專利名稱：聚(adp－核糖)聚合酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系有關(guān)新穎聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)基因及自其衍生的蛋白質(zhì)；對(duì)新穎蛋白質(zhì)具特異性的抗體；醫(yī)藥及基因療法組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)物；分析測(cè)定根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和核酸的方法；鑒定根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的效應(yīng)物或結(jié)合配偶體的方法；測(cè)定如此效應(yīng)物活性的方法及其用以診斷或治療病理狀態(tài)的用途。
在1966年，Chambon和同僚發(fā)現(xiàn)116 kD酶，其在其后年間經(jīng)詳細(xì)表征現(xiàn)稱為PARP(EC2.4.2.30)(聚(腺苷-5＇-二磷酸核糖)聚合酶)、PARS(聚(腺苷-5′-二磷酸核糖)合成酶)或ADPRT(腺苷-5′-二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)。在植物界(擬南芥(Arabidopsisthaliana))中，在1995年發(fā)現(xiàn)72 kD(637個(gè)氨基酸)PARP(LepiniecL.等人，F(xiàn)EBS Lett 1995；364(2):103-8)。未清楚的是此截短形式的PARP是否為植物特異的個(gè)體還是加工品(“剪接”變異體或類似物)。116 kD PARP 7酶目前已知僅在動(dòng)物和人體中有活性，其經(jīng)描述于下，以下稱為PARP1以避免混淆。
PARP1的主要生理功能似乎為其參預(yù)復(fù)合物修復(fù)機(jī)制，其細(xì)胞經(jīng)發(fā)展以修復(fù)DNA鏈斷裂處。對(duì)DNA鏈斷裂處的主要細(xì)胞反應(yīng)，再者，似乎包括聚(ADP-核糖)自NAD+的PARP1-催化合成(參閱DeMurcia,G.等人(1994)TIBS,19,172)。
PARP1具基準(zhǔn)的分子結(jié)構(gòu)。3個(gè)主要功能元件目前已經(jīng)鑒定N-端46kD DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；中央22kD自身修飾結(jié)構(gòu)域，其上連接著聚(ADP-核糖)，而PARP1酶活性隨增加的延長(zhǎng)而降低；及C-端54kD NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域。亮氨酸拉鏈區(qū)經(jīng)發(fā)現(xiàn)在自修飾結(jié)構(gòu)域內(nèi)，表明可能的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用僅于果蠅的PARP中。所有目前已知的PARP假定以同源二聚體為活性形式.
分子的高度組織反映于氨基酸序列的強(qiáng)保守性。因此，氨基酸的62％保守已發(fā)現(xiàn)在人、小鼠、牛和雞的PARP1中。與果蠅的PARP有更大的結(jié)構(gòu)差異。個(gè)別的結(jié)構(gòu)域具有更為保守的簇串。因此，DNA結(jié)合區(qū)域含2個(gè)所謂鋅指為次結(jié)構(gòu)域(包括CX2CX28/30HX2C型的基序)，其涉及DNA單鏈斷裂處或單鏈DNA突出的Zn2+-依賴性識(shí)別(例如在染色體末端上，端粒)。C-端催化的結(jié)構(gòu)域包括約50個(gè)氨基酸模塊(殘基859-908)，其在脊椎動(dòng)物間為約100％保守的(PARP“簽名(Signature)”)。此模塊結(jié)合天然底物NAD+及因此管理聚(ADP-核糖)的合成(參閱de Murcia，上引)。GX3GKG基序特別地在此塊中為PARP的特征。
上述的有利功能對(duì)應(yīng)于多種疾病的病理(中風(fēng)、心肌梗塞、敗血癥等)。PARP涉及腦(Choi,D.W.,(1997)天然醫(yī)學(xué)，3,10,1073)、心肌(Zingarelli,B.等人(1997)，心血管研究，36,205)及眼(Lam,T.T.(1997)，分子病理和藥理學(xué)的研究通訊，95,3,241)的局部缺血造成的細(xì)胞死亡。由炎性介體誘導(dǎo)的PARP活化曾見于膿毒性休克(Szabo,C.等人(1997)，臨床探討會(huì)刊，100,3,723)。在這些病例中，PARP的活化伴隨NAD+的廣泛地消耗。因?yàn)?摩爾NAD+的生合成消耗4摩爾ATP，細(xì)胞能量供給戲劇性地降低。結(jié)果為細(xì)胞死亡。
在前述專業(yè)文獻(xiàn)中所述的PARP1抑制劑為煙堿酰胺和3-胺基芐酰胺。3,4-二氫-5-[4-(1-六氫吡啶基)丁氧基]-1(2H)-異喹啉酮系由Takahashi,K.等人(1997)，腦血流和代謝會(huì)刊17,1137,所揭示。進(jìn)一步抑制劑系述,例如于Banasik,M.等人(1992)J.Biol.Chem.,267,3,1569及Griffin,R.J.等人(1995)，抗癌藥物設(shè)計(jì)，10,507。
被描述為人PARP1的高分子量結(jié)合配偶體包括堿基切除修復(fù)(BER)蛋白質(zhì)XRCC1(X-光修復(fù)交叉互補(bǔ)1)，其經(jīng)鋅指基序和BRCT(BRCA1C-端)模塊(氨基酸372-524)結(jié)合(Masson,M.等人(1998)分子和細(xì)胞生物學(xué)，18,6,3563)。
基于PARP的多樣生理和病理功能,本發(fā)明的目標(biāo)是提供新穎PARP同系物。理由是均相PARP的提供對(duì)發(fā)展新穎藥物靶物及新穎藥物特別重要，以期改進(jìn)涉及PARP、PARP同系物或自其衍生的物質(zhì)的病理狀態(tài)的診斷和/或療法。
目標(biāo)通過提供PARP同系物達(dá)到，優(yōu)選地來(lái)自人和非人哺乳動(dòng)物衍生，且具以下的氨基酸序列a)功能性NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即具特征性GX3GKG基序的PARP“簽名”序列及b)特別地在N-端序列區(qū)域中，即在最初200個(gè)N-端氨基酸的區(qū)域中如，例如在最初100個(gè)的區(qū)域中，無(wú)下式的PARP鋅指序列基序CX2CXmHX2C其中m為自28或30的整數(shù)值，及X基各自獨(dú)立為任何氨基酸；及其功能性相當(dāng)物。
因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明的PARP分子特別代表功能性同系物，其亦自然地具聚(ADP-核糖)合成活性。NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域必要地與此活性相對(duì)應(yīng)且位于C端。
因此，根據(jù)本發(fā)明的PARP必要特性系功能性NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PARP簽名)的存在，其位在氨基酸序列的C-端區(qū)域(即約在最后400個(gè)，例如最后350或300個(gè)C-端氨基酸的區(qū)域中)，結(jié)合著不具鋅指基序的N-端序列。因?yàn)樵谝阎狿ARP中的鋅指基序假定地貢獻(xiàn)于DNA斷裂的識(shí)別，假定地根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)不與DNA相互作用或以另一種方式進(jìn)行。有關(guān)的生化試驗(yàn)示范，根據(jù)本發(fā)明的PARP2可由“活化DNA”(即由限制DNaseⅠ消化后的DNA)活化?？勺源诉M(jìn)一步結(jié)論根據(jù)本發(fā)明的PARP2具DNA結(jié)合性質(zhì)。然而，根據(jù)本發(fā)明的PARPDNA結(jié)合與酶活化的機(jī)制和PARP1不同。其DNA結(jié)合與酶活化，如述地，由特性鋅指基序所介導(dǎo)。無(wú)如此的基序存在于根據(jù)本發(fā)明的PARP中。假定地，此些性質(zhì)由根據(jù)本發(fā)明PARP的N-端區(qū)域中的正電荷氨基酸所介導(dǎo)。因?yàn)椤盎罨疍NA”(即例如在以去氧核酸酶Ⅰ的限制處后后的DNA)具很多缺點(diǎn)(單鏈斷裂、單鏈裂隙、單鏈突出、雙鏈斷裂等)，可能地雖然PARP1和根據(jù)本發(fā)明的PARP系由相同“活化DNA”所活化，其系由不同的缺點(diǎn)亞群(例如單鏈裂隙而非單鏈斷裂)所活化。
功能性NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即催化結(jié)構(gòu)域)結(jié)合聚-(ADP-核糖)合成的底物。與已知PARP一致，特別是具有序列基序GX1X2X3GKG的那些，其中G為甘氨酸，K為賴氨酸，及X1、X2和X3各自獨(dú)立為任何氨基酸。然而，驚人地，如由比較根據(jù)本發(fā)明PARP分子的NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與前面揭示的人PARP1者所示，根據(jù)本發(fā)明的序列與NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域的已知序列明顯地不同。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選PARP分子優(yōu)選地在普通的催化結(jié)構(gòu)域上具以下的一般序列基序PXn(S/T)GX3GKGIYFA(SEQ ID NO:11)，特別地(S/T)XGLR(I/V)XPXn(S/T)GX3GKGIYFA(SEQ ID NO:12)，優(yōu)選地LLWHG(S/T)X7IL(S/T)XGLR(I/V)XPXn(S/T)GX3GKGIYFAX3SKSAXY(SEQ ID NO:13)其中(S/T)描述此序列位置由S或T的可替代占有，(I/V)描述此序列位置由I或V的可替代占有及n為自1至5的整數(shù)值，及X基各自獨(dú)立為任何氨基酸。最后的組合亦稱為“PARP簽名”組合。
自修飾結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地同樣存在于根據(jù)本發(fā)明的PARP中。其可位在例如在NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域N-端前面的自約100至200個(gè)氨基酸的區(qū)域中。
根據(jù)本發(fā)明的PARP同系物可附加地包括N-端NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域(即約30至約80個(gè)氨基酸更近于N端)、下式的亮氨酸拉鏈樣序列基序(L/V)X6LX6LX6L(SEQ ID NO:14)其中(L/V)代表此序列位置由L或V的可替代占有，及X基各自獨(dú)自為任何氨基酸。根據(jù)本發(fā)明所見的亮氨酸拉鏈基序明顯地不同于自那些所述為果蠅PARP的位置。亮氨酸拉鏈可導(dǎo)致同質(zhì)二聚體(2個(gè)PARP分子)或異源二聚體(1個(gè)PARP分子及與其不同的結(jié)合配偶體)。
根據(jù)本發(fā)明的PARP同系物優(yōu)選地，附加地包括在N-端上的上述亮氨酸拉鏈似序列基序，即約10至250個(gè)氨基酸殘基更近于N端，至少另一個(gè)以下的部分序列基序LX9NX2YX2OLLX(D/E)XbWGRVG，(基序1；SEQ ID NO:15)AX3FXKX4KTXNXWX5FX3PXK，(基序2；SEQ ID NO:16)QXL(I/L)X2IX9MX10PLGKLX3QIX6L，(基序3；SEQ ID NO:17)FYTXIPHXFGX3PP，(基序4；SEQ ID NO:18)及
KX3LX2LXDIEXAX2L (基序5；SEQ ID NO:19)其中(D/E)描述此序列位置由D或E可替代地占有，(I/L)描述此序列位置由I或L可替代地占有，b為整數(shù)值10或11，及X基各自獨(dú)立為任何氨基酸。最優(yōu)選地，此些基序1至5全部存在于所述的序列中，而基序1最近于N端。
上述的PARP簽名基序在根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)中跟隨著至少另一個(gè)以下的基序GX3LXEVALG(基序6；SEQ ID NO:20)GX2SX4GX3PXaLXGX2V(基序7；SEQ ID NO:21)及E(Y/E)X2YX3QX4YLL (基序8；SEQ ID NO:22)其中(Y/F)描述此序列位置由Y或F的可替代占有，a等于7至9及X在各例中為任何氨基酸。最優(yōu)選地此3個(gè)C-端基序全部存在且在所述的序列中，而基序8最近于C端。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選PARP結(jié)構(gòu)可圖式地描述如下基序1至5/PARP簽名/基序6至8或基序1至5/亮氨酸拉鏈/PARP簽名/基序6至8可能地，進(jìn)一步氨基酸殘基，例如多至40個(gè)排列在個(gè)別基序間及進(jìn)一步氨基酸殘基，例如多至80個(gè)排列在N端上和/或在C端上。
根據(jù)本發(fā)明特別佳的PARP同系物為蛋白質(zhì)人PARP2、人PARP3、小鼠PARP3及其功能性相當(dāng)物。稱為PARP2的蛋白質(zhì)包括570個(gè)氨基酸(參閱SEQ ID NO:2)。稱為人PARP3的蛋白質(zhì)可能地以2種形式存在。第1型包括533個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:4)及第2型包括540個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:6)。不同形式可能源自不同起始的轉(zhuǎn)譯。稱為小鼠PARP3的蛋白質(zhì)以2種形式存在，其不同在于5個(gè)氨基酸(15bp)的刪除。第1型包括533個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:8)及第2型包括528個(gè)氨基酸(SEQ ID NO:10)。本發(fā)明的PARP同系物在序列中顯著不同于擬南芥的該P(yáng)ARP蛋白質(zhì)(見以上)。例如，PARP2和PARP3不包括植物PARP特異肽序列AAVLDQWIPD，相對(duì)應(yīng)于擬南芥蛋白質(zhì)的氨基酸殘基143至152。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明PARP同系物的結(jié)合配偶體。此些結(jié)合配偶體優(yōu)選地選自a)抗體及其片段，例如Fv、Fab、F(ab′)2，b)蛋白質(zhì)性質(zhì)的化合物，其例如經(jīng)以上的亮氨酸拉鏈區(qū)域或另一個(gè)序列段，與PARP相互作用，及c)低分子量效應(yīng)物，其調(diào)節(jié)生物PARP功能，例如催化性PARP活性，即消耗NAD+的ADP核糖苷化，或與活化劑蛋白質(zhì)或與DNA結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步有關(guān)核酸，包括a)編碼至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的PARP同系物的核苷酸序列，或其互補(bǔ)的核苷酸序列；b)與如在a)中所特異的序列雜交的核苷酸序列，優(yōu)選地在嚴(yán)緊條件下；或c)由于基因碼簡(jiǎn)并性而由a)和b)中界定的核苷酸序列衍生的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的合適核酸特別地包括至少一個(gè)部份序列，其編碼上述氨基酸序列基序。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選核酸包括如示于SEQ ID NO:1和3中的核苷酸序列，及特別地具有根據(jù)本發(fā)明PARP同系物的特性的部份序列，如包括以下的核苷酸序列a)示于SEQ ID NO:1的核苷酸+3至+1715；b)示于SEQ ID NO:3的核苷酸+242至+1843；c)示于SEQ ID NO:5的核苷酸+221至+1843；d)示于SEQ ID NO:7的核苷酸+112至+1710；或e)示于SEQ ID NO:9的核苷酸+1至+1584或a)、b)、c)、d)和e)的部份序列，其編碼根據(jù)本發(fā)明PARP同系物的上述特性氨基酸序列基序。
本發(fā)明進(jìn)一步有關(guān)表達(dá)盒，其包括在調(diào)節(jié)核苷酸序列的基因控制下至少一種根據(jù)本發(fā)明的上述核苷酸序列。此些可用以制備根據(jù)本發(fā)明的重組載體，例如病毒載體或質(zhì)粒，其包括至少一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒。
根據(jù)本發(fā)明的重組微生物以至少一種上述載體轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明亦有關(guān)以根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染(transfigiert)外來(lái)基因哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明進(jìn)一步有關(guān)體外檢測(cè)方法，其檢測(cè)PARP抑制劑，均相或多相地進(jìn)行，其包括a)將無(wú)支持物的或有支持物的可聚-ADP-核糖苷化靶物與包括以下的反應(yīng)混合液溫孵a1)根據(jù)本發(fā)明的PARP同系物；a2)PARP活化劑；及a3)PARP抑制劑或分析物，其中至少被懷疑為一個(gè)PARP抑制劑；b)進(jìn)行聚ADP核糖苷化反應(yīng)；及c)定性或定量地測(cè)定靶物的聚ADP核糖苷化。
檢測(cè)方法優(yōu)選地由將PARP同系物與PARP活化劑和PARP抑制劑或至少一個(gè)被懷疑為抑制劑的分析物預(yù)培養(yǎng)，在進(jìn)行聚ADP核糖苷化反應(yīng)前，進(jìn)行約1-30分。
在由具單鏈斷裂的DNA(稱為根據(jù)本發(fā)明的“活化DNA”)活化后，PARP在NAD存在下聚-ADP核糖苷化大量的核蛋白質(zhì)。此些蛋白質(zhì)，包括PARP自身，及組蛋白等。
在檢測(cè)方法中所用的優(yōu)選可聚-ADP-核糖苷化靶物為以其天然形式的組蛋白蛋白質(zhì)或自其衍生的可聚-ADP-核糖苷化相當(dāng)物。由Sigma供應(yīng)的組蛋白制備物(SIGMA，目錄號(hào)H-7755；自小牛胸腺的組蛋白Ⅱ-AS型，Luck,J.M.等人，J.Biol.Chem.,233,1407(1958),Satake K.等人，J.Biol.Chem.,235,2801(1960))經(jīng)使用為實(shí)例。原則上可能地使用易于PARP聚-ADP-核糖苷化的所有類型蛋白質(zhì)或其部分。此些優(yōu)選地為核蛋白質(zhì)，例如組蛋白、DNA聚合酶、端粒酶或PARP自身。自相對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)衍生的合成肽亦可作為靶物。
在根據(jù)本發(fā)明的ELISA中，可能地使用在自約0.1微克/孔至約100微克/孔的范圍內(nèi)的組蛋白量，優(yōu)選地約1微克/孔至約10微克/孔。PARP酶的量在自約0.2皮摩爾/孔至約2納摩爾/孔的范圍內(nèi)，優(yōu)選地自約2皮摩爾/孔至約200皮摩爾/孔，反應(yīng)混合液在各例中包括100微升/孔。降至更小孔則相應(yīng)更少的反應(yīng)量。
在根據(jù)本發(fā)明的HTRF分析法中，采用相同量的PARP，及組蛋白或修飾組蛋白的量在自約2納克/孔至約25微克/孔的范圍內(nèi)，優(yōu)選地約25納克/孔至約2.5微克/孔，反應(yīng)混合液在各例中包括50微升/孔。降至更小則相應(yīng)反應(yīng)量更少。
根據(jù)本發(fā)明所用的PARP活化劑優(yōu)選地為活化DNA。
不同類型的受損DNA可作用為活化劑。DNA損傷可由去氧核酸酶或其他DNA修飾酶(例如限制內(nèi)核酸酶)消化，由照射或其他物理方法或化學(xué)處理DNA產(chǎn)生。進(jìn)一步可能地以靶物方式使用合成寡核苷酸刺激DNA損傷情況。在藉實(shí)例所示的分析法中，自小牛胸腺的活化DNA已被采用(Sigma，產(chǎn)物號(hào)D4522；CAS:91080-16-9，由Aposhian和Kornberg的方法使用小牛胸腺DNA(SIGMA D-1501)和去氧核糖核酸酶第Ⅰ型(D-4263)制備。Aposhian,H.V.和Kornberg,A.,J.Biol.Chem.,237,519(1962))?；罨疍NA在反應(yīng)步驟中在自0.1至1000微克/毫升的濃度范圍下使用，優(yōu)選地自1至100微克/毫升。
聚ADP核糖苷化反應(yīng)在根據(jù)本發(fā)明的方法中由添加NAD+啟動(dòng)。NAD濃度在自約0.1微摩爾濃度至約10毫摩爾濃度的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在自約10微摩爾濃度至約1毫摩爾濃度的范圍內(nèi)。
在可多相地進(jìn)行以上方法的變通方案中，結(jié)合支持物的靶物的聚ADP核糖苷化系使用抗聚(ADP-核糖)抗體測(cè)定。為達(dá)成此，反應(yīng)混合液系與結(jié)合支持物的靶物分開，清洗及與抗體培養(yǎng)。此抗體本身可經(jīng)標(biāo)記。然而，作為檢測(cè)結(jié)合抗聚(ADP-核糖)抗體的可替代法，標(biāo)記的第二抗體或相對(duì)應(yīng)的標(biāo)記抗體斷可予應(yīng)用。合適的標(biāo)記物為例如放射標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)-或螢光團(tuán)-標(biāo)記生物素化、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、具順磁金屬的標(biāo)記，或特別地例如以辣根過氧化酶的酶標(biāo)記。適當(dāng)檢測(cè)技術(shù)通常對(duì)熟諳此技藝者系已知的。
