專利名稱：分枝桿菌的突變株及其在潛在抗生素載體篩選中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到分枝桿菌的新突變株及其在潛在抗生素載體篩選中的應(yīng)用。
分枝桿菌感染導(dǎo)致的問題在不斷地增加。一些對(duì)化療藥物具廣譜抗性的菌株的出現(xiàn)更使這一問題加劇。因而，尋找新的活性物質(zhì)和作用機(jī)制勢(shì)在必行。
分枝桿菌的細(xì)胞壁對(duì)化療藥物的透過率較低是限制藥物抗分枝桿菌效用的一個(gè)重要因素(Suzuki,A.E.,Inamine,J.M.:Res.Microbiol.145,1994,210-213；Jarlier,V.,Nikaido,H.:FEMSMicrobiol.Lett.123,1994,11-28)。
克服這一障礙的一個(gè)概念性的方法是將抗生素同可被病原微生物主動(dòng)吸收的載體相耦聯(lián)。
鐵螯合試劑(鐵載體)可被用于作這樣的載體。在感染部位缺乏鐵離子的情況下，許多病原微生物可形成鐵載體并將其分泌至外環(huán)境。Fe3+-鐵載體可通過特異的受體同細(xì)胞表面相結(jié)合，然后被依賴于ATP的滲透酶轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)胞內(nèi)。已知革蘭氏陰性菌不僅可以吸收其自身產(chǎn)生的鐵載體，還可吸收其他種類有機(jī)體形成的鐵載體(外源鐵載體)。
對(duì)于分枝桿菌的攝鐵系統(tǒng)目前所知較少(綜述Wheeler,P.R.,Ratledge,C.:in Bloom,B.R.ed.:Tuberculosis,ASM Press,Washington,DC,1994)。迄今為止確認(rèn)了兩種類型的鐵載體，即結(jié)合與膜上的親脂的分枝菌素(Snow,G.A.:Bacteriological Reviews34,1970,99-125)以及胞外的疏脂的鐵外螯合素(Macham,L.P.etal.:J.Gen.Microbiol.101,1977,41-49；Hall,R.,Ratledge,C.:J.Gen.Microbiol.133,1987,193-199)。恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)(Sharman et al.:Biochem.J.305,1995,187-196),新金色分枝桿菌(M.neoaurum)(Sharman et al.:Chemistry & Biology 2,1995,553-561)和結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)(Gobin et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,1995,5189-5193)所形成鐵外螯合素的結(jié)構(gòu)已被確認(rèn)。許多種分枝菌素的結(jié)構(gòu)亦已闡明(Snow,G.A.:Bacteriol.Rev.34,1970,99-125)。
從恥垢分枝桿菌，確定了第一個(gè)參與鐵外螯合素的生物合成和可能涉及Fe3+-鐵外螯合素的吸收的基因(Fiss,E.H.et al.:Molecular Microbiology 14,1994,557-569)。有四個(gè)開放讀碼框架中的三個(gè)(fxuA,fxuB,fxuC)所推測(cè)出的蛋白與大腸桿菌的一些膜蛋白具同源性，這些大腸桿菌中的膜蛋白參與腸肝菌素的吸收。因此，這些開放讀碼框架編碼的蛋白估計(jì)為Fe3+-鐵外螯合素滲透酶的亞基，但迄今為止仍無證據(jù)。第四個(gè)開放讀碼框架(fxbA)編碼一個(gè)參與鐵外螯合素的生物合成的蛋白。這已被一個(gè)生物合成突變體的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。
通過鐵外螯合素/分枝菌素的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)過程的細(xì)節(jié)仍屬未知。分枝桿菌對(duì)外源鐵載體的吸收也同樣所知較少。迄今為止僅僅表明恥垢分枝桿菌可以利用不同的外源鐵載體(Matzanke,B.F.et al.:BioMetals 10,1997,193-203)。是否這些外源鐵載體通過特異的攝取系統(tǒng)被吸收，是否它們因此是潛在的的抗生素載體，這些問題只能通過昂貴的Mssbauer光譜法來闡明(Matzanke,B.F.:HyperfineInteractions 112,1998,123-128)。由于這一方法需大量的底物和非常昂貴的設(shè)備因此而不適于檢測(cè)。它只限于少數(shù)幾個(gè)高度專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室，且用于處理的樣品只有很有限的產(chǎn)出。
