專(zhuān)利名稱(chēng)：植物細(xì)胞聚集體和植物組織的觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及其植物的再生的制作方法
介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及其植物的再生本發(fā)明涉及用細(xì)長(zhǎng)針狀微纖維或“觸須(whisker)”轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞聚集體和所選植物組織的方法。
直到最近，基因工程處理的植物幾乎完全被限制于那些應(yīng)用傳統(tǒng)培育方法產(chǎn)生的植物。由于鑒定、雜交和將基因穩(wěn)定到基因組中由此產(chǎn)生預(yù)期性狀所需的費(fèi)用和時(shí)間問(wèn)題，通過(guò)培育產(chǎn)生新植物品種主要局限于農(nóng)業(yè)上最重要的農(nóng)作物，如谷物。相比之下，基因工程的出現(xiàn)已將許多不同的異源基因及性狀以更迅速的方式引入了不同農(nóng)作物，包括谷物、棉花、大豆、小麥、稻、向日葵和canola。不過(guò)，由于生產(chǎn)商用可存活原種、品系需組織培養(yǎng)和回交，將新轉(zhuǎn)基因整合入原種種質(zhì)內(nèi)依然是一項(xiàng)費(fèi)勁的工作。
有幾種技術(shù)可用于將含異源目的基因的外源重組載體引入植物細(xì)胞、使植物再生、穩(wěn)定整合和在其中表達(dá)。其中一項(xiàng)技術(shù)涉及將遺傳物質(zhì)包被的微粒直接加速進(jìn)入植物細(xì)胞(Cornell的美國(guó)專(zhuān)利4945050；DowElanco的美國(guó)專(zhuān)利5141131；和Dekalb的美國(guó)專(zhuān)利5538877及5538880)。此技術(shù)通常稱(chēng)為“微粒轟擊”或biolistics”。也可用農(nóng)桿菌技術(shù)轉(zhuǎn)化植物(Toledo大學(xué)的美國(guó)專(zhuān)利5177010；Texas A&M的5104310；Schilperoot的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0131624B1，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)120516，159418B1和176112；Schilperoot的美國(guó)專(zhuān)利5149645，5469976，5464763和4940838和4693976；Max Planck的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)116718，290799，320500；Japan Tobacco的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)604662，627752和美國(guó)專(zhuān)利5591616；Ciba-Geigy的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0267159和0292435及美國(guó)專(zhuān)利5231019；Calgene的美國(guó)專(zhuān)利5463174和4762785；及Agracetus的美國(guó)專(zhuān)利5004863和5159135)。另一轉(zhuǎn)化方法涉及利用細(xì)長(zhǎng)針狀微纖維或“觸須”轉(zhuǎn)化細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物(Zeneca的美國(guó)專(zhuān)利5302523和5464765)。此外，電穿孔技術(shù)也已用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，由此已得到可育的植物(Boyce Thompson研究所的WO87／06614；Dekalb的5472869和5384253；Plant Genetic Systems的5679558，5641664，WO9209696和WO9321335)。
盡管有上述所有技術(shù)成就，商用可存活原種、種質(zhì)轉(zhuǎn)基因植物的遺傳轉(zhuǎn)化和常規(guī)生產(chǎn)依然是費(fèi)勁的工作。例如微粒轟擊能用于個(gè)體細(xì)胞、細(xì)胞聚集體或植物組織，但它要求制備附著DNA的金顆粒及對(duì)昂貴且尚未廣泛應(yīng)用的“槍”設(shè)備最優(yōu)化。涉及農(nóng)桿菌的技術(shù)特別受限制，因?yàn)椴皇撬形锓N和給定物種內(nèi)的變種均對(duì)該細(xì)菌的感染敏感。
由于從不同植物種類(lèi)及其組織常規(guī)制備原生質(zhì)體一般會(huì)遇到極大的困難和花費(fèi)，且伴隨著生存能力低和與此相關(guān)的轉(zhuǎn)化率低，所以電穿孔技術(shù)也非優(yōu)選。
正如此處所公開(kāi)的，申請(qǐng)者已發(fā)明了一種可利用觸須將含所選基因的重組載體直接且花費(fèi)較少地轉(zhuǎn)化到來(lái)自非原種或原種種質(zhì)之植物細(xì)胞聚集體和植物組織的方法。申請(qǐng)人的發(fā)明以其簡(jiǎn)單、快速和方便使用而優(yōu)于目前使用的方法。而且，申請(qǐng)人的發(fā)明比本領(lǐng)域所述的其他方法優(yōu)越，因?yàn)樗鼰o(wú)需建立Ⅲ型的愈傷組織培養(yǎng)物或建立和維持細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物，并可用于Ⅰ型或Ⅱ型愈傷組織，從而更少種質(zhì)局限性。按本文所述，這意味著申請(qǐng)人的發(fā)明可直接用于轉(zhuǎn)化原種基因型，從而消除了通常與基因整合相關(guān)的問(wèn)題和時(shí)間。
本發(fā)明涉及含異源DNA的可育轉(zhuǎn)基因玉米(Zea mays)植物的生產(chǎn)，該異源DNA優(yōu)選整合入所述植物的染色體且可被其后代所繼承。
本發(fā)明的一方面涉及含所說(shuō)異源DNA之玉米植物、植物部分、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞聚集體和來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物的種子。
本發(fā)明也涉及含異源DNA的可育轉(zhuǎn)基因稻(Oryza sativa L．)植物的生產(chǎn)，該異源DNA優(yōu)選整合入所述植物的染色體且可被其后代所繼承。
本發(fā)明的另一方面涉及含所說(shuō)異源DNA之稻植物、植物部分、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞聚集體和來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物的種子。
本發(fā)明還涉及含異源DNA的可育轉(zhuǎn)基因陸地棉(Gossypiumhirsutum L．)植物的生產(chǎn)，該異源DNA優(yōu)選整合入這類(lèi)植物的染色體且可被其后代所繼承。
本發(fā)明的另一方面涉及含所說(shuō)異源DNA之陸地棉植物纖維、植物、植物部分、植物細(xì)胞、植物細(xì)胞聚集體和來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物的種子。
本發(fā)明還涉及用觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法從Ⅰ型愈傷組織、Ⅱ型愈傷組織、下胚軸衍生愈傷組織或子葉衍生愈傷組織生產(chǎn)可育的轉(zhuǎn)化植物的方法。
本發(fā)明還涉及用觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法從分生組織生產(chǎn)可育的轉(zhuǎn)化植物的方法。
本發(fā)明的另一方面涉及從Ⅰ型或Ⅱ型愈傷組織再生的可育成熟玉米植物及由其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子。
本發(fā)明的另一方面涉及從Ⅰ型愈傷組織再生的可育成熟稻植物及由其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子。
還有，本發(fā)明的另一方面涉及從下胚軸衍生或子葉衍生愈傷組織再生的可育成熟棉花植物及由其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因種子和纖維。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)觸須介導(dǎo)細(xì)胞穿孔和異源DNA攝入的方法產(chǎn)生此處所述的可育轉(zhuǎn)基因植物，該觸須介導(dǎo)的細(xì)胞穿孔對(duì)植物細(xì)胞聚集體和植物組織進(jìn)行，然后用受到控制的方案選擇和生產(chǎn)轉(zhuǎn)化植物品系。
本發(fā)明的其他方面、實(shí)施方案、優(yōu)越性和特性將由以下說(shuō)明更顯而易見(jiàn)。
本發(fā)明涉及通過(guò)觸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，用目的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化例如玉米、稻、陸地棉和蔓菁的植物細(xì)胞聚集體和植物組織從而產(chǎn)生所說(shuō)物種的可育轉(zhuǎn)基因植物及種子的方法。轉(zhuǎn)化后，由該轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞聚集體和植物組織再生轉(zhuǎn)基因植物，該再生植物表達(dá)嵌合的目的DNA構(gòu)建體。此處用所述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物包括所有的玉米種類(lèi)，包括但不局限于飼料用玉蜀黍、爆裂種玉米、甜玉米、硬質(zhì)種玉米、臼齒形玉米等等；所有的棉花種類(lèi)；和所有的稻種類(lèi)。
后面將用的短語(yǔ)和術(shù)語(yǔ)解釋如下“反義”意指所含序列與靶RNA和／或mRNA或其部分互補(bǔ)，并可通過(guò)干擾靶基因最初轉(zhuǎn)錄物和／或mRNA加工、運(yùn)輸和／或翻譯而阻斷靶基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物?；パa(bǔ)可以是與靶RNA的任何部分互補(bǔ)，即5’非編碼序列、3’非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列。反義RNA一般是有義RNA的互補(bǔ)物(鏡像)。
“cDNA”指來(lái)自mRNA并與其互補(bǔ)的DNA。
“嵌合DNA構(gòu)建體”指含來(lái)自一個(gè)或多個(gè)物種的有義或反義方向的基因或其部分的重組體DNA。
“組成型啟動(dòng)子”指在所有細(xì)胞類(lèi)型中和所有時(shí)間指導(dǎo)連續(xù)基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件(即肌動(dòng)蛋白、遍在蛋白、CaMV35S、35T啟動(dòng)子等等)。
“共抑制”是指引入與內(nèi)源基因基本同源的外源基因，在植物細(xì)胞內(nèi)引起外源基因和／或內(nèi)源基因產(chǎn)物的活性降低。有時(shí)可通過(guò)將啟動(dòng)子序列、5’和／或3’末端、內(nèi)含子或基因編碼區(qū)引入該植物細(xì)胞完成共抑制。
“發(fā)育特異性”啟動(dòng)子是指在特定植物發(fā)育階段，如早或晚期胚發(fā)生等階段負(fù)責(zé)基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件。
“增強(qiáng)子”是指能刺激啟動(dòng)子活性的核苷酸序列元件，如來(lái)自玉米條斑病毒(MSV)、苜?；ㄈ~病毒(AMV)、乙醇脫氫酶內(nèi)含子1等等的增強(qiáng)子。
此處所用“表達(dá)”一詞指植物細(xì)胞內(nèi)核酸分子、mRNA和／或反義RNA的酶促轉(zhuǎn)錄?；虮磉_(dá)也涉及基因轉(zhuǎn)錄，且可能涉及或不涉及mRNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。
“外源”或“異源基因”指所具有的DNA序列正常情況下不存在于宿主細(xì)胞中，但已通過(guò)觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化引入的基因。
“基因”指蛋白質(zhì)表達(dá)涉及的所有遺傳物質(zhì)，包括嵌合DNA構(gòu)建體、基因、植物基因及其部分。
“基因組”指生物體各細(xì)胞和／或病毒中所含的遺傳物質(zhì)。
“銹導(dǎo)型啟動(dòng)子”指響應(yīng)特殊信號(hào)，諸如物理刺激(熱休克蛋白)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代謝物、應(yīng)激等信號(hào)，負(fù)責(zé)基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件。
“修飾的植物”指相對(duì)于未修飾植物而言，其中特異蛋白質(zhì)的mRNA水平、蛋白質(zhì)水平或酶比活性已改變的植物。修飾可通過(guò)反義、共抑制或過(guò)表達(dá)來(lái)完成。
“植物細(xì)胞聚集體”、“植物細(xì)胞系”和“愈傷組織細(xì)胞系”指由經(jīng)歷從頭形態(tài)發(fā)生的未分化和分化細(xì)胞組成、將植物材料片(外植體)在無(wú)菌條件下置于生長(zhǎng)支持培養(yǎng)基上形成的組織增殖塊。術(shù)語(yǔ)“植物細(xì)胞聚集體”、“植物細(xì)胞系”和“愈傷組織細(xì)胞系”包括單子葉植物中的Ⅰ型和Ⅱ型愈傷組織培養(yǎng)物和雙子葉植物中的下胚軸和子葉衍生的培養(yǎng)物。此處所定義的術(shù)語(yǔ)不包括植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物或Ⅲ型愈傷組織培養(yǎng)物。
“植物組織”指有組織的組織，包括但不局限于分生組織、胚、花粉、子葉、生殖細(xì)胞等等。
“啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件”指核酸片段或基因中控制該核酸片段或基因表達(dá)的核苷酸序列元件。啟動(dòng)子序列為RNA聚合酶和有效轉(zhuǎn)錄所需的其他轉(zhuǎn)錄因子提供了識(shí)別位點(diǎn)。多種來(lái)源的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件可有效地用于植物細(xì)胞中表達(dá)有義和反義基因構(gòu)建體。啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件還包括組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、發(fā)育特異性啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等。啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件還包括可提高轉(zhuǎn)錄或翻譯效率的增強(qiáng)子序列元件。