在可均相地進(jìn)行以上方法的變異法中，無(wú)支持物的靶物以受體螢光團(tuán)標(biāo)記。在此例中所用的優(yōu)選靶物為生物素化組蛋白，受體螢光團(tuán)經(jīng)抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白與組蛋白的生物素基團(tuán)偶合。特別合適作為受體螢光團(tuán)的為藻膽蛋白質(zhì)(例如藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白)，例如R-藻藍(lán)蛋白(R-PC)、別藻藍(lán)素(APC)、R-藻紅蛋白(R-PE)、C-藻藍(lán)蛋白(C-PC)、B-藻紅蛋白(B-PE)或其互相或與螢光染劑如Cy5、Cy7或德州紅(Tandem系統(tǒng))的組合(Thammapalerd,N.等人，東南亞熱帶醫(yī)學(xué)和公共健康會(huì)刊，27(2):297-303(1996)；Kronick,M.N.等人，臨床化學(xué)，29(9),1582-1586(1986)；Hicks,J.M.,人體病理學(xué)，15(2),112-116(1984))。在實(shí)施例中所用的染劑XL 665為交聯(lián)的別藻藍(lán)素(Glazer,A.N.,Rev.Microbiol.,36,173-198(1982)；Kronick,M.N.,J.Imm.Meth.,92,1-13(1986)；MacColl,R.等人，藻膽蛋白質(zhì)，CRC Press Inc.,Boca Raron,Florida(1987)；MacColl,R.at al,Arch.Biochem.Biophys.,208(1)42-48(1981))。
此外，在均相方法中優(yōu)選的在測(cè)定未結(jié)合支持物的靶物的聚ADP核糖苷化，使用抗聚(ADP-核糖)抗體，其系以供體螢光團(tuán)標(biāo)記，其在因標(biāo)記抗體與聚ADP-核糖苷化組蛋白結(jié)合而供體和受體在空間上接近時(shí)，能轉(zhuǎn)移能量于受體螢光團(tuán)。氪酸銪優(yōu)選地作為抗聚(ADP-核糖)抗體的供體螢光團(tuán)。
除使用氪酸銪外，其他化合物亦可能作為潛在供體分子。在一方面，此會(huì)留下氪酸鹽籠(kryptatkafig)的修飾。由其他稀土金屬如鋱置換銪亦為可能的。決定性地，螢光持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)時(shí)間遲滯越長(zhǎng)(Lopez,E.等人，Clin.Chem.39/2,196-201(1993)；美國(guó)專利號(hào)5,534,622)。
上述的檢測(cè)方法系基于以下原理，即PARP活性與在組蛋白上形成ADP-核糖聚合物量間有相關(guān)性。在此所述的分析法，以ELISA和HTRF(均相時(shí)間解析(time-resolved)螢光)形式，使用特定抗體可能定量分析ADP-核糖聚合物。此兩種分析法的特定具體實(shí)施例系詳述于以下實(shí)施例中。
發(fā)展的HTRF(均相時(shí)間解析螢光)分析系統(tǒng)使用特定的抗體測(cè)定在組蛋白上聚(ADP-核糖)的形成。相對(duì)于ELISA，此分析法在均質(zhì)相中進(jìn)行，而無(wú)分開和清洗步驟。此造成更高的樣品產(chǎn)量及更少的可能誤差敏感性。HTRF系基于在2種螢光團(tuán)間“螢光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)”。在FRET分析法中，激發(fā)的供體螢光團(tuán)可當(dāng)其在空間上相互接近時(shí)，轉(zhuǎn)移其能量予受體螢光團(tuán)。在HTRF技術(shù)中，供體熒光團(tuán)為氪酸銪[(Eu)K]及受體為L(zhǎng)X665，穩(wěn)定化的別藻藍(lán)素。氪酸銪系基于Jean Marie Lehn的研究(Strasbourg)(Lopez,E.等人，Clin.Chem.,39/2,196-201(1993)；美國(guó)專利號(hào)5,534,622)。
在均相分析法中，所有成份均于測(cè)定時(shí)出現(xiàn)。而此具進(jìn)行分析法的優(yōu)點(diǎn)(快速、復(fù)合性)，必要時(shí)需排除分析成份的干擾(原有的熒光、染劑的猝滅等)。HTRF通過雙波長(zhǎng)(665納米、620納米)下的時(shí)間延遲測(cè)定而排除如此干擾。HTRF具極長(zhǎng)的衰退時(shí)間，時(shí)間延遲測(cè)定因此是可能的。不受短生背景熒光(例如自分析成份或物質(zhì)庫(kù)的抑制劑)影響。此外，測(cè)定總在2個(gè)波長(zhǎng)下進(jìn)行，以期補(bǔ)足有色物質(zhì)的猝滅作用。HTRF分析法可例如在96-或384-孔微滴度板孔式下進(jìn)行，及使用“發(fā)現(xiàn)HTRF微滴度板分析儀”(Canberra Packard)評(píng)估。
根據(jù)本發(fā)明亦提供的是以下PARP結(jié)合配偶體，特別地根據(jù)本發(fā)明的PARP同系物的體外篩選方法。
第一個(gè)變異法由以下進(jìn)行a1)將至少一個(gè)PARP同系物固定在支持物上；b1)將固定化APRP同系物與其中被懷疑有至少一個(gè)結(jié)合配偶體的分析物接觸；及c1)在適當(dāng)時(shí)在一段培養(yǎng)時(shí)段后，測(cè)定與固定化PARP同系物結(jié)合的分析物成分。第二個(gè)變異法a2)將分析物固定在支持物上，其分析物包括至少一個(gè)PARP同系物的可能結(jié)合配偶體；b2)將固定化分析物與至少一個(gè)結(jié)合配偶體所找尋的一個(gè)PARP同系物，接觸c2)在適當(dāng)時(shí)在一段培養(yǎng)時(shí)段后，檢視固定化分析物上PARP同系物的結(jié)合。本發(fā)明亦有關(guān)定性或定量測(cè)定編碼PARP同系物的核酸的方法，其包括a)將生物樣品與一定量根據(jù)本發(fā)明的外源核酸(例如與約20至500個(gè)堿基的長(zhǎng)度或更長(zhǎng))培養(yǎng)、雜交、優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下，測(cè)定雜交的核酸及，在適當(dāng)時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)物比較；或b)將生物樣品與一定量對(duì)編碼PARP同系物核酸具特異性的寡核苷酸引物對(duì)培養(yǎng)，擴(kuò)增核酸，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物及，在適當(dāng)時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)物比較。本發(fā)明進(jìn)一步有關(guān)定性或定量測(cè)定根據(jù)本發(fā)明PARP同系物的方法，其包括a)將生物樣品與至少一個(gè)PARP同系物特異性結(jié)合配偶體溫孵，b)偵測(cè)結(jié)合配偶體/PARP復(fù)合物及，在適當(dāng)時(shí)c)將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物比較。
在此例中結(jié)合配偶體優(yōu)選地抗PARP抗體或其結(jié)合片段，其在適當(dāng)時(shí)載有可檢測(cè)的標(biāo)志。
根據(jù)本發(fā)明對(duì)PARP，特別地對(duì)PARP同系物及對(duì)其編碼核酸序列的測(cè)定方法系合適的及對(duì)診斷膿毒性或局部缺血性組織損傷，特別是中風(fēng)、心肌梗塞、糖尿病或膿毒性休克系有利的。
本發(fā)明進(jìn)一步包括測(cè)定PARP效應(yīng)物效率的方法，其包括a)將根據(jù)本發(fā)明的PARP同系物與包括具生理或病理PARP活性的效應(yīng)物的分析物培養(yǎng)，在適當(dāng)時(shí)再除去效應(yīng)物；及b)在適當(dāng)時(shí)在添加底物或共底物后，測(cè)定PARP同系物的活性。
本發(fā)明進(jìn)一步有關(guān)基因療法組合物，其在基因療法可接受的載體中包括核酸構(gòu)建物，其編碼a)包括根據(jù)本發(fā)明的編碼核酸的反義核酸；或b)針對(duì)根據(jù)本發(fā)明非編碼核酸的核糖酶；或c)特異PARP抑制劑。
本發(fā)明進(jìn)一步有關(guān)醫(yī)藥組合物，在醫(yī)藥上可接受的載體中，包括至少一種根據(jù)本發(fā)明的PARP蛋白質(zhì)，至少一種根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合配偶體或至少一種根據(jù)本發(fā)明的編碼核苷酸序列。
最后，本發(fā)明系有關(guān)在診斷或治療在發(fā)展和/或進(jìn)行的病理狀態(tài)上PARP同系物的結(jié)合配偶體的用途，其中涉及至少一種PARP蛋白質(zhì)，特別地根據(jù)本發(fā)明的PARP同系物，或自其衍生的多肽。使用的結(jié)合配偶體可例如為低分子量結(jié)合配偶體，其分子量可例如為少于約2000道爾頓或少于約1000道爾頓。
此外，本發(fā)明系有關(guān)診斷或治療由能量不足介導(dǎo)病理狀態(tài)的PARP結(jié)合配偶體的用途。為本發(fā)明目的的能量不足特別地為細(xì)胞能量不足，其經(jīng)見于全身性或于個(gè)別身體區(qū)域、器官或器官區(qū)域，或組織或組織區(qū)域不適的病人。這些病癥的特征在于，NAD和/或ATP損耗超出了NAD和/或ATP量的生理變異范圍(上限或下限)，及優(yōu)選地由具PARP活性的蛋白質(zhì)，特別地根據(jù)本發(fā)明的PARP同系物，或自其衍生的多肽所介導(dǎo)。
“能量不足介導(dǎo)的疾病”，為本發(fā)明的目的，附加地包括組織損傷系來(lái)自因壞死或細(xì)胞凋亡所致的細(xì)胞死亡。根據(jù)本發(fā)明的方法系適合治療和預(yù)防因細(xì)胞計(jì)劃凋亡或壞死的細(xì)胞損傷所致的組織損傷；因局部缺血和/或再灌注對(duì)神經(jīng)組織的損傷；神經(jīng)疾??；神經(jīng)退行性疾??；血管中風(fēng)；治療和預(yù)防心血管疾??；治療其他疾病或病況如，老年性黃斑變性、AIDS或其他免疫缺陷疾??；關(guān)節(jié)炎；動(dòng)脈粥樣硬化癥；惡病質(zhì)；癌癥；骨骼肌的退行性疾??；糖尿病；顱外傷；胃腸道的炎性疾病，例如Crohnsche氏癥；肌肉營(yíng)養(yǎng)不良；骨關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松癥；慢性和/或急性疼痛；腎失調(diào)；視網(wǎng)膜局部缺血；膿毒性休克(例如內(nèi)毒素休克)；皮膚老化或全身老化；老化的全身顯現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的方法可附加地予以采用，以延長(zhǎng)身體組織細(xì)胞的壽命和增殖能力及，與照射療法相組合，以敏感化腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明特別有關(guān)使用如上界定的PARP結(jié)合配偶體以診斷或治療(急性或預(yù)防)由能量不足所介導(dǎo)的病理狀態(tài)，及選自神經(jīng)退行性疾病，或由膿毒性或局部缺血所致的組織損傷，特別地神經(jīng)毒性紊亂、中風(fēng)、心肌梗塞、在梗塞解離(Infarktlyse)期間或其后的損傷(例如以TPA、Reteplase或機(jī)械性以激光或旋光束(Rotablator)引起)及在心瓣置換期間或其后的微梗塞，動(dòng)脈瘤切除術(shù)和心臟移植、頭和脊髓的重傷、腎梗塞(急性腎衰竭、急性腎無(wú)能或在緊移植和其后的損傷)、骨骼肌的損傷、肝梗塞(肝衰竭、在肝移植期間或其后的損傷)、外周神經(jīng)病痛、AIDS癡呆、膿毒性休克、糖尿病、在局部缺血后發(fā)生的神經(jīng)退化疾病、重傷(顱腦重傷)、大出血、蜘蛛膜下出血和中風(fēng)，以有神經(jīng)退化疾病如阿爾滋海默氏病、多梗塞癡呆、哈丁頓氏癥、帕金森氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化、癲癇，特別地全身性癲癇發(fā)作如癲癇小發(fā)作(Petitmal)和緊張陣攣發(fā)作及部分癲癇發(fā)作如顳葉性，及復(fù)合的部分發(fā)作、腎衰竭，亦于腫瘤的化學(xué)治療和轉(zhuǎn)移的預(yù)防及以治療炎癥和風(fēng)濕性疾病，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，進(jìn)一步以治療極窄冠狀動(dòng)脈和極窄外周動(dòng)脈，例如腿動(dòng)脈的脈管再形成?！熬植咳毖?，為本發(fā)明目的，包括氧的局部性不正常供應(yīng)予組織，由動(dòng)脈血流封閉所致。球狀局部缺血在血流至整個(gè)腦經(jīng)中斷一段有限時(shí)間時(shí)發(fā)生。此可例如由心停止所致。病灶局部缺血在腦的部分經(jīng)切斷其正常血供應(yīng)時(shí)發(fā)生。病灶局部缺血可由血管的血栓性栓塞封閉，由腦重傷、水腫或脈腫瘤所致。甚至短暫的局部缺血可導(dǎo)致廣泛神經(jīng)元損傷。雖然對(duì)“神經(jīng)組織”的損傷可在局部缺血開始后數(shù)天或數(shù)周內(nèi)發(fā)生，但一些永久性損傷(例如壞死性細(xì)胞死亡)在血供應(yīng)中斷后最初幾分鐘內(nèi)發(fā)生。此損傷例如由谷氨酸的神經(jīng)毒性所致及接著二次再灌注，例如自由基的釋出(例如氧自由基、NO自由基)。局部缺血可同樣地在其他器官和組織中發(fā)生，例如在心(心肌梗塞及由冠狀動(dòng)脈的閉塞所致的其他心血管疾病)中或在眼睛(視網(wǎng)膜的局部缺血)中。
本發(fā)明附加地有關(guān)使用有效治療量的PARP結(jié)合配偶體以影響神經(jīng)元活性。“神經(jīng)元活性”，為本發(fā)明目的，包括刺激損傷的神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元再生或治療神經(jīng)元疾病?！吧窠?jīng)元損傷”，為本發(fā)明目的，包括各型對(duì)“神經(jīng)組織”的損傷的及自此損傷所至的每一項(xiàng)物理或精神損傷或死亡。損傷的致因本質(zhì)上為代謝、毒性、化學(xué)或熱的及包括，藉實(shí)例，局部缺血、缺氧癥、重傷、腦血管損傷、手術(shù)、壓力、出血、照射、血管痙攣、神經(jīng)變性疾病、感染、癲癇、知覺疾病、谷氨酸代謝混亂及因而所致的繼發(fā)性?！吧窠?jīng)組織”，為本發(fā)明目的，包括形成神經(jīng)系統(tǒng)的不同成份，特別地由神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、星狀細(xì)胞、施旺氏細(xì)胞、內(nèi)部及供給用的血管系統(tǒng)、CNS、腦、腦干、脊髓、外周神經(jīng)系統(tǒng)等組成。
“神經(jīng)保護(hù)”，為本發(fā)明目的，包括神經(jīng)元損傷的降低、斷絕、減緩或改進(jìn)，及暴露在神經(jīng)元損傷下的神經(jīng)組織的保護(hù)、恢復(fù)及再生。
“神經(jīng)變性疾病的預(yù)防”包括在人體中預(yù)防、減緩和改進(jìn)神經(jīng)變性疾病的可能性，其已診斷出如此疾病或其已包括在此些神經(jīng)變性疾病的相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)人群中。已罹患此些疾病癥狀的患者亦可接受此種治療。
“治療”，為本發(fā)明目的，包括(ⅰ)在具如此傾向的人體中預(yù)防疾病、混亂或病狀；(ⅱ)由減緩其發(fā)展預(yù)防疾病、混亂或病狀；及(ⅲ)改進(jìn)疾病、混亂或病狀。
可由根據(jù)本發(fā)明的方法治療的“神經(jīng)學(xué)疾病”實(shí)例為神經(jīng)痛(三叉神經(jīng)、舌咽)、重癥肌無(wú)力、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、進(jìn)展性肌肉萎縮性、由中毒所致的外周神經(jīng)病痛(例如鉛中毒)、孔巴二氏癥候群、哈丁頓氏病、阿爾滋海默氏癥、帕金森氏癥或神經(jīng)叢疾病。根據(jù)本發(fā)明的方法優(yōu)選地適于治療神經(jīng)學(xué)疾病，選自由物理?yè)p傷或生病所致的外周神經(jīng)病痛；顱外傷，例如重創(chuàng)性脈損傷；脊髓的物理?yè)p傷；與腦損傷有關(guān)的中風(fēng)，如與缺氧和腦損傷聯(lián)合的中風(fēng)，及腦再灌注損傷；脫髓鞘疾病(脊髓病、阿爾滋海默氏癥、帕金森氏癥、哈丁頓氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化)。
根據(jù)本發(fā)明的方法可附加地用以治療心血管疾病?！靶难芗膊　?，為本發(fā)明目的，包括那些導(dǎo)致局部缺血者或由局部缺血或心的局部缺血/再灌注所致者。實(shí)例為冠狀血管疾病(例動(dòng)脈粥狀硬化癥)、胸部絞痛、心肌硬塞、因心停止或分流手術(shù)的心血管損傷。
根據(jù)本發(fā)明的方法可用以治療癌癥或在照射療法中以敏感化癌細(xì)胞?！鞍┌Y”一詞經(jīng)了解為廣的觀念。根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑可作為“抗癌療劑”。例如，那些方法可用以治療各型的癌癥或腫瘤細(xì)胞，如ACTH-生成腫瘤、急性淋巴或淋巴胚細(xì)胞白血?。患毙曰蚵粤馨图?xì)胞白血??；急性非淋巴細(xì)胞白血??；膀胱癌；腦腫瘤；乳癌；子宮頸癌；慢性髓細(xì)胞白血??；腸癌；T區(qū)域淋巴瘤；子宮內(nèi)膜組織異位；食道癌；膽囊癌；尤恩氏癌；頭頸癌；舌癌；霍奇金氏??；卡波西氏?。荒I癌；肝癌；肺癌；間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤；神經(jīng)田細(xì)胞瘤；非霍奇金氏淋巴瘤；骨肉瘤；卵巢瘤；神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤；乳房瘤；子宮頸瘤；前列腺瘤；胰瘤；陰莖瘤；神網(wǎng)膜胚細(xì)胞瘤；皮膚癌；胃癌；甲狀腺癌；子宮瘤；陰道瘤；威而斯氏腫瘤；或營(yíng)養(yǎng)層瘤。“放射敏感化物”或“照射敏感化物”，為本發(fā)明目的，系有關(guān)在體內(nèi)增加細(xì)胞對(duì)電磁輻射的照射(例如X-射線)的敏感化，或加速此照射處理的分子。照射敏感化物增加癌細(xì)胞對(duì)電磁輻射的毒性作用的敏感化。那些在文獻(xiàn)中所揭示者包括絲裂霉素C、5-溴脫氧尿苷和滅滴靈?？赡艿厥褂镁卟ㄩL(zhǎng)在自10-20至10米范圍內(nèi)的輻射，優(yōu)選地γ射線(10-20至10-13米)、X-射線(10-11至10-9米)；紫外輻射(10納米至400納米)、可見光(400納米至700納米)、紅外輻射(700納米至1毫米)及微波輻射(1毫米至30厘米)。
可由如此療法治療的疾病特別地為贅瘤疾病、良性或惡性腫瘤和癌癥。其他疾病使用電磁輻射的治療系同樣可能的。
本發(fā)明現(xiàn)將以參閱隨附的圖更詳細(xì)地?cái)⑹觥?br> 在

圖1中，人PARP(人PARP1)及根據(jù)本發(fā)明的2個(gè)優(yōu)選PARP(人PARP2、人PARP3、鼠PARP3)的序列對(duì)仗。在人PARP1和人PARP2、人PARP3或鼠PARP3間的序列一致性系在碼框內(nèi)描述。大多數(shù)序列在對(duì)仗內(nèi)指出。人PARP1的鋅指基序系位在與氨基酸殘基21至56及125至162相對(duì)應(yīng)的序列區(qū)段上；在圖2中，具不同人組織的Northern Blot法在說明根據(jù)本發(fā)明PARP2和PARP3分子的組織分布。第1行腦；第2行心；第3行骨髓??；第4行結(jié)腸；第5行胸腺；第6行脾；第7行腎；第8行肝；第9行腸；第10行胎盤；第11行肺；第12行外周血液白血球；尺寸標(biāo)準(zhǔn)物(kb)的個(gè)別位置經(jīng)指出。
在圖3中，具進(jìn)一步不同人組織的Northern Blot法在說明根據(jù)本發(fā)明PARP3分子的組織分布。第1行心；第2行腦；第3行胎盤；第4行肺；第5行肝；第6行骨骼肌；第7行腎；第8行；胰；尺寸標(biāo)準(zhǔn)物(kb)的個(gè)別位置經(jīng)指出。
在圖4中，具不同人組織的Western Blot法在說明在蛋白質(zhì)量下根據(jù)本發(fā)明PARP3分子的組織分布。第1行心；第2行肺；第3行肝；第4行脾；第5行腎；第6行結(jié)腸；第7行肌肉；第8行腦；尺寸標(biāo)準(zhǔn)物(kb)的個(gè)別位置經(jīng)指出。
在圖5中，具不同人組織的Western Blot法在說明根據(jù)本發(fā)明PARP3分子的組織分布。第1行額皮質(zhì)；第2行后皮質(zhì)；第3行小腦；第4行海馬；第5行嗅蕾；第6行紋狀體；第7行丘腦；第8行中腦；第9行側(cè)皮質(zhì)；第10行腦橋；第11行質(zhì)髓；第12行脊髓。
在圖6中，PARP分析法(ELISA)的圖式表示。
在圖7中，PARP分析法(HTRF)的圖式表示。
本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選具體實(shí)施例系述于以下節(jié)中。PARP同系物及功能性相當(dāng)物除非另有說明，為本說明書目的，氨基酸序列經(jīng)指示以N端開始。若為氨基酸使用1字碼時(shí)，然后G為甘氨酸、A為丙氨酸、V為纈氨酸、L為亮氨酸、I為異亮氨酸、S為絲氨酸、T為蘇氨酸、D為天冬氨酸、N為天冬酰氨、E為谷氨酸、Q為谷氨酰胺、W為色氨酸、H為組氨酸、R為精氨酸、P為脯氨酸、K為賴氨酸、Y為酪氨酸、F為苯丙氨酸、C為半胱氨酸及M為甲硫氨酸。
本發(fā)明不限制于上述特異的PARP同系物。相反地，為其功能性相當(dāng)物的那些同系物亦包含在內(nèi)。功能性相當(dāng)物包括天然，例如種特異或器官特異的，及在此所述特異蛋白質(zhì)的人工制備變異體。根據(jù)本發(fā)明的功能性相當(dāng)物由添加、取代、反轉(zhuǎn)、插入和/或刪除人PARP2(SEQ IDNO:2)、人PARP3(SEQ ID NO:4和6)及鼠PARP3(SEQ ID NO:8和10)的1或多個(gè)氨基酸殘基而不同，其至少保守由功能性催化C-端結(jié)構(gòu)域所介導(dǎo)蛋白質(zhì)的NAD-結(jié)合功能。同樣地，優(yōu)選地保守聚(ADP-核糖)生成的催化活性。功能性相當(dāng)物在適當(dāng)時(shí)，亦包括那些變異體，其中與亮氨酸接鏈相似的區(qū)域當(dāng)必要時(shí)保守著。
