專(zhuān)利名稱(chēng)：水不溶性α－1,4－萄聚糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在無(wú)緩沖劑系統(tǒng)中制備水不溶性α-1,4-葡聚糖的體外方法。
人們對(duì)用于制備多糖的生物工程方法有巨大的工業(yè)興趣，特別是通過(guò)經(jīng)典的有機(jī)合成方法不容易得到的，或者克服極大困難才能得到的水不溶性α-1,4-葡聚糖。然而，由于費(fèi)用的原因，迄今為止這些方法中只有少數(shù)得到商業(yè)利用。生物工程方法比經(jīng)典的有機(jī)化學(xué)合成方法有優(yōu)勢(shì)。因而，酶催化反應(yīng)通常以更高的專(zhuān)一性(區(qū)域?qū)Ｒ恍?、立體專(zhuān)一性)和更高的反應(yīng)速率，在溫和的反應(yīng)條件下進(jìn)行，并獲得更高的收率。這些因素在新多糖的制備中格外重要。
生物轉(zhuǎn)化，換言之，通過(guò)純化或者部分純化的酶進(jìn)行的物質(zhì)體外轉(zhuǎn)化，與生物工程體內(nèi)方法相比，能夠提供更多的優(yōu)點(diǎn)。與體內(nèi)方法相比，它們的特點(diǎn)是改善的可控制性和更大的可再現(xiàn)性，由于體外反應(yīng)條件相對(duì)于活生物體中的條件可以以一種確定的方式設(shè)定。這使得制備具有高均勻性和純度，從而具備高質(zhì)量的穩(wěn)定產(chǎn)品成為可能，這對(duì)進(jìn)一步的工業(yè)利用非常重要。該穩(wěn)定質(zhì)量的產(chǎn)品的加工導(dǎo)致成本的降低，因?yàn)榧庸に璧墓に噮?shù)無(wú)需為了每個(gè)加工批次而重新優(yōu)化。體外方法的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是該產(chǎn)品，相對(duì)于體內(nèi)的方法，本身不含生物體。在某些食品工業(yè)和制藥工業(yè)應(yīng)用中這是絕對(duì)必需的。為了能夠在工業(yè)規(guī)模上利用水不溶性α-1,4-葡聚糖的有利性能，迫切需要廉價(jià)地提供它們。在工業(yè)規(guī)模上，迄今為止，只有水溶性α-1,4-葡聚糖，例如直鏈淀粉，可得到。為了制備水不溶性α-1,4-葡聚糖，迄今，在專(zhuān)利申請(qǐng)WO 95/31553和Remaud-Simon等人(Remaud-Simon,inPetersen,Svenson and Pedersen(Eds.)碳水化合物生物工程；E1sevier Science B.V.,Amsterdam,荷蘭(1995),313-320頁(yè))中描述了采用來(lái)自多糖奈瑟氏菌(Neisseria polysaccharea)的淀粉蔗糖酶的一種方法。這種體外方法基于采用部分純化的淀粉蔗糖酶的蔗糖至α-1,4-葡聚糖和果糖的轉(zhuǎn)化，并在檸檬酸鈉緩沖液(pH6.5)或馬來(lái)酸鈉緩沖液(pH6.4)中進(jìn)行。下列的反應(yīng)機(jī)理在WO 95/31553中假定蔗糖+(α-1,4-葡聚糖)n→果糖+(α-1,4-葡聚糖)n+1根據(jù)該反應(yīng)圖示，線性低聚的或聚合的α-1,4-葡聚糖充當(dāng)擴(kuò)鏈反應(yīng)的接受體，該反應(yīng)生成水不溶性α-1,4-葡聚糖聚合物。與WO95/31553相比，Remaud-Simon等人(上述)另外使用了0.1g/l的糖原作為一種外源的多糖接受體。與缺少外源多糖接受體的生物轉(zhuǎn)化相比，該支化多糖接受體導(dǎo)致反應(yīng)速度的提高。
迄今描述的采用淀粉蔗糖酶制備多葡聚糖的系統(tǒng)在緩沖水溶液中進(jìn)行。并非所有這些方法能產(chǎn)生水不溶性α-1,4-葡聚糖。緩沖化學(xué)品的使用和確立所需緩沖條件所需要的操作時(shí)間產(chǎn)生可觀的工藝成本，并且因此使得這些系統(tǒng)的商業(yè)應(yīng)用更加困難。清除生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)品(α-1,4-葡聚糖和果糖)中殘留的緩沖鹽所需的純化步驟會(huì)產(chǎn)生額外的成本。這些產(chǎn)品用于食品和藥物工業(yè)時(shí)，它顯得特別重要。因此，需要適于有效制備水不溶性α-1,4-葡聚糖的方法，該方法有商業(yè)利用價(jià)值，并能產(chǎn)生高純度的產(chǎn)品。