本發(fā)明的主要目的在于提供一種非放射性的經(jīng)濟(jì)有效的方法用于檢測(cè)對(duì)天然或外源的鐵載體以及化學(xué)類似物的吸收，這些物質(zhì)可能成為潛在的抗生素載體。
根據(jù)本發(fā)明，這一目的已經(jīng)達(dá)到。這是由于一套分枝桿菌的突變體已被生產(chǎn)出，各突變體分別被去除了鐵外螯合素/分枝菌素轉(zhuǎn)運(yùn)體系的不同組分。這套突變體構(gòu)成了一個(gè)快速、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)程序的基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明涉及到一種檢測(cè)分枝桿菌潛在的抗生素載體的方法。本方法的特征在于突變體中編碼鐵載體相關(guān)的鐵攝取系統(tǒng)的基因被去除活性，這些突變體被用于適當(dāng)?shù)臋z測(cè)程序而檢出在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中不依賴鐵外螯合素/分枝菌素轉(zhuǎn)運(yùn)體系的鐵載體。
一個(gè)適于本發(fā)明的檢測(cè)程序是固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)刺激實(shí)驗(yàn)。為這個(gè)目的，突變體在缺乏鐵的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待測(cè)的鐵載體被加在培養(yǎng)基上界定的區(qū)域內(nèi)。在該區(qū)域內(nèi)突變體生長(zhǎng)變活躍表明是否所加物質(zhì)中的鐵可被突變體利用。
令人驚奇的是，通過這一快速簡(jiǎn)單高產(chǎn)出的檢測(cè)方法可以確認(rèn)出轉(zhuǎn)運(yùn)入胞過程中不依賴鐵外螯合素/分枝菌素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的鐵載體。使用不同的突變體，本方法可以用于檢測(cè)不與鐵外螯合素或分枝菌素進(jìn)行配體交換的鐵載體。只有這樣的鐵載體才可能成為抗生素載體，因?yàn)槠渌蔫F載體將不能被轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法并不限于固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)刺激實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)也可在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行。
在本方法中，利用鐵外螯合素/分枝菌素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中特定單個(gè)組分被阻斷所形成的不同突變體，還可以獲得在轉(zhuǎn)運(yùn)體系中各組分參與外源鐵載體吸收的程度的信息。迄今為止，通過以前的Mossbauer光譜法(用Fe57)或用以檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞的鐵吸收的Fe55放射轉(zhuǎn)運(yùn)法還不能獲得這種信息。本發(fā)明進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是不需要放射性的或富集的穩(wěn)定同位素。
本發(fā)明的檢測(cè)方法所用的分枝桿菌突變體是通過使編碼鐵載體依賴的攝鐵體系組分的基因失活而產(chǎn)生的。突變的產(chǎn)生使用了本領(lǐng)域的幾種方法之一a)通過化學(xué)或物理突變?cè)a(chǎn)生突變，b)通過基因替換，即以一標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因替換整個(gè)或部分基因，c)通過插入失活(插入一標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因，使之失活)或刪除失活(刪除整個(gè)或部分基因使之失活)，d)綜合使用以上方法。
為了使產(chǎn)生的突變體盡可能地包括鐵外螯合素/分枝菌素轉(zhuǎn)運(yùn)體系的各重要組分，了解整個(gè)Fe+-鐵外螯合素?cái)z取基因簇是十分有益的。因此，Mycobacterium smegmatis菌株mc2155(Snapper et al.:Mol Microbiol 4,1990,1911-1919)上與fxuC相鄰的染色體片斷已被克隆出來，在本發(fā)明范圍內(nèi)的一個(gè)新的開放讀碼框架(fxuD)已被確認(rèn)，它很有可能屬于Fe3+-鐵外螯合素?cái)z取基因簇。圖一顯示的是由四個(gè)Fe3+-鐵外螯合素?cái)z取基因組成的基因簇的限制性內(nèi)切圖譜，這些基因已被確認(rèn)。圖二顯示的是與fxuC毗鄰的染色體片斷的核苷酸序列以及依此推導(dǎo)出的FxuD氨基酸序列。
