專利名稱：用于一步法純化方法的表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可以用于多肽生產(chǎn)中一種新穎的純化方法的表達(dá)載體。
對(duì)于低成本生產(chǎn)相關(guān)蛋白質(zhì)來說，提高在特定宿主中重組蛋白質(zhì)的表達(dá)水平以及簡化下游操作步驟十分重要。出于此種目的，除了其它的原則外，基于親和純化的特異性肽標(biāo)記的存在(Smith和Pidgeon，美國專利4,569,794；Sharma，美國專利5,594,115；Romanos等人，1995；Kim和Raines,1993；Kroll等人，1993；Smith和Johnson,1988)、重組蛋白質(zhì)的檢測和/或穩(wěn)定性(Riggs，美國專利4,366,246；LaVallie等人，1993)，已經(jīng)設(shè)計(jì)出新的表達(dá)載體和純化方法。這些標(biāo)記通?？梢酝ㄟ^蛋白質(zhì)水解或化學(xué)裂解除去(Hopp等人，美國專利4,782,137；Beghdadi等人，1998)，因而可以允許產(chǎn)生不含有任何多余氨基酸的重組多肽。
以肽標(biāo)記為基礎(chǔ)的已知方法的主要缺點(diǎn)是要使用用于親和純化的特殊樹脂，這種樹脂使得大規(guī)模純化難以進(jìn)行并且導(dǎo)致高的生產(chǎn)成本。而且，以金屬離子為基礎(chǔ)的技術(shù)可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的某些殘基改變，而在其它情況下，洗脫劑和方法能夠影響純化蛋白質(zhì)的催化活性。
因而，本發(fā)明的目的就是提供一種新的表達(dá)系統(tǒng)，它可以通過低成本樹脂生產(chǎn)且進(jìn)行簡便高效的多肽純化。更特定的，本發(fā)明的目的是提供一種能夠在Sepharose 4B這種已應(yīng)用于大規(guī)模純化過程的低成本樹脂上純化的表達(dá)系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明，通過一種用于產(chǎn)生重組多肽的表達(dá)構(gòu)建體來達(dá)到上述目的，這種構(gòu)建體包含一種至少由下述有效地連接的元件組成的表達(dá)盒a)啟動(dòng)子；b)編碼一種凝集素結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA編碼區(qū)，尤其是編碼盤基蛋白(discoidin)蛋白質(zhì)家族的成員的DNA編碼區(qū)，作為純化標(biāo)記序列；c)用于接收要生產(chǎn)的重組多肽之編碼區(qū)的克隆位點(diǎn)，以及d)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
為了實(shí)際的使用，構(gòu)建體優(yōu)選地包含于表達(dá)載體中，例如適于轉(zhuǎn)化所期望的宿主的質(zhì)粒。
在產(chǎn)生本發(fā)明的研究中，通過盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)表達(dá)載體(在Fasel和Reymond，美國專利5,736,358中作為實(shí)施例進(jìn)行了描述)探討了使用盤基蛋白Ⅰ(一種在盤基網(wǎng)柄菌中的受發(fā)育調(diào)節(jié)的凝集素)作為用于生產(chǎn)和純化重組蛋白質(zhì)的標(biāo)記的可能性。而且，添加信號(hào)肽可以用于介導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)重新回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而允許進(jìn)行二級(jí)修飾和分泌。(Reymond等人，1995)。
盤基蛋白由一個(gè)受發(fā)育調(diào)節(jié)的多基因家族編碼(Pools和Firtel,1984；Rowekamp等人，1980；Tsang等人，1981)。在盤基網(wǎng)柄菌中，已描述了兩種類型的盤基蛋白Ⅰ和Ⅱ。這兩者都是四聚體蛋白質(zhì)，可以根據(jù)其亞基分子量(2528kDa范圍)、等電點(diǎn)和肽圖譜(Frazier等人，1975)加以區(qū)分。在盤基網(wǎng)柄菌中已鑒定出編碼盤基蛋白Ⅱ的一個(gè)單基因，并且已經(jīng)證實(shí)盤基蛋白Ⅰ參與細(xì)胞聚集過程中的細(xì)胞-基底間粘附和有序細(xì)胞遷移。但是這種活性似乎依賴于盤基蛋白Ⅰ的纖維結(jié)合素樣細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)(Springer等人，1984)。雖然大多數(shù)盤基蛋白聚集在細(xì)胞內(nèi)，但是有一定數(shù)量的盤基蛋白可以通過可能包括于多片層體中(Barondes等人，1985)的某種未知途徑進(jìn)行分泌。雖然盤基蛋白的序列中存在幾個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，但是，它們不包含任何ER轉(zhuǎn)位信號(hào)，因而這些蛋白質(zhì)不能經(jīng)由通常的途徑外泌和被糖基化。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)可以通過使用Sepharose 4B親和層析和N-乙酰半乳糖胺偶聯(lián)的瓊脂糖，將盤基蛋白的凝集素樣、半乳糖基結(jié)合活性用于純化包含盤基蛋白和待表達(dá)多肽的融合蛋白質(zhì)，產(chǎn)生了用于重組蛋白質(zhì)表達(dá)和純化的綜合系統(tǒng)。
本發(fā)明的一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)是使用半乳糖進(jìn)行洗脫，此溶劑不會(huì)與蛋白質(zhì)的主要部分相互作用和/或?qū)ζ溥M(jìn)行修飾。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是盤基蛋白本身是無毒的，可以使用特定的抗體容易地檢測。而且，當(dāng)目的蛋白質(zhì)作為與盤基蛋白融合的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行表達(dá)時(shí)，目的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量水平會(huì)提高。最后，似乎來自大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、或網(wǎng)柄菌屬的蛋白質(zhì)除盤基蛋白以外沒有一種可以特異性的結(jié)合Sepharose并可通過半乳糖將其釋放，因而，可以減少純化樣品中污染物的水平。