因而，本發(fā)明的基本目的是提供一種方法，該方法適合工業(yè)上制備水不溶性α-1,4-葡聚糖，該方法也可產(chǎn)生高純度的產(chǎn)品。
通過(guò)實(shí)施表征在專(zhuān)利權(quán)利要求書(shū)中的實(shí)施方案可達(dá)到該目的。
本發(fā)明因而涉及一種制備水不溶性α-1,4-葡聚糖的方法，該方法中蔗糖通過(guò)具有淀粉蔗糖酶的酶活性的酶轉(zhuǎn)化成水不溶性α-1,4-葡聚糖和果糖，該方法包括在一種無(wú)緩沖劑的含水系統(tǒng)中實(shí)施該轉(zhuǎn)化。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，為了由得自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶體外制備水不溶性α-1,4-葡聚糖，可采用一種無(wú)緩沖劑的含水系統(tǒng)?？苫诠堑尼尫呕蛘崽堑南亩鴾y(cè)定的該方法的效率相當(dāng)于緩沖系統(tǒng)的效率。這是令人驚奇的，因?yàn)樗妹傅墓δ芏纫郧皟H能在緩沖溶液中檢測(cè)到(MacKenzie等人，Can.J.Microbiol,23(1977),1303-1307；Okada和Hehre,J.Biol.Chem.249(1974),126-135；Tao等人，Carbohydrate Res.182(1988)，163-174；Büttcher等人，J.Bacteriol.179(1997),3324-3330；WO 95/31553)。
本發(fā)明的方法現(xiàn)在使得體外制備不溶性α-1,4-葡聚糖的成本的大幅減少成為可能。尤其下列可以避免與緩沖溶液的制備以及設(shè)置和如果適當(dāng)?shù)脑挶３謕H值有關(guān)的操作步驟和儀器。本發(fā)明方法的另一個(gè)決定性的優(yōu)點(diǎn)是提高了產(chǎn)品的純度，這對(duì)于在食品部門(mén)并在食品、化妝品和藥品工業(yè)中的應(yīng)用特別重要。該無(wú)緩沖劑系統(tǒng)也提供一種優(yōu)點(diǎn)，即所得產(chǎn)品不含殘留的緩沖鹽。因此不需要用于清除這些鹽的復(fù)雜的純化步驟，這些鹽會(huì)干擾在食品和藥品工業(yè)中的某些應(yīng)用。這引起成本進(jìn)一步的減少。除了水不溶性α-1,4-葡聚糖外，本發(fā)明的方法中也形成了果糖。它可用于廉價(jià)生產(chǎn)“高果糖糖漿”(HFS)。本發(fā)明的方法由于無(wú)緩沖劑的反應(yīng)條件而產(chǎn)生高純度的產(chǎn)品。不同于由玉米淀粉制備HFS的、包含通過(guò)離子交換清除緩沖鹽的高費(fèi)用工藝步驟的常規(guī)方法(Crabb and Mitchinson,TIBTECH 15(1997),349-352)，本發(fā)明的方法因此無(wú)需果糖復(fù)雜的純化。
適用于本發(fā)明目的的“體外轉(zhuǎn)化”是這樣一種轉(zhuǎn)化，換言之是一種反應(yīng)，它在活生物體外進(jìn)行?！绑w外”特別指本發(fā)明的方法發(fā)生在反應(yīng)器中。
具有淀粉蔗糖酶(E.C.2.4.1.4.)的酶活性的酶指一種能催化下列反應(yīng)的酶蔗糖+(α-1,4-葡聚糖)n→果糖+(α-1,4-葡聚糖)n+1可以檢測(cè)淀粉蔗糖酶的酶活性，例如，如本申請(qǐng)實(shí)施例中描述的。
在本發(fā)明的上下文中，淀粉蔗糖酶也指一種酶，它由蔗糖和支化多糖接受體，例如糖原、支鏈淀粉或糊精開(kāi)始，催化蔗糖和在這些多糖接受體上的α-1,4-葡聚糖直鏈的合成。換言之，淀粉蔗糖酶還催化α-1,4-葡聚糖鏈在這些支化接受體上延伸。所得的產(chǎn)品，與所用的支化起始材料相比，具有較低的支化度。在本發(fā)明的上下文中，這些產(chǎn)品也稱(chēng)為水不溶性α-1,4-葡聚糖。
