專利名稱：一種新型人類血小板生成素突變蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型的人類血小板生成素(hTPO)的衍生物，該衍生物在體內(nèi)可高活性地增加血小板生成，本發(fā)明還涉及該衍生物的制備方法。
特別是，本發(fā)明還涉及通過天然hTPO的某些特定位點(diǎn)的氨基酸被其它某些氨基酸，如天冬氨酸所取代，而在天然hTPO中引入了糖鏈的新型hTPO衍生物；涉及編碼該hTPO衍生物的核苷酸序列；涉及含有該核苷酸序列的表達(dá)載體；涉及其構(gòu)建方法；涉及該載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系；以及涉及所述hTPO衍生物的制備方法。
血小板減少癥是由抗癌治療、骨髓移植等引起的一種血小板缺乏。在抗癌治療或骨髓移植過程中，骨髓中的巨核細(xì)胞群形成細(xì)胞，即血小板的前體細(xì)胞受到破壞，導(dǎo)致血小板的缺乏。血小板減少癥患者受到輕微的外傷后就會(huì)出血，嚴(yán)重的病人甚至未受傷也會(huì)出血。這種情況下，出血往往是致命的，因?yàn)檫@種出血完全不能止住。
目前對(duì)血小板減少癥的治療除了輸入血小板，別無它法。然而，這種治療有一些問題并產(chǎn)生一些副作用，如供血者不足，輸血引起的感染，例如感染HIV(人類免疫缺損病毒)和肝炎病毒，引起免疫應(yīng)答反應(yīng)等。
血小板是血液中的一種組分，來源于巨核細(xì)胞前體細(xì)胞，在出血的抑制方面起作用。血小板生成素(以下稱為TPO)是在肝或腎中合成和分泌的一種糖蛋白，在血液中調(diào)節(jié)血小板水平。TPO促進(jìn)巨核細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖和分化，然后產(chǎn)生血小板(Lok et al.,Nature,369:565-568,1994；De savage et al.,Nature,369:533-568,1994)。
由于在1994年首次從人類分離出一種編碼TPO的基因(Lok et al.,Nature,369:565-568,1994；De savage et al.,Nature,533-568,1994；Miyazaki et al.,Experimental hematol.,22:838,1994；WO95/18858),臨床上治療血小板減少癥的方向是基于改善人類TPO(以下稱為hTPO)的功能，即用調(diào)節(jié)血小板水平的方法。
為了增進(jìn)體內(nèi)hTPO的活性，已研究了三種方法。
將糖蛋白表達(dá)在細(xì)胞中，作為一種包括有353個(gè)氨基酸的無活性的前體，信號(hào)肽(21個(gè)氨基酸)的分解導(dǎo)致有活性的hTPO蛋白(332個(gè)氨基酸)從這些細(xì)胞中分泌出。HTPO的氨基酸序列分為兩個(gè)區(qū)。包括有151個(gè)氨基酸的N末端區(qū)有反應(yīng)位點(diǎn)，與促紅細(xì)胞生成素(EPO)的反應(yīng)活性十分類似。另一個(gè)區(qū)，C末端區(qū)，被假定在細(xì)胞外的分泌中和體內(nèi)hTPO的穩(wěn)定性方面起著一個(gè)關(guān)鍵性的作用。
修飾天然hTPO的第一種方法涉及C末端區(qū)的缺失或者在缺失的hTPO增加新的氨基酸。
為了支持這一方法，Amgen公司開發(fā)了多種hTPO衍生物，例如hTPO151(由151個(gè)氨基酸組成)，hTPO174(由174個(gè)氨基酸組成)和在N末端增加蛋氨酸一賴氨酸的hTPO163。然而被證實(shí)，這些衍生物在體內(nèi)的活性比起天然hTPO的活性低，盡管在體外試驗(yàn)中，它們能夠保持活性。(WO95/26746,WO95/25498)。
此外，Genentech公司從大腸桿菌中制備了一種N末端增加蛋氨酸的重組體hTPO153衍生物(WO95/18858)。Kirin生產(chǎn)了缺失C末端的hTPO衍生物，和在一個(gè)特定的氨基酸殘基有取代基，缺失或插入氨基酸的hTPO163衍生物(WO95/21920)。Zymogenetics公司還提供了其它C末端區(qū)缺失的hTPO衍生物(WO95/21920,WO95/17062)和G.D.Searl的(WO96/23888)。但是，這些衍生物在體內(nèi)比起天然hTPO都未顯示出較高的血小板產(chǎn)生活性。
第二種方法是與聚乙二醇(PEG)與hTPO片段結(jié)合有關(guān)的方法，實(shí)例是Amgen公司的hTPO163-PEG(WO95/26746)。
然而，根據(jù)這一方法制備的衍生物有著嚴(yán)重的缺陷，如穩(wěn)定性和安全性低，由于它們不含有對(duì)hTPO的穩(wěn)定性起重要作用的C末端區(qū)，還由于它們的空間結(jié)構(gòu)的改變會(huì)引起免疫反應(yīng)。而且，產(chǎn)品的質(zhì)量不均，因?yàn)镻EG并不以統(tǒng)一的比例被結(jié)合。
第三種方法開開發(fā)了hTPO的糖化，這種方法可以增加hTPO的活性。
Amgen公司進(jìn)行了一項(xiàng)誘發(fā)突變的工作，在cDNA中編碼hTPO的一個(gè)特定的核苷酸被取代，形成的氨基酸序列為“Asn-X-Ser/Thr”(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)。該突變的基因用于制備C末端區(qū)缺失的hTPO衍生物，其包括有174個(gè)氨基酸，該衍生物上產(chǎn)生了一個(gè)或多個(gè)N-連接的糖基化位點(diǎn)。
韓國生物學(xué)與生物技術(shù)研究所(KRIBB)制備了一種hTPO衍生物，在完整的天然hTPO上結(jié)合了一個(gè)糖鏈(Park et al.,J.Bio1.Chem.,273:256-261,1998)，該衍生物不同于Amgen公司的部分hTPO衍生物。
然而，所有這些衍生物都不能顯示出顯著的hTPO高活性。
如上所述，雖然開發(fā)具有增加的生物學(xué)活性的hTPO衍生物已經(jīng)使用了多種方法，但這些方法都沒能夠獲得在體內(nèi)活性高于天然hTPO的hTPO衍生物。
通常，許多蛋白是以在特定位點(diǎn)被低聚糖鏈修飾的蛋白方式存在，例如，糖蛋白。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩類糖化方式。在O-連接的糖化中，糖鏈連接在糖蛋白的Ser/Thr殘基的羥基上。在N-連接hTPO衍生物糖化中，糖鏈連接在糖蛋白的“Asn-X-Ser/Thr”(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)的酰胺基上。
糖蛋白中的糖鏈對(duì)蛋白的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性起到多種作用，如蛋白的穩(wěn)定性和蛋白的分泌等，特別是對(duì)蛋白在體內(nèi)產(chǎn)生的生物學(xué)活性以及藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)起到作用。(Jenkins et al.,Nature Biotechnological.,14:975-981,1996；Liu et al,,Act.TIBTECH.,10:114-120,1992)。
這些作用可以用人干擾素γ和葡萄糖運(yùn)輸?shù)鞍诪槔?，在合適的糖基化位點(diǎn)氨基酸取代引起hTPO活性的顯著降低，提示N-連接的糖鏈對(duì)糖蛋白的活性有重大影響(Sareneva et al.,Biochem.J.303:831-840,1994；Asano et al.,FEBS,324:258-261,1993)然而，引入額外的糖鏈并不總是伴隨著增加糖蛋白的催化活性，如前所述的Amgen公司和KRIBB的技術(shù)(WO96/25498；Park et al.,J.Biol.Chem.,273:256-261,1993)。雖然這些hTPO衍生物引入了額外的糖鏈，但當(dāng)與天然hTPO相比時(shí)，這些糖蛋白的生物學(xué)活性要低得多。根據(jù)此觀察，對(duì)于提高糖蛋白的催化活性，起決定性作用的并不是糖鏈的數(shù)量，而是糖基化反應(yīng)的特定位點(diǎn)。
