專利名稱：新的來(lái)自嗜線蟲(chóng)致病桿菌的殺蟲(chóng)毒素以及編碼此毒素的核酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自嗜線蟲(chóng)致病桿菌(Xenorhabdus nematophilus)、波氏致病桿菌(Xenorhabdus poinarii)以及發(fā)光光桿狀菌(Photorhabdus luminescens)的新的毒素，其表達(dá)產(chǎn)生所述毒素的核酸序列，以及產(chǎn)生和使用毒素以及相應(yīng)的核酸序列防治昆蟲(chóng)的方法。
害蟲(chóng)是農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因。僅在美國(guó)每年由各種害蟲(chóng)引起的損失大約為77億美元。除了農(nóng)作物遭受的損失外，害蟲(chóng)也是菜農(nóng)、果農(nóng)以及花農(nóng)的一個(gè)負(fù)擔(dān)，并且它們也是花匠和家庭業(yè)主所討厭的東西。
害蟲(chóng)主要通過(guò)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的高強(qiáng)度應(yīng)用被防治，化學(xué)殺蟲(chóng)劑通過(guò)抑制昆蟲(chóng)生長(zhǎng)，阻止昆蟲(chóng)進(jìn)食或繁殖，或殺死昆蟲(chóng)來(lái)起作用。好的昆蟲(chóng)防治因此可以被獲得，但是這些化學(xué)制劑有時(shí)也影響其它有益的昆蟲(chóng)?；瘜W(xué)殺蟲(chóng)劑的廣泛應(yīng)用產(chǎn)生的另一個(gè)問(wèn)題是抗性昆蟲(chóng)變種的出現(xiàn)。不同的抗性管理策略可部分緩和這種現(xiàn)象，但是可供選擇的害蟲(chóng)防治劑的需求仍呈現(xiàn)上升的勢(shì)頭，生物害蟲(chóng)防治劑，例如蘇云金牙孢桿菌表達(dá)的殺蟲(chóng)毒素如δ-內(nèi)毒素，在應(yīng)用方面產(chǎn)生了令人滿意的結(jié)果，提供了對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑的替代或補(bǔ)充。最近，編碼這些δ-內(nèi)毒素的基因被分離出來(lái)并且它們?cè)诋愒此拗髦械谋磉_(dá)顯示出其提供了另一種防治經(jīng)濟(jì)重要害蟲(chóng)的工具。特別地，殺蟲(chóng)毒素在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)，例如蘇云金牙孢桿菌δ-內(nèi)毒素，提供了有效的抗選擇害蟲(chóng)的保護(hù)，并且表達(dá)這些毒素的轉(zhuǎn)基因植物已被商品化，允許農(nóng)民減少化學(xué)殺蟲(chóng)劑的應(yīng)用。然而，即使在這種情況下，抗性仍存在一種發(fā)展的可能，并且僅有一小部分的特定的害蟲(chóng)是可防治的。所以，長(zhǎng)期期望但是仍沒(méi)有滿足的需要是新的且能有效的給農(nóng)民帶來(lái)經(jīng)濟(jì)利益以及環(huán)保上可接受的昆蟲(chóng)防治劑。
本發(fā)明滿足了長(zhǎng)期存在的對(duì)新昆蟲(chóng)防治劑的需求。特別是針對(duì)經(jīng)濟(jì)重要害蟲(chóng)以及有效控制對(duì)已存在的昆蟲(chóng)防治劑有抗性的害蟲(chóng)的防治劑的需求。此外，將對(duì)環(huán)境的負(fù)擔(dān)減少到最小的殺蟲(chóng)劑是所期望的。
在新的昆蟲(chóng)防治劑的研究中，對(duì)來(lái)自Heterorhabdus與Steinemema屬的線蟲(chóng)的一定的種特別感興趣，因?yàn)樗鼈兊臍⑾x(chóng)特性。它們殺死昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)及其用死幼蟲(chóng)作為食物的后代。實(shí)際上，它們的殺蟲(chóng)活性取決于生活在線蟲(chóng)中的共生細(xì)菌。這些共生細(xì)菌為Heterorhabdus情況下的光桿狀菌屬以及Steinernema情況下的致病桿菌屬。
本發(fā)明涉及分離自嗜線蟲(chóng)致病桿菌的核苷酸序列，以及與其基本上相似的核苷酸序列，它們的表達(dá)產(chǎn)生了對(duì)經(jīng)濟(jì)重要害蟲(chóng)特別是植物害蟲(chóng)有較高毒性的殺蟲(chóng)毒素。本發(fā)明進(jìn)一步提供了來(lái)自于該核苷酸序列表達(dá)產(chǎn)生的殺蟲(chóng)毒素，以及含有能夠抑制害蟲(chóng)生存能力，生長(zhǎng)或繁殖，或降低農(nóng)作物的與害蟲(chóng)相關(guān)的損失的組合物和制劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種生產(chǎn)毒素的方法以及利用核苷酸例如在微生物中防治害蟲(chóng)或在轉(zhuǎn)基因植物中賦予害蟲(chóng)抗性的方法，以及使用毒素與含有毒素的組合物和制劑的方法例如應(yīng)用該毒素，組合物和制劑到昆蟲(chóng)感染區(qū)或者預(yù)防處理昆蟲(chóng)易感區(qū)或以植物對(duì)賦予保護(hù)或?qū)οx(chóng)的抗性。
新的毒素對(duì)小菜蛾(Plutella xylostella)(菱形斑紋蛾(diamonback moth))具有非常高的殺蟲(chóng)作用，小菜蛾是經(jīng)濟(jì)上重要的害蟲(chóng)。毒素可被用于多種昆蟲(chóng)防治的策略，產(chǎn)生對(duì)環(huán)境有最小影響的最大效率。
一方面，本發(fā)明提供了一種分離的核苷酸分子，包括(a)一個(gè)基本上相似于選自含有下述序列的組的核苷酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14；或(b)一個(gè)與(a)的核苷酸序列同類(lèi)編碼的核苷酸序列；其中所述核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生至少一種有抗害蟲(chóng)活性的毒素。在此方面的一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列與基本上相似于SEQ IDNO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14的核苷酸同類(lèi)編碼。優(yōu)選的核苷酸序列基本上相似于SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14的核苷酸。更優(yōu)選的核苷酸序列編碼選自含有SEQID NO:2,3,5,7,9,11,13,以及15的氨基酸序列。最優(yōu)選的，核苷酸序列含有SEQ ID NO:1核苷酸的569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ IDNO:10,SEQ ID NO:12,或SEQ ID NO:14。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸序列含有包含在pClB9369(NRRL B-21883)中的大約3.0 kb DNA片段。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，來(lái)自本發(fā)明核苷酸分子的表達(dá)的毒素具有抗小菜蛾的活性。
另一方面，本發(fā)明提供了一個(gè)分離的核酸分子，其含有一個(gè)20,25,30,35,40,45,或50(優(yōu)選的20)堿基對(duì)核苷酸部分在序列上等同于選自含有下述序列的組的核苷酸序列的分別連續(xù)的20,25,30,35,40,45,或50(優(yōu)選的20)堿基對(duì)核苷酸部分SEQ ID NO:1的569-979核苷酸SEQ ID NO:1的1045-2334核苷酸，SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,和SEQ ID NO:14，其中上述核酸分子表達(dá)產(chǎn)生至少一種有抗害蟲(chóng)活性的毒素。
本發(fā)明也提供了一個(gè)嵌合基因，其包括有效的連接于本發(fā)明的核酸分子的異源啟動(dòng)子序列。另外，本發(fā)明提供了含有此嵌合基因的重組載體。進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一個(gè)含有該嵌合基因的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，宿主細(xì)胞可以是一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，一個(gè)酵母細(xì)胞，或者一個(gè)植物細(xì)胞，優(yōu)選的是植物細(xì)胞。更進(jìn)一步，本發(fā)明提供了含有這個(gè)植物細(xì)胞的植物。優(yōu)選的植物為玉米。
在另一方面，本發(fā)明提供了由本發(fā)明DNA分子表達(dá)產(chǎn)生的毒素。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的毒素具有抗小菜蛾的活性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，毒素由命名為NRRL保藏號(hào)為B-21883的大腸桿菌(E.coli)菌株產(chǎn)生。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的毒素含有選自包括SEQ ID NO:2,3,5,7,9,11,13,以及15的組的氨基酸序列。
本發(fā)明也提供了一種組合物，其含有殺蟲(chóng)有效量的本發(fā)明的毒素。在另一方面，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生有抗昆蟲(chóng)活性的毒素的方法，包括(a)獲得含有一個(gè)嵌合基因的宿主細(xì)胞，嵌合基因本身含有一段與本發(fā)明的核酸分子有效連接的異源啟動(dòng)子序列；以及(b)核酸分子在細(xì)胞中表達(dá)，其產(chǎn)生至少一種有效抗昆蟲(chóng)的毒素。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生抗昆蟲(chóng)植物的方法，包括導(dǎo)入本發(fā)明的核酸分子到植物中，其中的核酸分子在植物中以對(duì)防治昆蟲(chóng)的有效量進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，昆蟲(chóng)為小菜蛾。
進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了一種防治昆蟲(chóng)的方法，包括向昆蟲(chóng)給藥有效量的本發(fā)明的毒素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，昆蟲(chóng)為小菜蛾。優(yōu)選地，毒素口服給藥于昆蟲(chóng)。
本發(fā)明的另一方面，提供了誘變本發(fā)明的核酸分子的方法，其中的核酸分子被切割成所需大小的雙鏈隨機(jī)片段的群體，包括(a)加入雙鏈隨機(jī)片段群一個(gè)或多個(gè)單或雙鏈寡核苷酸，其中的寡核苷酸各含有一個(gè)與雙鏈模板多核苷酸同一性的區(qū)域以及一個(gè)異源區(qū)域；(b)使產(chǎn)生的雙鏈隨機(jī)片段與寡核苷酸的混合物變性為單鏈片段；(c)用聚合酶培育產(chǎn)生的單鏈片段群，其在導(dǎo)致在同一性區(qū)域的單鏈片段退火形成退火片段配對(duì)的條件下進(jìn)行，該同一性區(qū)對(duì)于一個(gè)對(duì)中的一個(gè)成員啟動(dòng)另一個(gè)的復(fù)制是充分的，因此形成一個(gè)誘變的雙鏈多核苷酸；以及(d)重復(fù)第二和第三步至少2個(gè)進(jìn)一步的循環(huán)，其中在進(jìn)一步循環(huán)的第二步中所得的混合物包括上一個(gè)循環(huán)中第三步中的誘變的雙鏈多核苷酸，并且其中在進(jìn)一步的循環(huán)中形成進(jìn)一步誘變的雙鏈多核苷酸。
本發(fā)明的其它方面以及優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)通過(guò)發(fā)明的說(shuō)明書(shū)以及非限制實(shí)施例將變得更加清楚。
定義本發(fā)明毒素的“活性”是指毒素作為口服活性昆蟲(chóng)防治劑，有毒效，或能夠中斷或制止昆蟲(chóng)的進(jìn)食，其可能會(huì)或可能不會(huì)引起昆蟲(chóng)的死亡。當(dāng)本發(fā)明的毒素給藥于昆蟲(chóng)時(shí)，結(jié)果典型地為昆蟲(chóng)死亡，或昆蟲(chóng)不進(jìn)食使得毒素對(duì)昆蟲(chóng)可得到的來(lái)源。
“結(jié)合/有效連接”是指兩個(gè)核酸序列是結(jié)構(gòu)或功能上相關(guān)的。例如，如果兩個(gè)序列是有效連接或位于某一位置，使得此調(diào)控DNA序列將影響編碼或結(jié)構(gòu)DNA序列的表達(dá)水平，則該啟動(dòng)子或調(diào)控DNA序列被稱為“結(jié)合”于編碼RNA或蛋白的DNA序列。
“嵌合基因”是一個(gè)重組核酸序列，其中啟動(dòng)子或調(diào)控核酸序列是有效連接于或結(jié)合于一個(gè)編碼mRNA或表達(dá)為蛋白質(zhì)的核酸序列，從而此調(diào)控核酸序列能夠調(diào)控被結(jié)合的核酸序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。嵌合基因的調(diào)控核酸序列在自然條件下通常不與被結(jié)合的核酸序列有效連接。
“編碼序列”是一個(gè)被轉(zhuǎn)錄為RNA例如mRNA,rRNA,tRNA,snRNA,有義RNA或反義RNA的核酸序列。優(yōu)選地，RNA然后在生物體中被翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
“防治”昆蟲(chóng)是指通過(guò)毒素影響抑制害蟲(chóng)生存，生長(zhǎng)，進(jìn)食，和/或繁殖的能力，或降低農(nóng)作物的與昆蟲(chóng)有關(guān)的損失。“防治”昆蟲(chóng)可意味或可能不意味殺死昆蟲(chóng)，盡管優(yōu)選地指殺死昆蟲(chóng)。
“給藥”一種毒素是指用毒素接觸昆蟲(chóng)，產(chǎn)生毒效并且防治昆蟲(chóng)。毒素可以通過(guò)許多公認(rèn)的方式給藥，例如通過(guò)昆蟲(chóng)口服攝取或通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)，配制的蛋白組合物，可噴霧蛋白組合物，餌料基質(zhì)，或任意其它的本領(lǐng)域公認(rèn)的毒素給藥系統(tǒng)來(lái)接觸昆蟲(chóng)。
此處所用的“表達(dá)盒”是指一個(gè)能夠在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)特定核苷酸序列的核酸序列，包括一個(gè)有效連接于與終止信號(hào)有效相連的目的核苷酸序列的啟動(dòng)子。其也典型地包括核苷酸序列合適翻譯所需要的序列。包括目的核苷酸序列的表達(dá)盒可能是嵌合的，意味著至少其組分之一與其它組分的至少一種是異源的。表達(dá)盒也可能為自然產(chǎn)生的但以一種對(duì)異源表達(dá)有用的重組方式被獲得。然而，典型地，表達(dá)盒與宿主是異源的，即，表達(dá)盒的特定的核酸序列在宿主細(xì)胞中并不天然的產(chǎn)生并且必須通過(guò)轉(zhuǎn)化被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的祖先。表達(dá)盒中核苷酸序列的表達(dá)可在組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控下進(jìn)行，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子只有當(dāng)宿主細(xì)胞暴露于一些特定的外界刺激時(shí)才啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。在多細(xì)胞的生物中，例如植物中，啟動(dòng)子可以是對(duì)特定的組織，或器官，或發(fā)育階段具有特異性。
“基因”是一個(gè)被定義的區(qū)域，其位于染色體組中并且除了上述的編碼核酸序列外，包括其它的基本調(diào)節(jié)的，負(fù)責(zé)編碼部分的轉(zhuǎn)錄和翻譯的表達(dá)調(diào)控的核酸序列。一個(gè)基因也可包括其它的5’與3’非翻譯序列和終止序列?？赡艽嬖诘钠渌抢鐑?nèi)含子。
“目的基因”指任意基因，其被給藥到植物中，賦予植物所期望的特征例如抗生素抗性，病毒抗性，昆蟲(chóng)抗性，疾病抗性，或其它害蟲(chóng)的抗性，除草劑耐性，改良的營(yíng)養(yǎng)值，工業(yè)過(guò)程中改良的特性或改變的生殖能力?！澳康幕颉币部墒潜唤o藥到植物中用于植物中商業(yè)上有價(jià)值的酶或代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)的。
“異源”核酸序列是一個(gè)與其被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞不是天然結(jié)合的核酸序列，包括天然產(chǎn)生的核酸序列的非天然產(chǎn)生的多拷貝。
“同源”核酸序列是一個(gè)與其被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞天然結(jié)合的核酸序列。
“同源重組”是同源核酸分子間的核酸片段的相互交換。
“殺蟲(chóng)的”被定義為能夠防治昆蟲(chóng)優(yōu)選通過(guò)殺死昆蟲(chóng)的毒性的生物活性。
當(dāng)核酸序列編碼的多肽與所引用的核酸序列編碼的多肽具有相同的氨基酸序列時(shí)，核酸序列與所引用的核酸序列“同類(lèi)編碼”。
“分離的”核酸分子或分離的酶是一個(gè)核酸分子或酶，其通過(guò)人工從其天然環(huán)境中脫離而存在并因此并非是天然產(chǎn)物。分離的核酸或酶可以以純化了的形式存在或存在于非天然的環(huán)境中，例如，一個(gè)重組宿主細(xì)胞中。
“核酸分子”或 “核酸序列”是可從任意來(lái)源分離的單鏈或雙鏈DNA或RNA的線性片段。在本發(fā)明的上下文中，核酸分子優(yōu)選為DNA的片段。
“ORF”是開(kāi)放閱讀框架。
“植物”是指在任意發(fā)育階段的任意植物，特別是指種子植物。
“植物細(xì)胞”是植物的結(jié)構(gòu)和生理的一個(gè)單位，包括一個(gè)原生質(zhì)體和一個(gè)細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以為分離的單細(xì)胞或一個(gè)培養(yǎng)的細(xì)胞的形式，或作為較高等有組織的單元例如，植物組織，植物器官，或整個(gè)植物的一部分。
“植物細(xì)胞培養(yǎng)”是指植物單位例如原生質(zhì)體，細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞，植物組織中的細(xì)胞，花粉，花粉管，原卵，胚囊，合子，以及不同發(fā)育階段的胚的培養(yǎng)。
“植物材料”是指花瓣，莖，根，花或花的部件，果實(shí)，花粉，卵細(xì)胞，合子，種子，插條，細(xì)胞或組織培養(yǎng)物，或任意植物產(chǎn)物的其它部分。
“植物器官”是植物的顯著的和明顯的結(jié)構(gòu)以及分化的部分，例如根，莖，葉，花芽，或胚。
此處所用的“植物組織”是指組成結(jié)構(gòu)和功能單位的一組植物細(xì)胞。植物或栽培中的植物的任意組織被包括在內(nèi)。此術(shù)語(yǔ)包括，但不限于，整個(gè)植物，植物器官，植物種子，組織培養(yǎng)物以及組成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的任意植物細(xì)胞組。此術(shù)語(yǔ)聯(lián)合，或缺失上述的或以其它方式包含在此定義內(nèi)的任何特定類(lèi)型的植物組織的應(yīng)用并不排除任意其它的植物組織類(lèi)型。
“啟動(dòng)子”是編碼區(qū)上游的非翻譯DNA序列，其含有RNA聚合酶Ⅱ的連接位點(diǎn)并且啟動(dòng)DNA的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)域也可包括其它充當(dāng)基因表達(dá)調(diào)節(jié)子的元件。
“原生質(zhì)體”是沒(méi)有細(xì)胞壁或僅有部分細(xì)胞壁的分離的植物細(xì)胞。
“調(diào)控元件”是指涉及調(diào)控核苷酸序列表達(dá)的序列。調(diào)控元件含有一個(gè)與目的核苷酸序列有效相連的啟動(dòng)子以及終止信號(hào)。其也典型地包括核苷酸序列的合適翻譯所需要的序列。
在最廣義上，術(shù)語(yǔ)“基本上相似”當(dāng)被用于指核苷酸序列時(shí)，是指一個(gè)對(duì)應(yīng)于引用的核苷酸序列的核苷酸序列，其中對(duì)應(yīng)的序列編碼的多肽基本上與被所引用的核苷酸序列編碼的多肽具有相同的結(jié)構(gòu)和功能，例如，僅氨基酸的變化并不影響產(chǎn)生多肽的功能。理想的基本上相似的核苷酸序列編碼由所引用的核苷酸序列編碼的多肽?；旧舷嗨频暮塑账嵝蛄信c所引用的核苷酸序列之間的同一性的百分比理想地為至少為80％，更理想地至少為85％，優(yōu)選為至少90％，較優(yōu)選為至少95％，更優(yōu)選的為至少99％?！盎旧舷嗨啤庇谒玫暮塑账嵝蛄械暮塑账嵝蛄性?0℃ 7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5 M NaPO4,1 mM EDTA中，在50℃用2×SSC,0.1％SDS洗滌雜交于所引用的核苷酸序列，較理想的在50℃ 7％十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5 M NaPO4,1 mM EDTA中，在50℃用1×SSC,0.1％SDS洗滌雜交于所引用的核苷酸序列，更理想的在50℃ 7％十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5 M NaPO4,1 mM EDTA中，在50℃用0.5×SSC,0.1％SDS洗滌雜交于所引用的核苷酸序列，優(yōu)選的在50℃7％十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5 M NaPO4,1 mM EDTA中，在50℃用0.1×SSC,0.1％SDS洗滌雜交于所引用的核苷酸序列，較優(yōu)選的在50℃7％十二烷基硫酸鈉(SDS),0.5 M NaPO4,1 mMEDTA中，在65℃用0.1×SSC,0.1％SDS洗滌雜交于所引用的核苷酸序列。
“合成的”是指核苷酸序列含有并不在天然序列中存在的結(jié)構(gòu)特征。例如，一個(gè)人工的具有更接近地類(lèi)似的G+C含量以及雙子葉和/或單子葉基因的正常密碼子分布的序列被稱為合成的。
“轉(zhuǎn)化”是將異源核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞或生物的過(guò)程。特定地，“轉(zhuǎn)化”指DNA分子穩(wěn)定整合到目的生物的染色體組中。
“轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)基因/重組”是指宿主生物例如細(xì)菌或植物被導(dǎo)入了異源核酸分子。核酸分子可被穩(wěn)定地整合到宿主的染色體組中或核酸分子也可作為染色體外分子存在。這種染色體外分子可以自主復(fù)制。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，組織，或植物可以理解不僅包含轉(zhuǎn)化過(guò)程的終產(chǎn)物，而且包括其轉(zhuǎn)基因的子代?！胺寝D(zhuǎn)化的”，“非轉(zhuǎn)基因的”， 或“非重組的”宿主是指不含有異源核酸分子的野生型的生物，例如，細(xì)菌或植物。
核苷酸通過(guò)下述標(biāo)準(zhǔn)的縮寫(xiě)的其堿基被顯示腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶[T]，以及鳥(niǎo)嘌呤(G)。氨基酸同樣通過(guò)下述標(biāo)準(zhǔn)的縮寫(xiě)被顯示丙氨酸(Ala；A)，精氨酸(Arg；R)，天冬酰胺(Asn；N)，天門(mén)冬氨酸(Asp；D)，半胱氨酸(Cys；C)，谷酰胺(GIn；Q)，谷氨酸(Glu；E)，甘氨酸(Gly；G)，組氨酸(His；H)，異亮氨酸(IIe；I)，亮氨酸(Leu；L)，賴氨酸(Lys；K)，甲硫氨酸(Met；M)，苯丙氨酸(Phe；F)，脯氨酸(Pro；P)，絲氨酸(Ser；S)，蘇氨酸(Thr；T)，色氨酸(Trp；W)，酪氨酸(Tyr；Y)，以及纈氨酸(Val；V)。此外，(Xaa；X)代表任意的氨基酸。
序列表中的序列的簡(jiǎn)要描述SEQ ID NO:1是包含在嗜線蟲(chóng)致病桿菌克隆pCIB9369中的大約3.0 kb DNA片段的序列，其在特定核苷酸位置含有下列ORF名稱起始終點(diǎn)orfi569 979orf210452334SEQ ID NO:2為克隆pCIB9369的orf1編碼的～15 kDa蛋白的序列。
SEQ ID NO:3為克隆pCIB9369的orf2編碼的～47.7 kDa保幼激素酯酶樣蛋白的序列。
SEQ ID NO:4為嗜線蟲(chóng)致病桿菌克隆pCIB9381的orf1的序列。
SEQ ID NO:5為克隆pCIB9381的orf1編碼的蛋白的序列。
SEQ ID NO:6嗜線蟲(chóng)致病桿菌克隆pCIB9381的orf2的DNA序列。
SEQ ID NO:7為克隆pCIB9381的orf2編碼的保幼激素酯酶樣蛋白的序列。
SEQ ID NO:8為波氏致病桿菌克隆pCIB9354的orf1的DNA序列。
SEQ ID NO:9為克隆pCIB9354的orf1編碼的蛋白的序列。
SEQ ID NO:10為波氏致病桿菌克隆pCIB9354的orf2的DNA序列。
SEQ ID NO:11為pCIB9354的orf2編碼的保幼激素酯酶樣蛋白的序列。
SEQ ID NO:12發(fā)光光桿狀菌克隆pC1B9383-21的orf1的DNA序列。
SEQ ID NO:13為克隆pCIB9383-21的orf1編碼的蛋白的序列。
SEQ ID NO:14為發(fā)光光桿狀菌克隆pCIB9383-2的orf2的DNA序列。
SEQ ID NO:15為克隆pCIB9383-21的orf2編碼的保幼激素樣酯酶蛋白的序列。
保藏下述的材料依照布達(dá)佩斯條約規(guī)定的用于專利程序目的的國(guó)際認(rèn)可的微生物保藏，被保藏在Agricultural Research Service，專利培養(yǎng)物保藏中心(NRRL)，1815北方大學(xué)街，Peoria,Illinois61604。所有對(duì)保藏材料可得性的限制在被授予專利權(quán)的基礎(chǔ)上將被不能變更的除去。
克隆 登記號(hào)保藏日期pCIB9369NRRL B-218831997,11月12pCIB9354NRRL B-301091999,2月25pCIB9381NRRL B-301101999,2月25pCIB9383-21 NRRL B-301111999,2月25其表達(dá)產(chǎn)生殺蟲(chóng)毒素的新的核酸序列本發(fā)明涉及表達(dá)產(chǎn)生新的毒素的核苷酸序列，并且涉及防治害蟲(chóng)的毒素的生產(chǎn)和使用。核苷酸序列從嗜線蟲(chóng)致病桿菌，波氏致病桿菌以及發(fā)光光桿狀菌，腸桿菌家族的成員中分離到。致病桿菌是Steinemema屬線蟲(chóng)的共生菌。光桿菌屬是Heterorhabditis屬線蟲(chóng)的共生菌。線蟲(chóng)定居于昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)中，將其殺死，并且它們的后代以死幼蟲(chóng)為食。殺昆蟲(chóng)劑活性實(shí)際上由共生的致病桿菌與光桿菌屬菌產(chǎn)生。發(fā)明人是第一個(gè)分離出本發(fā)明核酸序列的人。本發(fā)明的核酸序列的表達(dá)產(chǎn)生了可以用于防治鱗翅目昆蟲(chóng)例如小菜蛾(菱形斑紋蛾)的毒素。
克隆pCIB9369中的本發(fā)明的核酸序列特征為大約3.0 kb的DNA片段，其依照專利保藏的布達(dá)佩斯條約以登記號(hào)為NRRL B-21883保藏。此DNA片段的序列存在于SEQ ID NO:1中。兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)存在于SEQ ID NO:1中(分別為核苷酸569-979以及核苷酸1045-2334)，編碼預(yù)測(cè)大小為15 kDa和47.7 kDa的蛋白(分別為SEQ ID NO:2和3)。該兩個(gè)ORF被排列在一個(gè)操縱子樣結(jié)構(gòu)中。通過(guò)使用UWGCG Blast和Gap program對(duì)與每一ORF顯示同源的已知序列的研究并未顯示出任何的與ORF#1有效的匹配并且顯示出ORF#2與蘇云金芽孢桿菌cry3A蛋白之間21％的同一性，其在本領(lǐng)域被認(rèn)為是不顯著的。通過(guò)Blast program進(jìn)行的對(duì)pCIB9369的ORF#2編碼的蛋白的Gap分析表明與保幼激素酯酶相關(guān)蛋白有30.6％AA同一性和44.1％AA相似性(GenBank登記號(hào)2921553；Henikoff等.，PNAS USA 89:10915-10919(1992))。本發(fā)明的核苷酸序列也與已知的編碼殺蟲(chóng)毒素toxb4的嗜線蟲(chóng)致病桿菌序列(WO 95/00647)進(jìn)行了比較，但是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的同源性。3.0 kb DNA片段也與公開(kāi)在WO98/08388的核苷酸序列進(jìn)行了比較。使用UWGCG Gap program,22個(gè)來(lái)自描述在WO 98/08388的38.2 kb DNA片段的各60個(gè)核苷酸(60-mers)的序列被比較于本發(fā)明3.0 kb DNA片段。在38.2 kb DNA片段的堿基1處開(kāi)始的第一60-mer核苷酸序列而其它60-mers的核苷酸序列位于大約有2.0 kb的間隔。22個(gè)序列中的每一個(gè)及其互補(bǔ)序列被檢測(cè)。本發(fā)明3.0 kb DNA片段與這些60-mers的一個(gè)之間的同一性的最高百分比為53％，其并非顯著的同源。此外，38.2 kb序列的5個(gè)不同DNA片段通過(guò)Southern印跡分析與本發(fā)明的3.0 kb片段雜交被檢測(cè)。沒(méi)有陽(yáng)性的雜交信號(hào)出現(xiàn)。
