專利名稱：輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4可變形式的不同細胞毒性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式中，導致細胞毒性顯著改變的序列差異的鑒別。
背景技術(shù)：
認為輪狀病毒是人和動物中嚴重病毒性腸胃炎的最重要的原因(文獻引用1)。輪狀病毒是具有由11個雙鏈RNA區(qū)段構(gòu)成的基因組的、無包膜的三層顆粒。A組輪狀病毒是人和動物中輪狀病毒病的主要原因。
命名為SA11的原型A組輪狀病毒，發(fā)現(xiàn)于人輪狀病毒被鑒定的10年前。Malherbe等(2)描述了從健康東非猿猴的直腸分離出一種病毒猿猴介質(zhì)11(SA11)，和其在東非猿猴腎細胞培養(yǎng)物中的細胞病變作用。該病毒分送給了Holmes等，(Dept．Microbiology,University of Melbourne,Australia)(3),Estes等,(Division of Molecular Virology,Baylor College of Medicine,Houston,TX,USA)(4)，和美國典型培養(yǎng)物保藏中心。不幸的是，不知道各病毒樣品的準確傳代歷史。
稱為NPS4的非結(jié)構(gòu)蛋白4，是A組輪狀病毒的基因10編碼的。在多功能輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4(NSP4)的幾個推測的功能中，是疾病的致病原因(5-11)。該論點根據(jù)對原型輪狀病毒，SA11株編碼的NSP4的過去幾個研究(5-8)作出。
1983年Both等根據(jù)對澳大利亞Holmes等提供的噬斑純化的病毒原種的分析，報道了輪狀病毒SA11株(A組輪狀病毒原型)的基因10的核苷酸序列(12)，其測序通過聯(lián)合數(shù)種方法進行。將基因10的諸部分亞克隆入細菌噬菌體M13中，并用Sanger法測序(13)；將cDNA克隆的其它區(qū)域用Maxam和Gilbert法測序(14)。
NSP4的先前研究(5-8,11,12,15-23)是根據(jù)Both等提供的NSP4基因版本的cDNA克隆。澳大利亞株的原始NSP4序列在推斷的氨基酸序列中氨基酸位置47具有天冬酰胺(NSP4(Asp))(12)。
NSP是一種具有多種功能的跨膜蛋白。它的作用是亞病毒顆粒芽生入感染細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的胞內(nèi)受體(16,21)。NSP4的表達導致Sf9昆蟲細胞中胞內(nèi)鈣水平([Ca2+]i)的升高(5)。觀察到OSU株(一種不同的A組輪狀病毒)的NSP4對細胞內(nèi)鈣水平的改變具有相似的作用(9)。當將NSP4蛋白或合成肽NSP4 114-135外源性加到昆蟲(6)或哺乳動物(8)細胞中時，激活了磷脂酶C(PLC)介導途徑。
對于病毒誘導的許多病原性過程，已提出了鈣在細胞病變作用(CPE)和細胞死亡中的作用(24)。已將[Ca2+]i水平的升高和A組輪狀病毒感染的MA104細胞(猴腎細胞；Biowhittaker Inc.,Walkersville,MD)中的細胞毒性聯(lián)系起來(25)。已提出，NSP4-誘導的細胞毒性是由于在感染細胞中胞內(nèi)鈣水平的升高(5)。已發(fā)現(xiàn)NSP4對哺乳動物細胞有細胞毒性(5,11)。也已顯示NSP4在幼小鼠中起導致腹瀉的腸毒素(7)作用。針對NSP4的抗體在同樣的動物模型中提供了對輪狀病毒的被動保護(7)。
需要開發(fā)具有減弱的細胞毒性，但保留原型輪狀病毒株相似的構(gòu)象，從而仍有抗原性和免疫原性的NSP4可變形式。這種抗原性和免疫原性形式是包括在抗原性組合物中來保護機體抵抗輪狀病毒疾病的候選形式。
發(fā)明簡述因此，本發(fā)明的一個目的是鑒定負責細胞毒性，并提高胞內(nèi)鈣水平的NPS4區(qū)域。
本發(fā)明的還有一個目的是鑒定并開發(fā)具有減弱的細胞毒性，但由于和原型輪狀病毒株的構(gòu)象相近，仍保留抗原性和免疫原性的NSP4可變形式。
如本文所述，與Holmes等得到的并由Both等測序的澳大利亞輪狀病毒株(NSP4(Asn))中的天冬酰胺相比較，在SA11 ATCC輪狀病毒株(NSP4(His))中NSP4的氨基酸位置47有一個組氨酸。該取代形式NSP4(His)，保留了NSP4(Asn)的主要功能，即，細胞毒性和胞內(nèi)鈣改變功能，但它對細胞的細胞毒性更強。
要產(chǎn)生毒性減弱，同時保留其抗原性和免疫原性的NSP4可變形式，需將NSP4氨基酸位置47的組氨酸和天冬酰胺誘變成另一種氨基酸。例如，將編碼氨基酸47的組氨酸密碼子CAT或天冬酰胺密碼子AAT誘變成編碼天冬氨酸的GAA。該氨基酸的其它減毒突變也可用來減弱毒性。
如本文所述的，在SA11 ATCC和澳大利亞輪狀病毒株中的氨基酸位置48有一個賴氨酸。將該賴氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼崽岣吡瞬《緦е碌陌麅?nèi)鈣水平和毒性。因此，也將氨基酸48鑒定為和病毒毒性有關(guān)的位置。為了產(chǎn)生毒性減弱，同時保留其抗原性和免疫原性的NSP4可變形式，可將氨基酸位置48的賴氨酸誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸。
也可將氨基酸位置47和48旁側(cè)的氨基酸用相似方式誘變。還可將NSP4其它區(qū)域的突變和氨基酸位置47和/或48的突變聯(lián)合起來。
如本文還描述的，本發(fā)明也涉及一種分離并純化的核酸序列，它包含的核酸序列編碼(a)輪狀病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺誘變成另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留抗原性和免疫原性的NSP4可變形式；(b)輪狀病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置48的賴氨酸誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留抗原性和免疫原性的NSP4可變形式；或(c)輪狀病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺誘變成另一種氨基酸，并且其中氨基酸位置48的賴氨酸誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留抗原性和免疫原性的NSP4可變形式。