在本發(fā)明的表達(dá)載體中純化標(biāo)記序列可以位于例如克隆位點(diǎn)的上游和啟動(dòng)子的下游。放置純化標(biāo)記的一個(gè)替代位置是位于目的蛋白質(zhì)克隆位點(diǎn)之后。在上述兩種情況下，目的蛋白質(zhì)與純化標(biāo)記的融合可以允許通過特定的樹脂進(jìn)行純化。
為了將要表達(dá)的多肽和標(biāo)記容易地分離，一個(gè)裂解位點(diǎn)優(yōu)選的位于目的蛋白質(zhì)克隆位點(diǎn)和純化標(biāo)記之間。裂解位點(diǎn)可以是例如凝血酶裂解位點(diǎn)。其他可能的位點(diǎn)是因子X，或化學(xué)裂解位點(diǎn)，尤其是溴化氫裂解位點(diǎn)。凝血酶裂解位點(diǎn)包含一個(gè)編碼氨基酸序列LVPRGSDP的DNA序列。
由于盤基蛋白本身不含有信號(hào)序列，因而不能自主定位于特定的細(xì)胞區(qū)室。因而在某些實(shí)施方案中表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含編碼用于將待表達(dá)的多肽定位于特定細(xì)胞區(qū)室的信號(hào)肽的序列。這種信號(hào)序列通常位于啟動(dòng)子下游，目的蛋白質(zhì)序列與純化標(biāo)記融合子的上游。有利的，用于定位的信號(hào)肽是將多肽定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號(hào)肽，例如來自前孢子抗原(PsA)蛋白的21個(gè)氨基酸前導(dǎo)肽。其具有優(yōu)點(diǎn)是因?yàn)榇a(chǎn)生的多肽可以隨后被糖基化和分泌。
在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)成純化標(biāo)記序列的盤基蛋白是盤基蛋白Ⅰ，另一個(gè)合適的盤基蛋白是盤基蛋白Ⅱ，或任何其它具有結(jié)合半乳糖多聚體能力的凝集素結(jié)合蛋白。
根據(jù)本發(fā)明另一方面的特征，本發(fā)明涉及產(chǎn)生多肽的方法，其包括a)通過將多肽的編碼序列克隆入本發(fā)明表達(dá)載體的克隆位點(diǎn)，制備要生產(chǎn)的多肽的表達(dá)載體；b)使用上述方法獲得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；c)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使其允許純化標(biāo)記氨基酸序列和與其共價(jià)連接的要表達(dá)的多肽的氨基酸序列所組成的融合多肽表達(dá)；d)通過純化標(biāo)記的氨基酸序列將存在于宿主細(xì)胞或培養(yǎng)液中的融合多肽與多糖基質(zhì)結(jié)合，然后從基質(zhì)上將融合多肽洗脫下來，從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)液中分離融合多肽；及e)除去純化標(biāo)記的氨基酸序列。
如果載體包含裂解位點(diǎn)，那么可以通過裂解位點(diǎn)將融合多肽中純化標(biāo)記的氨基酸序列裂解，除去純化標(biāo)記。
在盤基蛋白Ⅰ的情況中，多糖基質(zhì)優(yōu)選Sepharose 4B的球形材料，因?yàn)榇瞬牧狭畠r(jià)并且主要純化盤基蛋白Ⅰ和盤基蛋白Ⅱ。洗脫可以優(yōu)選用半乳糖進(jìn)行。偶聯(lián)有N-乙酰半乳糖胺基團(tuán)的瓊脂糖基質(zhì)是第二步中特別合適的基質(zhì)，因?yàn)樗鼘?duì)于盤基蛋白Ⅰ較之與盤基蛋白Ⅱ有更大的親和力。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過上述方法得到的新融合多肽，以及這些融合多肽在重組多肽的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”意在包含位于多肽編碼序列起始位點(diǎn)5’上游的順式作用DNA序列，RNA聚合酶可以與這一DNA序列結(jié)合并且啟動(dòng)正確轉(zhuǎn)錄，可選的，還可以包含增強(qiáng)子。
“融合蛋白”指的是盤基蛋白氨基酸序列與要表達(dá)的多肽氨基酸序列的組合。
術(shù)語“盤基蛋白”意在涉及對(duì)半乳糖多聚體具有親和力的凝集素結(jié)合蛋白質(zhì)。
所使用的其它所有術(shù)語具有本領(lǐng)域公認(rèn)的含義，例如Gunter Kahl，VCH,Weinheim，德國(1995)出版的“基因技術(shù)詞典”中所列的含義。
下述是本說明書中使用的縮略語ER內(nèi)質(zhì)網(wǎng)CS瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白DisPf150,Dis-PfCter,Dis-PyCter含有盤基蛋白Ⅰα氨基末端標(biāo)記以及分別含有惡性瘧原蟲(P.falciparum)CS的Leu19-Cys382或Lys282-Cys382殘基或是尤氏瘧原蟲(P.yoelii)CS的Asn277-Ser345殘基的融合蛋白質(zhì)。SP-Dis-PyCter，是指攜帶氨基末端ER轉(zhuǎn)位信號(hào)的Dis-PyCter。
TCA三氯乙酸PBS磷酸緩沖鹽液mAB單克隆抗體本發(fā)明將在下述實(shí)施例中進(jìn)一步闡述，其中作為模式系統(tǒng)描述了來源于惡性瘧原蟲(Pf)和尤氏瘧原蟲(Py)的多種形式的環(huán)子孢子蛋白(CSP)作為盤基蛋白Ⅰ融合蛋白的表達(dá)和純化。很清楚，這一系統(tǒng)同樣適用于重組表達(dá)的所有其它任何多肽。這些實(shí)施例是不具有限制性的，盤基蛋白融合蛋白也可以在其它宿主中進(jìn)行表達(dá)，例如大腸桿菌、酵母、bacculo病毒或哺乳動(dòng)物。而且，盤基蛋白的半乳糖結(jié)合部分或整個(gè)盤基蛋白也可能通過化學(xué)合成并加到目的多肽上。
在實(shí)施例中參考了下述各圖

