,Vieira,J.,Messing,J.(1985),改良的M13嗜菌體克隆載體和宿主菌株M13 mp18和pUC19載體的核苷酸序列,基因33,103-119)),按下述構(gòu)建該質(zhì)粒將pDN1981 DNA用作模板以使用引物L(fēng)WN4739+LWN 4740進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用EcoRI和HindIII消化所得的0.5kb片段,與經(jīng)EcoRI和HindIII消化的pUC19連接,通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2(Diderichsen等,1990(Diderichsen,B.,Wedsted,U.,Hedegaard,L.,Jensen,B.R.,Sjoholm,C.(1990),編碼短芽孢桿菌胞外酶α-乙酰乳酸脫羧酶的aldB的克隆)),選擇氨芐青霉素抗性(AmpR),200μg/ml。“bla”表示pUC19氨芐青霉素抗性基因。
兩個(gè)轉(zhuǎn)化子被稱為SJ2433和SJ2434,通過(guò)末端DNA測(cè)序證實(shí)插入物的同一性,但未測(cè)定整個(gè)插入物的序列。LWN4739HindIII KpnI PstI NheI SphI<----amyLV2 464-437-5′-TGAGTAAGCTTGGTACCCTGCAGGCTAGCGCATGCGCTGAGATACAGTTACCAATT------->GATAGCC-3′LWN4740EcoRI XbaI<----amyLV2 18-43------>5′-TGAGTGAATTCTCTAGACCTTCTTTGTGCTTGGAAGCAGAGCC-3′通過(guò)將pDN1981上α-淀粉酶(amyL)基因的0.5kb PstI-KpnI片段與經(jīng)PstI+KpnI消化的pSJ2433連接,并通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2(Diderichsen等,1990),選擇AmpR(200μg/ml),從而由pSJ2433衍生得到pSJ2454(圖5)。
pSJ1327(圖6)含有衍生自pC194(Horinouchi和Weisblum,1982(Horinouchi,S和Weisblum,B.(1982).專門為氯霉素抗性的質(zhì)粒pC194的核苷酸序列和功能圖譜,細(xì)菌學(xué)雜志,173,559-567))的cat基因,該基因被插入pUC19衍生物的多接頭中。從pDN1600上切下1.0kb BamHI-BglII片段,其為專門為氯霉素抗性的cat基因,將此片段與經(jīng)BamHI消化的pDN3000(Diderichsen等,1990)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2,選擇AmpR(200μg/ml)。
pSJ2643(圖7)含有在pSJ2454中兩個(gè)amyL衍生區(qū)段之間插入的cat基因。從pSJ1327上切下1.1kb NheI-XbaI片段,將此片段與經(jīng)NheI消化的pSJ2454連接,通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ6,選擇氯霉素抗性(CamR,6μg/ml),以產(chǎn)生pSJ2643?!癙lac”表示衍生自pUC19的β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子。
pSJ2650(圖8)含有位于溫度敏感型芽孢桿菌質(zhì)粒上的UPS_PamyL-cat-amyL區(qū)段。用XbaI+HindIII消化pSJ2643,分離2.0kb的片段,與pSJ980(圖9;美國(guó)專利5698415)的5.1kb NheI-HindIII片段連接,轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen等,1990)感受態(tài)細(xì)胞,分別在LBPSG平板上選擇CamR和卡那霉素抗性(KanR),6μg/ml和10μg/ml,得到pSJ2650。“repF”表示衍生自pE194的復(fù)制蛋白基因,“+ori pE194”表示pE194復(fù)制起點(diǎn),“erm”表示pE194的紅霉素抗性基因,也稱其為“ermC”。
1B.地衣芽孢桿菌轉(zhuǎn)化將美國(guó)專利5698415的實(shí)施例6中所述的地衣芽孢桿菌菌株用作宿主菌株,該菌株含有1染色體拷貝α-淀粉酶(amyL)基因,該基因由突變的amyL啟動(dòng)子表達(dá)。通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Akamatzu和Sekiguchi,1984(Akamatsu,T.,Sekiguchi,J.(1984),芽孢桿菌原生質(zhì)體再生的改良方法及其在原生質(zhì)體融合和轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用,農(nóng)業(yè)生物化學(xué),48,651-655))將pSJ2645導(dǎo)入此菌株,于30℃選擇紅霉素抗性(ErmR,2μg/ml)。保溫2周后分離再生菌株,得到3個(gè)菌株,稱之為SJ3034,SJ3035和SJ3036。
