專利名稱：測定細(xì)菌的抗生素敏感性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及測定微生物對(duì)抗生素的敏感性的方法和裝置，具體涉及測定抗生素對(duì)微生物的最小抑制濃度的方法和裝置。
抗生素的最小抑制濃度(MIC)的測定是一項(xiàng)測定微生物(通常是細(xì)菌)對(duì)特定抗生素的敏感性的基本實(shí)驗(yàn)。MIC是指防止微生物生長所需的抗生素的最小濃度。通常根據(jù)這類實(shí)驗(yàn)判斷抗生素的類別和劑量，從而得出對(duì)患者護(hù)理和成本低的治療都極為重要的迅速且準(zhǔn)確的結(jié)果。最常應(yīng)用定性的Kirby-Bauer平板法進(jìn)行抗生素敏感性測試，但至于定量MIC分析，最常應(yīng)用“管稀釋法”。
Kirby-Bauer實(shí)驗(yàn)利用覆蓋了一層均勻的、專為手頭實(shí)驗(yàn)配制的微生物生長培養(yǎng)基的平板。將一些薄片置于這層生長培養(yǎng)基上，每片含特定濃度待評(píng)估的抗生素。細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長形成可見的覆蓋層，但在具有抑制細(xì)菌生長所需足夠抗生素濃度的那些薄片周圍的區(qū)(常被稱為“清亮區(qū)”)卻例外。圍繞薄片的清亮區(qū)的大小指示微生物對(duì)含于該特定薄片中的抗生素的敏感性；即，清亮區(qū)愈大，微生物對(duì)含于該薄片中的抗生素的敏感性就愈大。Kirby-Bauer實(shí)驗(yàn)因其簡單和能同時(shí)估測多種抗生素而得以普及。Kirby-Bauer實(shí)驗(yàn)的一個(gè)缺點(diǎn)在于，有若干變量影響生長培養(yǎng)基中任何給定點(diǎn)處的抗生素濃度，所以，不能計(jì)算MIC。已發(fā)表了有關(guān)基于清亮區(qū)大小計(jì)算近似的MIC的公式，但這些公式很少被應(yīng)用并被認(rèn)為充其量不過是近似法。
“管稀釋法”包括將等量的靶微生物置于很多布置在母板中的孔(被稱為“管”)內(nèi)，再往每個(gè)管添加不同濃度的抗生素。靶微生物不能生長的最低抗生素濃度決定了對(duì)該具體微生物的MIC?！肮芟♂尫ā钡囊粋€(gè)缺點(diǎn)是，它的精確度取決于管與管之間濃度變化的幅度。小幅度導(dǎo)致更大的精確度，但可能需要實(shí)際上達(dá)不到的數(shù)量的管和工作。此外，配制準(zhǔn)確的稀釋液是一項(xiàng)費(fèi)用大的操作，它的成本隨著管數(shù)量的增多而增大。因此，該方法精確度的提高還能增大成本和延長所需時(shí)間。
另一種進(jìn)行MIC測定的方法被描述于美國專利No．4，778，758和其它文獻(xiàn)中，該方法涉及“E-條帶(E-Strip)”的應(yīng)用，“E-條帶”是一種結(jié)合了準(zhǔn)確形成的單一抗生素梯度的條帶。沿該條帶的一邊布置了校準(zhǔn)標(biāo)記物，相應(yīng)于該點(diǎn)處抗生素的準(zhǔn)確濃度。將該條帶置于接種過的Kirby-Bauer平板上，保溫后，如果該梯度內(nèi)的一個(gè)抗生素濃度超過MIC值，就會(huì)形成鄰近微生物生長區(qū)的清亮區(qū)。相應(yīng)于清亮區(qū)和生長區(qū)之間的界限的校準(zhǔn)標(biāo)記物給出待評(píng)估抗生素的MIC值。關(guān)于測定抗生素的MIC的該方法的幾個(gè)缺點(diǎn)包括但不限于1)該條帶難于制作，所以昂貴；2)該條帶的尺寸使得不能在一個(gè)裝置中同時(shí)進(jìn)行多種抗生素實(shí)驗(yàn)；以及3)在準(zhǔn)確的保溫期后就必須讀取所述制劑以實(shí)現(xiàn)最佳準(zhǔn)確性。
美國專利No．5，702，684公開了一種監(jiān)測抗生素含量的方法，該方法應(yīng)用熒光標(biāo)記物來測定工業(yè)管道系統(tǒng)中什么時(shí)候應(yīng)該補(bǔ)充抗生素。但是，該方法不能測定MIC或進(jìn)行任何類型的抗生素敏感性測定。