再者，可能地例如自人PARP2或人PARP3的序列出發(fā)，由那些具相似物理化學(xué)性質(zhì)的氨基酸(容積、堿性、疏水性等)置換一些氨基酸?？赡艿?，例如精氨酸由賴氨酸殘基置換，纈氨酸殘基由異亮氨酸殘基或天冬氨酸殘基由谷氨酸殘基置換。然而，亦可能的在序列中1或多個(gè)氨基酸經(jīng)交換，添加或刪除，或此些方法合并使用。已以此方式自人PARP2或人PARP3序列修飾的蛋白質(zhì)與起始序列有至少60％，優(yōu)選地至少75％，極特別佳地至少85％的同源性，使用皮爾生和利埔曼的互除法計(jì)算，Proc.Natl.Acad.Sci(美國(guó))85(5),1988,2444-2448。
以下的同源性在氨基酸量和DNA量下在人PARP1、2和3間測(cè)定(快速A程式，皮爾生和利埔曼，上引)氨基酸同源性
括弧內(nèi)的數(shù)字指出重疊氨基酸的數(shù)字。
DNA同源性
括弧內(nèi)的數(shù)字指出重疊核苷酸的數(shù)字。
根據(jù)本發(fā)明的多肽可歸類為均相的聚(ADP-核糖)聚合酶，基于在催化結(jié)構(gòu)域區(qū)域的極大相似性。
對(duì)本發(fā)明亦必要地，這種新的PARP同系物不具傳統(tǒng)的鋅指基序。此意味著此些酶不必要涉及DNA修復(fù)或以不同于PARP1的方式修復(fù)，但仍能進(jìn)行其病理機(jī)制(NAD+消耗及因此因ATP消耗的能量消耗)。在Western Blot法中可見的強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)，特別地PARP3，表明它在NAD消耗中的顯著角色。此對(duì)藥物發(fā)展特別重要。根據(jù)本發(fā)明聚合酶的潛在新穎抑制劑因此可抑制病理功能，而對(duì)想要的生理性質(zhì)不具不利作用。此對(duì)目前已知對(duì)抗PARP的抑制劑是不可能的，因?yàn)槠淇偸且嘁种艱NA修復(fù)功能。已知PARP抑制劑的潛在致癌作用因此易于了解。亦可理解地，在設(shè)計(jì)PARP抑制劑使其在高親和力下有效地抑制所有PARP同系物。在這種情形的下，依需要而定的這種潛在作用是可以預(yù)料的。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的PARP同系物及示于SEQ ID NO:2(人PARP2)，有利地自人腦、心、骨骼肌、腎和肝分離。人PARP2在其他組織或器官的表達(dá)明顯地較弱。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的PARP同系物及示于SEQ ID NO:4和6(人PARP3)，可有利地自人腦(在此例中，極佳地自海馬)、心、骨骼肌、肝或腎。人PARP3在其他組織或器官的表達(dá)，如肌肉或肝，明顯地較弱。
熟諳蛋白質(zhì)分離者將利用制備方法的組合，其在各例中最適合自組織中分離根據(jù)本發(fā)明的天然PARP，或自細(xì)胞培養(yǎng)液中重組體制備根據(jù)本發(fā)明的PARP。合適的標(biāo)準(zhǔn)制備方法例如，述于Cooper,T.G.，生物化學(xué)方法，由華特孔拉特出版，柏林，紐約或于Scopes,R.蛋白質(zhì)純化，Springer Verlag，紐約、海德堡、柏林。
本發(fā)明附加地有關(guān)PARP2和PARP3同系物，雖然其可自其他真核生物種分離，即無(wú)脊椎動(dòng)物類或脊椎動(dòng)物類，特別地其他哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、貓、狗、豬、綿羊、牛、馬或猴子，或自其他器官例如心肌分離，其具由根據(jù)本發(fā)明的PARP預(yù)定的必要結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。
特別是，可自人腦分離的人PARP2及其功能性相當(dāng)物為發(fā)展神經(jīng)退化疾病例如中風(fēng)的抑制劑的優(yōu)選劑。因?yàn)榭杉俣ǖ兀赑ARP2作為指示劑的藥物發(fā)展可能地發(fā)展最適合用于人腦的抑制劑。然而，可排除基于PARP2發(fā)展的抑制劑，在其他器官中治療PARP介導(dǎo)的病理狀態(tài)的應(yīng)用(見根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的組織分布)。
與PARP1相似的PARP2及假定地PARP3亦由受傷的DNA活化，但由假定的不同機(jī)制。在DNA修復(fù)的意義是可理解的。根據(jù)本發(fā)明的PARP封阻在如癌癥的指示中亦應(yīng)為有利的(例如在腫瘤病患的放射敏感化中)。
根據(jù)本發(fā)明的PARP及其功能性相當(dāng)物的另一個(gè)必需生物學(xué)性質(zhì)是使與相互作用配偶體結(jié)合的能力為可視的。人PARP2和3不同于自高等真核生物如，特別地哺乳動(dòng)物的前面揭示PARP，在于具潛在所謂亮氨酸拉鏈基序。此為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的典型基序。可能地，此些基序由相互作用配偶體允許PARP活性的調(diào)整。此附加的結(jié)構(gòu)元件因此亦提供可能的起始點(diǎn)，以發(fā)展PARP效應(yīng)物，例如抑制劑。
本發(fā)明因此進(jìn)一步有關(guān)可與PARP2和/或3相互作用的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地那些可引起其活化或去活化者。
本發(fā)明進(jìn)一步有關(guān)蛋白質(zhì)，其仍具上述配體結(jié)合活性，其可自具體公開的氨基酸序列開始經(jīng)定向修飾制備。
可能地采用自根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的肽序列出發(fā)制備合成合成肽，單獨(dú)或組合，作為產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體的抗原。亦可能地，采用PARP蛋白質(zhì)或其片段以生成抗體。本發(fā)明因此亦有關(guān)根據(jù)本發(fā)明PARP蛋白質(zhì)的肽片段，其包括特性化部分序列，特別地那些寡或多肽者，其包括至少一個(gè)上述的序列基序。此型的片段可例如由蛋白水解消化PARP蛋白質(zhì)或由肽的化學(xué)合成獲得。新穎特異的PARP2和PARP3結(jié)合配偶體對(duì)抗根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性和優(yōu)選地選擇性抑制劑使用上述為PARP2和PARP3的結(jié)合配偶體的特異分析法系統(tǒng)發(fā)展。此些抑制劑視情況亦相對(duì)PARP1有效。
根據(jù)本發(fā)明提供的抑制劑對(duì)PARP2具強(qiáng)抑制活性。Ki值在此例中可少于約1000納摩爾濃度，如少于約700納摩爾濃度，少于約200納摩爾濃度或少于約30納摩爾濃度，例如約1至20納摩爾濃度。
根據(jù)本發(fā)明的抑制劑亦可對(duì)PARP2具驚人的選擇性。此由根據(jù)本發(fā)明如此抑制劑的Ki(PARP1)∶Ki(PARP2)比值所示，其例如大于3或大于5，如例如大于10或大于20。
應(yīng)提及的實(shí)例為4-(N-(4-羥基苯基)胺基甲基)-(2H)-2,3二氮雜萘-1-酮。此及其他類似化合物的制備可根據(jù)以下進(jìn)行Puodzhyunas等人，Pharm.Chem.J.1973,7,566或Mazkanowa等人，Zh.Obshch.Khim.,1958,28,2798或Mohamed等人，Ind.J.Chem.B.,1994,33,769,各自引入作為參考。
以上鑒定的化合物顯示PARP2的Ki值為113納摩爾濃度及相對(duì)于PARP3，對(duì)PARP2有8倍選擇性。編碼PARP同系物的核酸除非另有說明，核苷酸序列在本說明書系指示自5′至3′方向。
本發(fā)明進(jìn)一步有關(guān)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列，特別地那些具在SEQ ID NO:2、4、6、8和10中描述的氨基酸序列者，但不限于此。根據(jù)本發(fā)明可使用的核酸序列亦包括等位基因變異體，如以上所述為氨基酸序列，其可由刪除、反轉(zhuǎn)、插入、添加和/或取代核苷酸獲得，優(yōu)選地在SEQ ID NO:1、3、7和9中所示的核苷酸，但必要地保守相對(duì)應(yīng)基因產(chǎn)物的生物性質(zhì)和生物活性?？墒褂玫暮塑账嵝蛄欣缈捎蓪?dǎo)致沉默的核苷酸取代(而未改變氨基酸序列)或保守氨基酸變化的核苷酸取代(交換相似尺寸、電荷、極性或溶解度的氨基酸)獲得。
根據(jù)本發(fā)明的核酸序列亦包含基因的功能性相當(dāng)物，如真核生物同源物，例如自非脊椎動(dòng)物如Caenorhabditis如果蠅，或脊椎動(dòng)物，優(yōu)選地自上述的哺乳動(dòng)物。優(yōu)選的基因?yàn)槟切┳约棺祫?dòng)物者，其編碼具如上述的本發(fā)明必要性質(zhì)的基因產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明的核酸可以傳統(tǒng)方式由不同途徑獲得例如，基因組或cDNA庫(kù)可篩選編碼PARP分子或其部分的DNA。例如，自人腦、心或腎獲得的cDNA庫(kù)可以合適的探針篩選標(biāo)記的單鏈DNA片段，其與合適長(zhǎng)度選自SEQ ID NO:1或3的部分序列，或與其互補(bǔ)的序列相對(duì)應(yīng)。為此目的，可能地例如已轉(zhuǎn)移至合適克隆載體的DNA庫(kù)片段，在轉(zhuǎn)化至細(xì)菌后，在瓊脂板上涂板培養(yǎng)?？寺∪缓筠D(zhuǎn)至硝酸纖維素濾紙，及在DNA變性后，與標(biāo)記探針雜交。陽(yáng)性克隆然后經(jīng)分離及特性化。
編碼根據(jù)本發(fā)明的PARP同系物或部分片段的DNA亦可自本發(fā)明內(nèi)含的序列資料開始而化學(xué)合成。例如，可能地為此目的，具約100個(gè)堿基長(zhǎng)度的寡核苷酸以本質(zhì)上已知的方式，由例如提供合適的末端限制裂解位點(diǎn)而合成及依序連結(jié)。
根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列亦可藉聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)制備。為此，靶物DNA，例如自合適長(zhǎng)度克隆的DNA與一對(duì)合成寡核苷酸引物雜交，其具約15個(gè)堿基的長(zhǎng)度及其結(jié)合至靶物DNA的相反端。位在其間的序列區(qū)段然后以DNA聚合酶填入。此循環(huán)重復(fù)許多次使靶物DNA擴(kuò)增(參閱懷特等人(1989)，基因?qū)W趨勢(shì)5,185)。
根據(jù)本發(fā)明的核酸序列亦當(dāng)然地包括截短序列、編碼和非編碼的單鏈DNA或RNA、互補(bǔ)DNA序列、mRNA序列及自其衍生的cDNA。
本發(fā)明進(jìn)一步包括在嚴(yán)格條件下與以上序列雜交的核苷酸序列。嚴(yán)格的雜交條件，為本發(fā)明目的，在雜交序列具約70至100％同源性時(shí)存在，例如約80至100％或90至100％(優(yōu)選地至少約40，例如約50、100、150、200、400或500個(gè)氨基酸的氨基酸區(qū)段中)。
篩選DNA，特別地cDNA庫(kù)的嚴(yán)格條件在雜交混合液以0.1XSSC緩沖液(20XSSC緩沖液=3摩爾濃度NaCl、0.3摩爾濃度檸檬酸鈉，pH7.0)和0.1％SDS在約60℃的溫度下清洗時(shí)存在。
Nothern Blot分析，例如，在約65℃的溫度以0.1X SSC,0.1％SDS的嚴(yán)格條件下分析及清洗。核酸衍生物及表達(dá)構(gòu)建物核酸序列當(dāng)然地亦包括衍生物，例如啟動(dòng)子變異體或可替代性的剪切變異體。操作地連結(jié)至根據(jù)本發(fā)明核苷酸序列上游的啟動(dòng)子可再由核苷酸添加或取代、反轉(zhuǎn)、插入和/或刪除修飾，但不減弱啟動(dòng)子的功能性或活性。啟動(dòng)子亦可由修飾其序列而具增加的活性，或由更有效的啟動(dòng)子，甚至來(lái)自異種生物的啟動(dòng)子，完全取代。上述的啟動(dòng)子可經(jīng)用以制備根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒。
可提及的人PARP2剪接變異體的特定實(shí)例為變異體人PARP2a刪除堿基對(duì)766至904(參閱SEQ ID NO:1)。此導(dǎo)致具新的終止密碼子的移碼(“TAA”相對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的核苷酸922至924)。
變異體人PARP 2b在核苷酸204(SEQ ID NO:1)后插入5′-gta tgc cag gaa ggt cat ggg cca gca aaa ggg tct ctg-3′。這樣一來(lái)，以插入物GMPGRSWASKRVS延伸氨基酸序列核酸衍生物亦指變異體，其在起始密碼子前面自-1至-1000區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列已經(jīng)修飾，使基因表達(dá)和/或蛋白質(zhì)表達(dá)增加。
除上述的核苷酸序列外，根據(jù)本發(fā)明可使用的核酸構(gòu)建物在功能性、操作連結(jié)中已包括1或多個(gè)其他的調(diào)節(jié)序列，如啟動(dòng)子、擴(kuò)增信號(hào)、增強(qiáng)子、聚腺苷化序列、復(fù)制起點(diǎn)、報(bào)告基因、可選定標(biāo)記基因及類似物。此連結(jié)可，根據(jù)所要的用途，導(dǎo)致基因表達(dá)的增加或降低。
在新穎調(diào)節(jié)序列的外，可能地天然調(diào)節(jié)序列仍存在于真實(shí)結(jié)構(gòu)基因前面。此天然調(diào)節(jié)可在適當(dāng)時(shí)由基因修飾而關(guān)閉，以增加或降低的基因表達(dá)。然而，基因構(gòu)建物亦可具更簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，即無(wú)附加的調(diào)節(jié)信號(hào)插在結(jié)構(gòu)基因前面，及具其調(diào)節(jié)的天然啟動(dòng)子并未經(jīng)刪除。或者，天然調(diào)節(jié)序列以一種方式突變，使調(diào)節(jié)不再發(fā)生，及基因表達(dá)經(jīng)增強(qiáng)或消弱。亦可能地在核酸序列的3′端上插入附加的有利的調(diào)節(jié)元件。核酸序列可以在基因構(gòu)建物中以1或多拷貝存在。
根據(jù)本發(fā)明表達(dá)方法的有利調(diào)節(jié)序列例如存在于啟動(dòng)子中，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIg、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、1-PR或1-PL啟動(dòng)子，其有利地用于革蘭氏陰性菌中。其他有利調(diào)節(jié)序列系存在于例如革蘭氏陽(yáng)性啟動(dòng)子amy和SPO2中，于酵母啟動(dòng)子ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH中或在植物啟動(dòng)子CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nos中或在遍在蛋白或菜豆蛋白啟動(dòng)子中。
可能地原則上使用具其調(diào)節(jié)序列的所有天然啟動(dòng)子。亦可能及有利地使用合成的啟動(dòng)子。
那些調(diào)節(jié)序列意在使核酸序列的特定表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)成為可能。此指例如，基于宿主生物，基因僅在誘導(dǎo)后表達(dá)或過度表達(dá)，或其立即表達(dá)和/或過度表達(dá)。
調(diào)節(jié)序列或因子優(yōu)選地可再對(duì)表達(dá)具正面影響，及因此增加或降低。因此，調(diào)節(jié)元件的增強(qiáng)可有利地在轉(zhuǎn)錄階段發(fā)生，藉使用強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。然而，可能地由例如，改進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性而增強(qiáng)轉(zhuǎn)譯作用。
增強(qiáng)子指例如DNA序列經(jīng)RNA聚合酶和DNA間的改進(jìn)相互作用而增加表達(dá)。
重組核酸構(gòu)建物或基因構(gòu)建物，為在合適的宿主生物中表達(dá)，有利地插入宿主特異的載體中，其使基因在宿主中最適表達(dá)成為可能。載體對(duì)熟悉熟諳此技藝者系熟知的及可見于例如“克隆載體”(Pouwels P.H.等人，編者，Elsevier，阿姆斯特丹-紐約-牛津，1985)。除質(zhì)粒外，載體亦指熟諳此技藝者所知的所有其他載體，例如噬菌體、病毒如SV40、CMV、桿病毒和腺病毒、轉(zhuǎn)座子、IS元件、粘粒、柯斯質(zhì)粒及線性或環(huán)狀DNA。此些載體可在宿主生物或染色體復(fù)制中經(jīng)歷自我復(fù)制。構(gòu)建物的表達(dá)上述根據(jù)本發(fā)明的重組構(gòu)建物有利地導(dǎo)入合適的宿主系統(tǒng)中表達(dá)。熟諳此技藝者所熟悉的克隆與轉(zhuǎn)移感染方法優(yōu)選地使用，以期使那些核酸在特殊表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。合適的系統(tǒng)描述于例如分子生物學(xué)的目前實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，F(xiàn).Ausubel等人，編者，懷尼內(nèi)科學(xué)，紐約，1997。
合適的宿主生物原則上為所有生物，其可能地表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸、其對(duì)偶基因變異體、其功能性相當(dāng)物或衍生物或重組核酸構(gòu)建物。宿主生物指例如細(xì)菌、真菌、酵母、植物或細(xì)胞。優(yōu)選的生物為細(xì)菌，如大腸桿菌屬，例如大腸桿菌、鏈霉屬、芽孢桿菌屬或假單孢菌屬，真核微生物如啤酒酵母菌、霉菌屬，動(dòng)物或植物的高等真核生物的細(xì)胞，例如Sf9或CHO細(xì)胞。
基因產(chǎn)物亦可在需要時(shí)在導(dǎo)入外來(lái)基因生物中表達(dá)，如導(dǎo)入外來(lái)基因的動(dòng)物，如特別地小鼠、綿羊或?qū)胪鈦?lái)基因植物。導(dǎo)入外來(lái)基因生物亦可為所謂“剔除”的動(dòng)物或植物，其中相對(duì)應(yīng)的基因關(guān)閉，例如由突變或部分或完全刪除。
宿主生物和此些生物適當(dāng)?shù)妮d體如質(zhì)粒、病毒或噬菌體，例如具RNA聚合酶/啟動(dòng)子系統(tǒng)的質(zhì)粒、噬菌體λ、μ或其他溫和噬菌或轉(zhuǎn)座子和/或其他有利的調(diào)節(jié)序列的組合，形成表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)一詞優(yōu)選地指，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO細(xì)胞和載體如pcDNA3neo載體的組合，其載體適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
如上述，基因產(chǎn)物亦可有利地在導(dǎo)入外來(lái)基因動(dòng)物，例如小鼠、綿羊或?qū)胪鈦?lái)基因植物中表達(dá)。同樣可能地計(jì)劃進(jìn)行以自核酸衍生的RNA的無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)。
基因產(chǎn)物亦可以治療或診斷合適的片段形式表達(dá)。為分離重組蛋白質(zhì)，可能和有利地使用載體系統(tǒng)或寡核苷酸，其由一些核苷酸序列而延伸cDNA因此編碼供作簡(jiǎn)化純化的修飾多肽。此些的合適修飾例如為所謂標(biāo)志，其作為錨著物著物，例如稱為六組氨酸錨著物的修飾，或可由抗體識(shí)別為抗原的抗原決定部位(例如述于Harlow,E.和Lane,D.,1988，抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)。冷泉港(紐約)出版社)。此些錨著物可用以連結(jié)蛋白質(zhì)至固體支持物，例如聚合物基質(zhì)，其可例如填充至層析柱中，或至微滴度板或至另一個(gè)支持物。
此些錨著物亦可在同時(shí)用以識(shí)別蛋白質(zhì)。亦可能地使用識(shí)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)標(biāo)記如螢光染劑、酶標(biāo)記，其在與底物反應(yīng)后形成可檢測(cè)的反應(yīng)產(chǎn)物，或放射性標(biāo)記、單獨(dú)或聯(lián)結(jié)著衍生化蛋白質(zhì)的錨著物。抗體的制備抗-PARP2抗體以熟諳此技藝者熟悉的方式制備?？贵w指多克隆、單克隆、人或人化抗體或其片段，單鏈抗體或亦指合成抗體，同樣地抗體片段如Fv、Fab和F(ab′)2。合適的制備方法例如述于Campbell,A.M.,單克隆抗體技術(shù)，(1987)Elsevier Verlag，阿姆斯特丹、紐約、牛津及于Breitling,F.和Dubel,S.,重組抗體(1997)，SpektrumAkademischer Verlag，海德堡。編碼序列的進(jìn)一步用途本cDNA附加地提供克隆新穎PARP基因的基因組序列基礎(chǔ)。此亦包括相關(guān)的調(diào)節(jié)或啟動(dòng)子序列，其例如可由定序位在根據(jù)本發(fā)明的cDNA5′上游或位在基因插入序列的區(qū)域獲得。cDNA序列資訊亦藉已知方法的助為制備反義分子或核糖酶的基礎(chǔ)(參閱Jones,J.T.和Sallenger,B.A.(1997)Nat.Biotechnol.15,902；Nellen,W.和Lichtenstein,C.(1993)TIBS,18,419)?；蚪MDNA同樣地用以制備上述的基因構(gòu)建物。