圖1Dis-標(biāo)記的融合蛋白質(zhì)圖譜用肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子替代盤基蛋白啟動(dòng)子來修飾盤基網(wǎng)柄菌轉(zhuǎn)化載體pEDⅡ CS150。整個(gè)盤基蛋白Ⅰ編碼區(qū)通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)加入編碼凝血酶裂解共有序列位點(diǎn)的下游序列。將PCR產(chǎn)物符合讀框地插入CS編碼區(qū)。Dis-PyCter和Dis-PfCter的獲得是通過如材料和方法部分中所述，分別用來源于尤氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲CSP基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物替代BamHⅠ/SacⅠ Pf150片段而實(shí)現(xiàn)的。通過用含有肌動(dòng)蛋白15啟動(dòng)子和其后的盤基網(wǎng)柄菌PsA信號(hào)肽編碼序列的PCR產(chǎn)物替代肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子，可以從Dis-PyCter中衍生出SP-Dis-PyCter。(74-229)Dis-Pf150是通過用編碼74-229殘基的PCR產(chǎn)物替代盤基蛋白編碼區(qū)序列來建的。圖2Dis-PfCter的表達(dá)和親和純化約4×108Dis-PfCter表達(dá)細(xì)胞的可溶性提取物如材料和方法部分所述，用1mlSepharose 4B柱進(jìn)行層析。結(jié)合的蛋白質(zhì)用0.3M的半乳糖TBS溶液洗脫，收集到0.7ml洗脫級(jí)分。
A．使用針對(duì)PfCter羧基末端的小鼠多克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析。這些抗體的特異性通過分析來源于DP4對(duì)照細(xì)胞的可溶級(jí)分得到驗(yàn)證(泳道1)。泳道2-7顯示的是Dis-PfCter純化級(jí)分；泳道2是可溶性提取物；泳道3是非保留部分；泳道4-7是用0.3M半乳糖洗脫的級(jí)分1-4。
B和C．分別是Dis-PfCter和DP4級(jí)分的考馬斯藍(lán)凝膠染色/卑斯麥棕凝膠染色的結(jié)果。泳道1顯示的是可溶性級(jí)分；泳道2為流出部分；泳道3-6為用0.3M半乳糖洗脫的級(jí)分1-4。
箭頭顯示大約44kDa的重組蛋白質(zhì)的位置。每一個(gè)總的和流出樣品的上樣量都是約15μg蛋白質(zhì)。對(duì)于半乳糖洗脫級(jí)分，每一泳道的上樣量是相應(yīng)級(jí)分體積的五十分之一。圖3Dis-PyCter的表達(dá)和親和純化A．使用J-Ⅲ小鼠多克隆抗體(見材料與方法)對(duì)Dis-PyCter級(jí)分進(jìn)行Western印跡分析?？扇苄约?xì)胞提取物如圖2所述進(jìn)行純化。泳道1顯示的是可溶性級(jí)分；泳道2為流出級(jí)分；泳道3-4是用0.3M半乳糖洗脫的級(jí)分2-3。泳道5所示的是如何用平行的來源于DP4對(duì)照細(xì)胞的可溶性提取物對(duì)抗體的特異性進(jìn)行鑒定。
B和C．分別含有Dis-PyCter(B)和DP4(C)Sepharose純化級(jí)分12％凝膠的考馬斯藍(lán)染色結(jié)果。泳道1顯示的是可溶性級(jí)分；泳道2-4為半乳糖洗脫級(jí)分2-4。
箭頭顯示的是大約35kDa的重組蛋白質(zhì)的位置。圖4Dis-Pf150的表達(dá)和親和純化A．如圖2所描述使用Sepharose層析進(jìn)行可溶性細(xì)胞提取物的純化。在用10％的膠分離樣品后，使用SP3E9小鼠(參見材料與方法)對(duì)Dis-Pf150進(jìn)行Western印跡分析。泳道1顯示的是可溶性級(jí)分；泳道2為非保留蛋白質(zhì)；泳道3-4分別為0.3M半乳糖洗脫級(jí)分2-3；泳道5顯示的是如何使用平行的DP4提取物進(jìn)行分析以鑒定抗體的特異性。
B．Dis-Pf150和(74-229)Dis-Pf150細(xì)胞在HL5中生長至約5×106細(xì)胞/ml的密度。在約500g離心后兩種細(xì)胞沉淀(C)的相同等份和培養(yǎng)基上清(M)用SDSPAGE電泳分離，CSP如A中所述使用Western印跡進(jìn)行檢測。
C．(74-229)Dis-Pf150可溶性細(xì)胞提取物如圖2中所述進(jìn)行處理，如A中所述進(jìn)行Western印跡分析。泳道1顯示的是可溶性級(jí)分；泳道2為非保留蛋白質(zhì)；泳道3-6為0.3M半乳糖洗脫級(jí)分1-4。
箭頭顯示的是大約84kDa的重組蛋白質(zhì)的位置。每一個(gè)總的和流出樣品的上樣量都是約15μg蛋白質(zhì)。圖5SP-Dis-PyCter的糖基化按照產(chǎn)品制造商說明SP-Dis-PyCter(泳道a和b)和Dis-PyCter(泳道c和d)的裂解物用反應(yīng)緩沖液(K)或PN-聚糖酶F(G)(泳道2和4)(泳道1和3)進(jìn)行處理。37℃孵育1小時(shí)后，加入4×Laemmli樣品緩沖液以終止反應(yīng)，PyCter使用12.5％的凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，并使用J-Ⅲ小鼠血清進(jìn)行Western印跡分析。圖6Dis-PyCter的凝血酶裂解SP-Dis-PyCter表達(dá)細(xì)胞用材料與方法中所述方法進(jìn)行裂解，只是裂解緩沖液中不含蛋白酶抑制劑。提取物在如所示的不斷增加濃度的凝血酶(單位/毫升)下于25℃孵育。然后如圖5所述對(duì)PyCter進(jìn)行檢測。實(shí)施例導(dǎo)言本實(shí)施例描述允許在盤基網(wǎng)柄菌中生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)的新表達(dá)載體的構(gòu)建。利用盤基蛋白Ⅰ能夠與Sepharose-4B結(jié)合的能力建立幾乎是單一步驟的純化方法。盤基蛋白Ⅰ編碼區(qū)域與網(wǎng)柄菌屬表達(dá)載體中的瘧疾寄生蟲CSP基因的幾種形式相融合，這一載體允許在細(xì)胞內(nèi)聚積，以及融合蛋白質(zhì)經(jīng)由與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體無關(guān)的途徑部分分泌。存在于細(xì)胞提取物中的融合蛋白質(zhì)用Sepharose 4B柱進(jìn)行親和純化。信號(hào)肽的加入可以允許融合蛋白質(zhì)進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位和糖基化。含有凝血酶裂解位點(diǎn)可以允許從CSP蛋白質(zhì)中裂解出盤基蛋白。使用穩(wěn)定的和低成本的Sepharose4B作為親和基質(zhì)可以允許進(jìn)行大規(guī)模的制備。材料與方法1．試劑硝酸纖維素膜Schleicher&Schuell(Dassel，德國)生產(chǎn)。ECL-western印跡試劑購自Amersham公司。