需要的是一種測定抗生素對(duì)靶微生物的MIC的方法，一種能在最短時(shí)間內(nèi)測定MIC的方法，一種提供準(zhǔn)確的MIC的方法，一種能同時(shí)測定數(shù)種抗生素對(duì)靶微生物的MIC值的方法，以及一種成本低的方法。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種測定抗生素對(duì)靶微生物的MIC的方法，該方法在最短時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確的結(jié)果。
本發(fā)明的另一目的是提供一種測定數(shù)種抗生素對(duì)靶微生物的MIC的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供一種測定抗生素對(duì)靶微生物的MIC的成本低的方法。
本發(fā)明的又一目的是提供一種測定抗生素對(duì)靶微生物的MIC的成本低的裝置，該裝置在最短時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確的結(jié)果。
本發(fā)明的又一目的是提供一種實(shí)用于獸醫(yī)的、測定抗生素對(duì)靶微生物的MIC的方法。
按本發(fā)明，提供了一種測定抗生素對(duì)靶微生物的MIC的方法，該方法包括如下步驟(a)提供一種微生物生長培養(yǎng)基；(b)提供一種敏感試劑，它包含與一種標(biāo)記物混合的抗生素，所述標(biāo)記物具有大小與該標(biāo)記物的濃度成比例的信號(hào)；(c)將所述敏感試劑按一定的方式摻到該生長培養(yǎng)基中以至在所述生長培養(yǎng)基中產(chǎn)生抗生素濃度和標(biāo)記物濃度的梯度；(d)用靶微生物接種該生長培養(yǎng)基；(e)將接種過的生長培養(yǎng)基保溫達(dá)足以使靶微生物生長到可檢測量的一段時(shí)間；(f)測定在具有可檢測的靶微生物生長的生長培養(yǎng)基部分與基本上沒有可檢測的靶微生物的部分之間的生長界限；以及(g)測量生長界限處標(biāo)記物信號(hào)的大?。灰约?h)應(yīng)用測得的標(biāo)記物信號(hào)值確定抗生素的最小抑制濃度。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，提供了一種測定抗生素對(duì)靶微生物的MIC的方法，該方法在最短時(shí)間內(nèi)給出準(zhǔn)確的結(jié)果。本發(fā)明應(yīng)用了一種敏感試劑，它包含一種標(biāo)記物，該標(biāo)記物具有大小與該標(biāo)記物的濃度成比例的信號(hào)。所述試劑中標(biāo)記物的濃度與抗生素的濃度成比例。因而，可通過檢測生長界限處標(biāo)記物的信號(hào)測定該生長界限處抗生素的MIC。所以，可測定抗生素的準(zhǔn)確MIC而不是近似值，并且不用大量費(fèi)時(shí)的稀釋步驟就能測定。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，可應(yīng)用本發(fā)明方法同時(shí)測定數(shù)種抗生素對(duì)靶微生物的MIC’S。例如，可將一些用靶微生物接種的獨(dú)立的生長培養(yǎng)基區(qū)鋪板于一個(gè)容器中，并將不同的抗生素?fù)饺敫鳘?dú)立的區(qū)。然后，就可應(yīng)用本發(fā)明方法的后續(xù)步驟確定摻入各生長培養(yǎng)基區(qū)的特定抗生素的MIC。
本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，提供了一種測定抗生素對(duì)靶微生物的MIC的成本低的方法。本發(fā)明方法提供準(zhǔn)確MIC信息的能力避免了象管稀釋法中要求的那樣對(duì)很多昂貴抗生素稀釋液的需要。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，將寶貴的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)開支減至最少使本發(fā)明方法比現(xiàn)有的方法花費(fèi)少得多。