本發(fā)明的檢測(cè)方法以恥垢分枝桿菌的突變體為例說明。除此之外，其他快速生長(zhǎng)的分枝桿菌如草分枝桿菌(Mycobacteriumphlei)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、金色分枝桿菌(M.aurum)、偶發(fā)分枝桿菌(M.for tuitum)或龜分枝桿菌(M.chelonae)，其相對(duì)應(yīng)突變體可類似地使用。而且，使用快速生長(zhǎng)的分枝桿菌如牛分枝桿菌(M.bovis)、鳥分枝桿菌(M.avium)或結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)也是可能的。
下文的恥垢分枝桿菌菌株于1998年2月4日保存于DeutscheSammlung von Mikroorgnismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1B,D-38124 Braunschweig(DSMZ)保藏號(hào)恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)M24(DSM 12084),恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)B1(DSM 12085)and大腸桿菌(Escherichia coli)TOP10F’pGS4(DSM 12083)。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及到一些分枝桿菌的突變體，其特征在于參與分枝菌素生物合成的基因失活，或/和編碼鐵外螯合素依賴的攝鐵體系中的組分的基因被以基因替換、刪除或插入的方法去除。
在一個(gè)優(yōu)選的方案中，本發(fā)明涉及到一些分枝桿菌的突變體，其參與分枝菌素生物合成的一些基因已被失活。
在一個(gè)更優(yōu)選的方案中，本發(fā)明涉及到的分枝桿菌突變體有一個(gè)或更多選自fxbA、fxuA、fxuc和fxuD編碼鐵外螯合素依賴的攝鐵體系中組分的基因被除去。還可視需要除去參與分枝菌素合成的基因。
本發(fā)明特別涉及到實(shí)施例中講述的分枝桿菌的突變體，尤其是恥垢分桿桿菌的突變體。
聯(lián)系隨后的例子本發(fā)明將被非常詳細(xì)的解釋，以下的圖用于對(duì)例子進(jìn)一步的說明

圖1是鐵外螯合素基因簇的限制性內(nèi)切2顯示包括有側(cè)翼序列的fxuD基因的核苷酸序列圖3顯示fxbA的刪除的構(gòu)建物圖4顯示fxuA的刪除的構(gòu)建物圖5是質(zhì)粒pGS52的限制性內(nèi)切6顯示pGS41和pGS56的插入圖8是質(zhì)粒pGS57的限制性內(nèi)切圖例一恥垢分枝桿菌M24突變體的產(chǎn)生為產(chǎn)生分枝菌素生物合成的重要功能封阻的突變體，用N-nitrosomethyl-N-硝基-胍對(duì)Mycobacterium smegmatis mc2155(Snapper et al.:Mol Microbiol 4,1990,1911-1919)進(jìn)行化學(xué)誘變。突變體Mycobacterium smegmatis M24(DSM 12084)由于其缺乏紫外熒光而從存活細(xì)胞中被分離出。可以通過高壓液相色譜和電噴射質(zhì)譜學(xué)方法獲得其缺乏分枝菌素積累的證據(jù)。鐵外螯合素的生物合成不受產(chǎn)生突變的影響。
例二恥垢分枝桿菌B1和B2突變體的產(chǎn)生FxbA基因以基因替換的方法刪除。該過程中全基因被來自pUC4K的卡那霉素抗性基因(Pharmacia Biotech Europe GmbH)所取代。為達(dá)到這一目的，質(zhì)粒pGS31(圖3)是必需的，其構(gòu)建如下通過PCR方法獲得了染色體上緊鄰M24中被刪除基因的片斷，即長(zhǎng)507bp的片斷B7/8和758bp的片斷B5/6。以下的寡聚核苷酸被用作PCR的引物片斷B7/8:CAGGATCCATTGGTAAGCCTTACC 序列號(hào)No.1GATCTAGAGCTGGTTCAGGGCGATG 序列號(hào)No.2片段B5/6:ACGAATTCACACGCCAGAGAACGC 序列號(hào)No.3CAGGATCCTGATCTGGCAATTCCAG 序列號(hào)No.4在這一步人工引入了限制性內(nèi)切位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可使兩片斷以與其在染色體上相同的方向引入載體pUC118(Boehringer IngelheimBioproducts)上卡那霉素抗性基因的相鄰處。這樣便構(gòu)建完成質(zhì)粒pGS31(圖3)。