使用核苷酸序列或其部分的另一個(gè)可能性在產(chǎn)生導(dǎo)入外來(lái)基因動(dòng)物。在合適動(dòng)物模型中序列資訊的導(dǎo)入外來(lái)基因過度表達(dá)或基因剔除可提供進(jìn)一步有價(jià)值的資訊，有關(guān)新穎基因的(病)生理學(xué)。治療應(yīng)用在普遍缺乏根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的情況中，可能地采用一些置換方法。一方面，天然或重組蛋白質(zhì)可以其編碼核酸(DNA或RNA)直接或由基因療法施用?？赡艿厥褂脼榇说娜魏魏线m載體，例如病毒和非病毒載體。合適的方法例如述于由Strauss和Barranger的基因療法概念(1997),Walter de Gruyter，出版商。另一個(gè)可替代法系由合適的藥劑刺激內(nèi)源基因提供。
亦可能地例如由蛋白酶封阻根據(jù)本發(fā)明PARP的周轉(zhuǎn)(turn over)或去活化。最后，根據(jù)本發(fā)明PARP的抑制劑或拮抗劑可采用。
在PARP過量存在或過度活化的情況中，不同類型的抑制劑可采用。此抑制可由反義分子、核糖酶、寡核苷酸或抗體，及由低分子量化合物達(dá)成。
根據(jù)本發(fā)明的活性物質(zhì)，即PARP蛋白質(zhì)、核酸和PARP結(jié)合配偶體例如抗體或調(diào)節(jié)劑，可以單一治療活性物質(zhì)或以與其他治療活性物質(zhì)的混合物施用。其可以如此施用，但通常其以醫(yī)藥組合物形式施用，即以活性物質(zhì)與至少一種合適醫(yī)藥載體或稀釋劑的混合物?；钚晕镔|(zhì)或組合物可以適合特殊治療目的的任何方式，例如口服或腸外施用。
醫(yī)藥組合物和醫(yī)藥載體或稀釋劑的本質(zhì)依所要的施用模型而定。口服組合物可例如為片劑或膠囊的形式，及可含慣用賦形劑如粘合劑(例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、黃蓍膠或聚乙烯基吡咯烷酮)、填充劑(例如乳糖、糖、玉米淀粉。磷酸鈣、山梨糖醇或甘氨酸)、潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇或二氧化硅)、崩解劑(例如淀粉)或濕潤(rùn)劑(例如月桂基硫酸鈉)。口服液體產(chǎn)物可為水性或油性懸浮液、溶液、乳化液、糖漿、酏劑或噴霧劑等的形式，或可為干粉形式，供以水或另一種合適載體復(fù)原。此些形式的液體產(chǎn)物可含傳統(tǒng)添加物，例如懸浮劑、香味劑、稀釋劑或乳化劑?？赡艿夭捎媚c外施用溶液或懸浮液及傳統(tǒng)的醫(yī)藥載體。根據(jù)本發(fā)明活性物質(zhì)的腸外施用有利地使用液醫(yī)藥組合物進(jìn)行，其可以腸外，特別地靜脈內(nèi)施用。此在適合此目的的醫(yī)藥可接受載體中優(yōu)選地含有效量的至少一種活性物質(zhì)，優(yōu)選地以溶解形式。適合此目的的醫(yī)藥載體實(shí)例特別地為水溶液，例如生理鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏液、林格氏乳酸溶液及類似物。再者，組合物可含進(jìn)一步添加物如抗氧化劑、螯合劑或抗微生物劑。
在各例中根據(jù)本發(fā)明活性物質(zhì)劑量的選定及特殊施劑時(shí)程系為治療醫(yī)師的決定。后者將選擇合適的劑量及適當(dāng)?shù)氖﹦r(shí)程，根據(jù)選定的施用途徑、在各例中醫(yī)藥的效力、要治療疾病的本質(zhì)和嚴(yán)重性及病人的狀況和其對(duì)治療的反應(yīng)。因此，例如藥理活性物質(zhì)可以約0.5毫克至約100毫克每千克體重和天的劑量施至哺乳動(dòng)物(人或動(dòng)物)。其可以單一劑量或以多次劑量施用。非治療應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的核酸，例如cDNA、基因組DNA、啟動(dòng)子和多肽及其部分片段，亦可以重組成非重組形式使用，供發(fā)展不同的試驗(yàn)系統(tǒng)。
例如，可能地建立試驗(yàn)系統(tǒng)，其在試驗(yàn)物質(zhì)存在下適合測(cè)定啟動(dòng)子或蛋白質(zhì)的活性。在此例中測(cè)定的方法優(yōu)選地簡(jiǎn)單的，例如比色測(cè)定、發(fā)光測(cè)定、熒光測(cè)定、免疫或放射性方法，及優(yōu)選地允許要快速測(cè)定的大數(shù)目試驗(yàn)物質(zhì)。此型的試驗(yàn)系適合及有利地供所謂高產(chǎn)量篩選。此些試驗(yàn)系統(tǒng)允許試驗(yàn)物質(zhì)就其結(jié)合至其激動(dòng)、拮抗或抑制根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。
在人體中測(cè)定根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)或其潛在mRNA的量、活性和分布可用以診斷、以測(cè)定傾向及以監(jiān)測(cè)一些疾病。同樣地，cDNA序列及基因序列可提供有關(guān)一些疾病的基因素因和傾向資訊?？赡艿貫榇四康氖褂枚喾N類和形式的DNA/RNA探針和抗體。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列或其部分可進(jìn)一步以適當(dāng)探針的形式使用，以檢測(cè)點(diǎn)突變、刪除或插入。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)可進(jìn)一步用以鑒定及分離其天然配體或相互作用配偶體。根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)可附加地用以鑒定和分離人工或合成的配體。為此目的，重組制備或純化的天然蛋白質(zhì)可以一種方式衍生化，即其具允許連結(jié)至支持物物質(zhì)的修飾。以此方式結(jié)合的蛋白質(zhì)可與不同分析物溫孵，例如蛋白質(zhì)萃取物或肽庫(kù)或其他來(lái)源的配體。特異結(jié)合的肽、蛋白質(zhì)或低分子量、非蛋白質(zhì)物質(zhì)可以此方式分離和特性化。非蛋白質(zhì)物質(zhì)指例如低分子量化學(xué)物質(zhì)，其例如可源自傳統(tǒng)藥物合成或自所謂物質(zhì)庫(kù)，其經(jīng)組合地合成。
使用的蛋白質(zhì)萃取物系例如衍生自植物的均質(zhì)物或植物的部分、微生物、人或動(dòng)物組織或器官。
配體或相互作用配偶體亦可由如酵母2-雜交系統(tǒng)的方法鑒定(Fields,S.和Song,O.(1989)自然，340,245)?？稍诖死胁捎玫谋磉_(dá)庫(kù)可例如衍生自人組織，例如腦、心、腎等。
根據(jù)本發(fā)明的核酸序列及由編碼的蛋白質(zhì)可予采用以發(fā)展試劑、激動(dòng)劑和拮抗劑或抑制劑，以診斷和治療與活化表達(dá)根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)序列的一，例如其增加或降低表達(dá)有關(guān)的慢性和急性疾病。發(fā)展的試劑、激動(dòng)劑、拮抗劑或抑制劑其后可用以產(chǎn)生治療或診斷疾病的醫(yī)藥制備物?？赡芘c此相關(guān)的疾病實(shí)例為以下者腦、外周神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)或眼睛、膿毒性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、急性腎衰竭或癌癥。
根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)在那些指示的相關(guān)性系使用特定的抑制劑在相關(guān)的動(dòng)物模型中確認(rèn)。
本發(fā)明現(xiàn)藉參閱以下實(shí)施例而詳細(xì)說明。實(shí)施例1:PARP2和PARP3 cDNA的分離本cDNA序列第1次被發(fā)現(xiàn)于自人腦cDNA庫(kù)的cDNA克隆序列分析上(人腦5′伸展加上cDNA庫(kù)，#HL3002a，克隆技術(shù))。小鼠PARP3克隆自“λ三重小鼠腦cDNA庫(kù)”分離(選擇技術(shù)貨號(hào)ML5004t)。此些克隆的序列描述于SEQ ID NO:1、3、7和9。實(shí)施例2:PARP2和PARP3在人體組織的表達(dá)人PARP2和PARP3的表達(dá)在12個(gè)不同人體組織中由NorthernBlot分析法探討。由克隆技術(shù)供應(yīng)的多量組織Northern Blot(MTNTM)(#7760-1和#7780-1)為此目的與RNA探針雜交。探針由相對(duì)應(yīng)的人PARP2和人PARP3 cDNA在地高辛-標(biāo)記核苷酸存在下，與廠商的方法一致地體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生(BOEHRINGER MANNHEIM DIG簡(jiǎn)單雜交貨號(hào)1603 558,RNA:RNA雜交的DIG簡(jiǎn)單雜交方法)。實(shí)驗(yàn)計(jì)劃經(jīng)修飾以進(jìn)行與添加鯡魚精子DNA(10毫克/毫升雜交溶液)的預(yù)雜交2×1h。雜交與添加鯡魚精子DNA(10毫克/毫升雜交溶液)然后進(jìn)行過夜。條帶使用CDP-星實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(BOEHRINGER MANNHEIM CDP-星TM貨號(hào)1685 627)檢測(cè)。
嚴(yán)格清洗后，PARP2的轉(zhuǎn)錄本主要在人腦、心、骨骼肌、腎和肝中檢出。約1.9kb的轉(zhuǎn)錄本尺寸與cDNA測(cè)定的長(zhǎng)度(1.85kb)相對(duì)應(yīng)(參閱圖2(A))。
在其他組織或器官中，人PARP2表達(dá)系相當(dāng)?shù)厝酢?br> 嚴(yán)格清洗后，PARP3的轉(zhuǎn)錄本主要在心、腦、腎、骨骼肌和肝中檢出。在其他組織(胎盤、肺、胰)中表達(dá)系明顯較弱(參閱圖2(B))。人PAPR3至少有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其假定地可由不同聚腺苷化部位或可替代剪接解釋。其尺寸(分別地約2.2kb和2.5kb)與cDNA測(cè)定的長(zhǎng)度(2.3kb)相對(duì)應(yīng)。清洗以0.2×SSC/0.2％SDS在室溫下進(jìn)行2×15分及然后以0.1×SSC/0/1％SDS在65℃下2×15分(自20×SSC:3摩爾濃度NaCl,0.3摩爾濃度檸檬酸鈉，pH7.0制備)。
以下的肽由合成法以熟諳抗體制備者所熟悉的方式制備。在一些例中，半胱氨酸殘基經(jīng)連結(jié)至序列的N或C端，以期促進(jìn)偶合至KLH(匙孔槭血藍(lán)蛋白)。PARP-2:NH2-MAARRRRSTGGGRARALNES-CO2H(氨基酸1-20；SEQ ID NO:23)NH2-KTELQSPEHPLDQHYRNLHC-CO2H(氨基酸335-353；SEQ ID NO:24)PARP-3:NH2-CKGRQAGREEDPFRSTAEALK-CO2H(氨基酸25-44；SEQ ID NO:25)NH2-CKQQIARGFEALEALEEALK-CO2H(氨基酸230-248；SEQ ID NO:26)抗PARP3抗體的制備經(jīng)述為代表性樣品。
多株抗體使用具肽序列H2N-KQQIARG-FEALEALEEALK-CO2H(SEQ ID NO:27)(人PARP3蛋白質(zhì)序列的氨基酸230-248)的合成肽在兔子中產(chǎn)生人PARP3。相對(duì)應(yīng)的小鼠序列在此區(qū)域僅以1個(gè)氨基酸不同(H2N-KQQIARGFEALEALEEAMK-CO2H；SEQ IDNO:28)。半胱氨酸亦連結(jié)至N端，以期可能地使蛋白質(zhì)偶合至KLH。
兔子以KLH-肽共軛物在7-14天時(shí)段下免疫化總計(jì)5次。得到抗血清使用抗原經(jīng)親和力純化。特異IgG級(jí)分自血清使用個(gè)別肽分離，為此目的，其以熟諳此技藝者所熟知的方式先固定在親和層析柱上。個(gè)別抗血清經(jīng)載入此親和層析柱，及未特異吸收的蛋白質(zhì)以緩沖液溶析。特異結(jié)合IgG級(jí)分以0.2摩爾濃度甘氨酸/HCl緩沖液pH2.2溶析。pH立即使用1摩爾濃度TRIS/HCl緩沖液調(diào)至pH7.5。含IgG級(jí)分的洗脫液與飽合硫酸銨溶液混合1∶1(體積)及在+4℃下培養(yǎng)30分以完成沉淀。生成的沉淀物在10,000g下離心及，在除去上清液，溶于最小量的PBS/TBS。生成的溶液然后對(duì)PBS/TBS以比值1∶100(體積)透析?？贵w經(jīng)調(diào)至約100微克IgG/毫升的濃度。以此方式純化的PARP3抗體具對(duì)PARP3的高特異性。雖然小鼠PARP3經(jīng)識(shí)別良好，但與PARP1或PARP2并無(wú)可見的相互作用。實(shí)施例4組織分布由免疫印跡(Western Blot)分析在蛋白質(zhì)階段下的組織分布亦為PARP2和PARP3由免疫印跡(Western Blot)分析法探討。為蛋白質(zhì)凝膠的小鼠組織的制備組織或細(xì)胞使用Potter或Ultra-Turrax勻漿。為此，0.5克組織(或細(xì)胞)在5毫升緩沖液(10毫摩爾濃度Tris-HCl pH7.5,1毫摩爾濃度EDTA,6毫摩爾濃度MgCl2)、1片蛋白酶抑制劑雞尾酒(BoehringerMannheim，貨號(hào)1836153)和benzonase(純度級(jí)Ⅰ，默克)中在37℃下培養(yǎng)30分。制備小鼠的心、肺、肝、脾、腎、腸、肌肉、腦及人胎盤腎細(xì)胞(HEK293，人胎盤腎)的組織樣品。蛋白質(zhì)凝膠由NOVEX供應(yīng)的NuPAGE系統(tǒng)根據(jù)蛋白質(zhì)凝膠的指導(dǎo)使用。聚丙烯酰胺凝膠(NuPAGE4-12％BisTris,NOVEX NP 0321)、展開緩沖液(MES-展開緩沖液，NOVEX NP 0002)、抗氧化劑(NOVEX NP0005)、蛋白質(zhì)尺寸標(biāo)準(zhǔn)物(多標(biāo)記顏色標(biāo)準(zhǔn)物，NOVEX LC 5725)、樣品緩沖液(NuPAGE LDS樣品緩沖液(4X),NOVEX NP 0007)經(jīng)使用。凝膠在200伏特的電壓下展開45分。Western Blot法Western Blot法使用NOVEX系統(tǒng)與指導(dǎo)一致地進(jìn)行。硝酸纖維素膜(硝酸纖維素孔徑45微米，NOVEX LC 2001)經(jīng)使用。轉(zhuǎn)移在200毫安培的電流下耗時(shí)1小時(shí)。轉(zhuǎn)移緩沖液包括50毫升轉(zhuǎn)移緩沖濃縮液(NOVEX NP 0006)、1毫升抗氧化劑(NOVEX NP 0002)、100毫升分析級(jí)甲醇及849毫升二次蒸餾水。
除以此方式制備的印跡外，亦使用的是預(yù)制的印跡，例如自Chemicon(小鼠腦印跡，Chemicon，目錄號(hào)NS 106具組織1．前皮質(zhì)，2．后皮質(zhì)，3．小腦，4．海馬，5．嗅蕾，6．紋狀體，7．丘腦，8．中腦，9．側(cè)皮質(zhì)，10．腦橋，11．髓質(zhì)，12．骨髓)。與PARP3的抗體反應(yīng)Western Blot法在TBST(TBS+0.3％吐溫20)中以5％干乳粉封阻至少5小時(shí)(TBS:100毫摩爾濃度Tris pH7.5,200毫摩爾濃度NaCl)。與第一抗體的抗體反應(yīng)(稀釋1∶1000)在TBST中以5％干乳粉(見以上)在溫和攪拌(垂直旋轉(zhuǎn)器)下在室溫下進(jìn)行至少2小時(shí)或在4℃下過夜。此接著在TBST中清洗3次5分。與第二抗體(抗兔IgG，過氧化酶偶合，SIGMAA-6154，稀釋1∶2000)的培養(yǎng)在TBST中以5％干乳粉進(jìn)行1小時(shí)。此接著清洗3次，每次如上5分。其后的檢測(cè)系基于化學(xué)發(fā)光法，使用超光輝套組(皮爾斯，信號(hào)光輝化學(xué)發(fā)光底物34095)，如由廠商所述?！癓umi-膜”(化學(xué)發(fā)光檢測(cè)膜，Boehringer貨號(hào)1666916)經(jīng)使用。膜經(jīng)展現(xiàn)約2(X-射線展開劑濃縮物，ADEFO-Chemie GmbH)、水合、固定約4分(酸固定85克/升/AGFA)、水合及然后干燥。
純化由熟諳此技藝者所熟悉的蛋白質(zhì)純化古典方法進(jìn)行，以適當(dāng)?shù)奶禺惪贵w檢測(cè)酶。在一些例中，蛋白質(zhì)亦在3-胺基苯酰胺親和層析柱上如述地經(jīng)親和力純化(Burtscher等人，Anal Biochem 1986,152:285-290)。純度為＞90％。實(shí)施例6測(cè)定PARP2和PARP3的活性及效應(yīng)物在PARP1、PARP2和PARP3上抑制作用的分析法系統(tǒng)a)對(duì)抗聚(ADP-核糖)的抗體制備可能地使用聚(ADP-核糖)作為抗原以產(chǎn)生抗聚(ADP-核糖)抗體。抗聚(ADP-核糖)抗體的制備系述于文獻(xiàn)中(Kanai Y等人(1974)BiochemBiophys Res Comm 59:1,300-306；Kawamaitsu H等人(1984)生物化學(xué)23,3771-3777；Kanai Y等人(1978)免疫學(xué)34,501-508)。
以下特別地經(jīng)使用抗聚(ADP-核糖)抗體(多克隆抗血清，兔子)，BIOMOL；貨號(hào)SA-276，抗聚(ADP-核糖)抗體(單克隆，小鼠，克隆10H；融合瘤上清液，親和力純化)。
自融合瘤上清液獲得的抗血清或單克隆抗體由蛋白質(zhì)A親和力層析法以熟諳此技藝者所熟悉的方式純化。b)ELISA材料ELISA顏色試劑TMB混料，SGMA T-854096孔微滴度板(FALCON微試驗(yàn)ⅢTM彈性分析盤，#3912)經(jīng)涂以組蛋白(SIGMA,H-7755)。組蛋白為此目的以50微克/毫升的濃度溶于碳酸鹽緩沖液(0.05摩爾濃度Na2HCO；pH9.4)。微滴度板的個(gè)別孔各與150微升此組蛋白溶液在室溫下培養(yǎng)至少2小時(shí)或4℃下過夜。孔然后由添加150微升1％BSA在碳酸鹽緩沖液的溶液(SIGMA,A-7888)在室溫下封阻2小時(shí)。此接著以清洗緩沖液(0.05％吐溫10在1xPBS；PBS(磷酸鹽緩沖鹽水；Gibco，貨號(hào)10010):0.21克/升KH2PO4、9克/升NaCl、0.726克/升Na2HPO4·7H2O,pH7.4)的3次清洗步驟。清洗步驟全在微滴度板清洗器(“哥倫布”微滴度板清洗器，SLT-實(shí)驗(yàn)室儀器，澳洲)中進(jìn)行。
酶反應(yīng)所需的是酶反應(yīng)溶液及底物溶液，在各例中為預(yù)混料。此些溶液的絕對(duì)量依所要分析孔數(shù)數(shù)目而定。
酶反應(yīng)溶液每孔的組成-4微升PARP反應(yīng)緩沖液(1摩爾濃度Tris-HCl pH8.0,1.00毫摩爾濃度MgCl2,10毫摩爾濃度DTT)-20納克PARP1(人或牛)或8納克PARP2(人或小鼠)-4微升活化DNA(1毫克/毫升；SIGMA,D-4522)-H2O至40微升底物溶液每孔的組成-5微升PARP反應(yīng)緩沖液(10x)-0.8微升DNA溶液(10毫摩爾濃度，SIGMA N-1511)-44微升水抑制劑經(jīng)溶于1xPARP反應(yīng)緩沖液。偶而在較高濃度時(shí)用MDSO溶解抑制劑最多至2％的終濃度。為酶反應(yīng)，40微升的酶反應(yīng)溶液在導(dǎo)入各孔中及與10微升抑制劑溶液培養(yǎng)10分。然后由各孔中加入50微升底物溶液開始酶反應(yīng)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行30分及然后由清洗緩沖液清洗3次中止。
采用的初始抗體為以1∶5000稀釋的特異抗聚(ADP-核糖)抗體。稀釋在抗體緩沖液(1％BSA在PBS；0.05％吐溫20)中進(jìn)行。第一抗體的培養(yǎng)時(shí)間在室溫下為1小時(shí)。在其后以清洗緩沖液清洗3次后，與以1∶10,000稀釋在抗體緩沖液的第二抗體(抗小鼠IgG,Fab片段，過氧化酶偶合，Boehringer Mannheim，貨號(hào)1500.686；抗兔IgG，過氧化酶偶合，SIGMA，貨號(hào)A-6154)在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。以清洗緩沖液清洗3次后接著為顏色反應(yīng)，各孔使用100微升顏色試劑(TMB混料，SIGMA)在室溫下約15分。顏色反應(yīng)由添加100微升2摩爾濃度H2SO4中止。其后接著在ELISA板閱漢機(jī)(EAR340AT“易讀機(jī)”，SLT-實(shí)驗(yàn)室儀器，澳洲)中立即測(cè)定(450納米對(duì)620納米)。測(cè)定原理系圖式說明于圖6中。
用不同濃度繪制量效曲線，以確定抑制劑的Ki值。對(duì)特別的抑制劑濃度數(shù)值以一式三份獲得。算術(shù)平均值使用微軟Excel決定。IC50使用Microcal(原點(diǎn)軟件(第5.0版)決定(“S形調(diào)配”)。IC50值的換算系以此方式計(jì)算為Ki值，由使用“校準(zhǔn)抑制劑”進(jìn)行?！靶?zhǔn)抑制劑”亦在各分析中測(cè)定?！靶?zhǔn)抑制劑”的Ki值在相同的分析法系統(tǒng)中由以熟諳此技藝者所熟悉的方式分析Dixon圖形決定。b)HTRF(均相時(shí)間解析熒光)分析法在根據(jù)本發(fā)明的HTRF PARP分析法中，組蛋白，作為由PARP修飾的靶物蛋白質(zhì)，間接以XL665熒光團(tuán)標(biāo)記?？咕?ADP-核糖)抗體直接以氪酸銪-PAR-氪酸鹽標(biāo)記。若XL665熒光團(tuán)在空間上在直接鄰近時(shí)，其由結(jié)合至組蛋白上的聚(ADP-核糖)所確認(rèn)，然后可能能量轉(zhuǎn)移。在665納米的放射因此直接與結(jié)合抗體量成比例，因而對(duì)應(yīng)于聚(ADP-核糖)的量。測(cè)定的信號(hào)因此與PARP活性相對(duì)應(yīng)。測(cè)定原理經(jīng)圖示說明于圖7中。使用的物質(zhì)與那些在ELISA中使用者完全相同(見以上)，除非另有說明。
