專利名稱：新的植物質體啟動子序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明主要涉及植物分子生物學，更具體地涉及從擬南芥分離的新的質體啟動子及其應用方法。本發(fā)明還涉及應用質體基因的蛋白質編碼區(qū)分離間插調節(jié)序列的新方法。本發(fā)明還涉及應用新的質體啟動子序列提高質體轉化效率。
質體轉化(其中使基因通過同源重組插入出現(xiàn)在每個植物細胞中之環(huán)狀質體基因組的所有數(shù)千個拷貝中)利用優(yōu)于核表達基因的龐大拷貝數(shù)之便利，使表達水平可超過可溶性植物蛋白總量的10％。此外，由于質體編碼的性狀不能通過花粉傳播，因而使質體轉化比較理想；故避免了有害轉基因逃逸到轉基因植物野生型親屬的潛在危險。質體轉化的其它便利包括可以便于使多個基因作為一個聚順反子單元同時表達，并且可以消除核轉化可能存在的位置效應和基因沉默。質體轉化技術在美國專利第5，451，513、5，545，817、5，545，818和5，576，198號中；國際專利申請第WO 95／16783號中；以及在Boynton等，酶學方法217；510-536(1993)，Svab等，美國國家科學院學報90913-917(1993)，和McBride等，美國國家科學院學報917301-7305(1994)(均全文引入作為參考)中有較全面描述。
煙草質體轉化的基本技術涉及用位于選擇性標記，如抗生素抗性基因側翼的克隆化質體DNA區(qū)對葉組織的粒子轟擊。這一命名為靶向序列的1-1．5kb側翼區(qū)促進了與質體基因組的同源重組，并因此使156kb煙草原質體系的特定區(qū)被取代或修飾。最初，葉綠體16S rRNA的點突變以及賦予壯觀霉素和／或鏈霉素抗性的rps 12基因在轉化中作為選擇性標記應用(Svab等，美國國家科學院學報878526-8530(1990)；Staub，J．M．＆ Maliga，P．，植物細胞439-45(1992)；均全文引入作為參考)。由此產生穩(wěn)定的同質轉化體，轉化頻率大約每100次對靶葉的轟擊產生一個轉化體。這些標記之間的克隆位點的存在使得能產生可導入外源基因的質體靶向載體(Staub，J．M．& Maliga，P．，EMBO J．12601-606(1993)，已引入本文作為參考)。通過以一個顯性選擇標記即編碼壯觀霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺苷轉移酶的細菌aadA基因取代隱性rDNA或r-蛋白質抗生素抗性基因可使轉化頻率實質性提高(Svab等，1993)。此前，這一標記已成功用于綠藻Chlamydomonas reinhardtii質體基因組的高頻轉化(Goldschmidt-Clermont，M．，核酸研究194083-4089(1991)，已引入本文作為參考)。用于植物原生質體中質體轉染的技術已有描述(O’Neill等，植物雜志3(5)729-738(1993)和Koop等，Planta 199193-201(1996)，均全文引入作為參考)。
應用于質體靶向載體中以在植物質體中表達外源基因的一個特別優(yōu)選植物質體啟動子是clpP基因啟動子。clpP基因編碼Clp ATP依賴性蛋白酶的蛋白裂解亞單位，這種蛋白酶在擬南芥屬植物中是在光合成型和非光合成型植物組織的質體中組成型表達的(Shanklin等，植物細胞71713-1722(1995)，已引入作為參考)。clpP還是非光合成植物(如Epifagus virginiana；Morden等，EMBO J 103281-3288(1991))基因組中保留的為數(shù)不多的幾個植物質體基因之一，而已知clpP信息在大麥白色突變株(albostrians)的質體中表達，這種突變體缺乏可檢測的質體翻譯活性(Hubschmann & Borner，植物分子生物學36493-496(1998))。故，clpP啟動子甚至在非綠色質體中似乎也具有轉錄活性。對煙草clpP基因的啟動子區(qū)的鑒定在WO 97／06250(已引入本文為參考)中有述。在這一參考文獻中，煙草clpP基因經鑒定具有可被核編碼質體(NEP)RNA聚合酶和質體編碼質體(PEP)RNA聚合酶識別的5’啟動子序列。由定位于-53位核苷酸(從翻譯起始密碼子ATG向上游)的煙草clpP啟動子序列產生的一種初步轉錄體已在WO 97／06250中得到鑒定，它能在因缺失rpoB基因而缺乏質體編碼的RNA聚合酶的煙草突變體的白化質體中以高水平表達。
一種煙草clpP啟動子序列已用于驅動抗除草劑形式的擬南芥植物原卟啉原IX(“PROTOX”)基因在煙草質體中的表達(WO 97／32011，已引入本文為參考)。取代GUS報道基因的相同構建體已導入煙草質體，證實了clpP驅動的表達不局限于綠色質體，也可發(fā)生于根質體(白色體，造粉體)和花質體(色質體)中。
盡管質體轉化技術顯示了希望，但直到最近，這項技術才應用于除煙草以外的其它植物。國際專利申請第WO 97／32977號(已引入本文作為參考)描述了用于在十字花科，如蕓苔屬植物和擬南芥屬植物中用葉和子葉細胞創(chuàng)造轉質體(transplastomic)植物的方法和組合物。然而，除此之外還需要非煙草植物，尤其擬南芥屬植物的新的質體啟動子序列，這種序列能用于驅動轉基因在擬南芥屬植物及任何其它植物物種的綠色和非綠色質體中進行表達。
從上述角度看，本發(fā)明的目標之一是提供來自擬南芥的能在所有類型質體中發(fā)揮功能的新的質體啟動子。本發(fā)明的另一目標是提供利用質體基因的蛋白質編碼區(qū)分離新的間插調節(jié)序列，如新的啟動子序列或者3’或5’RNA非翻譯序列的方法。本發(fā)明的又一目標是應用新的質體啟動子序列，通過減少質體基因組中天然DNA序列與已插入質體轉化載體的嵌合DNA片段中的外源DNA序列之間不必要的同源重組，而提高質體轉化效率。