以質(zhì)粒pGS31轉(zhuǎn)化菌株Mycobacterium smegmatis mc2155和M24，并使用含卡那霉素的培養(yǎng)基選出卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子。這些克隆被用以檢測(cè)其鐵外螯合素的生物合成能力。克隆恥垢分枝桿菌B1(DSM12985)由mc2155菌株分離出，克隆恥垢分枝桿菌B3從M24分離出，這些克隆均不分泌鐵外螯合素。通過PCR的方法獲得的證據(jù)表明其鐵外螯合素陰性表現(xiàn)型是基于fxbA被卡那霉素抗性基因替換而成。這一替換是由克隆入pGS31上的染色體片斷和其在染色體上的同源序列發(fā)生同源重組而造成。
克隆B1不同于Fiss等人發(fā)表的fxbA突變體，后者是通過非特征化的化學(xué)誘變而獲得，同時(shí)，一個(gè)特定的基因替換確保了B1突變的穩(wěn)定。
例三恥垢分枝桿菌U1突變體的產(chǎn)生與例二相似，fxuA的刪除是通過“基因替換”完成的。為此目的而必需的質(zhì)粒pGS22的構(gòu)建如下通過PCR方法獲得了M24中染色體上緊鄰的fxuA基因的片斷，即長(zhǎng)768bp的片斷U1/5和755bp的片斷U6/7。以下的寡聚核苷酸被用作PCR的引物片斷U1/5:ACGAATTCGAGATCCTCGGCATCAAC序列號(hào)No.5CAGGATCCTGGCGCTTCCCGAAATC 序列號(hào)No.6片斷U6/7:GAGGATCCTGAAAGAACATATGACTC序列號(hào)No.7TATCTAGACAAGATCGGCCGACATC 序列號(hào)No.8在這一步人工引入了限制性內(nèi)切位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可使兩片斷以與其在染色體上相同的方向引入載體pUC118(Boehringer IngelheimBioproducts)上卡那霉素抗性基因的相鄰處。這樣便構(gòu)建完成質(zhì)粒pGS22(圖4)。以質(zhì)粒pGS22轉(zhuǎn)化菌株Mycobacterium smegmatisM24，并使用相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)基選出卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子。根據(jù)它的表現(xiàn)型，刪除突變體Mycobacterium smegmatis U1被從克隆中選出。為此目的，用所述檢測(cè)方法檢測(cè)卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子以檢出生長(zhǎng)不為鐵外螯合素所刺激的克隆。突變體U1中fuxA的刪除導(dǎo)致其不能吸收Fe3+-鐵外螯合素。通過PCR方法，確認(rèn)了造成所檢出表型的原因是卡那霉素抗性基因通過同源重組替換了fuxA。
例四恥垢分枝桿菌U5突變體的產(chǎn)生通過在基因內(nèi)部整合卡那霉素抗性使fxuC基因失活。在這一步中，通過選擇使卡那霉素基因的的轉(zhuǎn)錄方向與fxuC相反，這樣可盡可能地避免fxuA和fxuB的極性影響。為這一目的，725bp的KpnⅠ-PstⅠ片斷(圖1，片斷1)被亞克隆入pUC118。片斷1產(chǎn)自pGS4，pGS4可從E.coli TOP10F’pGS4(DSM 12083)中獲得。pGS4使pUC118的一個(gè)衍生質(zhì)粒，包括有片斷1和2的插入片段，見圖1?？敲顾乜剐曰蛞韵鄳?yīng)方向克隆入BamHⅠ限制性切點(diǎn)內(nèi)。這就形成了pGS52(圖5)。以質(zhì)粒pGS52轉(zhuǎn)化菌株恥垢分枝桿菌M24，并使用相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)基選出卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子。根據(jù)它的表現(xiàn)型，刪除突變體恥垢分枝桿菌U5被從克隆中選出。為此目的，用所述檢測(cè)方法檢測(cè)卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子以檢出生長(zhǎng)不為鐵外螯合素所刺激的克隆。在這一突變體中，染色體上的fxuC基因通過同源重組而被克隆入pGS52且被卡那霉素抗性基因插入失活的fxuC所取代?？敲顾乜剐曰虻牟迦雽?dǎo)致了突變體U5不再吸收Fe3+-外鐵螯合素。整合造成該表現(xiàn)型的推測(cè)為PCR所證實(shí)。
