專利名稱：用于治療腫瘤的cd40結(jié)合分子和ctl肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物中的CD40結(jié)合分子和激活CTL的肽，包括腫瘤抗原。
背景技術(shù)：
許多腫瘤逃避了我們免疫系統(tǒng)的檢測(cè)。在癌癥患者中在缺失腫瘤細(xì)胞的免疫系統(tǒng)特異性機(jī)理中清楚地存在定量和/或定性缺陷。通過能夠識(shí)別和殺傷被病毒感染或轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)提供了這些機(jī)理之一。以前假定樹突狀細(xì)胞(DC)刺激T-輔助細(xì)胞，該輔助細(xì)胞依次對(duì)CTL的活化提供幫助。本發(fā)明人已證實(shí)，T-輔助細(xì)胞不直接對(duì)該CTL提供輔助信號(hào)(通過分泌IL2)，然而，該T-輔助細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)在沒有T-輔助細(xì)胞的情況下能夠激活CTL的還未鑒定的細(xì)胞表面和/或可溶性分子的DC提供一信號(hào)。通過該T-輔助細(xì)胞提供給該DC的該信號(hào)通過CD40L-CD40相互作用介導(dǎo)。這種新發(fā)現(xiàn)對(duì)癌癥免疫療法提供了一種極難得的機(jī)會(huì)。
當(dāng)自身細(xì)胞受到病毒感染時(shí)或者當(dāng)它們轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞時(shí)，免疫系統(tǒng)能夠殺死這些自身細(xì)胞。這種潛在危險(xiǎn)的機(jī)理必需清楚地在嚴(yán)格控制之下。該免疫系統(tǒng)的CTL以無活性前體循環(huán)。為了將其激活，該前體T-殺傷細(xì)胞必需識(shí)別其特異的抗原肽，該抗原肽以MHC I型分子存在于專職APC上。然而，為了引發(fā)這些T細(xì)胞，該APC還必需以尤其通過共有刺激的表面分子B7.1和B7.2以及通過淋巴因子IL-12提供的固有共同刺激的前后序列呈遞該抗原。
直到最近，據(jù)信需要一在相同APC上識(shí)別相同抗原的T-輔助細(xì)胞完全激活該CTL。該特異T-輔助細(xì)胞應(yīng)供應(yīng)例如活化該CTL所需的IL-2的細(xì)胞因子。然而，Guerder和Matzinger(J.Exp.Med.176553(1992))提出了用于CTL活化的“特許”模型。在該模型中，暗示當(dāng)T-輔助細(xì)胞在專職APC上識(shí)別其抗原時(shí)，該T-輔助細(xì)胞將對(duì)該APC傳遞一活化信號(hào)，結(jié)果隨后能夠在不需要T-輔助細(xì)胞存在的情況下激活CTL。就在不久前，已對(duì)該特許模型的分子機(jī)理進(jìn)行了解釋。Schoenberger等人(Nature 393480(1998))描述了該CD40L-CD40途徑在該特許模型中的作用。T-輔助細(xì)胞和DC之間通過該CD40-CD40L結(jié)合的相互作用致使該DC活化，因此使該DC能夠有效地引發(fā)原初CTL。
DC通過我們身體的組織循環(huán)并以這種方式能夠收集、加工和呈遞抗原。收集抗原之后，它們移動(dòng)到該引流淋巴結(jié)，在其中它們向該T細(xì)胞呈遞抗原。眾所周知，DC需要最適地被激活。靜息DC僅表達(dá)普通級(jí)MHC和共同刺激的分子并且為T細(xì)胞的差的刺激物。DC能夠被炎癥細(xì)胞因子和細(xì)菌產(chǎn)物激活，這將導(dǎo)致MHC和共同刺激的分子正調(diào)節(jié)。DC活化成完全成熟的DC、表達(dá)最佳級(jí)MHC分子、共同刺激的分子和如IL-12的淋巴因子，這需要通過該CD40受體附加地觸發(fā)這些細(xì)胞。因此，在吸收抗原位置處的炎癥細(xì)胞因子和T-輔助細(xì)胞相互作用過程中的CD40L-CD40相互作用的組合致使特許該DC活化CTL的能力達(dá)到最佳。
許多腫瘤逃避特異CTL機(jī)理的免疫檢測(cè)。如果在沒有炎癥的情況下DC富集腫瘤抗原，那么被激活的T-輔助細(xì)胞的數(shù)量可能降低至足夠誘導(dǎo)待激活的CTL，從而誘導(dǎo)一適宜的抗腫瘤反應(yīng)。這一觀念已提示研究人員通過給藥直接刺激CTL活性的例如IL-2和IL-12的細(xì)胞因子或通過給藥用GM-CSF轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞加強(qiáng)抗原呈遞來幫助該免疫系統(tǒng)。這些策略已滿足各種僅啟動(dòng)的結(jié)果。
很顯然，仍有很大需求尋找產(chǎn)生和/或提高涉及細(xì)胞和體液免疫的保護(hù)性抗腫瘤反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)該CD40活化途徑是一種產(chǎn)生一級(jí)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要免疫調(diào)節(jié)途徑。如上所述，在DC上的該CD40途徑擔(dān)負(fù)著誘導(dǎo)抗腫瘤CTL反應(yīng)。此外，該CD40途徑在巨噬細(xì)胞上的活化刺激一強(qiáng)的殺腫瘤活性。