本發(fā)明更進一步提供從擬南芥質體clpP基因編碼序列上游的5’側翼區(qū)分離的核酸啟動子。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核酸啟動子實質上類似于SEQ ID NO1第263位核苷酸下游的啟動子序列。在一個更優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的核酸啟動子具有與SEQ ID NO1第263位核苷酸下游之啟動子序列完全相同的序列。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸啟動子實質上類似于SEQ ID NO1。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸啟動子包含在SEQ ID NO1中。在另一實施方案中，本發(fā)明的核酸啟動子包含一段20個堿基對的核苷酸部分，該部分與SEQ ID NO1中一段連續(xù)20個堿基對的核苷酸部分具有相同序列。本發(fā)明還包含嵌合基因，其中本發(fā)明的核酸啟動子與目的基因的編碼序列可操作連接；含有一個這樣的嵌合基因的植物轉化載體；以及分別含有一個這樣的嵌合基因的轉基因植物、植物細胞、植物種子、植物組織、或植物質體。
在另一方面，本發(fā)明提供用于分離兩種質體基因的蛋白質編碼區(qū)之間的間插調節(jié)DNA序列的新方法，該方法包括以下步驟(a)測定兩種質體基因的相對取向以及它們的蛋白質編碼區(qū)的簡并或特異性核苷酸序列；(b)根據(jù)所測兩種質體基因之一的蛋白質編碼區(qū)序列設計第一個簡并或特異性PCR引物；(c)根據(jù)所測兩種質體基因之另一種的蛋白質編碼區(qū)序列設計第二個簡并或特異性PCR引物；(d)用步驟(b)和(c)的引物擴增一段DNA片段，其中所擴增的DNA片段包含兩種質體基因蛋白質編碼區(qū)之間的一段間插調節(jié)DNA序列。
在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述兩種質體基因為clpP基因和psbB基因。根據(jù)這一實施方案，所述間插調節(jié)DNA序列包含一個clpP啟動子。在該方法的另一優(yōu)選實施方案中，所述兩種質體基因為16S rRNA基因和纈氨酸t(yī)RNA基因。根據(jù)這一實施方案，所述間插調節(jié)DNA序列包含一個16S rRNA啟動子。
在另一方面，本發(fā)明提供一種改進的質體轉化法，包括用含有質體活性調節(jié)序列以及與之可操作連接的目的編碼序列的嵌合基因轉化宿主植物的質體，其中所述調節(jié)序列具有與該宿主植物質體中相應天然調節(jié)序列相同性不到90％的核苷酸序列，其中所述嵌合基因中的調節(jié)序列與該宿主植物質體中相應的天然調節(jié)序列之間不理想的體細胞重組已減少。在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，所述嵌合基因分離自該宿主植物的質體基因組，并至少約10％的調節(jié)序列核苷酸已發(fā)生突變。在該方法的另一優(yōu)選實施方案中，所述嵌合基因中的調節(jié)序列分離自不同于宿主的其它植物的質體基因組。例如，所述嵌合基因中的調節(jié)序列可能分離自擬南芥屬植物的質體基因組。在一個特別優(yōu)選實施方案中，所述嵌合基因中的調節(jié)序列是分離自擬南芥屬植物clpP基因編碼序列上游5’側翼區(qū)的核酸啟動子。在另一特別優(yōu)選實施方案中，所述嵌合基因中的調節(jié)序列是分離自擬南芥屬植物16S rRNA基因編碼序列上游5’側翼區(qū)的核酸啟動子。
本發(fā)明的其它目標和便利之處在本領域技術人員研究了以下對本發(fā)明的描述和非限制性實施例之后，將十分明了。
對序列表中序列的描述SEQ ID NO1是擬南芥屬植物clpp基因啟動子區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO2是實施例1中所用引物A_clpP。
SEQ ID NO3是實施例1中所用引物A_psbB。
SEQ ID NO4是實施例2中所用引物Aclp_P1a。
SEQ ID NO5是實施例2中所用引物Aclp_P2b。
SEQ ID NO6是實施例2中所用引物rps 16P_1a。
SEQ ID NO7是實施例2中所用引物rps 16P_1b。
SEQ ID NO8是實施例3中所用頂鏈(top-strand)引物。
SEQ ID NO9是實施例3中所用底鏈(bottom-strand)引物。
SEQ ID NO10是擬南芥屬植物16S rRNA基因啟動子區(qū)的核苷酸序列。
SEQ ID NO11是實施例4中所用頂鏈引物。
SEQ ID NO12是實施例4中所用底鏈引物。
定義為了更明確，對說明書中所用的某些術語作如下定義相關／可操作連接指兩段物理相關或功能相關的核酸序列。例如，若一段啟動子或調節(jié)DNA序列與編碼一段RNA或一種蛋白質的DNA序列可操作連接，或所處位置使該調節(jié)DNA序列能影響該編碼或結構DNA序列的表達水平時，稱這兩種序列“相關”。
嵌合基因／融合序列一段重組核酸序列，其中啟動子或調節(jié)核酸序列與編碼mRNA或表達為蛋白質的核酸序列可操作連接或相關，從而使該調節(jié)核酸序列能調節(jié)所相關核酸序列的轉錄或表達。自然界中，嵌合基因的調節(jié)核酸序列通常不與該相關的核酸序列可操作連接。
編碼序列可轉錄為RNA如mRNA，rRNA，tRNA，snRNA，有義RNA或反義RNA的核酸序列。優(yōu)選該RNA隨后在生物體中被翻譯為蛋白質。
基因基因組中一段特定區(qū)，且除了上述編碼序列以外，還包含其它部分，主要有負責控制表達，即編碼部分的轉錄和翻譯的調節(jié)序列?；蜻€可包含其它5’和3’非翻譯區(qū)以及終止序列。還可能會出現(xiàn)的元件有，例如內含子。