Sepharose 4B為法瑪西亞(Uppsala，瑞典)生產(chǎn)。D(+)半乳糖、過氧化物酶偶聯(lián)的蛋白A、衣霉素和人凝血酶購自Sigma公司(圣路易斯，MO)。肽N-糖苷酶F(PNGase F)購自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(貝弗里，MA)，蛋白酶抑制劑為寶靈曼(Mannheim，德國)生產(chǎn)。
過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠免疫球蛋白來自Nordic免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室(提爾堡，荷蘭)。針對(duì)(NANP)3重復(fù)序列的免疫球蛋白從SP3E9雜交瘤細(xì)胞(Boulanger等人，1988)中純化得到。
小鼠血清Ⅳ-4是針對(duì)含有惡性瘧原蟲CSP羧基末端區(qū)282-382氨基酸的合成肽的抗血清(Roggero等人，1995)。
小鼠血清J-Ⅲ是針對(duì)含有尤氏瘧原蟲CSP羧基末端區(qū)277-344氨基酸的合成肽之抗血清(MA.Roggero和G.P.Corradin，未發(fā)表之結(jié)果)。2．DNA構(gòu)建體Dis-Pf150構(gòu)建體來源于pEDH-CS150(Reymond等人，1985)，其中的盤基蛋白啟動(dòng)子由肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子替代；CsA信號(hào)肽由盤基蛋白Ⅰa編碼區(qū)替代。肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子使用PCR由pDNeoⅡ質(zhì)粒(Witke等人，1987)擴(kuò)增得到，使用寡核苷酸5’GCGCTCGAGACTAGAGAGGTTTATTTTTAA3’作為5’擴(kuò)增引物，它能夠與肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子的20個(gè)核苷酸雜交，并且在此序列上游包含XhoⅠ限制性位點(diǎn)。使用寡核苷酸5’TTCTCTAGACATTTTATATTATATTTATTTATTTG3’作為3’擴(kuò)增引物，它能夠與肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子的23個(gè)核苷酸雜交，包含ATG起始密碼子和XbaⅠ限制性位點(diǎn)。
擴(kuò)增的片段起始于第1663核苷酸殘基，終止于起始密碼子ATG(第948位核苷酸)。經(jīng)XhoⅠ/XbaⅠ雙消化后，DNA片段插入到已去除包含盤基蛋白啟動(dòng)子的XhoⅠ/XbaⅠ插入?yún)^(qū)域的載體pEDⅡ-CS中。
使用BamHⅠ線性化的質(zhì)粒pWR7(Poole等人，1981)作為模板，5’ATGTCTAGACAAGGTTTAGTTCAACTCCTCG3’和5’CATGAATTCTGGATCCGAACCACGTGGAACTAATTCCAAAGCGGTAGCAATGT3’分別作為5’和3’擴(kuò)增引物，擴(kuò)增出盤基蛋白Ⅰa編碼區(qū)。5’擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于盤基蛋白編碼區(qū)的頭33個(gè)堿基，并且提供了XbaⅠ限制性位點(diǎn)。3’擴(kuò)增引物起始于EcoRⅠ限制性位點(diǎn)和凝血酶裂解位點(diǎn)編碼序列的33個(gè)堿基處，其中的序列已經(jīng)優(yōu)化以適于基盤網(wǎng)核菌密碼子偏好，隨后是能夠與盤基蛋白編碼區(qū)的最后20個(gè)堿基雜交的一段延伸序列。融合基因編碼629個(gè)氨基酸長的多肽，其包含盤基蛋白標(biāo)記(Met1至Met257)和364個(gè)氨基酸長的惡性瘧原蟲CSP片段(Leu19至Cys382)以及引入兩者之間的8個(gè)氨基酸長的凝血酶識(shí)別位點(diǎn)(LVPRGSAP)。
為了使惡性瘧原蟲CSP羧基末端區(qū)段101個(gè)氨基酸的區(qū)域(Lys282至Cys382)獲得表達(dá)，其相應(yīng)的DNA通過使用5’GGTGGATCCAGGAATTCAAAAAAACAATCAAGGTAATGGA3’和5’AAGCGAGCTCTTAACATMCCATMACAAAT3’分別作為5’和3’擴(kuò)增引物由CS NF54基因(Caspers等人，1989)擴(kuò)增得到。
5’擴(kuò)增引物能夠和CSP基因的21個(gè)核苷酸雜交。在CSP序列的上游，5’擴(kuò)增引物包含BamHⅠ限制性位點(diǎn)和代表EcoRⅠ限制性位點(diǎn)及編碼氨基酸G、I、Q的10個(gè)核苷酸。
3’擴(kuò)增引物可以與CSP基因的22個(gè)核苷酸雜交，并且能夠使框內(nèi)UAA和SacⅠ限制性位點(diǎn)插入到基因中。經(jīng)過BamHⅠ/SacⅠ雙消化后，得到的片段用于替換DisPf150表達(dá)載體中相應(yīng)的插入序列。得到的基因編碼369個(gè)氨基酸長的多肽，它包含盤基蛋白標(biāo)記的257個(gè)殘基、凝血酶裂解位點(diǎn)的8個(gè)殘基和來自CS基因的108個(gè)氨基酸。
Dis-PyCter構(gòu)建體的構(gòu)建過程與Dis-PfCter相似，不同的是編碼來源于CS基因的羧基末端片段((Asn277至Ser345)的PCR產(chǎn)物由尤氏瘧原蟲17X(de la Cruz等人，1988)DNA擴(kuò)增得到，并用于替換DisPf150表達(dá)載體中的BamHⅠ/SacⅠ插入序列。下述兩個(gè)寡核苷酸分別用作5’和3’擴(kuò)增引物5’GGTGGATCCAGGAATTCAAAATGAAGATTCTTATGTCCCA3’5’CGTACGAGCTCTTAAGATATCAATGAACAMATCCATMAC3’5’擴(kuò)增引物能夠和CSP基因的21個(gè)核苷酸雜交。在CSP序列的上游，5’擴(kuò)增引物包含BamHⅠ限制性位點(diǎn)和代表EcoRⅠ限制性位點(diǎn)及編碼氨基酸G、Ⅰ、Q的10個(gè)核苷酸。
3’擴(kuò)增引物可以與CSP基因的20個(gè)核苷酸雜交，并且能夠使另外12個(gè)核苷酸插入基因，所述12個(gè)核苷酸包含EcoR V限制性位點(diǎn)和位于氨基酸L、I、S與SacⅠ限制性位點(diǎn)上游的框內(nèi)終止密碼子UAA之間的編碼賴氨酸-異亮氨酸-絲氨酸連接頭。得到的基因編碼340個(gè)氨基酸長的多肽，它包含257+8盤基蛋白-凝血酶位點(diǎn)序列，其后是尤氏瘧原蟲CSP的79個(gè)殘基。