“組織特異性”啟動(dòng)子是在特殊細(xì)胞或組織類(lèi)型，如葉片或種子中負(fù)責(zé)基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件(即玉米醇溶蛋白、油質(zhì)蛋白、napin、ACP、球蛋白等等)。
“轉(zhuǎn)基因”指包括任何含異源DNA或嵌合基因構(gòu)建體的Ⅰ型或Ⅱ型愈傷組織、下胚軸或子葉衍生愈傷組織、組織、植物部分或植物，該DNA或嵌合基因構(gòu)建體是通過(guò)觸須引入所說(shuō)的愈傷組織、組織、植物部分或植物中，并隨后通過(guò)有性或無(wú)性細(xì)胞雜交或細(xì)胞分裂送遞給后代。
“觸須”指能自許多物質(zhì)產(chǎn)生的細(xì)長(zhǎng)針狀體，如“簡(jiǎn)明化學(xué)詞典，第7版，Arthur&Elizabeth Rose編輯，Reinhold出版社，紐約(1966)”中所述。本發(fā)明不限制觸須來(lái)源的材料，而是限定其為類(lèi)針形結(jié)構(gòu)，其中所說(shuō)觸須小于將用其轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在本發(fā)明范圍內(nèi)，觸須以便于DNA進(jìn)入細(xì)胞的方式成形。本發(fā)明范圍還意圖包括任何類(lèi)針形材料，該針形材料能穿孔進(jìn)入有或無(wú)細(xì)胞壁的植物細(xì)胞從而方便DNA攝入和植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本發(fā)明范圍不包括顯微注射技術(shù)，例如其中先將針插入所說(shuō)細(xì)胞，通過(guò)針本身的孔送遞DNA從而使DNA分子進(jìn)入細(xì)胞。優(yōu)選觸須是金屬或陶瓷針狀體，最優(yōu)選用碳化硅或四氮化三硅制成，大小30x0．5um-10x0．3um。
“觸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化”指通過(guò)觸須方便DNA插入植物細(xì)胞聚集體和／或植物組織并以瞬時(shí)或穩(wěn)定的方式表達(dá)該DNA。
產(chǎn)生植物細(xì)胞系時(shí)，目的組織被無(wú)菌分離并置于固體起始培養(yǎng)基上，由此破壞有組織的植物細(xì)胞組織中細(xì)胞分化和特化相關(guān)的過(guò)程，從而導(dǎo)致該組織去分化。一般地說(shuō)，通過(guò)加入瓊脂等使起始培養(yǎng)基固相化，因?yàn)橛鷤M織在液體培養(yǎng)基中不容易引發(fā)。培養(yǎng)基通常以Chu等人的N6鹽為基礎(chǔ)(1978，植物組織培養(yǎng)進(jìn)展研討會(huì)(Proc．Symp．Plant Tissue Cluture)，Peking Press，第43-56頁(yè))，補(bǔ)充有蔗糖、維生素、礦物質(zhì)、氨基酸，在某些情況下還有合成激素。不過(guò)，愈傷組織還能在Murashige和Skoog的MS鹽衍生培養(yǎng)基(1962植物生理學(xué)15473-497)上增殖。培養(yǎng)物通常保持于約28℃的黑暗、無(wú)菌環(huán)境中。
一般說(shuō)來(lái)，優(yōu)選植物細(xì)胞系來(lái)自幼葉基部區(qū)、不成熟雄花穗、下胚軸組織和子葉節(jié)。對(duì)于玉米和稻，可使用產(chǎn)生分生組織的植物細(xì)胞系，最優(yōu)選來(lái)自合子胚組織的植物細(xì)胞系。用于生產(chǎn)所說(shuō)植物細(xì)胞系的最優(yōu)選組織分離自授粉后10-14天的發(fā)育玉米谷穗和未發(fā)芽的稻種子。苗的下胚軸和子葉衍生組織最優(yōu)選用于產(chǎn)生棉花植物細(xì)胞系。
將所說(shuō)組織置于固體培養(yǎng)基上數(shù)天至數(shù)周后，從盾形區(qū)(以玉米和稻為例)或者下胚軸或子葉組織(以棉花為例)產(chǎn)生新的分生組織。這些新的分生組織產(chǎn)生未分化的薄壁組織細(xì)胞聚集體，這類(lèi)聚集體無(wú)來(lái)源組織的結(jié)構(gòu)順序特征。植物細(xì)胞聚集體缺少任何可識(shí)別的總體結(jié)構(gòu)，且只包含在完整和有組織的植物組織中發(fā)現(xiàn)的許多不同種類(lèi)特化細(xì)胞類(lèi)型中的有限數(shù)量。所說(shuō)的聚集體已被分類(lèi)為非胚發(fā)生的和胚發(fā)生的類(lèi)型，取決于它們的再生能力、繁殖方式和組織形態(tài)學(xué)(Franz，1988，Ph．D．Thesis，University of Wageningen，荷蘭)。
在玉米和稻中，非胚發(fā)生性愈傷組織含由不能再生成植物的細(xì)長(zhǎng)有液泡細(xì)胞組成的柔軟粒狀半透明組織。或者，能進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生和植物再生的胚發(fā)生性單子葉愈傷組織以三種獨(dú)特的形態(tài)類(lèi)型存在Ⅰ型；Ⅱ型；和Ⅲ型。
Ⅰ型愈傷組織由致密的結(jié)節(jié)狀緩慢生長(zhǎng)的胚發(fā)生性愈傷組織組成，該愈傷組織以復(fù)合組織混合物的形式增殖，顯示苗和／或類(lèi)盾形結(jié)構(gòu)(Phillips等，1988，玉米和玉米改良，第345-387頁(yè))。所說(shuō)的愈傷組織特征在于高度的細(xì)胞分化和發(fā)育良好的脈管結(jié)構(gòu)，已被稱(chēng)為致密的胚發(fā)生性愈傷組織(美國(guó)專(zhuān)利5641664，Plant Genetic Systems)?；旧纤械膯巫尤~植物都具有可產(chǎn)生Ⅰ型愈傷組織的組織。Ⅰ型愈傷組織中的植物再生通常通過(guò)分生組織延長(zhǎng)進(jìn)行器官發(fā)生(Green和Phillips，1975，Crop Sci．，15417-421)和／或通過(guò)由明確的根-芽軸進(jìn)行體細(xì)胞胚發(fā)生而完成(Vasil等，1984，Amer．J．Bot．71158-161)。Ⅰ型愈傷組織中再生幼苗的來(lái)源不總是顯而易見(jiàn)的，看起來(lái)是通過(guò)表皮下分生組織形成而產(chǎn)生的(Franz和Schel，1991，Can．J．Bot．6926-33)。
Ⅱ型愈傷組織不象Ⅰ型那樣常見(jiàn)，它由柔軟的易碎胚發(fā)生細(xì)胞組成，只能自某些單子葉基因型產(chǎn)生(Phillips等，1988，玉米和玉米改良，第345-387頁(yè))。它生長(zhǎng)迅速，包含很少或不含脈管結(jié)構(gòu)，可描述為易碎的胚發(fā)生性愈傷組織(美國(guó)專(zhuān)利5641664，Plant GeneticsSystems)。Ⅱ型愈傷組織的一區(qū)別特征是它包含附著于其表面胚柄狀結(jié)構(gòu)的許多球狀體細(xì)胞胚，其植物再生似乎以明顯可確認(rèn)的階段進(jìn)行(Franz，1988，Ph．D．Thesis，University of Wageningen，荷蘭)。
Ⅲ型愈傷組織只是最近才被描述的。該愈傷組織只很罕有地形成，它容易分散于液體中，在其表面無(wú)任何獨(dú)特的體細(xì)胞胚。它也被描述為“易碎的非粘質(zhì)”愈傷組織(Shillito等，1989，生物工程學(xué)(Bio／Technology)7581-587)，并主要由能通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生而再生的未分化組織組成。Ⅲ型愈傷組織被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化和再生的理想組織，因其細(xì)胞易于分離和分散，因此易于形成懸浮培養(yǎng)物。這類(lèi)愈傷組織是最少有的，這點(diǎn)上不同于Ⅱ型愈傷組織，它只能在Ⅱ型培養(yǎng)物的各亞培養(yǎng)代數(shù)時(shí)通過(guò)直觀選擇和擇優(yōu)富集產(chǎn)生(WO94／28148；Zeneca)。
在棉花中，正如其他雙子葉植物一樣，愈傷組織類(lèi)型一般不定義為Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ型。而且，來(lái)自棉花的下胚軸和子葉衍生愈傷組織培養(yǎng)物已根據(jù)形態(tài)學(xué)因素和再生能力被分類(lèi)為非胚發(fā)生和胚發(fā)生的類(lèi)型(Shoemaker等，1986植物細(xì)胞再生(Plant Cell Rep．)3178-181)。非胚發(fā)生性愈傷組織由不顯示強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)染色反應(yīng)的松散易碎細(xì)胞塊組成，不能用來(lái)方便地再生植物。不過(guò)，胚發(fā)生的愈傷組織看起來(lái)象是能通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生而再生植物的細(xì)胞的極致密、密集胞質(zhì)團(tuán)。從此產(chǎn)生的體細(xì)胞胚首先呈現(xiàn)球狀結(jié)構(gòu)并逐漸延長(zhǎng)，然后開(kāi)始顯現(xiàn)子葉的發(fā)育。
此處公開(kāi)的愈傷組織類(lèi)型中，來(lái)自單子葉植物的Ⅰ型和Ⅱ型愈傷組織培養(yǎng)物優(yōu)選用于植物產(chǎn)生和再生中。通過(guò)觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因玉米植物最優(yōu)選制備自Ⅰ型或Ⅱ型培養(yǎng)物；而在轉(zhuǎn)基因稻的生產(chǎn)和再生中最優(yōu)選Ⅰ型愈傷組織培養(yǎng)物。此外，在轉(zhuǎn)基因棉花植物的生產(chǎn)中優(yōu)選子葉節(jié)衍生和下胚軸衍生培養(yǎng)物，其中產(chǎn)生自子葉組織的培養(yǎng)物又是最優(yōu)選的。
包括玉米、稻和棉花在內(nèi)的植物芽尖包含頂端分生組織，在這種組織中從頂端原始細(xì)胞和表皮下細(xì)胞形成器官原基(Steeves和Sussex，1989，植物發(fā)育模式，劍橋大學(xué)出版社)?？煞蛛x分生組織，然后放至芽增殖培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)產(chǎn)生可再生成植株的多個(gè)芽(Zhong等，1992，植物187483-489)。新鮮分離或預(yù)培養(yǎng)而啟動(dòng)芽增殖的分生組織可用作按本發(fā)明教導(dǎo)進(jìn)行觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的接受者組織。優(yōu)選從正發(fā)育胚(Lowe等，1995，生物工程學(xué)13677-682)或發(fā)芽小苗(Gould等，1991，植物生理學(xué)95426-434)中分離含分生組織的芽尖，用經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)滲透預(yù)處理的觸須轉(zhuǎn)化，并在植物再生前放于含選擇劑的芽增殖培養(yǎng)基上(Zhong等，1996，植物生理學(xué)，1101097-1107)。
此處用于轉(zhuǎn)化的異源DNA可以是環(huán)狀的、線性的、雙鏈或單鏈的。一般地說(shuō)，該DNA是重組載體質(zhì)粒，其中包含編碼區(qū)，可用于促進(jìn)異源目的基因表達(dá)及提供選擇標(biāo)記，從而使含該基因的組織可被鑒定出來(lái)。優(yōu)選地，這些重組載體能穩(wěn)定整合入植物基因組，這樣轉(zhuǎn)化植物系的選擇可因其中所含的組成型、組織特異型或可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所述選擇標(biāo)記表達(dá)而進(jìn)行。
異源DNA中一可變處是嵌合基因的選擇。有義或反義方向的嵌合基因可在組成型、組織特異型、發(fā)育型或可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子等控制下表達(dá)于植物細(xì)胞中。按技術(shù)熟練人員的判斷優(yōu)選特殊嵌合基因；不過(guò)，嵌合基因可來(lái)自但不局限于植物、動(dòng)物或細(xì)菌等，并能用于表達(dá)在未轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有的或在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)具有的蛋白質(zhì)。嵌合基因也可用于，但不局限于內(nèi)源目的基因的正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)。
另一可變處是選擇標(biāo)記的選擇。按技術(shù)熟練人員的判斷優(yōu)選特殊選擇標(biāo)記，但任何以下選擇標(biāo)記可與此處未列但可用做選擇標(biāo)記的任何其他基因一起使用。所說(shuō)的選擇標(biāo)記包括但不局限于編碼抗生素卡那霉素、新霉素和G418抗性的轉(zhuǎn)座子Tn5(AphⅡ)的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，以及編碼對(duì)以下物質(zhì)的抗性或耐受性的基因草甘磷；潮霉素；氨甲喋呤；膦絲菌素(bialophos)；咪唑啉酮類(lèi)、磺胺脲類(lèi)和三唑嘧啶除草劑，如chlorsulfuron、bromoxynil、茅草枯(dalapon)等。
除選擇標(biāo)記外，還可使用報(bào)道基因。在某些情況下，報(bào)道基因可在有或沒(méi)有選擇標(biāo)記時(shí)使用。報(bào)道基因是一般不存在于接受者生物體或組織內(nèi)且一般所編碼蛋白質(zhì)導(dǎo)致一些表型改變或酶促特性的基因。這些基因的例子可見(jiàn)于K．Weising等，遺傳學(xué)年鑒(Ann．Rev．Genetics)，22，421(1988)，該文獻(xiàn)收編于此作為參考。優(yōu)選的報(bào)道基因包括大腸桿菌uidA位點(diǎn)的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、來(lái)自大腸桿菌Tn9的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、來(lái)自生物發(fā)光水母Aequorea victoria的綠色熒光蛋白和來(lái)自螢火蟲(chóng)Photinuspyralis的螢光素酶基因。然后可在該基因已引入受體細(xì)胞后的適當(dāng)時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)報(bào)道基因表達(dá)的試驗(yàn)。優(yōu)選如Jefferson等(1987，Biochem．Soc．Trans．15，17-19)所述利用編碼大腸桿菌uidA位點(diǎn)的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)之基因進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