原則上，本發(fā)明的方法中，可采用任何淀粉蔗糖酶。優(yōu)選地，采用原核生物來(lái)源的淀粉蔗糖酶。已知此類(lèi)型的酶是，例如，得自深黃奈瑟氏球菌(Okada和Hehre,J.Biol.Chem.249(1974),126-135；MacKenzie等人,Can.J.Microbiol.23(1977),1303-1307)或者狗奈瑟氏球菌、灰色奈瑟氏球菌、反硝化奈瑟氏球菌、干燥奈瑟氏球菌和微黃奈瑟氏球菌(MacKenzie等人,Can.J.Microbiol.24(1978),357-362)。此外，WO 95/31553描述了來(lái)自的多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶。特別優(yōu)選地，采用一種由原核生物天然分泌的淀粉蔗糖酶。
在本發(fā)明方法的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用一種得自奈瑟氏球菌屬細(xì)菌的淀粉蔗糖酶，特別優(yōu)選一種得自多糖奈瑟氏球菌種的淀粉蔗糖酶。
為了本發(fā)明的目的，水不溶性α-1,4-葡聚糖是通過(guò)上述的采用淀粉蔗糖酶的蔗糖的轉(zhuǎn)化制備的多糖。采用的術(shù)語(yǔ)“水不溶性葡聚糖”，按照德國(guó)藥典的定義(DAB=Deutsches Arzneimittelbuch,Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH,Stuttgart,Govi-Verlag GmbH,Frankfurt，第九版，1987)，歸入“少量溶解”化合物、“很少量溶解”或“實(shí)質(zhì)上不溶”化合物類(lèi)別，特別指由上述采用淀粉蔗糖酶的蔗糖的轉(zhuǎn)化制備的多糖。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“無(wú)緩沖劑的系統(tǒng)”是一種基本不含緩沖鹽的含水系統(tǒng)。上下文中采用的術(shù)語(yǔ)“緩沖鹽”指無(wú)機(jī)和有機(jī)鹽，特別是弱酸和堿的鹽。上下文中采用的術(shù)語(yǔ)“基本不”指緩沖鹽的最大濃度為25mM，在優(yōu)選的實(shí)施方案中最大濃度是10mM，在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中最大濃度是5mM，在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中最大濃度是1mM。
在本發(fā)明方法的一個(gè)進(jìn)一步特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用一種僅含有作為雜質(zhì)的痕量(＜1mM)無(wú)機(jī)和有機(jī)鹽的含水系統(tǒng)。非常特別優(yōu)選的無(wú)緩沖劑含水系統(tǒng)是純水。
在本發(fā)明方法的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用一種純化的淀粉蔗糖酶。這里采用的術(shù)語(yǔ)“純化的淀粉蔗糖酶”指一種基本上不含合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞組分的酶。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“純化的淀粉蔗糖酶”指一種純度至少為80％，優(yōu)選至少為90％，特別優(yōu)選至少為95％的淀粉蔗糖酶。
采用純化的蛋白質(zhì)制備α-1,4-葡聚糖提供了種種優(yōu)點(diǎn)。與采用部分純化的蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行操作的方法相比，本發(fā)明方法的反應(yīng)介質(zhì)不含有生產(chǎn)菌株(微生物)的殘留物，這種菌株用于純化或生物工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)。