本發(fā)明還涉及構(gòu)建表達上述NSP4可變形式的質(zhì)粒。
為了獲得NSP4可變形式的表達，首先將分離和純化的核酸序列插入一個合適的質(zhì)粒載體中。然后用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染合適的宿主細胞。在本發(fā)明的一個實施例中，宿主細胞是Sf9細胞。然后在允許宿主細胞表達所述NSP4可變形式的條件下培養(yǎng)宿主細胞。
在本發(fā)明的另一個實施例中，用NSP蛋白的可變形式來制備抗原性組合物，該抗原性組合物在哺乳動物宿主中能誘導抗輪狀病毒的保護性免疫應(yīng)答，或能在已感染了輪狀病毒的宿主中改善腹瀉癥狀。該抗原性組合物還可以包含佐劑、稀釋劑或載體。這些佐劑的實例包括氫氧化鋁、磷酸鋁、MPLTM、StimulonTMQS21,IL-12和霍亂毒素。將該抗原性組合物以足以保護宿主抵抗輪狀病毒引起的疾病，或足以在已感染了輪狀病毒的宿主中改善腹瀉癥狀的免疫原性量施給哺乳動物宿主。
附圖簡述

圖1描述了輪狀病毒SA11病毒原種的來源。表明了SA11 ATCC株的傳代史。WLVP代表Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics,VL代表WLVP中用的病毒批號。
圖2表示分別用含有輪狀病毒基因VP6(方塊)、氨基酸47的NSP4(His)(圓形)和氨基酸47的NSP4(Asn)(三角)的重組桿狀病毒以0.2MOI分別感染的Sf9細胞的細胞存活率。用臺酚藍排除試驗在指定時間測量細胞存活率。各時間點的平均值代表三個獨立的感染。
圖3表示Sf9細胞(模擬感染)(左)、在氨基酸位置47表達NSP4(Asn)的Sf9細胞(中間)和在氨基酸47表達NSP4(His)的Sf9細胞(右)中的胞內(nèi)鈣水平。圖象得自表明[Ca2+]i比率(340/380nm)的代表性實驗。
圖4描述了Sf9細胞中NSP4表達的蛋白印跡分析泳道1-氨基酸47的NSP4(His)；泳道2-氨基酸47的NSP4(Asn)；泳道3-作為陽性對照的感染SA11的MA104細胞裂解液；泳道4-分子量標記。
圖5描述了用不含輪狀病毒(模擬感染)(圓形)，含有氨基酸47的NSP4(His)(方塊)、氨基酸47的NSP4(Asn)(十字)、和氨基酸48的NSP4(Glu)(菱形)的重組桿狀病毒感染的Sf9細胞的細胞存活率。以10MOI用重組桿狀病毒感染Sf9細胞。用臺酚藍排除試驗在指定時間測量細胞存活率。各時間點的平均值代表三個獨立的感染。
圖6描述了Sf9細胞(模擬感染)(黑條)和分別表達氨基酸47處的NSP4(Asn)(暗灰條)、氨基酸47處的NSP4(His)(淺灰條)、和氨基酸48處的NSP4(G1u)(白條)的Sf9細胞的胞內(nèi)鈣水平。以10MOI用重組桿狀病毒感染Sf9細胞。在感染48小時后，用熒光鈣指示劑fura-2測量胞內(nèi)鈣。各柱顯示，與模擬感染的Sf9細胞相比的胞內(nèi)鈣水平。各柱代表三個實驗的平均值。
發(fā)明詳述Malherbe等在1963年首先分離出輪狀病毒SA11(2)。Malherbe博士實驗室的SA11傳代歷史已不可得。用于公布序列的病毒傳代史也已不可得。Dr.Estes提供了具有5代傳代史的SA11克隆3。
在RNA病毒中，點突變以規(guī)律性頻率發(fā)生。曾估計輪狀病毒每次復制在每個核苷酸位點有10-4頻率改變的復制錯誤(26)。因此，可能同一病毒的各分離物都有一些核苷酸序列差異。例如，已報道了從同一病毒分離到的SA11的不同克隆中VP7的兩種具有糖基化變體的版本(27)。SA11的基因9中的一個突變導致了VP7的非糖基化形式(克隆28)。因此，該病毒各cDNA克隆的序列或病毒RNA的RT-PCR擴增衍生的一個質(zhì)粒可能不是該病毒共有序列完全準確的代表。
如下文實施例2所述，對美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得的SA11輪狀病毒(ATCC登錄號VR-899)編碼NSP4的基因10(也稱為基因NS28)進行了測序。根據(jù)核苷酸序列，鑒定了SA11的NSP4版本中氨基酸位置47的組氨酸(NSP4(His))，它和先前出版的澳大利亞株(12)的序列只有這一個氨基酸不同，后者在該位點有一個天冬酰胺殘基(NSP4(Asn))。相信本文描述的SA11基因10的序列，即，編碼NSP4(His)的基因，是原型序列。
雖然由于不能確定SA11輪狀病毒的傳代史，明確推斷哪個是真正的基因10的原型序列是困難的，但相信編碼NSP4(His)的序列是共有序列的代表，因為ⅰ)在SA11株的不同傳代號中，包括非常早期的一代(Lot 1N)中觀察到它；ⅱ)通過對兩種RT-PCR產(chǎn)物(病毒群的代表)和各克隆的直接測序已證明了它；ⅲ)還在從其它實驗室(Estes)獲得的不同SA11原種中發(fā)現(xiàn)了它；和ⅳ)44種公開的不同輪狀病毒株的NSP4序列中有43種在位置47具有His。
由于大多數(shù)NSP4研究(5-8,12,15-23)是根據(jù)從Both等的cDNA基因10克隆的表達，所以知道在兩種NSP4變體，即，NSP4(Asn)和NSP4(His)中NSP功能是否是完全保守的很重要。
為了試驗NSP4蛋白的生物功能是否由組氨酸到天冬氨酸的氨基酸取代而改變，將編碼位置47處的組氨酸的密碼子用編碼天冬酰胺的密碼子替換。核苷酸139從A到C的改變導致從天冬酰胺到組氨酸的突變。具體的說，將密碼子(殘基139-141，其中起始密碼子是殘基1-3)從AAT變?yōu)镃AT。將NPS4基因的這兩種版本克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)運載體，然后在昆蟲細胞中表達。
用蛋白質(zhì)印跡和SDS-PAGE檢測了重組桿狀病毒載體感染的Sf9細胞的NSP4表達。用NSP4抗肽抗體檢測到感染的Sf9細胞中有三種形式的NSP4合成兩種為26和28kD的糖基化形式，一種為20kD的非糖基化形式(見圖5)。
SA11 NSP4在哺乳動物細胞中的表達看來是細胞毒性的(5)。在用表達NSP4的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞中已觀察到了反常的形態(tài)改變。近來，Newton等已顯示用重組痘病毒感染的哺乳動物細胞中NSP4的表達導致殺死細胞(11)。本文證明了NSP4表達對昆蟲(Sf9)細胞也有細胞毒性。與表達其它輪狀病毒蛋白質(zhì)，包括VP2、VP4、VP6和VP7的細胞比較，用重組桿狀病毒感染的Sf9細胞中NSP4的表達導致了顯著降低的細胞存活率。
如下文實施例3所述，昆蟲細胞中NSP4(His)的表達誘導了和細胞毒性相關(guān)的主要細胞病變作用。然而，這個氨基酸改變顯著影響了SA11 NSP4的細胞毒性作用程度。在Sf9細胞中表達的NSP4(His)，和NSP4(Asn)比較，導致了細胞死亡率的顯著提高。因此，當在Sf9細胞中表達時，NSP4(His)比NSP4(Asn)細胞毒性更強。如下文實施例7中描述的，證實了該結(jié)果。