1C.染色體整合和切除在含6μg/ml氯霉素和5μg/ml紅霉素的平板上劃線菌株SJ3035和SJ3036,50℃下保溫。使用引物L(fēng)WN4726+LWN3825進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從每個(gè)菌株中挑選出8個(gè)淀粉酶-陰性菌落,全都具有正確大小的擴(kuò)增片段。擴(kuò)增片段從cat基因內(nèi)的NcoI位點(diǎn)延伸至KpnI位點(diǎn)下游157bp處的amyL基因中的位置,共1007個(gè)堿基對(duì)。僅當(dāng)pSJ2650經(jīng)由amyL同源性整合時(shí)才會(huì)產(chǎn)生此片段。
LWN3825<-amyLV2 1341-1322->
5′-CTGCTGCGACATCAGGATGG-3′LWN4726<-pDN3060 548-528-->
5′-CATGGACTTCATTTACTGGG-3′
于30℃,在10ml不含抗生素的TY培養(yǎng)基(WO 91/09129)中連續(xù)2天過(guò)夜保溫,取出各個(gè)菌落鋪于含6μg/ml氯霉素的平板上,于30℃保溫過(guò)夜后,影印鋪板于含6μg/ml氯霉素+/-5μg/ml紅霉素的平板上,再在相同類型的平板上劃線推定的紅霉素敏感型菌落。
分離出3個(gè)氯霉素抗性,紅霉素敏感型菌株由SJ3035得到SJ3047,菌落1由SJ3035得到SJ3048,菌落2由SJ3036得到SJ3049,菌落3通過(guò)Southern分析證實(shí)cat基因整合至amyL啟動(dòng)子區(qū)域。
以前已構(gòu)建出amyL基因區(qū)域的限制性圖譜,該圖譜揭示出amyL啟動(dòng)子位于3.35kb HindIII片段和1.9kb ClaI片段上。
用cat基因取代amyL啟動(dòng)子應(yīng)凈插入835個(gè)堿基對(duì),cat基因未插入另外的HindIII或ClaI位點(diǎn)。因此,從分別被HindIII和ClaI消化的SJ3047-49中提取染色體DNA,在瓊脂糖凝膠上分離,通過(guò)真空印跡轉(zhuǎn)移到Immobilon-N膜上,通過(guò)切口平移用經(jīng)32P標(biāo)記的pSJ1325(含有cat基因的pUC19質(zhì)粒)探測(cè)。
正如所預(yù)期的,與SJ3047和SJ3048中的4.2kb HindIII片段雜交,但與SJ3049中的較大片段有某種程度的雜交,并如所預(yù)期的,與SJ3047和SJ3048中的2.7kb ClaI片段雜交。
因此,淀粉酶陰性的SJ3047和SJ3048菌株的amyL啟動(dòng)子按需要被cat基因取代。
實(shí)施例2.分離改良的α-淀粉酶(amyL)啟動(dòng)子2A.構(gòu)建質(zhì)粒美國(guó)專利5698415中要求了衍生自地衣芽孢桿菌amyL啟動(dòng)子的突變型啟動(dòng)子,參照該專利的權(quán)利要求1,所述突變型啟動(dòng)子是該權(quán)利要求中給出的序列片段,其中N2-N9具有序列ATGTATCA。通過(guò)將所需突變摻入覆蓋amyL啟動(dòng)子區(qū)域的長(zhǎng)PCR引物(#28902)即可構(gòu)建這種突變型啟動(dòng)子。另一個(gè)PCR引物L(fēng)WN3216從跨越AmyL信號(hào)肽編碼區(qū)之PstI位點(diǎn)的位置往上游讀碼。這兩個(gè)引物合在一起可PCR擴(kuò)增突變的amyL啟動(dòng)子片段。
#28902XbaI SphI←----序列片段5′-GCTCTAGAGCATGCTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTA-美國(guó)專利5,698,415之權(quán)利要求1中給出CTTGTTAAAAATTCGGAATATTTATACAATATCATATGTATCAC--------→ATTGAAAGGGGAGGAGAATCATG-3′LWN32165 ′-GCTGCTGCAGAATGAGGCAG-3 ′按下述構(gòu)建可轉(zhuǎn)移的溫度敏感型質(zhì)粒,該質(zhì)粒含有側(cè)翼于amyL DNA的突變型啟動(dòng)子,所述amyL DNA為適于整合至地衣芽孢桿菌菌株SJ3047染色體的形式PCR擴(kuò)增的底物是經(jīng)BglII消化的pDN1981,將引物#28902和引物L(fēng)WN3216一起使用,退火溫度為45℃,得到正確大小的PCR產(chǎn)物,用SphI+PstI消化,與pSJ2643 3.6kb SphI-PstI片段連接,用EcoRI+HindIII消化連接混合物,將1.1kb的片段(分離自片段混合物)與pSJ2739 4.4kbEcoRI-HindIII片段連接(圖10;描述于WO 96/23073中的“通過(guò)轉(zhuǎn)座整合DNA”)。用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草芽孢桿菌DN1885,于30℃選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。通過(guò)限制性圖譜的繪制分析重組質(zhì)粒,使用引物L(fēng)WN3207對(duì)pSJ4199質(zhì)粒(圖11)上的amyL啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序,發(fā)現(xiàn)它具有所需的序列?!皁riT(pUB110)”表示pUB110上質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移所必需的順式作用序列,見WO96/23073?!癙amyL 4199”表示突變的amyL啟動(dòng)子。