本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，提供了一種實(shí)用于獸醫(yī)的、測定抗生素對(duì)靶微生物的MIC的方法。
本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，容易測定不同濃度的多種抗生素對(duì)某特定靶微生物的效果。結(jié)果，涉及抗生素應(yīng)用的醫(yī)護(hù)人員能對(duì)抗生素的類別和有效劑量作出有更好指導(dǎo)性的判斷，所以，有益于抗生素接受者。
借助于如附圖闡釋的、對(duì)本發(fā)明最佳形式實(shí)施方案的詳細(xì)描述將使本發(fā)明的這些和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)變得明顯。


圖1示出闡釋本發(fā)明方法的Kirby-Bauer平板型裝置的剖面示意圖。
圖2是描繪與圖1所示Kirby-Bauer型裝置相關(guān)的標(biāo)記物信號(hào)值作為線性距離的函數(shù)的圖。
圖3示出闡釋本發(fā)明方法的、盛有微生物生長培養(yǎng)基的槽的剖面示意圖。
圖4是描繪與圖3所示裝置相關(guān)的標(biāo)記物信號(hào)值作為線性距離的函數(shù)的圖。
圖5示出圖3所示剖面的示意圖，它進(jìn)一步包含應(yīng)用于底物的敏感試劑。
本發(fā)明測定抗生素對(duì)靶微生物的最小抑制濃度(MIC)的方法包括如下步驟提供微生物生長培養(yǎng)基、提供有效量的靶微生物和提供敏感試劑。所述生長培養(yǎng)基必須能維持微生物生長，它可以是凝膠型培養(yǎng)基或滲透性固體生長培養(yǎng)基。能在應(yīng)用過程中再水合的脫水生長培養(yǎng)基是特別有利的，因?yàn)樗鼈円妆婚L時(shí)間貯存。所述靶微生物可以包括或是采自例如尿樣的第一代微生物，或是采自例如生長在另一生長培養(yǎng)基上的菌落的微生物懸浮液。該靶微生物一般是液體溶液中的一種組分，不過也可應(yīng)用攜帶該靶微生物的擴(kuò)散性凝膠。含有靶微生物的液體溶液便于用靶微生物接種生長培養(yǎng)基這一步驟，當(dāng)應(yīng)用脫水生長培養(yǎng)基時(shí)尤其如此。
所述敏感試劑包含待評(píng)估的抗生素和標(biāo)記物。在第一個(gè)實(shí)施方案中，敏感試劑合同實(shí)用的、但未準(zhǔn)確測定量的標(biāo)記物混合的準(zhǔn)確量待評(píng)估抗生素。在第二個(gè)實(shí)施方案中，將該試劑的待評(píng)估抗生素與標(biāo)記物按已知的準(zhǔn)確比例混合，但可改變?cè)撛噭┑目偭恳赃m合應(yīng)用。這些試劑實(shí)施方案只要求一個(gè)準(zhǔn)確已知的參數(shù)(抗生素的量或者抗生素與標(biāo)記物比例)，于是，將制備所述敏感試劑的費(fèi)用(因而將整個(gè)方法的費(fèi)用)減至最小。
所述標(biāo)記物可以是這樣的任何物質(zhì)1)具有可識(shí)別的信號(hào)，信號(hào)值與該標(biāo)記物濃度成比例；2)具有可與試驗(yàn)樣品中的其它成分區(qū)分的信號(hào)；3)具有不被靶微生物的生長不利地影響的信號(hào)和信號(hào)值；4)基本不會(huì)不利地影響靶微生物的生長；5)不會(huì)意外地或不利地影響待評(píng)估的抗生素的作用；以及6)如果需要的話，一種將在保溫期間與抗生素在生長培養(yǎng)基中以可預(yù)料的方式共同擴(kuò)散的標(biāo)記物，于是，局部標(biāo)記物濃度與局部抗生素濃度成比例。例如，可應(yīng)用一種熒光標(biāo)記物，它的激發(fā)波長或發(fā)射波長在生長培養(yǎng)基的激發(fā)波長或發(fā)射波長范圍之外，并且不與生長培養(yǎng)基或靶微生物結(jié)合。標(biāo)記物與抗生素優(yōu)選以相同速度在生長培養(yǎng)基中擴(kuò)散，不過，不要求相似的擴(kuò)散速度。也可應(yīng)用具有不同但已知的擴(kuò)散速度的標(biāo)記物和抗生素。在另一實(shí)例中，可應(yīng)用一種被抗生素吸收的可識(shí)別的染料。從該染料發(fā)射的標(biāo)記物信號(hào)的大小與抗生素的濃度成比例，因?yàn)槭强股亍皵y帶”了該染料。本說明書中應(yīng)用的術(shù)語“比例”和“成比例”包括可用數(shù)學(xué)方法描述的任何關(guān)系；例如，x∶y，x∶y2，x∶1／y，等。