本發(fā)明的發(fā)明者制備了不同種類的hTPO衍生物，并且進(jìn)行了活性試驗(yàn)。本發(fā)明公開了幾種hTPO衍生物，例如Asn取代Arg164的衍生物；Asn取代Thr193的衍生物；Asn取代Pro157和Arg164的衍生物；Asn取代Leu108、Arg117和Arg164的衍生物，這些衍生物比起天然hTPO產(chǎn)生水平明顯高的血小板，這在現(xiàn)有技術(shù)的hTPO衍生物中是從未觀察到的。
本發(fā)明的目的是提供新型的hTPO衍生物，這些衍生物在體內(nèi)對(duì)于增加血小板的產(chǎn)生比天然hTPO有著較高的活性。
按照本發(fā)明，上述目的和優(yōu)點(diǎn)是可以迅速達(dá)到的。
本發(fā)明提供了新型的在體內(nèi)促進(jìn)血小板的產(chǎn)生的高活性的hTPO衍生物。通過將天然hTPO的某些特定位點(diǎn)的氨基酸被某些氨基酸，如天冬氨酸取代，額外的糖鏈被引入所述hTPO衍生物。
本發(fā)明還提供了編碼所述hTPO衍生物的基因。
此外，本發(fā)明提供了制備所述hTPO衍生物的方法，包括將所述基因插入適當(dāng)?shù)妮d體；用所述載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞；以及轉(zhuǎn)入的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中的培養(yǎng)。
本發(fā)明進(jìn)一步的內(nèi)容將在后文中論述。


圖1是PCR-based誘變，其中產(chǎn)生了編碼hTPO衍生物的cDNA，圖中1由SEQ ID NO:1所示的引物；2由SEQ ID NO:2所示的引物；NN-引物；CC-引物；S信號(hào)序列圖2是突變的基因連接到pBlueBac4載體的過程。
圖3是構(gòu)建動(dòng)物表達(dá)載體的過程，該突變的cDNA被亞克隆在pCDT載體中。
圖4是細(xì)胞擴(kuò)增試驗(yàn)的結(jié)果，圖中M-07e細(xì)胞擴(kuò)增的活性在hTPO衍生物表達(dá)在動(dòng)物細(xì)胞之前被測(cè)出。
圖5是天然hTPO在體內(nèi)的活性，通過對(duì)小鼠用不同劑量的天然hTPO給藥后，測(cè)定小鼠血中血小板的數(shù)量而得到。
圖6是不同hTPO衍生物在體內(nèi)的活性，通過對(duì)小鼠用表達(dá)在動(dòng)物細(xì)胞上的hTPO衍生物(36μg/kg)給藥后，測(cè)定小鼠血中血小板的數(shù)量而得到。
圖7a和7b是不同種類的hTPO衍生物在體內(nèi)的活性，通過對(duì)小鼠用表達(dá)在動(dòng)物細(xì)胞上的hTPO衍生物(10μg/kg)給藥后，測(cè)定小鼠血中血小板的數(shù)量而得到。
圖8是構(gòu)建dhfr表達(dá)載體的過程，該載體含有一個(gè)編碼天然hTPO或hTPO衍生物的基因。
圖9是在一種hTPO衍生物的純化過程中所獲的不同部分SDS-PAGE和銀染色的結(jié)果，圖中帶M大小標(biāo)記；帶1培養(yǎng)上清液；帶2CM-離子交換親和柱洗脫；帶3苯基瓊脂糖凝膠柱洗脫；帶4羥基磷灰石柱洗脫；帶5Q筒柱洗脫。
圖10是天然hTPO和不同種類的hTPO衍生物在體內(nèi)的活性，通過對(duì)小鼠用天然hTPO或純化的hTPO衍生物(10μg/kg)給藥后，測(cè)定小鼠血中血小板的數(shù)量而得到。
圖11是純化的天然hTPO或hTPO衍生物經(jīng)SDS-PAGE和westernblot分析的結(jié)果，圖中帶M大小標(biāo)記；帶1天然hTPO；帶2hTPO衍生物40433；帶3hTPO衍生物40434；帶4hTPO衍生物40449；
帶5hTPO衍生物40458。
圖12a和12b是western blot分析的結(jié)果，其中天然hTPO(圖12a)或其衍生物40433(圖12b)的凝血酶-消化模式根據(jù)消化后的時(shí)間被顯示，圖中帶M大小標(biāo)記；帶1消化前；帶2消化后30分鐘；帶31小時(shí)；帶42小時(shí)；帶53小時(shí)；帶64小時(shí)；帶76小時(shí)。
本發(fā)明詳述如下本發(fā)明提供了新型的活性增強(qiáng)的在體內(nèi)促進(jìn)血小板的產(chǎn)生的hTPO衍生物。通過用某些氨基酸，如天冬氨酸，取代在天然hTPO的某些特定位點(diǎn)的氨基酸，額外的糖鏈被引入所述hTPO衍生物。
為了開發(fā)新型的在體內(nèi)促進(jìn)血小板的產(chǎn)生的活性增強(qiáng)的hTPO衍生物，制備了幾種hTPO衍生物，通過取代hTPO衍生物的特定位點(diǎn)上一個(gè)或多個(gè)氨基酸，一種或多種糖鏈被引入到這些衍生物上。結(jié)果，在特定的位置建立了N-連接的糖化位點(diǎn)“Asn-X-Ser/Thr”(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)例中，用重迭的PCR方法進(jìn)行位點(diǎn)特異性誘變(Cheng et al.,Proc.Natl.Acad.Soc.USA,91:5695,1994)，產(chǎn)生在特定位點(diǎn)上有特定的氨基酸取代的編碼hTPO衍生物的基因。(見圖1)。
首先，化學(xué)合成出了含有突變序列的下列引物對(duì)。這些寡核苷酸引物對(duì)含有與該突變氨基酸殘基相應(yīng)的核苷酸序列，在hTPO的cDNA突變區(qū)擴(kuò)展到該5′或3′相鄰的序列。
表1用于特定位點(diǎn)突變的引物對(duì)

完成了重疊PCR，其中所建立的含有hTPO cDNA的載體pBlue404(KOREA APPLICATION NO.97-7512)用作模板。一方面，編碼hTPO信號(hào)肽的寡核苷酸(SEQ ID NO:1)和編碼突變序列的一種寡核苷酸(表1中的N-引物系列)被用作PCR引物。另一方面，含有hTPO C-端ORF和停止密碼子的寡核苷酸(SEQ ID NO:2)和編碼突變序列的一種寡核苷酸(表1中的C-引物系列)被用作PCR引物。
該重疊PCR產(chǎn)物分別含有從N-端信號(hào)序列到突變區(qū)的DNA序列，和從突變區(qū)到C-端區(qū)的DNA序列。
為獲得全長的含有氨基酸取代目的位點(diǎn)的hTPO cDNA序列，用PCR方法，使用兩個(gè)重疊PCR產(chǎn)物作為模板，兩個(gè)寡核苷酸(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)被用作PCR引物。
通過上述方法，制備了編碼hTPO衍生物的1078-bp全長cDNA序列(見圖1)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)建了含有hTPO衍生物的cDNA的載體，以得到含有該cDNA的表達(dá)載體并最終產(chǎn)生被該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
具體地說，所建立的載體pBlueBac4和每個(gè)編碼hTPO衍生物的cDNA分別被BglⅡ和EcoRⅠ限制酶消化。然后兩種DNA片段用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建含該hTPO衍生物cDNA的載體。