此外，通過(guò)采用純化的蛋白質(zhì)，從食品和藥品工業(yè)的應(yīng)用上可看出它們的優(yōu)點(diǎn)。由于確定的反應(yīng)介質(zhì)組成，它不含一切不需要的組分，產(chǎn)品的組分也更加明確。這導(dǎo)致適于食品和藥品工業(yè)中通過(guò)生物工程制備的這些產(chǎn)品的認(rèn)可程序顯著地減少，特別由于這些產(chǎn)品應(yīng)該不含痕量的轉(zhuǎn)基因微生物。
在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，淀粉蔗糖酶是一種以重組體的形式生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，它指這樣一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)通過(guò)將編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列引入宿主細(xì)胞中并在那里表達(dá)而制備。然后該蛋白質(zhì)自宿主細(xì)胞和/或從培養(yǎng)基中分離。這種情況下宿主細(xì)胞優(yōu)選細(xì)菌或原生生物(例如真菌，特別是酵母，藻類(lèi))，例如Schlegel“Allgemeine Mikrobiologie”[普通微生物學(xué)](GeorgThieme Verlag,1985,1-2)中定義的。特別優(yōu)選地，由宿主細(xì)胞分泌該淀粉蔗糖酶。此類(lèi)型的適于重組淀粉蔗糖酶的生產(chǎn)的宿主細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的方法制備。
可找到對(duì)各種表達(dá)系統(tǒng)的綜述，例如，酶學(xué)方法153(1987),385-516和Bitter等人的方法(酶學(xué)方法153(1987),516-544)。在該文獻(xiàn)中很大程度上描述了表達(dá)載體。除選擇標(biāo)記基因和確保在選擇的宿主中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)之外，它們通常包含細(xì)菌或病毒啟動(dòng)子，還往往包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。使至少一個(gè)限制位點(diǎn)或允許編碼的DNA序列插入的多接頭處于啟動(dòng)子和終止信號(hào)之間。采用的啟動(dòng)子序列，如果它在選擇的宿主生物中有活性，可以是天然控制相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。然而，該序列也可被其它的啟動(dòng)子序列代替。可以采用引起基因組成型表達(dá)的啟動(dòng)子，或者可以采用允許專(zhuān)一性調(diào)節(jié)隨后基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。文獻(xiàn)中廣泛描述了具有這些性能的細(xì)菌和病毒啟動(dòng)子序列。文獻(xiàn)中也充分描述了用于微生物(例如大腸桿菌、釀酒酵母)中的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。允許隨后的基因特別高的表達(dá)的啟動(dòng)子是，例如，T7啟動(dòng)子(Studier等人，Methods in Enzymology 185(1990),60-89)、lacuv5、trp、trp-1ac UV5(DeBoer等人，Rodriguez和Chamberlin(Eds)，啟動(dòng)子，結(jié)構(gòu)和功能；Praeger，紐約，(1982),462-481；DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983),21-25)、1p1、rac(Boros等人，Gene 42(1986),97-100)。