用于Dis-PyCter融合蛋白質(zhì)(其包含氨基末端ER轉(zhuǎn)位信號(hào)肽)(PS-Dis-PyCter)的表達(dá)載體衍生自Dis-PyCter表達(dá)載體(如前所述)，其中，肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子已經(jīng)由肌動(dòng)蛋白15啟動(dòng)子替代(Knecht等人，1986)，其后是盤基網(wǎng)柄菌PsA信號(hào)肽(Early等人，1988)。盤基網(wǎng)柄菌PsA前導(dǎo)肽(氨基酸1-12)是通過PCR由pMUW1630載體(K.Williams和M.Slade，生物科學(xué)院，麥克夸利大學(xué)，悉尼，澳大利亞)擴(kuò)增得到，其中分別使用了5’AGCTCGAGATTCACAAATTAATTAATCCCATC3’和5’AATCTAGATTCATATGCATTGGCGTATGTTAA3’作為5’和3’擴(kuò)增引物。
5’擴(kuò)增引物能夠和肌動(dòng)蛋白15啟動(dòng)子的20個(gè)核苷酸雜交，并在序列上游包含XhoⅠ限制性位點(diǎn)。3’擴(kuò)增引物可以和PsA基因的24個(gè)核苷酸雜交，并且在序列下游包含XbaⅠ限制性位點(diǎn)。擴(kuò)增完成并且經(jīng)XhoⅠ和XbaⅠ限制性消化后，將DNA片段插入到Dis-PyCter載體用以替代肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子。
最終得到的載體編碼開始于與盤基蛋白Ⅰa(氨基酸位置3T→R)的第二個(gè)氨基酸融合的PsA蛋白質(zhì)前21個(gè)氨基酸(前導(dǎo)肽的裂解發(fā)生在第19殘基之后)。因而，在蛋白質(zhì)的加工過程中的信號(hào)肽的裂解可以產(chǎn)生僅僅比Dis-PyCter構(gòu)建體表達(dá)得到的蛋白質(zhì)多一個(gè)氨基酸的融合蛋白質(zhì)。
Dis-Pf150的一個(gè)截短形式，即(74-229)DisPf150是通過PCR的方法分別使用如下寡核苷酸5’AATCTAGAGTTGCTGCTCTCCAAGGTCGTGGT3’和5’AGGGATCCATATCGAAACCMGGTGGTAATGTT3’作為5’和3’擴(kuò)增引物，對(duì)Dis-PH50中編碼盤基蛋白Ⅰa的DNA區(qū)Val74至Asp229進(jìn)行擴(kuò)增而構(gòu)建出來的。
以與構(gòu)建DisPf150相似的方法，PCR產(chǎn)物插入到肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子旁，而信號(hào)肽由截短的盤基蛋白Ⅰ替代。3．細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染如Anjard等人(1992)所述，使用電穿孔法用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染純培養(yǎng)的盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞AX2。在滕黃微球菌(Micrococcus luteus)PRF3菌苔上在G418選擇下選擇克隆轉(zhuǎn)化子(Wilczynska和Fisher,1994)。在22℃HL5培養(yǎng)基(Sussman,1987)中，在G418的濃度最高增加到50-100μg/ml的條件下選擇穩(wěn)定細(xì)胞株。4．重組蛋白質(zhì)的純化培養(yǎng)物在HL5中生長至約7×106細(xì)胞/ml。300g離心5分鐘收獲細(xì)胞，然后將細(xì)胞沉淀按2×108細(xì)胞/ml的比例重懸于包含1％曲拉通X-100,5mM苯甲脒，0.1單位/ml抑酶肽，50μg/ml胰蛋白酶抑制劑和2μg/ml抗蛋白酶的TBS(25mM Tris,pH7.4,137mM NaCl,2.7mM KCl)裂解溶液中。一個(gè)凍融循環(huán)后，裂解物在5℃下10000g離心15分鐘。將上清中CaCl2調(diào)到10mM，然后將其上樣于用補(bǔ)充有10mMCaCl2的裂解溶液預(yù)平衡的Sepharose 4B層析柱上。每4×108細(xì)胞使用1ml柱床體積。使用20倍柱床體積的TBS，包含蛋白酶抑制劑的10mM CaCl2洗柱。使用0.3M的半乳糖TBS溶液洗脫蛋白質(zhì)，每級(jí)分0.7柱床體積，約90％的融合蛋白質(zhì)在第2-4級(jí)分中洗脫下。5.凝膠電泳與免疫印跡使用3×Laemmli樣品緩沖液(包含200mM DDT)(Laemmli,1970)在80℃加熱10分鐘來制備15μl純化級(jí)分樣品或2μl原始裂解物(總級(jí)分)的可溶性級(jí)分。對(duì)于Sepharose柱流出級(jí)分，將其上樣體積調(diào)整到與總級(jí)分有相同蛋白質(zhì)量的程度。使用考馬斯藍(lán)/貝斯麥棕R染色(Choi等人，1996)或銀染(Morrissey,1981)顯示蛋白質(zhì)。通過半干電轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western印跡分析。用包含4％脫脂牛奶的PBS封閉后，將膜在不同類型的血清和mAb中溫育，例如如圖中所示的針對(duì)已合成的(NANP)50-重復(fù)的Sp3E9mAb。
在含0.02％吐溫的PBS中洗滌3次后，將膜在按1/2000稀釋于PBS-牛奶中的過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠血清或過氧化物酶偶聯(lián)的蛋白A中孵育1小時(shí)。洗膜后，按照制造商的使用說明使用ECL試劑盒進(jìn)行免疫染色。結(jié)果1．細(xì)胞內(nèi)盤基蛋白標(biāo)記的蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化用作蛋白質(zhì)純化標(biāo)記的潛在盤基蛋白Ⅰ是通過將其與包含氨基酸282-382(圖1)的惡性瘧原蟲CSP蛋白質(zhì)羧基末端的一個(gè)片段進(jìn)行融合來評(píng)價(jià)的。使用PCR的方法從基因組DNA擴(kuò)增出盤基蛋白Ⅰ編碼區(qū)域，并且為了產(chǎn)生與盤基網(wǎng)柄菌表達(dá)載體(見材料與方法)相容的片段，加入了方便的限制性酶切位點(diǎn)。產(chǎn)生的載體pAC6-Dis-PfCter通過電穿孔的方法用于盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞純培養(yǎng)株AX2。