組蛋白以3毫克/毫升的濃度溶于Hepes緩沖液(50毫摩爾濃度，pH=7.5)。生物素化以磺?；?NHS-LC-生物素(皮爾斯，#21335T)進(jìn)行。使用每個(gè)組蛋白4個(gè)生物素分子的摩爾比值。培養(yǎng)時(shí)間為90分(RT)。生物素化組蛋白然后在G25 SF HR10/10管柱(Pharmacia,17-0591-01)上在Hepes緩沖液(50毫摩爾濃度，pH=7.0)中純化，以期除去過量的生物素化試劑?？咕?ADP-核糖)抗體以氪酸銪標(biāo)記，使用二功能性偶合試劑(Lopez,E.等人，Clin.Chem.39(2),196-201(1993)；美國(guó)專利號(hào)5,534,622)。純化在G25SF HR10/30管柱上進(jìn)行。每個(gè)抗體3.1個(gè)氪酸鹽的摩爾比值經(jīng)達(dá)成。產(chǎn)量為25％。共軛物在0.1％BSA的存在下在磷酸鹽緩沖液(0.1摩爾濃度，pH=7)中在-80℃下保存。
為酶反應(yīng)，以下經(jīng)吸入各孔中-10微升PARP溶液，在PARP HTRF反應(yīng)緩沖液(50毫摩爾濃度Tris-HCl pH8.0,10毫摩爾濃度MgCl2,1毫摩爾濃度DTT)，具20納克PARP1(人或牛)或8納克PARP2(人或小鼠)-10微升活化DNA，在PARP HTRF反應(yīng)緩沖液(50微克/毫升)-10微升生物素化組蛋白，在PARP HTRF反應(yīng)緩沖液(1.25微摩爾濃度)-10微升抑制劑在PARP HTRF反應(yīng)緩沖液此些試劑在反應(yīng)由添加以下開始前經(jīng)培養(yǎng)2分-10微升DNA溶液，在PARP HTRF反應(yīng)緩沖液(41微摩爾濃度/毫升)。
反應(yīng)時(shí)間在室溫下為30分。
反應(yīng)然后由添加以下中止-10微升PARP抑制劑(25微摩爾濃度，Ki=10納摩爾濃度)，在“啟示(Revelation)”緩沖液(100毫摩爾濃度Tris-HCl pH7.2,0.2摩爾濃度KF,0.05％BSA)。
以下然后加入-10微升EDTA溶液(SIGMA,E-7889,0.5摩爾濃度在H2O中)-100微升Sa-XL665(Packard儀器)在“啟示”緩沖液(15-31.25納摩爾濃度)-50微升抗PAR氪酸鹽在“啟示”緩沖液(1.6-3.3納摩爾濃度)。
測(cè)定在30分(多至4小時(shí))后為可能的。測(cè)定在“發(fā)現(xiàn)HTRF微滴度板分析器”(Canberra Packard儀器)中進(jìn)行。Ki值如所述為ELISA地計(jì)算。實(shí)施例7測(cè)定PARP抑制劑的治療效力的試驗(yàn)系統(tǒng)新穎PARP抑制劑可具其在有關(guān)藥理模型中檢查的治療效力。一些合適的模型實(shí)例經(jīng)列表于表1。
a)NMDA激發(fā)毒性模型谷氨酸為在腦中最重要的激發(fā)神經(jīng)傳遞質(zhì)。在正常情況下，谷氨酸排至突觸裂隙及刺激后突觸谷氨酸受體，特定地“NMDA”和“AMPA”型的谷氨酸受體。此刺激在腦的多種功能中扮演顯著角色，包括學(xué)習(xí)、記憶和運(yùn)動(dòng)控制。
在急性和慢性神經(jīng)變性的情況(例如中風(fēng))下，突觸谷氨酸分泌上大為增加，造成受體的過度刺激。此導(dǎo)致以此方式刺激的細(xì)胞死亡。這些增加的谷氨酸活性發(fā)生在多數(shù)神經(jīng)疾病或精神疾病中，及導(dǎo)致在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)以及在外周神經(jīng)系統(tǒng)中過度激發(fā)的狀態(tài)或毒性作用。因此，谷氨酸系涉及大量的神經(jīng)變性性疾病，特別地組織缺氧后的神經(jīng)毒性混亂、缺氧、局部缺血及損傷后，如那些在中風(fēng)和重傷后發(fā)生者，及中風(fēng)、阿爾滋海默氏癥、哈丁頓氏癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS；“路者林氏病”)，顱外傷、脊髓重傷、外周神經(jīng)病痛、AIDS癡呆和帕金森氏癥。谷氨酸在其中起重要作用的另一種疾病為癲癇(參閱腦研究公告1998；46(4):281-309,EurNeuropsychopharmacol.1998,8(2):141-152)。
谷氨酸作用系經(jīng)不同受體介導(dǎo)。此些受體之一在特定激動(dòng)劑后稱為NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受體(Arzneim.Forschung 1990,40,511-514；TIPS,1990,11,334-338；未來(lái)的藥物1989,14,1059-1071)。N-甲基-D-天冬氨酸為特別類谷氨酸受體的強(qiáng)激動(dòng)劑(“NMDA”型)。NMDA受體的刺激導(dǎo)致鈣流入細(xì)胞及生成自由基。自由基導(dǎo)致DNA損傷及PARP活化。PARP在細(xì)胞中耗盡高能量磷酸鹽(NAD和ATP)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這說明NMDA的毒性。NMDA治療的動(dòng)物因此可認(rèn)為是上述疾病的模型，其中涉及激發(fā)毒性。
因?yàn)楣劝彼崾荏w在神經(jīng)變性的重要性，許多藥理研究途徑目前已指向準(zhǔn)確地特定封阻此些受體。然而，因?yàn)槠湓谡４碳鲗?dǎo)的重要性，此些研究途徑已被證明為有問題的(副作用)。此外，受體的刺激發(fā)生極快速，使受體的施用時(shí)常太遲(“時(shí)窗”問題)。因此，對(duì)NMDA有關(guān)神經(jīng)毒性的新穎作用理論及抑制劑有著極大的需求。
由激發(fā)氨基酸對(duì)抗腦過度激發(fā)的保護(hù)(在小鼠中的NMDA拮抗作用)可視為基于激發(fā)毒性的PARP藥理效應(yīng)物在疾病中活性的適當(dāng)證據(jù)。激發(fā)(exzitatorischen)氨基酸(EAA)的腦內(nèi)施用誘生如此有力的過度激發(fā)，其在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致動(dòng)物(小鼠)的痙攣和死亡。
在本例中，在腹膜(i.p.)施用試驗(yàn)物質(zhì)120分后單側(cè)腦室內(nèi)施用10微升0.035％NMDA水溶液。此些癥狀可由中樞活性的藥物的全身性，例如腹膜內(nèi)施用抑制。因?yàn)樵谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中EAA受體的過度活化在不同神經(jīng)疾病中起重要作用，可通過體內(nèi)檢測(cè)EAA拮抗作用而獲得有關(guān)物質(zhì)對(duì)如此CNS疾病的可能治療有效性的資訊。ED50是指先前i.p.施用測(cè)定的物質(zhì)后，其中50％動(dòng)物不具固定劑量NMDA所有的癥狀時(shí)測(cè)定的物質(zhì)活性的測(cè)定值。b)Langendorf心模型(心肌梗塞模型)雄性Sprague-Dawley大鼠(體重300-400克；原種珍維爾，LeGenest-St-Isle，法國(guó))經(jīng)用于此試驗(yàn)，大鼠由灌食法口服施以活性物質(zhì)或安慰劑(體積5毫升/千克)。50分后，肝素經(jīng)腹膜內(nèi)施用(Liquemin N Roche,125IU/動(dòng)物，0.5毫升)。動(dòng)物以InactinT133(硫β巴比妥鈉10％)麻醉、固定在手術(shù)臺(tái)上，氣管切開及以“哈佛換氣泵”(40下/分，4.5毫升/下)。胸廓切開后接著主動(dòng)脈立即插入導(dǎo)管，取出心臟及立即逆行灌流。心臟以75毫米汞柱的恒壓灌注，其使用“Gilson Miniplus 2灌流泵”達(dá)成。灌注液的組成(毫摩爾/升)NaCl 118,KCl 4.7,CaCl2×2 H2O 2.53,MgSO4×7 H2O 1.64,NaCHO324.88,KH2PO41.18,葡萄糖11。溫度在實(shí)驗(yàn)全程保持在37℃下。功能性參數(shù)使用“Gould 4-軌記錄器”連續(xù)記錄。測(cè)定經(jīng)制成左室壓(LVP；毫米汞柱)、LVEDP(毫米汞柱)、酶釋出(肌酸激酶，毫單位/毫升/克)、冠狀流速(毫升/分)、HR(脈搏率，分-1)。左室壓使用液體填充乳膠氣球及Statham 23 Db壓力轉(zhuǎn)導(dǎo)計(jì)測(cè)定。氣球體積先調(diào)至達(dá)到約12毫米汞柱的LVEDP(左室端舒張壓)。dp/dtmax(最大泵力)系使用積分基準(zhǔn)自壓力信號(hào)衍生。心率自壓力信號(hào)計(jì)算。流速使用滴計(jì)數(shù)器(BMT Messtechnik GmbH柏林)測(cè)定。在平衡時(shí)間20分后，心接受30分全體局部缺血，由中止灌注液供給，而保持溫度在37℃下。在其后60分再灌注時(shí)段中，灌注液樣品在3、5、10、15、30、45和60分后取出，分析肌酸激酶(CK)活性。測(cè)定參數(shù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析(Dunnett試驗(yàn)法)。顯著性限度為p=0.05。
在兔心的實(shí)驗(yàn)同樣地進(jìn)行。使用雄性白紐西蘭兔(獲自Interfauna)。心如上述大鼠模型制備。灌注壓設(shè)在最大60毫米汞柱及流速在約25毫升/分。平衡時(shí)間為約30分。物質(zhì)由直接注入心的上游施用。開始注入15分后，30分全體局部缺血由中止流動(dòng)而致，但維持心臟的溫度。接著30分的再灌注。灌注液在底物施用前，在15分后及在再灌注期間不同時(shí)間(5、10、15、20、30分)時(shí)取出探討CK活性。以下參數(shù)經(jīng)測(cè)定LVP(毫米汞柱)、LVEDP、LVdP/dt、PP(毫米汞柱)、HR(脈搏率；下/分)、CK活性(單位/分/克心重)。c)急性腎衰竭的動(dòng)物模型靜脈內(nèi)施用PARP抑制劑(4天)對(duì)具局部缺血后急性腎衰竭的大鼠腎功能的保護(hù)作用經(jīng)探討。
雄Sprague-Dawley大鼠(在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)約330克；育種者CharlesRiver)經(jīng)使用。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組采用10-15只動(dòng)物?；钚晕镔|(zhì)/安慰劑的施用以滲透微泵連續(xù)進(jìn)行至股靜脈。眼窩血液在心烯氟烷(Ethrane Abbot，威斯巴登)吸入麻醉下進(jìn)行(1.5毫升全血)。
在最初測(cè)定(血樣品)及測(cè)定在24小時(shí)中排出尿量后，大鼠經(jīng)麻醉(“Nembutal”，戊巴比妥鈉，Sanofi CEVA；50毫克/千克，腹膜內(nèi)，體積注射1.0毫升/千克)及固定在可加熱的手術(shù)臺(tái)上(37℃)。125 IU/千克肝素(利貴明N，羅氏)經(jīng)靜脈施至尾靜脈。腹腔經(jīng)打開及右腎經(jīng)暴露。分枝的腎動(dòng)脈經(jīng)暴露及使用牛頭犬夾(Diefenbach38毫米)在上方夾住。左腎動(dòng)脈同樣地經(jīng)露出及夾住(上方，約至腎的半途)。在手術(shù)期間，滲透微泵經(jīng)植入股靜脈。腸經(jīng)再放入及流體損失補(bǔ)以微溫的0.9％NaCl。動(dòng)物經(jīng)蓋以濕布及在紅光下保溫。40分后，腎的外觀經(jīng)記錄，及夾經(jīng)取下，先右后左。腸再放回及加入2滴抗生素(Tardomyocel，拜爾)。腹壁以無(wú)菌貓腸(Ethicon 4號(hào))密閉及再一次以1滴抗生素處理。表皮以無(wú)菌(Ethibond Exel Ethicon)3/0號(hào)縫合，及縫合處噴以Nebacetin N(Yamanouchi)傷品噴霧。每日藥物/安慰劑劑量的10分之一經(jīng)快速濃注給藥。
樣品和血液在第1、2和4天實(shí)驗(yàn)時(shí)取出以探討在血清和尿中的生化參數(shù)Na、K、肌酸、蛋白質(zhì)(僅在尿中)。此外，飼料和水消耗、體重和尿量經(jīng)記錄。14天后，動(dòng)物經(jīng)犧牲及腎經(jīng)評(píng)估。
評(píng)估排除在實(shí)驗(yàn)期間死于梗塞或在第14天在驗(yàn)尸時(shí)顯示梗塞的所有動(dòng)物。肌酸清除與鈉級(jí)分排出被計(jì)算為腎功能參數(shù)，比較治療動(dòng)物與對(duì)照組和假陽(yáng)性對(duì)照(Sham)組。d)放射敏感化的體外模型(腫瘤療法)MCF-7-細(xì)胞(人乳癌)在具10％熱滅活FCS和2毫摩爾濃度L-谷氨酸的達(dá)貝可氏修飾伊哥氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞在6孔盤中以每孔100、1000或10,000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密度接種過夜及然暴露至0至10 Gy范圍內(nèi)劑量的離子輻射(137Cs，雪帕馬克，I-68A型，劑量率3.28 Gy/分)。照射后10天，實(shí)驗(yàn)經(jīng)評(píng)估，計(jì)算群落，而以50個(gè)細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。e)中風(fēng)模型(病灶性腦局部缺血；在大鼠中的MCA(中腦動(dòng)脈)閉塞)病灶性局部缺血在Sprague-Dawley或Long-Evans大鼠中藉右端MCA的導(dǎo)管插入進(jìn)行。大鼠在MCA閉塞前或其后以根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑處理。通常，1-10毫克/千克的劑量經(jīng)選定(快速濃注施用)，視情況接著連續(xù)注入0.5-5毫克/千克/小時(shí)。
大鼠以鹵代烷在70％氮?dú)夂?0％氧氣的混合物麻醉(4％在最后時(shí)及0.8-1.2％在手術(shù)期間)。體溫固定地直腸測(cè)定及藉可控制熱毯保持恒定在37.5℃±0.5℃。再者，動(dòng)脈血壓、動(dòng)脈pH、Pa(O2)和Pa(CO2)視情況藉尾靜脈導(dǎo)管測(cè)定。其后，病灶局部缺血使用Chen等人(中風(fēng)17:738-743；1986)或Liu等人(Am J.Physiol 256:H589-593；1989)的方法進(jìn)行。藉連續(xù)燒灼右MCA的遠(yuǎn)端部分。當(dāng)手術(shù)終止時(shí)，動(dòng)物保持在溫暖環(huán)境下再24小時(shí)。然后其使用CO2殺死及斷頭。其腦經(jīng)取出，快速冷凍(干冰或液態(tài)氮)后保存在-80℃下。腦經(jīng)切成0.02毫米厚切片及每第20個(gè)切片用于其后的分析。相對(duì)應(yīng)的切片以甲酚紫(尼斯?fàn)柸旧?染色?？商娲兀琓TC(2,3,4-三苯基四唑氯)可用于染色。梗塞量然后可在顯微鏡下分析。為正確定量，電腦影像分析軟件可使用(J Cereb Blood Flow Metabol 10:290-293；1990)。f)膿毒性休克每組10只雄C57/BL小鼠(體重18-20克)以LPS(脂多醣，自大腸桿菌，LD10020毫克/動(dòng)物，靜脈內(nèi))加入半乳糖胺(20毫克/動(dòng)物，靜脈內(nèi))處理。要試驗(yàn)的物質(zhì)在3個(gè)連續(xù)天中，腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用(例如1-10毫克/千克)，而第1個(gè)劑量在LPS處理30分后施用。死亡率每12小時(shí)測(cè)定。可替代地，物質(zhì)亦可以一些劑量在一些日子中施用。g)在老化細(xì)胞中改變基因表達(dá)的測(cè)定細(xì)胞的老化系由改變細(xì)胞培養(yǎng)基自完全培養(yǎng)基至具降低血清濃度的培養(yǎng)基而刺激，及其后藉定量性PCR或Northern Blot法(Linskens等人，核酸研究1995:23(16):3244-51)分析。皮膚老化的典型標(biāo)記例如膠原或彈性蛋白可使用。人纖維胚細(xì)胞或纖維胚細(xì)胞系經(jīng)使用，其刺激皮膚老化。根據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑經(jīng)加入培養(yǎng)基中及其在改變基因表達(dá)的作用經(jīng)觀察。在細(xì)胞中增加的彈性蛋白產(chǎn)生與藉那些調(diào)節(jié)劑所致的降低老化過程可觀察到。
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名BASF Aktiengesellschaft(B)街道(C)地區(qū)Ludwigshafen(E)國(guó)家Deutschland(F)郵編67065(ⅱ)發(fā)明名稱新的聚ADP核糖聚合物基因(ⅲ)序列數(shù)28(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀資料(A)數(shù)據(jù)載體Floppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC compatible(C)操作系統(tǒng)PC DOS/MS DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(EPA)(2)SEQ ID NO:1描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1843堿基對(duì)(B)種類核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假說非(ⅳ)反義非(ⅵ)來(lái)源(F)組織類型腦(ⅸ)特征(A)名稱/鍵CDS(B)LAGE:3..1715(D)SONSTIGE ANGABEN:/product=“聚ADP核糖聚合酶”(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:1CC ATG GCG GCG CGG CGG CGA CGG AGC ACC GGC GGC GGC AGG GCG AGAMet Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly Arg Ala Arg1 5 10 15SCA TTA AAT GAA AGC AAA AGA GTT AAT AAT GGC AAC ACG GCT CCA GAAAla Leu Asn Glu Ser Lys Arg Val Asn Asn Gly Asn Thr Ala Pro Glu20 25 30GAC TCT TCC CCT GCC AAG AAA ACT CGT AGA TGC CAG AGA CAG GAG TCG 143Asp Ser Ser Pro Ala Lys Lys Thr Arg Arg Cys Gln Arg Gln Glu Ser35 40 45AAA AAG ATG CCT GTG GCT GGA GGA AAA GCT AAT AAG GAC AGG ACA GAA 191Lys Lys Met Pro Val Ala Gly Gly Lys Ala 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Trp160 165 170 175GAA GAT CGA GAA AAG TTT GAG AAG GTG CCT GGA AAA TAT GAT ATG CTA 575Glu Asp Arg Glu Lys Phe Glu Lys Val Pro Gly Lys Tyr Asp Met Leu180 185 190CAG ATG GAC TAT GCC ACC AAT ACT CAG GAT GAA GAG GAA ACA AAG AAA 623Gln Met Asp Tyr Ala Thr Asn Thr Gln Asp Glu Glu Glu Thr Lys Lys195 200 205GAG GAA TCT CTT AAA TCT CCC TTG AAG CCA GAG TCA CAG CTA GAT CTT 671Glu Glu Ser Leu Lys Ser Pro Leu Lys Pro Glu Ser Gln Leu Asp Leu210 215 220CGG GTA CAG GAG TTA ATA AAG TTG ATC TGT AAT GTT CAG GCC ATG GAA 719Arg Val Gln Glu Leu Ile Lys Leu Ile Cys Asn Val Gln Ala Met Glu225 230 235GAA ATG ATG ATG GAA ATG AAG TAT AAT ACC AAG AAA GCC CCA CTT GGG 767Glu Met Met Met Glu Met Lys Tyr Asn Thr Lys Lys Ala Pro Leu Gly240 245 250 255AAG CTG ACA GTG GCA CAA ATC AAG GCA GGT TAC CAG TCT CTT AAG AAG 815Lys Leu Thr Val Ala Gln Ile Lys Ala Gly Tyr Gln Ser Leu Lys Lys260265270ATT GAG GAT TGT ATT CGG GCT GGC CAG CAT GGA CGA GCT CTC ATG GAA863Ile Glu Asp Cys Ile Arg Ala Gly Gln His Gly Arg Ala Leu Met Glu275 280 285GCA TGC AAT GAA TTC TAC ACC AGG ATT CCG CAT GAC TTT GGA CTC CGT911Ala Cys Asn Glu Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp Pne Gly Leu Arg290 295 300ACT CCT CCA CTA ATC CGG ACA CAG AAG GAA CTG TCA GAA AAA ATA CAA959Thr Pro Pro Leu Ile Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ile Gln305 310 315TTA CTA GAG GCT TTG GGA GAC ATT GAA ATT GCT ATT AAG CTG GTG AAA 1007Leu Leu Glu Ala Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile Lys Leu Val Lys320 325 330335ACA GAG CTA CAA AGC CCA GAA