目的基因任何下述基因，當將它們轉移至植物中時，賦予該植物所需特性如抗生素抗性、病毒抗性、昆蟲抗性、疾病抗性、或對其它有害生物的抗性、除草劑耐受性、營養(yǎng)價值提高、工業(yè)化加工中的性能改善或再生能力的改變?！澳康幕颉边€可以是轉移至植物中用于在該植物中生產有商業(yè)價值的酶類或代謝產物的基因。
異源核酸序列一段并非與其將導入之宿主基因組天然相關的核酸序列，包括天然核酸序列的非天然多重拷貝。
同源核酸序列一段與其將導入之宿主基因組天然相關的核酸序列。
同源重組同源核酸分子之間核酸片段的相互交換。
分離的在本發(fā)明的內容中，分離的核酸分子或分離的酶是通過人為手段使其脫離其天然環(huán)境而存在并因此而不屬于自然產物的核酸分子或酶。分離的核酸分子或酶可能以純化形式存在，也可能存在于非天然環(huán)境如轉基因宿主細胞中。
最小啟動子缺乏上游活化作用時沒有活性或啟動子活性大大降低的啟動子元件。在有適當轉錄因子存在時，該最小啟動子能發(fā)揮功能使轉錄進行。
核酸分子／核酸序列可從任何來源分離的單鏈或雙鏈DNA或RNA線性片段。在本發(fā)明中，所述核酸分子優(yōu)選為DNA片段。
植物處于任何發(fā)育階段的任何植物，尤其種子植物。
植物細胞植物的結構和生理單位，包含原生質體和細胞壁。所述植物細胞可能是分離的單細胞或培養(yǎng)細胞形式，或作為較高級單位如植物組織、植物器官、或植物整體的一部分。
植物細胞培養(yǎng)物對植物單位如原生質體、培養(yǎng)細胞、植物組織中的細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子以及處于各種發(fā)育階段的胚的培養(yǎng)物。
植物材料植物的葉、莖、根、花或花的部分、果實、花粉、卵細胞、合子、種子、插條、細胞或組織培養(yǎng)物、或任何其它部分或產物。
植物器官植物中獨立的、具有肉眼可見結構的分化部分，如根、莖、葉、花蕾、或胚。
植物組織本文中指組成一個結構和功能性單位的一組植物細胞。包括植物中的或培養(yǎng)中的任何植物組織。該術語包括，但不限于，整個植物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)物以及組成一定結構和／或功能單位的任意組植物細胞。該術語與上文所列任何特殊類型的植物組織聯(lián)合使用、或在缺乏上文所列任何特殊類型的植物組織時使用、或包含在本定義中時并不打算排除任何其它類型的植物組織。
啟動子編碼區(qū)上游一段非翻譯DNA序列，包含RNA聚合酶II的結合位點，可起始DNA的轉錄。啟動子區(qū)可能還包括能作為基因表達的調節(jié)物發(fā)揮功能的其它元件。
原生質體無細胞壁或只有部分細胞壁的分離的植物細胞。
調節(jié)序列有助于、可提高、或可影響相關的結構核酸序列(編碼蛋白質或其它基因產物)的轉錄、翻譯或表達的一段非翻譯核酸序列。調節(jié)序列包括啟動子。啟動子序列通常位于翻譯序列的5’端，常常是距離翻譯起始點5’端20-100個核苷酸的位置。調節(jié)序列還可包括位于編碼序列5’和3’端、可轉錄但不能翻譯的核酸序列。這些非翻譯RNA通常參與基因表達的轉錄后調節(jié)。
實質上相似對核酸而言，是與參照核酸分子有至少60％序列相同的核酸分子。在一個優(yōu)選實施方案中，一段實質上相似的DNA序列與參照DNA序列至少80％相同；在一個更優(yōu)選實施方案中，一段實質上相似的DNA序列與參照DNA序列至少90％相同；在一個最優(yōu)選實施方案中，一段實質上相似的DNA序列與參照DNA序列至少95％相同。一段實質上相似的核苷酸序列通?？膳c參照核酸分子，或它們的片段在下述條件下雜交在7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0．5M NaPO4pH 7．0，1mM EDTA，50℃雜交；用2X SSC，1％ SDS，在50℃漂洗。對蛋白質或肽而言，一段實質上相似的氨基酸序列是與參照蛋白質或肽的氨基酸序列至少90％相同，并具有與參照蛋白質或肽實質上相同的活性的氨基酸序列。
耐受性當接觸抑制物或除草劑時能繼續(xù)正常生長或發(fā)揮正常功能的能力。
轉化將外源DNA導入細胞、組織、或植物，包括植物質體的過程。轉化的細胞、組織或植物均理解為不僅包含轉化過程的終產物，還包含它們的轉基因后代。
轉化的／轉基因的／重組的指導入了異源核酸分子的宿主生物體如細菌或植物。該核酸分子可穩(wěn)定整合至該宿主的基因組中，或該核酸分子還可作為染色體外分子存在。這類染色體外分子可自我復制。轉化的細胞、組織、或植物均理解為不僅包含轉化過程的終產物，還包括它們的轉基因后代。“非轉化的”、“非轉基因的”或“非重組的”宿主指不包含異源核酸分子的野生型生物體如細菌或植物。
核苷酸用它們的堿基表示，堿基縮寫標準如下腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、和鳥嘌呤(G)。氨基酸也類似地用以下縮寫表示丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、組氨酸(His；H)、異亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、賴氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、絲氨酸(Ser；S)、蘇氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、和纈氨酸(Val；V)。此外，(Xaa；X)代表任何氨基酸。
本發(fā)明提供了來自擬南芥質體基因組、可編碼Clp ATP-依賴性蛋白酶之植物類似物的clpP基因的啟動子區(qū)。所公開的啟動子可用于驅動轉基因植物質體中選擇性標記基因或其它目的基因的編碼序列的表達。本發(fā)明的啟動子十分有用于轉基因在綠色和非綠色質體中的組成型表達，并因此特別有用于植物如玉米中的質體轉化，其中對可再生轉化體的選擇需要在非綠色組織中選擇。