使用突變的amyL啟動(dòng)子取代質(zhì)粒pDN1981上的amyL啟動(dòng)子,從pSJ4199上切下0.2kb SphI-PstI片段,即突變的amyL啟動(dòng)子,與pDN1981的5.0kb SphI-PstI片段連接,用連接混合物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌DN1885,選擇紅霉素抗性(10μg/ml)。兩個(gè)轉(zhuǎn)化子為SJ4277(DN1885/pSJ4277;圖12)和SJ4278(DN1885/pSJ4278)?!皉ep”表示pUB110復(fù)制蛋白基因。
2B.轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌和染色體整合將質(zhì)粒pSJ4199轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌PP289-5(dal-,pLS20,pBC16;WO96/23073,實(shí)施例4)的感受態(tài)細(xì)胞中,于30℃,在D-丙氨酸(100μg/ml)平板上選擇紅霉素(5μg/ml)和四環(huán)素(5μg/ml)抗性。兩個(gè)轉(zhuǎn)化子為SJ4237和SJ4238。
基本上按WO 96/23073之實(shí)施例11所述,通過(guò)接合,使用這兩個(gè)供體菌株將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌中。轉(zhuǎn)接合子幾乎都是四環(huán)素敏感型。
從兩個(gè)供體菌株中各衍生得到1個(gè)轉(zhuǎn)接合子SJ4258(得自SJ4237)和SJ4259(得自SJ4238),它們都含有pSJ4199。
在添加有氯霉素(6μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上劃線這些菌株,50℃培養(yǎng)過(guò)夜。從各個(gè)菌株中得到淀粉酶陽(yáng)性菌落,30℃下,將每個(gè)菌株的4個(gè)這種菌落接種于不含抗生素的TY培養(yǎng)基中,隨后轉(zhuǎn)移3-4次,使質(zhì)粒復(fù)制,切除和缺失。從各個(gè)轉(zhuǎn)接合子菌株中得到淀粉酶陽(yáng)性,紅霉素敏感型菌落,為SJ4270(得自SJ4258)和SJ4271(得自SJ4259)。
2C.檢測(cè)突變的啟動(dòng)子菌株在搖瓶實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)突變啟動(dòng)子的效力,其中將各個(gè)整合體菌株產(chǎn)生的α-淀粉酶與對(duì)照菌株(通過(guò)缺失啟動(dòng)子衍生得到SJ3047的菌株)產(chǎn)生的α-淀粉酶相比較。37℃下,在BPX培養(yǎng)基(EP0506780)中將雙份實(shí)驗(yàn)保溫7天,在第2,5和7天測(cè)定α-淀粉酶活性。
相對(duì)于由對(duì)照菌株所測(cè)定的最高活性給出活性。
相對(duì)于對(duì)照菌株的啟動(dòng)子而言,菌株SJ4270和SJ4271中存在的突變啟動(dòng)子顯然在α-淀粉酶的生產(chǎn)方面有所改良。
實(shí)施例3構(gòu)建含有兩個(gè)趨異轉(zhuǎn)錄的表達(dá)盒的菌株3A.構(gòu)建質(zhì)粒設(shè)計(jì)質(zhì)粒,其中將amyL基因的全部拷貝插入pSJ4199上UPS_PamyL區(qū)段和PamyL_4199啟動(dòng)子之間,以使所得質(zhì)粒上的兩個(gè)amyL啟動(dòng)子可在相反方向上讀碼。
構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4338(圖13)和pSJ4339,構(gòu)建方法與整合質(zhì)粒pSJ4199的幾乎相同,不同之處是在UPS_PamyL和PamyL_4199區(qū)段之間導(dǎo)入了幾個(gè)額外的限制性位點(diǎn)。將質(zhì)粒pSJ4278用作PCR擴(kuò)增的模板,所述PCR的引物為#113123和LWN3216。
#113123SphI ClaI BglII5′-GTCAGCATGCATCGATAGATCTTGGAAGAAAATATAGGG-3′LWN32165′-GCTGCTGCAGAATGAGGCAG-3′得到0.19kb的擴(kuò)增片段,純化之,并用SphI+PstI消化,將其與pSJ26433.5kb的SphI-PstI片段連接,用EcoRI+HindIII消化連接混合物,純化1.13kb的片段,與經(jīng)EcoRI+HindIII消化的pSJ2739連接,然后用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DN1885,30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。得到3個(gè)轉(zhuǎn)化子,菌株SJ4338(DN1885/pSJ4338)含有質(zhì)粒,通過(guò)限制性分析發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒是正確的,通過(guò)DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)amyL啟動(dòng)子區(qū)域是正確的。