通常，蛋白質(zhì)的量自中期至微生物生長(zhǎng)循環(huán)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束到達(dá)它們的最大量。因此，為了蛋白質(zhì)的合成，優(yōu)選采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。這些常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)收率高于組成型啟動(dòng)子。強(qiáng)組成型啟動(dòng)子的使用往往經(jīng)克隆基因的恒定轉(zhuǎn)錄和翻譯而導(dǎo)致用于其它必需的細(xì)胞功能的能量喪失，因而延遲細(xì)胞的生長(zhǎng)(Bernard R.Glick/Jack J.Pasternak,MolekulareBiotechnologie(1995),Spektrum Akademischer Verlag GmbH,Heidelberg Berlin Oxford,342頁(yè))。因此，為了達(dá)到蛋白質(zhì)的一種優(yōu)選的量，通常采用兩步法。首先，在最適宜的條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞至一相對(duì)高的細(xì)胞密度。第二步，然后誘導(dǎo)取決于采用啟動(dòng)子類(lèi)型的轉(zhuǎn)錄。上下文中一種特別適合的啟動(dòng)子是tac啟動(dòng)子(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80(1983),21-25)，它可以通過(guò)乳糖或IPTG(=異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)。文獻(xiàn)中也描述了用于轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)。
宿主細(xì)胞通常可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的方法采用編碼淀粉蔗糖酶的DNA轉(zhuǎn)化，例如，如Sambrook等人所述(分子克隆實(shí)驗(yàn)室教程手冊(cè)，第二版(1989),Cold Spring Harbor Press，紐約)。在符合各自采用的宿主細(xì)胞需要的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，特別要考慮pH、溫度、鹽濃度、通氣、抗生素、維生素、微量元素等。
由宿主細(xì)胞制備的酶可通過(guò)常規(guī)的純化方法純化，例如沉淀、離子交換色譜法、親和色譜法、凝膠過(guò)濾、反相HPLC等。
通過(guò)修飾在宿主細(xì)胞表達(dá)并且編碼淀粉蔗糖酶的DNA，在宿主細(xì)胞中可制備一種多肽，由于一定性能，它能夠從培養(yǎng)基中更容易地分離。因而，有可能表達(dá)這種被表達(dá)為一種具有另一多肽序列的融合蛋白的蛋白質(zhì)，該多肽序列的特異性結(jié)合性能使該融合蛋白能夠經(jīng)親和色譜法分離(例如，Hopp等人，Bio/Technology 6(1988),1204-1210；Sassenfeld,Trends Biotechnol.8(1990),88-93)。
在本發(fā)明方法的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用一種淀粉蔗糖酶，它作為一種重組體生產(chǎn)，并由宿主細(xì)胞分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，由于分泌出的蛋白質(zhì)可以從上清液分離，以致無(wú)需細(xì)胞消化和蛋白質(zhì)進(jìn)一步的純化。為了去除培養(yǎng)基中殘留的成分，可以采用工藝過(guò)程中常規(guī)的方法，例如透析、反滲透、色譜方法等。這也適用于濃縮分泌到培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。