本發(fā)明的擬南芥屬植物clpP啟動子可根據(jù)本領域已知的方法摻入質體轉化載體并轉化進質體中，所述方法尤其包括美國專利第5，451，513、5，545，817、5，545，818和5，576，198；國際專利申請第WO 95／16783、WO 97／32011和WO 97／32977；以及Svab等(1993)和McBride等(1994)。
本發(fā)明還提供應用質體基因的蛋白質編碼區(qū)分離新的間插調節(jié)序列，如新的啟動子或者3’或5’UTR的新方法。本申請人用于分離擬南芥質體clpP啟動子區(qū)和擬南芥質體16S rRNA啟動子區(qū)的技術(如下文實施例所詳述)是這類方法的具體實施。簡之，當擬南芥屬質體基因組中的基因順序相對于煙草(其完整質體基因組序列均已知的一種植物)的基因順序為保守時可便于這些啟動子區(qū)的分離。在煙草中，clpP的取向與psbB基因(其編碼序列在很多植物物種之間是保守的)相背離。由于煙草中psbB起始密碼子與取向相背離的clpP起始密碼子之間只分隔445個堿基對，故相背離的clpP和psbB基因的蛋白質編碼區(qū)序列可用于設計經PCR擴增這些基因之間非編碼區(qū)的引物。該區(qū)包括在一個方向上的psbB啟動子和在另一方向上的clpP啟動子。在表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了擬南芥屬植物的EST序列，它似乎包括clpP編碼序列的一部分以及5’非翻譯RNA(5’UTR)?？筛鶕?jù)擬南芥屬植物DNA序列中編碼clpP蛋白質假定起始區(qū)的序列，用所述EST序列設計用于對clpP啟動子進行PCR擴增的引物。這些引物與經設計和psbB起始密碼子附近高度保守DNA序列匹配的序列可配對。應用這些引物可從擬南芥屬植物的總DNA中擴增出包括擬南芥屬植物質體clpp啟動子區(qū)的一段近500個核苷酸的DNA片段。一段包括擬南芥屬植物質體16S rRNA啟動子區(qū)的DNA片段可通過類似方法擴增。
應用上述方法，本領域一般技術人員可利用兩個非常接近的質體基因的蛋白質編碼區(qū)，從任何植物的質體基因組中分離間插非翻譯序列，如啟動子以及其它調節(jié)序列。優(yōu)選兩個質體基因相互比鄰，使這兩個接近的質體基因之間沒有其它被轉錄序列；但可以預見，即使在這兩個接近的質體基因之間的擴增區(qū)內存在一個小基因如編碼tRNA的基因，該方法也能實行。在一個優(yōu)選實施方案中，本領域的一般技術人員可應用上述方法從任何植物的質體基因組中分離質體clpP啟動子。在另一優(yōu)選實施方案中，本領域的一般技術人員可應用上述方法從任何植物的質體基因組中分離質體16S rRNA啟動子。
本發(fā)明還提供應用新的質體啟動子如擬南芥屬植物質體clpP或16S rRNA啟動子，通過減少質體基因組中天然DNA序列與插入質體轉化載體內的嵌合DNA片段中所含外源DNA序列之間不必要的重組，而提高質體轉化效率的方法。已知質體基因組中的天然DNA序列與外源DNA序列之間的同源區(qū)相對較短也能最終導致在質體轉化體中發(fā)生體細胞重組。這一生物學特性甚至已作為一種方法用于通過使選擇性標記側翼帶有相同的重復異源DNA序列而使這些選擇性標記從綠藻-衣藻葉綠體的質體轉化體中除去。盡管既沒有鑒別出發(fā)生重組需要的同源片段最小大小，也沒有鑒別出足以發(fā)生重組的具體同源片段中序列相同性精確程度，但與質體基因組有少至50bp的同源片段可能就足以誘導重組。這些重組事件可在轉基因植物中觀察，如已發(fā)生質體基因組重排的細胞分裂后使葉片產生白化區(qū)。在更極端的實例中，葉子幾乎全部白化，只剩下小片綠色，說明大多數(shù)體細胞及它們的子代均發(fā)生了重組。
非重組性的調節(jié)序列(如啟動子以及5’和3’UTR區(qū))的基本特征包括控制外源基因在目的植物物種的質體中正確表達的能力，以及缺乏啟動同源質體重組所需的足夠序列相同性。后一特征可通過應用來自不同植物(因序列差異使相同性不到85-90％)質體基因組的異源調節(jié)序列獲得，或可以通過使同一植物物種的質體基因組的天然調節(jié)序列發(fā)生足夠多的突變而獲得。在一個實施方案中，該方法涉及利用本發(fā)明的擬南芥屬植物clpP啟動子指導目的基因在異源植物物種如煙草、玉米、水稻、大豆、西紅柿、馬鈴薯、或其它植物的質體中轉錄。在另一實施方案中，該方法涉及利用實施例中所述擬南芥屬植物的16S rRNA啟動子指導目的基因在異源植物物種如煙草、玉米、水稻、大豆、西紅柿、馬鈴薯、或其它植物的質體中轉錄。除了高等植物質體基因，對質體轉基因的非重組性調節(jié)十分有效的異源啟動子或者5’和3’UTR區(qū)也可從較低等植物或藻類的質體基因、藍細菌的染色體基因、或感染植物或藻類葉綠體或藍細菌細胞的病毒的基因組獲得。
選擇同一植物中已突變不能進行不必要重組的天然基因時，可對調節(jié)序列隨機誘變以使相對于最初序列的序列相同性下降至多達90％而使選擇更加容易。通過將各突變體克隆到在質體中起作用的選擇標記基因上游，然后將整個嵌合DNA群體轉化至野生型植物的質體中，選擇出隨機突變調節(jié)序列群中仍有質體活性(能在植物質體中發(fā)揮正常作用)的亞群。只有那些仍然能在質體中發(fā)揮功能的突變序列可使所述選擇性標記在轉基因植物中表達。還可通過觀察葉片扇形分區(qū)的頻率對表達所述選擇性標記的轉基因植物進行體細胞重組評估。表達選擇性標記并具有所需葉片扇形分區(qū)頻率的轉化植物的質體基因組打靶區(qū)隨后經測序確定其存在何種突變的調節(jié)序列。該突變序列因此符合控制目的基因在質體中表達，并具有相對于天然質體DNA序列足夠的序列差異以降低不必要重組頻率的標準。