CAC CCA TTG GAC CAA CAC TAT AGA AAC 1055Thr Glu Leu Gln Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg Asn340 345 350CTA CAT TGT GCC TTG CGC CCC CTT GAC CAT GAA AGT TAC GAG TTC AAA 1103Leu His Cys Ala Leu Arg Pro Leu Asp His Glu Ser Tyr Glu Phe Lys355 360 365GTG ATT TCC CAG TAC CTA CAA TCT ACC CAT GCT CCC ACA CAC AGC GAC 1151Val Ile Ser Gin Tyr Leu Gln Ser Thr His Ala Pro Thr His Ser Asp370 375 380TAT ACC ATG ACC TTG CTG GAT TTG TTT GAA GTG GAG AAG GAT GGT GAG 1199Tyr Thr Met Thr Leu Leu Asp Leu Phe Glu Val Glu Lys Asp Gly Glu385 390 395AAA GAA GCC TTC AGA GAG GAC CTT CAT AAC AGG ATG CTT CTA TGG CAT 1247Lys Glu Ala Phe Arg Glu Asp Leu His Asn Arg Met Leu Leu Trp His400 405 410 415GGT TCC AGG ATG AGT AAC TGG GTG GGA ATC TTG AGC CAT GGG CTT CGA 1295Gly Ser Arq Met Ser Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser His Gly Leu Arg420 425 430ATT GCC CCA CCT GAA GCT CCC ATC ACA GGT TAC ATG TTT GGG AAA GGA 1343Ile Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly435 440 445ATC TAC TTT GCT GAC ATG TCT TCC AAG AGT GCC AAT TAC TGC TTT GCC 1391Ile Tyr Phe Ala Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala450 455 460TCT CGC CTA AAC AAT AGA GGA CTG CTG CTC TTA TCA GAG GTA GCT CTA 1439Ser Arg Leu Lys Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu465 470 475GGT CAG TGT AAT GAA CTA CTA GAG GCC AAT CCT AAG GCC GAA GGA TTG 1487Gly Gln Cys Asn Glu Leu Leu Glu Ala Asn Pro Lys Ala Glu Gly Leu480 485 490 495CTT CAA GGT AAA CAT AGC ACC AAG GGG CTG GGC AAG ATG GCT CCC AGT 1535Leu Gln Gly Lys His Ser Thr Lys Gly Leu Gly Lys Met Ala Pro Ser500 505 510TCT GCC CAC TTC GTC ACC CTG AAT GGG AGT ACA GTG CCA TTA GGA CCA 1583Ser Ala His Phe Val Thr Leu Asn Gly Ser Thr Val Pro Leu Gly Pro515 520 525GCA AGT GAC ACA GGA ATT CTG AAT CCA GAT GGT TAT ACC CTC AAC TAC 1631Ala Ser Asp Thr Gly Ile Leu Asn Pro Asp Gly Tyr Thr Leu Asn Tyr530 535 540AAT GAA TAT ATT GTA TAT AAC CCC AAC CAG GTC CGT ATG CGG TAC CTT 1679Asn Glu Tyr Ile Val Tyr Asn Pro Asn Gln Val Arg Met Arg Tyr Leu545 550 555TTA AAG GTT CAG TTT AAT TTC CTT CAG CTG TGG TGA ATGTTGATAT1725Leu Lys Val Gln Phe Asn Phe Leu Gln Leu Trp *560 565 570TAAATAAACC AGAGATCTGA TCTTCAAGCA AGAAAATAAG CAGTGTTGTA CTTGTGAATT 1785TTGTGATATT TTATGTAATA AAAACTGTAC AGGTCTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1843(2)SEQ ID NO:2描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度571氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:2Met Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly Arg Ala Arg Ala1 5 10 15Leu Asn Glu Ser Lys Arg Val Asn Asn Gly Asn Thr Ala Pro Glu Asp20 25 30Ser Ser Pro Ala Lys Lys Thr Arg Arg Cys Gln Arg Gln Glu Ser Lys35 40 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Tyr Gln Ser Leu Lys Lys Ile260 265 270Glu Asp Cys Ile Arg Ala Gly Gln His Gly Arg Ala Leu Met Glu Ala275 280285Cys Asn Glu Phe Tyr Thr Arg Ile Pro His Asp Phe Gly Leu Arg Thr290 295 300Pro Pro Leu Ile Arg Thr Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Ile Gln Leu305 310 315 320Leu Glu Ala Leu Gly Asp Ile Glu Ile Ala Ile Lys Leu Val Lys Thr325330 335Glu Leu Gln Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg Asn Leu340 345350His Cys Ala Leu Arg Pro Leu Asp His Glu Ser Tyr Glu Phe Lys Val355 360 365Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Ser Thr His Ala Pro Thr His Ser Asp Tyr370 375 380Thr Met Thr Lau Leu Asp Leu Phe Glu Val Glu Lys Asp Gly Glu Lys385 390 395400Glu Ala Phe Arg Glu Asp Leu His Asn Arg Met Leu Leu Trp His Gly405 410 415Sar Arg Met Ser Asn Trp Val Gly Ile Leu Ser His Gly Leu Arg Ile420 425 430Ala Pro Pro Glu Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Met Phe Gly Lys Gly Ile435 440 445Tyr Phe Ala Asp Met Ser Ser Lys Ser Ala Asn Tyr Cys Phe Ala Ser450455460Arg Leu Lys Asn Thr Gly Leu Leu Leu Leu Ser Glu Val Ala Leu Gly465470 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NO:7CCCGGCTTTC ACTTTTTCTG CTGCCTCGGG GAACACCTCG AGCCAACTGC TTCCTAACTC60AGGGTGGGCA GAACTGACGG GATCTAAGCT TCTGCATCTC TGAGGAGAAC C ATG GCT117Met AlaCCA AAA CGA AAG GCC TCT GTG CAG ACT GAG GGC TCC AAG AAG CAG CGA 165Pro Lys Arg Lys Ala Ser Val Gln Thr Glu Gly Ser Lys Lys Gln Arg545 550 555CAA GGG ACA GAG GAG GAG GAC AGC TTC CGG TCC ACT GCC GAG GCT CTC213Gln Gly Thr Glu Glu Glu Asp Ser Phe Arg Ser Thr Ala Glu Ala Leu560 565 570 575AGA GCA GCA CCT GCT GAT AAT CGG GTC ATC CGT GTG GAC CCC TCA TGT261Arg Ala Ala Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Arg Val Asp Pro Ser Cys580 585 590CCA TTC AGC CGG AAC CCC GGG ATA CAG GTC CAC GAG GAC TAT GAC TGT309Pro Phe Ser Arg Asn Pro Gly Ile Gln Val His Glu Asp Tyr Asp Cys595 600 605ACC CTG AAC CAG ACC AAC ATC GGC AAC AAC AAC AAC AAG TTC TAT ATT357Thr Leu Asn Gln Thr Asn Ile Gly Asn Asn Asn Asn Lys Phe Tyr Ile610 615 620ATC CAA CTG CTG GAG GAG GGT AGT CGC TTC TTC TGC TGG AAT CGC TGG405Ile Gln Leu Leu Glu Glu Gly Ser Arg Phe Phe Cys Trp Asn Arg Trp625 630 635GGC CGC GTG GGA GAG GTG GGC CAG AGC AAG ATG AAC CAC TTC ACC TGC453Gly Arg Val Gly Glu Val Gly Gln Ser Lys Met Asn His Phe Thr Cys640 645 650 655CTG GAA GAT GCA AAG AAG GAC TTT AAG AAG AAA TTT TGG GAG AAG ACT501Leu Glu Asp Ala Lys Lys Asp Phe Lys Lys Lys Phe Trp Glu Lys Thr660 665 670AAA AAC AAA TGG GAG GAG CGG GAC CGT TTT GTG GCC CAG CCC AAC AAG549Lys Asn Lys Trp Glu Glu Arg Asp Arg Phe Val Ala Gln Pro Asn Lys675 680 685TAC ACA CTT ATA GAA GTC CAG GGA GAA GCA GAG AGC CAA GAG GCT GTA597Tyr Thr Leu Ile Glu Val Gln Gly Glu Ala Glu Ser Gln Glu Ala Val690 695 700GTG AAG GCC TTA TCT CCC CAG GTG GAC AGC GGC CCT GTG AGG ACC GTG645Val Lys Ala Leu Ser Pro Gln Val Asp Ser Gly Pro Val Arg Thr Val705 710 715GTC AAG CCC TGC TCC CTA GAC CCT GCC ACC CAG AAC CTT ATC ACC AAC693Val Lys Pro Cys Ser Leu Asp Pro Ala Thr Gln Asn Leu Ile Thr Asn720 725 730 735ATC TTC AGC AAA GAG ATG TTC AAG AAC GCA ATG ACC CTC ATG AAC CTG741Ile Phe Ser Lys Glu Met Phe Lys Asn Ala Met Thr Leu Met Asn Leu740 745 750GAT GTG AAG AAG ATG CCC TTG GGA AAG CTG ACC AAG CAG CAG ATT GCC789Asp Val Lys Lys Met Pro Leu Gly Lys Leu Thr Lys Gln Gln Ile Ala755760765CGT GGC TTC GAG GCC TTG GAA GCT CTA GAG GAG GCC ATG AAA AAC CCC837Arg Gly Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Glu Ala Met Lys Asn Pro770775 780ACA GGG GAT GGC CAG AGC CTG GAA GAG CTC TCC TCC TGC TTC TAC ACT885Thr Gly Asp Gly Gln Ser Leu Glu Glu Leu Ser Ser Cys Phe Tyr Thr785 790 795GTC ATC CCA CAC AAC TTC GGC CGC AGC CGA CCC CCG CCC ATC AAC TCC 933Val Ile Pro His Asn Phe Gly Arg Ser Arg Pro Pro Pro Ile Asn Ser800 805 810 815CCT GAT GTG CTT CAG GCC AAG AAG GAC ATG CTG CTG GTG CTA GCG GAC 981Pro Asp Val Leu Gln Ale Lys Lys Asp Met Leu Leu Val Leu Ala Asp820 825 830ATC GAG TTG GCG CAG ACC TTG CAG GCA GCC CCT GGG GAG GAG GAG GAG1029Ile Glu Leu Ala Gln Thr Leu Gln Ala Ala Pro Gly Glu Glu Glu Glu835 840 845AAA GTG GAA GAG GTG CCA CAC CCA CTG GAT CGA GAC TAC CAG CTC CTC1077Lys Val Glu Glu Val Pro His Pro Leu Asp Arg Asp Tyr Gln Leu Leu850 855 860AGG TGC CAG CTT CAA CTG CTG GAC TCC GGG GAG TCC GAG TAC AAG GCA1125Arg Cys Gln Leu Gln Leu Leu Asp Ser Gly Glu Ser Glu Tyr Lys Ala865 870 875ATA CAG ACC TAC CTG AAA CAG ACT GGC AAC AGC TAC AGG TGC CCA AAC1173Ile Gln Thr Tyr Leu Lys Gln Thr Gly Asn Ser Tyr Arg Cys Pro Asn880 885 890 895CTG CGG CAT GTT TGG AAA GTG AAC CGA GAA GGG GAG GGA GAC AGG TTC1221Leu Arg His Val Trp Lys Val Asn Arg Glu Gly Glu Gly Asp Arg Phe900 905 910CAG GCC CAC TCC AAA CTG GGC AAT CGG AGG CTG CTG TGG CAC GGC ACC1269Gln Ala His Ser Lys Leu Gly Asn Arg Arg Leu Leu Trp His Gly Thr915 920 925AAT GTG GCC GTG GTG GCT GCC ATC CTC ACC AGT GGG CTC CGA ATC ATG1317Asn Val Ala Val Val Ala Ala Ile Leu Thr Ser Gly Leu Arg Ile Met930 935 940CCA CAC TCG GGT GGT CGT GTT GGC AAG GGT ATT TAT TTT GCC TCT GAG1365Pro His Ser Gly Gly Arg Val Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala Ser Glu945 950 955AAC AGC AAG TCA GCT GGC TAT GTT ACC ACC ATG CAC TGT GGG GGC CAC1413Asn Ser Lys Ser Ala Gly Tyr Val Thr Thr Met His Cys Gly Gly His960 965 970 975CAG GTG GGC TAC ATG TTC CTG GGC GAG GTG GCC CTC GGC AAA GAG CAC1461Gln Val Gly Tyr Met Phe Leu Gly Glu Val Ala Leu Gly Lys Glu His980 985 990CAC ATC ACC ATC GAT GAC CCC AGC TTG AAG AGT CCA CCC CCT GGC TTT1509His Ile Thr Ile Asp Asp Pro Ser Leu Lys Ser Pro Pro Pro Gly Phe995 1000 1005GAC AGC GTC ATC GCC CGA GGC CAA ACC GAG CCG GAT CCC GCC CAG GAC1557Asp Ser Val Ile Ala Arg Gly Gln Thr Glu Pro Asp Pro Ala Gln Asp101010151020ATT GAA CTT GAA CTG GAT GGG CAG CCG GTG GTG GTG CCC CAA GGC CCG1605Ile Glu Leu Glu Leu Asp Gly Gln Pro Val Val Val Pro Gln Gly Pro10251030 1035CCT GTG CAG TGC CCG TCA TTC AAA AGC TCC AGC TTC AGC CAG AGT GAA 1653Pro Val Gln Cys Pro Ser Phe Lys Ser Ser Ser Phe Sar Gln Ser Glu1040 10451050 1055TAC CTC ATA TAC AAG GAG AGC CAG TGT CGC CTG CGC TAC CTG CTG GAG 1701Tyr Leu Ile Tyr Lys Glu Ser Gln Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Leu Glu10601065 1070ATT CAC CTC TAAGCTGCTT GCCCTCCCTA GGTCCAAGCC 1740Ile His Leu(2)SEQ ID NO:8描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度533氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:8Met Ala Pro Lys Arg Lys Ala Ser Val Gln Thr Glu Gly Ser Lys Lys1 510 15Gln Arg Gln Gly Thr Glu G1u Glu Asp Ser Phe Arg Ser Thr Ala Glu20 25 30Ala Leu Arg Ala Ala Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Arg Val Asp Pro35 40 45Ser Cys Pro Phe Ser Arg Asn Pro Gly Ile Gln Val His Glu Asp Tyr50 55 60Asp Cys Thr Leu Asn Gln Thr Asn Ile Gly Asn Asn Asn Asn Lys Phe65 70 75 80Tyr Ile Ile Gln Leu Leu Glu Glu Gly Ser Arg Phe Phe Cys Trp Asn85 90 95Arg Trp Gly Arg Val Gly Glu Val Gly Gln Ser Lys Met Asn His Phe100 105 110Thr Cys Leu Glu Asp Ala Lys Lys Asp Phe Lys Lys Lys Phe Trp Glu115 120 125Lys Thr Lys Asn Lys Trp Glu Glu Arg Asp Arg Phe Val Ala Gln Pro130 135 140Asn Lys Tyr Thr Leu Ile Glu Val Gln Gly Glu Ala Glu Ser G1n Glu145 150 155 160Ala Val Val Lys Ala Leu Ser Pro Gln Val Asp Ser Gly Pro Val Arg165 170 175Thr Val Val Lys Pro Cys Ser Leu Asp Pro Ala Thr Gln Asn Leu Ile180185190Thr Asn Ile Phe Ser Lys Glu Met Phe Lys Asn Ala Met Thr Leu Met195 200 205Asn Leu Asp Val Lys Lys Met Pro Leu Gly Lys Leu Thr Lys Gln Gln210 215 220Ile Ala Arg Gly Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Glu Ala Met Lys225 230 235 240Asn Pro Thr Gly Asp Gly Gln Ser Leu Glu Glu Leu Ser Ser Cys Phe245 250 255Tyr Thr Val Ile Pro His Asn Phe Gly Arg Ser Arg Pro Pro Pro Ile260 265 270Asn Ser Pro Asp Val Leu Gln Ala Lys Lys Asp Met Leu Leu Val