最近的數(shù)據(jù)(5)顯示，在Sf9細胞中NSP4的表達導致了胞內(nèi)鈣水平的顯著升高。已指出(5,6)升高的胞內(nèi)鈣可能引起NSP4導致的發(fā)病。如下文實施例4所示，NSP4(His)和NSP4(Asn)都導致胞內(nèi)鈣水平的顯著升高。然而，NSP4(His)的表達導致比NSP4(Asn)更高的胞內(nèi)鈣水平。如下文實施例8中所述，證實了該結(jié)果。在表達NSP4(His)的細胞中觀察到的更高的鈣水平不是由于該蛋白質(zhì)的過度表達，因為在感染了重組桿狀病毒NSP4(Asn)的Sf9細胞中，比感染了重組桿狀病毒NSP4(His)的Sf9細胞中表達更高量的NSP4(見下文實施例5)。因此，位置47的一個氨基酸改變顯著影響NSP4對胞內(nèi)鈣活動性的作用。
負責細胞病變性和毒性的功能性NSP4功能域還未被完全確定。然而，已知NSP4跨越氨基酸14到140的功能域?qū)Π麅?nèi)鈣活動性是重要的，如下文所示(ⅰ)對應(yīng)于NSP4氨基酸114到135的合成肽和完整蛋白質(zhì)在胞內(nèi)鈣活動性(6)和引起腹瀉(7)上功能相似；(ⅱ)Zhang等報道了毒性O(shè)SU病毒由于氨基酸135,136,138中的改變和該同一病毒的非毒性形式不同(9)。然而，其它功能域?qū)SP4的功能可能也是重要的。已顯示NSP4的N-連接糖基化(氨基酸8和18)可能是在病毒形態(tài)發(fā)生中除去臨時性包膜所需的(28)。近來，Newton等報道說H3功能域(氨基酸55到85)對NSP4的細胞毒性和膜去穩(wěn)定活性是關(guān)鍵的(11)。本文描述了一個氨基酸改變(與H2功能域毗鄰位置47從組氨酸到天冬氨酸)顯著改變了NSP4的功能。這些結(jié)果提示除了氨基酸114-140外的功能域?qū)SP4的細胞毒性和鈣活動性是重要的。
NSP4是一種ER跨膜蛋白(圖5)。疏水性分析揭示了三個假定的疏水區(qū)(H1-H3)。已提出了兩種模式的NSP4拓撲結(jié)構(gòu)。Chan等提出第三疏水區(qū)(H3，氨基酸67到85)跨越ER膜，而第二疏水區(qū)(H2，氨基酸28到47)位于ER內(nèi)腔(15,27)。Bergmann等提出H2區(qū)(氨基酸30到54)橫貫ER膜，而H3區(qū)(氨基酸63到80)位于ER的細胞質(zhì)一側(cè)(20)。在Bergmann的模式中，H2區(qū)的一部分(氨基酸30到44)跨越ER膜，而氨基酸47(和氨基酸48)延伸入ER的細胞質(zhì)位置。不受下文所限，氨基酸47(和氨基酸48)可能對NSP4和ER膜的相互作用是重要的。
在位置47將氨基酸從天冬酰胺(它是不帶電荷而且是極性的)改變成組氨酸(它是堿性而且?guī)д姷?導致生理pH下H2區(qū)中電荷的改變。不受下文所限，作為該電荷改變的結(jié)果，由于額外電荷，NSP4(His)可以直接使ER膜去穩(wěn)定，或通過形成NSP4C-末端膜去穩(wěn)定區(qū)(氨基酸114-140)的結(jié)構(gòu)，可以間接損傷ER膜，從而促進了NSP4的膜去穩(wěn)定化活性(18)。
因此，NSP4(His)擁有NSP4(Asn)在致病作用(如細胞毒性和胞內(nèi)鈣改變)中的主要功能。然而，位置47的這一個氨基酸改變顯著影響了SA11 NSP4的細胞毒性。
通過常規(guī)重組DNA技術(shù)將NSP4氨基酸位置47的組氨酸誘變成另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留其抗原性和免疫原性的NSP4可變形式。例如，在氨基酸47處，將編碼組氨酸密碼子CAT或編碼天冬酰胺的密碼子AAT誘變成編碼天冬氨酸的GAA。
也可用其它減毒突變來減弱NSP4的毒性。由于在任何給定位置可能的氨基酸數(shù)目有限，本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便的構(gòu)建一系列質(zhì)粒，各含有在位置47編碼不同氨基酸的不同密碼子。然后可輕易的在本文描述的細胞存活率和胞內(nèi)鈣水平系統(tǒng)中測試所得到的表達的NSP4蛋白，以評估毒性是否減弱。然后在乳(幼)小鼠動物模型系統(tǒng)(7)中測試導致毒性減弱的NSP4可變形式，以證實它們的毒性確實減弱了。然后如下測試毒性減弱的NSP4可變形式，來確認它們保留了抗原性和免疫原性。用NSP4可變形式免疫懷孕小鼠。然后用天然NSP4或完整輪狀病毒攻擊這些免疫母鼠所生的乳小鼠(29)。那些不產(chǎn)生腹瀉的乳小鼠受到了NSP4可變形式免疫的母鼠產(chǎn)生的獲得性母體抗體被動保護。
NSP4氨基酸位置48的殘基也和毒性相關(guān)。澳大利亞和SA11輪狀病毒株都在氨基酸位置48具有賴氨酸。當如下文實施例6-8所述的，通過常規(guī)重組DNA技術(shù)將賴氨酸誘變成谷氨酸時，該可變形式具有顯著的細胞毒性，并在Sf9細胞中導致胞內(nèi)鈣高水平。
因此，為了減弱NSP4的細胞毒性，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員還可輕易的構(gòu)建一系列質(zhì)粒，各含有位置48處編碼谷氨酸以外的不同氨基酸的密碼子。然后方便的在本文所述的細胞存活和胞內(nèi)鈣水平系統(tǒng)中測試得到的表達的NSP4蛋白質(zhì)，來評估毒性是否減弱。然后在上文所述的動物模式系統(tǒng)中測試導致毒性減弱的那些NSP4可變形式以確認它們的毒性減弱，并保留了抗原性和免疫原性。
NSP4可變形式包含那些在氨基酸位置47處具有突變，或在氨基酸位置48具有突變，或在氨基酸位置47和48都具有突變的形式，只要各可變形式的毒性都減弱，同時保留其抗原性和免疫原性。
在本發(fā)明的還有一個實施例中，可以相似方式誘變氨基酸位置47和48旁側(cè)的氨基酸。也可將NSP4其它區(qū)的突變和氨基酸位置47和/或48的突變聯(lián)合起來。
如上文所述，Estes等已集中研究氨基酸114-140之間的功能域。然而，如本文所示，其它區(qū)域?qū)SP4的細胞毒性也是重要的。在H2區(qū)內(nèi)或靠近它的區(qū)域--特別是在氨基酸位置47和/或氨基酸48--被作為產(chǎn)生遺傳脫毒的NSP4蛋白質(zhì)的目標。在H2區(qū)和/或H3區(qū)中引入一個脯氨酸來改變二級/三級結(jié)構(gòu)，并可能因此而減弱細胞毒力。這些進一步的突變可和上文所述氨基酸47的突變聯(lián)合。