表2列出了所產(chǎn)生的載體，表中給出了這些載體的名稱、編碼hTPO衍生物的突變序列，以及根據(jù)該突變修飾的氨基酸殘基。
本發(fā)明的hTPO衍生物的氨基酸序列通過下述方法被描述該氨基酸序列用替代的氨基酸殘基和在天然hTPO氨基酸序列的特定位點(diǎn)(SEQID NO:30)進(jìn)行描述。例如，本發(fā)明的一種hTPO衍生物40430也可以指作與SEQ ID NO:30所述的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的“[Asn108]hTPO”,表示只有天冬氨酸替代了氨基酸殘基108。
表2在含有hTPO衍生物cDNAs載體中取代的氨基酸和核苷酸序列

在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，為了被引入一種動(dòng)物細(xì)胞，構(gòu)建了該含有hTPO衍生物cDNAs序列的表達(dá)載體。
尤其是，通過將天然hTPO cDNA插入所建立的載體pCDNA3.1，制備了pCDT載體。該pCDT和含有hTPO衍生物基因的載體，如pBlue29、pBlue30、pBlue31、pBlue32、pBlue33、pBlue34、pBlue58、pBlue59、pBlue60、pBlue61、pBlue62、pBlue63被NheⅠ和EcoRⅠ酶所消化。然后這些片段用T4 DNA連接酶所連接，獲得含有每種hTPO衍生物基因的動(dòng)物表達(dá)載體(見圖3與表3)。
表3在含有hTPO衍生物cDNAs的動(dòng)物表達(dá)載體中取代的氨基酸和核苷酸序列

本發(fā)明的范圍不僅包括表3中的DNA序列，而且也根據(jù)遺傳密碼的簡并性包括與表3中氨基酸序列相應(yīng)的其它DNA序列。換句話說，含有表3中修飾的氨基酸的所有編碼hTPO衍生物的DNA序列均可用作一種突變種hTPO基因。
例如，一種可以從表達(dá)載體p40433制備的hTPO衍生物，包括一種多肽[Asn164]hTPO，不僅可以被SEQ ID NO:31 DNA序列編碼，而且可以被簡并DNA序列編碼。
為確定突變的序列插入載體，可使用該P(yáng)CR產(chǎn)物的DNA序列?？蛇x擇地，如果設(shè)計(jì)了重疊PCR引物，其含有一種新限制位點(diǎn)或缺失一個(gè)野生型限制位點(diǎn)，該載體的限制圖可以用于檢測(cè)誘變作用。如果一種表達(dá)載體p40433，例如，有一種突變的序列ACACGT代替野生型序列GAACCT,AflⅢ限制位點(diǎn)將在p40433建立。這樣，帶有AflⅢ的p40433的消化可以用于確定突變的序列是否引入。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，為了將額外的糖鏈連接到天然hTPO修飾的氨基酸中，用所述表達(dá)載體產(chǎn)生了兩種或多種氨基酸修飾的hTPO衍生物。
特別是，兩種所述表達(dá)載體被合適的限制酶消化，然后所得到的片段在所述pCDT載體中亞克隆，以構(gòu)建含有帶有兩個(gè)或三個(gè)修飾區(qū)的hTPO衍生物基因的表達(dá)載體。例如，一個(gè)表達(dá)載體p40429被NheⅠ或BspMⅠ酶消化，獲得一個(gè)包括有氨基酸取代Arg117→Asn117的DNA片段。此外，一種表達(dá)載體p40431被BspMI和Bsu36Ⅰ酶消化，獲得一個(gè)包括有氨基酸取代Gly147→Asn147的DNA片段。所得到的兩種DNA片段被插入pCDT載體的BspMⅠ-Bsu36Ⅰ位點(diǎn)，構(gòu)建一個(gè)表達(dá)載體p40435，該載體含有編碼帶有兩個(gè)氨基酸取代(Arg117→Asn177和Gly147→Asn147)的DNA序列。按照此步驟，構(gòu)建了一些表達(dá)載體，如p40436,p40437,p40438,p40439,p40446,p40447,p40448,p40449(見表3)。
又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，制備了表達(dá)每種hTPO衍生物的動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。
尤其是，通過lipofectamin方法，所述表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞系CHO/K-1，制備表達(dá)每種hTPO衍生物的動(dòng)物細(xì)胞系。
根據(jù)所引入的表達(dá)載體的名稱表示轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系CHO K-1/p40429,CHOK-1/p40430,CHOK-1/p40431,CHOK-1/p40432等，CHOK-1/p40433已于1998年6月17日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(保藏號(hào)KCTC0495BP)。
另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，通過培養(yǎng)帶有本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞系，制備了幾種hTPO衍生物。
尤其是，該轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系在一種含血清的培養(yǎng)基中被大量的傳代培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)染到一種分泌培養(yǎng)基中。濃縮并透析培養(yǎng)基，獲得hTPO衍生物。
一種從CHO K-1/p40433分離得到的hTPO衍生物，是天冬氨酸取代了天然hTPO序列中精氨酸164的多肽[Asn164]hTPO。
一種從CHO K-1/p40434分離得到的hTPO衍生物，是天冬氨酸取代了天然hTPO序列中蘇氨酸193的多肽[Asn193]hTPO。
一種從CHO K-1/p40449分離得到的hTPO衍生物，是天冬氨酸取代了天然hTPO序列中亮氨酸108、精氨酸117、精氨酸164的多肽[Asn108、Asn117、Asn164]hTPO。
一種從CHO K-1/p40458分離得到的hTPO衍生物，是天冬氨酸取代了天然hTPO序列中脯氨酸157、精氨酸164的多肽[Asn157、Asn164]hTPO。
根據(jù)表達(dá)載體的名稱，表達(dá)在動(dòng)物細(xì)胞系中的hTPO衍生物分別被表示為40429～40439、40446、40447、40449、40458～40463。它們?cè)隗w外的活性通過測(cè)定巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞系的增生而被估計(jì)。
其結(jié)果，hTPO衍生物如40429、40430、40432、40433、40434、40437、40438、40439等等顯示出比天然hTPO衍生物較高水平的生物學(xué)活性。未觀察到所增加的糖鏈數(shù)量與體外生物學(xué)活性方面有明顯關(guān)系，由于活性的增減與所引入的糖鏈數(shù)量無關(guān)(見圖4)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，為研究該hTPO衍生物的體內(nèi)生物學(xué)活性，將hTPO衍生物對(duì)小鼠給藥，然后測(cè)定血小板水平。
實(shí)驗(yàn)過程詳述如下將8周齡鼠根據(jù)體重不同分成4～5組，然后將預(yù)定濃度的hTPO衍生物在小鼠皮下給藥。給藥后，收集小鼠外周血管的血液并測(cè)定血液中血小板水平。發(fā)現(xiàn)比起天然hTPO，大多數(shù)hTPO衍生物顯示出較低的血小板水平，而衍生物40433、40434、40449和40458血小板水平相當(dāng)或較高(見圖6、7a或7b)。