pCIB9381，pCIB9354，以及pCIB9383-21的核苷酸序列在每一個(gè)克隆中也顯示出兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架。在pCIB9381和pCIB9383-21中的兩個(gè)ORF的核苷酸序列與pCIB9369中的有較高的同源性。因此，pCIB9381和pCIB9383-21的ORF#2蛋白與pCIB9369的ORF#2蛋白一樣與保幼激素酯酶相關(guān)蛋白有基本上相同的同源性。pCIB9354的ORF#1的核苷酸序列與pCIB9369的ORF#1的核苷酸序列有77％的同一性，并且pCIB9354的ORF#2的核苷酸序列與pCIB9369的ORF#2的核苷酸序列有79％的同一性。pCIB9354的ORF#2蛋白也具有與保幼激素酯酶-相關(guān)的蛋白的同源性(29.2％AA同一性與42.2％AA相似性)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)明包括一個(gè)基本上相似于SEQ IDNO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14的核苷酸序列，其表達(dá)產(chǎn)生一種殺蟲(chóng)毒素。本發(fā)明也包括一個(gè)含有本發(fā)明的核酸序列的重組載體。在該載體中，核酸序列優(yōu)選包含在含有調(diào)控元件的表達(dá)盒中，其中的調(diào)控元件用于在能夠表達(dá)核苷酸序列的宿主細(xì)胞中的核苷酸序列的表達(dá)。此調(diào)控元件通常含有啟動(dòng)子和終止信號(hào)且優(yōu)選含有允許由本發(fā)明的核酸序列編碼的多肽有效翻譯的元件。含有核酸序列的載體通常能夠在特定宿主細(xì)胞中復(fù)制，優(yōu)選的為染色體外分子，并且因此被用在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增本發(fā)明的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于此載體的宿主細(xì)胞為微生物，例如細(xì)菌，特別的為E.coli。在另一個(gè)實(shí)施例中，此重組載體的宿主細(xì)胞為內(nèi)寄生菌或體表寄生菌。此載體的優(yōu)選宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，例如酵母，植物細(xì)胞，或昆蟲(chóng)細(xì)胞。植物細(xì)胞例如玉米細(xì)胞為最優(yōu)選的細(xì)胞，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此載體為病毒載體并被用于特定的宿主細(xì)胞中的核苷酸序列的復(fù)制，例如昆蟲(chóng)細(xì)胞或植物細(xì)胞中。重組載體也用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的核苷酸序列到宿主細(xì)胞中，由此核苷酸序列被穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的DNA中。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞，或植物細(xì)胞。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞，例如玉米細(xì)胞。
本發(fā)明的核苷酸可通過(guò)下面描述的實(shí)施方案中的技術(shù)被分離，或用描述在序列表中的序列作為基礎(chǔ)構(gòu)建PCR引物進(jìn)行PCR來(lái)分離。例如，具有SEQ ID NO:1的orf1的大約第一個(gè)和最后20-25個(gè)連續(xù)核苷酸的序列的寡核苷酸(例如.，SEQ ID NO:1的核苷酸569-588和核苷酸957-976)可被用作PCR引物來(lái)擴(kuò)增直接來(lái)自來(lái)源菌株(嗜線蟲(chóng)致病桿菌菌株ATCC 19061)的orf1編碼序列(SEQ ID NO:1的核苷酸569-976)。本發(fā)明的其它基因序列同樣地也可通過(guò)用描述于序列表的編碼序列的末端作為PCR引物的基礎(chǔ)從各自的來(lái)源菌株被PCR擴(kuò)增。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，殺蟲(chóng)毒素含有至少一種由本發(fā)明的核苷酸序列編碼的多肽。根據(jù)本發(fā)明的殺蟲(chóng)毒素的分子量通過(guò)大小分級(jí)實(shí)驗(yàn)測(cè)得大于6000。在用蛋白酶K處理后，在昆蟲(chóng)生物鑒定中僅觀察到極微小的殺蟲(chóng)生物活性的減少，此表明殺蟲(chóng)毒素對(duì)蛋白酶K處理基本上是有抗性的。殺蟲(chóng)毒素在22℃或4℃貯藏2周后保持其殺蟲(chóng)活性。在被凍干且22℃貯藏2周后仍保持其殺蟲(chóng)活性。殺蟲(chóng)毒素在60℃溫育5分鐘后仍然具有活性，但是其在100℃或80℃溫育5分鐘后失去了殺蟲(chóng)活性。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列可通過(guò)在已知的體外重組或DNA改組技術(shù)中引入隨機(jī)突變被修飾。此技術(shù)被描述在Stemmer等人.，Nature 370:389-391(1994)以及US專利5,605,793上，其引入本發(fā)明作為參考。無(wú)數(shù)的核苷酸序列的突變拷貝在本發(fā)明的起始核苷酸序列的基礎(chǔ)上產(chǎn)生，帶有改良特性例如增加殺蟲(chóng)活性，增強(qiáng)穩(wěn)定性，或不同的目標(biāo)害蟲(chóng)的特異性或范圍的變體被回復(fù)。該方法包括從含有本發(fā)明的核苷酸序列的模板雙鏈多核苷酸形成一個(gè)誘變的雙鏈多核苷酸，其中的模板雙鏈多核苷酸被切割成所期望大小的雙鏈隨機(jī)片段，并且包括加入一或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸到雙鏈隨機(jī)片段的所得的群體中的步驟，其中所述的寡核苷酸含有一個(gè)與雙鏈模板多核苷酸相同性的區(qū)域和一個(gè)異源的區(qū)域；變性產(chǎn)生的雙鏈隨機(jī)片段與寡核苷酸的混合物成單鏈片段；在導(dǎo)致所述單鏈片段在所述的相同性區(qū)域退火的條件下用聚合酶溫育單鏈片段的生成群體形成退火片段的配對(duì)，所述的相同性區(qū)域?qū)τ谝粋€(gè)配對(duì)的一個(gè)成員啟動(dòng)另一個(gè)的復(fù)制是足夠的，因此形成了一個(gè)誘變的雙鏈多核苷酸；以及重復(fù)第二和第三步驟至少2個(gè)進(jìn)一步循環(huán)，其中進(jìn)一步循環(huán)的第二步生成的混合物包括上一個(gè)循環(huán)的第三步生成的誘變的雙鏈多核苷酸，并且進(jìn)一步的循環(huán)生成形成進(jìn)一步誘變雙鏈多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，單種雙鏈隨機(jī)片段在雙鏈隨機(jī)片段的群體中的濃度少于總DNA重的1％。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，模板雙鏈多核苷酸含有至少100種多核苷酸，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈隨機(jī)片段的大小為從5 bp到5 kb。在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法的第四步包括重復(fù)第二和第三步至少10個(gè)循環(huán)。
核苷酸序列在異源微生物宿主中的表達(dá)作為生物昆蟲(chóng)防治劑，殺蟲(chóng)毒素通過(guò)核苷酸序列在能夠表達(dá)核苷酸的異源宿主細(xì)胞中的表達(dá)被產(chǎn)生。在第一個(gè)實(shí)施方案中，在其染色體中含有至少一個(gè)本發(fā)明核苷酸序列的修飾的嗜線蟲(chóng)致病桿菌，波氏致病桿菌或發(fā)光光桿狀菌細(xì)胞被描述。這些修飾包括已存在的調(diào)控元件的突變或缺失，其導(dǎo)致核苷酸序列的改變的表達(dá)，或調(diào)控核苷酸序列表達(dá)的新調(diào)控元件的插入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)插入到染色體中或通過(guò)導(dǎo)入含有核苷酸序列的染色體外復(fù)制分子，一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的額外的拷貝被加到嗜線蟲(chóng)致病桿菌，波氏致病桿菌，或發(fā)光光桿狀菌中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)本發(fā)明的核苷酸序列被插到適當(dāng)?shù)暮幸粋€(gè)啟動(dòng)子和終止信號(hào)的表達(dá)盒中。核苷酸序列的表達(dá)是連續(xù)的，或一個(gè)對(duì)不同類(lèi)型的刺激應(yīng)答來(lái)啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)啟動(dòng)子被使用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在其中毒素被表達(dá)的細(xì)胞是一種微生物，例如為一種病毒，一種細(xì)菌，或一種真菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒例如桿狀病毒，在其染色體組中含有一個(gè)本發(fā)明的核苷酸序列并且在感染適當(dāng)?shù)倪m于病毒復(fù)制與核苷酸序列表達(dá)的真核細(xì)胞后表達(dá)大量的相應(yīng)的殺蟲(chóng)毒素。殺蟲(chóng)毒素因此被生產(chǎn)用作殺蟲(chóng)劑?；蛘撸换蚋脑旌泻塑账嵝蛄械臈U狀病毒被用于體內(nèi)感染昆蟲(chóng)并通過(guò)殺蟲(chóng)毒素的表達(dá)或通過(guò)病毒感染與殺蟲(chóng)毒素的聯(lián)合將其殺死。
細(xì)菌細(xì)胞也可為本發(fā)明的核苷酸序列表達(dá)的宿主。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用非致病共生菌，其能夠在植物組織中生存和復(fù)制，所謂內(nèi)寄生菌，或非致病共生菌，其能夠定居于葉際或根際，所謂體表寄生菌。這種細(xì)菌包括土壤桿菌屬，產(chǎn)堿菌屬，固氮螺菌屬，固氮菌類(lèi)，芽胞桿菌屬，棍狀桿菌屬，腸桿菌屬，歐文氏菌屬，產(chǎn)黃菌屬，克雷伯氏菌屬，假單胞菌屬，根瘤菌屬，沙雷氏菌屬，鏈霉菌屬以及黃單胞桿菌屬。共生真菌，例如木霉屬和粘帚霉屬也是本發(fā)明核苷酸序列用于相同目的的表達(dá)的可能的宿主。
這些遺傳操作技術(shù)對(duì)于不同的宿主是特異性的并且為被領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。例如表達(dá)載體pKK223-3和pKK223-2可被用于在E.coli中的轉(zhuǎn)錄或翻譯融合來(lái)表達(dá)在tac或trc啟動(dòng)子后面的異源基因。為了編碼多ORF的操縱子的表達(dá)，最簡(jiǎn)單的方法是在轉(zhuǎn)錄融合中插入操縱子到載體例如pKK223-3中，允許異源基因的關(guān)聯(lián)核糖體結(jié)合位點(diǎn)被使用。革蘭氏陽(yáng)性菌例如芽胞桿菌屬中的過(guò)量表達(dá)技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的且可被用于本發(fā)明的上下文中(Quax等.在.工業(yè)微生物基礎(chǔ)和應(yīng)用分子遺傳學(xué)，Eds.Baltz等.，American Society forMicrobiology，華盛頓(1993))。過(guò)量表達(dá)的可選擇的系統(tǒng)依賴于例如酵母載體以及包括應(yīng)用Pichia，酵母屬和克魯維酵母菌屬(Sreekrishna, 在.工業(yè)微生物基礎(chǔ)和應(yīng)用分子遺傳學(xué)，Baltz,Hegeman,以及Skatrud eds.,American Society for Microbiology,華盛頓(1993)；Dequin & Barre,生物技術(shù)12:173-177(1994)；vanden Berg等，生物技術(shù)8:135-139(1990))。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)被描述的核苷酸序列被給藥到并表達(dá)在具有生物防治特性的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)菌株CGA267356(描述在EU 0 472 494以及WO94/01561上)中，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的一個(gè)核苷酸序列被給藥到也具有生物防治特性的致金色假單胞菌(Pseudomonasaureofaciens) 菌株30-84中。在異源生物防治菌株中的表達(dá)要求篩選適于在所選擇的宿主中復(fù)制的載體以及選擇合適的啟動(dòng)子。在革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌以及真菌中表達(dá)的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。
核苷酸序列在植物組織中的表達(dá)在一個(gè)特定的優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少本發(fā)明的一種殺蟲(chóng)毒素在一種較為高等的生物體內(nèi)表達(dá)，例如在植物內(nèi)。在這種情況下，表達(dá)了有效量的毒素的轉(zhuǎn)基因植物保護(hù)其本身不受害蟲(chóng)的影響。當(dāng)害蟲(chóng)開(kāi)始以此轉(zhuǎn)基因植物為食時(shí)，其也攝取了表達(dá)的毒素。此將阻止昆蟲(chóng)進(jìn)一步咬入植物組織或可能甚至傷害或殺死此昆蟲(chóng)。本發(fā)明的核苷酸被插入到表達(dá)盒中，其優(yōu)選的穩(wěn)定的整合到所述植物的染色體組中。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，核苷酸序列包含在非致病性自我復(fù)制病毒中。按本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物可為單子葉或雙子葉植物以及包括，但不限于玉米，小麥，大麥，黑麥，甜馬鈴薯，豆，豌豆，菊苣，萵苣，卷心菜，菜花，花椰菜，蘿卜，小蘿卜，菠菜，蘆筍，洋蔥，大蒜，辣椒，芹菜，南瓜屬植物，南瓜，大麻，西葫蘆，蘋(píng)果，梨，quince，甜瓜，李子，櫻桃，桃子，蜜桃，杏子，草莓，葡萄，紅莓，黑莓，菠蘿，鱷梨，番木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，油菜籽，紅花草，煙草，胡蘿卜，棉花，苜蓿，水稻，馬鈴薯，茄子，黃瓜，Arabidopsis，以及木本植物例如松柏目的和落葉目的樹(shù)。
所期望的核苷酸序列一旦被轉(zhuǎn)化到特定的植物種中，其可以在此種中增殖或遷移到相同種的其它變種中，特別包括通過(guò)常規(guī)的育種技術(shù)的商用的變種。
本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選地在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，因此引起相關(guān)的毒素在轉(zhuǎn)基因植物中的生物合成。這樣，產(chǎn)生了帶有增強(qiáng)的昆蟲(chóng)抗性的轉(zhuǎn)基因植物。為了在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，本發(fā)明的核苷酸序列可能需要修飾和優(yōu)化。盡管在許多情況下，來(lái)自微生物的未被修飾的基因在植物中以高水平表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物中的低表達(dá)可能由于微生物的具有在植物中是非優(yōu)選的密碼子的核苷酸序列。本領(lǐng)域公知所有生物都具有密碼子使用的特定偏好，且本發(fā)明的核苷酸序列的密碼子可被改變以符合植物偏好，而保持被編碼的氨基酸。此外，在植物中的高表達(dá)最好獲自至少GC含量為大約35％，優(yōu)選大于45％，更優(yōu)選的大于50％，以及最優(yōu)選的大于60％的編碼序列。具有低GC含量的微生物核苷酸序列在植物中不良表達(dá)是由于去穩(wěn)定信使的ATTTA基序，以及可能引起不適當(dāng)?shù)亩嘞佘账峄腁ATAAA基序的存在。盡管優(yōu)選的基因序列可能在單子葉植物和雙子葉植物種中充分表達(dá)，序列可被修飾來(lái)滿足單子葉植物和雙子葉植物特異性密碼子偏好與GC含量偏好，這些參數(shù)選擇已被顯示是不同的(Murray等。核酸研究。17:477-498(1989))。此外，核苷酸被篩查可引起信使平截的不正常剪接位點(diǎn)的存在。所有需要的核苷酸序列中的改變例如上述的改變通過(guò)利用已知的定點(diǎn)誘變，PCR，以及利用描述在公開(kāi)的專利申請(qǐng)EP 0 385 962(Monsanto),EP 0 359 472(Lubrizol,與WO 93/07278(Ciba-Geigy)上的方法的合成基因構(gòu)建物的技術(shù)來(lái)產(chǎn)生。
為了有效的啟動(dòng)翻譯，鄰接于初始甲硫氨酸的序列需要被修飾。例如，可通過(guò)含有在植物中有效的已知序列被修飾。Joshi提出了一個(gè)對(duì)植物合適的共有區(qū)(NAR 15:6643-6653(1987))以及Clontech提出了進(jìn)一步的共有區(qū)翻譯起始密碼子(1993/1994 catalog,210頁(yè))。這些共有區(qū)適合與本發(fā)明的核苷酸序列一起使用。該序列被合并到含有該核苷酸序列的構(gòu)建物中，直到并包含ATG(同時(shí)讓第二氨基酸未被修飾)，或可選擇地，直到并包含ATG之后的GTC(帶有修飾轉(zhuǎn)基因的第二氨基酸的可能性)。
核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)被在植物中起作用的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和地點(diǎn)的要求以及目標(biāo)物種而變化。因此，本發(fā)明核苷酸序列優(yōu)選在葉中，在穗中，在花序(例如.穗狀花序，圓錐花序，穗軸，等等。)中，在根中，和/或苗中進(jìn)行表達(dá)。在許多情況下，然而，需要抗不止一種類(lèi)型的害蟲(chóng)的保護(hù)，且因此在多種組織中表達(dá)是所期望的。盡管許多來(lái)自雙子葉植物的啟動(dòng)子在單子葉植物表現(xiàn)出是有效的且反之亦然，理想的，雙子葉植物的啟動(dòng)子被篩選用于在雙子葉植物中表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子被篩選用于在單子葉植物中表達(dá)。然而，對(duì)所篩選的啟動(dòng)子的起源來(lái)源沒(méi)有限制；只要能在所需細(xì)胞中有效的驅(qū)動(dòng)核苷酸序列的表達(dá)便足夠了。
優(yōu)選組成型表達(dá)的啟動(dòng)子包括來(lái)自編碼肌動(dòng)蛋白或泛素的啟動(dòng)子以及CaMV 35S和19S啟動(dòng)子。本發(fā)明的核苷酸序列可在以化學(xué)方法調(diào)控的啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)。這使得殺蟲(chóng)毒素僅在當(dāng)農(nóng)作物用誘導(dǎo)化學(xué)藥劑處理時(shí)能夠被合成。優(yōu)選的基因表達(dá)化學(xué)誘導(dǎo)的技術(shù)具體描述在申請(qǐng)EP 0 332 104(Ciba-Geigy)以及US專利5,614,395上。優(yōu)選的化學(xué)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子為煙草PR-1a啟動(dòng)子。
優(yōu)選的一類(lèi)啟動(dòng)子是傷口誘導(dǎo)型的。無(wú)數(shù)被描述的啟動(dòng)子在傷口位置表達(dá)也在致植物病菌的感染位點(diǎn)局部表達(dá)。理想地，這樣的啟動(dòng)子將只在感染的位點(diǎn)局部有效，并且通過(guò)此方式殺蟲(chóng)毒素僅積累在需要合成殺蟲(chóng)毒素來(lái)殺死入侵害蟲(chóng)的細(xì)胞中。這種類(lèi)型優(yōu)選的啟動(dòng)子包括那些由Stanford等人。Mol.Gen.Genet.215:200-208(1989),Xu等人，植物分子生物學(xué)(Plant Molec.Biol.)22:573-588(1993),Logemann等人植物細(xì)胞1:151-158(1989),Rohrmeier & Lehle,植物分子生物學(xué)22:783-792(1993),Firek等人，植物分子生物學(xué)，22:129-142(1993)，以及Warner等人，Plant J.3:191-201(1993)描述的啟動(dòng)子。
優(yōu)選的組織特異性表達(dá)模式包括綠色組織特異性，根特異性，莖特異性，以及花特異性。適于在綠色組織表達(dá)的啟動(dòng)子包括許多調(diào)節(jié)與光合作用有關(guān)的基因的啟動(dòng)子和許多從單子葉植物與雙子葉植物中克隆的啟動(dòng)子。優(yōu)選的啟動(dòng)子為來(lái)自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC啟動(dòng)子(Hudspeth & Grula，植物分子生物學(xué)12:579-589(1989))。優(yōu)選的根特異性表達(dá)的啟動(dòng)子被de Framond(FEBS 290:103-106(1991)；EP 0 452 269(Ciba-Geigy)所描述。優(yōu)選的莖特異性啟動(dòng)子被描述在US專利5,625,136(Ciba-Geigy)上且啟動(dòng)玉米trpA基因的表達(dá)。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案為以根優(yōu)選的或根特異性方式表達(dá)至少一個(gè)本發(fā)明核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案為以創(chuàng)傷誘導(dǎo)性或以感染誘導(dǎo)性的方式表達(dá)核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。
除了篩選合適的啟動(dòng)子外，在植物中表達(dá)殺蟲(chóng)毒素的構(gòu)建物需要一個(gè)適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，其在異源核苷酸序列的下游連接。幾個(gè)這種終止子可以被獲得并為技術(shù)人員所公知(例如來(lái)自CaMV的tml，來(lái)自rbcS的E9)。任何已知其在植物中有功能的可得終止子可被用于本發(fā)明的上下文中。
其他數(shù)目眾多的序列可被合并到本發(fā)明所描述的表達(dá)盒中。這些包括已被顯示增強(qiáng)表達(dá)的序列例如內(nèi)含子序列(例如來(lái)自Adh 1與bronze 1)以及病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)自TMV,MCMV和AMV)。
本發(fā)明核苷酸序列的靶向表達(dá)到植物中的不同細(xì)胞位點(diǎn)將是優(yōu)選的。在一些情況下，在細(xì)胞溶膠中的定位將是期望的，然而在其它的情況下，在一些亞細(xì)胞器中定位將是優(yōu)選的。通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行編碼酶的轉(zhuǎn)基因的亞細(xì)胞定位。典型的，編碼來(lái)自一個(gè)已知的細(xì)胞器靶基因產(chǎn)物的目的肽的DNA是被操縱和融合在核苷酸序列的上游。已知許多這樣的葉綠體的靶序列及其在異源構(gòu)建物的功能已被顯示。本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)也靶向于宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或液泡。達(dá)到此目的的技術(shù)是本領(lǐng)域所公知的。
合適的用于植物轉(zhuǎn)化的載體被描述于本說(shuō)明書(shū)的其它地方。為了土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，二元載體或攜帶至少一個(gè)T-DNA邊緣序列的載體是合適的，然而對(duì)于直接基因給藥，任意的載體是合適的并且僅含有目的構(gòu)建物的線性DNA將是優(yōu)選的。在直接的基因給藥的情況下，單DNA種轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化可被使用(Schocher等人，生物技術(shù)4:1093-1096(1986))。為了直接基因轉(zhuǎn)化和土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化通常(但非必要地)用可提供對(duì)抗生素(卡那霉素，潮霉素或甲氨蝶呤)抗性或除草劑(basta)抗性的可篩選的標(biāo)記。這種標(biāo)記的實(shí)施例為新霉素轉(zhuǎn)磷酸酶，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，二氫葉酸鹽還原酶，膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶，2,2-二氯丙酸脫鹵素酶乙酰氧肟酸合成酶，5-enolpyruvyl-shikimate-磷酸合酶，芳香基腈鹽水解酶，原卟啉原氧化酶，乙酰基輔酶A羧酶，dihydropteroate合酶，氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶，以及β-葡萄糖醛酸酶。然而用于植物的可選擇的或可篩選的標(biāo)記的選擇并非本發(fā)明的關(guān)鍵。
上述的重組DNA可通過(guò)本領(lǐng)域所公知的方式被導(dǎo)入植物細(xì)胞中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解方法的選擇依賴于被轉(zhuǎn)化的目的植物的類(lèi)型。合適的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法包括微注射(Crossway等人.，生物技術(shù)4:320-334(1986))，電穿孔(Riggs等人.，Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 83:5602-5606(1986),土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hinchee等人.，生物技術(shù)6:915-921(1988)；也參見(jiàn)，Ish ida等人.，自然生物技術(shù)14:745-750(六月1996)用于玉米轉(zhuǎn)化)，直接的基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人.，EMBO J 3.2717-2722(1984)；Hayashimoto等人，植物生理.93:857-863(1990)(水稻))，以及利用從Agracetus,Inc.,Madison,Wisconsin和Dupont,Inc.,Wilmington,Delaware獲得的裝置的彈道粒子加速(參見(jiàn)，例如，Sanford等人.，U.S.專利4,945,050；以及McCabe等人.，生物技術(shù)6.923-926(1988)).也參見(jiàn)，Weissinger等人，Annual Rev.Genet.22:421-477(1988)；Sanford等人.，微粒科學(xué)和技術(shù)5:27-37 91987)(洋蔥)；Svab等人.,Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 87:8526-8530(1990)(煙草葉綠體)；Christou等人.，植物生理.87:671-674(1988)(黃豆)；McCabe等人.，生物技術(shù)6:923-926(1988)(黃豆)；Klein等人.，Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA,85:4305-4309(1988)(玉米)；Klein等人，生物技術(shù)6:559-563(1988)(玉米)；Klein等人.，植物生理.91:440-444(1988)(玉米)；Fromm等人.，生物/技術(shù)8:833-839(1990)；以及Gordon-Kamm等人.，植物細(xì)胞2:603-618(1990)(玉米)；Koziel等人.，生物技術(shù)11:194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等人，自然338:274-277(1989)(水稻)；Christou等人，生物技術(shù)9:957-962(1991)(水稻)；Datta等人.，生物/技術(shù)8:736-740(1990)(水稻)；歐洲專利申請(qǐng)EP 0 332 581(果園草與其它的Pooideae)；Vasil等人，生物技術(shù)11:1553-1558(1993)(小麥)；Weeks等人.，植物生理102:1077-1084(1993)(小麥)；Wan等人，植物生理.104:37-48(1994)(大麥)；Jahne等人.，Theor.AppⅠ.GeneL 89:525-533(1994)(大麥)；Umbeck等人，生物/技術(shù)5:263-266(1987)(棉花)；Casas等人.，Proc.NatL Acad.Sci.USA90:11212-11216(Dec.1993)(sorghum)；Somers等人，生物技術(shù)10:1589-1594(Dec.1992)(燕麥)；Torbert等，Plant Cell Reports14:635-640(1995)(燕麥)；Week等，Plant Physiol.102:1077-1084(1993)(小麥)；Chang等，WO 94/13822(小麥)以及Nehra等，ThePlant Journal 5.285-297(1994)(小麥)。一系列通過(guò)微粒轟擊將重組DNA分子導(dǎo)入到玉米中的尤其優(yōu)選實(shí)施例可在Koziel等，Biotechnology 11:194-200 (1993)，Hill等，Euphytica85:119-123(1995)以及Koziel等，Annals of the New YorkAcademy of Sciences 792:164-171(1996)中找到。另外的優(yōu)選實(shí)施方案為如EP 0 292 435的用于玉米的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法。植物的轉(zhuǎn)化可用單DNA種或多DNA種來(lái)進(jìn)行(例如.共轉(zhuǎn)化)并且這兩種技術(shù)適用于過(guò)氧化物酶編碼序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列被直接導(dǎo)入到質(zhì)體染色體組中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化的主要優(yōu)點(diǎn)是質(zhì)體通常能夠表達(dá)沒(méi)有實(shí)質(zhì)性修飾的細(xì)菌基因且質(zhì)體能夠表達(dá)在單啟動(dòng)子的調(diào)控下表達(dá)多重開(kāi)放閱讀框架。質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)被廣泛地描述在U.S.專利No.5,451,513,5,545,817,和5,545,818,PCT申請(qǐng)WO 95/16783，和在McBride等人(1994)Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 91,7301-7305上。葉綠粒轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)包括導(dǎo)入側(cè)接于一個(gè)與目的基因相聯(lián)的篩選標(biāo)記克隆質(zhì)體DNA的區(qū)域到一個(gè)合適的靶組織中，例如利用biolistics或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(例如，氯化鈣或PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)。1到1.5 kb旁側(cè)區(qū)，稱為靶序列，促進(jìn)了與質(zhì)體染色體組的同源重組且因此允許原質(zhì)體系的特異性區(qū)域的替換或修飾。最初，葉綠體16S rRNA和rpsl 2基因中的賦予了對(duì)大觀霉素和/或鏈霉素的抗性的點(diǎn)突變被用作轉(zhuǎn)化的可選擇性標(biāo)記(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.,與Maliga,P.(1990)Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 87,8526-8530；Staub,J.M.，以及Maliga,P.(1992)Plant Cell 4,39-45)。其以每100被轟擊的靶葉中約產(chǎn)生1個(gè)的頻率產(chǎn)生穩(wěn)定的同質(zhì)轉(zhuǎn)化體。這些標(biāo)記間克隆位點(diǎn)的存在允許外源基因?qū)氲馁|(zhì)體靶載體的產(chǎn)生(Staub,J.M.,與Maliga,P.(1993)EMBO J 12,601-606)。通過(guò)用編碼大觀霉素解毒酶氨基糖苷-3’-腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶(Svab,Z.,and Maliga,P.(1993)Proc.NatL Acad.Sci.USA 90,913-917)的細(xì)菌aadA基因顯性選擇標(biāo)記替換隱性的rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因，轉(zhuǎn)化頻率獲得了大幅度的提高。以前，這種標(biāo)記被成功的用于綠藻Chiamydomonas reinhardtii(Goldschmidt-Clermont,M.(1991)NucL Acids Res.19:4083-4089)的質(zhì)體染色體組的高頻率轉(zhuǎn)化。其它的用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記為本領(lǐng)域所公知且包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。典型的，需要轉(zhuǎn)化后大約15-20個(gè)的細(xì)胞分裂周期以達(dá)到一種同質(zhì)體狀態(tài)。其基因通過(guò)同源重組被插入到所有存在于每個(gè)植物細(xì)胞中的環(huán)狀質(zhì)體染色體組的幾千個(gè)拷貝中的質(zhì)體表達(dá)利用超過(guò)核表達(dá)基因的巨大的拷貝數(shù)的優(yōu)點(diǎn)來(lái)允許表達(dá)水平可以輕易超過(guò)總可溶解的植物蛋白的10％。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列被插入到一個(gè)質(zhì)體靶載體中以及被轉(zhuǎn)化到目的植物宿主的質(zhì)體基因組中。含有本發(fā)明核苷酸序列的質(zhì)體基因組的植物同型體(homoplastic)被獲得，并且偏向能夠高效表達(dá)核苷酸序列。