這些NSP4可變形式具有減弱的細胞毒性，但仍保持抗原性和免疫原性。這種脫毒的抗原性和免疫原性形式是包括在抗原性組合物中來保護機體抵抗輪狀病毒疾病的候選形式。
本發(fā)明也涉及一種分離并純化的核酸序列，它包含的核酸序列編碼(a)輪狀病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置47的組氨酸或天冬氨酸誘變成了另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留抗原性和免疫原性的NSP4可變形式；(b)輪狀病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置48的賴氨酸誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，來產(chǎn)生毒性減弱，同時保留抗原性和免疫原性的NSP4可變形式；或(c)輪狀病毒NSP4蛋白，其中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺誘變成另一種氨基酸，并且其中氨基酸位置48的賴氨酸誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留抗原性和免疫原的NSP4可變形式。
各種宿主細胞-載體系統(tǒng)適用于表達本文描述的NSP4可變形式。載體系統(tǒng)和所用的宿主細胞相容。合適的宿主細胞包括用質(zhì)粒DNA、粘粒DNA或細菌噬菌體DNA轉(zhuǎn)化的細菌；牛痘病毒和腺病毒等病毒；畢赤細胞等酵母；Sf9或Sf21細胞等昆蟲細胞；或中國倉鼠卵巢細胞等哺乳動物細胞系；以及其它常規(guī)生物體?？蓪⒏鞣N常規(guī)轉(zhuǎn)錄和翻譯元件用于宿主細胞-載體系統(tǒng)。
通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)染或感染將質(zhì)粒引入宿主細胞，由所用宿主細胞-載體系統(tǒng)決定。然后在允許宿主細胞表達NSP4可變形式的條件下培養(yǎng)宿主細胞。
NSP4蛋白質(zhì)的可變形式，可用來制備抗原性組合物，以賦予哺乳動物宿主抗輪狀病毒引起的疾病的保護力，或改善已感染了輪狀病毒宿主的腹瀉癥狀。
可將含有NSP4蛋白可變形式的抗原性組合物和免疫學上可接受的稀釋劑或載體以常規(guī)方式混合，來制備可注射溶液或懸液。抗原組合物誘導的抗體水平可以用某些佐劑，如StimulonTMQs-21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Framingham,MA),MPLTM(3-0-去乙?；涣姿嶂珹；RIBI ImmunoChem Research,Inc.,Hamilton,MT)，磷酸鋁，氫氧化鋁，IL-12(Genetics Institute,Cambridge,MA)和霍亂毒素(野生型或突變型，如其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一種氨基酸，優(yōu)選是組氨酸替換，根據(jù)美國臨時專利申請?zhí)?0/102,430)來提高。
用傳統(tǒng)方式，如皮下、腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)注射入哺乳動物，以及通過口腔、粘膜、鼻內(nèi)或陰道施藥來施用本發(fā)明的抗原組合物，來誘導抵抗輪狀病毒引起的疾病的保護性免疫應(yīng)答，或改善已感染了輪狀病毒的宿主的腹瀉癥狀?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知方法來確定施藥劑量?？捎脝蝿┛乖M合物來賦予保護力或改善癥狀，或可能需要施用幾次加強劑量。
還可將這些可變形式用作配體來鑒定輪狀病毒腸毒素NSP4的目前還未知的受體。它們可通過形成無功能異二聚物來封閉NSP4受體，因而還具有治療腸胃炎病的治療用途。
為了能更好理解本發(fā)明，列出了下列實施例。這些實施例僅用于說明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1細胞、病毒株和病毒感染細胞和SA11輪狀病毒圖1中顯示了該研究中所用的SA11株的歷史。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得SA11輪狀病毒。SA11輪狀病毒原種的Lot 1N(它是1980年遞交的原始未傳代細菌原種(2))，是Dr.Charles Buck的慷慨禮物(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas,VA)。lot 1N的傳代歷史不明確(在靈長類東非猿猴腎細胞和恒河猴胎腎細胞中不知道傳代數(shù))。Lot 1N在ATCC作為Lot2,6,和7的病毒種(Dr.Buck,個人聯(lián)絡(luò))。從ATCC購得了VL589(Lot5)。Lot5在靈長類東非猿猴腎中傳代數(shù)不明，在CV-1細胞中傳了2代。VL589在從ATCC收到后在MA104細胞中傳了1代。還從ATCC獲得了VL919(Lot7，在靈長類東非猿猴腎和恒河猴胎腎細胞中傳代數(shù)不明。而在MA104細胞中傳了5代)。SA11克隆3是Dr.Mary K.Estes(BaylorCollege of Medicine)好意提供的，在MA104細胞中傳了5代。
輪狀病毒感染和病毒RNA分離使MA104細胞生長并維持在改良Dulbecco’s培養(yǎng)基與10％胎牛血清中。用L-1-甲苯磺酰胺-2-苯基乙基氯甲基酮(TPCK)處理的胰蛋白酶(Sigma)以最終濃度10μg/ml活化SA11輪狀病毒30分鐘，并以感染復數(shù)(MOI)10加到MA104細胞中。感染10小時后，用Ultraspec RNA分離系統(tǒng)(Biotecx Laboratories,Inc.,Houston TX)將信使RNA從感染細胞中分離出來。
昆蟲細胞感染使草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆蟲細胞系(命名為Sf9,ATCC登錄號CAL1711)的細胞在無血清SF 900 II(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)或Insect-Xpress(Biowhittaker Inc.)培養(yǎng)基中生長，以密度2.5×105/ml,28℃接種在120rpm的旋回振蕩器上的250mL Erlenmeyer瓶中。以低MOI(0.2)的重組桿狀病毒，密度為1.5×106/mL在振蕩瓶中感染細胞。每24小時收集1毫升細胞懸液，用于細胞存活率研究(通過臺酚藍排除；見下文實施例3)和用于蛋白質(zhì)印跡分析。使細胞在二孔培養(yǎng)室(Nunc Inc.,Naperville,IL)中生長，用于顯影研究。