使用濃度高達(dá)50μg/ml的G418選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化株之后，通過免疫印跡對(duì)融合蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行了分析，并且與用只攜帶選擇標(biāo)記的載體(DP4)(Aniard等人，1992)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行比較。
使用針對(duì)惡性瘧原蟲羧基末端肽(Roggero等人，1995)的小鼠抗血清(Ⅳ-4)在Western印跡中發(fā)現(xiàn)了在對(duì)照組DP4株中不存在的44kDa的蛋白質(zhì)，該大小是預(yù)期的Dis-pfCter蛋白質(zhì)的大小。(圖2A)。一條更低一些的區(qū)帶的存在顯示可能發(fā)生了蛋白質(zhì)的部分降解或不完全合成。Dis-PfCter的聚集程度隨著細(xì)胞密度變化，在大約7×106細(xì)胞/ml附近時(shí)達(dá)到最大。
使用Sepharose 4B層析(Simpson等人，1974)之盤基蛋白Ⅰ、Ⅱ的純化操作可以允許對(duì)Dis-PfCter進(jìn)行部分純化(圖2A和C)。44kDa的蛋白質(zhì)(箭頭所示)可以在0.3M半乳糖加入時(shí)于第二和第三級(jí)分中從樹脂中洗脫下來，同時(shí)洗脫下來的還有內(nèi)源性盤基蛋白(25和28kDa)。在Western印跡中還發(fā)現(xiàn)大約35kDa的中等大小的區(qū)帶。在DP4級(jí)分中44和35kDa蛋白質(zhì)的缺失(圖2B)說明考馬斯藍(lán)染色的區(qū)帶確實(shí)是Dis-PfCter或其衍生物。而且，使用梯度而不是0.3M半乳糖的洗脫顯示，盤基蛋白Ⅰ和重組蛋白質(zhì)同時(shí)在200和220mM半乳糖之間洗脫下來，而盤基蛋白Ⅱ的洗脫則需略微高些的半乳糖濃度(未列出數(shù)據(jù))。使用這樣的方法，采用Bradford分析(Bradford,1976)和考馬斯染色膠的密度度量分析(Choi等人，1996)進(jìn)行鑒定，大約每升培養(yǎng)物可以分離出1-2mg的融合蛋白質(zhì)。計(jì)算得到的純化因子大約是30倍，用Western印跡分析測得回收率主要隨著實(shí)驗(yàn)中所用的Sepharose/蛋白質(zhì)比率的變化在50％-70％之間變化。綜合上述結(jié)果，可以估計(jì)出Dis-PfCter至少占盤基網(wǎng)柄菌可溶性蛋白質(zhì)的1％。
進(jìn)一步分析了是否有其它的蛋白質(zhì)可以與Dis標(biāo)記連接而不影響其Sepharose結(jié)合活性。來源于尤氏瘧原蟲的CSP的羧基末端區(qū)(PyCter)有著與PfCter不同的氨基酸組成(de la Cruz等人，1988)。編碼尤氏瘧原蟲CSP的277-344殘基的DNA符合讀框地克隆入盤基蛋白Ⅰ的編碼序列，得到的基因置于肌動(dòng)蛋白6啟動(dòng)子控制之下。使用針對(duì)尤氏瘧原蟲CSP羧基末端(參見材料與方法)的小鼠血清(J-Ⅲ)在用pAC6-Dis-PyCter質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞中檢測出大約35kDa的一條區(qū)帶(圖3A)。Dis-PyCter融合蛋白質(zhì)與Sepharose 4B的結(jié)合以及用半乳糖來洗脫都與Dis-PfCter相似(圖3A)，這些使得使用考馬斯藍(lán)染色可以檢測出大約35kDa的蛋白質(zhì)。每升培養(yǎng)物累積大約0.2mg Dis-PfCter蛋白質(zhì)。因而這些結(jié)果證實(shí)了盤基蛋白Ⅰ作為用于重組多肽純化標(biāo)記的可應(yīng)用性。
為了檢查是否更大的蛋白質(zhì)可以通過使用盤基蛋白Ⅰ融合載體進(jìn)行表達(dá)，只缺少最后23個(gè)氨基酸的PfFCSP的一種形式CS150(Reymond等人，1995)與盤基蛋白Ⅰ進(jìn)行了融合，并在盤基網(wǎng)柄菌中進(jìn)行了表達(dá)。雖然表達(dá)水平比Dis-PfCter低(大約每升0.1mg，)，但是在用針對(duì)(NANP)3重復(fù)(Boulanger等人，1988)(圖4A)的SP3E9單克隆抗體或針對(duì)CSP282-382(未列出數(shù)據(jù))的小鼠血清染色的細(xì)胞裂解物免疫印跡中，發(fā)現(xiàn)了大約84KDa的一條區(qū)帶。這一蛋白質(zhì)可以在與Dis-PfCter和Dis-PyCter相似的條件下采用Sepharose親和層析進(jìn)行純化。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證融合蛋白質(zhì)對(duì)Sepharose結(jié)合的特異性，刪除了盤基蛋白Ⅰ的前73個(gè)氨基酸，并將刪除后的多肽與惡性瘧原蟲CS150((74-229)DisPf150)融合。(74-229)DisPf150不能夠與Sepharose 4B結(jié)合，說明盤基蛋白Ⅰ的氨基末端的1-73殘基對(duì)于其結(jié)合活性是必需的(圖4B)。2．細(xì)胞外盤基蛋白標(biāo)記的蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化既然盤基蛋白是由盤基網(wǎng)柄菌向外排出的(Barondes等人，1983；Barondes等人，1985)，那么我們就研究了Dis標(biāo)記的蛋白質(zhì)在細(xì)胞外培養(yǎng)基中的存在情況，并且評(píng)價(jià)了其與Sepharose 4B的親和性。Dis-PfCter和Dis-Pf150都可以通過Western印跡的方法在培養(yǎng)基中檢測出，其水平可以達(dá)到產(chǎn)生的總的融合蛋白質(zhì)的20-50％之間(圖4C，數(shù)據(jù)未列出)。那么我們就要問使用刪除突變體，缺失前72個(gè)盤基蛋白氨基酸的分泌是否需要盤基蛋白部分。雖然(73-229)Dis-Pf150在細(xì)胞內(nèi)聚積可以達(dá)到與全長的Dis-Pf150相似的水平，但是在細(xì)胞外培養(yǎng)基中檢測不到融合蛋白質(zhì)(圖4C)。這些結(jié)果提示，要進(jìn)行分泌需要盤基蛋白標(biāo)記的完整性。3．ER信號(hào)肽的加入產(chǎn)生Dis-PyCter的N-糖基化盤基蛋白Ⅰ和盤基蛋白Ⅱ進(jìn)入細(xì)胞外空間的途徑還沒有完全研究清楚。盤基蛋白Ⅰ的氨基酸序列中包含4個(gè)潛在的Asn-X-Ser/Thr-X的N糖基化位點(diǎn)。但是，缺少信號(hào)肽以及缺少關(guān)于盤基蛋白糖基化的相關(guān)報(bào)道說明，蛋白質(zhì)是通過一個(gè)可能不包含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體的途徑到達(dá)細(xì)胞外空間。