然后通過(guò)將整個(gè)amyL基因插入上述整合質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4372和pSJ4373(圖14)。因此,用BclI+BglII(+NcoI以進(jìn)一步消化不需要的片段)消化pSJ4277,純化2.8kb的片段,將其與經(jīng)BglII消化的pSJ4338連接,用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DN1885,30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。通過(guò)限制性分析證實(shí)為正確的淀粉酶陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子是SJ4372(DN1885/pSJ4372)和SJ4373(DN1885/pSJ4373)。
3B.轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌和染色體整合
隨后,用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化接合供體菌株宿主PP289-5,產(chǎn)生菌株SJ4378和SJ4379(皆為PP289-5/pSJ4373;ErmRTetRDal-)。
按上文所述將質(zhì)粒pSJ4373轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌SJ3047中。
2天后出現(xiàn)轉(zhuǎn)接合子(使用SJ4378供體的為4個(gè),使用SJ4379供體的為9個(gè))。
保存4個(gè)菌株得自SJ4378供體的SJ4395和SJ4396,得自SJ4379供體的SJ4397和SJ4398。
50℃,在含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上將菌株劃線,然后將各個(gè)菌株的10個(gè)單菌落接種于10ml TY培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)過(guò)夜。在LBPSG平板上將培養(yǎng)物鋪成單菌落,30℃下將這些平板保溫過(guò)夜,影印鋪板于含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上,過(guò)夜培養(yǎng)后評(píng)價(jià)紅霉素抗性和淀粉酶表型的評(píng)分。大多數(shù)菌落為紅霉素敏感型,但淀粉酶為陰性。然而,從一個(gè)培養(yǎng)物中分離到紅霉素敏感型,淀粉酶陽(yáng)性菌株,將該菌株稱為SJ4414。
3C.檢測(cè)兩-拷貝菌株在兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中,將兩拷貝菌株SJ4414在BPX搖瓶中的性能與SJ4270(相應(yīng)的1-拷貝菌株)的相比較。
37℃下,將BPX搖瓶保溫7天,未加入抗生素,測(cè)定α-淀粉酶的活性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中所得的活性是相對(duì)于1拷貝菌株所得活性的活性。
實(shí)驗(yàn)A
實(shí)驗(yàn)B
實(shí)驗(yàn)A和B清楚地闡明兩拷貝菌株SJ4414的產(chǎn)量比相應(yīng)的1拷貝菌株SJ4270的要高。
另外,將SJ4414樣品鋪于LBPSG上,所有單菌落(從包括含低pH肉湯之燒瓶的各個(gè)燒瓶中得到約30個(gè))都是淀粉酶陽(yáng)性,說(shuō)明穩(wěn)定維持了兩個(gè)整合的拷貝。
實(shí)施例4以兩個(gè)連續(xù)的步驟的染色體基因插入作為上述(實(shí)施例3)構(gòu)建途徑的可替代方法,設(shè)計(jì)并構(gòu)建溫度敏感型的可轉(zhuǎn)移載體對(duì)以易于克隆和整合任何表達(dá)盒。第一個(gè)載體含有兩個(gè)與宿主細(xì)胞染色體的相鄰區(qū)段具有同源性的區(qū)域。在這兩個(gè)區(qū)域之間含有多接頭位點(diǎn)和大的(如5kb)“中性”DNA區(qū)段。第二個(gè)載體僅含有大的“中性”DNA區(qū)段,但在此區(qū)段的中間插入多接頭位點(diǎn),插入方向與第一個(gè)載體中的相反。圖15的圖示中闡明了載體及其使用策略。除了上述說(shuō)明外,“區(qū)段A”表示大的“中性”DNA區(qū)段的一半,“區(qū)段B”表示此區(qū)段的另一半,“GFP”表示表達(dá)綠色熒光蛋白的基因。
作為適于整合至生產(chǎn)菌株的“中性”DNA,可選擇由枯草芽孢桿菌168pps基因區(qū)域(GenBank/EMBL登記號(hào)為Z34883)的兩個(gè)區(qū)段組成,這兩個(gè)區(qū)段取自用于國(guó)際基因組測(cè)序計(jì)劃的枯草芽孢桿菌菌株SJ2692。一個(gè)區(qū)段全部位于基因pps2的內(nèi)部,另一個(gè)區(qū)段全部位于pps4的內(nèi)部。之所以選擇它們是因?yàn)樗鼈兒泻苌俚南拗菩悦肝稽c(diǎn),并且克隆時(shí)不會(huì)編碼任何基因產(chǎn)物。
4A.構(gòu)建載體以整合第一個(gè)表達(dá)盒拷貝按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4459(圖16)以#119882和#119883為引物,PCR擴(kuò)增SJ2692的染色體DNA。
#119882EcoRI SphI←z34883 9964-9987----→5′-CAGTGAATTCGCATGCAGCAGGTAGTTCTATCAAACCG-3′#119883HindIII NheI←z34883 12565-12540--→5′-GACTAAGCTTGCTAGCCGCTGGATGTTAATGGCATCTGGC-3′