殺蟲(chóng)劑組合物的制劑本發(fā)明也包括含有至少一種本發(fā)明的殺蟲(chóng)毒素的組合物。為了有效的防治昆蟲(chóng)，此組合物優(yōu)選含有足量的毒素。這些量隨著被保護(hù)的農(nóng)作物，特異性目的害蟲(chóng)，環(huán)境條件，例如濕度，溫度或土壤類(lèi)型而變化。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有殺蟲(chóng)毒素的組合物包括表達(dá)沒(méi)有額外純化的毒素的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)殺蟲(chóng)毒素的細(xì)胞在其被用作殺蟲(chóng)劑之前被凍干。在另一個(gè)實(shí)施方案中，殺蟲(chóng)毒素被改造從細(xì)胞宿主中分泌出來(lái)。在一些從宿主細(xì)胞中表達(dá)的毒素被純化是所希望的情況下，殺蟲(chóng)毒素的不同程度的純化被達(dá)到。
本發(fā)明進(jìn)一步包括含有至少一種本發(fā)明殺蟲(chóng)毒素的組合物的制劑，其被均勻與此處所述的一種或多種化合物或化合物組混合。本發(fā)明也涉及處理植物的方法，其包括將殺蟲(chóng)毒素或含有殺蟲(chóng)毒素的組合物應(yīng)用于植物。殺蟲(chóng)毒素可以被以組合物的形式應(yīng)用于農(nóng)作物地區(qū)或應(yīng)用于已被用其它的化合物同時(shí)或連續(xù)處理的植物。這些化合物可以是肥料或微量營(yíng)養(yǎng)素供體或其它的影響植物生長(zhǎng)的制劑。它們也可以是選擇性的除草劑，殺蟲(chóng)劑，殺真菌劑，殺菌劑，殺線蟲(chóng)劑，軟體動(dòng)物滅殺劑，或幾種這些制劑的混合物，如果需要，與其它的本領(lǐng)域常規(guī)的載體，表面活性劑或應(yīng)用促進(jìn)佐劑一起聯(lián)合使用。合適的載體和佐劑可為固體或液體以及與配制工藝有關(guān)的常規(guī)的物質(zhì)，例如天然的或再生礦物質(zhì)，溶劑，分散劑，濕潤(rùn)劑，增粘劑，粘合劑或肥料。
優(yōu)選的本發(fā)明殺蟲(chóng)毒素應(yīng)用的方法是通過(guò)向寄生害蟲(chóng)的例如土壤，水，或植物的葉子等的環(huán)境中噴灑。應(yīng)用的數(shù)目和比率依賴于被害蟲(chóng)感染的類(lèi)型和強(qiáng)度。殺蟲(chóng)毒素用液體組合物灌輸?shù)街参飯?chǎng)所經(jīng)由土壤(系統(tǒng)作用)通過(guò)根部滲透到植物中，或通過(guò)將固體的形式例如顆粒的形式的化合物應(yīng)用到土壤中(土壤應(yīng)用)。殺蟲(chóng)毒素可通過(guò)用含有殺蟲(chóng)毒素的液體制劑灌輸?shù)椒N子(包被)，或用固體制劑涂布到種子的方式應(yīng)用于種子。在特殊的情況下，其它類(lèi)型的應(yīng)用也是可能的，例如選擇性處理植物的莖或芽。殺蟲(chóng)毒素也可以被提供作為誘餌置于上層或下層的土壤。
殺蟲(chóng)毒素以未修飾的形式使用或者，優(yōu)選的，與本制劑領(lǐng)域的常規(guī)的佐劑一起聯(lián)合使用，并以已知的方式配成可乳化的濃縮物，可包被的糊劑，直接噴灑或稀釋的溶液，稀釋乳劑，可濕性粉劑，可溶性粉劑，粉劑，顆粒劑，并且也可以包被，例如在聚合物中。如同組合物一樣，應(yīng)用的方法例如噴霧，粉化，撒布，擴(kuò)散或澆注依據(jù)所計(jì)劃的目標(biāo)和主要的環(huán)境來(lái)選擇。
含有殺蟲(chóng)毒素以及必要時(shí)的固體或液體的佐劑的制劑，組合物或制劑，通過(guò)已知的方式被配制，例如通過(guò)均勻混合和/或研磨殺蟲(chóng)毒素與增量劑，例如溶劑，固體載體以及適當(dāng)?shù)谋砻婊钚晕镔|(zhì)(表面活性劑)。
合適的溶劑包括芳香烴，優(yōu)選為含有8到12個(gè)碳原子的級(jí)分，例如，二甲苯混合物或取代的萘，鄰苯二甲酸酯如二丁基鄰苯二甲酸酯或二辛基鄰苯二甲酸酯，脂肪族烴例如環(huán)己烷或石蠟烴，醇和乙二醇及其醚和酯，例如乙醇，乙烯一甲基乙二醇或一乙基醚，酮例如環(huán)己酮，強(qiáng)極性溶劑例如N-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基亞砜或二甲基甲酰胺，以及環(huán)氧植物油類(lèi)例如環(huán)氧化椰子油或大豆油或水。
所用的固體載體例如用于粉劑和可分散的粉劑，通常是天然的礦物填料例如方解石，滑石，高嶺土，蒙脫石或attapulgite。為了增加物質(zhì)的性能，也可能加入高分散的硅酸或高分散的吸收聚合物。合適的顆粒狀吸附載體是多孔型的，例如浮石，碎磚，海泡石或皂粘土；且合適的非吸附載體為例如方解石或沙子。此外，大量的無(wú)機(jī)或有機(jī)性質(zhì)的顆粒狀物質(zhì)可被使用，例如，特別是白云石或粉狀植物殘?jiān)?。合適的表面活性化合物為具有優(yōu)良的乳化，分散和潤(rùn)濕特性的非離子型，陽(yáng)離子和/或陰離子表面活性劑。術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”也可理解為包括表面活性劑的混合物。合適的陰離子表面活性劑可以是水溶性的肥皂和水溶性的合成的表面活性化合物。
合適的肥皂為高等脂肪酸(10到22個(gè)碳原子的鏈)堿金屬鹽，堿土金屬鹽或非取代的或取代的銨鹽，例如油酸或硬脂酸或可從例如椰子油或動(dòng)物油中獲得的天然脂肪酸混合物的鈉或鉀鹽。脂肪甲基?；撬猁}也可被使用。
然而，更經(jīng)常的，使用所謂合成的表面活性劑，特別的脂肪磺酸鹽，脂肪硫酸鹽，磺化苯并咪唑衍生物或烷基芳香基磺酸鹽。
脂肪磺酸鹽或硫酸鹽通常為堿金屬鹽，堿土金屬鹽或非取代的或取代的銨鹽以及具有8到22個(gè)碳的包括烷基的烷基部分的烷基的形式，例如，木質(zhì)素磺酸的，十二烷基硫酸的或從天然脂肪酸中獲得的脂肪醇硫酸鹽混合物的鈉鹽或鈣鹽。這些化合物也包括硫酸酯的鹽和脂肪醇/環(huán)氧乙烷加成物的磺酸的鹽?；腔讲⑦溥蜓苌飪?yōu)選含有2個(gè)磺酸基團(tuán)和一個(gè)含有8到22個(gè)碳原子的脂肪酸基。烷基芳基磺酸鹽的實(shí)施例為十二烷基苯磺酸，二丁基萘磺酸，或萘磺酸/甲醛縮合產(chǎn)物的鈉，鈣或三乙醇胺鹽。也合適的是對(duì)應(yīng)的磷酸鹽，例如帶有4到14個(gè)環(huán)氧乙烷的p-壬基苯酚加成物的磷酸酯的鹽。
非離子表面活性劑優(yōu)選為脂肪族或環(huán)狀脂肪醇，飽和的或不飽和的脂肪酸以及烷基苯酚的聚乙二醇醚衍生物，所述的衍生物含有3到30個(gè)乙二醇醚基團(tuán)以及8到20個(gè)碳原子在(脂肪族的)烴部分以及6到18碳原子在烷基苯酚的烷基部分。
進(jìn)一步合適的非離子表面活性劑為聚環(huán)氧乙烷與聚丙二醇，乙二胺基丙二醇與烷基聚丙二醇的水溶性加成物，其中的烷基聚丙二醇的烷基鏈中含有1到10個(gè)碳原子，其加成化合物含有20到250個(gè)乙二醇醚基團(tuán)和10到100個(gè)丙二醇醚基團(tuán)。這些化合物通常每個(gè)丙二醇單元含有1到5個(gè)乙二醇單元。
非離子表面活性劑的典型例子是壬基苯酚聚乙氧基乙醇，蓖麻油聚乙二醇醚，聚丙烯/聚環(huán)氧環(huán)烷加成物，三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇，聚乙二醇和辛基苯氧基乙氧基乙醇。聚氧乙烯脫水山梨醇的脂肪酸酯與聚環(huán)氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯也是合適的非離子表面活性劑。
陽(yáng)離子表面活性劑優(yōu)選為季銨鹽，其具有，作為N-取代基，至少一個(gè)C8-C22烷基基團(tuán)與，作為進(jìn)一步的取代基，低級(jí)非取代或鹵化烷基，苯甲基或低等羥基烷基基團(tuán)。鹽優(yōu)選為鹵化物，甲基硫酸鹽或乙基硫酸鹽的形式，例如，硬脂酰三甲氯化銨或苯甲基二(2-氯乙基)乙基溴化銨。
制劑領(lǐng)域通常使用的表面活性劑被描述在，例如，在"McCutcheon’s Detergents and Emulsifiers Annual", MCPublishing Corp.Ringwood，新澤西1979，以及Sisely與Wood,“表面活性劑百科全書(shū)”Chemical Publishing Co.,Inc.紐約，1980。
實(shí)施例本發(fā)明通過(guò)引用下述具體的實(shí)施例進(jìn)一步進(jìn)行描述。這些實(shí)施例僅提供用于解釋的目的，而不是用來(lái)限制，除非另有說(shuō)明。這里所用的標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并被Ausubel(ed.)，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，John Wiley與Sons,Inc.(1994)；T.Maniatis,E.F.Fritsch與J.Sambrook,分子克隆一種實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，NY(1989)；以及被T.J.Silhavy,M.L.Berman,和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1984)所描述。
A.表達(dá)產(chǎn)生抗鱗翅目昆蟲(chóng)毒素活性的核苷酸序列的分離實(shí)施例1致病桿菌屬和發(fā)光桿菌屬菌株的生長(zhǎng)為了昆蟲(chóng)的生物測(cè)定，依據(jù)ATCC介紹的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，下述菌株在營(yíng)養(yǎng)物肉湯培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)3天。為了DNA分離，培養(yǎng)物被在相同的條件下培養(yǎng)24 hr。
嗜線蟲(chóng)致病桿菌菌株ATCC 19061嗜線蟲(chóng)致病桿菌菌株P(guān)si，一個(gè)USDA分離物波氏致病桿菌菌株ATCC 49122發(fā)光光桿狀菌菌株P(guān)s5，一個(gè)USDA分離物實(shí)施例2昆蟲(chóng)的生物測(cè)定通過(guò)在固體的人工(P.xylostella)食物上等分50μl每一種大腸桿菌培養(yǎng)物進(jìn)行小菜蛾(Px)生物測(cè)定(Biever與Boldt,Annals of Entomological Society of America,1971；Shelton，等人J.Ent.Sci 26:17)。4ml的食物被注入1盎司(oz.)的干凈塑料杯中(Bioserve product #9051)。來(lái)自食物改變的實(shí)驗(yàn)室群體的5個(gè)新生的小菜蛾被分別置于含有每種食物的杯子中然后用白紙蓋蓋上(Bioserve product #9049)。每種濃度用10個(gè)幼蟲(chóng)來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。裝杯子的托盤(pán)被置于恒溫箱內(nèi)以72°F 14:10(小時(shí))光暗周期。記錄每一個(gè)杯子中的活幼蟲(chóng)數(shù)。
實(shí)施例3生物測(cè)定的結(jié)果在實(shí)施例2的昆蟲(chóng)生物測(cè)定中，嗜線蟲(chóng)致病桿菌菌株ATCC 19061的培養(yǎng)基產(chǎn)生了抗小菜蛾(Px)的100％死亡率。同樣的，在實(shí)施例2的昆蟲(chóng)生物測(cè)定中，嗜線蟲(chóng)致病桿菌菌株P(guān)s1，波氏致病桿菌菌株ATCC49122，以及發(fā)光光桿狀菌菌株P(guān)s5的細(xì)菌培養(yǎng)基產(chǎn)生了抗小菜蛾(Px)的100％死亡率。
實(shí)施例4粘粒文庫(kù)的構(gòu)建通過(guò)用2mg/ml溶菌酶處理重懸浮在100 mM Tris pH 8,10 mM EDTA中37℃30分鐘的嗜線蟲(chóng)致病桿菌菌株ATCC 19061的新生長(zhǎng)的細(xì)胞從中分離得到DNA。蛋白酶K被加到0.5％SDS中至終濃度為100μg/ml并45℃培養(yǎng)。溶液澄清并變得很粘性。SDS濃度被增加到1％以及300 mM NaCl和等體積的苯酚-氯仿-異戊醇被加入。樣品被輕輕地混合5分鐘并3K下離心。重復(fù)兩次。水相然后與0.7體積的異丙醇混合并離心。DNA沉淀用70％乙醇洗滌3次并溫和地重懸浮在0.5X TE中。6μg的DNA被用每μg DNA 0.3單位的Sau3A在100μl的體積內(nèi)37℃處理3.5分鐘。樣品然后被65℃加熱30分鐘來(lái)使酶失活，然后用2單位的牛小腸堿性磷酸酶37℃溫育30分鐘。樣品用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇混合并離心。水相被去除并與0.7體積的異丙醇混合并離心。沉淀物以100ng/ml濃度被重懸浮在0.5X TE中。
通過(guò)利用BamHⅠ克隆位點(diǎn)如供應(yīng)商所述方法來(lái)制備SuperCos粘粒載體(Stratagene,La Jolla,CA)。制備的100μg/ml的Supercos被用事先用Sau3A在5μl的體積中以2∶1的比率6℃過(guò)夜消化的嗜線蟲(chóng)致病桿菌DNA連接。連接混合物如供應(yīng)商所述利用Gigapack XLⅢ(Stratagene)被包裝。被包裝的噬菌體如供應(yīng)商所述被感染到XL-1 MR大腸桿菌細(xì)胞(Stratagene)中。粘粒文庫(kù)加在含有50μg/ml卡那霉素的L-瓊脂上并37℃培養(yǎng)16小時(shí)。500個(gè)菌落被轉(zhuǎn)到新鮮的L-kan平板上，密度為50/平板。LB培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞并與20％甘油混合以及-80℃冷凍。
在嗜線蟲(chóng)致病桿菌的4.2 Mb的大基因組的情況下，平均大小為40kb的450個(gè)克隆相當(dāng)于基因組的4倍。因此，450個(gè)克隆的篩選將產(chǎn)生99％的發(fā)現(xiàn)任何基因的可能。
來(lái)自嗜線蟲(chóng)致病桿菌菌株P(guān)s1，波氏致病桿菌菌株ATCC 49122，以及發(fā)光光桿狀菌菌株P(guān)s5的粘粒文庫(kù)以同樣的方式被建立。
實(shí)施例5粘粒生物測(cè)定的結(jié)果以及具有殺蟲(chóng)活性克隆的鑒定來(lái)自每一個(gè)粘粒文庫(kù)的400大腸桿菌克隆通過(guò)昆蟲(chóng)生物鑒定產(chǎn)生的帶有抗小菜蛾活性的克隆而被篩選。一個(gè)來(lái)自嗜線蟲(chóng)致病桿菌菌株ATCC 19061的殺蟲(chóng)粘?？寺”昏b定為pCIB9362。一個(gè)來(lái)自嗜線蟲(chóng)致病桿菌菌株P(guān)s1的42 kb的殺蟲(chóng)粘粒克隆被鑒定為pCIB9379。一個(gè)來(lái)自波氏致病桿菌菌株ATCC 49122的42 kb的殺蟲(chóng)粘粒克隆被鑒定為pCIB9354。一個(gè)來(lái)自發(fā)光光桿狀菌菌株P(guān)s5的7 kb的殺蟲(chóng)粘粒克隆被鑒定為pCIB9383-21。
實(shí)施例6具有殺蟲(chóng)活性的亞克隆的分離克隆pCIB9362被用SacⅡ消化并分離到一個(gè)9 kb DNA片段。此片段被連接到用SacⅡ切割的Bluescript上。連接混合物如分子克隆，第二版(Sambrook等.)所述被轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化混合物被輔在添加了100μg/ml氨芐青霉素的L瓊脂上并37℃過(guò)夜培養(yǎng)。分離到的菌落在添加了100μg/ml氨芐青霉素的L培養(yǎng)液中生長(zhǎng)并且通過(guò)分子克隆，第二版(Sambrook等.)所述的堿性微量制備分離粘粒DNA。9 kb SaclⅠ克隆被鑒定為pCIB9362-3并當(dāng)生物測(cè)定抗小菜蛾時(shí)產(chǎn)生100％的死亡率。3μg的pCIB9362-3被分離，每μg DNA用0.3單位的Sau3A 37℃消化4,6及8分鐘并且在75℃加熱15分鐘。樣品被合并，并連接到先用BamHⅠ消化的pUC19中并用牛小腸堿性磷酸酶處理。連接體被轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌細(xì)胞，如分子克隆所述的輔在含有Xgal/Amp的L瓊脂上并在37℃過(guò)夜培養(yǎng)。選擇白色菌落并培養(yǎng)在含100μg/ml的氨芐青霉素的L培養(yǎng)基上，粘粒DNA如上所述被分離。DNA用EcoRⅠ/HindⅢ消化并且新的限制譜被測(cè)序。測(cè)序引物定自Genosys Biotechnologies(Woodlands,Tx)。測(cè)序是通過(guò)雙脫氧鏈終止法來(lái)進(jìn)行的并使用Applied Biosystems Inc.377型自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Foster City,CA)來(lái)完成。序列通過(guò)Gene Codes Corporation(Ann Arbor,Michgan)的Sequencher 3.0裝配。
在限制性位點(diǎn)以及潛在ORF’s的鑒定之后，pCIB9362-3被用CIaⅠ消化且一個(gè)3.0 kb的片段被分離克隆到Bluescript中并被轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌細(xì)胞中。被分離的菌落如前面所述進(jìn)行生長(zhǎng)且通過(guò)堿性法分離質(zhì)粒DNA。亞克隆被鑒定為pCIB9369并在生物測(cè)定中產(chǎn)生了100％的抗小菜蛾死亡率。pCIB9369被于1997年11月12，保藏并在USDA ARS專利培養(yǎng)物中心保藏號(hào)為NRRL B-21883。
一個(gè)20kb被鑒定為pCIB9381的片段通過(guò)NotⅠ消化從粘粒pCIB9379中亞克隆。
實(shí)施例7生物測(cè)定結(jié)果不同昆蟲(chóng)的pCIB9369的昆蟲(chóng)生物測(cè)定
na=沒(méi)有活性+=顯著的生長(zhǎng)抑制
++ =＞40％死亡率，但少于100％+++ 100％死亡率這些結(jié)果表明pCIB9369的3.0kb的核苷酸序列表達(dá)產(chǎn)生的殺蟲(chóng)毒素具有高度的小菜蛾抗性。
pCIB9381,pCIB9354，以及pCIB9383-21的生物測(cè)定也表現(xiàn)出高度的小菜蛾抗性。
實(shí)施例8殺蟲(chóng)活性的大小分級(jí)嗜線蟲(chóng)致病桿菌粘粒克隆pCIB9369與大腸桿菌宿主DH5中的Stratagene’s Blue Script載體在添加了50μg/ml的氨芐青霉素的由50％Terrific肉湯和50％Luria肉湯組成的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。搖瓶培養(yǎng)物(在1000ml擋板搖瓶中裝300ml)250 RPM培養(yǎng)，37℃過(guò)夜。每一種菌株的培養(yǎng)物在4℃ Sorvall GS-3轉(zhuǎn)子7,000 RPM離心。沉淀細(xì)胞被重懸浮在30ml的50mM NaCl,25mM Tris堿，pH 7.0中。濃縮的細(xì)胞通過(guò)使用Branson450型超聲波儀超聲波處理大約八個(gè)10秒的循環(huán)并在循環(huán)之間在冰上冷卻超聲破碎。超聲波處理的產(chǎn)物用Sorvall SS34轉(zhuǎn)子6,000 RPM 4℃離心10分鐘。產(chǎn)生的上清液通過(guò)一個(gè)0.2μ過(guò)濾器過(guò)濾。來(lái)自離心的超聲波產(chǎn)物的沉淀物被重懸浮在30ml的50mM NaCl,25mM Tris堿，pH 7.0中。
3ml的濾出液被應(yīng)用于先前用10ml的50mM NaCl,25mM Tris堿，pH 7.0平衡的Bio-Rad Econo-Pac 10 DG柱中。在樣品加載過(guò)程中收集的流出液被棄去。隨后加入兩種各為4ml的NaCl-Tris平衡緩沖液分餾樣品。首先的三種級(jí)分被保存用于實(shí)驗(yàn)。第一級(jí)分應(yīng)該含有所有的大于約6,000 mol.wt的物質(zhì)。后來(lái)的級(jí)分應(yīng)該含有小于6,000 mol.wt的物質(zhì)。
超聲波處理的濾出液的樣品以及超聲波處理后重懸浮的沉淀物，同來(lái)自10DG柱的三種級(jí)分一起被用于測(cè)定在表面污染試驗(yàn)中對(duì)新生小菜蛾的活性。超聲波處理物的濾過(guò)上清液和來(lái)自9369樣品的第一柱級(jí)分對(duì)小菜蛾是高度活性的。來(lái)自9369樣品的第二和第三級(jí)分是無(wú)活性的。來(lái)自帶有Blue Script質(zhì)粒培養(yǎng)物的DH5a的樣品沒(méi)有活性。這些結(jié)果表明嗜線蟲(chóng)致病桿菌(X.nematophilus)克隆pCIB9369編碼的殺蟲(chóng)活性與來(lái)自pCIB9381,pCIB9354，以及pCIB9383-21的同系物是大于6,000分子量的。
實(shí)施例9殺蟲(chóng)活性的穩(wěn)定性300ml添加了氨芐青霉素的Luria培養(yǎng)基被接種pCIB9369并37℃過(guò)夜培養(yǎng)。樣品被置于無(wú)菌的15ml的旋蓋試管中且22℃和4℃保存。一個(gè)樣品被離心并除去上清液，冷凍干燥并22℃保存。這些樣品在這些條件下保存2個(gè)星期然后進(jìn)行抗Px.的生物鑒定。冷凍干燥的物質(zhì)被重懸浮在與先前冷凍干燥樣品的相同體積內(nèi)。所有的樣品通過(guò)渦旋被重懸浮。另一種樣品100℃處理5分鐘。
na=沒(méi)有活性實(shí)施例10殺蟲(chóng)活性的熱失活毒素的熱穩(wěn)定性被檢測(cè)。大腸桿菌菌株pCIB9369(大腸桿菌宿主DH5a，攜帶嗜線蟲(chóng)致病桿菌的3.0 kbDNA)的過(guò)夜培養(yǎng)物被培養(yǎng)在Luria培養(yǎng)基與terrific培養(yǎng)基的50∶50混合物上。培養(yǎng)管中的培養(yǎng)物37℃培養(yǎng)在試管滾筒中。每種培養(yǎng)物的1ml的樣品被置于1.5ml的eppendorf管中并置于60℃,80℃。在5分鐘后除去樣品并冷卻到室溫。此樣品與未被處理部分的培養(yǎng)物一起用于對(duì)小菜蛾的檢測(cè)。50μl的樣品被涂布在食物上，干燥并且新生的小菜蛾幼蟲(chóng)被應(yīng)用于此表面。試驗(yàn)在室溫下培育5天。
未處理的樣品以及在60℃處理的樣品導(dǎo)致100％死亡率。80℃處理的樣品和單獨(dú)的食物對(duì)照未引起可觀察的死亡率。
實(shí)施例11殺蟲(chóng)活性的蛋白酶處理嗜線蟲(chóng)致病桿菌粘粒克隆pCIB9369與大腸桿菌宿主DH5中的Stratagene’s Blue Script載體被培養(yǎng)在含有50％ Terrific培養(yǎng)基和50％Luria培養(yǎng)基，其中添加了50μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)基上。250 RPM搖瓶(在1000ml擋板搖瓶中裝300ml)培養(yǎng)，37℃過(guò)夜。每一種菌株的培養(yǎng)物在Sorvall GS-3轉(zhuǎn)子中4℃下7,000RPM離心。沉淀物細(xì)胞被重懸浮在30ml的50mM NaCl,25mM Tris堿，pH 7.0.的溶液中。濃縮的細(xì)胞通過(guò)使用Branson450型超聲波儀超聲波處理大約八個(gè)10秒的循環(huán)并在循環(huán)之間在冰上冷卻被破碎。超聲波處理的產(chǎn)物用Sorvall SS34轉(zhuǎn)子6,000 RPM 4℃離心10分鐘。產(chǎn)生的上清液通過(guò)一個(gè)0.2μ過(guò)濾器過(guò)濾。1ml的上清液樣品加入CaCl2調(diào)整到5mM Ca++。加入蛋白酶K(Gibco BRL；Gaithersburg,MD)至500μg/ml。樣品在37℃培養(yǎng)2到24小時(shí)。制備對(duì)照樣品并加入Ca++但不加入蛋白酶進(jìn)行培養(yǎng)。
在5mM Ca++存在的情況下培養(yǎng)的pCIB9369和pCIB9369樣品的超聲波濾出液產(chǎn)生了對(duì)小菜蛾新生幼蟲(chóng)的100％的致死率。pCIB9369樣品與蛋白酶K和Ca++一起培養(yǎng)顯示出對(duì)Plutella的較少的，大約90％的致死率。
實(shí)施例12與cry3A的蛋白序列和保幼激素酯酶的蛋白序列的序列比較pCIB9369(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列在核苷酸569-976和1045-2334顯示兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)。ORF#1在用UWGCG Blast和Gap程序檢索后在Genbank中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何的同源的序列。通過(guò)Blast程序?qū)CIB9369的ORF#2編碼的蛋白進(jìn)行的Gap分析確定了其與蘇云金芽孢桿菌cry3A蛋白具有一定的不顯著的同源性(21％同一性)，然而，通過(guò)Blast程序?qū)CIB9369 ORF#2(SEQ ID NO:3)編碼的蛋白進(jìn)行的Gap分析的確表明其與保幼激素酯酶相關(guān)的蛋白(GenBank 注冊(cè)號(hào)為 2921553；Henikoff等.，PNAS USA 89:10915-10919(1992))具有同源性(30.6％的AA同一性和44.1％AA相似性)。
pCIB9381,pCIB9354，與pCIB9383-21的核苷酸序列也在每一個(gè)這些克隆中顯示出兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架。pCIB9381和pCIB9383-21的每一個(gè)中的兩個(gè)ORF的核苷酸序列與在pCIB9369中的那些序列的同一性都超過(guò)90％。因此，pCIB9381和pCIB9383-21的ORF#2蛋白與pCIB9369中的ORF#2一樣與保幼激素酯酶相關(guān)的蛋白基本上具有相同的同源性。pCIB9354 ORF#1的核苷酸序列與pCIB9369的ORF#1的核苷酸序列有77％的同一性，以及pCIB9354 ORF#2的核苷酸序列與pCIB9369 ORF#2的核苷酸序列有79％的同一性。pCIB9354的ORF#2蛋白也與保幼激素酯酶相關(guān)的蛋白具有同源性(29.2％AA同一性和42.2％AA相似性)。
實(shí)施例13pCIB9369與來(lái)自WO 98/08388的序列的序列比較從其核苷酸序列被描述在WO 98/08388上的38.2 kb DNA片段中獲得的22個(gè)其中每個(gè)序列為60個(gè)核苷酸(60-mers)的序列，并比較于含有pCIB9369的pCIB9362-3的核苷酸序列。第一個(gè)60-mer從38.2kb DNA片段的堿基1開(kāi)始，而其它的60-mers以大約2kb的間隔位于DNA片段上。他們?cè)?8.2 kb DNA片段上的位置被列舉如下1-60；2,041-2,100；4,021-4,080；6,001-6,060；8,041-8,100；10,021-10,080；12,001-12,060；14,041-14,100；16,021-16,080；18,001-18,060；20,041-20,100；22,021-22,080；24,001-24,060；26,041-26,100；28,021-28,080；30,001-30,060；32,041-32,100；34,021-34,080；36,001-36,060；38,041-38,100；38,161-38,220.
利用UWGCG Gap程序進(jìn)行序列比較且22個(gè)60-mer序列中的每一個(gè)及其互補(bǔ)序列被檢測(cè)。這些序列對(duì)比的結(jié)果顯示最高為53％的同一性，其在本領(lǐng)域被認(rèn)為是不顯著的同源性。
實(shí)施例14使用得自WO 98/08388序列的探針進(jìn)行Southern印跡分析寡核苷酸對(duì)被設(shè)計(jì)用來(lái)擴(kuò)增公開(kāi)在WO 98/08388上的38.2 kb DNA片段的DNA片段。寡核苷酸定購(gòu)自Genosys Biotechnologies(TheWoodlands,Texas)且它們?cè)?8.2 kb DNA片段中的位置顯示如下。它們的擴(kuò)增PCR片段的大小也列舉如下VK1046位置20-40VK1047位置2,078-2,100使用VK1046和VK1047擴(kuò)增的PCR片段的大小2,080 bpVK1048位置11,221-11,241VK1049位置13,360-13,380使用VK1 048和VK1049擴(kuò)增的PCR片段的大小2,120 bpVK1050位置26,581-26,601VK1051位置28,537-28,560使用VK1050和VK1051擴(kuò)增的PCR片段的大小1,979 bpVK1052位置18,901-18,921VK1053位置20,321-20,340使用VK1052和VK1053擴(kuò)增的PCR片段的大小1,439 bpVK1054位置34,261-34,281VK1055位置35,320-35,340 BP使用VK1054和VK1055擴(kuò)增的PCR片段的大小1,079bp通過(guò)使用Perkin-Elmer 9600 Thermo-Cycler在下述條件下完成了PCR反應(yīng)94℃,2分鐘；然后30個(gè)循環(huán)94℃30秒,54℃,30秒；72℃,4分鐘。樣品在100μl終體積中含有800ng的嗜線蟲(chóng)致病桿菌DNA,0.1-0.5μM的每一種寡核苷酸對(duì)，250μM dNTP,5UTaq聚合酶以及1x緩沖液(Perkin-Elmer)。完成的反應(yīng)物用乙醇沉淀，重懸浮在TE中并置于1％SeaPlaque(FMC,Rockland,Maine)TBE凝膠上。在電泳后，溴化乙錠染色以及用紫外光顯影然后從凝膠上切割片段。凝膠切片在65℃溶化并用10μl等分樣品與μl蒸餾水混合，煮沸5分鐘。并置于冰上。然后，15μl的隨機(jī)引物標(biāo)記緩沖液(GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD),6μl dNTP混合物(無(wú)dCTP),80μCi α-dCT32P和1μl Klenow被混合。標(biāo)記的反應(yīng)在室溫下進(jìn)行60分鐘。樣品被依據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明書(shū)被清理到Nick柱上(Pharmacia Biotech)。探針被煮沸5分鐘，并置于冰上。