實施例本發(fā)明進一步參照以下詳述的實施例進行描述。這些實施例意在舉例說明，并非限制，除非有特別說明。在此所用的標準重組DNA和分子克隆技術為本領域已知并述于Ausubel(編)，分子生物學最新方案，John Wiley ＆ Sons，Inc．(1994)；T．Maniatis，E．F．Fritsch＆ J．Sambrook，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)；和T．J．Silhavy，M．L．Berman ＆ L．W．Enquist，基因融合實驗，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1984)。
實施例1擬南芥屬植物clpP啟動子區(qū)的分離因擬南芥屬質體基因組中的基因順序恰好相對于煙草(其完整質體基因組序列均已知的一種植物)的基因順序比較保守，這有利于擬南芥屬植物clpP啟動子區(qū)的分離。在煙草中，clpP的取向與psbB基因相背離，psbB基因已從多種植物物種中測序得到并顯示為保守序列。對煙草、玉米、小麥和Nicotiana acumina的psbB序列進行比對，顯示最初8個氨基酸如它們的DNA編碼序列一樣是完全保守的。在煙草中，只有445個堿基對使psbB起始密碼子與取向背離的clpP的起始密碼子隔開。
鑒于上述，本申請人推測取向背離的clpP基因和psbB基因的蛋白質編碼區(qū)序列可用于設計引物，用于PCR擴增這些基因之間的間插非編碼區(qū)。理論上，這一區(qū)將包括在一個方向上的psbB啟動子以及在另一方向上的clpP啟動子。在TIGR NHC AtEST數(shù)據(jù)庫(http／／www．tigr．org)中發(fā)現(xiàn)了擬南芥屬植物可表達序列標記(EST)序列，該序列似乎包括clpP編碼序列的一部分以及5’非翻譯RNA(5’UTR)。由于該序列的假定翻譯過程與大腸桿菌成熟clpP的相似，并因此似乎不包括質體轉位肽，因而推定該EST(TIGR NHC AtEST數(shù)據(jù)庫中SeqID#P_3982)代表質體clpP信號的一部分。然而，因Shanklin等(1995)已提出，擬南芥屬植物中有可能存在核編碼的clpP同系物，本申請人對這些基因的發(fā)現(xiàn)比對真正質體所編碼基因的發(fā)現(xiàn)更為謹慎。由于由定義可知EST源自所表達的信號，因而預計ESTP_3982不包括任何不轉錄的clpP啟動子區(qū)。
ESTP_3982的核苷酸序列可用于根據(jù)擬南芥屬植物中編碼clpP蛋白起點的DNA序列設計引物用于經PCR擴增clpP啟動子。這些引物與經設計和psbB起始密碼子附近的高度保守DNA序列相匹配的序列可配對，申請人推測這些序列在擬南芥屬植物中具有相似保守性。所用引物為A_clpP5＇-AAGGGACTTTTGGAACGCCAATAGGCAT-3＇(SEQ ID NO2)A_psbB5＇-CACGATACCAAGGCAAACCCATGGA-3＇(SEQ ID NO3)。
這些引物用Pfu熱穩(wěn)定性DNA聚合酶成功地從擬南芥(栽培品種“Landsburg erecta”)的總DNA中擴增得到約500個核苷酸的一個DNA片段。所述平端DNA片段從兩端直接測序(用克隆引物)并隨后克隆至載體pGEM5Zf(-)的EcoRV位點，構建質粒pPH146b。這一約500bp的PCR片段的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。序列分析揭示與煙草clpP啟動子區(qū)中從clpP起始密碼子向上游延伸的一個約200bp區(qū)具有86％的序列相同性。因此，SEQ ID NO1包括擬南芥clpP啟動子區(qū)。
實施例2制備在質體轉化載體中包含擬南芥clpP啟動子和與GUS報道基因融合的天然clpP 5’非翻譯序列以及煙草質體rps 16基因之3’非翻譯序列的嵌合基因I．擬南芥質體clpP基因啟動子和完整的5’非翻譯RNA(5’UTR)的擴增。
以質粒pPH146b的DNA為模板，用在相對于擬南芥屬質體clpP基因ATG起始密碼子的第-234位核苷酸(SEQ ID NO1的第263位核苷酸)處引入EcoRI限制位點的一種從左向右“頂鏈”引物(引物Aclp_P1a5’-GCGGAATTCATCATTCAGAAGCCCGTTCGT-3’(SEQ ID NO4；下劃線為EcoRI限制性位點))和與相對于clpP啟動子ATG起始密碼子的-21至-1區(qū)同源、在翻譯起始點引入BspHI限制性位點的一種從右向左“底鏈”引物(引物Aclp_P2b5’-GCGTCATGAAATGAAAGAAAAAGAGAAT-3’(SEQ ID NO5；下劃線為BspHI限制性位點))進行PCR。該PCR反應用Pfu熱穩(wěn)定性DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla CA)在Perkin Elmer 480型熱循環(huán)儀上按廠家(Perkin Elmer／Roche，Branchburg，NJ)建議的條件如下進行95℃ 7分鐘，然后按95℃ 1分鐘／43℃ 2分鐘／72℃ 1分鐘進行4個循環(huán)，再按95℃ 1分鐘／55℃ 2分鐘／72℃ 1分鐘進行25個循環(huán)。一種包含擬南芥屬clpP基因的啟動子和5’非翻譯區(qū)、并在ATG附近有兩處變化以與煙草clpP序列5’UTR一致的250bp擴增產物(其左端有EcoRI位點，其右端有BspHI位點)用標準過程凝膠電泳純化，并用EcoRI和BspHI(所有限制酶可從New England Biolabs，Beverly，MA購買)消化。
II．煙草質體rps 16基因3’非翻譯RNA序列(3’UTR)的擴增。