這些結(jié)果提示，hTPO衍生物的體內(nèi)活性不依賴于所引入的糖鏈數(shù)量，而是依賴于糖鏈的特定位置。即，為了增加hTPO在體內(nèi)的活性，應(yīng)在hTPO的特定位置上引入糖鏈，如氨基酸164、氨基酸193等位置。
最值得注意的是，在用40433給藥的組中血小板水平比天然hTPO給藥的組高了2天，從給藥后第3天到第4天，表明40433可用作血小板減少癥的一種治療劑。觀察到的最高的血小板水平是用40433對(duì)小鼠給藥后的第5天，這一天達(dá)到了天然hTPO活性的134％，總共高于180％。
本發(fā)明的另一方面，用純化的hTPO衍生物研究了體內(nèi)hTPO活性，產(chǎn)生了與天然hTPO同樣或較高的血小板水平。為進(jìn)行此研究，構(gòu)建了含有hTPO衍生物基因的dhfr表達(dá)載體，產(chǎn)生的載體用于制備有效表達(dá)hTPO基因的細(xì)胞系。
尤其是，BamHI連接物被連接在含有dfhr基因的pSV2-dhfr載體的PvuⅡ-SphⅠ片段上。這種含有dfhr基因的1710-bpDNA片段被插入pCDT，制備含有天然hTPO基因的dfhr表達(dá)載體pCDT。然后，該hTPO衍生物基因被插入pCDT代替天然hTPO基因，構(gòu)建dfhr表達(dá)載體pD40433、pD40434、pD40449和pD40458(見圖8)。
含有hTPO基因的dfhr表達(dá)載體可在轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞基因組中通過細(xì)胞的傳代培養(yǎng)被迅速地?cái)U(kuò)增。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，這些載體被轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞系CHO/dhfr(-)。該新型的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系被分別表示為CHOdhfr-/pD40433、CHO dhfr-/pD40434、CHO dhfr-/pD40449和CHOdhfr/pD40458。CHO dhfr-/pD40434、CHO dhfr-/pD40449和CHOdhfr/pD40458己分別于1999年6月8日保藏在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)(保藏號(hào)KCTC0630BP,KCTC0631BP,KCTC0632BP)。其它的含有hTPO衍生物基因dfhr載體和其轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可根據(jù)所述步驟被獲得。
該轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可以大量培養(yǎng)，hTPO衍生物可按照所建立的方法被純化?？捎酶鞣N不同的柱層析法純化來自細(xì)胞系的hTPO衍生物(該細(xì)胞系與含所述hTPO衍生物基因的dfhr表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，使用了CM-離子交換親和柱、苯基瓊脂糖凝膠柱、羥基磷灰石柱等柱層析法(見圖9)。
為了評(píng)估純化的hTPO衍生物的體內(nèi)生物學(xué)活性，在對(duì)小鼠進(jìn)行該衍生物的給藥后，按照所述方法測(cè)定了血小板水平。在40433-、40434-、40449-和40458-用藥組，給藥10天后，血小板水平分別達(dá)到了天然hTPO用藥組的177％、191％、126％和179％(見圖10)。
為確定附加的糖鏈引入hTPO衍生物，對(duì)純化的天然hTPO和hTPO衍生物進(jìn)行了SDS-PAGE和隨后進(jìn)行的Western blot分析。結(jié)果，衍生物40433和40434的分子量大于天然hTPO分子量。帶有兩個(gè)附加糖鏈的40458和帶有三個(gè)附加糖鏈的40449的分子量，根據(jù)糖鏈的數(shù)量成比例比例增長(見圖11)。
為考察hTPO衍生物的穩(wěn)定性，天然hTPO和衍生物40433與凝血酶一起處理，然后根據(jù)消化的時(shí)間，觀察在Western blot分析中的蛋白帶。結(jié)果表明，40433對(duì)抗凝血酶的消化作用比天然hTPO衍生物更穩(wěn)定(見圖12)。由此提示，由于糖基化而增加的穩(wěn)定性對(duì)提高h(yuǎn)TPO在體內(nèi)的生物學(xué)活性起到了作用。
本發(fā)明的含有hTPO衍生物的藥物組合物可以很方便地制備，可單獨(dú)用藥或與藥物可接受的載體、賦形劑、稀釋劑等組合。這種組合物可以是粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、注射劑等。
尤其是，可用于與水、磷酸緩沖液、extroso溶液、白蛋白溶液、抗氧化劑、糊精等的組合物中。優(yōu)選地，可在靜脈內(nèi)或皮下給藥。
hTPO衍生物可以用比天然hTPO更少的量給藥，例如，劑量范圍在約0.01～1000μg/kg/日。
本發(fā)明的hTPO衍生物可用作治療各種情況引起的血小板減少癥。
例如，可用在服用了抗癌藥、放療、骨髓移植、肝炎、肝硬變等引起的血小板減少癥。為治療這些病，hTPO衍生物可與抗癌劑，如阿霉素、順鉑和造血細(xì)胞因子類生物制品如白介素-3、MCSF、SCF、促紅細(xì)胞生成素，組合給藥。
下列實(shí)施例中列出了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。
然而，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以在本發(fā)明的思路和范圍內(nèi)做出一些修改。
實(shí)施例1編碼hTPO衍生物的cDNA的PCR擴(kuò)增為在編碼hTPO衍生物的基因的特定位點(diǎn)引起突變，制備了表1中12對(duì)寡核苷酸，這些寡核苷酸含有與突變氨基酸殘基相應(yīng)的特定的核苷酸序列。
用已建立的含hTPO cDNA的載體pBlue404(KOREA PATENTAPPLICATION NO.97-7512)作為hTPO基因擴(kuò)增的模板。
詳述如下用50ng pBlue404作為模板進(jìn)行PCR。用含hTPO信號(hào)序列的寡核苷酸(SEQ ID NO:1)和一種含突變序列(表1中的N-引物)抗敏寡核苷酸作為引物。在總體積100μl含4μl引物溶液(40pmol/μl)和1μl Pfu(Pyrococcus furiosus)聚合酶(2.5u/μl；Stratagene,Cat.No.600153)的溶液中完成PCR反應(yīng)。PCR中的熱循環(huán)過程如下在94℃預(yù)變性90秒；包括在94℃變性40秒的35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，在55℃退火60秒，在72℃延伸120秒，在72℃后延伸5分鐘。
按上述反應(yīng)進(jìn)行了另一個(gè)PCR。用含hTPO C-端ORF的寡核苷酸(SEQ ID NO:2)和一種含突變序列(表1中的C-引物)有意義寡核苷酸的停止密碼子作為引物。
在PCR中得到的是從N-端hTPO信號(hào)序列到突變序列DNA片段和從突變序列到hTPO C-端DNA片段。
該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，然后用刀切下有關(guān)的DNA帶，用50μl經(jīng)三次蒸餾的蒸餾水與QIAEXⅡ kit(Qiagen,Cat No.20021)洗脫。