通過(guò)消化的嗜線蟲(chóng)致病桿菌總DNA，得自粘粒pCIB9362以及pCIB9363(這些粘粒重疊超過(guò)25 kb且都含有pCIB9369的DNA片段；pCIB9362被用于亞克隆)的DNA，得自亞克隆pCIB9362-3(9 kb SacⅡ片段)和pCIB9369(2.96 kb ClaⅠ片段)的DNA進(jìn)行Southern雜交，用ClaⅠ,SacⅡ或HindⅢ消化。消化反應(yīng)物加在0.75％瓊脂糖TBE凝膠上并電泳過(guò)夜。拍照且凝膠如 Bio-Rad所述進(jìn)行處理用于印跡到Zeta-探針雜交膜。印跡后，膜被80℃烘干30分鐘。膜然后被放到7％SDS,250 mM磷酸鈉，pH 7.2中并67℃培養(yǎng)30分鐘。加入新鮮的溶液并在平衡到67℃后，如上所述的放射性探針被加入且允許雜交過(guò)夜，膜用2X SSC,0.5％SDS 67℃洗滌30分鐘，然后，在0.5×SSC，0.5％SDS中于67℃下洗滌30分鐘。膜被曝光在膠片上1和3小時(shí)。顯色膠片且結(jié)果顯示來(lái)自WO 98/08388序列的PCR探針并不雜交于本發(fā)明所述的粘粒的DNA或亞克隆的DNA。然而觀察到與嗜線蟲(chóng)致病桿菌DNA有強(qiáng)烈的雜交信號(hào)。
這些結(jié)果證實(shí)了序列比較的結(jié)果并表明了克隆pCIB9369與WO98/08388中所述的核苷酸序列是不同的。
B．本發(fā)明的核酸序列在異源微生物宿主中的表達(dá)適于本發(fā)明核苷酸序列的異源表達(dá)的微生物為所有的能夠定居于植物或根際的微生物。其本身將被用于接觸害蟲(chóng)。這些包括革蘭氏陰性微生物例如假單胞菌屬，腸桿菌屬和沙雷氏菌屬，革蘭氏陽(yáng)性微生物例如芽胞桿菌屬以及真菌木霉菌屬，粘帚霉屬，以及啤酒酵母。尤其優(yōu)選的異源宿主為熒光假單胞菌，惡臭假單胞菌，洋蔥假單胞菌，致金色假單胞菌，桔黃假單胞菌，陰溝腸桿菌，粘質(zhì)沙雷氏菌，枯草芽胞桿菌，臘狀芽胞桿菌，Trichoderma viride,Trichodermaharizianum,Gilocladium virens,以及釀酒酵母。
實(shí)施例19核苷酸序列在大腸桿菌及其它的革蘭氏陰性細(xì)菌中的表達(dá)許多基因已在革蘭氏陰性細(xì)菌中以異源的方式表達(dá)。表達(dá)載體pKK223-3(Pharmacia catalogue#27-4935-01)可在大腸桿菌中表達(dá)。此載體具有一個(gè)被lac調(diào)控和IPTG誘導(dǎo)的強(qiáng)烈的tac啟動(dòng)子(Brosius,J.等人.，Proc.Nat’.Acad.Sd.USA 81)。大量的表達(dá)系統(tǒng)被改進(jìn)用于大腸桿菌。熱誘導(dǎo)表達(dá)載體pPL(Pharmacia#27-4946-01)使用嚴(yán)緊調(diào)控的噬菌體λ啟動(dòng)子，其允許蛋白的高水平表達(dá)。lac啟動(dòng)子提供了另一種表達(dá)的方式但是啟動(dòng)子并不表達(dá)象tac啟動(dòng)子一樣的高水平。隨著將廣范圍宿主復(fù)制子加入到這些表達(dá)系統(tǒng)的載體中，核苷酸序列在嚴(yán)緊相關(guān)的革蘭氏陰性細(xì)菌例如假單胞菌屬，腸桿菌，沙雷氏菌屬以及歐文氏菌中的表達(dá)是可能的。例如，pLRKD211(Kaiser & Kroos,Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 81:5816-5820(1984))含有其允許在許多革蘭氏陰性細(xì)菌中復(fù)制的廣范圍宿主復(fù)制子ori T。
在大腸桿菌中，IPTG誘導(dǎo)需要tac(即trp-lac)啟動(dòng)子的表達(dá)。當(dāng)此相同的啟動(dòng)子(如廣宿主范圍質(zhì)粒PLRKD211)被導(dǎo)入假單胞菌屬時(shí)，其為沒(méi)有PTG誘導(dǎo)的組成型活性。此trp-lac啟動(dòng)子可被置于任意在假單胞菌屬或其它嚴(yán)緊相關(guān)的細(xì)菌中表達(dá)的目的基因或操縱子的前面用于此基因的組成型表達(dá)的目的。因此，表達(dá)產(chǎn)生殺蟲(chóng)毒素的核苷酸序列可被置于組成型啟動(dòng)子的后面，給藥到具有定居植物或根際特性的細(xì)菌中，轉(zhuǎn)化此微生物為殺蟲(chóng)劑。其它可能的啟動(dòng)子可被用于革蘭氏陰性菌的核苷酸序列的組成型表達(dá)。這些啟動(dòng)子包括，例如來(lái)自假單胞菌屬調(diào)控基因gafA和lemA(WO 94/01561)以及薩氏假單胞菌IAA操縱子啟動(dòng)子(Gaffney等人.,J.Bactedol.172:5593-5601(1990)。
實(shí)施例20核苷酸序列在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中的表達(dá)核苷酸序列在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中的異源表達(dá)是產(chǎn)生殺蟲(chóng)毒素的另一種方式。用于芽胞桿菌屬和鏈霉菌屬的表達(dá)系統(tǒng)被最充分地表征。來(lái)自肺炎鏈球菌的紅霉素抗性基因(ermR)的啟動(dòng)子被顯示在革蘭氏陽(yáng)性需氧菌以及厭氧菌以及大腸桿菌(Trieu-Cuot等人，Nud AcidsRes 18:3660(1990))中具有活性。另一個(gè)來(lái)自硫鏈絲菌肽基因抗生素抗性啟動(dòng)子被用在鏈霉菌屬克隆載體中(Bibb,Mol Gen Ge net 199:26-36(1985))。穿梭載體pHT3101也適于在芽胞桿菌屬中表達(dá)(Lereclus,FEMS Microbiol Lett 60:211-218(1989))。此方法的一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)是許多革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生可被用于配制長(zhǎng)效殺蟲(chóng)劑的孢子。芽胞桿菌屬和鏈霉菌屬種是土壤的侵占性定居者。
實(shí)施例21核苷酸序列在真菌中的表達(dá)Trichodema harzianum和Gliocladium virens被顯示出提供了在田地中不同水平的生物調(diào)控(US 5,165,928以及US 4,996,157,都授予Cornell Research Foundation)。一個(gè)表達(dá)產(chǎn)生殺蟲(chóng)毒素的核苷酸序列能夠在這種真菌中表達(dá)。此可以通過(guò)大量的本領(lǐng)域公知的方式來(lái)完成。其中之一是真菌通過(guò)PEG或電穿孔介導(dǎo)的技術(shù)進(jìn)行的原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化?？蛇x擇地，微粒轟擊可被用于轉(zhuǎn)化具有再生成熟結(jié)構(gòu)能力的原生質(zhì)體或其它的真菌細(xì)胞。原來(lái)被發(fā)展用于曲霉屬轉(zhuǎn)化現(xiàn)在被廣泛用于真菌轉(zhuǎn)化載體pAN7-1(Curragh 等.，Mycol.Res.97(3):313-317(1992)；Tooley等,Curr.Genet.21:55-60(1992)；Punt等.，Gene 56:117-124(1987))被工程改造含有核苷酸序列。此質(zhì)粒含有大腸桿菌側(cè)接于Aspergillus nidulans gpd啟動(dòng)子和trpC終止子的潮霉素B抗性基因(Punt等，Gene 56:117-124(1987))。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列在釀酒酵母中表達(dá)。例如，來(lái)自pCIB9369,pCIB9381,pCIB9354,或pCIB9383的兩個(gè)ORF’s中的每一個(gè)被克隆到帶有GALl誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和CYCl終止子的各個(gè)載體中。每個(gè)載體具有氨芐青霉素抗性和2微米復(fù)制子。載體優(yōu)選具有不同于酵母的生長(zhǎng)標(biāo)記。構(gòu)建物被獨(dú)立的以及一起被轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中。ORF被一起表達(dá)和用來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)和殺蟲(chóng)活性。
C．殺蟲(chóng)毒素的制劑使用含有分離的毒素或上述實(shí)施例所述的產(chǎn)生毒素的細(xì)胞懸浮液或濃縮液的活性成分來(lái)制得殺蟲(chóng)制劑。例如表達(dá)殺蟲(chóng)毒素的大腸桿菌可被用于防治害蟲(chóng)。制劑以液態(tài)或固態(tài)的形式被制得并被描述如下。
實(shí)施例18殺蟲(chóng)劑成分的液態(tài)制劑在下面的實(shí)施例中，成分的百分比以重量表示1．可乳化的濃縮物a b c活性成分 20％ 40％ 50％十二烷基苯磺酸鈣 5％ 8％ 6％蓖麻油聚乙二醇醚 5％--(36摩爾的環(huán)氧乙烷)三丁基苯酚聚乙二醇醚 -12％ 4％(30摩爾的環(huán)氧乙烷)環(huán)己酮 -15％ 20％二甲苯混合物 70％ 25％ 20％任意所需濃度的乳劑可通過(guò)用水稀釋此濃縮液來(lái)產(chǎn)生。2．溶液ab cd活性成分80％ 10％ 5％ 95％乙二醇一甲基醚 20％ - --聚乙二醇400 - 70％ --N-甲基-2-吡咯烷酮- 20％ --環(huán)氧化椰子油 --1％ 5％石油餾出液 --94％ -(沸騰范圍160～190°)這些溶液適合以微滴的形式應(yīng)用。3．顆粒劑ab活性組分5％ 10％高嶺土 94％ -高度分散的硅酸 1％ -Attapulgit - 90％活性組合物被溶解在二氯甲烷中，溶液被噴射到載體上，且溶劑隨后在真空中被蒸發(fā)掉。4．粉劑ab活性組分2％ 5％高度分散的硅酸 1％ 5％滑石97％ -高嶺土- 90％通過(guò)徹底地混合載體與活性組分獲得了即用的粉劑。
實(shí)施例19殺蟲(chóng)組合物的固態(tài)制劑在下面的實(shí)施例中，成分的百分比以重量表示1．可濕性粉劑 a bc活性組分 20％ 60％ 75％木素磺酸鈉 5％ 5％-十二烷基硫酸鈉 3％-5％二異丁萘磺酸鈉 -6％ 10％辛基苯酚聚乙二醇醚(7-8摩爾的環(huán)氧-2％-乙烷)高度分散的硅酸 5％ 27％ 10％高嶺土 67％ - -活性成分與助劑徹底地混合且混合物在合適的碾磨機(jī)中被徹底的研磨，使得可濕性粉劑，可被用水稀釋產(chǎn)生所需濃度的懸浮液。2．可乳化的濃縮物活性成分 10％辛基苯酚聚乙二醇醚(4-5摩爾的環(huán)氧乙烷) 3％十二烷基苯磺酸鈣 3％蓖麻油聚乙二醇醚(36摩爾的環(huán)氧乙烷)4％環(huán)己酮30％二甲苯混合物 50％任意所需濃度的乳劑可通過(guò)用水稀釋此濃縮液來(lái)產(chǎn)生。3．粉劑 a b活性組分 5％8％滑石 95％-高嶺土 - 92％通過(guò)混合活性組合物與載體并在一個(gè)合適的碾磨機(jī)中研磨，獲得了即用的粉劑。4．?dāng)D壓顆粒劑活性成分 10％木素磺酸鈉2％羧甲基纖維素 1％高齡土87％活性組分被與助劑混合并研磨，混合物接著用水濕潤(rùn)?；旌衔锉粩D壓然后在氣流中干燥。5．包被顆?；钚猿煞? 3％聚乙二醇200 3％高齡土94％微細(xì)研磨過(guò)的活性成分在攪拌機(jī)中被均勻的應(yīng)用到用聚乙二醇濕潤(rùn)的高齡土中。通過(guò)此方式獲得非粉狀的包被顆粒。6．懸浮濃縮物活性成分 40％乙二醇10％壬基苯酚聚乙二醇(15摩爾的環(huán)氧乙烷)6％木素磺酸鈉10％羧甲基纖維素 10％37％水性甲醛溶液 0.2％75％水性乳劑的硅油0.8％水32％微細(xì)研磨過(guò)的活性成分被徹底的與助劑混合，產(chǎn)生一個(gè)懸浮濃縮物，從此可通過(guò)用水稀釋來(lái)獲得任意的所需的濃度懸浮液。
上述的殺蟲(chóng)制劑通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)以害蟲(chóng)被殺蟲(chóng)毒素防治的量應(yīng)用于植物。
D．核苷酸序列在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)本申請(qǐng)所述的核酸序列通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)可被引入到植物細(xì)胞中。通常地，此涉及通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法插入一個(gè)本發(fā)明的編碼序列到一個(gè)其編碼序列是異源(即，通常不存在)的表達(dá)系統(tǒng)中。載體含有插入的蛋白編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯必需的元件。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的大量的表達(dá)系統(tǒng)可以被使用，例如，質(zhì)粒，噬菌體病毒和其它的被修飾的病毒。合適的載體包括，但不限于，病毒載體例如λ載體系統(tǒng)λgtl1,λgtl0和Charon載體4；質(zhì)粒載體例如pB1121,pBR322,pACYC177,pACYC184,pAR系列,pKK223-3,pUC8,pUC9,pUC18,pUC19,pLG339,pR1(290,pKC37,pKC101,pCDNAⅡ；以及其它的類(lèi)似的系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)的元件可被修飾來(lái)增加表達(dá)。例如平截序列，核苷酸替換或其它的修飾可以被采用。此處所述的表達(dá)系統(tǒng)可被在合適的條件下用于實(shí)質(zhì)上轉(zhuǎn)化任意農(nóng)作物植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生成整個(gè)植物，這樣本發(fā)明的核苷酸序列便賦予了轉(zhuǎn)基因植物昆蟲(chóng)抗性。
實(shí)施例22編碼序列以及相鄰序列的修飾本申請(qǐng)所述的核苷酸序列可被修飾用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。表達(dá)核苷酸序列的以及在其細(xì)胞中產(chǎn)生殺蟲(chóng)毒素的宿主植物增強(qiáng)了對(duì)昆蟲(chóng)攻擊的抗性且因此較好的減少了因昆蟲(chóng)攻擊引起的農(nóng)作物的損失。
微生物來(lái)源的基因在植物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可能需要這些基因的修飾來(lái)獲得和最優(yōu)化在植物中的表達(dá)。特別地，編碼獨(dú)立的但被相同轉(zhuǎn)錄體在天然微生物中編碼的酶的細(xì)菌ORF最好在植物中獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄體上表達(dá)。為了達(dá)到上述目標(biāo)，每一個(gè)微生物的ORF分別被分離和在盒中克隆，其中的盒在ORF的5’末端提供一個(gè)植物啟動(dòng)子序列以及在ORF的3’末端提供一個(gè)植物轉(zhuǎn)錄終止子。分離的ORF序列優(yōu)選包括起始ATG密碼子和終止STOP密碼子，但可能在起始ATG密碼子和STOP密碼子之外包括另外的序列。此外，ORF可被截短，但仍保留所需的活性；對(duì)于特別的長(zhǎng)ORF，仍保留活性的截短形式可優(yōu)先在轉(zhuǎn)基因生物體內(nèi)表達(dá)?！爸参飭?dòng)子”和“植物轉(zhuǎn)錄終止子”指在植物細(xì)胞中有效的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。其包括可從非植物來(lái)源的例如病毒(一個(gè)例子為花椰菜花葉病毒)獲得的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。
在一些情況下，不需要對(duì)ORF編碼序列及其相鄰序列進(jìn)行修飾。分離含有目的ORF的片段與插入到植物啟動(dòng)子的下游就足夠了。例如，Gaffney等人(Science 261:754-756(1993))在轉(zhuǎn)基因植物中在CaMV 35S啟動(dòng)子和CaMV tml終止子的調(diào)控下成功的表達(dá)了假單胞菌屬nahG基因，而沒(méi)有編碼序列的修飾并且ATG上游的假單胞菌屬基因xbp以及STOP密碼子的下游ybp仍舊與nahG ORF相連。優(yōu)選的如小的相鄰的微生物的序列將被留在與ATG的上游以及STOP密碼子的下游相連。實(shí)際上，此構(gòu)建物依賴于限制性位點(diǎn)的可得性。
在其它的情況下，來(lái)自微生物來(lái)源的基因表達(dá)在表達(dá)中會(huì)產(chǎn)生一些問(wèn)題。這些問(wèn)題在本領(lǐng)域已被充分描述且特別是來(lái)自一定的來(lái)源例如芽胞桿菌屬的基因所常見(jiàn)的。這些問(wèn)題可被應(yīng)用于本發(fā)明的核苷酸序列且這些基因的修飾可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)來(lái)進(jìn)行。下面的問(wèn)題將被遇到。
1．密碼子選擇植物中的優(yōu)選的密碼子選擇不同于在特定的微生物中的密碼子選擇。克隆微生物ORF的密碼子選擇與植物基因(以及來(lái)自靶植物的特定基因)的密碼子選擇的比較將能夠鑒定優(yōu)選被改變的ORF中的密碼子。典型地，植物進(jìn)化趨于在單子葉植物的第三堿基位置強(qiáng)烈使用核苷酸C和G，然而雙子葉植物通常在此位置使用核苷酸A和T。通過(guò)修飾一個(gè)基因來(lái)引入對(duì)于特定的目的轉(zhuǎn)基因品種優(yōu)選的密碼子選擇，許多下述的GC/AT含量以及不正常剪接的難題將被克服。
2．GC/AT含量植物基因典型地含有大于35％的GC含量。富含A和T核苷酸的ORF序列可在植物中引起一些難題。首先，據(jù)信ATTTA基元引起信使的去穩(wěn)定作用并在許多短壽mRNA的3’末端被發(fā)現(xiàn)。第二，據(jù)信多腺苷酸化信號(hào)例如AATAA在信使中的合適的位點(diǎn)的產(chǎn)生引起轉(zhuǎn)錄的過(guò)早截?cái)?。此外，單子葉植物可識(shí)別富含AT的序列為剪接位點(diǎn)(見(jiàn)下面)。
3．與起始甲硫氨酸相鄰的序列植物不同于微生物之處在于其信使不具有確定的核糖體結(jié)合部位。相反，據(jù)信核糖體連接于信使的5’末端且掃描第一個(gè)可得的ATG，在此處開(kāi)始翻譯。然而，據(jù)信，某些核苷酸優(yōu)先相鄰于ATG且微生物基因的表達(dá)可通過(guò)一個(gè)真核的共有區(qū)翻譯起始密碼子在ATG處的引入被增強(qiáng)。Clontech(1993/1994 catalog,第210頁(yè)，在此引入作為參考)提出了一個(gè)序列作為一個(gè)共有區(qū)翻譯起始密碼子用于大腸桿菌uidA基因在植物中的表達(dá)。此外，Joshi(NAR L5:6643-6653(1987),在此引入作為參考) 比較了許多相鄰于ATG的植物序列并提出了另外的共有區(qū)序列。遇到微生物ORF在植物中的表達(dá)中的難題的情況下，這些序列中的一個(gè)在起始ATG處的包含能改善翻譯。在此情況下，共有區(qū)的最后三個(gè)核苷酸可能不適于包含在修飾的序列中，這是由于其修飾第二個(gè)AA殘基。優(yōu)選的相鄰于起始甲硫氨酸的序列在不同的植物種類(lèi)中可能是不同的。對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的14個(gè)玉米基因的研究得到了下面的結(jié)果14個(gè)玉米基因的起始ATG前的位置-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3-2-1C38462560107T303432111 0A231432372 3G636065461 5
用于所期望的該核苷酸序列被引入的植物種類(lèi)的這種分析可被進(jìn)行，并且鄰接于ATG的序列被修飾來(lái)引入優(yōu)選的核苷酸。
4．不正常剪接位點(diǎn)的去除。
從非植物來(lái)源克隆的以及未被優(yōu)化在植物中表達(dá)的基因也可能含有在植物中被識(shí)別為5’或3’剪接位點(diǎn)的基元并被切除，因此產(chǎn)生截短的或缺失的信使。這些位點(diǎn)可通過(guò)本領(lǐng)域公知的技術(shù)被除去。
編碼序列和相鄰序列的修飾技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。在微生物ORF的起始表達(dá)很低的并且其被認(rèn)為適合產(chǎn)生如上所述序列的改變情況下，則合成基因的構(gòu)建可通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)被完成。這些，例如，描述在公開(kāi)的專利EP 0 385 962(Monsanto),EP 0 359 472(Lubrizol)以及WO 93/07278(Ciba-Geigy)中，所有這些在此引入作為參考。在大多數(shù)的情況下，通過(guò)使用瞬時(shí)分析方法(其在本領(lǐng)域是公知的)在其轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)基因植物前分析基因構(gòu)建物的表達(dá)是優(yōu)選的。
實(shí)施例23植物表達(dá)盒的構(gòu)建計(jì)劃用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的編碼序列首先被裝配在表達(dá)盒中在植物中表達(dá)的合適的啟動(dòng)子的后面。表達(dá)盒也可含有任意其它需要或選擇用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的序列。此序列包括，但不限于，轉(zhuǎn)錄終止子，增強(qiáng)表達(dá)的附加的序列例如內(nèi)含子，有生活力的序列，以及用于基因產(chǎn)物對(duì)特定的細(xì)胞器和細(xì)胞區(qū)室的尋靶作用的序列。這些表達(dá)盒然后可輕易地被給藥到在下面描述的植物轉(zhuǎn)化載體。下列是典型的表達(dá)盒的不同組成的描述。
1．啟動(dòng)子表達(dá)盒中所用啟動(dòng)子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的空間和時(shí)間的表達(dá)模式。選擇的啟動(dòng)子將在特定的細(xì)胞類(lèi)型(例如葉表皮的細(xì)胞，葉肉細(xì)胞，根皮層細(xì)胞)或在特定的組織或器官(例如，根，葉，或花)中表達(dá)轉(zhuǎn)基因并且選擇將反映所期望的基因產(chǎn)物積累的場(chǎng)所?？蛇x擇地，所選擇的啟動(dòng)子在不同的誘導(dǎo)條件下驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。啟動(dòng)子在其強(qiáng)度例如啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力上是不同的。依賴于所利用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，任意一個(gè)合適的啟動(dòng)子可被使用，包括基因的天然啟動(dòng)子。下面是可用在表達(dá)盒中的啟動(dòng)子的非限制性的實(shí)例。
a．組成型表達(dá)，遍在蛋白啟動(dòng)子遍在蛋白質(zhì)是一種基因產(chǎn)物已知在許多細(xì)胞類(lèi)型中積累并且其啟動(dòng)子被從一些種中克隆用于轉(zhuǎn)基因植物(如向日葵-Binet等Plant Science 79:87-94(1991)；玉米-Christensen等人.PlantMolec.Biol.12:619-632(1989)；以及Arabidopsis-Norris等人.，Plant MoL BIoL 21:895-906(1993))。玉米遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因單子葉植物系統(tǒng)中被改進(jìn)且其用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的序列以及載體被公開(kāi)在專利申請(qǐng)EP 0 342 926(to Lubrizol)上，其在此通過(guò)引用被合。Taylor等人(Plant Cell Rep.12:491-495(1993))描述了一個(gè)載體(pAHC25)其含有玉米遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子和第一內(nèi)含子以及其當(dāng)經(jīng)過(guò)微粒子轟擊導(dǎo)入時(shí)在很多單子葉植物的細(xì)胞懸浮液中的高活性。Arabidopsis遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子理想地用于本發(fā)明的核苷酸序列。遍在蛋白質(zhì)啟動(dòng)子適于在轉(zhuǎn)基因植物，單子葉植物以及雙子葉植物中的基因表達(dá)。合適的載體為pAHC25的衍生物或任意在本申請(qǐng)中描述的通過(guò)導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋樵诘鞍踪|(zhì)啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子序列進(jìn)行修飾的的轉(zhuǎn)化載體。
b．組成型表達(dá)，CaMV 35S啟動(dòng)子質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建被描述在公開(kāi)的專利申請(qǐng)EP 0 392 225(實(shí)施例23)，其在此引入作為參考。pCGN1761含有“雙”CaMV 35S啟動(dòng)子和tml轉(zhuǎn)錄終止子，在啟動(dòng)子和終止子間帶有一個(gè)獨(dú)特的EcoRⅠ位點(diǎn)并且具有一個(gè)pUC型主鏈。pCGN1761的衍生物被構(gòu)建具有一個(gè)修飾的包括除存在的EcoRⅠ位點(diǎn)外的Notl位點(diǎn)和Xhol位點(diǎn)的多接頭。此衍生物被設(shè)計(jì)為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX對(duì)于cDNA序列或編碼序列(包括微生物ORF序列)在其多接頭中的用于在轉(zhuǎn)基因植物中35S啟動(dòng)子的調(diào)控下的表達(dá)目的的克隆是有用的。此構(gòu)建物的整個(gè)35S啟動(dòng)子-編碼序列-tml終止子可被HindⅢ,SphⅠ,Sall在從5’位點(diǎn)到啟動(dòng)子切除，以及XbaⅠ,BamHⅠ以及BgⅡ在從3’位點(diǎn)到終止子切除來(lái)給藥到如下面所述的轉(zhuǎn)化載體。此外，雙35S啟動(dòng)子片段可被去除通過(guò)用HindⅢ,SphⅠ,Sall,XbaⅠ,或PstⅠ 5’切除和任意的多接頭限制性位點(diǎn)(EcoRⅠ,NotⅠ或XhoⅠ)用其它的啟動(dòng)子替換。如果需要，克隆位點(diǎn)周?chē)男揎椏赏ㄟ^(guò)導(dǎo)入能增強(qiáng)翻譯的序列來(lái)產(chǎn)生。當(dāng)過(guò)量表達(dá)被期望時(shí)，此特別有用。例如，pCGN1761ENX可通過(guò)翻譯起始位點(diǎn)的優(yōu)化被修飾，如實(shí)施例37中的US專利No.5,639,949所述，其引入作為參考。
c．組成型表達(dá)，肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子肌動(dòng)蛋白的一些異構(gòu)形式已知在大多數(shù)的細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)并且因此所以肌動(dòng)蛋白是組成型啟動(dòng)子的良好的選擇。特定的，來(lái)自水稻ActⅠ基因的啟動(dòng)子被克隆和鑒定(McElroy等人Plant Cell 2:163-171(1990))。啟動(dòng)子的一個(gè)1.3kb的片段被發(fā)現(xiàn)含有在水稻原生質(zhì)體表達(dá)需要的所有調(diào)控元件。此外，無(wú)數(shù)的基于AcTl啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的表達(dá)載體被構(gòu)建特定的用于單子葉植物(McElroy等人Mol.Gen.Genet232:150-160(1991))。這些包括Acti-內(nèi)含子，Adhl 5’側(cè)翼序列和Adhl-內(nèi)含子(來(lái)自玉米乙醇脫氫酶基因)以及來(lái)自CaMV 35S啟動(dòng)子的序列。顯示出最高表達(dá)的載體是35S和Acti-內(nèi)含子或Adhl 5’側(cè)翼序列和Adhl-內(nèi)含子的融合物。起始密碼子ATG(GUS報(bào)道基因)周?chē)男蛄械膬?yōu)化也增強(qiáng)了表達(dá)。McElroy等人(Mol.Gen.Genet.231:150-160(1991))描述的啟動(dòng)子表達(dá)盒可輕易地被修飾用于基因表達(dá)且特別適合用于單子葉植物宿主。例如，含有啟動(dòng)子的片段被從McElroy構(gòu)建物中去除并用于替換pCGNl761 ENX中的雙35S啟動(dòng)子，其有效用于特異性基因序列的插入。融合基因如此被構(gòu)建然后被給藥到適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化載體中。在一個(gè)獨(dú)立的報(bào)道中，攜帶其第一內(nèi)含子的水稻ActⅠ啟動(dòng)子也已被發(fā)現(xiàn)在種植的大麥細(xì)胞中指導(dǎo)高效表達(dá)(Chibbar等人.Plant Cell Rep.12:506-509(1993))。
d．誘導(dǎo)型表達(dá)，PR-1啟動(dòng)子pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子可被任何其它的會(huì)產(chǎn)生合適的高表達(dá)水平的啟動(dòng)子替換。例如，一個(gè)描述在US專利No.5,614,395上的化學(xué)調(diào)控的啟動(dòng)子可替換雙35S啟動(dòng)子。所選的啟動(dòng)子優(yōu)選被限制性酶從其來(lái)源被切除，但可選擇地利用攜帶適當(dāng)?shù)慕K止限制位點(diǎn)的引物被PCR擴(kuò)增。若PCR-擴(kuò)增將被進(jìn)行，則啟動(dòng)子應(yīng)在擴(kuò)增的啟動(dòng)子在靶載體中的克隆之后被重測(cè)序來(lái)檢查擴(kuò)增錯(cuò)誤?；瘜W(xué)/病原體調(diào)控?zé)煵軵R-1a啟動(dòng)子被從質(zhì)粒pCIB1004(用于構(gòu)建，參見(jiàn)EP 0332 104的實(shí)施例21，其在此引入作為參考)分離并被給藥到質(zhì)粒pCGN1761ENX(Uknes等人.，1992)中。pCIB1004用NcoⅠ切割且所得的線性片段的3’突出端被通過(guò)用T4 DNA聚合酶處理變鈍。然后片段用HindⅢ切割且產(chǎn)生的含PR-1a啟動(dòng)子的片段被凝膠純化并克隆到其35S啟動(dòng)子已被去除的pCGN1761 ENX中。這通過(guò)下述步驟完成用Xho1切割并用T4聚合酶鈍化，接著用HindⅢ切割以及分離pCIB1004啟動(dòng)子被克隆入的較大含有-載體終止子的片段。此產(chǎn)生了帶有PR-1a啟動(dòng)子和tml終止子和一個(gè)帶有獨(dú)特的EcoRⅠ以及NotⅠ位點(diǎn)的間插多接頭的pCGN1761ENX衍生物。所選的編碼序列可被插入到此載體中，且融合的產(chǎn)物(即啟動(dòng)子-基因-終止子)隨后可被給藥代任意所選的轉(zhuǎn)化載體中，包括那些下文描述的。不同的化學(xué)調(diào)節(jié)劑可被用來(lái)誘導(dǎo)所選的編碼序列在通過(guò)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá)，包含公開(kāi)在US專利No.5,523,311和5,614,395上的苯并噻二唑，異煙酸，以及水楊酸化合物。