實施例2RT/PCR和測序用Ready to Go First-Strand Beads(Pharmacia Biotech Inc.,Piscataway,NJ)，然后PCR擴增從純化的病毒信使RNA(實施例1中獲得的)合成了NSP4 cDNA。在PCR反應(yīng)中所用的SA11 NSP4-特異性引物是根據(jù)出版的NSP4序列(12)。SA11NSP4特異性引物的5′末端是ATGGAAAAGCTTACCGACCTC(SEQ ID NO:1)，而SA11特異性引物的3′末端是CTCTTACATTGCTGCAGTC(SEQ ID NO:2)。直接用ABI PRISMTMDNA測序系統(tǒng)(Perkin-Elmer Corporation,Forest City,CA)對PCR產(chǎn)物測序。另外，還對從TATM克隆反應(yīng)物(Invitrogen,San Diego,CA)獲得的各克隆進行了測序。為了對重組桿狀病毒中的NSP4基因測序，將病毒DNA用苯然后是乙醇沉淀抽提出來。用NSP4特異性引物PCR擴增NSP4基因序列。用QiaquickTMSpin試劑盒(Qiagen,Santa Clarita,CA)純化PCR產(chǎn)物，并用ABI PRISMTMDyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction試劑盒(Perkin-Elmer Corporation)對反應(yīng)物進行了測序。
通過對SA11感染細胞的RT-PCR產(chǎn)物，或RT-PCR產(chǎn)物的克隆直接測序獲得了基因10的核苷酸序列。核苷酸139從A到C的改變，致使密碼子從AAT改變成CAT，導致氨基酸位置47從天冬酰胺到組氨酸的改變。特別是，發(fā)現(xiàn)Holmes等得到的，Both等測序的澳大利亞株在NSP4的氨基酸位置47有一個天冬酰胺。相反的，在SA11 ATCC株中，NSP4的氨基酸位置47有一個組氨酸。
為了確定NSP4的哪種版本代表了真正的原型，測定了其它不同SA11病毒原種基因10的核苷酸序列。ATCC SA11主種病毒(從其衍生出所有其它SA11原種)，和完全不同來源的SA11病毒(Dr.Mary K.Estes,Baylor College of Medicine,Houston,TX)在核苷酸位置139有一個C。因此，不同SA11病毒原種的NSP4的大多數(shù)版本在氨基酸位置47有一個組氨酸。
通過對重組桿狀病毒抽提物的PCR產(chǎn)物測序再確認了重組桿狀病毒中的NSP4(His)和NSP4(Asn)的序列。用QuickChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene,LaJolla,CA)構(gòu)建了NSP4(Asn)基因。將各個NSP4(His)和NSP4(Asn)基因插入到pFastBac轉(zhuǎn)移載體(Life Technologies,Rockville,MD)拷貝中。重組桿狀病毒用噬斑純化3次，以低MOI擴增。用上述方法確認了各病毒的正確序列。通過對感染了重組桿狀病毒的Sf9細胞免疫熒光染色和用NSP4抗肽抗體(18；見下文實施例4)蛋白質(zhì)印跡分析肯定了NSP4的表達。
實施例3細胞存活率測量以2.5×105/mL將Sf9細胞接種在無血清Sf-900 ⅡSFMTM培養(yǎng)基或Insect-Xpress培養(yǎng)基的250mL Erlenmeyer瓶中，當細胞密度達到1.5×106/mL時，用重組桿狀病毒以MOI0.2感染。使細胞28℃生長在120rpm速度的旋回振蕩器中。用臺酚藍排除試驗測定細胞存活率(11)。簡單說，將一份細胞懸液(50微升)和等量的2％臺酚藍培育5分鐘；然后計數(shù)染色和未染色的細胞。
6天(D1到D6)內(nèi)逐日測量表達各種輪狀病毒蛋白的Sf9細胞的存活率，在表1中顯示了結(jié)果。數(shù)據(jù)以至少三個獨立試驗的平均值±標準差表示。表達VP2、VP4、VP6和VP7的重組桿狀病毒是Dr.Mary K.Estes(Baylor College of Medicine,Houston,TX)友好提供的。
表1細胞存活率(％)
NSP4的表達對Sf9細胞有細胞毒性。如表1中所見，NSP4(His)比NSP4(Ash)殺死細胞更迅速，而其它輪狀病毒蛋白質(zhì)，包括VP2、VP4、VP6和VP7的表達，直到感染的很晚期才導致細胞死亡。然而，NSP4的表達導致細胞迅速死亡。感染后48小時(D2)對于表達VP2、VP4、VP6和VP7的細胞，存活率分別是96.8％、97.5％、97.5％和96.3％，而對于表達NSP4(His)和NSP4(Asn)的細胞，存活率分別是65.9％和83％。因此，NSP4(His)比NSP4(Asn)對細胞毒性具有更深的效果。殺死表達NSP4(His)的Sf9細胞比表達NSP4(Asn)的Sf9細胞更快。在感染后72小時(D3)，對于表達VP2、VP4、VP6和VP7的細胞，存活率分別是94.3％、90.2％、88.1％和80.7％。而對于分別表達NSP4(His)和NSP4(Asn)的細胞，存活率分別是47.2％和61.6％(表1和圖2)。在任何時間點，表達VP2、VP4、VP6和VP7的細胞中，細胞存活率之間沒有統(tǒng)計學上的顯著差異。然而，除了表達NSP二版本之一的細胞和表達其它輪狀病毒蛋白質(zhì)的細胞之間在感染后48和72小時存活率有顯著差異(p＜0.05)外，在表達不同版本的NSP4的細胞之間存活率上也有顯著差異。NSP(His)比NSP(Asn)對Sf9細胞更具細胞毒性。
實施例4胞內(nèi)鈣水平的測量使用熒光Ca2+指示劑Fura-2/AM，用裝備了QuantexTMQX-7 CCD照相機和數(shù)碼顯影系統(tǒng)的Nikon DiaphotTM熒光顯微鏡測量，測定了[Ca2+]i。簡單說，將Sf9細胞與最終濃度為2μM的Fura-2/AM(Molecular Probes,Eugene,OR)在室溫下反應(yīng)30分鐘。如Grynkiewicz等(32)和Nankova等(31)所述，算出各獨立細胞中的胞內(nèi)鈣水平，并表達為340nm和380nm處測量的吸光度之比。鈣的結(jié)合將fura-2的吸光度譜切換到更短的波長(從380到340nm)。340/380的吸光度比代表胞內(nèi)游離鈣的水平。對于各實驗，拍攝10張圖片。計算各照片中的12個細胞的胞內(nèi)鈣濃度。至少進行三次獨立實驗。