用EcoRI和HindIII消化擴(kuò)增的2.6kb片段,與經(jīng)EcoRI和HindIII消化的pUC19連接,通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ2中,在IPTGX-gal平板上選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。挑選4個(gè)白色菌落以制備質(zhì)粒,所有質(zhì)粒都是正確的,用EcoRI,HindIII,SphI和NheI消化質(zhì)粒,一個(gè)菌株為SJ4459(SJ2/pSJ4459)?!皕34883 10-12.5”表示由pps2擴(kuò)增的片段。
按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4461(圖17)以#119884和#119885為引物,PCR擴(kuò)增SJ2692的染色體DNA。
#119884XbaI←z34883 25234-25260----→5′-CAGTTCTAGACTTTTACAATAGAAGGAAAAGTCACCC-5′#119885HindIII BglII SalI SacII NotI MluI NheI NcoI5′-GACTAAGCTTAGATCTGAGCTCCGCGGCGGCCGCACGCGTGCTAGCCATGG<-z34883 28038-28015→-CCTCTAACAGATTTCGAGGGGCAG-3′用EcoRI和HindIII消化擴(kuò)增的2.8kb片段,與經(jīng)EcoRI和HindIII消化的pUC19連接,通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ2中,在IPTGX-gal平板上選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。挑選4個(gè)白色菌落以制備質(zhì)粒,3個(gè)質(zhì)粒是正確的,且可用HindIII,XbaI,BglII,SalI,SacII,NotI,MluI,NheI,NcoI消化質(zhì)粒,一個(gè)轉(zhuǎn)化子為SJ4461(SJ2/pSJ4461)?!皕34883 25.2-28.0”表示由pps4擴(kuò)增的片段。
按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4498(圖18)用EcoRI和NheI(+BsaI以進(jìn)一步消化不需要的部分)消化質(zhì)粒pSJ4459,從瓊脂糖凝膠中純化2.6kb的EcoRI-NheI片段,與經(jīng)EcoRI和XbaI消化的pSJ4461連接,通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ6中,選擇氨芐青霉素抗性(6μg/ml)。一個(gè)菌株為SJ4498(SJ6/pSJ4498)。
按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4505(圖19)用SphI和HindIII消化質(zhì)粒pSJ4498,凝膠純化5.4kb的片段,與純化自pSJ2643(上文圖7)的3.2kb SphI-HindIII片段連接,通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ6中,選擇氨芐青霉素抗性(6μg/ml)。一個(gè)轉(zhuǎn)化子為SJ4505(SJ6/pSJ4505)。
為了能可見地篩選第二個(gè)基因拷貝的插入,將編碼綠色熒光蛋白的基因插入第一個(gè)整合載體中的兩個(gè)pps基因區(qū)段之間。使用此系統(tǒng)第一次插入所需基因可使細(xì)胞變?yōu)镚FP陽(yáng)性,而第二拷貝所需基因的正確插入再次使細(xì)胞變?yōu)镚FP陰性。表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒是專利申請(qǐng)DK 0792/97的實(shí)施例1和圖3中和WO 99/01562中所述的pSJ4574(圖20)。“bioST”表示GFP基因,“PamyQ”表示解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動(dòng)子。
按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4581(圖21)用PstI消化pSJ4574,凝膠純化0.95kb的片段,與經(jīng)NsiI消化的pSJ4505連接,通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ2中,選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。一個(gè)轉(zhuǎn)化子為SJ4581(SJ2/pSJ4581)。
按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4587(圖22)用EcoRI+BglII消化pSJ4581,凝膠純化6.9kb的片段,與5.0kb經(jīng)EcoRI+BglII消化的pSJ2739(上文圖10)片段連接,將連接混合物轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌DN1885感受態(tài)細(xì)胞中,30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。一個(gè)轉(zhuǎn)化子為SJ4587(DN1885/pSJ4587)。