Leu275 280 285Ala Asp Ile Glu Leu Ala Gln Thr Leu Gln Ala Ala Pro Gly Glu Glu290 295 300Glu Glu Lys Val Glu Glu Val Pro His Pro Leu Asp Arg Asp Tyr Gln305 310 315 320Leu Leu Arg Cys Gln Leu Gln Leu Leu Asp Ser Gly Glu Ser Glu Tyr325 330 335Lys Ala Ile Gln Thr Tyr Leu Lys Gln Thr Gly Asn Ser Tyr Arg Cys340 345 350Pro Asn Leu Arg His Val Trp Lys Val Asn Arg Glu Gly Glu Gly Asp355 360 365Arg Phe Gln Ala His Ser Lys Leu Gly Asn Arg Arg Leu Leu Trp His370 375 380Gly Thr Asn Val Ala Val Val Ala Ala Ile Leu Thr Ser Gly Leu Arg385 390 395400Ile Met Pro His Ser Gly Gly Arg Val Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala405 410 415Ser Glu Asn Ser Lys Ser Ala Gly Tyr Val Thr Thr Met His Cys Gly420 425 430Gly His Gln Val Gly Tyr Met Phe Leu Gly Glu Val Ala Leu Gly Lys435 440 445Glu His His Ile Thr Ile Asp Asp Pro Ser Leu Lys Ser Pro Pro Pro450 455 460Gly Phe Asp Ser Val Ile Ala Arg Gly Gln Thr Glu Pro Asp Pro Ale465 470 475 480Gln Asp Ile Glu Leu Glu Leu Asp Gly Gln Pro Val Val Val Pro Gln485 490 495Gly Pro Pro Val Gln Cys Pro Ser Phe Lys Ser Ser Ser Phe Ser Gln500505510Ser Glu Tyr Leu Ile Tyr Lys Glu Ser Gln Cys Arg Leu Arg Tyr Leu515 520 525Leu Glu Ile His Leu530(2)SEQ ID NO:9描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1587堿基對(duì)(B)種類核苷酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅲ)假說非(ⅳ)反義非(ⅵ)來(lái)源(F)組織類型骨骼肌(ⅸ)特征(A)名稱/鍵CDS(B)LAGE:1..1584(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:9ATG GCT CCA AAA CGA AAG GCC TCT GTG CAG ACT GAG GGC TCC AAG AAG 48Met Ala Pro Lys Arg Lys Ala Ser Val Gln Thr Glu Gly Ser Lys Lys535 540 545CAG CGA CAA GGG ACA GAG GAG GAG GAC AGC TTC CGG TCC ACT GCC GAG 96Gln Arg Gln Gly Thr Glu Glu Glu Asp Ser Phe Arg Ser Thr Ala Glu550 555 560 565GCT CTC AGA GCA GCA CCT GCT GAT AAT CGG GTC ATC CGT GTG GAC CCC144Ala Leu Arg Ala Ala Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Arg Val Asp Pro570 575 580TCA TGT CCA TTC AGC CGG AAC CCC GGG ATA CAG GTC CAC GAG GAC TAT192Ser Cys Pro Phe Ser Arg Asn Pro Gly Ile Gln Val His Glu Asp Tyr585 590 595GAC TGT ACC CTG AAC CAG ACC AAC ATC GGC AAC AAC AAC AAC AAG TTC240Asp Cys Thr Leu Asn Gln Thr Asn Ile Gly Asn Asn Asn Asn Lys Phe600 605 610TAT ATT ATC CAA CTG CTG GAG GAG GGT AGT CGC TTC TTC TGC TGG AAT288Tyr Ile Ile Gln Leu Leu Glu Glu Gly Ser Arg Phe Phe Cys Trp Asn615 620 625CGC TGG GGC CGC GTG GGA GAG GTG GGC CAG AGC AAG ATG AAC CAC TTC336Arg Trp Gly Arg Val Gly Glu Val Gly Gln Ser Lys Met Asn His Phe630 635 640 645ACC TGC CTG GAA GAT GCA AAG AAG GAC TTT AAG AAG AAA TTT TGG GAG384Thr Cys Leu Glu Asp Ala Lys Lys Asp Phe Lys Lys Lys Phe Trp Glu650 655 660AAG ACT AAA AAC AAA TGG GAG GAG CGG GAC CGT TTT GTG GCC CAG CCC432Lys Thr Lys Asn Lys Trp Glu Glu Arg Asp Arg Phe Val Ala Gln Pro665 670 675AAC AAG TAC ACA CTT ATA GAA GTC CAG GGA GAA GCA GAG AGC CAA GAG 480Asn Lys Tyr Thr Leu Ile Glu Val Gln Gly Glu Ala Glu Ser Gln Glu680 685 690GCT GTA GTG AAG GTG GAC AGC GGC CCT GTG AGG ACC GTG GTC AAG CCC528Ala Val Val Lys Val Asp Ser Gly Pro Val Arg Thr Val Val Lys Pro695 700705TGC TCC CTA GAC CCT GCC ACC CAG AAC CTT ATC ACC AAC ATC TTC AGC576Cys Ser Leu Asp Pro Ala Thr Gln Asn Leu Ile Thr Asn Ile Phe Ser710 715 720 725AAA GAG ATG TTC AAG AAC GCA ATG ACC CTC ATG AAC CTG GAT GTG AAG624Lys Glu Met Phe Lys Asn Ala Met Thr Leu Met Asn Leu Asp Val Lys730 735 740AAG ATG CCC TTG GGA AAG CTG ACC AAG CAG CAG ATT GCC CGT GGC TTC672Lys Met Pro Leu Gly Lys Leu Thr Lys Gln Gln Ile Ala Arg Gly Phe745 750 755GAG GCC TTG GAA GCT CTA GAG GAG GCC ATG AAA AAC CCC ACA GGG GAT720Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Glu Ala Met Lys Asn Pro Thr Gly Asp760 765 770GGC CAG AGC CTG GAA GAG CTC TCC TCC TGC TTC TAC ACT GTC ATC CCA768Gly Gln Ser Leu Glu Glu Leu Ser Ser Cys Phe Tyr Thr Val Ile Pro775 780 785CAC AAC TTC GGC CGC AGC CGA CCC CCG CCC ATC AAC TCC CCT GAT GTG816His Asn Phe Gly Arg Ser Arg Pro Pro Pro Ile Asn Ser Pro Asp Val790 795 800 805CTT CAG GCC AAG AAG GAC ATG CTG CTG GTG CTA GCG GAC ATC GAG TTG864Leu Gln Ala Lys Lys Asp Met Leu Leu Val Leu Ala Asp Ile Glu Leu810 815 820GCG CAG ACC TTG CAG GCA GCC CCT GGG GAG GAG GAG GAG AAA GTG GAA912Ala Gln Thr Leu Gln Ala Ala Pro Gly Glu Glu Glu Glu Lys Val Glu825 830 835GAG GTC CCA CAC CCA CTG GAT CGA GAC TAC CAG CTC CTC AGG TGC CAG960Glu Val Pro His Pro Leu Asp Arg Asp Tyr Gln Leu Leu Arg Cys Gln840 845 850CTT CAA CTG CTG GAC TCC GGG GAG TCC GAG TAC AAG GCA ATA CAG ACC 1008Leu Gln Leu Leu Asp Ser Gly Glu Ser Glu Tyr Lys Ala Ile Gln Thr855 860 865TAC CTG AAA CAG ACT GGC AAC AGC TAC AGG TGC CCA AAC CTG CGG CAT 1056Tyr Leu Lys Gln Thr Gly Asn Ser Tyr Arg Cys Pro Asn Leu Arg His870875880885GTT TGG AAA GTG AAC CGA GAA GGG GAG GGA GAC AGG TTC CAG GCC CAC 1104Val Trp Lys Val Asn Arg Glu Gly Glu Gly Asp Arg Phe Gln Ala His890 895 900TCC AAA CTG GGC AAT CGG AGG CTG CTG TGG CAC GGC ACC AAT GTG GCC 1152Ser Lys Leu Gly Asn Arg Arg Leu Leu Trp His Gly Thr Asn Val Ala905 910 915GTG GTG GCT GCC ATC CTC ACC AGT GGG CTC CGA ATC ATG CCA CAC TCG 1200Val Val Ala Ala Ile Leu Thr Ser Gly Leu Arg Ile Met Pro His Ser920 925 930GGT GGT CGT GTT GGC AAG GGT ATT TAT TTT GCC TCT GAG AAC AGC AAG 1248Gly Gly Arg Val Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala Ser Glu Asn Ser Lys935 940 945TCA GCT GGC TAT GTT ACC ACC ATG CAC TGT GGG GGC CAC CAG GTG GGC 1296Ser Ala Gly Tyr Val Thr Thr Met His Cys Gly Gly His Gln Val Gly950 955 960 965TAC ATG TTC CTG GGC GAG GTG GCC CTC GGC AAA GAG CAC CAC ATC ACC 1344Tyr Met Phe Leu Gly Glu Val Ala Leu Gly Lys Glu His His Ile Thr970 975 980ATC GAT GAC CCC AGC TTG AAG AGT CCA CCC CCT GGC TTT GAC AGC GTC 1392Ile Asp Asp Pro Ser Leu Lys Ser Pro Pro Pro Gly Phe Asp Ser Val985 990 995ATC GCC CGA GGC CAA ACC GAG CCG GAT CCC GCC CAG GAC ATT GAA CTT 1440Ile Ala Arg Gly Gln Thr Glu Pro Asp Pro Ala Gln Asp Ile Glu Leu10001005 1010GAA CTG GAT GGG CAG CCG GTG GTG GTG CCC CAA GGC CCG CCT GTG CAG 1488Glu Leu Asp Gly Gln Pro Val Val Val Pro Gln Gly Pro Pro Val Gln1015 10201025TGC CCG TCA TTC AAA AGC TCC AGC TTC AGC CAG AGT GAA TAC CTC ATA 1536Cys Pro Ser Phe Lys Ser Ser Ser Phe Ser Gln Ser Glu Tyr Leu Ile10301035 10401045TAC AAG GAG AGC CAG TGT CGC CTG CGC TAC CTG CTG GAG ATT CAC CTC 1584Tyr Lys Glu Ser Gln Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Leu Glu Ile His Leu10501055 1060TAA 1587(2)SEQ ID NO:10描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度528氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:10Met Ala Pro Lys Arg Lys Ala Ser Val Gln Thr Glu Gly Ser Lys Lys1 51015Gln Arg Gln Gly Thr Glu Glu Glu Asp Ser Phe Arg Ser Thr Ala Glu20 25 30Ala Leu Arg Ala Ala Pro Ala Asp Asn Arg Val Ile Arg Val Asp Pro35 40 45Ser Cys Pro Phe Ser Arg Asn Pro Gly Ile Gln Val His Glu Asp Tyr50 55 60Asp Cys Thr Leu Asn Gln Thr Asn Ile Gly Asn Asn Asn Asn Lys Phe65 70 75 80Tyr Ile Ile Gln Leu Leu Glu Glu Gly Ser Arg Phe Phe Cys Trp Asn85 90 95Arg Trp Gly Arg Val Gly Glu Val Gly Gln Ser Lys Met Asn His Phe100 105 110Thr Cys Leu Glu Asp Ala Lys Lys Asp Phe Lys Lys Lys Phe Trp Glu115 120 125Lys Thr Lys Asn Lys Trp Glu Glu Arg Asp Arg Phe Val Ala Gln Pro130 135 140Asn Lys Tyr Thr Leu Ile Glu Val Gln Gly Glu Ala Glu Ser Gln Glu145 150 155160Ala Val Val Lys Val Asp Ser Gly Pro Val Arg Thr Val Val Lys Pro165 170 175Cys Ser Leu Asp Pro Ala Thr Gln Asn Leu Ile Thr Asn Ile Phe Ser180 185 190Lys Glu Met Phe Lys Asn Ala Met Thr Leu Met Asn Leu Asp Val Lys195 200 205Lys Met Pro Leu Gly Lys Leu Thr Lys Gln Gln Ile Ala Arg Gly Phe210 215 220Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Glu Ala Met Lys Asn Pro Thr Gly Asp225 230 235 240Gly Gln Ser Leu Glu Glu Leu Ser Ser Cys Phe Tyr Thr Val Ile Pro245 250255His Asn Phe Gly Arg Ser Arg Pro Pro Pro Ile Asn Ser Pro Asp Val260 265 270Leu Gln Ala Lys Lys Asp Met Leu Leu Val Leu Ala Asp Ile Glu Leu275 280285Ala Gln Thr Leu Gln Ala Ala Pro Gly Glu Glu Glu Glu Lys Val Glu290 295 300Glu Val Pro His Pro Leu Asp Arg Asp Tyr Gln Leu Leu Arg Cys Gln305 310 315 320Leu Gln Leu Leu Asp Ser Gly Glu Ser Glu Tyr Lys Ala Ile Gln Thr325 330 335Tyr Leu Lys Gln Thr Gly Asn Ser Tyr Arg Cys Pro Asn Leu Arg His340 345 350Val Trp Lys Val Asn Arg Glu Gly Glu Gly Asp Arg Phe Gln Ala His355 360 365Ser Lys Leu Gly Asn Arg Arg Leu Leu Trp His Gly Thr Asn Val Ala370 375 380Val Val Ala Ala Ile Leu Thr Ser Gly Leu Arg Ile Met Pro His Ser395 390 395 400Gly Gly Arg Val Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala Ser Glu Asn Ser Lys405 4l0 415Ser Ala Gly Tyr Val Thr Thr Met His Cys Gly Gly His Gln Val Gly420 425 430Tyr Met Phe Leu Gly Glu Val Ala Leu Gly Lys Glu His His Ile Thr435 440 445Ile Asp Asp Pro Ser Leu Lys Ser Pro Pro Pro Gly Phe Asp Ser Val450 455 460Ile Ale Arg Gly Gln Thr Glu Pro Asp Pro Ala Gln Asp Ile Glu Leu465 470 475 480Glu Leu Asp Gly Gln Pro Val Val Val Pro Gln Gly Pro Pro Val Gln485 490 495Cys Pro Ser Phe Lys Ser Ser Ser Phe Ser Gln Ser Glu Tyr Leu Ile500 505 510Tyr Lys Glu Ser Gln Cys Arg Leu Arg Tyr Leu Leu Glu Ile His Leu515 520 525(2)SEQ ID NO:11描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度14氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)IAGE:2
(D) SONSTIGE ANGABEN/注釋= “Xaa代表1至5個(gè)其他氨基酸”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:3(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Ser或Thr”(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:11Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Lys Gly Ile Tyr Phe Ala1510(2)SEQ ID NO:12描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:1(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Ser或Thr”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:6(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Ile或Val”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:9(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表1至5個(gè)其他氨基酸”(ⅸ)特征
(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:10(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Ser或Thr”(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:12Xaa Xaa Gly Leu Arg Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Lys15 10 15Gly Ile Tyr Phe Ala20(2)SEQ ID NO:13描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度45氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:16(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋= “Xaa代表Ser或Thr”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:21(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Ile或Val”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:24(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表1至5個(gè)其他氨基酸”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段