e．誘導(dǎo)型表達(dá)，乙醇-可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子被特定的醇或酮，例如乙醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可被用來(lái)賦予本發(fā)明的編碼序列可誘導(dǎo)的表達(dá)。此種啟動(dòng)子例如來(lái)自Aspergillus nidulans的alcA基因啟動(dòng)子(Caddick等人(1998)Nat.Biotechnol16:177-180)。在A.nidulans中，alcA基因編碼乙醇脫氫酶，其表達(dá)在化學(xué)誘導(dǎo)劑的存在下被AIcR轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，在含有被融合到最小的35S啟動(dòng)子(Caddick等人(1998)Nat.Biotechnol 16:177-180)上的alcA基因啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒palcA:CAT中的CAT編碼序列被本發(fā)明的一個(gè)編碼序列替換來(lái)形成一個(gè)具有在alcA基因啟動(dòng)子調(diào)控下的編碼序列的表達(dá)盒。此是通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法來(lái)進(jìn)行。
f．誘導(dǎo)型表達(dá)，糖皮質(zhì)素可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子本發(fā)明的利用基于類(lèi)固醇激素的系統(tǒng)的核苷酸序列的表達(dá)的誘導(dǎo)也已被考慮。例如，糖皮質(zhì)素介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)被使用(Aoyama和Chua(1997)The Plant Journal 11:605-612)以及通過(guò)糖皮質(zhì)素的應(yīng)用誘導(dǎo)基因表達(dá)，例如，一個(gè)合成的糖皮質(zhì)素，優(yōu)選的為地塞米松，優(yōu)選的濃度為0.1mM到1mM，較優(yōu)選的為10mM到100mM。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，熒光素酶基因序列被本發(fā)明的一段核酸序列替換來(lái)產(chǎn)生一個(gè)具有本發(fā)明的核酸序列的表達(dá)盒，其是在6拷貝的融合到35S最小啟動(dòng)子的激活序列上游GAL4的調(diào)控下。此通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行的。反式作用因子含有融合到疤疹病毒蛋白質(zhì)VP16(Triezenberg等人(1988)Genes Devel.2:718-729)反式激活區(qū)的GAL4 DNA-結(jié)合區(qū)(Keegan等人(1986)Science 231:699-704)，其中的皰疹病毒蛋白質(zhì)VP16融合到鼠糖皮質(zhì)素受體(Picard等人(1988)Cell54:1073-1080)的激素結(jié)合區(qū)。融合蛋白的表達(dá)被適用于在本領(lǐng)域公知的或此處所描述的植物中表達(dá)的任意啟動(dòng)子所調(diào)控。此表達(dá)盒也包含在含有本發(fā)明的融合到6xGAL4/最小啟動(dòng)子的核酸序列的植物中。因此，融合蛋白的組織或器官特異性被獲得來(lái)產(chǎn)生殺蟲(chóng)毒素的可誘導(dǎo)的組織或器官特異性。
g．根特異性表達(dá)另一種基因表達(dá)的模式是根表達(dá)。一個(gè)合適的根啟動(dòng)子被deFramond描述(FEBS 290:103-106(1991))以及被描述在公開(kāi)的專利申請(qǐng)EP 0 452 269上，其在此引入作為參考。此啟動(dòng)子被轉(zhuǎn)到一個(gè)合適的例如pCGN1761 ENX載體中，用于插入一個(gè)被選擇的基因并且隨后轉(zhuǎn)移完整的啟動(dòng)子-基因-終止子盒到目的轉(zhuǎn)化載體中。
h．愈傷-誘導(dǎo)啟動(dòng)子:
愈傷-誘導(dǎo)啟動(dòng)子也適于基因表達(dá)。大量的這種啟動(dòng)子已被描述(如Xu等人Plant Molec.Biol.22:573-588(1993),Logemann等人Plant Cell 1:151-158(1989),Rohrmeier & Lehle,Plant Molec.Biol.22:783-792(1993),Firek等人.Plant Molec.Biol.22:129-142(1993),Warner等人.Plant J.3:191-201(1993))且全都適用于本發(fā)明。Logemann等人描述了雙子葉馬鈴薯wunL基因的5’上游序列。Xu等人表明來(lái)源于雙子葉馬鈴薯(pin2)的愈傷-誘導(dǎo)啟動(dòng)子在單子葉植物水稻中也具有活性。另外，Rohrmeier & Lehle描述愈傷誘導(dǎo)的玉米Wipl cDNA的克隆且其可被通過(guò)常規(guī)技術(shù)用來(lái)分離關(guān)聯(lián)啟動(dòng)子。Similar,Firek等人以及Warner等人描述了一個(gè)來(lái)自于單子葉植物Asparagus officinalls的愈傷-誘導(dǎo)基因，其被表達(dá)在局部愈傷區(qū)以及病原體侵染位點(diǎn)。利用本領(lǐng)域公知的克隆技術(shù)，這些啟動(dòng)子可被轉(zhuǎn)到合適的載體中，融合到本發(fā)明涉及的基因中，并且用于在植物愈傷點(diǎn)表達(dá)這些基因。
i．木髓-優(yōu)選的表達(dá)專利WO 93/07278，其引入作為參考，描述了優(yōu)選在木髓細(xì)胞中表達(dá)的玉米trpA基因的分離。從轉(zhuǎn)錄起始延伸到-1726 bp的基因序列以及啟動(dòng)子被描述。利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，此啟動(dòng)子或其部分，可被轉(zhuǎn)到一個(gè)如pCGN1761載體中，其可替換35S啟動(dòng)子并用于驅(qū)動(dòng)外源基因以木髓-優(yōu)選的方式表達(dá)。事實(shí)上，含有木髓-優(yōu)選的啟動(dòng)子或其部分的片段可被轉(zhuǎn)到任意載體并被修飾用于轉(zhuǎn)基因植物。
j．葉-特異性表達(dá)編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因已被Hudspeth & Grula描述(Plant Molec Biol 12:579-589(1989))。利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，該基因的啟動(dòng)子可被用來(lái)驅(qū)動(dòng)任意基因以葉-特異性的方式在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。
k．花粉-特異性表達(dá)WO 93/07278描述了表達(dá)在花粉細(xì)胞中的玉米鈣-依賴的蛋白質(zhì)激酶(CDPK)基因的分離。該基因序列和啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄起始延伸到1400bp。利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)，該啟動(dòng)子或其部分，可被轉(zhuǎn)到如pCGN1761載體中來(lái)替換35S啟動(dòng)子并且用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的核酸序列以花粉-特異性方式表達(dá)。
2．轉(zhuǎn)錄終止子可得到很多種類(lèi)的轉(zhuǎn)錄終止子用于表達(dá)盒。這些終止子負(fù)責(zé)除轉(zhuǎn)基因以及準(zhǔn)確的聚腺苷酸化外的轉(zhuǎn)錄終止。適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子為那些已知在植物中有功能的終止子且包括CaMV 35S終止子，tml終止子，胭脂氨酸合酶終止子以及豌豆rbcS E9終止子。這些可被用于單子葉和雙子葉植物。此外，一個(gè)基因的天然轉(zhuǎn)錄終止子也可被利用。
3．用于增強(qiáng)或調(diào)控表達(dá)的序列大量的序列已被發(fā)現(xiàn)從轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)部增強(qiáng)基因表達(dá)并且這些序列可被用于聯(lián)合本發(fā)明的基因來(lái)增加其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。
不同的內(nèi)含子序列已被顯示出特別是在單子葉植物的細(xì)胞中增強(qiáng)表達(dá)。例如，玉米Adhl基因的內(nèi)含子已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)當(dāng)被導(dǎo)入到玉米細(xì)胞后顯著加強(qiáng)在其關(guān)聯(lián)啟動(dòng)子控制下的野生型基因的表達(dá)。內(nèi)含子1被發(fā)現(xiàn)特別有效并且增強(qiáng)帶有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(Callis等人.，Genes Develop.1:1183-1200(1987))的融合構(gòu)建物中的表達(dá)。在相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，來(lái)自玉米bronzel基因的內(nèi)含子具有相似的增強(qiáng)表達(dá)活性。內(nèi)含子序列已經(jīng)被常規(guī)地引入到植物轉(zhuǎn)化載體，典型的在非翻譯前導(dǎo)區(qū)內(nèi)。
也已知來(lái)源于病毒的大量非翻譯前導(dǎo)序列增強(qiáng)表達(dá)，并且這些在雙子葉植物細(xì)胞中特別有效。具體地，來(lái)自煙草花葉病毒(TMV,“W-序列”)，玉米黃斑病毒(MCMV)，以及苜蓿花葉病毒(AMV)的前導(dǎo)序列已被顯示對(duì)增強(qiáng)表達(dá)有效(e.g.Gallie等人Nud.Acids Res.15:8693-8711(1987)；Skuzeski等人Plant Molec.Biol.15:65-79(1990))。
4．細(xì)胞內(nèi)基因產(chǎn)物的尋靶作用靶向基因產(chǎn)物的不同機(jī)制已知存在于植物中且調(diào)控這些機(jī)制功能的序列在一些細(xì)節(jié)上已被鑒定。例如，基因產(chǎn)物對(duì)葉綠體的尋靶作用被一個(gè)發(fā)現(xiàn)在不同蛋白質(zhì)氨基末端的信號(hào)序列調(diào)控，其在葉綠體輸入的過(guò)程中被切割產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)(如Comai等人J.Biol.Chem.263:15104-15109(1988))。這些信號(hào)序列可被融合到異源基因產(chǎn)物中來(lái)影響異源產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)饺~綠體中(van den Broeck，等人.Nature313:358-363(1985))。編碼適當(dāng)信號(hào)序列的DNA可被從編碼RUBISCO蛋白，CAB蛋白，EPSP合酶，G52蛋白以及許多其它的已知定位于葉綠體的蛋白的cDNA的5’末端分離。也參見(jiàn)，U.S.專利No.5,639,949的實(shí)施例37的命稱為“葉綠體尋靶作用的表達(dá)”。
其它的基因產(chǎn)物被定位在其它的細(xì)胞器例如線粒體以及過(guò)氧物酶體中(如Unger等人.Plant Molec.Biol.13:411-418(1989))。編碼這些產(chǎn)物的cDNA已被人工處理來(lái)影響異源基因產(chǎn)物對(duì)這些細(xì)胞器的尋靶作用。這種序列的實(shí)例為核-編碼的腺苷三磷酸酶以及線粒體的特異性天門(mén)冬氨酸鹽氨基轉(zhuǎn)移酶同Ⅰ型。靶向細(xì)胞蛋白體已被Rogers等人描述(Proc.NatⅠ.Acad.Sci.USA 82:6512-6516(1985))。
此外，已鑒定引起基因產(chǎn)物對(duì)其它細(xì)胞室的尋靶作用的序列。氨基末端序列負(fù)責(zé)對(duì)ER，質(zhì)外體，以及來(lái)自糊粉細(xì)胞的細(xì)胞外分泌物的尋靶作用(Koehler & Ho,Plant Cell 2:769-783(1990))。另外，氨基末端序列與羧基末端序列聯(lián)合對(duì)基因產(chǎn)物的液泡的尋靶作用負(fù)責(zé)(Shinshi等Plant Molec.Biol.14:357-368(1990))。
通過(guò)將上述的適當(dāng)?shù)膶ぐ凶饔眯蛄腥诤系侥康霓D(zhuǎn)基因序列中，其可能引導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到任意細(xì)胞器或細(xì)胞小室中。為了葉綠體的尋靶作用，例如，來(lái)源于RUBISCO基因，CAB基因，EPSP合酶基因，或GS2基因的葉綠體信號(hào)序列被融合到轉(zhuǎn)基因的氨基末端ATG框中。選擇的信號(hào)序列應(yīng)包括已知的切割位點(diǎn)，且構(gòu)建的融合物應(yīng)考慮切割所需的切割位點(diǎn)后的任意氨基酸。在一些情況下，這種需要可通過(guò)在切割位點(diǎn)和轉(zhuǎn)基因ATG之間加入少許的氨基酸，或可選擇地，在轉(zhuǎn)基因內(nèi)部替換一些氨基酸來(lái)滿足。用于葉綠體輸入的構(gòu)建融合物可被通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物的體外翻譯接著體外葉綠體吸收用于檢測(cè)葉綠體吸收的效率，利用的技術(shù)為Bartlett等人在Edelmann等(Eds.)Methodsin Chloroplast Molecular Biology,Elsevier pp 1081-1091(1982)以及Wasmann等Mol.Gen.Genet.205:446-453(1986)所描述。這些構(gòu)建物技術(shù)是本領(lǐng)域公知的且同樣適用于線粒體和過(guò)氧物酶體。
上述的用于細(xì)胞尋靶作用機(jī)制可被不僅與它的關(guān)聯(lián)啟動(dòng)子聯(lián)合，而且也可與異源啟動(dòng)子聯(lián)合使用以便達(dá)到在一個(gè)具有不同于靶向信號(hào)來(lái)源的啟動(dòng)子的表達(dá)模式的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的特異性細(xì)胞-尋靶作用的目的。
實(shí)施例24構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體大量的適用于植物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化載體對(duì)于植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是已知，且與本發(fā)明相關(guān)的基因可被用于連接于任意的這樣的載體。載體的選擇將依賴于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)以及用于轉(zhuǎn)化的靶種。對(duì)于一定的靶的種類(lèi)來(lái)說(shuō)，不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記將是優(yōu)選的。轉(zhuǎn)化中常規(guī)應(yīng)用的選擇標(biāo)記包括nptll基因，其賦予卡那霉素以及相關(guān)的抗生素的抗性(Messing & Vierra.基因19:259-268(1982)；Bevan等人，Nature 304:184-187(1983)),bar基因，其賦予除草劑膦絲霉素抗性(White等人.，Nud.Acids Res 18:1062(1990),Spencer等人.Theor.Appl.Genet 79:625-631(1990)),hph基因，其賦予抗生素潮霉素抗性(Blochinger & Diggelmann,MolCell Biol 4:2929-2931),以及dhfr基因，其賦予methatrexate抗性(Bourouis等人.，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))，以及EPSPS基因，其賦予草甘膦抗性(U.S.專利No.4,940,935和5,188,642)。
1．適合于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體許多載體適合于利用根瘤土壤桿菌的轉(zhuǎn)化。這些典型地?cái)y帶至少一個(gè)T-DNA邊界序列并包括例如pBINl 9(Bevan,Nud.Acids Res.(1984))和pXYZ的載體。下面，兩種典型的適用于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體的構(gòu)建被描述。
a．pCIB200和pCIB2001:
二元載體pcIB200和pCIB2001被用于構(gòu)建用于土壤桿菌的重組載體并以下述的方式構(gòu)建。通過(guò)pTJS75的NarⅠ消化(Schmidhauser& Helinski,J.Bacteriol.164:446-455(1985))允許四環(huán)素-抗性基因的切除，接著插入來(lái)源于攜帶NPTⅡ的pUC4K的一個(gè)AccⅠ片段，產(chǎn)生了pTJS75kan(Messing & Vierra，基因19:259-268(1982):Bevan等人.，Nature 304:184-187(1983):McBride等人.，Plant Molecular Biology 14:266-276(1990))。XhoⅠ接頭被連接到PCIB7的EcoRV片段上，其中的EcoRV片段含有左或右T-DNA邊界，一個(gè)植物選擇性nos/nptll嵌合基因 以及pUC多接頭(Rothstein等人.，基因53:153-161(1987))，且Xhol-消化的片段被克隆到Sall-消化的pTJS75kan片段上來(lái)產(chǎn)生pCIB200(也參見(jiàn)EP 0332 104，實(shí)施例19)。pCIB200含有下面的獨(dú)特的多接頭限制性位點(diǎn)EcoRⅠ,SstⅠ,KpnⅠ,BgⅢ,XbaⅠ,和SaⅡ。pCIB2001是通過(guò)插入另外的限制性位點(diǎn)到多接頭中產(chǎn)生的pCIB200的衍生物。在pCIB2001多接頭中獨(dú)特的限制性位點(diǎn)為EcoRⅠ,SstⅠ,KpnⅠ,BgⅢ,XbaⅠ,SaⅡ,MIuⅠ,BcⅡ,AvrⅡ,Apal,HpaⅠ,以及StuⅠ。pCIB2001除了含有獨(dú)特的限制性位點(diǎn)外還含有植物和細(xì)菌卡那霉素選擇性，土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的左和右T-DNA邊界，用于在E.coil和其它的宿主間的遷移的RK2-來(lái)源的trfA功能，以及也來(lái)自于RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接頭適用于含有它們自身調(diào)節(jié)信號(hào)的植物表達(dá)盒的克隆。
b．pCIB10以及其潮霉素選擇性衍生物二元載體pCIB10含有編碼用于植物中選擇的卡那霉素抗性基因以及T-DNA右和左邊界序列以及引入來(lái)自于宿主廣譜的允許其在E.coli和土壤桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pRK252的序列。其構(gòu)建物被Rothstein等人描述(基因53:153-161(1987))。pCIB10的不同衍生物被構(gòu)建，其引入了潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，如Gritz等所描述(Gene 25:179-188(1983))。這些衍生物能夠在僅含潮霉素(pCIB743)，或潮霉素與卡那霉素(pCIB715,pCIB717)上篩選轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
2．適用于非-土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體沒(méi)有利用根瘤土壤桿菌的轉(zhuǎn)化避免了對(duì)在選擇轉(zhuǎn)化載體的T-DNA序列的要求，且因此除了諸如上述的含有T-DNA序列的載體外，缺少這些序列的載體可被利用。不依賴于土壤桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過(guò)微粒轟擊，原生質(zhì)體攝取(例如.PEG和電穿孔)以及微注射的轉(zhuǎn)化。載體的選擇較多地依賴于被轉(zhuǎn)化種類(lèi)的優(yōu)選選擇。下面，適用于非土壤桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體的構(gòu)建被描述。
a．pCIB3064:
pC1B3064是一個(gè)pUC-起源的載體，適用于與除草劑basta(或膦絲霉素)的選擇聯(lián)合的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。質(zhì)粒pCIB246含有CaMV 35S啟動(dòng)子(可操作地融合到E.coil GUS基因)和CaMV 35S轉(zhuǎn)錄終止子并被描述于公開(kāi)的PCT申請(qǐng)WO 93/07278。此載體的35S啟動(dòng)子含有兩個(gè)起始位點(diǎn)的5’ATG序列。這些位點(diǎn)利用標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)被誘變使得去除ATG并產(chǎn)生Sspl和PvuⅡ限制性位點(diǎn)。新的限制性位點(diǎn)距離獨(dú)特的SaⅡ位點(diǎn)96和37 bp以及距離實(shí)際的起始位點(diǎn)101和42 bp。產(chǎn)生的pCIB246的衍生物被命名為pCIB3025。然后，GUS基因通過(guò)SaⅡ和SacⅠ的消化被從pCIB3025切除，末端被變鈍并被重新連接產(chǎn)生質(zhì)粒pCIB3060。質(zhì)粒pJIT82從John InnesCentre,Norwich獲得并且一個(gè)400 bp的含有來(lái)自Streptomycesviridochrormogenes的bar基因的Smal片段被切除并插入到pCIB3060的Hpal位點(diǎn)(Thompson等EMBO J 6:2519-2523(1987))。產(chǎn)生pCIB3064，其含有在CaMV 35S啟動(dòng)子和用于除草劑選擇的終止子的調(diào)控下的bar基因，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因(用于在E.coil中選擇)和一個(gè)具有特定位點(diǎn)SphⅠ,PstⅠ,HindⅢ，和BamHⅠ的多接頭。此載體適于含有自身調(diào)控信號(hào)的植物表達(dá)盒的克隆。
b．pSOG19和pSOG35:
pSOG35是一個(gè)轉(zhuǎn)化載體，其利用E.coli二氫葉酸還原酶基因(DFR)作為選擇性標(biāo)記賦予甲氨蝶呤抗性。PCR被用于擴(kuò)增35S啟動(dòng)子(-800 bp)，來(lái)自玉米Adhl基因的內(nèi)含子6(-550 bp)以及來(lái)自pSOG10的18bp的GUS非翻譯前導(dǎo)序列。一個(gè)編碼E.coli二氫葉酸還原酶Ⅱ型基因的250-bp片段也通過(guò)PCR被擴(kuò)增并且這兩個(gè)PCR片段用來(lái)自pBl221(Clontech)的SacⅠ-PstⅠ片段裝配，其中的片段含有pUC19載體主鏈以及胭脂氨酸合酶終止子。這些片段的裝配產(chǎn)生pSOG19，片段其含有與內(nèi)含子6序列，GUS前導(dǎo)序列，DHFR基因以及胭脂氨酸合酶終止子融合的35S啟動(dòng)子。pSOG19中的GUS前導(dǎo)序列被來(lái)自玉米黃斑病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus)(MCMV)的前導(dǎo)序列替換產(chǎn)生了載體pSOG35。pSOG19和pSOG35攜帶氨芐青霉素抗性的pUC基因并具有適于外源物質(zhì)克隆的HindⅢ,SphⅠ,PstⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)。
3．適用于葉綠體轉(zhuǎn)化的載體為了本發(fā)明的核苷酸序列在植物質(zhì)體中的表達(dá)，質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pPH143(WO 97/32011，實(shí)施例36)被利用。核苷酸序列被插入到pPH143，因此替換PROTOX編碼序列。此載體然后被用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及大觀霉素抗性的轉(zhuǎn)化子的選擇?？蛇x擇地，核苷酸序列被插入到pPH143從而替換了aadH基因。在這種情況下，選擇轉(zhuǎn)化子的對(duì)PROTOX的抑制劑抗性。
實(shí)施例25轉(zhuǎn)化一旦本發(fā)明的核酸序列被克隆到一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中，其被轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞。植物的轉(zhuǎn)化和再生的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，Ti質(zhì)粒載體已被利于轉(zhuǎn)運(yùn)外源DNA，以及直接DNA攝取，脂質(zhì)體，電穿孔，微注射，以及微粒。此外，來(lái)源于土壤桿菌屬的細(xì)菌可被用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。下面描述轉(zhuǎn)化單子葉植物和雙子葉植物的代表性的技術(shù)以及代表性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化技術(shù)。
1．雙子葉植物的轉(zhuǎn)化雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并且包括基于土壤桿菌的技術(shù)和不需要土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌技術(shù)包括由原生質(zhì)體或細(xì)胞直接攝取外源遺傳物質(zhì)。此可以通過(guò)PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取，微粒轟擊介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)，或微注射被完成。這些技術(shù)的實(shí)例被Paszkowski等，EMBO J 3:2717-2722(1984),Potrykus等，Mol.Gen.Genet.199:169-177(1985),Reich等，Biotechnology 4:1001-1004(1986)，以及Klein等人，Nature 327:70-73(1987)描述。在每一個(gè)情況下，被轉(zhuǎn)化的植物通過(guò)本領(lǐng)域公知的常規(guī)技術(shù)被再生為整個(gè)植株。
土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是雙子葉植物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選技術(shù)，因?yàn)樗母咝мD(zhuǎn)化和在很多不同種類(lèi)中的廣泛應(yīng)用。土壤桿菌轉(zhuǎn)化典型地包括攜帶外源目的DNA的二元載體(例如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)化到一個(gè)適宜的土壤桿菌菌株中，其可能依賴于由土壤桿菌菌株在共住的Ti質(zhì)?；蛉旧w上(例如pCIB200和pCIB2001的菌株CIB542(Uknes等Plant Cell 5:159-169(1993))所攜帶的vir基因的互補(bǔ)序列(complement)。重組二元載體的轉(zhuǎn)到土壤桿菌通過(guò)利用攜帶重組二元載體的E.coil，攜帶例如pRK2013的質(zhì)粒且能運(yùn)輸重組二元載體到靶土壤桿菌菌株的輔助E.coil菌株的三親本交配法被完成?？蛇x擇地，重組二元載體可通過(guò)DNA轉(zhuǎn)化被轉(zhuǎn)運(yùn)到土壤桿菌(HOfgen &Willmitzer,Nud.Acids Res.16:9877(1988))。
通過(guò)重組土壤桿菌的靶植物種的轉(zhuǎn)化通常包括來(lái)自植物的外植體與土壤桿菌的共培養(yǎng)且根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法。被轉(zhuǎn)化的組織在含有位于二元質(zhì)粒T-DNA邊界之間的抗生素或除草劑抗性標(biāo)記的選擇性培養(yǎng)基上再生。
另一種用基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法涉及在植物組織和細(xì)胞中推進(jìn)惰性或生物活性粒子。此技術(shù)公開(kāi)于Sanford等人的U.S.專利No.4,945,050,5,036,006,和5,100,792上。通常地，此方法涉及在有效穿透細(xì)胞的外表面并與摻入其內(nèi)部的條件下推進(jìn)惰性或生物活性粒子。當(dāng)惰性粒子被利用時(shí)，載體可通過(guò)包被有含有目的基因的載體的粒子被導(dǎo)入到細(xì)胞中。選擇性地，靶細(xì)胞可被載體包圍以致于載體通過(guò)粒子的激發(fā)被導(dǎo)入到細(xì)胞中。生物活性粒子(例如，干酵母細(xì)胞，干細(xì)菌或噬菌體，各含有要被導(dǎo)入的DNA)也可被推進(jìn)入到植物細(xì)胞組織中。
2．單子葉植物的轉(zhuǎn)化大多數(shù)的單子葉植物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在已成為常規(guī)的技術(shù)。優(yōu)選的技術(shù)包括利用PEG或電穿孔技術(shù)，和微粒攻擊到愈傷組織直接轉(zhuǎn)化基因到原生質(zhì)體中。轉(zhuǎn)化可用單DNA種類(lèi)或多DNA種類(lèi)來(lái)進(jìn)行(例如.共轉(zhuǎn)化)且這兩種技術(shù)都適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化可以具有避開(kāi)完全載體的構(gòu)建以及產(chǎn)生帶有目的基因和可選擇性標(biāo)記的非連接基因座的轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)點(diǎn)，能夠在后代中除去選擇性標(biāo)記，這些是所期望的。然而，利用共轉(zhuǎn)化的一個(gè)缺點(diǎn)是分離DNA種類(lèi)被整合到基因組中的頻率低于100％(Schocher等Biotechnology 4:1093-1096(1986))。