以煙草栽培品種“Xanthi NC”的總DNA為模板，用在緊鄰編碼核糖體蛋白S16之質體rps 16基因的TAA終止密碼子之后引入XbaI限制性位點的一種從左向右“頂鏈”引物(引物rps 16P_1a5'-GCGTCTAGATCAACCGAAATTCAATTAAGG-3’(SEQ ID NO6；下劃線為XbaI限制性位點))和與相對于rps 16之TAA終止密碼子+134至+151的區(qū)同源、在rps 16之3’UTR的3’端引入HindIII限制性位點的一種從右向左“底鏈”引物(引物rps 16P_1b5'-CGCAAGCTTCAATGGAAGCAATGATAA-3’(SEQ ID NO7；下劃線為HindIII限制性位點))如上述進行PCR。包含rps 16基因之3’非翻譯區(qū)、并包含與煙草質體DNA序列(Shinozaki等，1986)中第4943-5093位核苷酸相應的區(qū)的擴增產物(其左端有XbaI位點，其右端有HindIII位點)經凝膠電泳純化并用XbaI和HindIII消化。III．GUS報道基因片段與cipP基因啟動子以及5’和3’UTR的連接。
質粒pRAJ275(Clontech)在其ATG起始密碼子處包含一個NcoI限制性位點，在其天然3’UTR之后包含一個XbaI位點。用NcoI和XbaI消化該質粒產生一種1864bp的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)報道基因片段。將該片段與上述250bp的擬南芥屬clpP啟動子EcoRI／BspHI片段、157bp的煙草rps 16之3’UTR XbaI／HindIII片段、以及克隆載體pGEM3Zf(-)(Promega，Madison WI)的3148bpEcoRI／HindIII片段用一個四步反應連接，以構建質粒pPH165。質粒pPRVllla(Zoubenko等，1994)用EcoRI和HindIII消化，將所得7287bp的片段與pPH165的2222bp EcoRI／HindIII片段連接，構建成質體轉化載體pPH166。實施例3擬南芥屬16S rRNA基因啟動子區(qū)的分離因擬南芥屬質體基因組中的基因順序恰好相對于煙草(其完整質體基因組均已知的一種植物)的基因順序保守，這有利于擬南芥屬16SrRNA基因啟動子區(qū)的分離。在與擬南芥屬親緣關系很接近的歐白芥中，16S rRNA基因以及纈氨酸t(yī)RNA的取向與在煙草中的(GeneBank錄入號CHSARRN1)相同。以擬南芥(cv“Landsburg erecta”)的總DNA為模板，用在煙草以及歐白芥(Sinapis alba)中均保守的下述引物“頂鏈”引物(5’-CAGTTCGAGCCTGATTATCC-3’(SEQ ID NO8))和“底鏈”引物(5’-GTTCTTACGCGTTACTCACC-3’(SEQ ID NO9))，經PCR擴增(Pfu Turbo DNA聚合酶，Stratagene，La Jolla，CA)分離擬南芥屬16S rRNA基因啟動子區(qū)。將包含對應于煙草質體基因組(Shinozaki等，1986)第102508-102872位核苷酸的擬南芥屬16SrRNA基因啟動子區(qū)的預計379bp(以歐白芥序列計)的擴增產物經鈍端連接至pGEM5Zf(-)(Promega)的EcoRV位點，以構建pArab 16S，進行測序分析并與煙草16S rRNA啟動子比較。擬南芥屬16S rRNA基因啟動子區(qū)的產物為369bp，示于SEQ ID NO10。實施例4制備在質體轉化載體中包含與煙草rbcL基因的核糖體結合位點、GUS報道基因融合的擬南芥屬16S rRNA基因啟動子和天然5’非翻譯序列以及煙草質體rps 16基因之3’非翻譯序列的嵌合基因I．擬南芥屬質體16S rRNA基因啟動子和天然5’非翻譯序列(5’UTR)的擴增以及與煙草rbcL基因之核糖體結合位點的融合。
以質粒pArab 16S的DNA為模板，用在16S rRNA基因啟動子區(qū)的5’端(SEQ ID NO10的第63位)引入EcoRI限制性位點的“頂鏈”引物(5’-GCCGGAATTCTCGCTGTGATCGAATAAGAATG-3’(SEQ ID NO11；下劃線為EcoRI限制性位點))進行PCR擴增?！暗祖湣币镅由熘?6SrRNA基因啟動子5’非翻譯區(qū)的第172位(SEQ ID NO10)，通過改變第151位(T變?yōu)镚)(SEQ ID NO10)、第158位(A變?yōu)镃)(SEQID NO10)和第167位(A變?yōu)镃)(SEQ ID NO10)使轉錄起始位點下游的三個ATG發(fā)生突變，使煙草rbcL基因的核糖體結合位點(第57569-57585位)(Shinozaki等，1986)作為5’延伸與16S rRNA基因5’UTR的3’端融合，并在核糖體結合位點的3’端引入BspHI位點(5’-GCCTTCATGAATCCCTCCCTACAACTATCCAGGCGCTTCAGATTCGCCTGGAGTT-3’(SEQ ID NO12；下劃線為BspHI限制性位點))。PCR擴增用Pfu Turbo DNA聚合酶試劑盒(Stratagene)進行。包含擬南芥屬16S rRNA基因啟動子和三個ATG突變了的5’非翻譯區(qū)以及煙草rbcL基因核糖體結合位點的145bp擴增產物經凝膠電泳純化，并用EcoRI和BspHI消化，產生一種131bp的產物。II．將擬南芥屬16S rRNA基因啟動子、5’UTR和煙草rbcL基因之核糖體結合位點與GUS報道基因和煙草質體rps 16基因3’非翻譯區(qū)(3’UTR)在質體轉化載體中連接。