另一可變處是啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件。除植物啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件外，多種來(lái)源的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件可有效用于植物細(xì)胞中表達(dá)異源基因。例如，細(xì)菌來(lái)源的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件，如章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子、胭脂堿合酶啟動(dòng)子、甘露堿合酶啟動(dòng)子；病毒來(lái)源的啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(35S和19S)、35T(重改造的35S啟動(dòng)子，參閱PCT／US96／1682、公布于1997年4月17日的WO97／13402)等都可使用。植物啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件包括但不局限于1，6-二磷酸核酮糖(RUBP)羧化酶小亞基(ssu)、β-conglycinin啟動(dòng)子、云扁豆蛋白啟動(dòng)子、ADH啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。
其他諸如基質(zhì)附著區(qū)、支架附著區(qū)、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化序列等元件也可存在，因而可提高轉(zhuǎn)錄效率或DNA整合。盡管這些元件能通過(guò)影響mRNA的轉(zhuǎn)錄、穩(wěn)定性等使DNA更好地表達(dá)或行使功能，但它們對(duì)于DNA的功能可以是必需的，也可能不是。這些元件可如期望的包含于該DNA中，以獲得植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化DNA的最適效果。典型的元件包括但不局限于Adh-內(nèi)含子1、苜蓿花葉病毒衣殼蛋白前導(dǎo)序列、玉米條斑病毒衣殼蛋白前導(dǎo)序列以及技術(shù)熟練人員可獲得的其他元件。
也可使用組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件在所有細(xì)胞類(lèi)型和所有時(shí)間內(nèi)指導(dǎo)連續(xù)的基因表達(dá)(如肌動(dòng)蛋白、遍在蛋白、CaMV35S等)。組織特異型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件負(fù)責(zé)在特殊細(xì)胞或組織類(lèi)型中的基因表達(dá)，如葉片和種子(如玉米醇溶蛋白、油質(zhì)蛋白、napin、ACP、球蛋白等)，因而也可使用。
啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件也可能是在植物發(fā)育的某一階段以及特殊植物組織和器官內(nèi)有活性的。這樣的例子包括但不局限于花粉特異、胚特異、玉米穗絲特異、棉花纖維特異、根特異、種子胚乳特異型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件等。在某些情況下可能需要使用負(fù)責(zé)響應(yīng)特殊信號(hào)進(jìn)行基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件，所說(shuō)的信號(hào)如物理刺激(熱休克基因)、光(RUBP羧化酶)、激素(Em)、代謝物和應(yīng)激狀況。還可使用在植物中有功能的其他需要的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。技術(shù)熟練人員已知并可得到許多植物特異型基因轉(zhuǎn)移載體。
通過(guò)觸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化能將異源DNA引入可再生的植物細(xì)胞培養(yǎng)物。此過(guò)程的總描述可見(jiàn)授予Zeneca的美國(guó)專(zhuān)利5302523和5464765，迄今為止還未出版用于Ⅰ型、Ⅱ型、下胚軸或子葉可再生植物細(xì)胞系之觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的流程。
在觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中，通過(guò)由生物惰性材料組成的很小的細(xì)長(zhǎng)針狀微?？纱龠M(jìn)植物材料攝入DNA。在將該微粒與DNA和植物細(xì)胞系攪拌時(shí)，一個(gè)或多個(gè)微粒在可再生植物細(xì)胞聚集體中造成小孔，從而使該聚集體攝入DNA。已攝入DNA的細(xì)胞被視為是已轉(zhuǎn)化的。一些轉(zhuǎn)化細(xì)胞將穩(wěn)定保留所引入的DNA并表達(dá)它。
用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的細(xì)長(zhǎng)針狀微粒被稱(chēng)為“觸須”，優(yōu)選用諸如碳化硅或四氮化三硅之類(lèi)的高密度材料制備；不過(guò)，任何具有針狀結(jié)構(gòu)，且該結(jié)構(gòu)大小小于待轉(zhuǎn)化細(xì)胞的材料均在本發(fā)明范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，觸須由碳化硅制成，如本文所述的Silar SC-9或Alfa Aesar。
轉(zhuǎn)化前，優(yōu)選將植物細(xì)胞系放于滲透介質(zhì)上并溫育，這樣，相比于非滲透性處理細(xì)胞將可增強(qiáng)轉(zhuǎn)化。最優(yōu)選的是其中含約36．4g／L山梨醇和約36．4g／L甘露醇的滲透介質(zhì)。在觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化前將這些組織于該介質(zhì)上維持約4小時(shí)。按技術(shù)熟練人員的判斷在轉(zhuǎn)化后保溫于含滲透劑的介質(zhì)上。不過(guò)，非滲透性處理的植物細(xì)胞聚集體和組織的轉(zhuǎn)化也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
此處用于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的愈傷組織培養(yǎng)物通常應(yīng)為約3-20周大，依培養(yǎng)物類(lèi)型而定。一般地，愈傷組織應(yīng)在大約轉(zhuǎn)移期的中間，因而不處于可能與轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基相關(guān)的任何滯后期，或在到達(dá)通常與平板上培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)期的培養(yǎng)物相關(guān)的任何靜止期之前。不過(guò)，可在傳代培養(yǎng)之前或之后取植物材料；因而對(duì)于實(shí)行此處公開(kāi)之本發(fā)明來(lái)說(shuō)，通常認(rèn)為收獲時(shí)間不是關(guān)鍵的。每個(gè)轉(zhuǎn)化中所用的愈傷組織量?jī)?yōu)選約100-500mg，更優(yōu)選約100-250mg，最優(yōu)選約為200mg組織。
為了轉(zhuǎn)化，觸須一般放于小容器中，如圓錐管或微量離心管等，其中該容器中已放有含目的DNA構(gòu)建體、液體培養(yǎng)基和愈傷組織的混合物。對(duì)于實(shí)行此處公開(kāi)的本發(fā)明來(lái)說(shuō)，材料加入的順序是不重要的。之后，將容器密封并攪拌。不象植物組織biolistic轉(zhuǎn)化中所用的微粒(Sanford等，1990Physiol．Plantarum，79206-209；和美國(guó)專(zhuān)利5100712)，觸須在使用前不需要用DNA載體或沉淀劑，如氯化鈣、亞精胺、剪切鮭精DNA等進(jìn)行任何特殊預(yù)處理。
轉(zhuǎn)化過(guò)程中所用的攪拌時(shí)間可變化，一般在約10-160秒之間。每個(gè)轉(zhuǎn)化中加入的觸須量也可為約1-4mg／管。在加入觸須量和達(dá)到最佳轉(zhuǎn)化所需的攪拌時(shí)間之間觀察到反比關(guān)系。因此，加入觸須量和完成轉(zhuǎn)化所需攪拌時(shí)間是本領(lǐng)域技術(shù)人員可測(cè)定的。此外，所加入液體培養(yǎng)基的體積為約200-1000ul，優(yōu)選約200ul。另外，加入的異源DNA量?jī)?yōu)選為約10-100ul 1mg／ml溶液。對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，加入的DNA體積不是象DNA終濃度那么關(guān)鍵的因素。而優(yōu)選的DNA終濃度約為0．03-0．14ug／ul。本發(fā)明的范圍包括但不局限于此處所公開(kāi)的容器大小、加入的異源DNA量或濃度、加入的異源DNA體積、加入的液體培養(yǎng)基量、加入的愈傷組織材料量或加入的觸須量。本發(fā)明包括但不局限于攪拌混合物所用裝置或攪拌是否通過(guò)手工或機(jī)械方式完成。
一旦植物細(xì)胞系被穿孔且異源DNA已進(jìn)入其中，則必須鑒定、增殖和選擇不只含目的異源DNA且還能再生的那些細(xì)胞。可用多種標(biāo)準(zhǔn)方法篩選該細(xì)胞或由此再生的植物中異源DNA的存在或缺乏，所說(shuō)方法包括但不局限于報(bào)道基因表達(dá)的評(píng)估?；蛘撸c異源DNA一起或作為其中一部分的選擇標(biāo)記的送遞使那些含該DNA的細(xì)胞可通過(guò)使用選擇劑而鑒定出來(lái)。
只選擇那些包含和表達(dá)目的異源DNA的細(xì)胞是可育的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)中關(guān)鍵的一步。選擇條件必須是在抑制開(kāi)始時(shí)極多的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，選擇條件必須不會(huì)引起轉(zhuǎn)化細(xì)胞喪失其植物再生能力、未來(lái)的發(fā)育能力或生殖力。通過(guò)制做生長(zhǎng)抑制曲線，技術(shù)熟練人員可很容易確定用于選擇表達(dá)特殊選擇標(biāo)記之轉(zhuǎn)化細(xì)胞的適當(dāng)條件。通過(guò)將細(xì)胞生長(zhǎng)情況相對(duì)選擇劑濃度作圖，可得到生長(zhǎng)抑制曲線。一般地說(shuō)，選擇劑濃度設(shè)為幾乎所有非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制但不被殺死的濃度。優(yōu)選的選擇劑濃度是其中90-99％的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制但不被殺死的濃度。最優(yōu)選的選擇劑濃度是其中97-99％的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制但不被殺死的濃度。
轉(zhuǎn)移并暴露于選擇劑中的轉(zhuǎn)化愈傷組織通常溫育于可支持生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基上。各類(lèi)型組織優(yōu)選的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域中已很明確。最初暴露于選擇劑后，定期將組織轉(zhuǎn)移到保持選擇劑濃度的新鮮培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)化細(xì)胞量基本上增長(zhǎng)1倍后，選擇生長(zhǎng)最快且最健康的細(xì)胞團(tuán)并將其轉(zhuǎn)移到所含選擇劑濃度將殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基中。重復(fù)選擇和轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)細(xì)胞至新鮮培養(yǎng)基中，最后得到幾乎完全由含目的異源DNA之轉(zhuǎn)化細(xì)胞組成的細(xì)胞群。
再生對(duì)本發(fā)明來(lái)說(shuō)是重要的，可通過(guò)技術(shù)熟練人員掌握的任何常規(guī)方式完成。若細(xì)胞已用選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化，可將選擇劑摻入再生培養(yǎng)基中以進(jìn)一步確認(rèn)再生的小植株被轉(zhuǎn)化了。培養(yǎng)數(shù)周后，可將對(duì)選擇劑有免疫力的再生小植株轉(zhuǎn)移到土壤中并生長(zhǎng)至成熟。
通過(guò)表型和／或基因型分析可將愈傷組織和由其衍生的植物鑒定為轉(zhuǎn)化子。例如，如果異源DNA編碼一種酶或蛋白質(zhì)，就可利用特異于該特殊酶或蛋白質(zhì)的酶促或免疫學(xué)檢驗(yàn)。其他基因產(chǎn)物可用合適的生物試驗(yàn)或化學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。別的技術(shù)包括，用Southern所述方法((1975)分子生物學(xué)雜志，98503-517)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等等分析植物的基因組成分。
自轉(zhuǎn)化愈傷組織再生的植物被稱(chēng)為R0世代或R0植物。此世代植物的多種有性雜交產(chǎn)生的種子被稱(chēng)為R1子代。隨后R1種子發(fā)芽產(chǎn)生R1植物。應(yīng)當(dāng)應(yīng)用本文所述方法證實(shí)異源DNA被成功地送遞并遺傳給R1植物和其后代。
一般來(lái)說(shuō)，如果異源DNA可摻入許多不同雜合體中，轉(zhuǎn)化玉米及其后代在商業(yè)上將有很大的價(jià)值。這可通過(guò)建立該品系的植物細(xì)胞聚集體并用觸須轉(zhuǎn)化該品系，從而如本文所述將異源DNA直接摻入大量親代系中而完成。此外，這還可通過(guò)將最初的轉(zhuǎn)基因可育植物與正常原種自交系雜交，然后將其后代與正常親本回交而完成。此雜交的后代將發(fā)生分離，以致一些植物包含目的異源DNA而一些植物則沒(méi)有。繼續(xù)品系雜交直到最初的正常親本已轉(zhuǎn)變成含目的異源DNA且還基本上擁有與此品系相關(guān)的所有特征的遺傳修飾品系。完成原種種質(zhì)品系和其自親所需的玉米育種技術(shù)對(duì)技術(shù)熟練人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的。