4B.構(gòu)建載體以整合第二個(gè)表達(dá)盒拷貝按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4465(圖23)質(zhì)粒pSJ4459被用作引物為#119882和#119886的PCR反應(yīng)中的模板,退火溫度為60℃,PCR反應(yīng)僅有10個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。
#119882見上文#119886HindIII NheISacII SalI BglII←z34883 12565-12540---→5′-GACTAAGCTTGCTAGCCGCGGAGCTCAGATCTGCCGCTGGATGTTAATGGCATCTGGC-3′用EcoRI和HindIII消化擴(kuò)增的2.6kb片段,與經(jīng)EcoRI和HindIII消化的pUC19連接,通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ2中,在IPTGX-gal平板上選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。挑選6個(gè)白色菌落以制備質(zhì)粒,3個(gè)質(zhì)粒是正確的,并可用酶EcoRI,HindIII,SphI,NheI,SacII,SalI和BglII消化質(zhì)粒,一個(gè)轉(zhuǎn)化子為SJ4465(SJ2/pSJ4465)。
按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4471(圖24)質(zhì)粒pSJ4461被用作引物為#119887和#119888的PCR反應(yīng)中的底物,退火溫度為60℃,PCR反應(yīng)僅有10個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。#119887XbaI NotI MluI NheI NcoI←z34883 25234-25260----→5′-CAGTTCTAGAGCGGCCGCACGCGTGCTAGCCATGGCTTTTACAATAGAAGGAAAAGTCACCC-3′#119888HindIII<-z34883 28038-28015→5 ′-GACTAAGCTTCCTCTAACAGATTTCGAGGGGCAG-3′用XbaI和HindIII消化擴(kuò)增的2.8kb片段,與經(jīng)XbaI和HindIII消化的pUC19連接,通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ2中,在IPTGX-gal平板上選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。挑選12個(gè)白色菌落以制備質(zhì)粒,1個(gè)質(zhì)粒是正確的,并可用酶XbaI,HindIII,NotI,MluI,NheI和NcoI消化質(zhì)粒,一個(gè)菌株為SJ4471(SJ2/pSJ4471)。
按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4499(圖25)用EcoRI和NheI(+BsaI進(jìn)一步消化不需要的部分)消化質(zhì)粒pSJ4465,從瓊脂糖凝膠中純化2.6kb的EcoRI-NheI片段,與經(jīng)EcoRI和XbaI消化的pSJ4471連接,通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌SJ6中,選擇氨芐青霉素抗性(200μg/ml)。一個(gè)正確的轉(zhuǎn)化子為SJ4499(SJ6/pSJ4499)。
按下述構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4507(圖26)用EcoRI和HindIII消化質(zhì)粒pSJ4499,純化5.4kb的片段,與4.3kb經(jīng)EcoRI和HindIII消化的pSJ2739片段連接,將連接混合物轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌DN1885的感受態(tài)細(xì)胞中,30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。一個(gè)轉(zhuǎn)化子為SJ4507(DN1885/pSJ4507)。
4C.將編碼地衣芽孢桿菌α淀粉酶的基因amyL插入第一個(gè)和第二個(gè)整合載體構(gòu)建質(zhì)粒pSJ4457(圖27),構(gòu)建方法與上述pSJ4277(圖12)幾乎相同,不同的是在突變的amyL啟動(dòng)子上游插入了幾個(gè)額外的限制性位點(diǎn)。其構(gòu)建過(guò)程如下從pSJ4338(上文實(shí)施例3A,圖13)中純化0.2kb的SphI-PstI片段,將此片段與pDN1981之5kb的PstI-SphI片段連接,將連接混合物轉(zhuǎn)化至DN1885中,選擇卡那霉素(10μg/ml)抗性,一個(gè)轉(zhuǎn)化子為SJ4457(DN1885/pSJ4457)。
質(zhì)粒pSJ4608(圖28)含有amyL基因,該基因被插入第一拷貝整合載體中,其構(gòu)建過(guò)程如下用BglII和HindIII消化質(zhì)粒pSJ4457,凝膠純化1.9kb的片段,與11.2kb經(jīng)BglII和HindIII消化的pSJ4587片段連接,將連接混合物轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌DN1885的感受態(tài)細(xì)胞中,30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。一個(gè)淀粉酶陽(yáng)性,GFP陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子為SJ4608(DN1885/pSJ4608)。