通過(guò)微生物的蛋白質(zhì)的分泌通常由氨基末端信號(hào)肽(信號(hào)序列、前導(dǎo)肽)介導(dǎo)。具有此信號(hào)序列的蛋白質(zhì)可滲透過(guò)該微生物的細(xì)胞膜。通過(guò)DNA序列可獲得蛋白質(zhì)的分泌，該序列編碼該信號(hào)肽、與相應(yīng)的淀粉蔗糖酶-編碼區(qū)連接。優(yōu)選地，該信號(hào)肽是表達(dá)的淀粉蔗糖酶的天然信號(hào)肽，特別優(yōu)選來(lái)自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的那些。
非常特別優(yōu)選地，該信號(hào)肽是來(lái)自產(chǎn)酸克雷伯氏菌M5A1的α-CGTase的信號(hào)肽(Fiedler等人，J.Mol.Biol.256(1996)，279-291)或者是這樣一種信號(hào)肽，它由在GenBank中可按入藏號(hào)X864014獲得的序列的核苷酸11529-11618所編碼。
可以選擇地，本發(fā)明的方法中使用的淀粉蔗糖酶也可采用一種體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)，這種系統(tǒng)能引起蛋白質(zhì)的表達(dá)，無(wú)需使用微生物。
在本發(fā)明的方法的一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將一種外部的糖類(lèi)接受體加入淀粉蔗糖酶催化的蔗糖轉(zhuǎn)化中。為了本發(fā)明的目的，外部的糖類(lèi)接受體是一種可提高淀粉蔗糖酶催化的蔗糖轉(zhuǎn)化初始速率的分子。優(yōu)選地，該外部糖類(lèi)接受體在轉(zhuǎn)化的開(kāi)始加入到反應(yīng)混合物中。外部接受體的使用導(dǎo)致處理時(shí)間的減少，因而減少了本方法的成本。糖類(lèi)接受體優(yōu)選是一種寡糖或多糖，優(yōu)選一種線型多糖，并且特別優(yōu)選一種支化多糖，例如，糊精、糖原或支鏈淀粉。如果α-1,4-葡聚糖鏈延伸發(fā)生在這些接受體上，與支化的起始材料比較，制備的產(chǎn)品具有相當(dāng)?shù)偷闹Щ?。這種情況下，支化度降低的程度取決于聚合程度n。與接受體相比，如果采用的蔗糖摩爾數(shù)大為過(guò)量，在產(chǎn)品中不再能通過(guò)甲基化分析檢測(cè)到α-1,6分枝(支化度＜1％)。本發(fā)明的上下文中這些產(chǎn)品也稱(chēng)為水不溶性α-1,4-葡聚糖。
在一項(xiàng)優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有淀粉蔗糖酶的酶活性的酶被固定在載體材料上。淀粉蔗糖酶的固定提供了這樣的優(yōu)點(diǎn)，作為合成反應(yīng)催化劑的酶，可以從反應(yīng)混合物中以一種簡(jiǎn)單的方式回收并重復(fù)使用。由于酶的純化通常是高費(fèi)用和耗時(shí)的，酶的固定化和重新使用使得節(jié)約大量費(fèi)用成為可能。進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)產(chǎn)物的純度，該產(chǎn)物不含蛋白質(zhì)殘留物。
可以獲得多種適用于蛋白質(zhì)固定化的載體，通過(guò)共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵能夠發(fā)生與載體的偶合(可參見(jiàn)綜述Methods in Enzymology 135、136、137)。廣泛用做載體材料的材料是，例如，瓊脂糖、藻酸鹽、纖維素、聚丙烯酰胺、二氧化硅或尼龍。


圖1顯示了一種通過(guò)多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶、采用不同的緩沖鹽濃度體外制備水不溶性α-1,4-葡聚糖的效率比較?；谡崽橇康臏p少測(cè)定該方法的效率。
下列實(shí)施例闡述了本發(fā)明。