本發(fā)明的特殊實(shí)施方案進(jìn)一步舉例說(shuō)明于實(shí)施例中。不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)理解，特別詳述的實(shí)驗(yàn)只是本發(fā)明的例證，其后的權(quán)利要求中對(duì)本發(fā)明將有更完整的描述。
實(shí)施例1Ⅰ型和Ⅱ型愈傷組織的建立為了引發(fā)Ⅰ型愈傷組織，如下文無(wú)菌分離基因型H99、Pa91和擁有產(chǎn)權(quán)的品系139／39(美國(guó)專(zhuān)利5306864)的合子胚(1．5-3．0mm)，并置于由以下成分組成的Ⅰ型培養(yǎng)基上N6常量營(yíng)養(yǎng)物和維生素(Chu，1978，植物組織培養(yǎng)進(jìn)展研討會(huì)，第43-56頁(yè))、B5微量營(yíng)養(yǎng)物(Gamborg等，Exp．Cell Res．50151-158)、30g／L蔗糖、2．9g／L L-脯氨酸、100mg／L肌醇、100mg／L酪蛋白水解物、37mg／L乙二胺四乙酸亞鐵的鈉鹽(NaFeEDTA)、8mg／L麥草畏、0．8mg／L 2，4-D、4．9mg／L硝酸銀和2．5g／L GELRITE。自原始合子胚盾形區(qū)引發(fā)的Ⅰ型愈傷組織由顯示類(lèi)盾形結(jié)構(gòu)的致密胚發(fā)生組織和芽分生組織組成。在以21-28天為間隔進(jìn)行選擇性傳代培養(yǎng)數(shù)代后，培養(yǎng)物用于本文所述的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
為了引發(fā)Ⅱ型愈傷組織，將自B73XA188雜交來(lái)源的兩S3品系雜交制備的雜種植物(Armstrong等，1991，Maize Genet．Coop．NewsLett．，6592-93)在標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下培養(yǎng)并自花授粉或近緣授粉(Petolino和Genovesi，1994，玉米手冊(cè)，第701-704頁(yè))。授粉10-14天后(DAP)，切下正發(fā)育的谷穗并用70％(v／v)酒精消毒表面2分鐘，隨后浸泡于含幾滴LIQUI-NOX的20％(v／v)市售漂白粉中0．5小時(shí)，然后用無(wú)菌水漂洗數(shù)次。之后將未成熟胚(1．5-3．0mm)分離并放于起始培養(yǎng)基上[N6基本鹽類(lèi)和維生素(Chu，1978，植物組織培養(yǎng)進(jìn)展研討會(huì)，第43-56頁(yè))、20g／L蔗糖、2．9g／L L-脯氨酸、100mg／L酶促酪蛋白水解物(ECH)、37mg／L Fe-EDTA、10mg／L硝酸銀、1mg／L2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)和2．5g／L GELRITE(Schweizerhall，SouthPlainfield，NJ)，pH5．8]。黑暗中28℃放2-3周后，得到具許多球狀和細(xì)長(zhǎng)體細(xì)胞胚的Ⅱ型愈傷組織。為了富集具預(yù)期形態(tài)的Ⅱ型培養(yǎng)物，如文獻(xiàn)Welter等，1995，Plant Cell Rep．14725-729中所述再進(jìn)行2-3代選擇性傳代培養(yǎng)。一旦建立了Ⅱ型形態(tài)(4-6周)，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到維持培養(yǎng)液(含6mM L-脯氨酸且不含硝酸銀的起始培養(yǎng)液)中。培養(yǎng)起始約16-20周后將Ⅱ型愈傷組織用于轉(zhuǎn)化。
實(shí)施例2質(zhì)粒pUGN81-3和pDAB418的構(gòu)建含驅(qū)動(dòng)β-葡糖醛酸糖苷酶基因之遍在蛋白啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件的玉米表達(dá)載體pUGN81-3按本文所述被利用。質(zhì)粒pUGN81-3是按順時(shí)針次序含以下序列的8730個(gè)堿基對(duì)雙鏈植物轉(zhuǎn)化載體。核苷酸1-17編碼序列為AGCTTCCGCG GCTGCAG的多位點(diǎn)接頭。pUGN81-3的核苷酸18-2003位是玉米遍在蛋白啟動(dòng)子和其第一個(gè)內(nèi)含子，是經(jīng)PCR擴(kuò)增自玉米基因型B73的基因組DNA(Christensen等，(1992)植物分子生物學(xué)18675-689)。pUGN81-3的核苷酸2004-2022位編碼序列為GGTACCCCCG GGGTCGACC的多位點(diǎn)接頭。pUGN81-3的核苷酸2023-4154位相應(yīng)于質(zhì)粒pBⅠ101(Clontech，Palo Alto，CA)的核苷酸2551-4682位，其后是具有相應(yīng)于pUGN81-3堿基4155-4197位之序列ATCGGGAATT AAGCTTGCAT GCCTGCAGGCCGGCCTTAAT TAA的多位點(diǎn)接頭。pUGN81-3的核苷酸4198-4264相應(yīng)于GCGGCCGCTT TAACGCCCGG GCATTTAAATGGCGCGCCGC GATCGCTTGC AGATCTGCAT GGGTG。pUGN81-3的核苷酸4265-4776位包含雙增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子，其中核苷酸4265-4516位相應(yīng)于花椰菜花葉病毒基因組第7093-7344位核苷酸(Franck等，(1980)細(xì)胞21285-294)。pUGN81-3的核苷酸4525-4776位是核苷酸4265-4516位的重復(fù)，在重復(fù)序列間有含核苷酸4517-4524位的接頭CATCGATG。pUGN81-3的核苷酸4777-4871位相應(yīng)于花椰菜花葉病毒基因組第7345-7439位堿基(Franck等，(1980)細(xì)胞21285-294)。核苷酸4872-4891位包含接頭GGGGACTCTAGAGGATCCAG。pUGN81-3的核苷酸4892-5001位相應(yīng)于玉米條斑病毒基因組的核苷酸167-277位，其中第187位堿基缺失(Mullineaux等，(1984)EMBO J-33063-3068)。核苷酸5002-5223位相應(yīng)于玉米乙醇脫氫酶基因(Adh1-S)被修飾的第一個(gè)內(nèi)含子(Dennis等，(1984)核酸研究123983-4000)。該修飾導(dǎo)致343個(gè)核苷酸的去除(第1313-1656位堿基)，而玉米Adh1-S基因的堿基1222-1312位(內(nèi)含子5’端)和核苷酸1657-1775位(內(nèi)含子3’端)保留。pUGN81-3的核苷酸5224-5275位相應(yīng)于玉米條斑病毒(MSV)的核苷酸279-312位。玉米條斑病毒(下文稱(chēng)MSV)上述兩部分序列都包含MSV衣殼蛋白V2基因的非翻譯前導(dǎo)序列，在質(zhì)粒pUGN81-3中被修飾的Adh1內(nèi)含子打斷。質(zhì)粒pUGN81-3的核苷酸5258-5814位相應(yīng)于吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(BAR)基因的核苷酸29-585位(White等，(1989)核酸研究181062)。為了便于克隆，將該公布序列中的核苷酸34和575位的A和G分別改變成G和A。此序列用作選擇標(biāo)記。核苷酸5815-5819位包含接頭GATCT。pUGN81-3的核苷酸5820-6089位相應(yīng)于質(zhì)粒pBⅠ101(Clontech，PaloAlto，CA)的核苷酸4414-4683位，其后是接頭序列ATCGG。pUGN81-3的剩余序列(核苷酸6095-8730位)相應(yīng)于pUC19的反向互補(bǔ)序列(Yanish-Perron等，(1985)基因33103-119)。
含驅(qū)動(dòng)β-葡糖醛酸糖苷酶基因之遍在蛋白啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件的玉米表達(dá)載體pDAB418被用于一些表達(dá)研究中。此外，該質(zhì)粒攜帶用作植物選擇標(biāo)記的第二個(gè)基因。質(zhì)粒pDAB418是按順時(shí)針?lè)较虼涡蛴梢韵滦蛄薪M成的10149個(gè)堿基對(duì)的雙鏈植物轉(zhuǎn)化載體。核苷酸1-31位具有核苷酸序列AATTCATCGA AGCGGCCGCA AGCTTCCGCGG。質(zhì)粒pDAB418的核苷酸32-2023位是玉米遍在蛋白(Ubil)啟動(dòng)子和其第一個(gè)內(nèi)含子，是經(jīng)PCR擴(kuò)增自玉米基因型B73的基因組DNA(Christensen等，(1992)植物分子生物學(xué)18675-689)。pDAB418的核苷酸2024-2042位包含接頭序列GGTACCCCCGGGGTCGACC。pDAB418的核苷酸2043-3894位相應(yīng)于質(zhì)粒pBⅠ101(Clontech，Palo Alto，CA)的核苷酸2551-4402位，其后是接頭序列TGGGGAATTG(堿基3895-3904位)。pDAB418的核苷酸3905-4174位相應(yīng)于pBⅠ101的4414-4683位。核苷酸4175-4192位含接頭序列ATCGGGAATT AAGCTTGG。堿基4193-6184位包括如上所述的玉米遍在蛋白啟動(dòng)子和其第一個(gè)內(nèi)含子的又一拷貝。此序列之后是接頭序列GTCGGGGATC TA(6185-6196位)。質(zhì)粒pDAB418的核苷酸6197-6753位相應(yīng)于吸水鏈霉菌膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(BAR)基因的核苷酸29-585位(White等，(1989)核酸研究181062)。為了便于克隆，將該公布序列中的核苷酸34和575位從A和G分別改變成G和A。此序列用作選擇標(biāo)記并被玉米遍在蛋白啟動(dòng)子調(diào)控。核苷酸6754-6758位包含接頭TAACC。核苷酸6759-7472位作為3’聚腺苷酸化序列，包括根癌農(nóng)桿菌章魚(yú)堿Ti質(zhì)粒pTi15955的第21728-22441位堿基(Barker等，(1983)植物分子生物學(xué)2，335-350)。序列7473-7504位含多接頭GGAATTCATC GATATCTAGA TGTCGAGCTC GG。pDAB418的剩余序列(核苷酸7505-10149位)相應(yīng)于pUC19質(zhì)粒骨架來(lái)源的核苷酸的反向互補(bǔ)物(Yanish-Perron等，(1985)基因33103-119)。
實(shí)施例3觸須制備、優(yōu)化和Ⅰ型玉米愈傷組織的轉(zhuǎn)化
Ⅰ型愈傷組織產(chǎn)生自不同的近交系。為了進(jìn)行檢測(cè)，將Ⅰ型愈傷組織各約250mg樣品放入2．0mL微量離心管(BrinkmanInstuments，Inc．，Westbury，NY)中，加入由以下成分組成的Ⅰ型培養(yǎng)基300mLN6常量營(yíng)養(yǎng)物和維生素(Chu，1978，植物組織培養(yǎng)進(jìn)展研討會(huì)，第43-56頁(yè))、B5微量營(yíng)養(yǎng)物(Gamborg等，Exp．Ce．Res．50151-158)、30g／L蔗糖、2．9g／L L-脯氨酸、100mg／L肌醇、100mg／L酪蛋白水解物、37mg／L NaFeEDTA、8mg／L麥草畏、0．8mg／L2，4-D、4．9mg／L硝酸銀、20uL DNA溶液(1．0mg／mL pDAB418溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8．0)和40ug／uL(SC-9)觸須懸浮液200uL。然后將各管用Vortex-Genie2TM混勻20秒，并將愈傷組織轉(zhuǎn)移回用2．5g／LGELRITE固化的Ⅰ型培養(yǎng)基中保溫16小時(shí)。之后將愈傷組織用于如下文所述的GUS表達(dá)檢驗(yàn)，結(jié)果總結(jié)于表1。
表1．Ⅰ型愈傷組織中的GUS表達(dá)
在所有被測(cè)基因型中觀察到觸須處理后Ⅰ型愈傷組織中有瞬時(shí)GUS表達(dá)。
實(shí)施例4觸須制備、優(yōu)化和Ⅱ型玉米愈傷組織的轉(zhuǎn)化用約40mg干觸須(來(lái)自Advanced Composite Materials Corp．，Greer，SC的Silar SC-9；來(lái)自Johnson-Matthey，Ward Hill，MA的AlfaAesar)并放于預(yù)先稱(chēng)重的2．0mL聚丙烯管中，制備無(wú)菌碳化硅觸須懸液。將管再稱(chēng)重以確定所加入觸須的量，然后高壓蒸氣滅菌。臨用前加入維持液(見(jiàn)上文)制備40mg／mL觸須懸液，高速混勻1分鐘。
在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，將來(lái)自不同未成熟胚衍生品系的Ⅱ型愈傷組織樣品200或500mg加入17x100mm培養(yǎng)管(Falcon2059，BectonDickinson，Lincoln Park，NJ)中。在各管中加入液體維持培養(yǎng)基(無(wú)GELRITE)500uL、80uL DNA溶液(0．5ug／uL pDAB418溶于10mMTris，1mM EDTA，pH8．0)和40mg／mL(SC-9)觸須懸浮液50uL。然后將各管用Vortex-Genie 2TM(Scientific Industries，Bohemia，NY)混勻20秒。還進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。一種情況是無(wú)DNA時(shí)用觸須處理愈傷組織。另一種情況是無(wú)觸須時(shí)用DNA處理愈傷組織。不管如何處理，將愈傷組織轉(zhuǎn)移回含2．5g／L GELRITE的固體維持培養(yǎng)基中并于黑暗中28℃保溫16小時(shí)。然后將愈傷組織置于GUS檢驗(yàn)溶液(0．2M磷酸鈉pH8．0、鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀各0．1mM、1．0M NaEDTA、0．5mg／mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸和0．6％v／v Triton x-100)中。黑暗中37℃保溫48小時(shí)后檢測(cè)GUS表達(dá)，用各樣品中的藍(lán)色扇形區(qū)計(jì)數(shù)表示，總結(jié)于表2中。
表2在固定DNA濃度下(0．0635ug／uL終濃度)經(jīng)觸須介導(dǎo)愈傷組織轉(zhuǎn)化后的GUS表達(dá)
只有當(dāng)觸須和DNA均與愈傷組織混勻后才觀察到GUS表達(dá)。與500mg／管相比，使用200mg愈傷組織／管觀察到的瞬時(shí)GUS表達(dá)稍高。
為了檢測(cè)不同DNA濃度的影響，將來(lái)自不同未成熟胚衍生品系的Ⅱ型愈傷組織樣品200mg加入17x100mm培養(yǎng)管(Falcon2059，BectonDickinson，Lincoln Park，NJ)中。各管中加入250uL液體維持培養(yǎng)基、DNA10、25、或50uL(1．0ug／uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8．0)和40mg／mL(SC-9)觸須懸浮液50uL。然后將各管用Vortex-Genie2TM(Scientific Industries，Bohemia，NY)混勻20秒。將愈傷組織轉(zhuǎn)移回半固體維持培養(yǎng)基中并于黑暗中28℃保溫16小時(shí)。然后如前所述檢驗(yàn)愈傷組織GUS表達(dá)，結(jié)果如表3所示。