本發(fā)明的方法包括如下進(jìn)一步的步驟a)將所述敏感試劑摻入生長培養(yǎng)基；b)用靶微生物接種該生長培養(yǎng)基；c)將接種過的生長培養(yǎng)基保溫；d)確定靶微生物生長的生長界限；e)測定生長界限處標(biāo)記物的信號(hào)值；以及f)應(yīng)用測得的標(biāo)記物信號(hào)值確定抗生素的MIC。
按一定方式將敏感試劑摻入生長培養(yǎng)基以至在該生長培養(yǎng)基內(nèi)形成至少一個(gè)試劑濃度梯度。在該梯度的一端，抗生素濃度和標(biāo)記物濃度都大于關(guān)于抗生素的MIC可能的濃度。在該梯度的另一端，抗生素濃度和標(biāo)記物濃度都小于關(guān)于抗生素的MIC可能的濃度?？赏ㄟ^將試劑加入生長培養(yǎng)基中或者通過將試劑涂到生長培養(yǎng)基表面而直接實(shí)現(xiàn)摻和。還可通過這樣間接實(shí)現(xiàn)摻和將試劑涂到底物上，再將該底物與生長培養(yǎng)基接觸或緊靠著生長培養(yǎng)基。
生長培養(yǎng)基可通過為生長培養(yǎng)基和靶微生物的應(yīng)用所接受的任何已知方法接種。接種入生長培養(yǎng)基的靶微生物的數(shù)量應(yīng)足以充分覆蓋摻有試劑的生長培養(yǎng)基的整個(gè)區(qū)。接種物濃度的足夠量將取決于當(dāng)前的MIC試驗(yàn)參數(shù)，包括模式生長培養(yǎng)基、靶微生物、抗生素等。然而，在大多數(shù)情況下，足夠的靶微生物接種物濃度將在每毫升接種物一千個(gè)微生物(103個(gè)微生物／ml)和每毫升接種物一億個(gè)微生物(108個(gè)微生物／ml)之間；更高的接種物濃度一般需要更小的接種物體積。如前所述，靶微生物優(yōu)選是液體溶液或凝膠溶液中的一種成分。
摻有所述試劑并用靶微生物接種過的生長培養(yǎng)基可在生長培養(yǎng)基和靶微生物可接受的任何條件下被保溫。一般將生長培養(yǎng)基保溫直到生長培養(yǎng)基的一部分具有可檢測的靶微生物生長。具有可檢測的靶微生物生長的該部分生長培養(yǎng)基將接近一個(gè)基本上沒有可檢測的靶微生物生長的生長培養(yǎng)基部分。在一些情況下，該“基本上沒有”可檢測靶微生物生長的生長培養(yǎng)基部分可能存在可忽略量的靶微生物生長。這兩部分之間的界限被稱為生長界限。具有靶微生物的可檢測生長的那部分生長培養(yǎng)基是這樣的其中，靶微生物的生長基本上未受抗生素抑制。反之，沒有可檢測靶微生物生長的部分是這樣的其中，靶微生物的生長基本上被抗生素抑制。生長界限與待評(píng)估的抗生素對(duì)靶微生物的MIC相符。
生長界限的位置通常由光學(xué)法確定。確定生長界限的位置的第二種方法應(yīng)用一種標(biāo)記物(它可能與所述試劑中包含的標(biāo)記物相同或不同)，該標(biāo)記物與生長著的微生物相互作用(包括但不限于被生長著的微生物代謝)而生成可檢測的產(chǎn)物。該可檢測的產(chǎn)物(它隨著靶微生物的生長而存在)被檢測到從而確定生長界限。確定生長界限的位置的第三種方法包括，評(píng)定有靶微生物生長的部分中的光散射特性與基本上沒有靶微生物生長的部分中的光散射特性。在所有這三種方法中，一旦確定了生長界限，就能測得所述試劑內(nèi)的標(biāo)記物信號(hào)并測定它的大小。
在敏感試劑中與抗生素混合的標(biāo)記物提供生長界限處的定量信息，它使得能計(jì)算抗生素的MIC。具體地說，生長界限處的標(biāo)記物信號(hào)值與標(biāo)記物濃度成比例，于是，可應(yīng)用標(biāo)記物濃度和抗生素濃度之間的已知的比例關(guān)系確定抗生素的濃度。測定抗生素濃度的確切方法將依賴于生長培養(yǎng)基的實(shí)際實(shí)施方案、敏感試劑是如何分布的、該試劑中標(biāo)記物與抗生素之間的比例關(guān)系等。如下實(shí)施例闡述了如何可應(yīng)用本發(fā)明的方法計(jì)算抗生素濃度。