發(fā)明概述本發(fā)明包括藥物組合物中的CD40結(jié)合分子和激活CTL的肽，包括腫瘤抗原。將這種組合物用于提高肽腫瘤疫苗的抗腫瘤效應(yīng)，或者用于另外激活CTL，以便該激活的CTL能夠起到抵抗腫瘤細(xì)胞或受感染的細(xì)胞的作用。該CD40結(jié)合分子可以包括抗體分子，及其同系物、類似物和其修飾或衍生形式，包括象Fab、(Fab′)2和Fv的免疫球蛋白片段，以及結(jié)合在CD40上并激活該CTL反應(yīng)的包括肽、低聚核苷酸、擬態(tài)肽和有機(jī)化合物的小分子。激活CTL的肽包括來自腺病毒且具有序列SGPSNTPPEI(SEQ ID NO2)的E1A-肽和來自人乳頭瘤病毒16型且具有序列RAHYNIVTF(SEQ ID NO3)的HPV16 E7-肽。
可以通過包括注射的適宜方式將該CD40結(jié)合分子和激活CTL的肽給藥到一患者，或者可以給藥編碼這種分子和肽的基因構(gòu)建體，并且因此在體內(nèi)或體外生產(chǎn)該分子和肽。根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法進(jìn)行這種基因療法。如果在體外進(jìn)行該基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染或感染的話，可以向該患者給藥該被感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或者可以在體內(nèi)進(jìn)行這些步驟，由此內(nèi)生地生產(chǎn)該分子和肽。如果在體外進(jìn)行，可以通過包括電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、微注射的傳統(tǒng)方法或者通過將該基因構(gòu)建體加入適宜脂質(zhì)體中進(jìn)行該轉(zhuǎn)染或感染?？梢允褂冒ǚ崔D(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或細(xì)小病毒的載體或質(zhì)粒加入該基因構(gòu)建體，然后它們?cè)隗w內(nèi)或體外表達(dá)。
本文證實(shí)，通過CD40-CD40配體(CD40L)相互作用介導(dǎo)對(duì)CTL引發(fā)有幫助的T-細(xì)胞，在沒有CD4+T細(xì)胞的情況下CTL引發(fā)的缺少可以通過在有包括腫瘤抗原的激活CTL的肽的情況下來自骨髓的APC的單克隆抗體(mAb)所介導(dǎo)的CD40活化來恢復(fù)。而且，由CD4+T細(xì)胞表達(dá)的CD40L的阻斷導(dǎo)致不能產(chǎn)生CTL免疫。這種缺陷可以通過體內(nèi)CD40-觸發(fā)來克服。CD40的體內(nèi)觸發(fā)可以明顯地提高肽基抗腫瘤疫苗的功效，或者另外激活CTL，從而導(dǎo)致抗腫瘤或抗感染的細(xì)胞反應(yīng)。
還應(yīng)指出的是，激活CTL的肽能夠成為耐受原的，意思是在沒有抗-CD40的情況下抵抗表達(dá)這種肽的細(xì)胞的寄主反應(yīng)受到抑制。然而，這種肽與激活抗-CD40的抗體組合將耐受性轉(zhuǎn)變成強(qiáng)的CTL活性。而且，如上所述，CD40連接反應(yīng)能夠賦予已經(jīng)保護(hù)的腫瘤-特異性肽疫苗以在載有腫瘤的小鼠中誘導(dǎo)治療CTL免疫的能力。
這些發(fā)現(xiàn)一起證明了，CD40-CD40配體對(duì)起一決定是否引發(fā)或耐受原初周圍CTL的開關(guān)的作用，因此可以有效地將例如單克隆抗體和其它刺激配體的CD40結(jié)合劑用于與激活CTL的肽組合。
附圖簡(jiǎn)述

圖1E1B特異性CTL的交叉引發(fā)需要CD4+T輔助細(xì)胞在不同效應(yīng)物/靶比值下檢測(cè)用Ad5E1-BALB/c MEC免疫的正常(a)或缺失CD4的B6(b)的小鼠的脾細(xì)胞的載有EIB192-200肽(實(shí)線)或Dd受限制的對(duì)照肽HPV-16 E749-57(虛線)的同源MEC靶細(xì)胞的溶胞作用，該E1B192-200肽來自人體腺病毒并具有序列VNIRNCCYI(SEQID NO1)。每條線代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)代表了具有相同結(jié)果的三個(gè)試驗(yàn)之一。