表3在不同DNA濃度下200mg愈傷組織經(jīng)觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的GUS表達(dá)
含約200mg愈傷組織的少到10ug DNA／管(0．032ug／uL)的濃度可產(chǎn)生瞬時(shí)GUS表達(dá)。增加DNA量未顯示明顯提高瞬時(shí)GUS表達(dá)。
如本文所述制備代表不同未成熟胚衍生品系的Ⅱ型愈傷組織樣品約500mg，并加入17x100mm培養(yǎng)管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中。在各管中加入液體維持培養(yǎng)基500uL和50uLDNA溶液(0．5ug／uL pDAB418溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8．0)。然后將愈傷組織／DNA混合物在室溫或冰上放1小時(shí)。在缺少DNA的條件下溫育愈傷組織作為陰性對(duì)照。然后加入40ug／uL(SC-9)觸須懸浮液50uL并如上所述混勻。將愈傷組織轉(zhuǎn)移回含2．5g／L GELRITE的固體維持培養(yǎng)基中并于黑暗中28℃保溫16小時(shí)。之后如前所述檢測(cè)愈傷組織的GUS表達(dá)。結(jié)果總結(jié)于表4。
表4與DNA預(yù)保溫1小時(shí)條件下愈傷組織經(jīng)觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的GUS表達(dá)
在與觸須攪拌前溫育愈傷組織和DNA導(dǎo)致較低的瞬時(shí)GUS表達(dá)，當(dāng)室溫保溫時(shí)更是如此。在臨進(jìn)行觸須處理前加入DNA可觀察到最好的結(jié)果。
將代表不同未成熟胚衍生品系的Ⅱ型愈傷組織樣品約200mg或放于滲透培養(yǎng)基(含36．4g／L山梨醇和36．4g／L甘露醇的維持培養(yǎng)基)中保溫4小時(shí)，或保持于維持培養(yǎng)基上。然后將愈傷組織放于17x100mm培養(yǎng)管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中并在各管中加入液體滲透培養(yǎng)基或液體維持培養(yǎng)基200uL、20uL DNA溶液(1．0ug／uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8．0)和40ug／uL(Alfa)觸須懸浮液50uL。然后將各管用Vortex-Genie2TM混勻20秒，將愈傷組織轉(zhuǎn)移回用2．5g／L GELRITE凝固的滲透培養(yǎng)基或維持培養(yǎng)基中并于黑暗中28℃保溫16小時(shí)。之后如前所述檢測(cè)愈傷組織的GUS表達(dá)。結(jié)果總結(jié)于表5。
表5在觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化前和／或后經(jīng)滲透處理的愈傷組織的GUS表達(dá)
在于觸須混合前經(jīng)過(guò)滲透處理的培養(yǎng)物中瞬時(shí)GUS表達(dá)最高。
將代表不同細(xì)胞系的Ⅱ型愈傷組織樣品約200mg放于滲透培養(yǎng)基中并保溫4小時(shí)。然后將愈傷組織加入17x100mm培養(yǎng)管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中并在每管中加入200uL液體滲透培養(yǎng)基(無(wú)GELRITE)、20uL DNA溶液(1．0ug／uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8．0)和40ug／uL(Alfa)觸須懸浮液25、50或100uL。各管用Vortex-Genie2TM混勻20或60秒。將愈傷組織轉(zhuǎn)移回液體滲透培養(yǎng)基上并于黑暗中28℃保溫16小時(shí)，之后如前所述檢測(cè)愈傷組織的GUS表達(dá)。結(jié)果總結(jié)于表6。
表6用不同觸須量轉(zhuǎn)化20和60秒的愈傷組織GUS表達(dá)
對(duì)總觸須量平均后，與20秒攪拌相比，攪拌60秒觀察到最高的GUS表達(dá)。不過(guò)，攪拌60秒似乎對(duì)愈傷組織有很大的傷害。使用100uL觸須懸液(4mg觸須／管)時(shí)也觀察到高GUS表達(dá)。我們的數(shù)據(jù)表明增加觸須量可補(bǔ)償攪拌時(shí)間，反之亦然。最優(yōu)選的條件是與100uL觸須混合20秒。
將代表不同細(xì)胞系的Ⅱ型愈傷組織樣品約500mg放于滲透培養(yǎng)基中并保溫4小時(shí)。然后將愈傷組織加入17x100mm培養(yǎng)管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中并在每管中加入1000uL液體滲透培養(yǎng)基、27．7uL DNA溶液(0．72ug／uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8．0)和用Silar SC-9(Advanced Composite，Greer，SC)或Alfa Aesar(Johmson Matthey，Ward Hill，MA)觸須配制的40ug／uL觸須懸浮液200uL。各管用Vortex-Genie2TM混勻20秒，將愈傷組織轉(zhuǎn)移回用2．5g／L GELRITE凝固的滲透培養(yǎng)基上并于黑暗中28℃保溫16小時(shí)，之后如前所述檢測(cè)愈傷組織的GUS表達(dá)，結(jié)果總結(jié)于表7。
表7轉(zhuǎn)化中觸須類(lèi)型的比較
盡管兩者均有表達(dá)，但用Silar SC-9觸須比用Alfa Aesar觸須可觀察到更好的瞬時(shí)GUS表達(dá)。
將代表不同細(xì)胞系的Ⅱ型愈傷組織樣品約500mg放于滲透培養(yǎng)基中并保溫4小時(shí)。然后將愈傷組織加入17x100mm培養(yǎng)管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)或15mL圓錐形離心管(Corning25319-15，Corning，NY)中。在每管中加入1000uL液體滲透培養(yǎng)基、20uL DNA溶液(1．0mg／mL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8．0)和40ug／uL(Alfa)觸須懸浮液200uL。各管用Vortex-Genie或Caulk Vari-Mix Ⅱ(Estrada Dental，Rancho Cucamonga，CA)攪拌20秒。將愈傷組織轉(zhuǎn)移回固體滲透培養(yǎng)基上并保溫16小時(shí)，如前所述檢測(cè)愈傷組織的GUS活性(表8)。
表8容器和混合儀類(lèi)型對(duì)觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化愈傷組織的影響
用Vortex和Vari-Mix攪拌后都觀察到高水平的瞬時(shí)GUS表達(dá)；不過(guò)Vortex混勻似乎更好一些。實(shí)施例5穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因玉米植株的生產(chǎn)和再生將Ⅱ型愈傷組織樣品約200mg放于滲透培養(yǎng)基中并保溫4小時(shí)。然后將愈傷組織加入17x100mm培養(yǎng)管(Falcon2059，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)中并在每管中加入200uL液體滲透培養(yǎng)基、20uLDNA溶液(1．0ug／uL pUGN81-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8．0)和40ug／uL(Alfa)觸須懸浮液100uL。各管用Vortex-Genie2TM混勻20秒，將愈傷組織轉(zhuǎn)移回用2．5g／L GELRITE凝固的滲透培養(yǎng)基上并在選擇前恢復(fù)約48小時(shí)。
將經(jīng)觸須處理的愈傷組織置于選擇培養(yǎng)基[含30mg／LBastaTM(Hoechst，F(xiàn)rankfurt，Germany)的維持培養(yǎng)基，無(wú)酶促酪蛋白水解物或L-脯氨酸]上并在約3-4個(gè)月的期間內(nèi)每4周轉(zhuǎn)移到新鮮的選擇培養(yǎng)基中。10-20周后，每?jī)芍芊蛛x活躍生長(zhǎng)的集落并傳代培養(yǎng)至新鮮的選擇培養(yǎng)基中以便在再生前擴(kuò)大培養(yǎng)愈傷組織。
為進(jìn)行植物再生，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，見(jiàn)下文，保溫于28℃中16小時(shí)／8小時(shí)的光／暗光周期，低亮度光(13mE／m2／sec)，持續(xù)一周，然后28℃中16小時(shí)／8小時(shí)的光／暗光周期，高亮度光(40mE／m2／sec)中，持續(xù)一周，光照由涼白熒光燈提供。誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含MS鹽和維生素(Murashige和Skoog，1962，植物生理學(xué)15473-497)、30g／L蔗糖、100mg／L肌醇、5mg／L芐氨基嘌呤、0．025mg／L2，4-D、2．5g／L GELRITE并調(diào)到pH5．7。在此兩周的誘導(dǎo)期后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上并于高亮度光(40mE／m2／sec)中28℃保溫。再生培養(yǎng)基包含MS鹽和維生素、30g／L蔗糖和2．5g／L GELRITE并調(diào)到pH5．7。將愈傷組織每約兩周傳代培養(yǎng)一次至新鮮再生培養(yǎng)基中直到小植株出現(xiàn)。誘導(dǎo)和再生培養(yǎng)基均含30mg／L BastaTM。將小植株轉(zhuǎn)移到含約0．1kg干Metro-Mix360(The Scotts Co，Marysville，OH)的10cm花盆中，放在溫室，保持徹底潮濕，并用透明塑料杯蓋2-4天。待有3-5片葉片時(shí)，將植物移植到裝有土壤的5加侖花盆中并生長(zhǎng)至成熟。實(shí)施例6轉(zhuǎn)化的愈傷組織和植物組織的DNA印跡分析用特異于目的基因編碼區(qū)的DNA探針，通過(guò)DNA印跡分析鑒定BASTA抗性品系，以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的存在。對(duì)來(lái)自愈傷組織和葉片材料的DNA均進(jìn)行分析。
對(duì)于愈傷組織，凍干前將材料在蒸餾水中浸泡30分鐘并轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿上。在6-8片葉片期收獲植物的葉片材料。如Saghai-Maroof等所述從凍干組織中制備基因組DNA((1984)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)818014-8018)。在制造商(Bethesda Research，Gaithersburg，MD)推薦條件下用特異于各質(zhì)粒構(gòu)建體的限制性酶消化DNA各8ug，并在0．8％的瓊脂糖凝膠上電泳分離。然后如Southern((1975)分子生物學(xué)雜志98503-517)所述將DNA印跡到尼龍膜上。用50mCi[a-32P]dCTP(Amersham Life Science，Arlington Heights，IL)，使用Oligolabelling Kit(Pharmacia LKB，Piscataway，NJ)制備特異于GUS編碼區(qū)的1．9kb DNA探針。然后將放射性探針與印跡上的基因組DNA在45mL的基本雜交緩沖液(10％聚乙二醇、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0．6xSSC(其中1xSSC是0．15M NaCl、0．015M檸檬酸鈉，pH7．0)、10mM磷酸鈉、5mM EDTA和100ug／mL變性鮭精DNA)中60℃雜交過(guò)夜。雜交后，將印跡用0．25xSSC和0．2％SDS在60℃洗45分鐘，印干并在兩增強(qiáng)屏(DuPont，Newark，DE)上對(duì)XAR-5膠片(Kodak，Rochester，NY)曝光過(guò)夜。
通過(guò)Southern分析檢測(cè)再生自轉(zhuǎn)基因愈傷組織系的植物，發(fā)現(xiàn)所有這些植物均具4．2kb雜交產(chǎn)物。預(yù)期雜交產(chǎn)物含遍在蛋白-1啟動(dòng)子／內(nèi)含子、GUS編碼序列和nos3’非翻譯區(qū)。由所給培養(yǎng)物再生的各植物均展示相同的雜交模式。實(shí)施例7胚發(fā)生性Ⅰ型稻愈傷組織的建立為了引發(fā)稻胚發(fā)生性Ⅰ型愈傷組織培養(yǎng)物，將稻栽培品種Japonica，Taipei309的成熟種子脫殼并用70％(v／v)酒精表面消毒分鐘，隨后浸泡于含幾滴LIQUI-NOX(Alconox，Inc．，New York，NY))的市售50％(v／v)漂白液中。在轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基[N6常量營(yíng)養(yǎng)物(Chu，1978，植物組織培養(yǎng)進(jìn)展研討會(huì)，Peking Press，第43-56頁(yè))、B5微量營(yíng)養(yǎng)物和維生素(Gamborg等，Exp．Cell Res．50151-158)、30mg／L酪蛋白水解物、500mg／L L-脯氨酸、500mg／L L-谷氨酰胺、30g／L蔗糖、2mg／L2，4-D和2．5g／L GELRITE，pH5．8]中前將種子用無(wú)菌水洗3次并置于濾紙上。種子培養(yǎng)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并于黑暗中28℃保溫3周。之后，將誘發(fā)自盾形區(qū)的新初級(jí)愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中以便進(jìn)一步的維持。一般說(shuō)來(lái)，在各次傳代培養(yǎng)后以其形態(tài)為基礎(chǔ)選擇胚愈傷組織。稻Ⅰ型胚發(fā)生性愈傷組織的一般形態(tài)是硬的致密結(jié)節(jié)狀結(jié)構(gòu)，有時(shí)顯示類(lèi)胚形，在某些情況下不顯示這種形態(tài)。該材料被稱(chēng)為Ⅰ型。實(shí)施例8觸須制備、優(yōu)化和稻Ⅰ型愈傷組織轉(zhuǎn)化臨送遞DNA前，如前所述在水中制備50ug／uL無(wú)菌碳化硅觸須(Silar SC-9)懸液。選擇不到4個(gè)月大的Ⅰ型稻胚發(fā)生性愈傷組織約125-500mg，并轉(zhuǎn)移至已裝入約250uL液體起始培養(yǎng)基(無(wú)GELRITE的起始培養(yǎng)基)的15mL Corning圓錐離心管或1．5mL微量離心管中。然后，加入約10-160uL50ug／uL觸須溶液和約25uL1ug／uL pDAB418DNA溶液，立即用Vortex Genie2TM以盡可能高的速度混勻15-120秒。之后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到有或無(wú)高滲透劑(0．2M甘露醇和0．2M山梨醇；Vain等，1993，Plant Cell Rep．1284-88)的起始培養(yǎng)基中，28℃黑暗中保溫約24小時(shí)，檢測(cè)GUS活性。