參照?qǐng)D1和2，將平板12置于已被調(diào)節(jié)到檢測所述標(biāo)記物的熒光信號(hào)特征的可商購掃描熒光計(jì)(未示出)中。該熒光計(jì)產(chǎn)生一條曲線26(圖2)，它反映作為穿過平板12的徑向距離的函數(shù)的信號(hào)值。標(biāo)記物信號(hào)值是給定體積(V)中標(biāo)記物濃度的函數(shù)，是通過檢測具有均勻厚度(T；V=A*T)的生長培養(yǎng)基14的面積(A)測定的。在20、24這兩部分之間的生長界限28處的標(biāo)記物信號(hào)值例如是以位于生長界限28處的生長培養(yǎng)基14的體積(V)中測定的信號(hào)值給出的。如前所述，在20、24這兩部分之間的生長界限28的位置可通過光學(xué)法或通過其它方法確定。在薄片16下方的生長培養(yǎng)基14中和有可檢測靶微生物生長22的生長培養(yǎng)基14的部分20中，標(biāo)記物的信號(hào)可能因干擾而模糊。標(biāo)記物的總信號(hào)值可通過用曲線擬合數(shù)學(xué)分析法估測模糊區(qū)內(nèi)的標(biāo)記物信號(hào)值而測定。為闡述起見，圖2示出一條模糊區(qū)內(nèi)的數(shù)學(xué)擬合曲線30的實(shí)例。接著，通過積分曲線26、30下方的面積而測定標(biāo)記物的總信號(hào)值。如上所述，以線性方式穿過試驗(yàn)區(qū)的中心掃描標(biāo)記物信號(hào)。由于敏感試劑17實(shí)際上以徑向方式擴(kuò)散，所以，可能需要調(diào)節(jié)信號(hào)積分法從而反射試劑的徑向擴(kuò)散。不過，可通過掃描含試劑的徑向擴(kuò)散的整個(gè)區(qū)而避免信號(hào)積分法調(diào)節(jié)。
生長界限28處的給定體積(V)中標(biāo)記物的濃度可以以生長界限28處的標(biāo)記物信號(hào)值(從體積V檢測的)與生長培養(yǎng)基14的總體積內(nèi)檢測的標(biāo)記物信號(hào)的總值的比率表示。生長界限28處的標(biāo)記物濃度又通過標(biāo)記物和抗生素的擴(kuò)散速度比率而與生長界限28處(相同體積V內(nèi))抗生素的濃度關(guān)聯(lián)。如果擴(kuò)散速度相等，就可按下式測定生長界限28處的抗生素濃度(即，抗生素對(duì)靶微生物的MIC) 可將該式重排而求出生長界限28處的未知抗生素濃度 如果抗生素和標(biāo)記物的擴(kuò)散速度不同，就應(yīng)用表示兩個(gè)擴(kuò)散速度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系的校正因子來校正該差異。此外，上述表達(dá)式要求生長培養(yǎng)基總體積中抗生素的量是準(zhǔn)確已知的。如果將全部敏感試劑17(包含與未準(zhǔn)確測定量的熒光標(biāo)記物混合的準(zhǔn)確已知量的抗生素)摻入生長培養(yǎng)基中，就可從試劑的量求得抗生素的量。也可應(yīng)用準(zhǔn)確測定生長培養(yǎng)基總體積中抗生素的量的其它方法。
敏感試劑36擴(kuò)散入生長培養(yǎng)基34中，隨著它橫向擴(kuò)散而產(chǎn)生遞降濃度的梯度40(如圖3中的示意圖所示)。將接種過的生長培養(yǎng)基34保溫，形成了與沒有可檢測的靶微生物生長的部分46接近的、有可檢測的靶微生物生長44的部分42。應(yīng)用一個(gè)被調(diào)節(jié)到檢測所述標(biāo)記物的熒光信號(hào)特征的可商購掃描熒光計(jì)(未示出)來測量從處于42和46這兩部分之間的生長界限48的給定體積(V)發(fā)射的標(biāo)記物信號(hào)值，其中，體積(V)被定義為具有均勻厚度(T；V=A*T)的被掃描的接種生長培養(yǎng)基34的面積(A)。如前所述，處于42和46這兩部分之間的生長界限28的位置可通過光學(xué)法或者通過其它方法確定。該熒光計(jì)產(chǎn)生一條曲線50(圖4)，它反映作為穿過槽32的橫向距離的函數(shù)的信號(hào)值。