已顯示Sf9細胞中NSP4的表達導致胞內(nèi)鈣水平的顯著升高(5)。已提出，胞內(nèi)鈣水平的升高導致哺乳動物細胞SA11-介導的細胞毒性(25)。對表達NSP4的Sf9細胞也已提出了相同的概念(15)。測量了表達NSP4(His)和NSP4(Asn)的Sf9細胞的胞內(nèi)鈣水平。圖3描述的結(jié)果證明，在表達NSP4(His)的Sf9細胞中(右)比在表達NSP4(Asn)的Sf9細胞中(中)觀察到顯著更高的胞內(nèi)鈣水平。在感染后48小時，在模擬感染的Sf9細胞、表達NSP4(Asn)的Sf9細胞和表達NSP4(His)的Sf9細胞中胞內(nèi)鈣水平分別是0.12、0.32和0.48(加入Fura-2/AM后讀到的340/380nm的比率)。這對應(yīng)于下列胞內(nèi)鈣水平濃度模擬感染的Sf9細胞為80nM，表達NSP4(Asn)的細胞為213nM和表達NSP4(His)的細胞為320nM。因此，NSP4(Asn)的表達導致如先前報道(5)的胞內(nèi)鈣水平的顯著提高。然而，和表達NSP(Asn)的細胞比較，在表達NSP(His)的細胞中有顯著更高的胞內(nèi)鈣水平(P＜0.05)。
實施例5蛋白質(zhì)印跡分析雖然分別將編碼NSP4的基因的兩種版本克隆入相同的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體拷貝中，但對于表達NSP4這兩種版本的重組桿狀病毒來說，蛋白質(zhì)表達水平的不同是有可能的。為了排除這種可能性(即與NSP4(His)表達有關(guān)的毒性增加和胞內(nèi)鈣堆積是由于在這兩種形式之間蛋白質(zhì)表達水平的不同)，測量了Sf9細胞中NSP4的絕對量。用重組桿狀病毒以MOI0.2感染Sf9細胞，并在感染48小時后收集細胞。將等量樣品(2×104細胞的裂解液)加到SDS-PAGE上，通過使用NSP4抗肽抗體的蛋白質(zhì)印跡分析檢測(圖4)。
Covance Reaseach Products公司(Denver,PA)在兩只Elite-New家兔中制備了這種NSP4抗肽抗體。簡單的說，合成具有序列Cys Asp Lys Leu ThrThr ArgGlu Ile Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys Arg Ile Tyr Lys Asp Leu Thr(SEQ ID NO:3)的合成肽并和KLH交聯(lián)。用加在N-末端的半胱氨酸來促進特異性交聯(lián)。此序列的其余部分代表NSP4的殘基114-135。將500微克交聯(lián)肽與500微升FCA混合，并皮內(nèi)注射。用混合了250微升IFA的250微克交聯(lián)肽每隔3周加強免疫家兔4次。
用SDS-PAGE分析了感染48小時后收集的桿狀病毒重組物感染的Sf9細胞的樣品等分。將分離的蛋白質(zhì)電印跡到硝基纖維素膜上，然后用含有5％BLOTTO(Bio-Rad,Inc.,Hercules,CA)的PBS室溫下封閉30分鐘，并與PBS1∶100稀釋的NSP-4特異性抗肽抗體室溫下培育1小時。在PBS中洗滌3次后，在膜上加辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)山羊抗兔免疫球蛋白(1∶200稀釋度)，并培育1小時，然后用HRPTM底物試劑盒(Bio-Rad,Inc.)顯色。
如圖4所示，如代表糖基化和非糖基化NSP4的條帶亮度所測量的那樣，在表達NSP4(Asn)的重組桿狀病毒感染的Sf9細胞(泳道3)中比表達NSP4(His)的細胞中(泳道2)中表達了更多的NSP4。當?shù)攘康闹亟M桿狀病毒感染的總細胞蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)印跡分析比較，獲得基本相同的結(jié)果。NSP4的表達在早至24小時時就被檢測到，而在48小時和72小時之間達到了峰值。在感染72小時后，觀察到NSP4的降解。在各時間點，除了感染后24小時外，NSP4(Asn)的表達比NSP4(His)的表達更高。因此，NSP4(His)的細胞毒性不是因為NSP4(His)的表達水平比NSP4(Asn)更高。
用Bonferroni(乘法比較)t-檢驗分析了細胞存活率和鈣濃度測定至少3個獨立實驗的結(jié)果。簡單說，該方法進行了變量參數(shù)分析，然后用t-檢驗配對比較。P值乘以用來解決作許多統(tǒng)計比較的組合風險的比較數(shù)字。
實施例6來自用重組桿狀病毒感染的Sf9細胞的NSP4蛋白表達將編碼NSP4蛋白(His)的基因插入pFastBac桿狀病毒為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)。通過在核苷酸142用G替換A使該質(zhì)粒突變。該突變將密碼子從AAA(賴氨酸)改變?yōu)镚AA(谷氨酸)。通過將編碼NSP4蛋白(Asn)的基因插入pFastBac轉(zhuǎn)移質(zhì)粒產(chǎn)生了第三個重組物。將各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞(Gibco BRL)。篩選獲得重組桿狀病毒DNA的白色菌落。然后純化重組桿狀病毒DNA。分別用這三種重組桿狀病毒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細胞，如所述(34)噬斑純化重組桿狀病毒。確認了三種NSP4基因的序列。這些構(gòu)建物被用于下文實施例7和8。
實施例7細胞存活率的進一步測量除了用MOI10外，按照實施例3的方案評估了NSP4蛋白的三種重組形式氨基酸47NSP4(Asn)，氨基酸47NSP4(His)和氨基酸47NSP4(His)、氨基酸48NSP4(Glu)。各時間點的平均數(shù)代表三個獨立的感染。
NSP4的表達對Sf9細胞有細胞毒性。如圖5所見，氨基酸47NSP(His)、氨基酸48(Glu)比氨基酸47NSP4(His)殺死細胞稍快一點，而根據(jù)Dunnett乘法比較試驗，這兩種形式都比氨基酸47NSP4(Asn)以統(tǒng)計學上顯著更高的速度殺死細胞。這些結(jié)果表明氨基酸47NSP4(His)、氨基酸48NSP4(Glu)是最毒的，而NSP4(Asn)是這三種形式中對細胞毒性最小。
實施例8胞內(nèi)鈣水平的進一步測量按照實施例4的方案，除了評估了NSP4蛋白的三種重組形式氨基酸47NSP4(Asn)，氨基酸47NSP4(His)和氨基酸47NSP4(His)、氨基酸48NSP4(Glu)。圖6顯示了結(jié)果。直方條表示三種NSP4重組體感染的Sf9細胞和模擬感染的Sf9細胞的胞內(nèi)鈣水平。各直方條代表三個實驗的平均數(shù)。
在表達氨基酸47NSP(His)、氨基酸48(Glu)的細胞中觀察到最高的胞內(nèi)鈣水平，然后是NSP4(His)和NSP4(Asn)。這些結(jié)果表明氨基酸47NSP(His)、氨基酸48(Glu)對胞內(nèi)鈣水平具有最深的作用，而NSP4(Asn)在三種形式中作用最小。根據(jù)Dunnett乘法比較試驗，差異由統(tǒng)計學意義。