為獲得編碼突變hTPO的全長hTPO cDNA，在100μl終體積中完成PCR，其中用兩種系列的PCR產(chǎn)物(分別為10ng)作為模板，兩種寡核苷酸(SEQ ID NO:1和2)作為引物。PCR中的熱循環(huán)過程如下在94℃預(yù)變性90秒，包括在94℃變性40秒的35次擴(kuò)增循環(huán)，在58℃退火60秒，在72℃延伸120秒，在72℃后延伸5分鐘。
對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，然后按上述步驟用經(jīng)三次蒸餾的蒸餾水30μl洗脫1078-bpDNA帶。
為制備含有兩個(gè)或多個(gè)突變DNA序列區(qū)的hTPO基因，PCR中使用了4對(duì)引物(引物58-N,58-C,60-N,60-C,61-N和61-C,63-N和63-C)。按上述步驟制備了含有突變序列的全長cDNA，然后用一個(gè)引物對(duì)33-N和33-C再次進(jìn)行特定位點(diǎn)的誘變步驟。
在結(jié)果得到的cDNA修飾的氨基酸和核苷酸序列見表2。
實(shí)施例2含hTPO衍生物cDNA的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在CHO細(xì)胞中的表達(dá)(2-1)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建實(shí)施例1中制備的編碼hTPO衍生物的基因在一種市售的載體pBlueBac4中被亞克隆(Invitrogen,Cat.No.V1995-20)，過程如下與每種hTPO衍生物相應(yīng)的PCR產(chǎn)物用BglⅡ和EcoRⅠ酶在37℃消化3小時(shí)，然后用1％瓊脂糖凝膠電泳從反應(yīng)混合物中分離出1068-bpDNA片段。從用BglⅡ和EcoRⅠ酶消化的載體pBlueBac4中也獲得了4771-bpDNA片段。
為亞克隆在載體pBlueBac4中編碼hTPO衍生物的cDNA，通過與T4 DNA連接酶(NEB,Cat.No.202S)在16℃共同溫育16小時(shí)，兩種DNA片段以cDNA比載體DNA片段為4比1的摩爾比例被連接。然后該連接混合物與產(chǎn)生的轉(zhuǎn)移載體被用于轉(zhuǎn)化E.coli TOP10F′菌株(Invitrogen,Cat.No.C3030-03)。所建立的電泳方法已用于獲得E.coli轉(zhuǎn)化體。這些轉(zhuǎn)化體在50ml LB培養(yǎng)基(1升水中10g胰胨，5g酵母提取物，10g氯化鈉)中在37℃培養(yǎng)18小時(shí)后，從帶有Wizard idiprep kit(Promega,Cat.No.A7640)的培養(yǎng)物中獲得轉(zhuǎn)移載體。
這些含hTPO衍生物基因的轉(zhuǎn)移載體分別被表示為pBlue29、pBlue30、pBlue31、pBlue32、pBlue33、pBlue34、pBlue58、pBlue59、pBlue60、pBlue61、pBlue62、pBlue63(見圖2)。
(2-2)動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建為構(gòu)建含hTPO衍生物基因的重組動(dòng)物表達(dá)載體，使用了通過在一種市售載體pCDNA3.1(Invitrogen,Cat.No.790-20)中插入野生型hTPO基因制備的pCDT。
尤其是，5μgpCDT載體用EcoRⅠ和NheⅠ酶在37℃消化3小時(shí)，然后通過1％瓊脂糖凝膠電泳從反應(yīng)混合物中分離出4958-bpDNA片段。實(shí)施例2-1中的轉(zhuǎn)移載體被EcoRⅠ和NheⅠ酶消化，然后1087-bpDNA片段也從每種限制混合物中被分離出。
為亞克隆在pCDT載體中編碼不同hTPO衍生物的CDNA片段，兩種DNA片段以3比1的摩爾比例被混合，并用T4DNA連接酶(NEB Cat.No.202S)在16℃共同溫育18小時(shí)。然后該連接混合物與產(chǎn)生的表達(dá)載體被用于轉(zhuǎn)化E.coli TOP10F′菌株(Invitrogen,Cat.No.C3030-03)。所建立的電泳方法已用于獲得E.coli轉(zhuǎn)化體(見圖3)。這些轉(zhuǎn)化體在50mlLB培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)18小時(shí)后，從帶有Wizardidiprep kit(Promega,Cat.No.A7640)的培養(yǎng)物中獲得表達(dá)載體。含有hTPO衍生物基因的動(dòng)物表達(dá)載體分別被命名為p40429,p40430,p40431,p40432,p40433,p40434,p40458,p40459,p40460,p40461,p40462(見圖3)。分離的質(zhì)粒DNA用NheⅠ,EcoRⅠ,BamHⅠ,Bsu36Ⅰ酶消化，以檢驗(yàn)cDNA是否插入。通過限制制圖和序列測(cè)定，確定表達(dá)載體中的突變。用Sambrook等的DNA電泳方法(Sambrook et al.,Molecular cloning-A laboratory manual,2nd ED.,Cold spring harbor laboratory press,1987)對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行定量測(cè)定和用于轉(zhuǎn)染CHO/K-1細(xì)胞系。
(2-3)hTPO衍生物基因在CHO細(xì)胞的表達(dá)根據(jù)lipofectamin方法(Gibco-BRL,Cat.No.18324012)進(jìn)行轉(zhuǎn)染步驟，在轉(zhuǎn)染前一天將CHO/K-1細(xì)胞(ATCC CCL-61)裝入6孔的微測(cè)定板，每孔的細(xì)胞密度為2×105。24小時(shí)以后用CHO-S-SFMⅡ培養(yǎng)基(Gibco-BRL,Cat.No.12052-098)沖洗一次,并在細(xì)胞中加入0.8ml新鮮培養(yǎng)基。同時(shí)，將每種表達(dá)載體12μg加至600μl CHO-S-SFMⅡ培養(yǎng)基中，然后與含36μl lipofectamin的600μl CHO-S-SFMⅡ培養(yǎng)基混合。該混合物室溫下溫育30分鐘后，每孔中200μl混合物加入6孔板中的細(xì)胞內(nèi)。然后細(xì)胞在5％二氧化碳?xì)怏w中于37℃溫育5小時(shí)。加入1ml含10％FBS(Gibco-BRL,Cat.No.16000-036)培養(yǎng)基到細(xì)胞中后，再于37℃在5％二氧化碳?xì)怏w中培養(yǎng)24小時(shí)。測(cè)定板中的培養(yǎng)基用含10％FBS的HamF-12(Gibco-BRL,Cat.No.11059)替換，然后再在5％二氧化碳?xì)怏w中于37℃培養(yǎng)72小時(shí)以制備一種瞬時(shí)表達(dá)的培養(yǎng)物。
此外，當(dāng)細(xì)胞在HamF-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)以后，將6孔板中的一個(gè)孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含500μg/ml zeocin(Gibco-BRL,Cat.No.R25001)100mm盤的培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)7～10天后，用顯微鏡鑒別抗zeocin菌落。用克隆筒(Cloning cylinder)(Bellco,Cat.No.2090-01010)分離每種hTPO衍生物多于12個(gè)菌落。用測(cè)定hTPO的ELISA kit(R＆DCat.No.DTP00)測(cè)定基因表達(dá)水平，從而可選擇出顯示出最高表達(dá)水平的細(xì)胞系。