生長界限48處的抗生素濃度(即，抗生素對(duì)靶微生物的MIC)可通過這樣計(jì)算首先，應(yīng)用下列關(guān)系式確定生長界限48處的給定體積(V)中的標(biāo)記物濃度 可將它重排而求出未知的標(biāo)記物濃度，因?yàn)樯L界限48處的標(biāo)記物信號(hào)是已知的 一旦確定了生長界限48處的標(biāo)記物濃度，就可確定生長界限48處的抗生素濃度，即，通過將抗生素和標(biāo)記物初始濃度的比率(k1)乘以生長界限48處的標(biāo)記物濃度，但須敏感試劑36中的抗生素和標(biāo)記物具有相等的擴(kuò)散速度k1*[(標(biāo)記物的量)／(V)]生長界限=生長界限處的抗生素濃度如果抗生素和標(biāo)記物的擴(kuò)散速度不同，就應(yīng)用一個(gè)表示這兩個(gè)擴(kuò)散速度之間數(shù)學(xué)關(guān)系的校正因子校正該差異。
雖然就其詳細(xì)的實(shí)施方案展示和描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)懂得，可對(duì)其形式和細(xì)節(jié)作各種改變而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。
權(quán)利要求
1．一種測定抗生素對(duì)靶微生物的最小抑制濃度的方法，該方法包括如下步驟(a)提供一種微生物生長培養(yǎng)基(14，34)；(b)提供一種敏感試劑(17，36)，它包含與第一種標(biāo)記物混合的抗生素，所述第一種標(biāo)記物具有大小與所述第一種標(biāo)記物的濃度成比例的第一種信號(hào)；(c)將所述試劑按一定的方式摻到所述生長培養(yǎng)基中以至在所述生長培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述抗生素濃度和所述第一種標(biāo)記物濃度的梯度；(c)用所述靶微生物接種所述生長培養(yǎng)基；(d)將所述接種過的培養(yǎng)基保溫達(dá)足以使所述靶微生物在所述生長培養(yǎng)基的第一部分(20，42)上生長到可檢測量的一段時(shí)間；(e)確定在有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的所述第一部分與基本上沒有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的所述第二部分(24，46)之間的生長界限(28，48)；接著(f)測量所述生長界限處的所述第一種信號(hào)的值；以及(g)應(yīng)用所述第一種信號(hào)的所述測定值確定所述抗生素的所述最小抑制濃度。
2．權(quán)利要求1的方法，其中，所述接種步驟包括以液體溶液形式提供所述靶微生物，其中，所述液體溶液在所述接種步驟過程中水合初始脫水的所述生長培養(yǎng)基(14，34)。
3．權(quán)利要求2的方法，其中，所述摻和步驟包括將所述敏感試劑(17，36)直接加入所述生長培養(yǎng)基(14，34)中。
4．權(quán)利要求1的方法，其中，所述摻和步驟包括將所述敏感試劑(17，36)直接涂到所述生長培養(yǎng)基(14，34)的表面。
5．權(quán)利要求1的方法，其中，所述摻和步驟包括將所述敏感試劑(17，36)涂到底物(16，33)上，再放置所述底物使其接觸或緊鄰所述生長培養(yǎng)基(14，34)。
6．權(quán)利要求1的方法，它進(jìn)一步包括如下步驟提供第二種標(biāo)記物，其中，所述第二種標(biāo)記物與所述可檢測的靶微生物生長相互作用而產(chǎn)生敏感的第二種信號(hào)；檢測所述第二種標(biāo)記物而確定所述生長界限(28，48)。
7．權(quán)利要求1的方法，它進(jìn)一步包括如下步驟檢測所述生長培養(yǎng)基(14，34)而確定在光散射特性方面有差異的鄰接區(qū)；確定所述沿所述鄰接區(qū)之間的界限的生長界限(28，48)。
8．權(quán)利要求1的方法，其中，所述提供所述敏感試劑(17，36)這一步驟進(jìn)一步包括以準(zhǔn)確已知量提供與實(shí)用量的所述標(biāo)記物混合的所述抗生素。
9．權(quán)利要求8的方法，其中，所述測量步驟進(jìn)一步包括測量所述生長培養(yǎng)基(14，34)的已知體積內(nèi)所述第一種信號(hào)的所述值，所述體積位于所述生長界限(28，48)處。