質(zhì)粒pSJ4606(圖29)含有amyL基因,該基因被插入第二拷貝整合載體中,其構(gòu)建過(guò)程如下用BglII和BclI消化pSJ4457,凝膠純化1.9kb的片段,與經(jīng)BglII消化的pSJ4507片段連接,將連接混合物轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌DN1885的感受態(tài)細(xì)胞中,30℃下選擇紅霉素抗性(5μg/ml)。一個(gè)含有以所需方向插入的amyL基因的轉(zhuǎn)化子為SJ4606(DN1885/pSJ4606)。
4D.轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌和第一個(gè)整合載體的染色體整合將質(zhì)粒pSJ4608轉(zhuǎn)化至接合供體宿主菌株P(guān)P289-5的感受態(tài)細(xì)胞中,在添加有D-丙氨酸(100μg/ml)的LBPSG平板上選擇紅霉素(5μg/ml)和四環(huán)素(5μg/ml)抗性,轉(zhuǎn)化子為SJ4611(PP289-5/pSJ4608)。
按上文所述通過(guò)接合將質(zhì)粒pSJ4608轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌SJ3047(實(shí)施例1)中。在含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上劃線淀粉酶陽(yáng)性,GFP陽(yáng)性的轉(zhuǎn)接合子,50℃保溫過(guò)夜。將6個(gè)淀粉酶陽(yáng)性,GFP陽(yáng)性的菌落接種于各為10ml的TY培養(yǎng)基中,30℃搖瓶培養(yǎng)。于30℃在LBPSG平板上將培養(yǎng)物鋪成單菌落,影印鋪板于含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上。重新分離推定的紅霉素敏感型,淀粉酶陽(yáng)性菌落。在平板上培養(yǎng)約1周后可清楚地看見GFP陽(yáng)性表型。兩個(gè)淀粉酶陽(yáng)性,GFP陽(yáng)性和紅霉素敏感型菌株為SJ4629和SJ4630。
4E.轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌和第二個(gè)整合載體整合至染色體上將質(zhì)粒pSJ4606轉(zhuǎn)化至接合供體宿主菌株P(guān)P289-5的感受態(tài)細(xì)胞中,在添加有D-丙氨酸(100μg/ml)的LBPSG平板上選擇紅霉素(5μg/ml)和四環(huán)素(5μg/ml)抗性,轉(zhuǎn)化子為SJ4609。
通過(guò)接合將SJ4609中的質(zhì)粒pSJ4606轉(zhuǎn)移至地衣芽孢桿菌菌株SJ4629和SJ4630中。在紅霉素(5μg/ml)平板上劃線由各個(gè)受體得到的兩個(gè)轉(zhuǎn)接合子,50℃保溫過(guò)夜。將12個(gè)在50℃時(shí)由各個(gè)受體產(chǎn)生的菌落接種于各為10ml的TY培養(yǎng)基中,30℃搖瓶培養(yǎng)。重復(fù)增殖1次,于30℃在LBPSG平板上將培養(yǎng)物鋪成單菌落,影印鋪板于含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上。從24個(gè)培養(yǎng)物的12個(gè)中得到紅霉素敏感型,GFP陰性菌落。一些菌株為SJ4669,SJ4670和SJ4671(從分開的TY培養(yǎng)物中得到,得自SJ4629受體),和SJ4672,SJ4673和SJ4674(從分開的TY培養(yǎng)物中得到,得自SJ4630受體)。
4F.檢測(cè)兩拷貝菌株于37℃,在BPX搖瓶中保溫1周后,檢測(cè)菌株SJ4270(單拷貝菌株),SJ4629和SJ4630(也表達(dá)GFP的單拷貝菌株,其中含有插入的pps基因區(qū)段),和兩拷貝菌株SJ4669-SJ4674,并測(cè)定α淀粉酶活性。產(chǎn)量表示為用對(duì)照1拷貝菌株SJ4270所得產(chǎn)量的百分比。
用菌株SJ4630得到令人驚奇的低產(chǎn)量可能是由于此菌株較后被檢測(cè)的污染所致。
通過(guò)Southern分析(見下文)證實(shí)菌株SJ4671含有兩拷貝按需要以相反方向插入的amyL基因,選擇該菌株通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐中發(fā)酵以進(jìn)一步分析之。在發(fā)酵的第4天,將SJ4671培養(yǎng)物的樣品鋪于含染料支鏈淀粉的LBPG平板上以檢查淀粉酶表型。出現(xiàn)的800個(gè)菌落都是同等程度的淀粉酶陽(yáng)性,反映出該菌株的穩(wěn)定性。
將其中10個(gè)菌落接種于BPX搖瓶中,將來(lái)自冷凍儲(chǔ)液的SJ4671鋪平板作為對(duì)照,結(jié)果如下(7天,37℃)。<
<p>此實(shí)驗(yàn)中SJ4671的產(chǎn)量為第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中SJ4671產(chǎn)量的102%,因此,發(fā)酵后挑選的單菌落得到的產(chǎn)量全部與原始的SJ4671菌株產(chǎn)量相同,反映出該菌株的穩(wěn)定性。