實(shí)施例3含帶有兩個(gè)或兩個(gè)以上修飾區(qū)的hTPO衍生物cDNAs的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在CHO細(xì)胞中的表達(dá)為產(chǎn)生含帶有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸修飾區(qū)的hTPO衍生物，利用實(shí)施例2中的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。
為構(gòu)建p40435，表達(dá)載體p40429用NheⅠ和BspMⅠ酶消化，以分離編碼一種取代的氨基酸(Arg117→Asn117)的494-bpDNA片段。另一個(gè)表達(dá)載體p40431用BspMⅠ和Bsu36Ⅰ酶切斷，以分離編碼一種取代的氨基酸(Gly147→Asn147)的355-bpDNA片段。此外，含hTPO cDNA的動(dòng)物表達(dá)載體pCDT用NheⅠ和Bsu36Ⅰ酶消化。p40429和p40431片段被插入pCDT片段，以構(gòu)建動(dòng)物表達(dá)載體p40435，其含有編碼帶有兩個(gè)修飾區(qū)(Arg117→Asn117和Gly147→Asn147)的hTPO衍生物的cDNA。
另一個(gè)表達(dá)載體p40436與兩種氨基酸取代有關(guān)(Arg117→Asn117和Arg164→Asn164)，通過在pCDT中插入p40429的494-bp片段和p40433的593-bp BspMⅠ-EcoRⅠ片段而制備。
根據(jù)上述步驟，表達(dá)載體如p40437、p40438和p40439被制備。其中編碼取代氨基酸的DNA片段從相應(yīng)的載體中被分離出并插入至表達(dá)載體pCDT(見圖3)。
其它表達(dá)載體如p40446、p40447和p40449被制備，在制備步驟中編碼取代氨基酸的三個(gè)DNA片段從相應(yīng)的載體中被分離出并插入至pCDT(見圖3)。
此處所獲的8個(gè)載體被轉(zhuǎn)染至6孔板上的CHO/K-1細(xì)胞中。按照實(shí)施例2的步驟，制備了瞬時(shí)表達(dá)的培養(yǎng)物，并分別分離出抗zeocin菌落。
實(shí)施例4 hTPO衍生物體外活性的估計(jì)M-07e增殖試驗(yàn)為制備hTPO衍生物，在細(xì)胞工廠(Cell Factory)(Nunc Cat.No.170009)以10升的量培養(yǎng)實(shí)施例2和3的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。將每種轉(zhuǎn)染細(xì)胞(5×104cells/ml)轉(zhuǎn)移到含補(bǔ)充了10％FBS的Ham F-12培養(yǎng)基的細(xì)胞工廠。培養(yǎng)72小時(shí)后，將這些細(xì)胞用PBS沖洗一次，然后在ExCell細(xì)胞培養(yǎng)基(JRH,Cat.No.14311-10L)中培養(yǎng)。細(xì)胞再于5％二氧化碳?xì)怏w中在37℃培養(yǎng)96小時(shí)后，從培養(yǎng)物中獲得上清液。上清液第一次濃縮用pelicon膜(Millipore,Cat.No.42PEL60)，第二次濃縮用minitan膜(Millipore,Cat.No.80EL004)。濃縮后，每種樣品在1×TNT緩沖劑(10mM Tris(三羥甲氨基甲烷)，0.15M氯化鈉，0.01％吐溫20,pH7.4)中在4℃透析30小時(shí)，接著進(jìn)行第三次濃縮，用Ultrafree進(jìn)行(Millipore,Cat.No.UFV2BGC10)。樣品用ELISA kit定量分析三次。
巨核細(xì)胞白血病細(xì)胞系M-07e被保持在補(bǔ)充了GM-CSF(100u/ml)和10％FBS的PRMⅠ1640培養(yǎng)基中(Gibco-BRL,Cat.No.22400-089)。
為估算活性,制備試驗(yàn)培養(yǎng)基(補(bǔ)充了5％FBS的RPM1640)，離心處理收集M-07e細(xì)胞，然后用RPM1640沖洗三次。細(xì)胞被重新懸浮在試驗(yàn)培養(yǎng)基上，在T-75瓶中調(diào)節(jié)到8×104cells/ml，在5％二氧化碳?xì)怏w中培養(yǎng)24小時(shí)。再次收集細(xì)胞，并調(diào)節(jié)到1×105cells/ml。將100μl細(xì)胞懸浮液加至96孔板上。通過用RPMⅠ1640培養(yǎng)基系列稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)材料(rhTPO,25μg)的8步濃縮液(100.0～0.78125ng/ml)，用CHO衍生細(xì)胞(cell-derived)天然hTPO作為對(duì)照?？偣?1種hTPO衍生物(從40429至40439)以1.5625,6.25,25ng/ml的濃度被制備。每孔中加入每個(gè)樣品100μl，調(diào)節(jié)至每孔200μl。于5％二氧化碳?xì)怏w中溫育20小時(shí)后，供給細(xì)胞1μCi(37kBq)3H-胸苷，然后再溫育4小時(shí)。用裝有玻璃纖維濾器的細(xì)胞收集器收集細(xì)胞，用PBS沖洗7次。
將收集有細(xì)胞的濾器一個(gè)接一個(gè)地放入計(jì)數(shù)瓶中，用液閃計(jì)數(shù)器測(cè)定每個(gè)樣品發(fā)出的3H-放射性。Riasmart軟件用于計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品的半數(shù)最大濃度。
所有衍生物都顯示出類似的促進(jìn)M-07e細(xì)胞增生活性的模式。在濃度為25ng/ml時(shí)，8種衍生物40429、40430、40432、40433、404334、40437、40438、40439都顯示出比天然hTPO類似或更高的活性，活性達(dá)到了天然hTPO活性的117％、135％、120％、131％、97％、121％、166％和133％(見圖4)。
實(shí)施例5從CHO細(xì)胞分離出的hTPO衍生物的體內(nèi)活性hTPO在體內(nèi)的試驗(yàn)是小鼠用本發(fā)明的各種hTPO衍生物給藥，測(cè)定小鼠血中血小板水平，圖6和圖7a、7b給出了試驗(yàn)結(jié)果。在條件調(diào)節(jié)室內(nèi)用7周齡的Balb/c鼠(Charles River,Japan)試驗(yàn)一個(gè)星期，實(shí)驗(yàn)室條件為24±1℃,55％R.H.，照明12小時(shí)，從早7時(shí)至晚7時(shí)。試驗(yàn)期間，該8周齡的小鼠一直在飼養(yǎng)間進(jìn)行試驗(yàn)。
根據(jù)體重該鼠被隨機(jī)分組，每組5只。用藥分別情況為有僅用培養(yǎng)基的組、用天然hTPO的組、用本發(fā)明每種hTPO衍生物的組或不用藥的空白對(duì)照組。
各種hTPO衍生物(36μg/kg或10μg/kg)對(duì)小鼠皮下進(jìn)行一次注射，從第0天(開始注射的當(dāng)天)至第10天，每天收集小鼠血樣。在給藥后24小時(shí)內(nèi)從腹部腔靜脈收集樣品。將經(jīng)EDTA處理過的試管中的全血樣置于自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)中(Cell dyn 3500,Abbott)進(jìn)行血小板水平測(cè)定。所提供的結(jié)果是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