實(shí)施例1淀粉蔗糖酶的純化為了制備一種淀粉蔗糖酶，采用大腸桿菌細(xì)胞，該細(xì)胞已用得自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)WO 9531553)。這種DNA來(lái)源于多糖奈瑟氏球菌基因組文庫(kù)。
將這些大腸桿菌細(xì)胞的隔夜培養(yǎng)物(它們分泌來(lái)自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶)離心并再懸浮在大約1/20體積的50mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.5)、10mM DTT(二硫蘇糖醇)、1mM PMSF(苯基甲基磺酰氟)中。然后采用弗氏壓碎器以16000psi將這些細(xì)胞破碎兩次。然后將1mM的MgCl2和Benzonase(購(gòu)自Merk；100000單位；250單位μl-1)以12.5單位ml-1的最終濃度加入到細(xì)胞提取物中。然后將該溶液在37℃培養(yǎng)至少30分鐘，并輕微攪拌。該提取物置于冰上至少1.5小時(shí)。然后將該提取物在4℃以大約40000g離心30分鐘，直到上清液相對(duì)澄清。進(jìn)行孔徑為0.45μm的PVDF膜(微孔“Durapore”，或者類(lèi)似物)預(yù)過(guò)濾。4℃該提取物放置過(guò)夜。在進(jìn)行疏水性相互作用(HI)色譜法之前，將固體NaCl加入到提取物中，并得到2M NaCl濃度。接著將該提取物在4℃以大約40000mg再離心30分鐘。然后通過(guò)以一種孔徑為0.22μm的PVDF膜(微孔“Durapore”，或者類(lèi)似物)過(guò)濾，將該提取物從最終的大腸桿菌殘留物中分離出來(lái)。將這種濾過(guò)后的提取物在丁基瓊脂糖凝膠-4B柱(Pharmacia)(柱體積93ml，長(zhǎng)度17.5cm)上分離。大約50ml的具有1至5單位μl-1淀粉蔗糖酶活性的提取物加至柱上。然后以150ml的緩沖劑B(緩沖劑B50mM檸檬酸鈉，pH6.5,2M NaCl)從柱上洗滌未結(jié)合的蛋白質(zhì)。該淀粉蔗糖酶最終采用下降的線性NaCl梯度洗脫(433ml 50mM檸檬酸鈉中NaCl濃度為2M至OM，流入速度1.5ml min-1)，該梯度是采用一種自動(dòng)泵系統(tǒng)(FPLC,Pharmacia)產(chǎn)生的。在0.7M和0.1M NaCl之間洗脫出淀粉蔗糖酶。收集這些級(jí)分，經(jīng)PD10 Sephadex柱(Pharmacia)脫鹽，以8.7％的甘油穩(wěn)定，測(cè)試淀粉蔗糖酶活性并最后冷凍于存貯緩沖液(8.7％甘油，50mM檸檬酸鹽)。
實(shí)施例2淀粉蔗糖酶活性的測(cè)定
37℃下在含有5％蔗糖、0.1％糖原和100mM檸檬酸鹽pH6.5的1ml批料中，培養(yǎng)各種稀釋度的純化蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)粗提物。5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘和30分鐘后，從這些溶液中每一個(gè)均取出10μl，通過(guò)立即加熱至95℃滅失淀粉蔗糖酶的酶活性。在偶合的光度測(cè)定試驗(yàn)中，檢測(cè)由淀粉蔗糖酶釋放的果糖的含量。為此，將1μl至10μl的滅活的樣品加入至1ml的50mM咪唑緩沖液pH6.9、2mMMgCl2、1mM ATP、0.4mM NAD和0.5 U/ml的己糖激酶中。按順序添加葡糖-6-磷酸脫氫酶(來(lái)自腸膜明串珠菌)和葡糖磷酸異構(gòu)酶之后，檢測(cè)到在340nm的吸收的變化。然后，根據(jù)Lamber-Beer定律，計(jì)算釋放的果糖的量。
如果獲得的值與取樣時(shí)間有關(guān)，可以測(cè)定單位數(shù)(1U=μmol果糖/分鐘)(每μl的蛋白質(zhì)提取物或每μg的純化蛋白質(zhì))。