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權(quán)利要求
1．一種輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，其特征在于，該蛋白中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺被誘變成另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留其抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
2．如權(quán)利要求1所述的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，其特征在于，所述位置47的氨基酸是天冬氨酸。
3．如權(quán)利要求1所述的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，其特征在于，氨基酸47以外的非結(jié)構(gòu)蛋白4區(qū)域內(nèi)還包含至少一個突變，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
4．一種輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，其特征在于，該蛋白中氨基酸位置48的賴氨酸被誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，來產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
5．如權(quán)利要求4所述的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，其特征在于，該蛋白質(zhì)在氨基酸48以外的非結(jié)構(gòu)蛋白4區(qū)域內(nèi)還包含至少一個突變，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
6．一種輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，其特征在于，該蛋白中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺被誘變成另一種氨基酸，并且該蛋白中氨基酸位置48的賴氨酸被誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
7．如權(quán)利要求6所述的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，其特征在于，位置47的氨基酸是天冬氨酸。
8．如權(quán)利要求6所述的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，其特征在于，該蛋白質(zhì)在氨基酸47和48以外的非結(jié)構(gòu)蛋白4區(qū)域內(nèi)還包含至少一個突變，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
9．一種抗原組合物，其特征在于，該抗原組合物包含輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，該蛋白中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺被誘變成另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
10．如權(quán)利要求9所述的抗原組合物，其特征在于，位置47的氨基酸是天冬氨酸。
11．如權(quán)利要求9所述的抗原組合物，其特征在于，該抗原組合物在氨基酸47以外的非結(jié)構(gòu)蛋白4區(qū)域內(nèi)還包含至少一個突變，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
12．如權(quán)利要求9所述的抗原組合物，其特征在于，該抗原組合物還包含佐劑、稀釋劑或載體。
13．一種抗原組合物，其特征在于，該抗原組合物包含輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，所述蛋白中氨基酸位置48的賴氨酸被誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
14．如權(quán)利要求13所述的抗原組合物，其特征在于，該抗原組合物在氨基酸48以外的非結(jié)構(gòu)蛋白4區(qū)域內(nèi)還包含至少一個突變，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
15．如權(quán)利要求13所述的抗原組合物，其特征在于，該抗原組合物還包含佐劑、稀釋劑或載體。
16．一種抗原組合物，其特征在于，該抗原組合物包含輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4，所述蛋白中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺被誘變成另一種氨基酸，并且該蛋白中氨基酸位置48的賴氨酸被誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
17．如權(quán)利要求16所述的抗原組合物，其特征在于，位置47的氨基酸是天冬氨酸。
18．如權(quán)利要求16所述的抗原組合物，其特征在于，該抗原組合物在氨基酸47和48以外的非結(jié)構(gòu)蛋白4區(qū)域內(nèi)還包含至少一個突變，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
19．如權(quán)利要求16所述的抗原組合物，其特征在于，該抗原組合物還包含佐劑、稀釋劑或載體。
20．一種保護哺乳動物宿主抵抗輪狀病毒所致疾病的方法，其特征在于，該方法包含對所述宿主施用有效量的權(quán)利要求9所述的抗原組合物。
21．一種保護哺乳動物宿主抵抗輪狀病毒所致疾病的方法，其特征在于，該方法包含對所述宿主施用有效量的權(quán)利要求13所述的抗原組合物。
22．一種保護哺乳動物宿主抵抗輪狀病毒所致疾病的方法，其特征在于，該方法包含對所述宿主施用有效量的權(quán)利要求16所述的抗原組合物。