10．權(quán)利要求9的方法，它進(jìn)一步包括測量所述生長培養(yǎng)基(14，34)內(nèi)所述第一種信號(hào)的總值這一步驟。
11．權(quán)利要求10的方法，其中，所述測定所述最小抑制濃度的步驟進(jìn)一步包括如下步驟將所述抗生素的準(zhǔn)確已知量乘以所述已知體積內(nèi)測量的所述第一種信號(hào)的所述值與在所述生長培養(yǎng)基(14，34)內(nèi)測量的所述第一種信號(hào)的所述總值的比率；其中，所述相乘步驟的所述結(jié)果等于所述抗生素對(duì)所述靶微生物的所述最小抑制濃度。
12．權(quán)利要求1的方法，其中，所述提供敏感試劑(17，36)的步驟進(jìn)一步包括以已知準(zhǔn)確比率提供所述抗生素和所述第一種標(biāo)記物，其中，所述準(zhǔn)確比率在數(shù)學(xué)上可表示為初始抗生素濃度與初始標(biāo)記物濃度的比率。
13．權(quán)利要求12的方法，它進(jìn)一步包括如下步驟提供一塊含有已知量的參比標(biāo)記物的參比貼片(38)，所述第一量的參比標(biāo)記物具有已知大小的參比信號(hào)。
14．權(quán)利要求13的方法，其中，所述測量步驟進(jìn)一步包括測量所述生長培養(yǎng)基(14，34)的已知體積內(nèi)所述第一種信號(hào)的所述值，所述體積位于所述生長界限(28，48)處。
15．權(quán)利要求14的方法，其中，所述測定所述最小抑制濃度的步驟進(jìn)一步包括如下步驟將所述已知體積內(nèi)測量的所述第一種信號(hào)的所述值乘以所述參比標(biāo)記物的所述已知量與所述參比信號(hào)的所述已知值的比率，以及乘以所述初始抗生素濃度與所述初始標(biāo)記物濃度的所述比率；其中，所述相乘步驟的結(jié)果等于所述抗生素對(duì)所述靶微生物的所述最小抑制濃度。
16．一種測定抗生素對(duì)靶微生物的最小抑制濃度的方法，該方法包括如下步驟(a)提供一種微生物生長培養(yǎng)基(14，34)；(b)提供一種敏感試劑(17，36)，它包含與一種標(biāo)記物混合的抗生素，所述標(biāo)記物具有大小與所述標(biāo)記物的濃度成比例的信號(hào)；(c)將所述試劑按一定的方式摻到所述生長培養(yǎng)基中以至在所述生長培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述抗生素濃度和所述標(biāo)記物濃度的梯度(18，40)；(c)用所述靶微生物接種所述生長培養(yǎng)基；(d)將所述接種過的培養(yǎng)基保溫達(dá)足以使所述靶微生物在所述生長培養(yǎng)基的第一部分(20，42)中生長到可檢測量的一段時(shí)間，所述第一部分具有的所述抗生素濃度不足以抑制所述靶微生物在所述生長培養(yǎng)基上的生長，所述第一部分鄰接基本上沒有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的第二部分(24，46)，所述第二部分具有的所述抗生素濃度足以基本上抑制所述靶微生物的生長；(e)確定在有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的所述第一部分與基本上沒有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的所述第二部分之間的生長界限(28，48)；接著(f)測量所述生長界限處的所述標(biāo)記物信號(hào)的所述值；以及(g)應(yīng)用所述標(biāo)記物信號(hào)的所述測定值計(jì)算所述抗生素的所述最小抑制濃度。