按照J(rèn)efferson等(1987，EMBO J63901-3907)和本文所述進(jìn)行GUS組織化學(xué)檢驗(yàn)。將組織置于24-孔微量滴定板(Corning，New York，NY)上，每孔中含500uL檢驗(yàn)緩沖液。檢驗(yàn)緩沖液由以下成分組成0．2M磷酸鈉(pH8．0)、0．1mM鐵氰化鉀、0．1mM亞鐵氰化鉀、1．0MNaEDTA、1．9mM 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸和0．06％tritonX-100。在用顯微鏡檢測(cè)組織表達(dá)前將平板于黑暗中37℃保溫1-2天。檢測(cè)碳化硅觸須介導(dǎo)的DNA送遞，以GUS瞬時(shí)表達(dá)表示，即GUS表達(dá)單位(藍(lán)點(diǎn))／樣品。
檢測(cè)許多不同的轉(zhuǎn)化參數(shù)以確定轉(zhuǎn)化所需的最佳條件。一些檢測(cè)參數(shù)包括混勻時(shí)間、加入50ug／uL觸須溶液的量、在觸須處理前和／或后用高滲透劑處理、每次轉(zhuǎn)化所用組織量和容器大小。在所有這些實(shí)驗(yàn)中，除非另外提及，否則與本文所述流程基本相同。
研究混合時(shí)間(15-60秒)對(duì)于DNA送遞入稻胚發(fā)生性Ⅰ型愈傷組織的影響。此實(shí)驗(yàn)中，在用觸須轉(zhuǎn)化前用高滲透劑處理愈傷組織約4小時(shí)，在用觸須處理后再用高滲透劑處理愈傷組織約16小時(shí)。將250mg愈傷組織放入15mL Corning圓錐離心管中，加入1000uL液體起始培養(yǎng)基、25uL1ug／uL DNA溶液(pDAB418)和100uL50ug／uL觸須溶液，轉(zhuǎn)化愈傷組織。多套樣品分別混合15、30、60和120秒，結(jié)果定量顯示于表9中。
表9混合時(shí)間對(duì)稻Ⅰ型胚發(fā)生性愈傷組織轉(zhuǎn)化的影響
可見(jiàn)，盡管稻Ⅰ型胚發(fā)生性愈傷組織的形態(tài)堅(jiān)硬致密，混合時(shí)間少至15秒時(shí)DNA送遞和愈傷組織轉(zhuǎn)化仍是可能的。
在保持恒定體積(1000uL)液體起始培養(yǎng)基的條件下測(cè)定改變加入觸須的量對(duì)表達(dá)的影響。在觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化前和后用高滲透劑處理愈傷組織樣品。選擇約250mg愈傷組織并轉(zhuǎn)移到已加入無(wú)GELRITE之1000uL液體起始培養(yǎng)基的15mL Corning圓錐離心管中。加入不同量的50ug／uL觸須溶液(10、20、40、80和160uL)和25uL1ug／uL DNA溶液(pDAB418)，之后用Vortex Genie2TM混勻60秒。然后將樣品轉(zhuǎn)移回含高滲透劑的起始培養(yǎng)基中過(guò)夜，再進(jìn)行組織化學(xué)GUS檢驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表10。發(fā)現(xiàn)GUS表達(dá)與加入觸須量的增加相關(guān)。
表10在保持起始培養(yǎng)基體積恒定的條件下增加觸須量的影響
研究高滲透劑對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果總結(jié)于表11。此實(shí)驗(yàn)中，在觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化后用高滲透劑處理愈傷組織或不用高滲透劑處理。將約250mg愈傷組織轉(zhuǎn)移到1．5mL微量離心管中。加入約250uL液體起始培養(yǎng)基，然后加入125uL50ug／uL觸須溶液和25uL1ug／uL DNA溶液(pDAB418)。將樣品混合60秒，轉(zhuǎn)移回含或不含高滲透劑的起始培養(yǎng)基中過(guò)夜，再進(jìn)行GUS檢驗(yàn)。與用高滲透劑處理的樣品相比，觸須轉(zhuǎn)化后不用高滲透劑處理的愈傷組織表達(dá)水平較高。
表11混勻后用滲透劑處理及混合時(shí)間對(duì)稻Ⅰ型胚發(fā)生性愈傷組織轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因表達(dá)的影響
研究加入的愈傷組織量和容器大小(1．5mL微量離心管和2．0mL微量離心管)。此實(shí)驗(yàn)中，在保持恒定體積液體起始培養(yǎng)基，即250uL的條件下使用125或250mg愈傷組織。所有各例中均加入125uL50ug／uL觸須溶液和25uL1ug／uL DNA溶液(pDAB418)，再用VortexGenie2TM混勻60秒。轉(zhuǎn)化后，將愈傷組織樣品在含高滲透劑的起始培養(yǎng)基中保溫過(guò)夜，再進(jìn)行GUS檢驗(yàn)。結(jié)果總結(jié)于表12。
表12容器大小和加入的組織量對(duì)稻Ⅰ型愈傷組織經(jīng)觸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的影響
液、1xPCR緩沖液(包括1．5毫摩爾氯化鎂)、2．5單位TaqⅠDNA聚合酶(用Perkin-ElmerAmpliTaQ，GIBCO Platinum，Pwo DNA聚合酶或Tahara Shuzo Taq聚合酶)存在下，用50-200ng基因組DNA作為模板。
在一些例子中，通過(guò)加入10微升DMSO或50微升2M甜菜堿來(lái)優(yōu)化PCR。
加熱開(kāi)始后(在95℃初步培育整個(gè)混合物3分鐘期間加入聚合酶)，每個(gè)樣品經(jīng)歷兩個(gè)步驟的擴(kuò)增開(kāi)頭5輪的進(jìn)行用排除限制性酶尾部的寡核苷酸的解鏈溫度作為雜交溫度，隨后的30輪根據(jù)全長(zhǎng)寡核苷酸的雜交溫度來(lái)進(jìn)行。這些輪后是最后在72℃下延伸10分鐘。
標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)如下
延伸時(shí)間隨待擴(kuò)增ORF的長(zhǎng)度不同而不同。
擴(kuò)增用9600或2400 Perkin Elmer GeneAmp PCR系統(tǒng)進(jìn)行。為了檢查結(jié)果，將1／10的擴(kuò)增體積裝載到1-1．5％瓊脂糖凝膠上，將各擴(kuò)增片段的大小與DNA分子量標(biāo)記作比較。
將擴(kuò)增的DNA直接上樣到1％瓊脂糖凝膠上，或是先用乙醇沉淀，然后重懸于合適的體積中，上樣到1％瓊脂糖凝膠上。然后用Qiagen凝膠抽提試劑盒按照生產(chǎn)商說(shuō)明從凝膠中洗脫并純化獲得對(duì)應(yīng)于大小正確條帶的DNA片段。該DNA片段的最終體積為30微升或50微升的水，或10毫摩爾Tris，pH8．5。
D)PCR片段的消化將對(duì)應(yīng)于擴(kuò)增片段的純化的DNA分成2等份，用以下物質(zhì)進(jìn)行雙重消化-NdeⅠ／XhoⅠ或NheⅠ／XhoⅠ，用于克隆到pET-21b+中，該蛋白進(jìn)一步表達(dá)成C-端His-尾融合物-BamHⅠ／XhoⅠ或EcoRⅠ／XhoⅠ，用于克隆到pGEX-KG中，該蛋白進(jìn)一步表達(dá)成N-端GST融合物-EcoRⅠ／PstⅠ，EcoRⅠ／SalⅠ，SalⅠ／PstⅠ，用于克隆到pGex-His中，該蛋白進(jìn)一步表達(dá)成N-端His-尾融合物在合適的緩沖液存在下，使各純化DNA片段與20單位的各種限制性酶(NewEngland Biolabs)在30或40微升的最終體積中培育(37℃培育3小時(shí)至過(guò)夜)。然后用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的稻Ⅰ型愈傷組織的生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因植物的再生為了生產(chǎn)穩(wěn)定的稻轉(zhuǎn)基因植物，如本文所述產(chǎn)生稻Ⅰ型愈傷組織并進(jìn)行觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化。一般地，將經(jīng)過(guò)或未經(jīng)過(guò)高滲透劑處理4小時(shí)的250mg稻Ⅰ型愈傷組織加入1．5mL微量離心管中。還加入250uL液體起始培養(yǎng)基、125uL50ug／uL觸須溶液和25uL1ug／uL DNA溶液(pDAB305和pUbiHyg，比例1∶1)。如前所述混勻60秒以保證DNA的送遞。觸須介導(dǎo)DNA送遞后，如前所述將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含高滲透劑的起始培養(yǎng)基中24小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中。選擇培養(yǎng)基由起始培養(yǎng)基和30mg／L潮霉素(CalBiochem-NovabiochemCorporation，La Jolla，CA)組成。兩周后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含50mg／L潮霉素的選擇培養(yǎng)基中(Li等，1993，Plant Cell Rep．12250-255)。將培養(yǎng)物置于選擇培養(yǎng)基上，30-45天后形成致密的白黃色胚發(fā)生性愈傷組織培養(yǎng)物。然后將這些培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含50mg／L潮霉素的預(yù)再生(PR)培養(yǎng)基中并在黑暗中保持于28℃條件下。PR培養(yǎng)基由起始培養(yǎng)基和2mg／L芐氨基嘌呤(BAP)、1mg／L萘乙酸(NAA)和5mg／L脫落酸(ABA)組成。兩周后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到再生(RN)培養(yǎng)基中，其中RN培養(yǎng)基是起始培養(yǎng)基加3mg／L BAP和0．5mg／L NAA。RN培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物在高熒光燈(325英尺燭光(ft-candle))下28℃保溫直到小植株出現(xiàn)。當(dāng)小植株芽長(zhǎng)到約2cm時(shí)，將它們轉(zhuǎn)移到含以下成分培養(yǎng)基的Magenta GA7盒(Magenta Corp．，Chicago，IL)中MS常量和微量營(yíng)養(yǎng)物、1∶1稀釋于水中的B5維生素(Gamborg等，1968，Exp．CellRes．50151-158)、10g／L蔗糖、0．05mg／L NAA、50mg／L潮霉素、2．5g／LGELRITE并調(diào)到pH5．8。當(dāng)小植株建立了發(fā)育良好的根系后，將它們轉(zhuǎn)移到土壤／metromix360(1∶1)中并在溫室內(nèi)(29℃／24℃白天／黑夜循環(huán)、50-60％濕度、12小時(shí)光周期)培養(yǎng)直到成熟。這些植物的DNA印跡分析顯示有潮霉素基因存在，表明它們確實(shí)被轉(zhuǎn)化了。這些植物在溫室中成功地長(zhǎng)到成熟。實(shí)施例11pSMGN179-3的質(zhì)粒描述表達(dá)載體pSMGN179-3包含驅(qū)動(dòng)β-葡糖醛酸糖苷酶基因、由Gelvin和Hauptmann，(1995)專(zhuān)利WO95／14098中描述的根癌農(nóng)桿菌冠癭堿合酶基因嵌合調(diào)節(jié)區(qū)的修飾衍生物。質(zhì)粒pSMGN179-3是5541個(gè)堿基對(duì)的雙鏈植物轉(zhuǎn)化載體，包括以下順時(shí)針?lè)较虻男蛄械?-16位核苷酸具有pUC19(Yanish-Perron等，(1985)基因33103-119)的質(zhì)粒骨架多克隆序列AATTCGAGCT CGGTAC。pSMGN179-3的第17-57位核苷酸含接頭片段序列CGGGCCCCCC CTCGAGGTCGACGGTATCGA TAAGCTTGAT C。pSMGN179-3的第58-277位堿基相應(yīng)于根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTi15955T-DNA(Barker等(1983)植物分子生物學(xué)2335-350)第13774-13993位堿基的反向互補(bǔ)物。這些堿基相應(yīng)于來(lái)自章魚(yú)堿合酶(ocs)基因的上游活化序列。第278-304位堿基相應(yīng)于接頭DNA序列CGAATTCCAA GCTTGGGCTG CAGGTCA。第305-350位堿基相應(yīng)于根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTi15955T-DNA(Barker等(1983)植物分子生物學(xué)2335-350)第21475-21520位堿基的反向互補(bǔ)物。pSMGN179-3的第351-737位堿基含根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒pTi15955T-DNA(Barker等(1983)植物分子生物學(xué)2335-350)β-葡糖醛酸糖苷酶基因第20128-20514位堿基的反向互補(bǔ)物。pSMGN179-3的第305-737位序列包括Gelvin和Haupman，(1995)專(zhuān)利WO95／14098所述的△MAS啟動(dòng)子。pSMGN179-3的第738-763位堿基包含接頭序列CTCTAGAACT AGTGGATCCG TCGACC。pSMGN179-3的第58-763位堿基包含SEQ ID NO1中所給的啟動(dòng)子和非翻譯前導(dǎo)序列調(diào)節(jié)融合序列。pSMGN179-3的第764-2615位核苷酸相應(yīng)于質(zhì)粒pBⅠ101(Clontech，Palo Alto，CA)編碼β-葡糖醛酸糖苷酶基因的第2551-4402位核苷酸(Jefferson等，(1986)PlantMol．Biol．Rep．83(22)8447-8451)。第767-769位堿基從TTA改變成GTC。β-葡糖醛酸糖苷酶基因之后是多接頭序列TGGGGAATTG，相應(yīng)于pSMGN179-3的第2616-2625位堿基。第2626-2895位堿基相應(yīng)于pBⅠ101(Clontech，Palo Alto，CA)的第4414-4683位，其中包含來(lái)自胭脂堿合酶3’非翻譯區(qū)的序列(Jefferson等，(1986)PlantMol．Biol．Rep．83(22)8447-8451)。pSMGN179-3的剩余序列(第4684-5541位核苷酸)相應(yīng)于來(lái)自pUC19之質(zhì)粒骨架核苷酸的反向互補(bǔ)物(Yanish-Perron等，(1985)基因33103-119)。實(shí)施例12胚發(fā)生棉花愈傷組織的轉(zhuǎn)化將約250mg來(lái)自不同幼苗衍生株系的棉花愈傷組織置于滲透培養(yǎng)基(維持培養(yǎng)基加36．4g／L山梨醇和36．4g／L甘露醇)上并于黑暗中保溫4小時(shí)。然后將愈傷組織加入17x100mm培養(yǎng)管(Falcon2059，BectonDickinson，Lincoln Park，NJ)中，并在每管中加入250uL液體滲透培養(yǎng)基(無(wú)GELRITE)、20uL DNA溶液(1．0ug／uL pSMGN179-3溶于10mM Tris，1mM EDTA，pH8．0)和40mg／mL(Alfa)觸須懸浮液50uL。各管用Vortex-Genie2TM(Scientific Industries，Bohemia，NY)混勻40、80或160秒。將愈傷組織轉(zhuǎn)移回用2．5g／L GELRITE凝固的滲透培養(yǎng)基上并于黑暗中28℃保溫16小時(shí)，之后如前所述檢測(cè)愈傷組織的GUS表達(dá)。結(jié)果顯示于表13。