圖2CD40激活替換CD4+T輔助細(xì)胞將缺失CD4的(a，b)或II型有缺陷的I-Ab敲除(KO)的(c，d)B6小鼠的脾細(xì)胞用Ad5E1-BALB/c MEC免疫并用激活CD40的抗體(Ab)FGK45(a，c)或同種型對(duì)照抗體(b，d)處理。檢測(cè)這些脾細(xì)胞對(duì)載有E1B192-200肽(實(shí)線)或HPV-16E749-57對(duì)照肽(虛線)的同源MEC靶細(xì)胞的E1B特異性CTL活性。每條線代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)來自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。E/T比為效應(yīng)物/靶比值。
圖3B細(xì)胞對(duì)交叉引發(fā)APC或交叉引發(fā)的抗-CD40介導(dǎo)的恢復(fù)不是必需的從未經(jīng)處理的(a)、缺失CD4且B細(xì)胞有缺陷的B6 MT小鼠(b，c)中取出脾細(xì)胞，這些小鼠是用Ad5E1-BALB/c MEC免疫并接受過同種型對(duì)照抗體(b)或激活CD40的抗體FGK45(c)。檢測(cè)這些脾細(xì)胞對(duì)載有E1B192-200肽(實(shí)線)或HPV E749-57對(duì)照肽(虛線)的同源MEC靶細(xì)胞的E1B特異性CTL活性。每條線代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)代表兩個(gè)具有相同結(jié)果的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之一。
圖4CD40L阻斷阻止E1B特異性CTL的交叉引發(fā)從用Ad5E1-BALB/c MEC免疫并用阻斷CD40L的抗體MR-1(a)或?qū)φ湛贵w(b)處理的B6小鼠、或從免疫24小時(shí)后用阻斷CD40L的抗體MR-1與激活CD40的抗體FGK45一起處理的小鼠(c)中取出脾細(xì)胞。檢測(cè)這些脾細(xì)胞對(duì)載有E1B192-200肽(實(shí)線)或HPV E749-57對(duì)照肽(虛線)的同源MEC靶細(xì)胞的E1B特異性CTL活性。每條線代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)代表兩個(gè)具有相同結(jié)果的三個(gè)實(shí)驗(yàn)之一。E/T比為效應(yīng)物/靶比值。
圖5皮下注射有E1A-肽的小鼠不再能封固E1A-特異性CTL用IFA中的20μg E1A-肽(a，b)或?qū)φ针?c，d)給C57BL/6小鼠皮下注射2次(間隔1周)，1天后用SAMB7腹膜內(nèi)注射刺激(b，d)，該SAMB7為一表達(dá)大量E1A-肽的細(xì)胞系。檢測(cè)來自這些小鼠的大塊培養(yǎng)物的對(duì)用E1A-肽(-■-)或HPV16 E7-肽(-O-)脈沖的靶細(xì)胞的E1A-特異性細(xì)胞毒性。顯示了在不同效應(yīng)物∶靶(E/T)比值下典型大塊培養(yǎng)物的溶胞率。將該實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，從而獲得可比較的結(jié)果。
圖6在以IFA皮下注射之后快速地在全身分布耐受的E1A-肽將從未經(jīng)處理的C57BL/6小鼠(-)或從16個(gè)小時(shí)以前經(jīng)皮下注射了IFA中的100μg E1A-肽或HPV16 E7-肽的小鼠獲得的脾細(xì)胞用作用于E1A-特異性CTL克隆的刺激物細(xì)胞。顯示了在沒有扣除本底計(jì)數(shù)的情況下不同效應(yīng)物刺激物濃度的[3H]-胸腺嘧啶摻入(cpm)+/-S.E.M。結(jié)果為單獨(dú)試驗(yàn)的代表。
圖7CD40在體內(nèi)觸發(fā)之后將CTL誘導(dǎo)耐受回復(fù)成CTL引發(fā)對(duì)野生型C57BL/6小鼠(a，b)和H-2bCD40-/-小鼠(c，d)僅經(jīng)皮下注射IFA中的20μg的E1A-肽、與大鼠IgG2a對(duì)照抗體一起注射(a)、或者與抗-CD40mAb FGK-45一起注射(b，d)。檢測(cè)來自這些小鼠的大塊培養(yǎng)物對(duì)用E1A-肽(-■-)、HPV16 E7-肽(-O-)或轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞的Ad5EI(-◆-)脈沖的靶細(xì)胞的E1A-特異性細(xì)胞毒性。顯示了在不同E/T比值下典型大塊培養(yǎng)物的溶胞率。分別將該實(shí)驗(yàn)重復(fù)18次(B6小鼠)和2次(CD40-/-小鼠)，從而獲得可比較的結(jié)果。在(e)中顯示了在E/T為60時(shí)從僅注射了IFA中的E1A-肽(左邊)或注射了IFA中的E1A-肽和抗-CD40mAb(右邊)的B6小鼠中分別獲得的23塊、37塊CTL培養(yǎng)物的溶胞率％。顯示了每組的平均正標(biāo)準(zhǔn)偏差(E1A相對(duì)E1A+抗-CD40p＜0.01，學(xué)生t測(cè)驗(yàn))。