為了特異性地將融合蛋白質(zhì)定位到ER/高爾基體分泌途徑，將來源于盤基網(wǎng)柄菌PsA細(xì)胞表面抗原的信號(hào)肽(Early等人，1988)與Dis-PyCter的氨基末端融合。沒有任何SP-Dis-PyCter蛋白質(zhì)進(jìn)行了分泌(數(shù)據(jù)未列出)。而且，SP-Dis-PyCter不能與Sepharose 4B結(jié)合(數(shù)據(jù)未列出)。如Western印跡分析，SP-Dis-PyCter蛋白質(zhì)與DispyCter相比以相似的水平進(jìn)行表達(dá)，但前者比后者大了約15kDa(參見圖5)。
SP-Dis-PyCter和Dis-PyCter細(xì)胞裂解物之間可見15kDa的差異比信號(hào)肽本身的19個(gè)氨基酸大。既然盤基蛋白Ⅰ中包含4個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(39-42NGTN,97-100NLSW,212-215NQTR,222-225NITT)以及表達(dá)的尤氏瘧原蟲CSP中另外的一個(gè)糖基化位點(diǎn)(328-331NLTL)，因而SP-Dis-PyCter大小的增加反映了它的糖基化。
實(shí)際上，用聚糖酶F處理導(dǎo)致SP-Dis-PyCter區(qū)帶分子量向下遷移約35kDa(圖5)，從而與Dis-PyCter接近。作為對(duì)照，缺少PsA信號(hào)肽的DisPyCter用聚糖酶F處理后，其在SDS PAGE凝膠電泳上的遷移率并不改變(圖5)。SP-Dis-PyCter糖基化的另一個(gè)證明是通過向培養(yǎng)基中加入N糖基化阻斷劑衣霉素后，導(dǎo)致更低分子量形式的出現(xiàn)而得到的(數(shù)據(jù)未列出)。這些結(jié)果說明向融合蛋白質(zhì)提供信號(hào)肽可以導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)向ER/高爾基體區(qū)室定位，隨后在該處被糖基化。4．盤基蛋白標(biāo)記的去除為了能夠?qū)⒈P基蛋白標(biāo)記從重組蛋白質(zhì)中去除，在Dis標(biāo)記和尤氏瘧原蟲羧基末端肽之間插入凝血酶裂解位點(diǎn)(參見圖1)。如圖6所示，重組蛋白質(zhì)的大小隨著凝血酶的濃度上升而減小，說明盤基蛋白標(biāo)記可被裂解除去。討論將重組蛋白質(zhì)與盤基蛋白Ⅰ融合可以僅僅使用Sepharose 4B，以單一步驟去除絕大多數(shù)的雜質(zhì)。既然缺失突變體不能與親和樹脂結(jié)合，那么就需要保持盤基蛋白部分的完整性。對(duì)于所有的細(xì)胞質(zhì)融合蛋白質(zhì)，盤基蛋白標(biāo)記在與Sepharose結(jié)合方面是完全有功能的，與內(nèi)源性的盤基蛋白Ⅰ相比在親和性方面沒有顯著的差異。正如使用考馬斯和銀染色所示，除了內(nèi)源性的盤基蛋白，幾乎沒有其他的蛋白質(zhì)可共同純化，因而此純化系統(tǒng)是有效的?；诓煌姆椒?如離子交換層析、分子排阻或高效液相層析)的額外步驟可以向上述過程中加入，以將融合蛋白質(zhì)與盤基蛋白分離。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二次通過Sepharose 4B的滯留，可從融合蛋白質(zhì)中去除盤基蛋白標(biāo)記。為此，在盤基蛋白Ⅰ和CSP序列之間加入凝血酶裂解位點(diǎn)。在蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)附近加入多聚甘氨酸連接頭可能進(jìn)一步有助于盤基蛋白Ⅰ標(biāo)記除去。
將重組蛋白質(zhì)向細(xì)胞外培養(yǎng)基定位可以簡化純化，并且可以允許次級(jí)修飾。本發(fā)明顯示通過加入來源于前孢子抗原PsA蛋白質(zhì)的21個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽，而使融合蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體定位，這導(dǎo)致尤氏瘧原蟲CSP(328-331 NLTL)和盤基蛋白Ⅰ(39-42 NGTN,97-100 NLSW,212-215 NQTR,222-225 NITT)潛在位點(diǎn)中至少有一些糖基化。
本發(fā)明顯示盤基蛋白標(biāo)記可以用于純化融合蛋白質(zhì)。如果使用正確的表達(dá)載體以及某些密碼子可能在序列上改變一下，這一特性可以應(yīng)用于包括從大腸桿菌到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的其它表達(dá)系統(tǒng)。而且，本發(fā)明還顯示，盤基網(wǎng)柄菌組成了用于可以作為亞單位疫苗成分或其他生物技術(shù)應(yīng)用的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的誘人選擇。與其它許多類型的細(xì)菌相比，盤基網(wǎng)柄菌沒有致病性且不會(huì)產(chǎn)生腸毒素。因此，用于動(dòng)物或人類注射的蛋白質(zhì)之純化應(yīng)當(dāng)可以大大簡化。免疫實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞裂解物對(duì)于小鼠(Reymond等人，1995)或猴(N.Fasel,C.Reymond，和S.Herrera，未發(fā)表之結(jié)果)是無毒的，這使得使用無微量毒性成分風(fēng)險(xiǎn)的純化多肽進(jìn)行人類免疫變得可行。
除了簡單的生長需要以及可獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系，盤基網(wǎng)柄菌還具有多個(gè)特點(diǎn)，這使得比使用其它生物體(例如細(xì)菌和酵母)時(shí)的操作更容易。由于沒有細(xì)胞壁，所以允許將細(xì)胞快速且容易的裂解，方法是通過使用低百分比的曲拉通X-100的凍融過程。這應(yīng)當(dāng)可以筒化將脆弱的蛋白質(zhì)以活性形式進(jìn)行分離的過程。本發(fā)明提出的基于盤基蛋白標(biāo)記和Sepharose 4B作為廉價(jià)親和載體的直接純化方法，應(yīng)當(dāng)可以提高盤基網(wǎng)柄菌在生物技術(shù)方面的應(yīng)用價(jià)值。