4G.Southern分析提取菌株SJ3047,SJ4270,SJ4629和兩拷貝菌株,包括SJ4671的染色體DNA,通過(guò)Southern印跡雜交進(jìn)行分析。用HindIII或用HindIII+KpnI消化DNA制品,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段,通過(guò)真空印跡轉(zhuǎn)移至Immobilon-N(Millipore)膜上。使用New England Biolabs的NE-BlotPhotope試劑盒和Photope檢測(cè)試劑盒,用生物素化的質(zhì)粒pDN1981 DNA探測(cè)膜。
用作探針的質(zhì)粒pDN1981含有整個(gè)Termamyl基因(位于2.4kb的SphI-HindIII片段上),pUB110的起點(diǎn)和rep基因,以及卡那霉素抗性基因。
所得印跡表明菌株SJ3047中有一個(gè)所期望的4.2kb HindIII片段。
菌株SJ4270中有一個(gè)3.3kb的HindIII片段。
菌株SJ4629中有一個(gè)9.6kb的HindIII片段。
菌株SJ4671中有一個(gè)10.6kb的HindIII片段。
最后,用HindIII和KpnI消化菌株SJ4671 DNA,顯示出5.2kb,4.2kb和1.3kb的片段。
此雜交模式按預(yù)期得自所需的兩拷貝菌株,證實(shí)了菌株SJ4671的正確。
權(quán)利要求
1.表達(dá)所需基因的原核細(xì)胞,其特征在于i)細(xì)胞染色體上含有兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的所需基因拷貝;和ii)位于i)中所述的兩個(gè)所需基因拷貝之間的任何DNA區(qū)段僅含有細(xì)胞生長(zhǎng)非必需的DNA序列。
2.構(gòu)建表達(dá)所需基因的原核細(xì)胞的方法,所述方法包括構(gòu)建細(xì)胞,其中i)細(xì)胞染色體上含有兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的所需基因拷貝;和ii)位于i)中所述的兩個(gè)反平行轉(zhuǎn)錄的所需基因拷貝之間的任何DNA區(qū)段僅含有細(xì)胞生長(zhǎng)非必需的DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的原核細(xì)胞,或根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其中所述基因是能表達(dá)由細(xì)胞分泌之多肽的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3的原核細(xì)胞,或根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法,其中所述基因編碼酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3-4中任一項(xiàng)的原核細(xì)胞,或根據(jù)權(quán)利要求2或3-4中任一項(xiàng)的方法,其中所述原核細(xì)胞是芽孢桿菌屬細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3-5中任一項(xiàng)的原核細(xì)胞,或根據(jù)權(quán)利要求2或3-5中任一項(xiàng)的方法,其中所述位于兩拷貝所述基因之間的所述DNA區(qū)段為至少10bp長(zhǎng),更優(yōu)選為10bp-6000bp長(zhǎng),甚至更優(yōu)選為75bp-4500bp長(zhǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或3-6中任一項(xiàng)的原核細(xì)胞,或根據(jù)權(quán)利要求2或3-6中任一項(xiàng)的方法,其中所述位于兩拷貝所述基因之間的所述DNA區(qū)段不含有抗生素抗性標(biāo)記基因。
8.生產(chǎn)和分離所需多肽的方法,所述方法包括i)在允許表達(dá)由所需基因編碼之所需多肽的適當(dāng)條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1或3-7中任一項(xiàng)的原核細(xì)胞;和ii)分離所需多肽。
9.生產(chǎn)和分離權(quán)利要求8之所需多肽的方法,其中在所需多肽的表達(dá)量為至少2g多肽(干重)/kg培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)i)中所述的原核細(xì)胞。
10.生產(chǎn)和分離權(quán)利要求8之所需多肽的方法,其中在體積規(guī)模>10m3的發(fā)酵方法中培養(yǎng)i)中所述的原核細(xì)胞。
全文摘要
表達(dá)所需基因,且染色體上含有至少兩拷貝所述基因的原核細(xì)胞??截愒诓煌姆较蛏媳晦D(zhuǎn)錄,從而避免了同源刪除,兩拷貝之間的DNA區(qū)段不含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的任何信息,如抗生素抗性基因。
文檔編號(hào)C12P21/00GK1272135SQ9980075
公開日2000年11月1日 申請(qǐng)日期1999年2月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月12日
發(fā)明者斯蒂恩·T·喬根森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司
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