圖8通過肽與體內(nèi)CD40觸發(fā)一起的聯(lián)合治療的HPV16和E7轉(zhuǎn)化細(xì)胞的療法對(duì)小鼠經(jīng)皮下注射25.000 HPV16轉(zhuǎn)化同源細(xì)胞(TC-1)。將C57BL/6小鼠保持未被處理(-O-)或在6天后以IFA腹膜內(nèi)注射接受100μg HPV16 E7-肽(-□-)、以IFA腹膜內(nèi)注射接受100μg HPV16 E7-肽和抗-CD40 mAb FGK-45(-■-)或以IFA腹膜內(nèi)注射接受對(duì)照肽和抗-CD40 mAb FGK-45(-●-)。在(a)中描述了不同處理組(n＝10)中產(chǎn)生腫瘤的小鼠的百分比。經(jīng)統(tǒng)計(jì)用HPV16-肽和抗-CD40 mAb處理的組與其它三個(gè)組之間的差異很大(p＜0.01)(Log-Rank試驗(yàn))。在(b)中顯示了存活動(dòng)物的百分比(E7-肽處理組E7-肽和抗-CD40處理組p＜0.002，Log-Rank試驗(yàn))。
可以通過傳統(tǒng)生產(chǎn)和篩選技術(shù)制備本發(fā)明的CD40結(jié)合分子。在Nature 393474-77(1998)中分別描述了大鼠和倉(cāng)鼠抗鼠CD40單克隆抗體(“Mab”)并可商購(gòu)獲得(Pharmingen，Inc.，CA)。Rolink.A等人在Immunity 5,319-330(1996)中描述了該抗鼠CD40 MAb，叫做FGK45，將其用于下述試驗(yàn)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)制備抗人CD40 MAb，并已由G.Khler和C.Milstein述及(Nature，1975256495-497)?？梢酝ㄟ^用原初CD40免疫嚙齒動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠)產(chǎn)生MAb，該原初CD40是在細(xì)胞上表達(dá)的或是從人血漿或尿中純化的，或者在真核或原核系統(tǒng)中表達(dá)的重組CD40或其片段?？梢詫⑵渌鼊?dòng)物用于免疫，例如非人靈長(zhǎng)類、表達(dá)人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠和用人B淋巴細(xì)胞移植的重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠。如G.Khler和C.Milstein Id所述，通過融合來自用骨髓瘤細(xì)胞(例如Sp2/0和NS0)免疫過的動(dòng)物的B淋巴細(xì)胞的傳統(tǒng)方法可以產(chǎn)生雜交瘤。此外，通過從噬菌體展示系統(tǒng)中的人B淋巴細(xì)胞中篩選重組單鏈Fv或Fab庫(kù)，能夠產(chǎn)生抗-CD40 MAb。該MAb對(duì)CD40的特異性可以通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法或其它免疫化學(xué)技術(shù)檢測(cè)?？贵w在CTL上的激活活性以及激活CTL的肽可以使用下面實(shí)施例中所述的測(cè)定來評(píng)價(jià)。
為了處理人體，應(yīng)優(yōu)選將該抗-CD40 MAb以嵌合的、去免疫的、人化的或人抗體使用。這些抗體可以降低免疫原性，因此避免了人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)。優(yōu)選該抗體為IgG4、IgG2或經(jīng)過其它一般誘變且不增加抗體依賴型細(xì)胞的細(xì)胞毒性(S.M.Canfield和S.L.Morrison，J.Exp.Med.，19911731483-1491)并且不補(bǔ)充所介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(Y Xu等人，J.Biol.Chem.，19942693468-3474；V.L.Pulito等人，J.Immunol.，1996；1562840-2850)的IgG或IgM。
嵌合抗體是通過本領(lǐng)域中眾所周知的重組法生產(chǎn)的，并具有動(dòng)物可變區(qū)和人恒定區(qū)。人化抗體比嵌合抗體具有更大程度的人肽序列。在人化抗體中，僅對(duì)抗原結(jié)合和特異性有反應(yīng)的互補(bǔ)性決定區(qū)是來自動(dòng)物且具有與該動(dòng)物抗體相應(yīng)的氨基酸序列，并且該分子中剩余部分基本上全部(在某些情況下除可變區(qū)中小部分的構(gòu)架區(qū)之外)都是來自人體且相應(yīng)于人抗體的氨基酸序列。參見L.Riechmann等人的Nature，1988；332323-327；G.Winter的US5225539；C.Queen等人的US5530101。
去免疫的抗體為已剔除T和B細(xì)胞表位的抗體，如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/GB98/01473中所述。當(dāng)將它們用于體內(nèi)時(shí)它們降低了免疫原性。