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權(quán)利要求
1．用于產(chǎn)生重組多肽的表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含至少由下述可操作連接的元件組成的表達(dá)盒a)啟動(dòng)子；b)作為一種純化標(biāo)記序列的編碼凝集素結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA之編碼區(qū)，尤其是編碼盤基蛋白蛋白質(zhì)家族成員的DNA；c)用于接受待產(chǎn)生的重組多肽之編碼區(qū)的克隆位點(diǎn)；以及d)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
2．如權(quán)利要求1所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中純化標(biāo)記序列置于緊鄰克隆位點(diǎn)處，啟動(dòng)子的下游。
3．如權(quán)利要求1和2所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中裂解位點(diǎn)位于純化標(biāo)記序列和克隆位點(diǎn)之間。
4．如權(quán)利要求1-3所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中用于將所要產(chǎn)生的多肽定位于特定細(xì)胞區(qū)室的信號(hào)肽位于啟動(dòng)子下游，且在純化標(biāo)記序列或克隆位點(diǎn)之前。
5．如權(quán)利要求1-4所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中純化標(biāo)記序列編碼盤基蛋白Ⅰa。
6．如權(quán)利要求1-4所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中純化標(biāo)記序列編碼盤基蛋白Ⅱ。
7．如權(quán)利要求3-6所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中裂解位點(diǎn)是凝血酶的裂解位點(diǎn)。
8．如權(quán)利要求7所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中凝血酶裂解位點(diǎn)由編碼氨基酸序列LVPRGSDP的DNA序列構(gòu)成。
9．如權(quán)利要求4-8所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中用于定位的信號(hào)肽用于將多肽定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
10．如權(quán)利要求9所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中用于定位的信號(hào)肽是來源于前孢子抗原(PsA)蛋白質(zhì)的21個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽。
11．用于產(chǎn)生多肽的方法中的如權(quán)利要求1-10所述的表達(dá)構(gòu)建體。
12．包含如權(quán)利要求1-10所述的表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)載體。
13．用于產(chǎn)生多肽的方法中的如權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體。
14．用于產(chǎn)生多肽的方法，包括a)通過將多肽的編碼序列克隆到如權(quán)利要求12所述的表達(dá)載體之克隆位點(diǎn)，來制備用于所要產(chǎn)生的多肽的表達(dá)載體；b)使用由上得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化一種合適的宿主細(xì)胞；c)在允許融合多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述融合多肽包含純化標(biāo)記的氨基酸序列以及共價(jià)連接于其上的要表達(dá)的多肽的氨基酸序列；以及d)通過純化標(biāo)記的氨基酸序列將存在于宿主細(xì)胞或培養(yǎng)液中的融合多肽與多糖基質(zhì)結(jié)合，然后將融合多肽從基質(zhì)上洗脫下來的方法，從宿主細(xì)胞或其培養(yǎng)液中分離融合多肽；以及e)除去純化標(biāo)記的氨基酸序列。
15．如權(quán)利要求14所述的方法，其中載體包含如權(quán)利要求3-10所述的構(gòu)建體，除去純化標(biāo)記是通過裂解位點(diǎn)將融合多肽中純化標(biāo)記的氨基酸序列裂解來進(jìn)行。
16．如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中基質(zhì)是Sepharose 4B，洗脫是用半乳糖進(jìn)行。
17．如權(quán)利要求14或15所述的方法，其中多糖基質(zhì)是一種有乙酰半乳糖胺基團(tuán)偶聯(lián)于其上的瓊脂糖基質(zhì)，洗脫是用半乳糖進(jìn)行。
18．如權(quán)利要求17所述的方法，其中Sepharose 4B基質(zhì)是珠的形式。
19．通過如權(quán)利要求14和16-18所述的方法可以獲得的融合多肽。
20．通過如權(quán)利要求15-18所述的方法純化的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可以通過單一步驟純化方法而得到應(yīng)用的表達(dá)載體。重組蛋白質(zhì)以一種與凝集素,特別是與作為純化的標(biāo)記的盤基蛋白,融合的蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生。此融合蛋白質(zhì)可以在Sepharose 4B層析柱上使用半乳糖作為洗脫液被純化。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1305531SQ99807293
公開日2001年7月25日 申請(qǐng)日期1999年6月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月16日
發(fā)明者C·D·雷蒙德, N·J·法賽爾 申請(qǐng)人:Rmf迪克塔吉恩有限公司