第3天時(shí)，天然hTPO刺激血小板水平增加。在第5天時(shí)，血小板水平達(dá)到最大值，在第10天趨于正常。發(fā)現(xiàn)所有衍生物都刺激血小板水平增加，其中衍生物40433、40434、40449和40458與天然hTPO的作用相比，產(chǎn)生相同或更高的血小板水平。特別是40433，在第5天時(shí)，其體內(nèi)產(chǎn)生血小板的活性最大值比天然hTPO約高出34％，總體上高出80％或更多。
比較實(shí)施例1天然hTPO的體內(nèi)活性圖5示出用從動(dòng)物細(xì)胞得出的天然hTPO給藥的一只小鼠的血小板水平。7周齡雌性Balb/c小鼠(Charles River,Japan)試驗(yàn)一個(gè)星期，實(shí)驗(yàn)室條件為24±1℃,55％R.H.，照明12小時(shí)，從早7時(shí)至晚7時(shí)。試驗(yàn)期間，該8周齡的小鼠一直在飼養(yǎng)間進(jìn)行試驗(yàn)。
根據(jù)體重該鼠被隨機(jī)分組，每組5只。用藥分別情況為有僅用培養(yǎng)基的組、用天然hTPO的組或不用藥的空白對(duì)照組。
不同濃度的天然hTPO衍生物(1、5或10μg/kg)對(duì)小鼠皮下進(jìn)行一次注射，在第4、8和10天(開始注射的當(dāng)天為第1天)收集小鼠血樣。在給藥后24小時(shí)內(nèi)從腹部腔靜脈收集樣品。將經(jīng)EDTA處理過的試管中的全血樣置于自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)中(Cell dyn 3500,Abbott)進(jìn)行血小板水平測(cè)定。所提供的結(jié)果是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。從第4天開始，天然hTPO刺激血小板水平增加。在第8天時(shí)，血小板水平達(dá)到最大值，在第10天降到最大值的80％。
實(shí)施例6含天然hTPO衍生物cDNA的dhfr表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)它們的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的選擇(6-1)含天然hTPO衍生物cDNA的dhfr表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)實(shí)施例5的結(jié)果構(gòu)建了dhfr表達(dá)載體，其與衍生物40433、40434、43449和40458相對(duì)應(yīng)。
首先，BamHⅠ連接物被插入含有dhfr基因的pSV-dhfr(ATCC37146)。為制備BamHⅠ連接物，兩種寡核苷酸(SEQ ID NO:27和28)被磷酸化，然后被退火，以互相雜交。尤其是，在37℃用T4多核苷酸激酶(NEBL,Cat.No.201S)進(jìn)行磷酸化反應(yīng)3小時(shí)。在退火反應(yīng)中，等分子的寡核苷酸被混合并在94℃放置2分鐘，然后將該混合隨溫度的下降逐步冷卻，從65℃到37℃，每秒下降0.2℃。載體pSV2-dhfr與限制酶PvuⅡ和SphⅠ作用，然后BamHⅠ連接物與pSV2-dhfr片段連接。為制備含dhfr基因的1710-bp片段，所得的載體被BamHⅠ酶消化。
含有野生型hTPO基因的表達(dá)載體pCDT被BglⅡ酶消化后，該1710-bp片段被插入pCDT。所得到的表達(dá)天然hTPO的dhfr的表達(dá)載體被pCDT消化。(見圖8)。
對(duì)于相應(yīng)于5種衍生物的dhfr表達(dá)載體，兩種核苷酸(SEQ ID NO:29和NO:2)被用作PCR引物。除了引物，該P(yáng)CR的條件與實(shí)施例1中相同。被擴(kuò)增的編碼hTPO衍生物的序列用KpnⅠ和EcoRⅠ酶進(jìn)行酶切，然后插入該pCDT載體的KpnⅠ-EcoRⅠ位點(diǎn)。所得到的載體分別標(biāo)示為pD40433、pD40434、pD40449、pD40458。
(6-2)轉(zhuǎn)染入CHO/dhfr(-)細(xì)胞系和基因擴(kuò)增按實(shí)施例2的轉(zhuǎn)染步驟，實(shí)施例6-1中的dhfr表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染入動(dòng)物細(xì)胞系CHO/dhfr(-)(ATCC CRL-9096)。用補(bǔ)充了10％透析的FBS(Gibco-BRL,Cat.No.26300-061)IMDM培養(yǎng)基FBS(Gibco-BRL,Cat.No.12200-036)進(jìn)行隨后的培養(yǎng)。
為選擇轉(zhuǎn)化系，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)內(nèi)將細(xì)胞加入96孔的微測(cè)定板上(每孔的細(xì)胞密度為1×103)，在含有500μl/mlzeocin的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～14天。分離抗zeocin菌落，用ELISA定量法選擇產(chǎn)生高表達(dá)的10～20個(gè)細(xì)胞系。
所選擇的細(xì)胞系在含有20nM MTX(氨甲蝶呤，Sigma,Cat.No.M8407)的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，以擴(kuò)增hTPO基因。詳述如下將細(xì)胞在T-25瓶中培養(yǎng)直到瓶中細(xì)胞飽和。將1/5的飽和細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，接著進(jìn)行1/10和1/15傳代培養(yǎng)。當(dāng)1/15的細(xì)胞傳代培養(yǎng)3～天后，T-25瓶被飽和時(shí)，擴(kuò)增完成。用ELISA定量法從在20nM MTX中擴(kuò)增的細(xì)胞系選擇出產(chǎn)生最高表達(dá)水平的細(xì)胞系。該細(xì)胞系被用于制備進(jìn)行體內(nèi)hTPO活性測(cè)定的樣品。
實(shí)施例7天然hTPO及其衍生物在CHO/dhfr(-)細(xì)胞中的表達(dá)以及純化為制備天然hTPO和及其衍生物，在細(xì)胞工廠(Cell Factory)(NuncCat.No.170069)以4升的量培養(yǎng)實(shí)施例6的細(xì)胞系。將每個(gè)細(xì)胞系(5×104cells/ml)轉(zhuǎn)移到含補(bǔ)充了10％FBS的IMDM培養(yǎng)基的細(xì)胞工廠。培養(yǎng)72小時(shí)后，將這些細(xì)胞用PBS沖洗一次，然后在DMEM/HamF-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞于5％二氧化碳?xì)怏w中在37℃再培養(yǎng)96小時(shí)后，從培養(yǎng)物中獲得上清液用于純化步驟。