可以通過幾種不同方式制備人抗體，包括使用人免疫球蛋白表達(dá)庫(kù)(Stratagene Corp.，La Jolla，California)以生產(chǎn)人抗體片段(VH、VL、Fv、Fab或(Fab′)2，以及使用這些片段采用與生產(chǎn)嵌合抗體相似的技術(shù)構(gòu)建整個(gè)人抗體。還可以在具有人免疫球蛋白基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠中生產(chǎn)人抗體。這些小鼠可以從Abgenix，Inc.，F(xiàn)remont，California和Medarex，Inc.，Annandale，New Jersey獲得。
人們還可以創(chuàng)建連接重鏈和輕鏈Fv區(qū)的單肽鏈結(jié)合分子。在US4946778中描述了單鏈抗體(“ScFv”)和其構(gòu)建方法?；蛘?，可以通過相似方式構(gòu)建和表達(dá)Fab(M.J.Evans等人的J.Immunol.Meth.，1995；184123-138)。全部和部分的人抗體所有的免疫原性都比不上整個(gè)鼠MAb的，并且這些片段和單鏈抗體也幾乎沒有免疫原性。因此所有這些類型的抗體都不可能引起免疫或變態(tài)反應(yīng)。因此，它們比整個(gè)動(dòng)物抗體更適宜在人體內(nèi)給藥，特別是當(dāng)必需重復(fù)或長(zhǎng)期給藥時(shí)。此外，更小尺寸的抗體片段可以幫助改善組織生物利用率，而該生物利用率可能對(duì)急性病適應(yīng)癥如腫瘤治療中更好地藥量積聚是至關(guān)重要的。
基于抗-CD40 mAb或已知激活CTL的肽的可變區(qū)的分子結(jié)構(gòu)，人們能夠使用分子模型和合理的分子設(shè)計(jì)產(chǎn)生和篩選分別模擬所述抗體或肽的結(jié)合區(qū)的分子結(jié)構(gòu)且激活CTL的分子。這些小分子可以是肽、擬態(tài)肽、低聚核苷酸或其它有機(jī)化合物?？梢允褂眠@些模擬分子治療癌癥和感染。另外，人們可以使用本領(lǐng)域中常用的大規(guī)模篩選步驟從化合物庫(kù)中分離適宜分子。
可以從下述的體內(nèi)試驗(yàn)和測(cè)定、或者從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或從人體臨床試驗(yàn)通過外推法容易地確定本發(fā)明分子的劑量。在為抗體或蛋白質(zhì)時(shí)，盡管某些小分子可能適宜口服，但是本發(fā)明的分子優(yōu)選通過注射給藥。下面描述證明本發(fā)明效果的測(cè)定和試驗(yàn)。
實(shí)施例1在引發(fā)CTL 時(shí)通過CD40發(fā)出的信號(hào)能夠代替CD4+輔助T細(xì)胞使用一完全鑒定的模型系統(tǒng)探測(cè)T-細(xì)胞幫助在體內(nèi)一級(jí)活化CD8+CTL反應(yīng)的機(jī)理。用表達(dá)人腺病毒5型早期區(qū)域1(Ad5EI-BALB/c MEC)的異源BALB/c(H-2d)鼠胚細(xì)胞(MEC)免疫的C57BL/6(具有主要組織相容性復(fù)合體(MHC)H-2b)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腺病毒EIB蛋白(E1B192-200)的H-2Db限制性表位的CTL反應(yīng)(圖1a)。由于通過Ad5EI-BALB/c MEC表達(dá)的異源H-2dMHC分子不能引發(fā)H-2b限制性宿主CTL，因此必需交叉引發(fā)才能產(chǎn)生E1B特異性CTL，即，通過宿主APC吸收并H-2b限制性再呈遞抗原。由于缺失CD4+T-輔助(Th)細(xì)胞的小鼠在免疫之前不再封固E1B特異性CTL反應(yīng)，因此EIB特異性CTL的交叉引發(fā)為嚴(yán)格輔助依賴型(圖1b)。
為了研究通過CD40發(fā)出的信號(hào)是否能夠替代CTL引發(fā)中的CD4+輔助T細(xì)胞，在用Ad5EIBALB/c MEC免疫之前在體內(nèi)使小鼠缺失CD4+T細(xì)胞。免疫一天后，這些小鼠接受活化抗體抗鼠CD40mAb FGK45或同種型配對(duì)的對(duì)照抗體的單一注射。向缺失CD4的給藥FGK45，經(jīng)過免疫的小鼠因此有效地恢復(fù)了E1B特異性CTL反應(yīng)(圖2a)，然而用對(duì)照抗體的處理沒有(圖2b)。在單用FGK45處理的原初小鼠中E1B特異性CTL的引發(fā)沒有缺失(未顯示)。為了解釋FGK45的效果是通過用抗-CD4抗體處理沒有缺失的剩余D4+細(xì)胞介導(dǎo)的可能性，將缺少成熟功能性CD4+周圍T細(xì)胞的B6 I-Ab敲除的小鼠用Ad5EI-BALB/c MEC免疫。在這些小鼠中的該免疫反應(yīng)反射出缺失CD4的小鼠中所看到的，其中僅在接受激活CD40的抗體的小鼠中可以檢測(cè)出E1B特異性CTL(圖2c)，并且在接受對(duì)照抗體中不能檢出(圖2d)。