質粒pRAJ275(Clontech)在ATG起始密碼子處有一個NcoI限制性位點，在終止密碼子之后有一個XbaI位點。該質粒用NcoI和XbaI消化產生一個1864bp的b-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)報道基因片段。將該片段與131bp擬南芥屬16S rRNA基因啟動子、5’UTR和煙草rbcL核糖體結合位點EcoRI／BspHI片段、實施例2所述煙草rps 16之3’UTR XbaI／HindIII片段、以及克隆載體pGEM3Zf(-)(Promega，MadisonWI)的3148bp EcoRI／HindIII片段用一個四步反應連接。上述構建體用EcoRI和HindIII消化，將所得2．1kb片段與質粒pPRVllla(Zoubenko等，1994)的7．3kb EcoRI／HindIII片段連接，構建成一種質體轉化載體。實施例5對煙草質體基因組的biolistic轉化將煙草栽培品種‘Xanthi nc’的種子按1”環(huán)形陣列播種在T瓊脂培養(yǎng)基上，每平板播7個，使之發(fā)芽。播種12-14天后，用包被了實施例2和4所述質粒之DNA的1μm鎢粒子(M10，Biorad，Hercules，CA)基本上按Svab，Z．& Maliga，P．((1993)PNAS 90，913-917)所述轟擊。轟擊過的幼苗在T培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，然后切下葉子，將其離軸側朝上置于含有500μg／ml壯觀霉素二鹽酸鹽(Sigma，St．Louis，MO)的RMOP培養(yǎng)基平板上在光(350-500μmol光子／m2／s)中生長(Svab，Z．，Hajdukiewica，P．& Maliga，P．(1990)PNAS87，8526-8530)。將轟擊3-8周后變白的葉子下出現(xiàn)的抗性苗在同樣的選擇性培養(yǎng)基上再次克隆培養(yǎng)，使之形成愈傷組織，并對次級苗進行分離和再克隆。不同亞克隆中轉化的質體基因組拷貝(同質)的徹底分離通過Southern印跡的標準技術(Sambrook等，(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港)進行評估。BamHI／EcoRI消化的細胞總DNA(Mettler，I．J．(1987)plant Mol Biol Report 5，346-349)在1％ Tris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠上分離，轉移至尼龍膜(Amersham)并用32P-標記的隨機引發(fā)DNA序列探測，其中所述探測序列對應于pC8中含有rps7／12質體打靶序列的0．7kb BamHI／HindIII DNA片段。同質苗經無菌操作扎根于含有壯觀霉素的MS／IBA培養(yǎng)基(McBride，K．E．等(1994)PNAS 91，7301-7305)上并轉移至溫室。
對本文所述本發(fā)明的各種改變是本領域技術人員顯而易見的。這些改變均將包含在所附權利要求書的范圍內。
序列表<110>Novartis AG<120>新的植物質體啟動子序列<130>PH／5-30422／CGC 1988<140><141><160>12<170>PatentIn Ver．2．0<210>l<211>499<212>DNA<213>擬南芥<220><221>misc feature<222>(497)．．(499)<223>clpP ATG起始密碼子<220><221>misc feature<222>((6)．．(8))的互補物<223>psbB ATG起始密碼子<400>laaacccatgg aaatacccct ttatcaacga aaaatagaca ctatgtaact ttattgcatt 60ggaaaaaact atgctacgta cccccccttt ttaggtaatt atttcggaga aaggattaat 120atttgttcta ttctgttagt aataatggaa caattcaatt catagaaaaa aagggaagcg 180gatctattct atatccgata agtaccaata tgcaatgggg gttaatccta ttttctatga 240accaagatag ctattgttgt tgatcattca gaagcccgtt cgtaaaaaat ttcctttagt 300tttattcatt ctctcttact ttacttttat tttatatttt attttagctt attcaactta 360tgtattaaat atcattaatt taaatatgat taataaagta ggaaaaaagg ataatagtat 420taaaaaacga aaccccaatt ttacgtttcc acatcaaagt gaaatagaga acttcattct 480cttttttttt catttcatg 499<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自ESTP_3982的A_clpP PCR引物<400>
aagggacttt tggaacgcca ataggcat 28<210>3<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自psbB起始密碼子附近的保守DNA序列的A_psbB PCR引物<400>3cacgatacca aggcaaaccc atgga 25<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述Aclp_P1a引物<400>4gcggaattca tcattcagaa gcccgttcgt 30<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述Aclp_P2b引物<400>5