例五恥垢分枝桿菌U7突變體的產(chǎn)生為盡可能地避免fxuA、fxuB和fxuC的極性影響并免于影響fxuD-fxuA簇的表達(dá)調(diào)控，fxuD通過刪除距基因5’端69bp處的一個(gè)325bp的片斷而失活。
為這一目的，來自pGS4的一個(gè)1737bp(圖1，片斷2)的片斷被亞克隆入pUC118，這便形成了pGS41(圖6)。用BspMⅡ切開pGS41并重新連接而形成pGS56(圖7)。將卡那霉素抗性基因克隆入pGS56的BglⅡ位點(diǎn)形成了pGS57(圖8)。用pGS57轉(zhuǎn)化菌株M24并用相應(yīng)培養(yǎng)基選擇出卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化子。以PCR方法選擇出Mycobacterium smegmatis插入突變體U7，其fxuD已通過同源重組被經(jīng)刪除過的拷貝替換。在該突變體中，卡那霉素抗性基因被整合入fxuD-fxuB簇啟動(dòng)子之前的位置。因此可排除fxu簇的表達(dá)的極性影響。
例六用來檢測(cè)可能的抗生素載體的方法本發(fā)明中的突變體于35～37℃下在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(12g Oxoid No.1培養(yǎng)基/升)上培養(yǎng)48小時(shí)，隨后以極限培養(yǎng)基(50ml甘油、8.5gNacl/升，pH7.2)懸浮。懸浮的細(xì)胞密度約3×108/ml。用1.5ml的懸浮液加入99ml的生物測(cè)試瓊脂(20ml甘油、5gL-天冬酰胺/升，用雙蒸水配制；pH7.5；加入2％的alumina后，在121℃下滅菌15分鐘；隨后過濾并調(diào)pH至6.8；加入12克瓊脂No.1(Oxiod)，在121℃下滅菌；接種前加入0.46μg/ml Zn2+,0.1μg/ml Mn2+,0.05mg/mlMg2+,1μg/ml CaCl2×2H2O,0.2μg/ml Na2MoO4×2H2O,0.2μg/ml CuSO4×5H2O,0.4μg/ml CoCl2×2H2O,0.2μg/ml和10μM ethylenediamine-di-(o-hydroxyphenyl-acetic acid))。將懸浮液加入培養(yǎng)皿。瓊脂凝固后，用一個(gè)被待側(cè)底物浸透的圓形濾紙(直徑5mm)置于瓊脂表面。接種后35～37℃培養(yǎng)兩天，測(cè)量濾紙周圍的生長(zhǎng)區(qū)域。
突變體U1至U7的生長(zhǎng)區(qū)域表明受測(cè)的外源鐵載體的吸收不依賴于任何外鐵螯合素/分枝菌素轉(zhuǎn)運(yùn)體系中的已知組分。突變體B1的生長(zhǎng)區(qū)域表明了同分枝菌素的配基交換，同時(shí)突變體M24的生長(zhǎng)區(qū)域顯示了在缺乏突變體U1的供給下同外鐵螯合素的配基交換。
序列表<110> Grnenthal GmbH<120>分枝桿菌的突變株及其在潛在抗生素載體篩選中的應(yīng)用<130>Grnenthal HKI 2806<140><141><160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>恥垢分枝桿菌<400>1caggatccat tggtaagcct tacc 24<210>2<211>25<212>DNA<2l3>恥垢分枝桿菌<400>2gatctagagc tggttcaggg cgatg 25<210>3<211>24<212>DNA<213>恥垢分枝桿菌<400>3acgaattcac acgccagaga acgc24<210>4<211>25<212>DNA<213>恥垢分枝桿菌<400>4caggatcctg atctggcaat tccag 25<210>5<211>26<212>DNA<213>恥垢分枝桿菌<400>5acgaattcga gatcctcggc atcaac 26<210>6<211>25<212>DNA<213>恥垢分枝桿菌<400>6caggatcctg gcgcttcccg aaatc 25<210>7<211>26<212>DNA<213>恥垢分枝桿菌<400>7gaggatcctg aaagaacata tgactc 26<210>8<211>25<212>DNA<213>恥垢分枝桿菌<400>8tatctagaca agatcggccg acatc 25<210>9<211>1482<212>DNA<213>恥垢分枝桿菌<220><221>CDS<222>(446)..(1480)<400>9gatctcgtcg ggggtatcga agtgacgttg gcggatcggg attgaaccgt tttggagaac 60cgcccctcag tggggtaatc tcgctgctcg gttgatccac tattcgggcc tatagctcag 120gcggttagag cgcttcgctg ataacgaaga ggtcggaggt tcgagtcctc ctaggcccac 180gacgccggtc tgccggtgat caccgaaagg gtgtgccatg cggtttgtgg 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1．分枝桿菌突變體，其特征在于通過基因置換、刪除失活或插入失活，使參與分枝菌素的生物合成的基因被滅活或/和編碼鐵外螯合素依賴的攝鐵體系組分的基因被除去。