還研究了在引發(fā)CTL時(shí)在缺失CD4的小鼠中抗-CD40抗體的需要是否能被細(xì)菌性脂多糖(LPS)(50μg靜脈內(nèi))、促炎細(xì)胞因子的有效誘導(dǎo)劑，或通過用Ad5EI-BALB/c MEC免疫之后給藥IL-2(在不完全弗氏佐劑中1×105U，皮下)取代。然而用FGK45處理的缺失CD4的小鼠呈現(xiàn)出強(qiáng)的E1B特異性CTL活性，LPS或IL-2處理都不能導(dǎo)致可檢出的CTL引發(fā)(未顯示)。
CD40在B細(xì)胞上的連接反應(yīng)正調(diào)節(jié)它們的共同刺激活性，這暗示這些細(xì)胞在通過用激活CD40的抗體處理恢復(fù)引發(fā)CTL中的作用。為了解釋該問題，將缺少成熟B細(xì)胞的B6 MT小鼠用異源Ad5EI-BALB/c MEC免疫。E1B特異性CTL的交叉引發(fā)不需要成熟B細(xì)胞(圖3a)。但是，當(dāng)缺失CD4+細(xì)胞時(shí)，該B細(xì)胞有缺陷的小鼠不產(chǎn)生E1B特異性CTL反應(yīng)(圖3b)。用FGK45單克隆抗體通過CD40的激化完全恢復(fù)了CD4缺失型的能力。MT小鼠引發(fā)E1B特異性CTL(圖3c)。因此不需要B細(xì)胞作為APC或用于這種模型系統(tǒng)中交叉引發(fā)的佐細(xì)胞，它們也不需要在沒有CD4+輔助T細(xì)胞的情況下交叉引發(fā)CTL時(shí)CD40所介導(dǎo)的恢復(fù)。這些結(jié)果證明了通過CD40的來自骨髓的APC的激活在E1B特異性CTL的交叉引發(fā)中可以回避對(duì)CD4+T-輔助細(xì)胞的需要。
實(shí)施例2阻斷CD4+輔助T細(xì)胞的能力以通過CD40L-D40徑與APC相互作用防止在正常小鼠中的抗原特異性CTL反應(yīng)如果該CD40L-CD40相互作用代表幫助CTL的CD4+輔助T細(xì)胞所用的生物途徑，那么希望阻斷CD4+T細(xì)胞通過CD40L-CD40相互作用與APC相互作用的能力，從而消除E1B特異性CTL反應(yīng)在正常小鼠中引發(fā)。將B6小鼠用Ad5EI-BALB/c MEC免疫，然后或者用CD40L阻斷的抗體MR1或者用對(duì)照抗體處理。與接受對(duì)照抗體的小鼠中看到的有效CTL引發(fā)(圖4b)相比，CD40L阻斷的結(jié)果大大地降低了E1B特異性CTL反應(yīng)(圖4a)。CD40通過FGK45發(fā)出信號(hào)之后，CD40L阻斷所誘導(dǎo)的引發(fā)缺陷完全得到恢復(fù)(圖4c)。因此通過CD40L誘導(dǎo)的CTL引發(fā)的缺陷在于TH細(xì)胞不能傳遞(而不是接收)CD40L所介導(dǎo)的信號(hào)。
實(shí)施例3在給藥肽之后E1B特異性CTL的無應(yīng)答性使用前面描述的模型系統(tǒng)(Toes等人，J.Immunol.1563911(1996))。已說明用IFA中的來自Ad5E1A的CTL表位SGPSNTPPEI(SEQ ID NO2)皮下接種疫苗防止了小鼠長(zhǎng)出表達(dá)Ad5E1A的腫瘤。這說明該E1A/IFA疫苗誘導(dǎo)抑制而不是誘導(dǎo)E1A-特異性CTL免疫。而且，向T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)基因的小鼠給藥該E1A/IFA，這樣表達(dá)E1A-特異性CTL克隆的TCRα和β鏈，因此強(qiáng)烈地抑制了腫瘤-特異性CTL所介導(dǎo)的免疫。這些試驗(yàn)檢測(cè)了肽給藥到單克隆CTL群體的效果。為了證實(shí)在多克隆CTL級(jí)下皮下接種E1A-肽疫苗是否也誘導(dǎo)E1A-特異性CTL耐受性，向野生型(wt)C57BL/6小鼠注射E1A-肽(圖5a和5b)或?qū)φ针?圖5c和5d)。一天后對(duì)這些小鼠用在其表面表達(dá)高水平E1A-肽的同源細(xì)胞系加強(qiáng)(圖5b和5d)。將該細(xì)胞系注射到用對(duì)照肽引發(fā)的小鼠中容易地誘導(dǎo)E1A-特異性免疫(圖5d)。但是，在注射該E1A/IFA疫苗之后小鼠封固E1A-特異性CTL反應(yīng)的能力被廢除(圖5b)。這些數(shù)據(jù)說明，注射該E1A-肽不僅導(dǎo)致在TCR-轉(zhuǎn)基因小鼠中而且在表達(dá)多克隆E1A-特異性T細(xì)胞所有組成成分的小鼠中的E1A-特異性耐受性。
由于皮下注射該E1A/IFA疫苗導(dǎo)致了全身CTL耐受性，因此研究了該E1A-肽是否分散全身并呈遞到周邊的前體CTL上。因此，對(duì)小鼠皮下注射乳化于IFA中的E1A-肽或來自人乳頭瘤病毒(HPV)16 E7的對(duì)照肽。16個(gè)小時(shí)后從這些小鼠中分離脾細(xì)胞并將其用作體內(nèi)E1A-特異性CTL克隆的刺激細(xì)胞。來自皮下注射有E1A-肽的小鼠的脾細(xì)胞誘導(dǎo)特異性繁殖，然而來自皮下注射有E7-肽的小鼠的脾細(xì)胞不能這樣做(圖6)。而且，對(duì)照CTL克隆在來自注射有E1A的小鼠的脾細(xì)胞上不繁殖(數(shù)據(jù)沒有顯示)。因此，這些數(shù)據(jù)說明，尤其通過脾細(xì)胞將在周邊中全身地呈遞皮下注射IFA中的E1A-肽。