gcgtcatgaa atgaaagaaa aagagaat 28<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述rps 16P_1a引物<400>6gcgtctagat caaccgaaat tcaattaagg30<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述rps 16_1b引物<400>7cgcaagcttc aatggaagca atgataa 27<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述頂鏈引物<400>8cagttcgagc ctgattatcc 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述底鏈引物<400>9gttcttacgc gttactcacc 20<210>10<211>369<212>DNA<213>擬南芥<400>10cagttcgagc ctgattatcc ctaaacccaa tgaatgtgag tttttctatt ttgacttgct 60ccctcgctgt gatcgaataa gaatggataa gaggctcgtg ggattgacgt gagggggtag 120gggtagctat atttctggga gcgaactcca tgcgaatatg aagcgcatgg atacaagtta 180tgacttggaa tgaaagacaa ttccgaatca gctttgtcta cgaagaagga agctataagt 240aatgcaacta tgaatctcat ggagagttcg atcctggctc aggatgaacg ctggcggcat 300gcttaacaca tgcaagtcgg acgggaagtg gtgtttccag tggcggacgg gtgagtaagg 360cgtaagaac 369<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述頂鏈引物<400>11gccggaattc tcgctgtgat cgaataagaa tg 32<210>12<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述底鏈引物<400>12gccttcatga atccctccct acaactatcc aggcgcttca gattcgcctg gagtt 5權利要求
1．一種核酸分子，其包含從擬南芥屬質體clpP 基因的編碼序列上游5’側翼區(qū)分離的核酸啟動子。
2．權利要求1的核酸分子，其中所述核酸啟動子實質上類似于SEQID NO1的第263位核苷酸下游的啟動子序列。
3．權利要求1的核酸分子，其中所述核酸啟動子與SEQ ID NO1的第263位核苷酸下游的啟動子序列具有序列相同性。
4．權利要求1的核酸分子，其中所述核酸啟動子實質上類似于SEQID NO1。
5．權利要求1的核酸分子，其中所述核酸啟動子包含在SEQ ID NO1中。
6．權利要求1的核酸分子，其中所述核酸啟動子包含一段20個堿基對的核苷酸部分，該部分與SEQ ID NO1中一段20個堿基對的連續(xù)核苷酸部分具有相同序列。
7．一種嵌合基因，其包含與目的基因編碼序列可操作連接的權利要求1之核酸分子。
8．一種包含權利要求7的嵌合基因的植物轉化載體。
9．包含權利要求7的嵌合基因的轉基因植物、植物細胞、植物種子、植物組織、或植物質體。
10．一種分離兩種質體基因蛋白質編碼區(qū)之間的間插調節(jié)DNA序列的方法，其包括以下步驟(a)測定兩種質體基因蛋白質編碼區(qū)的相對取向以及簡并或特異性核苷酸序列；(b)根據(jù)所測得兩種質體基因之一的蛋白質編碼區(qū)序列設計一個簡并或特異性第一PCR引物；(c)根據(jù)所測得兩種質體基因之另一基因的蛋白質編碼區(qū)序列設計一個簡并或特異性第二PCR引物；(d)用步驟(b)和(c)的引物擴增一段DNA片段，其中所擴增的DNA片段包含所述兩種質體基因的蛋白質編碼區(qū)之間的間插調節(jié)DNA序列。
11．權利要求10的方法，其中所述兩種質體基因是clpP基因和psbB基因。
12．權利要求11的方法，其中所述間插調節(jié)DNA序列包含clpP啟動子。
13．權利要求10的方法，其中所述兩種質體基因是16S rRNA基因和纈氨酸t(yī)RNA基因。
14．權利要求13的方法，其中所述間插調節(jié)DNA序列包含16S rRNA啟動子。
15．一種改進的質體轉化方法，其中包括用含有與目的編碼序列可操作連接之質體活性調節(jié)序列的嵌合基因轉化宿主植物物種的質體，其中所述調節(jié)序列的核苷酸序列與該宿主植物質體中相應天然調節(jié)序列不足約90％相同，從而所述嵌合基因中的該調節(jié)序列與該宿主植物質體中相應天然調節(jié)序列之間的不必要體細胞重組有所降低。
16．權利要求15的方法，其中所述嵌合基因中的所述調節(jié)序列分離自該宿主植物物種的質體基因組，而且該調節(jié)序列的至少約10％的核苷酸已被突變。
17．權利要求15的方法，其中所述嵌合基因中的所述調節(jié)序列分離自與該宿主植物物種不同的植物物種中的質體基因組。
18．權利要求17的方法，其中所述嵌合基因中的所述調節(jié)序列分離自擬南芥屬植物的質體基因組。
19．權利要求18的方法，其中所述嵌合基因中的所述調節(jié)序列是分離自擬南芥屬質體clpP基因編碼序列上游5’側翼區(qū)的核酸啟動子。
20．權利要求18的方法，其中所述嵌合基因中的所述調節(jié)序列是分離自擬南芥屬質體16S rRNA基因編碼序列上游5’側翼區(qū)的核酸啟動子。
全文摘要
本發(fā)明描述了從擬南芥屬質體clpP基因編碼序列上游5’側翼區(qū)分離的一種新啟動子。本發(fā)明還描述了應用質體基因的蛋白質編碼區(qū)分離間插調節(jié)序列的新方法以及應用與天然質體啟動子在核苷酸序列方面有所不同的外源質體啟動子提高質體轉化效率的新方法。
文檔編號C12N9/64GK1292825SQ99803825
公開日2001年4月25日 申請日期1999年3月9日 優(yōu)先權日1998年3月11日
發(fā)明者P·B·海費茨 申請人:諾瓦提斯公司