23．一種改善哺乳動物宿主中腹瀉癥狀的方法，其特征在于，該方法包含施用給所述宿主有效量的權(quán)利要求9所述的抗原組合物。
24．一種改善哺乳動物宿主中腹瀉癥狀的方法，其特征在于，該方法包含施用給所述宿主有效量的權(quán)利要求13所述的抗原組合物。
25．一種改善哺乳動物宿主中腹瀉癥狀的方法，其特征在于，該方法包含施用給所述宿主有效量的權(quán)利要求16所述的抗原組合物。
26．一種分離和純化的核酸序列，其特征在于，該序列包含編碼輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的核酸序列，所述序列中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺被誘變成另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
27．一種分離和純化的核酸序列，其特征在于，該序列包含編碼輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的核酸序列，所述序列中氨基酸位置48的賴氨酸被誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
28．一種分離和純化的核酸序列，其特征在于，該序列包含編碼輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的核酸序列，所述序列中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺被誘變成另一種氨基酸，并且該蛋白中氨基酸位置48的賴氨酸被誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
29．一種含有分離和純化核酸序列的質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒包含編碼輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的核酸序列，所述序列中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺被誘變成另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
30．一種含有分離和純化核酸序列的質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒包含編碼輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的核酸序列，所述序列中氨基酸位置48的賴氨酸被誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
31．一種含有分離和純化核酸序列的質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒包含編碼輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的核酸序列，所述序列中氨基酸位置47的組氨酸或天冬酰胺被誘變成另一種氨基酸，并且該蛋白中氨基酸位置48的賴氨酸被誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸，而產(chǎn)生毒性減弱，同時保留所述蛋白質(zhì)的抗原性和免疫原性的輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的可變形式。
32．用權(quán)利要求29所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的宿主細胞。
33．用權(quán)利要求30所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的宿主細胞。
34．用權(quán)利要求31所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染的宿主細胞。
35．一種產(chǎn)生可變形式輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的方法，其特征在于，該方法包含用權(quán)利要求29所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染宿主細胞，并在允許宿主細胞表達所述輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
36．一種產(chǎn)生可變形式輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的方法，其特征在于，該方法包含用權(quán)利要求30所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染宿主細胞，并在允許宿主細胞表達所述輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
37．一種產(chǎn)生可變形式輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的方法，其特征在于，該方法包含用權(quán)利要求31所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染宿主細胞，并在允許宿主細胞表達所述輪狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白4的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞。
全文摘要
SA11 ATCC輪狀病毒株中的非結(jié)構(gòu)蛋白4(NSP4)在氨基酸位置47具有一個組氨酸。該取代形式比澳大利亞輪狀病毒株(氨基酸位置47是天冬酰胺)細胞毒性更強,將氨基酸位置47的組氨酸誘變?yōu)榱硪粋€氨基酸而產(chǎn)生毒性減弱,同時保留其抗原性和免疫原性的NSP4可變形式。氨基酸位置48是谷氨酸的NSP4比氨基酸位置48是賴氨酸的NSP4細胞毒性更強,將氨基酸位置48的賴氨酸誘變成谷氨酸以外的另一種氨基酸而產(chǎn)生毒性減弱,同時保留其抗原性和免疫原性的NPS4的可變形式。
文檔編號C12P21/02GK1302330SQ99806546
公開日2001年7月4日 申請日期1999年5月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月29日
發(fā)明者田鵬, T·J·贊布, S·A·烏登 申請人:美國氰胺公司