實(shí)施例3與緩沖系統(tǒng)相比，無(wú)緩沖劑系統(tǒng)中的反應(yīng)溶液體積 50ml酶活性 5單位/ml緩沖劑 pH6.5的醋酸鈉，在0mM(=水)和200mM之間變動(dòng)(Merck)底物 10％蔗糖(ICN)引物 0.1％糊精，Ⅳ型馬鈴薯(sigma)程序各為50ml反應(yīng)體積的含有10％蔗糖、0.1％糊精、250單位的淀粉蔗糖酶和不同濃度的反應(yīng)緩沖劑(25mM、50mM、100mM或200mM醋酸鈉，pH6.5)的溶液，于37℃下培養(yǎng)46小時(shí)和73.25小時(shí)。此外，配制一種不含緩沖劑的反應(yīng)混合物，換言之，在軟化水(pH7.0)中配制。除了緩沖物質(zhì)之外，該反應(yīng)溶液含有上述所有組分。
為測(cè)定蔗糖至直鏈淀粉和果糖的轉(zhuǎn)化，自這六個(gè)反應(yīng)溶液中在不同的時(shí)間點(diǎn)各取出1ml等分試樣。通過(guò)加熱至90℃達(dá)10分鐘，停止取出的樣品中的反應(yīng)。通過(guò)采用光度計(jì)內(nèi)偶合酶試驗(yàn)，檢測(cè)生成的果糖或者檢測(cè)仍存在于滅活樣品中蔗糖的濃度而測(cè)定轉(zhuǎn)化速率。酶測(cè)定測(cè)定體積 1ml酶得自酵母的己糖激酶、得自腸膜明串珠菌的葡糖磷酸異構(gòu)酶、葡糖-6-磷酸脫氫酶、得自酵母的β-果糖苷酶(所有的酶Boehringer Mannheim)測(cè)定緩沖劑1mM ATP0.4mM NAD+50mM咪唑pH6.9該試驗(yàn)基于采用己糖激酶和葡糖磷酸異構(gòu)酶的果糖至葡糖-6-磷酸的轉(zhuǎn)化。葡糖-6-磷酸然后由葡糖-6-磷酸脫氫酶轉(zhuǎn)化成6-磷酸葡糖酸。該反應(yīng)與NAD+至NADH+H+的轉(zhuǎn)化相關(guān)，它可以在340nm波長(zhǎng)下光度法測(cè)量。根據(jù)Lamber-Beer定律，由所得的吸收度可計(jì)算出果糖的量。
為了測(cè)定蔗糖的濃度，除了上述的反應(yīng)混合物之外，向待測(cè)樣品中加入β-果糖苷酶。這種酶將蔗糖分解成果糖和葡萄糖。然后如上所述，采用NAD+至NADH+H+的轉(zhuǎn)化，測(cè)量從該反應(yīng)中得到的這兩種單糖的濃度。由測(cè)定的總的單糖的量可以計(jì)算出蔗糖的濃度。
結(jié)果大約73小時(shí)后，在所有反應(yīng)條件下，存在于反應(yīng)溶液中的蔗糖已經(jīng)近似100％的轉(zhuǎn)化成直鏈淀粉和果糖。
權(quán)利要求
1．一種制備水不溶性α-1,4-葡聚糖的方法，其中蔗糖通過(guò)具有淀粉蔗糖酶的酶活性的酶，體外轉(zhuǎn)化成水不溶性α-1,4-葡聚糖和果糖，這種方法包括在無(wú)緩沖劑的含水系統(tǒng)中進(jìn)行該反應(yīng)。
2．權(quán)利要求1的方法，其中淀粉蔗糖酶是一種來(lái)自原核生物的酶。
3．權(quán)利要求2的方法，其中的原核生物屬于奈瑟氏球菌屬。
4．權(quán)利要求3的方法，其中的原核生物是多糖奈瑟氏球菌。
5．權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中的淀粉蔗糖酶以重組體的形式制備。
6．權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中采用純化的淀粉蔗糖酶。
7．權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中淀粉蔗糖酶與載體材料結(jié)合。
8．權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中加入外部糖類(lèi)接受體。
全文摘要
描述了一種制備水不溶性α－1,4－葡聚糖的體外方法,其中蔗糖在采用淀粉蔗糖酶的無(wú)緩沖劑系統(tǒng)中反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12P19/18GK1306581SQ99807620
公開(kāi)日2001年8月1日 申請(qǐng)日期1999年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月24日
發(fā)明者M·曲安茲, N·普瓦特, R·巴納斯阿克 申請(qǐng)人:阿克西瓦有限公司