從上面所述的E1A-肽疫苗的耐受性效果的角度來看，存在一問題，CD40在體內(nèi)的觸發(fā)是否足夠地防止了CTL的周邊耐受性并恢復(fù)了CTL引發(fā)。因此，研究了耐受性肽的注射與體內(nèi)CD40觸發(fā)一起是否能夠防止導(dǎo)致腫瘤-特異性CTL免疫的周圍CTL耐受性的誘導(dǎo)。
在實(shí)施例1和2中已顯示了，體內(nèi)CD40的觸發(fā)能夠代替引發(fā)輔助依賴性CTL反應(yīng)時(shí)對(duì)CD4+T輔助細(xì)胞的需求。由于在防止周圍CTL耐受性誘導(dǎo)時(shí)已包含CD4+T細(xì)胞所介導(dǎo)的輔助活性，因此本發(fā)明人解決了體內(nèi)CD-40的觸發(fā)是否足夠防止周圍E1A-特異性CTL的耐受性的問題。為此，對(duì)小鼠注射該E1A/IFA疫苗和活化抗-CD40 mAb FGK-45。接受這種組合的小鼠封固了強(qiáng)的E1A-特異性CTL反應(yīng)(圖7b和7e)，然而僅僅接受該E1A/IFA疫苗(圖7e)或mAb的小鼠沒有封固(未顯示)。E1A/IFA疫苗和抗-CD40 mAb的組合在CD40-有缺陷的小鼠中不能引出CTL(圖7c和7d)。而且，該E1A/IFA疫苗與同種型配對(duì)的對(duì)照mAb(圖6a)或IL-2的共注射不能將該E1A/IFA疫苗誘導(dǎo)的CTL耐受性轉(zhuǎn)變成CTL引發(fā)(未顯示)。在僅用E1A-肽、或者E1A-肽加抗-CD40接種疫苗的動(dòng)物中對(duì)該E1A-表位的反應(yīng)的范圍和差異顯示在圖7e中。這樣，全身CD40的激活能夠?qū)㈦乃T導(dǎo)的周圍CTL耐受性倒轉(zhuǎn)成肽和腫瘤-特異性CTL所介導(dǎo)的免疫。
E1A-特異性免疫的誘導(dǎo)與用含有E1A-肽的與PE共軛的H-2-Db-四聚體(Db/E1A)染色的接種疫苗的小鼠的脾臟中存在CD8+T細(xì)胞有很大關(guān)系。接種疫苗后10天內(nèi)，通過流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)能夠在注射E1A-肽和抗-CD40 mAb的小鼠中檢測(cè)出用Db/E1A四聚體染色的CD8+T細(xì)胞，但在僅注射E1A-肽的小鼠中不能檢出(未顯示)。在注射E1A-肽的小鼠中，用Db/E1A四聚體染色的CD8+細(xì)胞的百分比為約3％。在用整腺病毒(它誘導(dǎo)有效E1A-特異性免疫)接種疫苗的小鼠中，檢測(cè)出可比較量的Db/E1A四聚體反應(yīng)性CD8+脾臟細(xì)胞。這些結(jié)果說明，E1A-特異性CD8+T細(xì)胞在接受E1A/IFA疫苗和抗-CD40 mAb的小鼠中的擴(kuò)展大致為或等于在接種病毒的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的。
實(shí)施例4CD40的觸發(fā)大大提高了肽基抗癌疫苗的功效盡管上述的發(fā)現(xiàn)顯示了通過CD40觸發(fā)的幫助足夠防止了給藥耐受原肽疫苗之后CTL的耐受性，但是他們沒有解決正常誘導(dǎo)保護(hù)性免疫而不是耐受性的抗癌疫苗的功效是否能通過CD40的激活得到提高。檢測(cè)了體內(nèi)CD40的觸發(fā)對(duì)用來自HPV16 E7的肽的接種疫苗的結(jié)果是否有益。用這種肽接種疫苗將誘導(dǎo)抗用HPV16轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞刺激的保護(hù)性CTL所介導(dǎo)的免疫。而且，當(dāng)該肽負(fù)載在體內(nèi)激活的DC上時(shí)能夠?qū)⒃撾挠糜谥委熣{(diào)整，這暗示當(dāng)該抗腫瘤反應(yīng)通過激活的DC呈遞時(shí)其強(qiáng)度得到加強(qiáng)。
與僅用E7-肽處理的小鼠(未顯示)相比，接受E7-肽并伴隨CD40觸發(fā)的小鼠封固了更有效的CTL反應(yīng)，這說明CD40觸發(fā)也提高了HPV16 E7-肽疫苗的功效，并證實(shí)了具有上述E1A肽的發(fā)現(xiàn)。而且，經(jīng)皮下注射僅帶有HPV16 E7-肽(平頭開口)的CD40-HPV16 E6/E7轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞處理6天后的小鼠能夠使腫瘤生長(zhǎng)減慢，但是最終大多數(shù)動(dòng)物死于腫瘤(圖8)。但是，當(dāng)將HPV16 E7-肽接種疫苗與抗-CD40 mAb的注射相結(jié)合時(shí)，腫瘤的生長(zhǎng)明顯降低，并且10只小鼠中有7只沒有排斥腫瘤，然而注射有對(duì)照肽和抗-CD40 mAb的動(dòng)物不能控制腫瘤生長(zhǎng)。這些結(jié)果顯示了當(dāng)免疫與體內(nèi)CD40觸發(fā)組合時(shí)能夠明顯提高接種機(jī)制的效果。這些數(shù)據(jù)為癌癥患者提供了開發(fā)極有效并新穎的抗腫瘤疫苗的基礎(chǔ)。