表13使用不同攪拌時(shí)間的觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化棉花愈傷組織后GUS的表達(dá)
在觸須處理的棉花愈傷組織中觀察到GUS表達(dá)。將攪拌時(shí)間從40秒延長(zhǎng)到160秒未顯示能顯著增加表達(dá)量。實(shí)施例13質(zhì)粒pDAB305的產(chǎn)生質(zhì)粒pDAB305是5800bp的質(zhì)粒，含有具串聯(lián)拷貝花椰菜花葉病毒35S增強(qiáng)子(35S)的啟動(dòng)子、Adh1內(nèi)含子1的缺失變體和與β-葡糖醛酸糖苷酶基因融合之玉米條斑花葉病毒衣殼蛋白的非翻譯前導(dǎo)序列，其后是nos3’UTR。制備如下原始材料是Odell等(1985自然313810-812)所述的質(zhì)粒pUC13／35S(-343)。起始于pUC13之SmaⅠ位點(diǎn)的3’末端(Messing，1983酶學(xué)方法，Wu，R．編，10120-78)，并按緊鄰pUC13之lacZ基因非編碼鏈的鏈閱讀，該質(zhì)粒包含CaMV的第6495-6972位核苷酸，其后是接頭序列CATCGATG(編碼ClaⅠ識(shí)別位點(diǎn))，之后是CaMV的第7089-7443位核苷酸，再之后是接頭序列CAAGCTTG，后一序列包含HindⅢ的識(shí)別位點(diǎn)，之后是pUC13質(zhì)粒DNA的剩余序列。
用ClaⅠ和NcoⅠ消化質(zhì)粒pUC13／35S(-343)DNA，用瓊脂糖凝膠電泳將3429個(gè)堿基對(duì)(bp)的大片段與66bp的小片段分離，然后用標(biāo)準(zhǔn)方法純化。用ClaⅠ消化DNA，然后通過(guò)T4 DNA聚合酶處理補(bǔ)平突出端。將平端DNA與含NcoⅠ識(shí)別位點(diǎn)的合成寡核苷酸接頭序列CCCATGGG連接。將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，鑒定出所含質(zhì)粒(稱(chēng)pOO#1)具有位于原ClaⅠ位點(diǎn)處的NcoⅠ位點(diǎn)的轉(zhuǎn)化子。用NcoⅠ消化pOO#1的DNA并將大片段的匹配端再連接，導(dǎo)致從pOO#1中缺失70bp，從而產(chǎn)生中間質(zhì)粒pOO#1Nco*。
用EcoR V消化質(zhì)粒pOO#1Nco*DNA，并將平端與具序列CATCGATG的ClaⅠ接頭連接。鑒定所含質(zhì)粒在原EcoR V位點(diǎn)處有一新ClaⅠ位點(diǎn)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，該質(zhì)粒被稱(chēng)為pOO#1Nco*RV＞Cla。然后用ClaⅠ和NcoⅠ消化此DNA，從瓊脂糖凝膠上純化小片段(268bp)。然后將此片段與前面制備的pUC13／35S(-343)的3429bpClaⅠ／NcoⅠ片段連接，鑒別出所含質(zhì)粒具3429和268bp ClaⅠ／NcoⅠ片段的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。該質(zhì)粒被稱(chēng)為pUC13／35S En。
用NcoⅠ消化質(zhì)粒pUC13／35S En DNA，通過(guò)T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平突出端。然后用SmaⅠ切割處理過(guò)的DNA，并與具序列CAGATCTG的BgⅢ接頭連接。鑒別出所含質(zhì)粒中416bp SmaⅠ／NcoⅠ片段已被至少兩拷貝BgⅢ接頭置換的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，稱(chēng)為p35SEn2。p35S En2的DNA結(jié)構(gòu)如下由pUC13之lacZ基因非編碼鏈的緊鄰鏈上SmaⅠ位點(diǎn)第三個(gè)C殘基后的核苷酸開(kāi)始；后是接頭序列CAGATCTGCA GATCTGCATG GGCGATG，然后是CaMV的第7090-7344位核苷酸，之后是ClaⅠ接頭序列CATCGATG，然后是CaMV的第7089-7443位核苷酸，后面是HindⅢ接頭序列CAAGCTT，再之后是pUC13的剩余序列。此結(jié)構(gòu)的特征是位于病毒基因組EcoRV位點(diǎn)上游區(qū)內(nèi)的CaMV35S啟動(dòng)子的增強(qiáng)子序列(第7090-7344位核苷酸)已被加倍。此啟動(dòng)子構(gòu)建體摻入了天然35S轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，位于HindⅢ位點(diǎn)第1個(gè)A殘基上游11個(gè)核苷酸處。
對(duì)于利用35S啟動(dòng)子和農(nóng)桿菌NOS PolyA序列的質(zhì)粒，用于第一個(gè)構(gòu)建體的原材料是質(zhì)粒pBⅠ221，購(gòu)自CLONTECH(Palo Alto，CA)。該質(zhì)粒含稍改變的CaMV 35S啟動(dòng)子拷貝。由pUC19的PstⅠ位點(diǎn)3’端開(kāi)始(Yanish-Perron等，(1985)基因33103-119)，按pUC19之編碼lacZ基因的同一鏈閱讀，序列依次是接頭核苷酸GTCCCC，其后是CaMV的第6605-7439位核苷酸，后面是接頭序列GGGGACTCTAGAGGATCCCC GGGTGGTCAG TCCCTT。這些堿基之后是包含編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)蛋白質(zhì)之大腸桿菌UidA基因編碼序列的1809bp和來(lái)自大腸桿菌基因組的55bp3’側(cè)翼堿基(Jefferson，1986美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)838447-8451)，然后是SacⅠ接頭序列GAGCTC，其后是接頭序列GAATTTCCCC。這些堿基后面是來(lái)自根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合酶(NOS)基因的RNA轉(zhuǎn)錄終止／聚腺苷酸化信號(hào)序列，包括相應(yīng)于DePicker等(1982J．Molec．Appl．Genet．1561-573)所述之第1298-1554位核苷酸的256bp Sau3AⅠ片段，之后是兩個(gè)C殘基、EcoRⅠ識(shí)別序列GAATTC和pUC19的剩余序列。
用EcoRⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒pBⅠ221DNA，從瓊脂糖凝膠上純化3507bp的片段。用EcoRⅠ和SaIⅠ消化質(zhì)粒pRAJ275(CLONTECH)DNA，從瓊脂糖凝膠上純化1862bp的片段。將這兩片段混合，加入序列為GATCCGGATC CG和TCGACGGATC CG的互補(bǔ)合成寡核苷酸。將這些片段連在一起并通過(guò)限制酶分析鑒定所含質(zhì)粒具有正確DNA結(jié)構(gòu)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。用BalⅠ和EcoRⅠ消化被稱(chēng)為pKA881的該質(zhì)粒DNA，從瓊脂糖凝膠上分離4148bp的片段。同樣地消化pBⅠ221的DNA，凝膠純化1517bp的EcoRⅠ／BalⅠ片段并與上述pKA881片段連接，產(chǎn)生質(zhì)粒pKA882。然后用SacⅠ消化pKA882DNA，用T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平突出端，將片段與序列為CGGATCCG的合成BamHⅠ接頭連接。鑒定出所含質(zhì)粒具有3784和1885bp BamHⅠ片段的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子并稱(chēng)之為pKA882B。然后用BamHⅠ消化pKA882B的DNA，連接混合物片段。鑒定出所含質(zhì)粒用BamHⅠ消化時(shí)具有單條帶3783bp片段的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子并稱(chēng)之為p35S／NOS。該質(zhì)粒除了缺失GUS基因的編碼序列外，具有pBⅠ221的基本DNA結(jié)構(gòu)。因此，CaMV第6605-7439位核苷酸之后是接頭序列GGGGACTCTA GAGGATCCCG AATTTCCCC。接頭序列后面是NOS聚腺苷酸化序列和pBⅠ221的剩余序列。
用EcoRV和PstⅠ消化質(zhì)粒p35S／NOS DNA，純化3037bp片段并與用EcoRV和PstⅠ消化p35S En2DNA獲得的534bp片段連接。鑒定出所含質(zhì)粒用EcoRV和PstⅠ消化產(chǎn)生3031和534bp片段的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子并將此質(zhì)粒稱(chēng)為p35S En2／NOS。該質(zhì)粒包含對(duì)p35S En2描述過(guò)的重復(fù)35S啟動(dòng)子增強(qiáng)子區(qū)，此啟動(dòng)子序列通過(guò)含唯一XbaⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)的接頭序列與NOS多聚腺苷酸化序列隔開(kāi)。
MSV基因組序列已由Mullineaux等(1984EMBO J．33063-3068)和Howell(1984核酸研究127459-7375)公布，轉(zhuǎn)錄物由Fenoll等(1988EMBO J．71589-1596)描述過(guò)。全部序列包括154bp，通過(guò)裝配合成寡核苷酸塊分三階段進(jìn)行構(gòu)建。首先合成具下述序列的互補(bǔ)寡核苷酸并用標(biāo)準(zhǔn)方法純化GATCCAGCTG AAGGCTCGAC AAGGCAGATCCACGGAGGAG CTGATATTTG GTGGACA and AGCTTGTCCA CCAAATATCAGCTCCTCCGT GGATCTGCCT TGTCGAGCCT TCAGCTG將這些核苷酸退火產(chǎn)生兩端4個(gè)堿基為單鏈突出端的雙鏈結(jié)構(gòu)，其中一端與BamHⅠ產(chǎn)生的末端(GATC)匹配，另一端與HindⅢ產(chǎn)生的單鏈端(AGCT)匹配。將該退火分子連入已用BamHⅠ和HindⅢ消化的質(zhì)粒pBluescript SK(-)[以下稱(chēng)pBSK；Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA]。這些寡核苷酸的序列使得當(dāng)它們分別與相應(yīng)BamHi和HindⅢ突出端連接后，將保持各自的識(shí)別位點(diǎn)序列。通過(guò)限制酶分析鑒定出所含質(zhì)粒包括所說(shuō)寡核苷酸序列的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，該質(zhì)粒稱(chēng)為pMSVA。
合成具有下述序列的互補(bǔ)寡核苷酸并用標(biāo)準(zhǔn)方法純化AGCTGTGGAT AGGAGCAACC CTATCCCTAA TATACCAGCA CCACCAAGTCAGGGCAATCC CGGG and TCGACCCGGG ATTGCCCTGA CTTGGTGGTGCTGGTATATT AGGGATAGGG TTGCTCCTAT CCAC將這些核苷酸退火產(chǎn)生兩端4個(gè)堿基為單鏈突出端的雙鏈結(jié)構(gòu)，其中一端與HindⅢ產(chǎn)生的分子端(AGCT)匹配，另一端與SalⅠ產(chǎn)生的突出端(TCGA)匹配。這些寡核苷酸的序列使得當(dāng)它們與HindⅢ突出端連接后HindⅢ的識(shí)別序列被破壞。
用HindⅢ和SalⅠ消化pMSV A的DNA并將其與上述退火寡核苷酸連接。通過(guò)限制酶位點(diǎn)作圖鑒定出所含質(zhì)粒包括新寡核苷酸的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，該質(zhì)粒稱(chēng)為pMSVAB。
合成具有下述序列的互補(bǔ)寡核苷酸并用標(biāo)準(zhǔn)方法純化CCGGGCCATT TGTTCCAGGC ACGGGATAAG CATTCAGCCA TGGGATATCAAGCTTGGATC CC and TCGAGGGATC CAAGCTTGAT ATCCCATGGCTGAATGCTTA TCCCGTGCCT GGAACAAATG GC這些寡核苷酸摻入的堿基中包含NcoⅠ、EcoRV、HindⅢ和BamHⅠ的識(shí)別位點(diǎn)。將這些核苷酸退火產(chǎn)生除兩端4個(gè)堿基為單鏈突出端的雙鏈結(jié)構(gòu)，其中一端與XmaⅠ產(chǎn)生的分子末端(CCGG)匹配，另一端與XhoⅠ產(chǎn)生的突出端(TCGA)匹配。將該退火分子連入已用XmaⅠ和XhoⅠ消化的質(zhì)粒pMSV AB DNA中。通過(guò)限制酶分析鑒定出所含質(zhì)粒包括該寡核苷酸序列的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，序列分析證實(shí)了DNA結(jié)構(gòu)。該質(zhì)粒稱(chēng)為pMSV CPL?？偟膩?lái)說(shuō)，它們包含MSV衣殼蛋白(“CP”)基因的5’非翻譯前導(dǎo)序列(“L”)。這些相應(yīng)于Mullineaux等(1984)公布的MSV序列第167-186和188-317位核苷酸，5’端旁側(cè)是BamHⅠ接頭序列GGATCCAG，而3’端旁側(cè)是接頭序列GATATCAAGC TTGGATCCC。相應(yīng)于野生型MSV序列第187位堿基的A殘基在克隆過(guò)程中被不小心地丟失了。
在相應(yīng)于MSV基因組第277位堿基的SmaⅠ位點(diǎn)處消化質(zhì)粒pMSV CPL DNA，將該DNA與序列為CAGATCTG的BglⅡ接頭連接。鑒定出所含質(zhì)粒在原SmaⅠ位點(diǎn)處具有唯一BglⅡ位點(diǎn)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子并通過(guò)DNA序列分析證實(shí)，該質(zhì)粒稱(chēng)為pCPL-Bgl。