2．權(quán)利要求1的分枝桿菌突變體，其特征在于參與分枝菌素生物合成的基因已被滅活。
3．權(quán)利要求2的分枝桿菌突變體，特征在于其基因的滅活通過以下方法之一完成a)利用化學(xué)或物理突變?cè)a(chǎn)生突變，b)通過基因替換，c)通過插入或刪除失活，d)綜合以上幾種方法。
4．權(quán)利要求1的分枝桿菌突變體，其特征在于一個(gè)或多個(gè)編碼鐵外螯合素依賴的攝鐵體系組分的基因已通過基因替換，刪除或插入的方法去除，另外，還視需要使參與分枝菌素生物合成的基因失活。
5．權(quán)利要求1的分枝桿菌突變體，其特征在于其在分類上屬于恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)、草分枝桿菌(M.phlei)、母牛分枝桿菌(M.vaccae)、金色分枝桿菌(M.auram)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)、龜分枝桿菌(M.chelonae)、牛分枝桿菌(M.bovis)、鳥分枝桿菌(M.avium)、新金色分枝桿菌(M.neoaurum)、M.gordonae、M.flavescens、結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)或其他形成外鐵載體的分枝桿菌菌株。
6．權(quán)利要求1的恥垢分枝桿菌突變體M24(DSM 12084)。
7．權(quán)利要求1的恥垢分枝桿菌突變體B1(DSM 12085)，其特征在于通過質(zhì)粒pGS31上的插入片段同fxbA同源重組，mc2155菌株的fxbA基因被卡那霉素抗性基因替換，如圖3所示。
8．權(quán)利要求1的恥垢分枝桿菌突變體B3，其特征在于通過質(zhì)粒pGS31上的插入片段同fxbA同源重組，M24菌株的fxbA基因被卡那霉素抗性基因替換，如圖3所示。
9．權(quán)利要求1的恥垢分枝桿菌突變體U1，其特征在于通過質(zhì)粒pGS22上的插入片段同fxuA同源重組，M24菌株的fxuA被卡那霉素抗性基因替換，如圖4所示。
10．權(quán)利要求1的恥垢分枝桿菌突變體U5，其特征在于通過質(zhì)粒pGS52上的插入片段同fxuC同源重組，M24菌株的fxuC表達(dá)被來自pUC44的卡那霉素抗性基因的整合所打斷，如圖5所示。
11．權(quán)利要求1的恥垢分枝桿菌突變體U7，其特征在于通過質(zhì)粒pGS56上的插入片段同基因fuxD同源重組而使其被部分刪除，如圖6、7所示。
12．一種檢測(cè)潛在的抗生素載體的方法，其特征在于使用了權(quán)利要求1-11的突變體，可檢出不依賴于鐵外螯合素/分枝菌素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在分枝桿菌細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)的鐵載體。
13．一種權(quán)利要求12的方法，其特征在于測(cè)試過程通過在固體或液體培養(yǎng)基上進(jìn)行的生長(zhǎng)刺激實(shí)驗(yàn)而完成。
全文摘要
本發(fā)明涉及到分枝桿菌的新突變株及其在潛在抗生素載體篩選中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的突變體的特征在于其編碼鐵載體依賴的攝鐵體系的基因被滅活。滅活通過以下方法之一完成:a)通過化學(xué)或物理突變?cè)a(chǎn)生突變,b)通過“基因替換”,即以一標(biāo)記基因替換整個(gè)或部分基因,c)通過插入失活或刪除失活,d)綜合使用以上方法由此獲得的突變體形成了篩選在轉(zhuǎn)運(yùn)入分枝桿菌細(xì)胞過程中不依賴于鐵外螯合素/分枝菌素轉(zhuǎn)運(yùn)體系的鐵載體,它們是潛在的抗生素載體。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1309703SQ99807501
公開日2001年8月22日 申請(qǐng)日期1999年4月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月17日
發(fā)明者G·蘇曼, U·梅爾曼, I·海尼曼 申請(qǐng)人:格呂倫塔爾有限公司