(B)LAGE:25(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Ser或Thr”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:6(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Ser或Thr”(ⅸ)序列特征SEQ ID NO:13Leu Leu Trp His Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Leu Xaa1 510 15Xaa Gly Leu Arg Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Gly Lys Gly20 25 30Ile Tyr Phe Ala Xaa Xaa Xaa Ser Lys Ser Ala Xaa Tyr35 40 45(2)SEQ ID NO:14描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:1(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Leu或Val”(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:14Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa15 10 15Xaa Xaa Xaa Xas Xaa Leu20(2)SEQ ID NO:15描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度27氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:21(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Asp或Glu”(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:22(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表10或11個(gè)其他氨基酸”(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:15Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa1 5 10 15Gln Leu Leu Xaa Xaa Xaa Trp Gly Arg Val Gly20 25(2)SEQ ID NO:16描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度29氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性
(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:16Ala Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Thr Xaa Asn Xaa15 10 15Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Lys20 25(2)SEQ ID NO:17描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度44氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:4(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Ile或Leu”(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:17Gln Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 510 15Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu Gly Lys Leu20 25 30Xaa Xaa Xaa Gln Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu35 40(2)SEQ ID NO:18描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度15氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽
(ⅲ)假說是(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:18Phe Tyr Thr Xaa Ile Pro His Xaa Phe Gly Xaa Xaa Xaa Pro Pro15 10 15(2)SEQ ID NO:19描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度17氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:19Lys Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Xaa Asp Ile Glu Xaa Ala Xaa Xaa15 10 15Leu(2)SEQ ID NO:20描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度11氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:20Gly Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Glu Val Ala Leu Gly15 10(2)SEQ ID NO:21描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:14(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表7至9個(gè)其他氨基酸”(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:21Gly Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Leu Xaa1 5 10 15Gly Xaa Xaa Val20(2)SEQ ID NO:22描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度16氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅸ)特征(A)名稱/鍵區(qū)段(B)LAGE:2(D)SONSTIGE ANGABEN/注釋=“Xaa代表Tyr或Phe”(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:22Glu Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa xaa Xaa Tyr Leu Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO:23描述
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說非(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:23Met Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Thr Gly Gly Gly Arg Ala Arg Ala1 5 10 15Leu Asn Glu Ser(2)SEQ ID NO:24描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說非(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:24Lys Thr Glu Leu Gln Ser Pro Glu His Pro Leu Asp Gln His Tyr Arg1 5 10 15Asn Leu His Cys20(2)SEQ ID NO:25描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度21氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽
(ⅲ)假說非(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:25Cys Lys Gly Arg Gln Ala Gly Arg Glu Glu Asp Pro Phe Arg ser Thr1 510 15Ala Glu Ala Leu Lys20(2)SEQ ID NO:26描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說非(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO26Cys Lys Gln Gln Ile Ala Arq Gly Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu1 5 10 15Glu Ala Leu Lys20(2)SEQ ID NO:27描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說非(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:27Lys Gln Gln Ile Ala Arg Gly Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Glu1 510 15Ala Leu Lys(2)SEQ ID NO:28描述(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度19氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€性(ⅱ)分子類型肽(ⅲ)假說是(ⅹⅰ)序列特征SEQ ID NO:28Lys Gln Gln Ile Ala Arg Gly Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu Glu Glul 5 10 15Ala Met Lys
權(quán)利要求
1．一種聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)同系物，其具以下的氨基酸序列a)功能性NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域及b)不含下式鋅指序列基序CX2CXmHX2C其中m為自28或30的整數(shù)值，及X基各自獨(dú)立為任何氨基酸；及其功能性相當(dāng)物。
2．如權(quán)利要求第1項(xiàng)的PARP同系物，其中功能性NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括以下一般序列基序之一PXn(S/T)GX3GKGIYFA,(S/T)XGLR(I/V)XPXn(S/T)GX3GKGIYFA或LLWHG(S/T)X7IL(S/T)XGLR(I/V)XPXn(S/T)GX3GKGIYFAX3SKSAXY其中n為自1至5的整數(shù)值，及X基各自獨(dú)立為任何氨基酸。
3．如權(quán)利要求第1或2項(xiàng)的PARP同系物，至少包括另一以下部分序列基序LX9NX2YX2QLLX(D/E)X10/11WGRVG,AX3FXKX4KTXNXWX5FX3PXK,QXL(I/L)X2IX9MX10PLGKLX3QIX6L,FYTXIPHXFGX3PP；及KX3LX2LXDIEXAX2L,其中X基各自獨(dú)立為任何氨基酸。
4．如上述權(quán)利要求之一的PARP同系物，選自人PARP同系物，其具在SEQ ID NO:2(人PARP2)或SEQ ID NO:4或6(人PARP3第1或2型)中所示的氨基酸序列；或鼠PARP同系物，其具在SEQID NO:8(小鼠PARP長(zhǎng)型)或SEQ ID NO:10(小鼠PARP截短型)中所示的氨基酸序列；及其功能性相當(dāng)物。
5．一種如上述權(quán)利要求之一的PARP同系物的結(jié)合配偶體，選自a)其抗體及片段，b)蛋白質(zhì)樣化合物，其與蛋白質(zhì)的部分序列相互作用，及c)低分子量效應(yīng)物，其調(diào)節(jié)催化PARP活性或PARP分子的另一種生物功能。
6．一種核酸，包括a)一種核苷酸序列，編碼至少一種如權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的同系物，或其互補(bǔ)的核苷酸序列；b)一種核苷酸序列，其與在a)中特定的序列在嚴(yán)格條件下雜交；或c)從在a)和b)中界定的核苷酸序列，由遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而衍生的核苷酸序列。
7．如權(quán)利要求第6項(xiàng)的核酸，包括a)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸+3至+1715；b)在SEQ ID NO:3中所示的核苷酸+242至+1843；c)在SEQ ID NO:5中所示的核苷酸+221至+1843；d)在SEQ ID NO:7中所示的核苷酸+112至+1710；或e)在SEQ ID NO:9中所示的核苷酸+1至+1584。
8．一種表達(dá)盒，包括在至少一種調(diào)節(jié)核苷酸序列的基因控制下，至少一種如權(quán)利要求第6或7項(xiàng)中任一項(xiàng)的核苷酸序列。
9．一種重組載體，包括至少一種如權(quán)利要求第8項(xiàng)的表達(dá)盒。
10．一種重組微生物，包括至少一種如權(quán)利要求第9項(xiàng)的重組載體。
11．一種導(dǎo)入外來(lái)基因的哺乳動(dòng)物，包括如權(quán)利要求第9項(xiàng)的載體。
12．一種PARP-缺乏的哺乳動(dòng)物或PARP-缺乏的真核生物細(xì)胞，其中功能性表達(dá)至少一種編碼如權(quán)利要求第1或2項(xiàng)中任一項(xiàng)的PARP同系物的基因被抑制。
13．一種PARP抑制劑的體外檢測(cè)方法，其包括a)將未與支持物結(jié)合的或與支持物結(jié)合的的聚ADP-可核糖苷化靶物與反應(yīng)混合液培養(yǎng)，其混合液包括a1)如權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的PARP同系物，a2)PARP活化劑；及a3)PARP抑制劑或其中至少一個(gè)被懷疑為PARP抑制劑的分析物；b)進(jìn)行聚ADP核糖苷化反應(yīng)；及c)定量或定性地測(cè)定靶物的聚ADP核糖苷化。
14．如權(quán)利要求第13項(xiàng)的方法，其中PARP同系物系與PARP活化劑和PARP抑制或其中被懷疑具有至少一個(gè)PARP抑制劑的分析物，在聚ADP核糖苷化反應(yīng)進(jìn)行前預(yù)培養(yǎng)。
15．如權(quán)利要求第13或14項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中聚ADP-核糖苷化靶物是組蛋白蛋白質(zhì)。
16．如權(quán)利要求第13至15項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中PARP活化劑為活化DNA。
17．如權(quán)利要求第13至16項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中聚ADP核糖苷化反應(yīng)系由添加NAD+開始。
18．如權(quán)利要求第13至17項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中與支持物結(jié)合的靶物的聚ADP核糖苷化系使用抗聚(ADP-核糖)抗體測(cè)定。
19．如權(quán)利要求第13至17項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中未與支持物結(jié)合的靶物系以受體熒光團(tuán)標(biāo)記。
20．如權(quán)利要求第19項(xiàng)的方法，其中未與支持物結(jié)合的抗體的聚ADP核糖苷化系使用抗聚(ADP-核糖)抗體測(cè)定，其以能將能量轉(zhuǎn)予受體熒光團(tuán)的供體熒光團(tuán)標(biāo)記。
21．如權(quán)利要求第19和20項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中靶物為生物素化的組蛋白，及受體熒光團(tuán)經(jīng)抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白偶合至其上。
22．如權(quán)利要求第20或21項(xiàng)中任一項(xiàng)的方法，其中抗聚(ADP-核糖)抗體載有氪酸銪作為供體熒光團(tuán)。
23．一種體外篩選PARP分子的結(jié)合配偶體的方法，其包括a1)將至少一種如權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的PARP同系物固定在支持物上；b1)將固定化PARP同系物與被懷疑其中具有至少一種結(jié)合配偶體的分析物接觸；及c1)在適當(dāng)時(shí)在一段培養(yǎng)時(shí)間后，測(cè)定與固定化PARP同系物結(jié)合的分析物成分；或a2)將包括至少一個(gè)PARP分子的可能結(jié)合配偶體的分析物固定在支持物上；b2)將固定化分析物與至少一個(gè)在其中找尋結(jié)合配偶體的如權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的PARP同系物接觸；及c2)在適當(dāng)時(shí)在一段培養(yǎng)時(shí)間后，檢視固定化分析物的PARP同系物結(jié)合。
24．一種定性或定量地測(cè)定核酸的方法，其核酸編碼如權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的PARP同系物，其包括a)將生物樣品與如權(quán)利要求第6和7項(xiàng)中任一項(xiàng)的一定量外源核酸培養(yǎng)，在嚴(yán)格條件下雜交，測(cè)定雜交核酸及，在適當(dāng)時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)物比較；或b)將生物樣品與一對(duì)對(duì)PARP同系物編碼的核酸具特異性的寡核苷酸引物培養(yǎng)，擴(kuò)增核酸，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物，及在適當(dāng)時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)物比較。
25．一種定性或定量地測(cè)定如權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的PARP同系物的方法，其包括a)將生物樣品與對(duì)PARP同系物特異的結(jié)合配偶體培養(yǎng)，b)檢測(cè)結(jié)合配偶體/PARP復(fù)合物，及在適當(dāng)時(shí)，c)比較結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物。
26．如權(quán)利要求第25項(xiàng)的方法，其中結(jié)合配偶體為抗體或其結(jié)合片段，其在適當(dāng)時(shí)載有可檢測(cè)的標(biāo)記。
27．一種如權(quán)利要求第24至26項(xiàng)中任一項(xiàng)以診斷能量不足介導(dǎo)疾病的方法。
28．一種測(cè)定PARP效應(yīng)物效力的方法，其包括a)將如權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的PARP同系物與包括生理或病理PARP活性的效應(yīng)物的分析物培養(yǎng)；再在適當(dāng)時(shí)除去效應(yīng)物；及b)在適當(dāng)時(shí)在添加底物或共底物后，測(cè)定PARP同系物的活性。
29．一種基因療法組合物，其包括在基因療法可接受載體中一種核酸構(gòu)建物，其編碼a)包括如權(quán)利要求第6和7項(xiàng)中任一項(xiàng)的編碼核酸的反義核酸；或b)對(duì)如權(quán)利要求第6和7項(xiàng)中任一項(xiàng)的核酸的核糖酶；或c)特定的PARP抑制劑。
30．一種醫(yī)藥組合物，在醫(yī)藥上可接受的載體中，包括至少一種如權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的PARP蛋白質(zhì)，至少一種如權(quán)利要求第5項(xiàng)的PARP結(jié)合配偶體及至少一種如權(quán)利要求第6或7項(xiàng)的編碼核苷酸序列。
31．如權(quán)利要求第5項(xiàng)的低分子量PARP結(jié)合配偶體，用于診斷或治療在發(fā)展和/或進(jìn)展其中涉及至少一種PARP蛋白質(zhì)或自其衍生多肽的病理狀態(tài)。
32．如權(quán)利要求第5項(xiàng)的低分子量PARP結(jié)合配偶體，用于診斷或治療由能量不足介導(dǎo)的病理狀態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚(ADP－核糖)聚合酶(PARP)同系物,其具以下的氨基酸序列,a)功能性NAD
文檔編號(hào)C12N15/54GK1304446SQ99807043
公開日2001年7月18日 申請(qǐng)日期1999年6月4日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月5日
發(fā)明者M·科克, T·赫格爾, B·克雷格爾, B·奧特爾巴赫, W·盧比施, H·－G·勒麥雷 申請(qǐng)人:Basf公司