專利申請(qǐng)EP 0 292435,EP 0 392 225，以及WO 93/07278描述了用于制備來(lái)自玉米的優(yōu)良近交系的愈傷組織和原生質(zhì)體的技術(shù)，利用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的技術(shù)，以及來(lái)自被轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的玉米植株的再生。Gordon-Kamm等(Plant Cell 2:603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology 8:833-839(1990))已公開(kāi)了利用微粒轟擊轉(zhuǎn)化Al88衍生玉米系的技術(shù)。此外，WO 93/07278和Koziel等(Biotechnology il:194-200(1993))描述了利用微粒轟擊轉(zhuǎn)化玉米優(yōu)良近交系的技術(shù)。該技術(shù)利用從授粉后14-15從玉米穗上切割的1.5-2.5mm長(zhǎng)的非成熟玉米胚和用于轟擊的PDS-1000He Biolistics裝置。
水稻的轉(zhuǎn)化也通過(guò)利用原生質(zhì)體或微粒轟擊直接的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)進(jìn)行。Japonica-型以及Indica-型的原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已被描述(Zhang等Plant Cell Rep Z:379-384(1988)；Shimamoto等Nature338:274-277(1989)；Datta等Biotechnology 8:736-740(1990))。兩種類(lèi)型也可利用微粒轟擊被常規(guī)的轉(zhuǎn)化(Christou等Biotechnology 9:957-962(1991))。此外，WO 93/21335描述了利用電穿孔來(lái)轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)。
專利申請(qǐng)EP 0 332 581描述Pooideae原生質(zhì)體的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)化和再生的技術(shù)。這些技術(shù)允許Dactyils和小麥的轉(zhuǎn)化。此外，小麥轉(zhuǎn)化已被Vasil等(Biotechnology 10:667-674(1992))描述利用微粒轟擊到C型長(zhǎng)期可再生的愈傷組織的細(xì)胞，也被描述利用微粒轟擊不成熟胚和不成熟胚來(lái)源的愈傷組織，Vasil等人(Biotechnology11:1553-1558(1993))和Weeks等(Plant Physiol.102:1077-1084(1993))。然而，小麥轉(zhuǎn)化的優(yōu)選的技術(shù)，包括通過(guò)粒子轟擊不成熟胚細(xì)胞的小麥轉(zhuǎn)化并包括在基因轉(zhuǎn)運(yùn)前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊前，任何數(shù)量的胚(0.75-1mm長(zhǎng))被置于有3％蔗糖(Murashiga &Skoog,Physiologia Plantarum 15:473-497(1962))以及3mg/l2,4-D的MS培養(yǎng)基上用于誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，其在黑暗中進(jìn)行。在被選擇轟擊的那一天，胚被從誘導(dǎo)培養(yǎng)基上移走并放置滲壓劑上(帶有被加至所需濃度的蔗糖或麥芽糖，典型地為15％的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)。胚被允許質(zhì)壁分離2-3h并被轟擊。典型的每個(gè)目的平皿20個(gè)胚，但不是關(guān)鍵。一個(gè)適宜的攜帶基因的質(zhì)粒(例如pCIB3064或pSG35)利用常規(guī)的方法被沉淀到微米大小的金顆粒。每個(gè)胚平皿用DuPontBiolisticshelium設(shè)備在1000 psi的突發(fā)壓下利用標(biāo)準(zhǔn)80目的篩來(lái)射擊。在轟擊后，胚被放回到黑暗中恢復(fù)24小時(shí)(仍在滲透劑上)。24小時(shí)后，胚從滲透劑上移走并被放回到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并在再生前培養(yǎng)大約1個(gè)月。大約1個(gè)月后，具有發(fā)育的胚發(fā)生的愈傷組織的胚外植體被轉(zhuǎn)化到再生培養(yǎng)基(MS+1mg/升NAA，5mg/升GA)，另外含有適宜的選擇劑0(在pCIB3064情況下為10mg/l basta，在pSOG35情況下為2mg/I甲氨蝶呤)。大約1個(gè)月后，發(fā)育的芽被轉(zhuǎn)移到較大的無(wú)菌容器其含有半量MS,2％蔗糖，以及相同濃度的選擇劑。
利用土壤桿菌的單子葉植物轉(zhuǎn)化也被描述。參見(jiàn)WO 94/00977和U.S.專利No.5,591,616，此二者引入作為參考。
3．質(zhì)體的轉(zhuǎn)化Nicotiana tabacurn c.v.‘Xanthi nc’的種子在一個(gè)T瓊脂培養(yǎng)基上1”環(huán)狀排列每皿中有7個(gè)發(fā)芽且在播種12-14天后用包被有來(lái)自質(zhì)粒pPH143和PPHI45的DNA的1μm鎢粒子(M10,Biorad,Hercules,CA)轟擊，基本上如下所述(Svab,Z.和Maliga,P.(1993)PNAS 90,913-917)。被轟擊的種子培養(yǎng)在T培養(yǎng)基上兩天后，葉子被切割并將遠(yuǎn)軸側(cè)朝上于亮光(350-500 pmol光子/m2/s)中于含有500μg/ml的大觀霉素二鹽酸鹽(Sigma,St.Louis,MO)的RMOP培養(yǎng)基上。在轟擊3到8周后，有脫色葉的下面出現(xiàn)的抗性芽被亞克隆到相同的選擇性培養(yǎng)基上，允許形成愈合組織，且繼發(fā)的芽被分離和亞克隆。在獨(dú)立亞克隆中的轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組拷貝的完全分離通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡技術(shù)被評(píng)估(Sambrook等.，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory，冷泉港)。BamH/EcoRl-消化的總細(xì)胞DNA(Mettler,I.J.(1987)Plant Mol BiolReporter 5,346-349)在1％Tris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠上被分離，被轉(zhuǎn)到尼龍薄膜上(Amersham)并用對(duì)應(yīng)于來(lái)自含有部分rps7/12質(zhì)體靶序列的pC8的0.7 kb BamHⅠ/HindⅢ DNA片段的32p標(biāo)記的隨機(jī)引物DNA序列探測(cè)。同質(zhì)芽在含有大觀霉素的MS/IBA培養(yǎng)基上無(wú)菌生根(McBride,K.E.等人.(1994)PNAS 91,7301-7305)并被轉(zhuǎn)移到溫室中。
E．育種和種子生產(chǎn)實(shí)施例26育種通過(guò)用本發(fā)明的核酸序列轉(zhuǎn)化獲得的植物可為任意種類(lèi)的植物品種，包括單子葉植物和雙子葉植物；然而，用于本發(fā)明方法的植物優(yōu)選的選自農(nóng)業(yè)上重要的如上文所述的目的作物。本發(fā)明的基因的表達(dá)與其它重要的產(chǎn)量和品質(zhì)特性可通過(guò)育種被合并到植物品系。育種的方法和技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)，例如，Welsh J.R.，植物遺傳和育種基礎(chǔ)，John Wiley & Sons,NY(1981)；農(nóng)作物育種，Wood D.R.(Ed.)American Society of Agronomy Madison,Wisconsin(1983)；Mayo O.,植物育種原理，第二版，Clarendon出版社，Oxford(1987)；Singh,D.P.,用于抗疾病和抗害蟲(chóng)的育種，Springer-Verlag,NY(1986)；以及Wricke和Weber,Quantitative Genetics andSelection Plant Breeding,Walter de Gruyter以及Co.,Berlin(1986)。
被工程改造到上述轉(zhuǎn)基因種子和植物中的遺傳特性通過(guò)有性繁殖或無(wú)性生長(zhǎng)被給藥且因此在后代植物植物中保持和傳播。通常所說(shuō)的保持和傳播利用了已知的被改進(jìn)以適用特定目的的農(nóng)業(yè)方法，例如耕種，播種，或收割。特別的方法例如溶液培養(yǎng)或溫室技術(shù)也可被應(yīng)用。由于正在成長(zhǎng)的作物容易被害蟲(chóng)攻擊和損害同樣也受雜草競(jìng)爭(zhēng)的影響，一些如防治雜草，植物疾病，昆蟲(chóng)，線蟲(chóng)以及其它不利條件的措施被采用來(lái)提高產(chǎn)量。這些包括機(jī)械的方法例如土壤的耕作或去雜草和被感染的植物，同樣也包括農(nóng)用化學(xué)藥品例如除草劑，殺菌劑，殺配子劑，殺線蟲(chóng)劑，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，催熟劑以及殺蟲(chóng)劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物和種子的有利遺傳特性的用途可進(jìn)一步被用于植物育種上，其目的在于培育改良特性的植物，例如害蟲(chóng)耐性與除草劑耐性，或逆境耐性，改良的營(yíng)養(yǎng)值，增加的產(chǎn)量，引起減少由于寄生或脫落引起損失的改良結(jié)構(gòu)。不同的育種步驟通過(guò)明確的人類(lèi)干預(yù)被表征，例如篩選用于雜交的品系，引導(dǎo)親本系的授粉，或篩選適當(dāng)?shù)淖哟仓?。依賴于所期望的特性，采取了不同的育種措施。相關(guān)的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的且包括但不限于雜交，近交，回交育種，多線育種，品種混交，種間雜交，非整倍體技術(shù)等等。雜交技術(shù)也包括通過(guò)機(jī)械的，化學(xué)的，或生物化學(xué)的方式不育化植物產(chǎn)生雄性或雌性不育植物。雄性不育植株與不同品系的花粉間的交叉授粉確保雄性不育但雌性保育植株的基因組將始終如一地獲得兩個(gè)親本品系的特性。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和植物可被用于改良的植物品系的育種，例如，增加傳統(tǒng)方法例如除草劑或殺蟲(chóng)劑處理的有效性或由于它們的被修飾的遺傳特性而可以省去所說(shuō)的方法?？蛇x擇地，帶有改良的應(yīng)力耐性的新作物可被獲得，其取決于它們被優(yōu)化的遺傳“設(shè)備”，與不能耐受類(lèi)似的不良發(fā)育條件的產(chǎn)品相比產(chǎn)生了較好品質(zhì)的收獲產(chǎn)品。
實(shí)施例27種子的生產(chǎn)在種子的生產(chǎn)中，發(fā)芽質(zhì)量及種子的均一性是重要的產(chǎn)品特性，然而農(nóng)民所收獲的以及出售的種子的發(fā)芽質(zhì)量及種子的均一性是不重要的。由于保持一種作物不受其它的作物和雜草種子的影響，防治種傳病，以及生產(chǎn)帶有優(yōu)良發(fā)芽的種子是很困難的，相當(dāng)廣泛和明確的種子生產(chǎn)操作已被種子生產(chǎn)商改進(jìn)，其中生產(chǎn)商在純種子的生長(zhǎng)，調(diào)理，以及銷(xiāo)售方面是富有經(jīng)驗(yàn)的。因此，使用購(gòu)買(mǎi)的符合特定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的種子代替使用自己收獲的種子對(duì)農(nóng)民來(lái)說(shuō)是共有的經(jīng)驗(yàn)。被用作種子的繁殖物質(zhì)通常用含有除草劑，殺蟲(chóng)劑，殺真菌劑，殺菌劑，殺線蟲(chóng)劑，滅螺劑，或其混合物的保護(hù)劑包衣處理。通常，所用的保護(hù)劑包衣含有化合物例如克菌丹，萎銹靈，福美雙(TMTD)，methalaxyl(Apron)，以及甲基蟲(chóng)螨磷(ActelIic)。如需要，這些化合物與其它的通常用于配制領(lǐng)域的載體，表面活性劑或促進(jìn)應(yīng)用的助劑一起配制來(lái)提供抗細(xì)菌，真菌或動(dòng)物害蟲(chóng)引起的損害的保護(hù)。保護(hù)劑包衣可通過(guò)用液態(tài)制劑浸滲繁殖物質(zhì)或通過(guò)用聯(lián)合的濕或干制劑包被被應(yīng)用。其它應(yīng)用的方法例如直接處理芽或果實(shí)也是合適的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是通過(guò)新的農(nóng)業(yè)方法，例如上述實(shí)施例的方法，其特征在于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因植物材料，或轉(zhuǎn)基因種子的應(yīng)用。
種子可以以由合適的包裝材料組成的袋子，器皿或容器中的形式提供，該袋子和容器能夠被密封來(lái)包含種子。袋子，器皿或容器可被設(shè)計(jì)用于種子的短期或長(zhǎng)期或短期和長(zhǎng)期的儲(chǔ)藏。合適的包裝材料的實(shí)例包括紙，例如牛皮紙，硬或軟的塑料或其它的聚合材料，玻璃或金屬。理想的袋子，器皿或容器由相同的或不同類(lèi)型的多層的包裝材料構(gòu)成。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供袋子，器皿或容器從而排除或限制水以及濕氣接觸種子。在一個(gè)實(shí)施例中，袋子，器皿或容器被密封，例如熱封，來(lái)阻止水分或濕氣進(jìn)入。在另一個(gè)實(shí)施例中，水吸收物質(zhì)被置于包裝材料層間或與包裝材料層相鄰。在另一個(gè)實(shí)施例中，袋子，器皿或容器，或其構(gòu)成它的包裝材料被處理來(lái)限制，抑制或阻止疾病，污染或其它的對(duì)種子儲(chǔ)藏和運(yùn)輸不良的影響。這種處理的一個(gè)實(shí)施例是滅菌，例如通過(guò)化學(xué)方式或通過(guò)暴露于射線中。本發(fā)明包含是一個(gè)商用袋子，其含有在所述轉(zhuǎn)化植物中以比野生型植物中的更高水平表達(dá)的本發(fā)明的基因的轉(zhuǎn)基因植物的種子，和一個(gè)合適的載體，以及賦予植物廣譜疾病抗性的標(biāo)簽說(shuō)明書(shū)。
上述公開(kāi)的實(shí)施例是舉例說(shuō)明。本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容將使本領(lǐng)域的技術(shù)人員擁有許多本發(fā)明的變化形式。因此，所有的這些明顯的和可預(yù)見(jiàn)的變化被包含在附加的權(quán)利要求的范圍中。
序列表<110>Novartis AG<120>來(lái)自嗜線蟲(chóng)致病桿菌的新型殺蟲(chóng)毒素及其編碼核酸<130>30472/A/CGC1992<140><141><160>15<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2978<212>DNA<213>嗜線蟲(chóng)致病桿菌<220><221>CDS<222>(569)..(976)<223>orf1<220><221>CDS<222>(1045)..(2331)<223>JHE-樣orf2<220><223>pCIB9369<400>1atcgatgtga cggcagagta tttttattcc tgtaaactga cgacaatgca tttctaagat 60atcaatataa taatgataaa tttattgatc atatatctgt tatattttga ttgaaaatta 120ttgaatatac ctcttgtact aaattcatta catttttttt actttaaaca acattaaatt 180cacacataat acagcttaaa tataacatgt gatatatatt atgattataa aaaacattaa 240aataaataat acgccacata tattaacaat atctaattac tgatgatact attttctgag 300tatatataaa tcttaaagaa aataattatt ttttatattt cacatcaatt taaaatctgc 360ttagaatgcc ccccggcatc acaagaaaac aaaatcattc aagtaataca atagagttaa 420atttaaaaat aacatgtata acaaaataca tagacaatta tacatgtaaa tgacagacaa 480ctgacaaaac atagcaaaaa aacgccttaa atattaaggt atcaaaacaa tatatcagac 540tatcttaaat ctaataggag aatccctc atg att aca ata cat atc agt ggt592Met Ile Thr Ile His Ile Ser Gly1 5ggt agt gta aca att aat aac aat ata gta aca gaa act gat gtc caa 640Gly Ser Val Thr Ile Asn Asn Asn Ile Val Thr Glu Thr Asp Val Gln10 15 20aat aca ccc gct tca gcg cct tta tca att act aat ttt agg gat atg 688Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu Ser Ile Thr Asn Phe Arg Asp Met25 30 35 40aca ata gaa cct cat tca tct gtt gag gcg ata aga acc gat aca ccg736Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro45 50 55att att cct gaa tca cga cca aat tac tat gtt gct aat tct ggc ccg784Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro60 65 70gcc tca tca gtc aga gct gtt ttc tat tgg tcc cac tct ttt aca tca832Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser75 80 85gaa tgg ttt gaa tct tcc tct att att gta aaa gca ggc gaa gac gga880Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly90 95 100gtc tta cat tca ccg ggt aat tct tta tat tac agc aag gtt gta att928Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile105 110 115 120tat aac gat aca gac aaa cgt gct ttt gtt acc ggc tac aat cta taa976Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu125 130 135taacgcagaa atacaatcca tatttccaat gaatttcaaa taacatcctt aaggcaagaa 1036acaaaatc atg aat aat gaa ccg atg aat act aat gaa tca caa gct tca 1086Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Ala Ser140 145 150gag ata gta ccc tca atg aat gaa tct ata tta gca gca cct tat tca1134Glu Ile Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser155 160 165att tct aca cct aat tat gaa tgg gat atg tca tca ata ata aaa gat1182Ile Ser Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp170 175 180gct att att ggt ggt ata ggc ttt att cct ggt ccg ggc tca gca ata1230Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile185 190 195tca ttt ttg tta ggg tta ttt tgg cca caa caa acc gac aat act tgg1278Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp200 205 210gag caa att ctc caa aaa gta gaa caa atg atc gag caa gcc aat ctc1326Glu Gln Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu215 220 225 230aaa act att caa gga ata ttg aac ggc gat ata caa gaa att aaa ggc1374Lys Thr Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly235 240 245aaa atg gaa cat gtg caa ttc atg cta gaa tcc tca cct ggc act caa1422Lys Met Glu His Val Gln Phe Met Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln250 255 260gaa agc cat gac gca tac atg ttt ctg gcg aga tat ctg gtc agt ata1470Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile265 270 275gac gaa aaa ttc aag tct ttt gat aac aaa aca aat tat caa att ctt1518Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu280 285 290ccc atg tat acc aat acg att atg tta caa gcc cct tat tgg aaa atg1566Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met295 300 305 310ggt ata gag aga aaa gat gag atc aaa cta aca gat ata gaa gtt aat1614Gly Ile Glu Arg Lys Asp Glu Ile Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn315 320 325gaa tta aaa gag ctg ata gga aaa tta tct acc agc gcc gat aaa tat1662Glu Leu Lys Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr330 335 340att cat gat gtc tat act cgt gaa tat gat aat gcg atg aac act tca1710Ile His Asp Val Tyr Thr Arg Glu Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser345 350 355aca gca gca aat atc acc aat aat tta tta tct gta aga ggc tat tgt1758Thr Ala Ala Asn Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys360 365 370tta tta cat ggt tta gaa tgt ctc gaa gtc att aac cat ata caa aat1806Leu Leu His Gly Leu Glu Cys Leu Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn375 380 385 390aat agc ctt gag caa agt ttt tat cct aaa act atc agc tac tcc acc1854Asn Ser Leu Glu Gln Ser Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr395 400 405gta ttc gat cgc cag aca aat aaa aca agg gtt caa gcc ctg aca gaa1902Val Phe Asp Arg Gln Thr Asn Lys Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu410 415 420gac gat caa atg caa gag cca ttc aag cct gct tta att aat ggg aag1950Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys425 430 435tac aac aaa ata aaa tca ttg att ggg tat gta caa aga atc gga aac1998Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Ile Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn440 445 450gca ccc aga gtt gga ggc att aaa gtc aca ttt gca aac gat gca tct2046Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser455 460 465 470tat acc ctc ggt aca gta act tca gaa gta aac tca att gaa ctg aat2094Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn475 480 485gac agc gtt ata acc agc ctg gaa gta tgg gga aat ggc gct att gat2142Asp Ser Val Ile Thr Ser Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Ile Asp490 495 500gag gca ttc ttt aca tta agt gac gga cgt caa ttt agg ctt ggc caa2190Glu Ala Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln505 510 515cgc tat gcc agt aac tat aga aaa tat gct gtc gat aac cac tat att2238Arg Tyr Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile520 525 530tca gga ttg tac tta gcc agt gat gaa cct tca ttg gca ggt caa gca2286Ser Gly Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala535 540 545 550gca ggc att gca gtt tca tac cat atg ata gct gat aaa aaa tca 2331Ala Gly Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser555 560 565tagtattaac aggcttctga tttcagacta agcaagtaag cggatcttca gagtcatata 2391gcatgctata tgactgaaga gttatccgct cctcactttt aactaaactc attacatcct 2451ccactaattt attcagcgat aaaaaacaca caatgaaaac caaacatttg tttgttattt 2511tcataaaaaa tgcaactctt tgtttaataa aaatttatcg cagtataaaa tattgccagt 2571tttatagact atattatatt ctcactttat ctatattttt agtttaaaat tcaagactaa 2631aatcacactt ttatgcaaaa tgttcacttt atataactta cgatcgtact ctcataatta 2691gaatcaaata tcaaaataat ctttactgtt tatcagacat gcaatacaac attaatacaa 2751aaaatagcta aggacatgat atgttgaaaa gggaaaatca gatattgcaa ctactgaagg 2811gcgatccttt catgcagcag caagaaatcg ctgatatcct tggaattagc cgctcgtgtg 2871ttgcaggaca tattatgaac ctaagcaaaa aaggatatat taaaggcaaa gggtatatct 2931tatctaatga tgtttatact gttacaattg gtgctgccaa tatcgat 2978<210>2<211>135<212>PRT<213>嗜線蟲(chóng)致病桿菌<400>2Met Ile Thr Ile His Ile Ser Gly Gly Ser Val Thr Ile Asn Asn Asn1 5 10 15Ile Val Thr Glu Thr Asp Val Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu20 25 30Ser Ile Thr Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val35 40 45Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn50 55 60Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe65 70 75 80Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile85 90 95Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser100 105 110Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala115 120 125Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu130 135<210>3<211>429<212>PRT<213>嗜線蟲(chóng)致病桿菌<400>3Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Ala Ser Glu Ile1 5 10 15Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser20 25 30Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile35 40 45Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe50 55 60Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln65 70 75 80Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr85 90 95Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met100 105 110Glu His Val Gln Phe Met Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser115 120 125His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu130 135 140Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met145 150 155 160Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile165 170 175Glu Arg Lys Asp Glu Ile Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu180 185 190Lys Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His195 200 205Asp Val Tyr Thr Arg Glu Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala210 215 220Ala Asn Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu225 230 235 240His Gly Leu Glu Cys Leu Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser245 250 255Leu Glu Gln Ser Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe260 265 270Asp Arg Gln Thr Asn Lys Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp275 280 285Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn290 295 300Lys Ile Lys Ser Leu Ile Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro305 310 315 320Arg Val Gly Gly Ile Lys Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr325 330 335Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser340 345 350Val Ile Thr Ser Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Ile Asp Glu Ala355 360 365Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr370 375 380Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly385 390 395 400Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly405 410 415Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser420 425<210>4<211>408<212>DNA<213>嗜線蟲(chóng)致病桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(405)<223>pCIB9381的orf1<400>4atg att aca atc aat atc act ggt gat aat gta aga gtt aat aac aat48Met Ile Thr Ile Asn Ile Thr Gly Asp Asn Val Arg Val Asn Asn Asn1 5 10 15ata gca aca gaa acc gac ctc caa aat aca cct gct tca gca ccc tta96Ile Ala Thr Glu Thr Asp Leu Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu20 25 30tca att att aat ttt agg gat atg aca ata gaa cct cat tca tct gtt144Ser Ile Ile Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val35 40 45gag gcg ata aga acc gat aca ccg att att cct gaa tca cga cca aat192Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn50 55 60tac tat gtt gct aat tct ggc ccg gcc tca tca gtc aga gct gtt ttc240Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe65 70 75 80tat tgg tcc cac tct ttt aca tca gaa tgg ttt gaa tct tcc tct att288Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile85 90 95att gta aaa gca ggc gaa gac gga gtc tta cat tca ccg ggt aat tct336Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser100 105 110tta tat tac agc aag gtt gLa att tat aac gat aca gac aaa cgt gct384Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala115 120 125ttt gtt acc ggc tac aat cta taa408Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu130 135<210>5<211>135<212>PRT<213>嗜線蟲(chóng)致病桿菌<400>5Met Ile Thr Ile Asn Ile Thr Gly Asp Asn Val Arg Val Asn Asn Asn1 5 10 15Ile Ala Thr Glu Thr Asp Leu Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu20 25 30Ser Ile Ile Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val35 40 45Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn50 55 60Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe65 70 75 80Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile85 90 95Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser100 105 110Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala115 120 125Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu130 135<210>6<211>1290<212>DNA<213>嗜線蟲(chóng)致病桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(1287)<223>pCIB9381的JHE一樣orf2<400>6atg aat aat gaa ccg atg aat act aat gaa tca caa gtt tca gag ata48Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Val Ser Glu Ile1 5 10 15gta ccc tca atg aat gaa tct ata tta gca gca cct tat tca att tct96Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser20 25 30aca cct aat tat gaa tgg gat atg tca tca ata ata aaa gat gcc att144Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile35 40 45att ggt ggt ata ggc ttt att cct ggt ccg ggc tca gca ata tca ttt192Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe50 55 60ttg tta ggg tta ttt tgg cca caa caa acc gac aat act tgg gag caa240Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln65 70 75 80att ctc caa aaa gta gaa caa atg atc gag caa gcc aat ctc aaa act288Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr85 90 95att caa gga ata ttg aac ggc gat ata caa gaa att aaa ggc aaa atg336Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met100 105 110gaa cat gtg caa ttc atg cta gaa tcc tca cct ggc act caa gaa agc384Glu His Val Gln Phe Met Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser115 120 125cat gac gca tac atg ttt ctg gcg aga tat ctg gtc agt ata gac gaa432His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu130 135 140aaa ttc aag tct ttt gat aac aaa aca aat tat caa att ctt ccc atg480Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met145 150 155 160tat acc aat acg att atg tta caa gcc cct tat tgg aaa atg ggt ata528Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile165 170 175gag aga aaa gat gag ata aaa cta aca gat ata gaa gtt aat gaa tta576Glu Arg Lys Asp Glu Ile Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu180 185 190aaa gag ctg ata gga aaa tta tct acc agc gcc gat aaa tat att cat624Lys Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His195 200 205gat gtc tat act cgt gaa tat gat aat gcg atg aac act tca aca gca672Asp Val Tyr Thr Arg Glu Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala210 215 220gca aat atc acc aat aat tta tta tct gta aga ggc tat tgt tta tta720Ala Asn Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu225 230 235 240cat ggt tta gaa tgt ctc gaa gtc att aac cat ata caa aat aat agc768His Gly Leu Glu Cys Leu Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser245 250 255ctt gag caa agt ttt tat cct aaa act atc agc tac tcc acc gta ttc816Leu Glu Gln Ser Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe260 265 270gat cgc cag aca aat aaa aca agg gtt caa gcc ctg aca gaa gac gat864Asp Arg Gln Thr Asn Lys Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp275 280 285caa atg caa gag cca ttc aag cct gct tta att aat ggg aag tac aac912Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn290 295 300aaa ata aaa tca ttg att ggg tat gta caa aga atc gga aac gca ccc960Lys Ile Lys Ser Leu Ile Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro305 310 315 320aga gtt gga ggc att aaa gtc aca ttt gca aac gat gca tct tat acc1008Arg Val Gly Gly Ile Lys Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr325 330 335ctc ggt aca gta act tca gaa gta aac tca att gaa ctg aat gac agc1056Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser340 345 350gtt ata acc agc ctg gaa gta tgg gga aat ggc gct gtt gat gag gca1104Val Ile Thr Set Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala355 360 365ttc ttt aca tta agt gac gga cgt caa ttt agg ctt ggc caa cgc tat1152Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr370 375 380gcc agt aac tat aga aaa tat gct gtc gat aac cac tat att tca gga1200Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly385 390 395 400ttg tac tta gcc agt gat gaa cct tca ttg gca ggt caa gca gca ggc1248Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly405 410 415att gca gtt tca tac cat atg ata gct gat aaa aaa tca tag1290Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser420 425<210>7<211>429<212>PRT<213>嗜線蟲(chóng)致病桿菌<400>7Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Val Ser Glu Ile1 5 10 15Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser20 25 30Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile35 40 45Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe50 55 60Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln65 70 75 80Ile Leu Gln Lys Val Glu Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr85 90 95Ile Gln Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met100 105 110Glu His Val Gln Phe Met Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser115 120 125His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu130 135 140Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met145 150 155 160Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile165 170 175Glu Arg Lys Asp Glu Ile Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu180 185 190Lys Glu Leu Ile Gly Lys Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His195 200 205Asp Val Tyr Thr Arg Glu Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala210 215 220Ala Asn Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu225 230 235 240His Gly Leu Glu Cys Leu Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser245 250 255Leu Glu Gln Ser Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe260 265 270Asp Arg Gln Thr Asn Lys Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp275 280 285Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn290 295 300Lys Ile Lys Ser Leu Ile Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro305 310 315 320Arg Val Gly Gly Ile Lys Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr325 330 335Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser340 345 350Val Ile Thr Ser Leu Glu Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala355 360 365Phe Phe Thr Leu Ser Asp Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr370 375 380Ala Ser Asn Tyr Arg Lys Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly385 390 395 400Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly405 410 415Ile Ala Val Ser Tyr His Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser420 425<210>8<211>408<212>DNA<213>波氏致病桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(405)<223>pCIB9354的orf1<400>8atg atc aca atc aat atc agt ggt ggt aat gta aca att aat aac aat48Met Ile Thr Ile Asn Ile Ser Gly Gly Asn Val Thr Ile Asn Asn Asn1 5 10 15atc agt tca gta acg gat atc caa aaa ccc ctt gat gca gaa ccc ctc96Ile Ser Ser Val Thr Asp Ile Gln Lys Pro Leu Asp Ala Glu Pro Leu20 25 30tca gtc acg aat tat aga gat ctg aca ata gag ccg cac tca tct att144Ser Val Thr Asn Tyr Arg Asp Leu Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Ile35 40 45caa gca gac aga acg gac acc ccc att att cct gaa aca cgc cct gat192Gln Ala Asp Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Thr Arg Pro Asp50 55 60tat tat atc gct aac tca ggc cct gct tca tca gtc aaa gct gtg ttt240Tyr Tyr Ile Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Lys Ala Val Phe65 70 75 80tat tgg tcg cat tcg ttt aca tcg gaa tgg ttc gag tat tca tct atc288Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Tyr Ser Ser Ile85 90 95acg gta aaa gca gga gaa gat gga ata tta aaa tca ccg agt aat gct336Thr Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Ile Leu Lys Ser Pro Ser Asn Ala100 105 110gta tat tac agt aaa gta gtc att tat aat gat aca gat aag cgg gct384Val Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala115 120 125ttt gtg act gga tat aac atg taa408Phe Val Thr Gly Tyr Asn Met130 135<210>9<211>135<212>PRT<213>波氏致病桿菌<400>9Met Ile Thr Ile Asn Ile Ser Gly Gly Asn Val Thr Ile Asn Asn Asn1 5 10 15Ile Ser Ser Val Thr Asp Ile Gln Lys Pro Leu Asp Ala Glu Pro Leu20 25 30Ser Val Thr Asn Tyr Arg Asp Leu Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Ile35 40 45Gln Ala Asp Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Thr Arg Pro Asp50 55 60Tyr Tyr Ile Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Lys Ala Val Phe65 70 75 80Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Tyr Ser Ser Ile85 90 95Thr Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Ile Leu Lys Ser Pro Ser Asn Ala100 105 110Val Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala115 120 125Phe Val Thr Gly Tyr Asn Met130 135<210>10<211>1056<212>DNA<213>波氏致病桿菌<220><221>CDS<222>(1)..(1053)<223>pCIB9354的JHE-樣orf2<400>10atg aat aat agt cca atg aat gat cag tta tca aca gcg cct tat tca48Met Asn Asn Ser Pro Met Asn Asp Gln Leu Ser Thr Ala Pro Tyr Ser1 5 10 15att tcg aca ccc aat tat gaa tgg gat atg tca tca atc ata aaa gat96Ile Ser Thr Pro Asn Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp20 25 30gcc att atc ggt ggc ata gga ttt att ccc gga cca ggc cct gca atc144Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Pro Ala Ile35 40 45tct ttt tta tta gga ctg ttc tgg cca caa cag aca gac aat acc tgg192Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp50 55 60gat caa atc ctc caa aaa atc gaa caa atg ata gaa gaa gcg aat tta240Asp Gln Ile Leu Gln Lys Ile Glu Gln Met Ile Glu Glu Ala Asn Leu65 70 75 80aaa acc att aaa ggt ata tta aat gga gat ata caa gaa att aaa gga288Lys Thr Ile Lys Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly85 90 95aaa atg gac cat gtg aaa tct atg cta gag aat tct cct ggc agc cag336Lys Met Asp His Val Lys Ser Met Leu Glu Asn Ser Pro Gly Ser Gln100 105 110gaa agc cat gat gct tat atg ttt ctg gca agg ttt ttg gtc agt att384Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Phe Leu Val Ser Ile115 120 125gat gaa aaa ttc aaa tct ttc gat gat aga aca aat tat caa att ctt432Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asp Arg Thr Asn Tyr Gln Ile Leu130 135 140ccc atg tac acg aat aca att atg tta caa gcg cct tat tgg aaa atg480Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met145 150 155 160ggc atc gaa aag aaa gag gat atc ggt tta acc gat att gaa gtt ggt528Gly Ile Glu Lys Lys Glu Asp Ile Gly Leu Thr Asp Ile Glu Val Gly165 170 175gaa tta aaa gaa ctt atc gat aaa tta tat act aaa tca tat gat tat576Glu Leu Lys Glu Leu Ile Asp Lys Leu Tyr Thr Lys Ser Tyr Asp Tyr180 185 190atc aat aat acg tat aat cgt gaa tat aat aat gca atc aat acg tca624Ile Asn Asn Thr Tyr Asn Arg Glu Tyr Asn Asn Ala Ile Asn Thr Ser195 200 205acc gca gag agt atc acc aat aat tta ttg tct gtc aga gga tat tgt672Thr Ala Glu Ser Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys210 215 220tta tta cat ggt tgt gaa tgc ctt gaa gtt att gcg cat ata caa aac720Leu Leu His Gly Cys Glu Cys Leu Glu Val Ile Ala His Ile Gln Asn225 230 235 240aat agt ctt gat aaa ggc ttc tac cct aaa acg atc agc tat tcg agt768Asn Ser Leu Asp Lys Gly Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Ser245 250 255gtt ttc gat cgt cct aca aac aaa atg aga att cag gcg ctt aca gaa816Val Phe Asp Arg Pro Thr Asn Lys Met Arg Ile Gln Ala Leu Thr Glu260 265 270gat gac caa atg caa gaa ccg ttc aaa cct tct ttc gtc aat ggt caa864Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ser