前面的描述、術(shù)語、解釋和實(shí)施例僅為舉例并不是限制性的。本發(fā)明包括前述實(shí)施方式的所有已知和未知的等價(jià)物。本發(fā)明僅通過以下的權(quán)利要求書而不是通過本文的任意其它部分或任意其它文獻(xiàn)中的任意描述來限制。
序列表＜110＞考內(nèi)里斯J.M.梅烈夫瑞因克.歐夫林加瑞內(nèi).托艾斯史蒂芬P.斯考因伯格馬克.德.鮑爾＜120＞用于治療腫瘤的CD40結(jié)合分子和CTL肽＜130＞98-4-pct＜150＞06/086,625＜151＞1998-05-23＜160＞3＜170＞FastSEQ for Windows Version 4.0＜210＞1＜211＞9＜212＞PRT＜213＞小鼠＜220＞＜400＞1Val Asn Ile Arg Asn Cys Cys Tyr Ile1 5＜210＞2＜211＞10＜212＞PRT＜213＞小鼠＜400＞2Ser Gly Pro Ser Asn Thr Pro Glu Ile1 5 10＜210＞3＜211＞9＜212＞PRT＜213＞乳頭瘤病毒＜400＞3Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe1 權(quán)利要求
1.一種藥物組合為，包括CD40結(jié)合分子和激活CTL的肽。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述CD40結(jié)合分子為抗-CD40抗體或其片段、肽、低聚核苷酸或有機(jī)分子。
3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述抗-CD40抗體為人、人化、嵌合或去免疫的。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述激活CTL的肽為來自腺病毒且具有序列SGPSNTPPEI(SEQ ID NO1)的E1A肽或來自人乳頭瘤病毒16型且具有序列RAHYNIVTF(SEQ ID NO3)的HPV16 E7肽。
5.一種治療腫瘤的方法，包括給藥權(quán)利要求1-4中任意的藥物組合物。
6.一種治療腫瘤或傳染病的方法，包括給藥CD40結(jié)合分子和激活CTL的肽。
7.權(quán)利要求5的方法，其中直接向腫瘤給藥所述藥物組合物。
8.一種治療腫瘤或傳染病的方法，包括給藥編碼CD40結(jié)合分子和激活CTL的肽的基因構(gòu)建體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述CD40結(jié)合分子為抗-CD40抗體或其片段、或肽，并且所述激活CTL的肽為來自腺病毒且具有序列SGPSNTPPEI(SEQ ID NO2)的E1A肽或來自人乳頭瘤病毒16型且具有序列RAHYNIVTF(SEQ ID NO3)的HPV16 E7肽。
10.用權(quán)利要求8的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。
11.權(quán)利要求8或9的方法，其中在體外或體內(nèi)進(jìn)行基因構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染或感染。
12.權(quán)利要求11的方法，其中通過電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、微注射或者通過將所述基因構(gòu)建體加入適宜脂質(zhì)體中在體外進(jìn)行所述轉(zhuǎn)染。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過將所述基因構(gòu)建體加入反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或細(xì)小病毒載體、或者通過將所述基因構(gòu)建體或所述基因構(gòu)建體與病毒或質(zhì)粒載體加入適宜脂質(zhì)體中在體內(nèi)或體外進(jìn)行所述感染。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療腫瘤或傳染病的方法和組合物,其中該組合物包括CD40結(jié)合分子以及CTL活化肽,例如,腫瘤抗原。該組合物用于增強(qiáng)肽腫瘤疫苗的抗腫瘤效力,或者用于活化CTL以便活化的CTL可起抗腫瘤細(xì)胞或感染細(xì)胞的作用。CD40結(jié)合分子包括抗體分子,以及其同源物,類似物和修飾的或衍生的形式,包括如Fab,(Fab’)
文檔編號(hào)C12N1/15GK1346284SQ99807669
公開日2002年4月24日 申請(qǐng)日期1999年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月23日
發(fā)明者考內(nèi)里斯J·M·梅烈夫, 瑞因克·歐夫林加, 瑞內(nèi)·托艾斯, 史蒂芬P·斯考因伯格 申請(qǐng)人:萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心, 泰諾士公司