17．一種測定一種或多種抗生素對(duì)靶微生物的最小抑制濃度的方法，所述方法應(yīng)用一種微生物生長培養(yǎng)基(14，34)和一種敏感試劑(17，36)，所述敏感試劑包含與一種標(biāo)記物混合的抗生素，所述標(biāo)記物具有大小與所述標(biāo)記物的濃度成比例的信號(hào)，其中，將所述試劑按一定的方式摻到所述生長培養(yǎng)基中以至在所述生長培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述抗生素濃度和所述標(biāo)記物濃度的梯度(18，40)，所述方法包括如下步驟(a)用所述靶微生物接種所述生長培養(yǎng)基；(b)將所述接種過的生長培養(yǎng)基保溫達(dá)足以使所述靶微生物在所述生長培養(yǎng)基的第一部分(20，42)上生長到可檢測量的一段時(shí)間；(c)確定在有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的所述第一部分與基本上沒有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的所述第二部分(24，46)之間的生長界限(28，48)；接著(d)測量所述生長界限處的所述標(biāo)記物信號(hào)的所述值；以及(e)應(yīng)用所述標(biāo)記物信號(hào)的所述測定值確定所述抗生素的所述最小抑制濃度。
18．一種測定抗生素對(duì)靶微生物的最小抑制濃度的方法，它包括如下步驟(a)提供一種微生物生長培養(yǎng)基(14，34)，它包含一種敏感試劑(17，36)；(b)用所述靶微生物接種所述生長培養(yǎng)基；(c)將所述接種過的培養(yǎng)基保溫達(dá)足以使所述靶微生物在所述生長培養(yǎng)基的第一部分(20，42)上生長到可檢測量的一段時(shí)間；(d)確定在有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的所述第一部分與基本上沒有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的所述第二部分(24，46)之間的生長界限(28，48)；接著(e)檢測所述生長界限處的所述敏感試劑；以及(f)應(yīng)用所述檢測的敏感試劑計(jì)算所述抗生素的所述最小抑制濃度。
19．一種測定抗生素對(duì)靶微生物樣品的最小抑制濃度的裝置，它包括一個(gè)樣品保持器(12，32)；一片置于所述樣品保持器中的微生物生長培養(yǎng)基(14，34)；以及一種敏感試劑(17，36)，它包含一種抗生素和一種標(biāo)記物，所述標(biāo)記物具有大小與所述標(biāo)記物的濃度成比例的信號(hào)，將所述試劑按一定的方式摻到所述那片生長培養(yǎng)基中以至在所述生長培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述抗生素濃度和所述標(biāo)記物濃度的梯度(18，40)。
20．權(quán)利要求19的裝置，它進(jìn)一步包括一個(gè)檢測所述標(biāo)記物信號(hào)的傳感器；以及檢測靶微生物生長的裝置；其中，所述傳感器可被操作以檢測在檢測到的與所述靶微生物生長鄰近的生長界限(28，48)處的所述標(biāo)記物信號(hào)。
全文摘要
提供了測定抗生素對(duì)靶微生物的最小抑制濃度的方法和裝置。該方法包括如下步驟:(a)提供一種微生物生長培養(yǎng)基(14,34);(b)提供一種敏感試劑(17,36),它包含與標(biāo)記物混合的抗生素,所述標(biāo)記物具有大小與該標(biāo)記物的濃度成比例的信號(hào);(c)將所述試劑按一定的方式摻到生長培養(yǎng)基中以至在該生長培養(yǎng)基中產(chǎn)生所述抗生素濃度和所述標(biāo)記物濃度的梯度(18,40);(c)用所述靶微生物接種所述生長培養(yǎng)基;(d)將所述接種過的培養(yǎng)基保溫達(dá)足以使所述靶微生物在該生長培養(yǎng)基的第一部分(20,42)上生長到可檢測量的一段時(shí)間;(e)確定在有可檢測的靶微生物生長的所述生長培養(yǎng)基的第一部分與基本上沒有可檢測的靶微生物生長的第二部分(24,46)之間的生長界限(28,48);(f)測量所述生長界限處的信號(hào)值;以及(g)應(yīng)用測得的信號(hào)值測定所述抗生素的最小抑制濃度。
文檔編號(hào)C12M1/40GK1292829SQ99803742
公開日2001年4月25日 申請(qǐng)日期1999年3月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月7日
發(fā)明者斯蒂芬·C·沃德羅 申請(qǐng)人:斯蒂芬·C·沃德羅, 沃德羅合伙有限公司, 羅伯特·A·利費(fèi)恩