Phe Val Asn Gly Gln275 280 285tat aat aaa ata aaa tca ttg gag ggt tat gtc aca agg atc ggc aat912Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Glu Gly Tyr Val Thr Arg Ile Gly Asn290 295 300gcc ccc cga gtc ggc gga att aaa atc aca ttt gaa aac aac gca tct960Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys Ile Thr Phe Glu Asn Asn Ala Ser305 310 315 320tat act ctt ggc act gta act tca gaa aca acc tct att gaa ctc aat1008Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Thr Thr Ser Ile Glu Leu Asn325 330 335gag agt gtt ata acc agc ata gaa gtg tgg gga gag tgg tgc cgt tga1056Glu Ser Val Ile Thr Ser Ile Glu Val Trp Gly Glu Trp Cys Arg340 345 350<210>11<211>351<212>PRT<213>波氏致病桿菌<400>11Met Asn Asn Ser Pro Met Asn Asp Gln Leu Ser Thr Ala Pro Tyr Ser1 5 10 15Ile Ser Thr Pro Ash Tyr Glu Trp Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp20 25 30Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe Ile Pro Gly Pro Gly Pro Ala Ile35 40 45Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp50 55 60Asp Gln Ile Leu Gln Lys Ile Glu Gln Met Ile Glu Glu Ala Asn Leu65 70 75 80Lys Thr Ile Lys Gly Ile Leu Asn Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly85 90 95Lys Met Asp His Val Lys Ser Met Leu Glu Asn Ser Pro Gly Ser Gln100 105 110Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe Leu Ala Arg Phe Leu Val Ser Ile115 120 125Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp Asp Arg Thr Asn Tyr Gln Ile Leu130 135 140Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met145 150 155 160Gly Ile Glu Lys Lys Glu Asp Ile Gly Leu Thr Asp Ile Glu Val Gly165 170 175Glu Leu Lys Glu Leu Ile Asp Lys Leu Tyr Thr Lys Ser Tyr Asp Tyr180 185 190Ile Asn Asn Thr Tyr Asn Arg Glu Tyr Asn Asn Ala Ile Asn Thr Ser195 200 205Thr Ala Glu Ser Ile Thr Asn Asn Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys210 215 220Leu Leu His Gly Cys Glu Cys Leu Glu Val Ile Ala His Ile Gln Asn225 230 235 240Asn Ser Leu Asp Lys Gly Phe Tyr Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Ser245 250 255Val Phe Asp Arg Pro Thr Asn Lys Met Arg Ile Gln Ala Leu Thr Glu260 265 270Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe Lys Pro Ser Phe Val Asn Gly Gln275 280 285Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Glu Gly Tyr Val Thr Arg Ile Gly Asn290 295 300Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys Ile Thr Phe Glu Asn Asn Ala Ser305 310 315 320Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser Glu Thr Thr Ser Ile Glu Leu Asn325 330 335Glu Ser Val Ile Thr Ser Ile Glu Val Trp Gly Glu Trp Cys Arg340 345 350<210>12<211>408<212>DNA<213>發(fā)光光桿狀菌<220><221>CDS<222>(1)..(405)<223>pCIB9383-21的orf1<400>12atg att aca atc aat atc act ggt gat aat gta aga gtt aat aac aat48Met Ile Thr Ile Asn Ile Thr Gly Asp Asn Val Arg Val Asn Asn Asn1 5 10 15ata gca aca gaa acc gac ctc caa aat aca cct gct tca gca ccc tta96Ile Ala Thr Glu Thr Asp Leu Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu20 25 30tca att att aat ttt agg gat atg aca ata gaa cct cat tca tct gtt144Ser Ile Ile Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val
35 40 45gag gcg ata aga acc gat aca ccg att att cct gaa tca cga cca aat192Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn50 55 60tac tat gtt gct aat tct ggc ccg gcc tca tca gtc aga gct gtt ttc240Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe65 70 75 80tat tgg tcc cac tct ttt aca tca gaa tgg ttt gaa tct tcc tct att288Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile85 90 95att gta aaa gca ggc gaa gac gga gtc tta cat tca ccg ggt aat tct336Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser100 105 110tta tat tac agc aag gtt gta att tat aac gat aca gac aaa cgt gct384Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala115 120 125ttt gtt acc ggc tac aat cta taa408Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu130 135<210>13<211>135<212>PRT<213>發(fā)光光桿狀菌<400>13Met Ile Thr Ile Asn Ile Thr Gly Asp Asn Val Arg Val Asn Asn Asn1 5 10 15Ile Ala Thr Glu Thr Asp Leu Gln Asn Thr Pro Ala Ser Ala Pro Leu20 25 30Ser Ile Ile Asn Phe Arg Asp Met Thr Ile Glu Pro His Ser Ser Val35 40 45Glu Ala Ile Arg Thr Asp Thr Pro Ile Ile Pro Glu Ser Arg Pro Asn50 55 60Tyr Tyr Val Ala Asn Ser Gly Pro Ala Ser Ser Val Arg Ala Val Phe65 70 75 80Tyr Trp Ser His Ser Phe Thr Ser Glu Trp Phe Glu Ser Ser Ser Ile85 90 95Ile Val Lys Ala Gly Glu Asp Gly Val Leu His Ser Pro Gly Asn Ser100 105 110Leu Tyr Tyr Ser Lys Val Val Ile Tyr Asn Asp Thr Asp Lys Arg Ala115 120 125Phe Val Thr Gly Tyr Asn Leu130 135<210>14<211>1320<212>DNA<213>發(fā)光光桿狀菌<220><221>CDS<222>(1)..(1317)<223>pCIB9383-21的JHE-樣orf2<400>14atg aat aat gaa ccg atg aat act aat gaa tca caa gct tca gag ata48Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Ala Ser Glu Ile1 5 10 15gta ccc tca atg aat gaa tct ata tta aat gaa tct ata tta aat gaa96Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu20 25 30tct ata tta gca gca cct tat tca att tct aca cct aat tat gaa tgg144Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser Thr Pro Asn Tyr Glu Trp35 40 45gat atg tca tca ata ata aaa gat gcc att att ggt ggt ata ggc ttt192Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe50 55 60att cct ggt ccg ggc tca gca ata tca ttt ttg tta ggg tta ttt tgg240Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp65 70 75 80cca caa caa acc gac aat act tgg gag caa att ctc caa aaa gta gaa288Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln Ile Leu Gln Lys Val Glu85 90 95caa atg atc gag caa gcc aat ctc aaa act att caa gga ata ttg aac336Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr Ile Gln Gly Ile Leu Asn100 105 110ggc gat ata caa gaa att aaa ggc aaa atg gaa cat gtg caa ttc atg384Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met Glu His Val Gln Phe Met115 120 125cta gaa tcc tca cct ggc act caa gaa agc cat gac gca tac atg ttt432Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe130 135 140ctg gcg aga tat ctg gtc agt ata gac gaa aaa ttc aag tct ttt gat480Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp145 150 155 160aac aaa aca aat tat caa att ctt ccc atg tat acc aat acg att atg528Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met165 170 175tta caa gcc cct tat tgg aaa atg ggt ata gag aga aaa gat gag ata576Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile Glu Arg Lys Asp Glu Ile180 185 190aaa cta aca gat ata gaa gtt aat gaa tta aaa gag ctg ata gga aaa624Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu Lys Glu Leu Ile Gly Lys195 200 205tta tct acc agc gcc gat aaa tat att cat gat gtc tat act cgt gaa672Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His Asp Val Tyr Thr Arg Glu210 215 220tat gat aat gcg atg aac act tca aca gca gca aat atc acc aat aat720Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala Ala Asn Ile Thr Asn Asn225 230 235 240tta tta tct gta aga ggc tat tgt tta tta cat ggt tta gaa tgt ctc768Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu His Gly Leu Glu Cys Leu245 250 255gaa gtc att aac cat ata caa aat aat agc ctt gag caa agt ttt tat816Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser Leu Glu Gln Ser Phe Tyr260 265 270cct aaa act atc agc tac tcc acc gta ttc gat cgc cag aca aat aaa864Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe Asp Arg Gln Thr Asn Lys275 280 285aca agg gtt caa gcc ctg aca gaa gac gat caa atg caa gag cca ttc912Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe290 295 300aag cct gct tta att aat ggg aag tac aac aaa ata aaa tca ttg att960Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Ile305 310 315 320ggg tat gta caa aga atc gga aac gca ccc aga gtt gga ggc att aaa1008Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys325 330 335gtc aca ttt gca aac gat gca tct tat acc ctc ggt aca gta act tca1056Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser340 345 350gaa gta aac tca att gaa ctg aat gac agc gtt ata acc agc ctg gaa1104Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser Val Ile Thr Ser Leu Glu355 360 365gta tgg gga aat ggc gct gtt gat gag gca ttc ttt aca tta agt gac1152Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala Phe Phe Thr Leu Ser Asp370 375 380gga cgt caa ttt agg ctt ggc caa cgc tat gcc agt aac tat aga aaa1200Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr Ala Ser Asn Tyr Arg Lys385 390 395 400tat gct gtc gat aac cac tat att tca gga ttg tac tta gcc agt gat1248Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Ala Ser Asp405 410 415gaa cct tca ttg gca ggt caa gca gca ggc att gca gtt tca tac cat1296Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly Ile Ala Val Ser Tyr His420 425 430atg ata gct gat aaa aaa tca tag1320Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser435<210>15<211>439<212>PRT<213>發(fā)光光桿狀菌<400>15Met Asn Asn Glu Pro Met Asn Thr Asn Glu Ser Gln Ala Ser Glu Ile1 5 10 15Val Pro Ser Met Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Leu Asn Glu
20 25 30Ser Ile Leu Ala Ala Pro Tyr Ser Ile Ser Thr Pro Asn Tyr Glu Trp35 40 45Asp Met Ser Ser Ile Ile Lys Asp Ala Ile Ile Gly Gly Ile Gly Phe50 55 60Ile Pro Gly Pro Gly Ser Ala Ile Ser Phe Leu Leu Gly Leu Phe Trp65 70 75 80Pro Gln Gln Thr Asp Asn Thr Trp Glu Gln Ile Leu Gln Lys Val Glu85 90 95Gln Met Ile Glu Gln Ala Asn Leu Lys Thr Ile Gln Gly Ile Leu Asn100 105 110Gly Asp Ile Gln Glu Ile Lys Gly Lys Met Glu His Val Gln Phe Met115 120 125Leu Glu Ser Ser Pro Gly Thr Gln Glu Ser His Asp Ala Tyr Met Phe130 135 140Leu Ala Arg Tyr Leu Val Ser Ile Asp Glu Lys Phe Lys Ser Phe Asp145 150 155 160Asn Lys Thr Asn Tyr Gln Ile Leu Pro Met Tyr Thr Asn Thr Ile Met165 170 175Leu Gln Ala Pro Tyr Trp Lys Met Gly Ile Glu Arg Lys Asp Glu Ile180 185 190Lys Leu Thr Asp Ile Glu Val Asn Glu Leu Lys Glu Leu Ile Gly Lys195 200 205Leu Ser Thr Ser Ala Asp Lys Tyr Ile His Asp Val Tyr Thr Arg Glu210 215 220Tyr Asp Asn Ala Met Asn Thr Ser Thr Ala Ala Asn Ile Thr Asn Asn225 230 235 240Leu Leu Ser Val Arg Gly Tyr Cys Leu Leu His Gly Leu Glu Cys Leu245 250 255Glu Val Ile Asn His Ile Gln Asn Asn Ser Leu Glu Gln Ser Phe Tyr260 265 270Pro Lys Thr Ile Ser Tyr Ser Thr Val Phe Asp Arg Gln Thr Asn Lys275 280 285Thr Arg Val Gln Ala Leu Thr Glu Asp Asp Gln Met Gln Glu Pro Phe290 295 300Lys Pro Ala Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Leu Ile305 310 315 320Gly Tyr Val Gln Arg Ile Gly Asn Ala Pro Arg Val Gly Gly Ile Lys325 330 335Val Thr Phe Ala Asn Asp Ala Ser Tyr Thr Leu Gly Thr Val Thr Ser340 345 350Glu Val Asn Ser Ile Glu Leu Asn Asp Ser Val Ile Thr Ser Leu Glu355 360 365Val Trp Gly Asn Gly Ala Val Asp Glu Ala Phe Phe Thr Leu Ser Asp370 375 380Gly Arg Gln Phe Arg Leu Gly Gln Arg Tyr Ala Ser Asn Tyr Arg Lys385 390 395 400Tyr Ala Val Asp Asn His Tyr Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Ala Ser Asp405 410 415Glu Pro Ser Leu Ala Gly Gln Ala Ala Gly Ile Ala Val Ser Tyr His420 425 430Met Ile Ala Asp Lys Lys Ser43權(quán)利要求
1．一種分離的核酸分子，包括(a)一種基本上相似于選自下列的核苷酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,以及SEQ ID NO:14；或(b)與(a)的核苷酸序列同類(lèi)編碼的核苷酸序列；其中所述核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生至少一種有抗昆蟲(chóng)活性的毒素。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的核苷酸序列與基本上相似于SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQID NO:10,SEQ ID NO:12,或SEQ ID NO:14的核苷酸序列同類(lèi)編碼。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的核苷酸序列基本上相似于SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQID NO:10,SEQ ID NO:12,或SEQ ID NO:14。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的核苷酸序列編碼選自SEQ ID NO:2,3,5,7,9,11,13,和15的氨基酸序列。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,或SEQ ID NO:14。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的核苷酸序列基本上相似于SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO:4,SEQID NO:8,或SEQ ID NO:12。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:9,或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的核苷酸序列基本上相似于SEQ ID NO:1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:6,SEQID NO:10,或SEQ ID NO:14。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO11,和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的核苷酸序列含有包含在pCIB9369(NRRL B-21883)中的大約3.0 kb DNA片段。
11．根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離核酸分子，其中所述的毒素具有抗小菜蛾活性。
12．一種分離的核酸分子，含有在序列上等同于選自下列的核苷酸序列的連續(xù)的20個(gè)堿基對(duì)核苷酸部分的20個(gè)堿基對(duì)核苷酸部分SEQ ID NO:1的核苷酸569-979,SEQ ID NO1的核苷酸1045-2334,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,和SEQ ID NO:14,其中所述核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生至少一種有抗昆蟲(chóng)活性的毒素。
13．一個(gè)嵌合基因，含有有效地連接到權(quán)利要求1或權(quán)利要求12的核酸分子上的異源啟動(dòng)子序列。
14．一種含有權(quán)利要求13的嵌合基因的重組載體。
15．一種含有權(quán)利要求13的嵌合基因的宿主細(xì)胞。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其為細(xì)菌細(xì)胞。
17．根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其為酵母細(xì)胞。
18．根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其為植物細(xì)胞。
19．一種含有權(quán)利要求18的植物細(xì)胞的植物。
20．根據(jù)權(quán)利要求18的植物，其為玉米。
21．一種通過(guò)權(quán)利要求1或12的DNA分子的表達(dá)產(chǎn)生的毒素。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的毒素，其中所述的毒素有抗小菜蛾活性。
23．根據(jù)權(quán)利要求21的毒素，其中所述的毒素通過(guò)命名為NRRL登記號(hào)B-21883的大腸桿菌菌株產(chǎn)生。
24．根據(jù)權(quán)利要求21的毒素，其中所述的毒素含有選自SEQ IDNO:2,3,5,7,9,11,13,15的氨基酸序列。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的毒素，其中所述的毒素含有選自SEQ IDNO:2,5,9,和13的氨基酸序列。
26．根據(jù)權(quán)利要求24的毒素，其中所述的毒素含有選自SEQ IDNO:3,7,11,和15的氨基酸序列。
27．一種含有殺蟲(chóng)有效量的權(quán)利要求21的毒素的組合物。
28．一種生產(chǎn)具有抗昆蟲(chóng)活性的毒素的方法，包括(a)獲得如權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞；以及(b)在所述細(xì)胞中表達(dá)核酸序列，其產(chǎn)生至少一種有抗昆蟲(chóng)活性的毒素。
29．一種產(chǎn)生昆蟲(chóng)抗性植物的方法，包括導(dǎo)入權(quán)利要求1或12所述的核酸分子到所述植物中，其中所述的核酸分子可在所述的植物中以防治昆蟲(chóng)有效量表達(dá)。
30．根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中的昆蟲(chóng)為小菜蛾。
31．一種防治昆蟲(chóng)的方法，包括對(duì)昆蟲(chóng)給藥有效量的權(quán)利要求21所述的毒素。
32．根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中的昆蟲(chóng)為小菜蛾。
33．根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中的毒素口服給藥于昆蟲(chóng)。
34．一種誘變權(quán)利要求1或權(quán)利要求12所述的核酸分子的方法，其中的核酸分子被切割為所需大小的雙鏈隨機(jī)片段的群體，包括(a)加入一個(gè)或多個(gè)單-或雙鏈寡核苷酸到雙鏈隨機(jī)片段的群體中，其中所述的寡核苷酸各含有一個(gè)與雙鏈模板多核苷酸的同一性區(qū)域和一個(gè)異源性區(qū)域；(b)變性產(chǎn)生的雙鏈隨機(jī)片段和寡核苷酸的混合物成單鏈片段；(c)在產(chǎn)生所述單鏈片段在所述同一區(qū)的退火來(lái)形成退火的片段的配對(duì)的條件下，用聚合酶溫育產(chǎn)生的單鏈片段的群體，所述的同一性區(qū)對(duì)于一個(gè)對(duì)中的一個(gè)成員啟動(dòng)另一個(gè)的復(fù)制是足夠的，因此形成了一種誘變的雙鏈多核苷酸；以及(d)重復(fù)第二和第三步至少兩個(gè)進(jìn)一步的循環(huán)，其中在進(jìn)一步循環(huán)的第2步中產(chǎn)生的混合物包括來(lái)自上一循環(huán)的第三步的誘變的雙鏈多核苷酸，以及其中的進(jìn)一步的循環(huán)形成了進(jìn)一步誘變的雙鏈多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了分離自嗜線蟲(chóng)致病桿菌,波氏致病桿菌以及發(fā)光光桿狀菌的新的核酸序列,其表達(dá)產(chǎn)生新的殺蟲(chóng)毒素。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了含有能夠防治害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)毒素的組合物和制劑。本發(fā)明進(jìn)一步描述了生產(chǎn)該毒素的方法以及該核苷酸序列的使用的方法,例如在微生物中防治害蟲(chóng)或在轉(zhuǎn)基因植物中賦予昆蟲(chóng)抗性的方法。
文檔編號(hào)C12N1/19GK1303432SQ99806688
公開(kāi)日2001年7月11日 申請(qǐng)日期1999年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月21日
發(fā)明者V·C·卡拉默, M·K·摩根, A·R·安德森 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司