在玉米乙醇脫氫酶1(Adh1)內(nèi)含子1的缺失變體構(gòu)建中所用的原材料是獲自V．Walbot，Stanford University，Stanford，CA的質(zhì)粒pVW119。該質(zhì)粒含玉米Adh1．S基因的DNA序列，包括第119-672位核苷酸[Dennis等人(1984核酸研究123983-4000)的編號(hào)]的內(nèi)含子1，Callis等人對(duì)此也有描述(1987基因和發(fā)育11183-1200)。在pVW119中，Dennis等人(1984)編號(hào)的第672位堿基之后的序列是GACGGATCC。用BclⅠ和BamHⅠ消化，從該質(zhì)粒得到556bp片段，上有完整的內(nèi)含子1序列以及外顯子1的14個(gè)堿基和外顯子2的9個(gè)堿基。
用BamHⅠ和BclⅠ消化質(zhì)粒pSG3525a(Pst)DNA，從瓊脂糖凝膠上純化3430bp的片段。用BamHⅠ和BclⅠ消化質(zhì)粒pVW119DNA，凝膠純化546bp的片段并與該3430bp片段連接。鑒定出所含質(zhì)粒在用BamHⅠ和BclⅠ消化時(shí)產(chǎn)生3430和546bp片段的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。該質(zhì)粒稱(chēng)為pSG AdhA1。
用HindⅢ和StuⅠ消化pSG AdhA1的DNA。通過(guò)T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端然后連接。鑒定出所含質(zhì)粒缺少HindⅢ和StuⅠ位點(diǎn)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子并通過(guò)序列分析確認(rèn)DNA結(jié)構(gòu)。該質(zhì)粒稱(chēng)為pSGAdhA1*。在此構(gòu)建體中，已從內(nèi)含子1內(nèi)部缺失了344bp的DNA。這些堿基的丟失不影響該內(nèi)含子的剪接。有功能的內(nèi)含子序列可獲自用BclⅠ和BamHⅠ消化后的213bp片段上。
用BglⅡ消化質(zhì)粒pCPL-Bgl的DNA，并將此線性化DNA與來(lái)自pSG AdhA1*的含Adh1．S內(nèi)含子1缺失變體的213bp BclⅠ／BamHⅠ片段連接。通過(guò)限制酶位點(diǎn)作圖鑒定出所含質(zhì)粒包含有于BglⅡ位點(diǎn)處連入內(nèi)含子序列的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，其中內(nèi)含子的連入方向是BglⅡ／BclⅠ接合點(diǎn)離MSV CPL前導(dǎo)序列的5’端最近，而B(niǎo)glⅡ／BamHⅠ接合點(diǎn)離CPL的3’端最近。此方位通過(guò)DNA序列分析證實(shí)。該質(zhì)粒稱(chēng)為pCPL A1I1*。用BamHⅠ和NcoⅠ消化該質(zhì)粒，并純化373bp片段得到MSV前導(dǎo)／內(nèi)含子序列。
以增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子、MSV CPL和Adh1內(nèi)含子1缺失變體為基礎(chǔ)的植物表達(dá)載體構(gòu)建如下。用BamHⅠ消化質(zhì)粒p35S En2／NOS的DNA，將3562bp線性片段與用BamHⅠ消化pMSV CPL DNA而制備的171bp片段連接。該片段包含完整的MSV CPL序列。通過(guò)限制酶位點(diǎn)作圖鑒定出所含質(zhì)粒包括這些序列的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，其中這些序列的方位為NcoⅠ位點(diǎn)位于NOS PolyA序列附近。該質(zhì)粒稱(chēng)為p35SEn2CPL／NOS。它包括與MSV前導(dǎo)序列直接緊鄰的35S啟動(dòng)子增強(qiáng)變體，從而衍生的轉(zhuǎn)錄物在其5’非翻譯部分包含MSV序列。
用HindⅢ和NcoⅠ消化質(zhì)粒pKA882的DNA，并將4778bp的大片段與含來(lái)自p35S En2CPL／NOS之增強(qiáng)35S啟動(dòng)子序列和MSV前導(dǎo)序列的802bp HindⅢ／NcoⅠ片段連接。鑒定出所含質(zhì)粒用HindⅢ和NcoⅠ消化后具有4778和802bp片段的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，稱(chēng)為pDAB310。在此質(zhì)粒中，35S啟動(dòng)子的增強(qiáng)變體用于控制GUS基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄物的5’非翻譯前導(dǎo)序列部分含有MSV衣殼蛋白基因的前導(dǎo)序列。
用NcoⅠ和SacⅠ消化質(zhì)粒pDAB310的DNA。從瓊脂糖凝膠上純化3717bp的大片段并與序列為CGGTACCTCGAGTTAAC和CATGGTTAACTCGAGGTACCGAGCT的互補(bǔ)合成寡核苷酸連接。當(dāng)這些寡核苷酸退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，產(chǎn)生的分子具有粘性末端，其中一端與ScaⅠ切點(diǎn)、另一端與NcoⅠ切點(diǎn)的末端匹配。除恢復(fù)這兩種酶的識(shí)別位點(diǎn)序列外，形成了新的酶識(shí)別位點(diǎn)KpnⅠ(GGTACC)、XhoⅠ(CTCGAG)和HpaⅠ(GTTAAC)。鑒定出所含質(zhì)粒包括這些酶的識(shí)別位點(diǎn)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，并用序列分析確認(rèn)DNA結(jié)構(gòu)。該質(zhì)粒稱(chēng)為pDAB1148。
用BamHⅠ和NcoⅠ消化質(zhì)粒pDAB1148的DNA，從瓊脂糖凝膠上純化3577bp的大片段，并與純化自用BamHⅠ和NcoⅠ消化后的pCPLA1I1*的373bp片段連接。鑒定出所含質(zhì)粒用BamHⅠ和NcoⅠ消化后產(chǎn)生3577和373bp片段的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，該質(zhì)粒稱(chēng)為pDAB303。該質(zhì)粒DNA構(gòu)成如下由pUC19之PstⅠ位點(diǎn)最后的G殘基之后的堿基(第435位堿基)開(kāi)始，按lacZ基因編碼鏈的緊接鏈方向閱讀，依次是接頭序列ATCTGCATGG GTG，CaMV DNA的第7093-7344位核苷酸，接頭序列CATCGATG，CaMV DNA的第7093-7439位核苷酸，接頭序列GGGGACTCTA GAGGATCCAG，MSV的第167-186位核苷酸，MSV的第188-277位核苷酸，一C殘基，之后是Adh1．S的第119-209位核苷酸，玉米Adh1．S的第555-672位核苷酸，接頭序列GACGGATCTG，MSV的第278-317位核苷酸，具有HpaⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ和SacⅠ識(shí)別位點(diǎn)的多位點(diǎn)接頭序列GTTAACTCGAGGTACCGAGC TCGAATTTCC CC，NOS的第1298-1554位核苷酸和一G殘基，之后是pUC19的剩余序列(包括EcoRⅠ位點(diǎn))。
用NcoⅠ和SacⅠ消化質(zhì)粒pDAB303的DNA，將3939bp片段與制備自同樣消化之pKA882DNA、含GUS編碼區(qū)的1866bp片段連接。通過(guò)限制酶位點(diǎn)作圖鑒定出正確的質(zhì)粒，稱(chēng)為pDAB305。該質(zhì)粒具有pDAB303的增強(qiáng)啟動(dòng)子、MSV前導(dǎo)序列和Adh1內(nèi)含子排列，定位于一定的位置以控制GUS基因的表達(dá)。
質(zhì)粒pDAB305包含帶附加3’序列的增強(qiáng)35S啟動(dòng)子和CaMVDNA的第7093-7344位核苷酸，接頭序列CATCGATG，CaMV DNA的第7093-7439位核苷酸，接頭序列GGGGACTCTAGAGGATCCAG，MSV的第167-186位核苷酸，MSV的第188-277位核苷酸，-C殘基，之后是玉米Adh1．S的第120-210位核苷酸，玉米Adh1．S的第555-672位核苷酸，接頭序列GACGGATCTG，MSV的第278-317位核苷酸，及代表NcoⅠ識(shí)別序列CCATGG最后一個(gè)堿基的G殘基。如上所述，GUS翻譯起始密碼子是NcoⅠ位點(diǎn)的一部分。由此啟動(dòng)子得到的轉(zhuǎn)錄物包含基本上作為5’非翻譯前導(dǎo)序列的MSV衣殼蛋白前導(dǎo)序列，其中已插入了玉米Adh1．S內(nèi)含子1的缺失變體。
序列表<110>Petolino，Joseph FPareddy， Dayakar RHopkins， Nicole LArmstrong， Katherine<120>植物細(xì)胞聚集體和植物組織的觸須介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及其植物的再生<130>50518<140><141><160>1<170>PatentIn Ver． 2．0<210>1<211>706<212>DNA<213>Agrobacterium tumefaciens<400>1ctacaggcca aattcgctct tagccgtaca atattactca ccggtgcgat gccccccactc 60gtaggtgaag gtggaaatta atgatccatc ttgagaccac aggcccacaa cagctaccag 120tttcctcaag ggtccaccaa aaacgtaagc gcttacgtac atggtcgata agaaaaggca 180atttgtagat gttaacatcc aacgtcgctt tcagggatcc cgaattccaa gcttgggctg 240caggtcaatc ccattgcttt tgaagcagct caacattgat ctctttctcg agggagattt 300ttcaaatcag tgcgcaagac gtgacgtaag tatccgagtc agtttttatt tttctactaa 360tttggtcgtt tatttcggcg tgtaggacat ggcaaccggg cctgaatttc gcgggtattc 420tgtttctatt ccaacttttt cttgatccgc agccattaac gacttttgaa tagatacgct 480gacacgccaa gcctcgctag tcaaaagtgt accaaacaac gctttacagc aagaacggaa 540tgcgcgtgac gctcgcggtg acgccatttc gccttttcag aaatggataa atagccttgc 600ttcctattat atcttcccaa attaccaata cattacacta gcatctgaat ttcataacca 660atctcgatac accaaatcga ctctagaact agtggatccg tcgacc70權(quán)利要求
1．一種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，包括(a)從Ⅰ型、Ⅱ型、下胚軸來(lái)源或子葉來(lái)源的愈傷組織培養(yǎng)物或者從分生組織、花粉、子葉或生殖細(xì)胞組織中選擇至少一個(gè)細(xì)胞；并(b)通過(guò)觸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將DNA插入所說(shuō)的細(xì)胞中。
2．一種生產(chǎn)可育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括再生由權(quán)利要求1的方法產(chǎn)生的細(xì)胞。
3．一種生產(chǎn)可育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟(ⅰ)由待轉(zhuǎn)化植物建立可再生的愈傷組織培養(yǎng)物，其中所說(shuō)的愈傷組織培養(yǎng)物選自Ⅰ型、Ⅱ型、下胚軸來(lái)源或子葉來(lái)源的愈傷組織培養(yǎng)物；(ⅱ)由其選擇出植物細(xì)胞聚集體用于轉(zhuǎn)化；(ⅲ)通過(guò)觸須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用DNA轉(zhuǎn)化所說(shuō)的植物細(xì)胞聚集體；(ⅳ)由其鑒定出轉(zhuǎn)化細(xì)胞系；并(ⅴ)由其再生出可育的轉(zhuǎn)基因植物。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的Ⅰ型愈傷組織培養(yǎng)物是由玉米或稻建立的。
5．權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的Ⅱ型愈傷組織培養(yǎng)物是由玉米建立的。
6．權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的下胚軸來(lái)源培養(yǎng)物是由陸地棉建立的。
7．權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的子葉來(lái)源培養(yǎng)物是由陸地棉建立的。
8．權(quán)利要求3的方法，其中所說(shuō)的植物細(xì)胞聚集體在固體培養(yǎng)基上引發(fā)。
9．用權(quán)利要求3-8中任何一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的可育轉(zhuǎn)基因植物。
10．在植物細(xì)胞內(nèi)有功能的DNA構(gòu)建體，其按轉(zhuǎn)錄的5’到3’方向包括在該植物細(xì)胞內(nèi)有功能并具有SEQ ID NO1 DNA序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，以及有義或反義方向的目的基因。
11．按權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其中包括SEQ ID NO1的DNA序列。
全文摘要
可用稱(chēng)為“觸須”的細(xì)長(zhǎng)針狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞聚集體和植物組織。此過(guò)程包括在DNA和觸須存在時(shí)將待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞聚集體和植物組織攪拌,從而促進(jìn)DNA的攝入及其整合。此方法可應(yīng)用于已證實(shí)用其他技術(shù)不易轉(zhuǎn)化的其他植物細(xì)胞聚集體和植物組織。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1292821SQ99803893
公開(kāi)日2001年4月25日 申請(qǐng)日期1999年1月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年1月29日
發(fā)明者J·F·派拖里諾, D·R·帕萊蒂, N·L·霍普金斯, K·阿姆斯特朗 申請(qǐng)人:道農(nóng)業(yè)科學(xué)公司