將XK26/20柱(Amersham-pharmacia,Cat.No.18-1000-72)用50mlCM Affi-Gel蘭色樹脂(Bio-Rad,Cat.No.153-7304)填充后，用緩沖液A(10mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，pH7.4)沖洗柱子過夜。裝入4升培養(yǎng)物上清液并以5ml/分鐘的流速通過柱子。在波長為280nm的紫外光下通過分光光度法進(jìn)行監(jiān)控。待全部培養(yǎng)上清液都通過柱子后，用緩沖液B(10mM磷酸鈉，2M尿素，pH7.4)沖洗，直到紫外吸收降到基礎(chǔ)水平為止。包括hTPO的結(jié)合蛋白用緩沖液C(10mM磷酸鈉，2M尿素，1M氯化鈉，pH7.4)洗脫，這部分用于隨后進(jìn)行的苯基瓊脂糖凝膠柱層析。將XK26/20柱用50ml苯基瓊脂糖凝膠柱CL4B樹脂(Sigma,Cat.No,P7892)填充后，用緩沖液C沖洗柱子過夜。從CM Affi-Gel蘭色柱洗脫的部分進(jìn)行苯基瓊脂糖凝膠柱層析，以3ml/分鐘的流速通過柱子并在波長為280nm的紫外光下通過分光光度法進(jìn)行監(jiān)控。待全部培養(yǎng)上清液都通過柱子后，用緩沖液C沖洗，直到紫外吸收降到基礎(chǔ)水平為止。結(jié)合到樹脂上的蛋白用緩沖液B洗脫，這部分用于隨后進(jìn)行的羥基磷灰石柱層析。將XK16/20柱(Amersham-pharmacia,Cat.No.18-8773-01)用10ml羥基磷灰石樹脂(Bio-Rad,Cat.No.130-0420)填充后，用緩沖液D(10mM磷酸鈉，2M尿素，pH6.8)沖洗柱子過夜。從苯基瓊脂糖凝膠柱洗脫的部分用5N鹽酸調(diào)pH至6.8，然后進(jìn)行羥基磷灰石柱層析，流速為3ml/分鐘。由于hTPO未結(jié)合到羥基磷灰石樹脂上這部分被保留了下來。用緩沖液D沖洗柱子，直到紫外吸收降到基礎(chǔ)水平為止。然后將結(jié)合到樹脂上的不純的蛋白用緩沖液E(0.5M磷酸鈉，2M尿素，pH6.8)洗脫。用Econo-Pac Q筒(Bio-Rad,Cat.No.732-0021)將所獲得的hTPO部分濃縮至10ml的體積，然后在10mM磷酸鈉中透析24小時(shí)，以去除鹽和尿素。在純化步驟中每一部分通過SDS-PAGE和銀染色而觀察到(見圖9)，其中，銀染色試劑盒(Siver-Stain Plus kit,Bio-Rad,Cat.No.161-0449)的使用方法是按盒的制造者的說明書要求進(jìn)行的。
HTPO的體內(nèi)試驗(yàn)是用純化的hTPO衍生物(劑量為10μg/kg)，按照實(shí)施例5的方法進(jìn)行的。已發(fā)現(xiàn)，所有衍生物不僅能促進(jìn)血小板水平的增加，而且能產(chǎn)生比天然hTPO更高的血小板水平。尤其是40433、40434、40449和40458在給藥后10天內(nèi)，總體上比天然hTPO分別高出77％、91％、26％和79％的血小板水平(見圖10)。
實(shí)施例8 hTPO衍生物的特性檢測(cè)引入糖鏈和hTPO衍生物穩(wěn)定性考察為檢驗(yàn)是否在hTPO衍生物中引入了糖鏈，用SDS-PAGE和Westernblot方法進(jìn)行分析。如果引入了糖鏈，則hTPO衍生物的分子量將比天然hTPO分子量大。
將純化的天然hTPO及其衍生物裝入有10～20％梯度tricine聚丙烯酰胺凝膠(Novex,Cat.No.EC66252)的孔中，在10V/cm的電壓下進(jìn)行電泳。電泳之后，將凝膠上分離出的蛋白轉(zhuǎn)至一種硝化纖維濾器上。將該濾器置于含5％脫脂奶粉的TBS液(pH7.5)中溫育1小時(shí)，然后加入用TBS稀釋(1∶1000)的山羊抗hTPO多克隆抗體(R＆D system,Cat.No.AB-288-NA)繼續(xù)溫育18小時(shí)。該濾器再與第二種抗體-用TBS稀釋(1∶10000)的堿性磷酸酶結(jié)合抗山羊抗IgG抗體(Sigma,Cat.No.A4187)溫育2小時(shí)。染色的底物BCIP/NBT(Sigma,Cat.No.B5655)用作檢測(cè)hTPO帶。結(jié)果為，根據(jù)引入糖鏈數(shù)量的不同，純化的hTPO衍生物的分子量高于天然hTPO的分子量(圖11)。
為評(píng)價(jià)hTPO衍生物的穩(wěn)定性，將天然hTPO與hTPO衍生物40433分別用凝血酶消化，然后觀察時(shí)間-消化曲線圖。將該hTPO衍生物(50μg/ml)加入凝血酶(5units/ml,Sigma,Cat.No.T6759)在37℃消化0.5、1、2、3、4或6小時(shí)。然后用SDS-PAGE和Western blot方法進(jìn)行分析，觀察消化圖。天然hTPO在用凝血酶處理后30分鐘后明顯降解，而衍生物40433在4小時(shí)后才降解。(見圖12)。此結(jié)果證實(shí)衍生物40433比天然hTPO更穩(wěn)定，這可從引入的糖鏈解釋。
如上所述，本發(fā)明的hTPO衍生物可促使體內(nèi)血小板前體細(xì)胞產(chǎn)生，因此可用于與抗癌治療或骨髓移植有關(guān)的血小板減少癥的治療。特別是衍生物40433、40434、40449和40458在促使血小板生成方面的作用比天然hTPO有顯著的提高，并提供了多種優(yōu)點(diǎn)。由于低劑量的hTPO衍生物與天然hTPO有類似的效果，可對(duì)患有血小板減少癥病人偶而進(jìn)行小劑量用藥。因此，由于不含有不純的蛋白以及使用小劑量，使用本發(fā)明的hTPO衍生物將減少治療該病的費(fèi)用。并提高患者的福利及用藥安全性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，上述概念和所公開的實(shí)施例很容易被用作修改或設(shè)計(jì)其它與本發(fā)明目的相同的實(shí)施例的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)理解，這樣同類的實(shí)施例并不能脫離本發(fā)明在權(quán)利要求書中所提出要求的精神實(shí)質(zhì)和范圍。
序列表<110>株式會(huì)社大熊制藥<120>一種新型人類血小板生成素突變蛋白<130>9fpo-04-08<150>KR98-25935<151>1998-06-30<150>KR99-25143<151>1999-06-29<160>34<170>KOPATIN1.0<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>相應(yīng)于hTPO蛋白質(zhì)N末端序列的BglⅡ-標(biāo)記的引物<400>1gaagatctat ggagctgact gaa23<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>相應(yīng)于hTPO蛋白質(zhì)的C末端序列的EcoRⅠ-標(biāo)記的引物<400>2atgaattctc acccttcctg agac24<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡脫氧核苷酸引物29-N<400>3gctgtggtgt tgccctgtgg20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡脫氧核苷酸引物，29-C<400>4acagggcaac accacagctc20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡脫氧核苷酸引物，30-N<400>5gggttccgtt taaactctgc ag22<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡脫氧核苷酸引物30-C<400>6ctgcagagtt taaacggaac ccag24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物31-N<400>7agagggtgga attccctaca agca24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物31-C<400>8tgcttgtagg gaattccacc ctct24<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物32-N<400>9gggcccggtt gacgcaga18<210>10<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物32-C<400>10tctgcgtcaa ccgggccc18<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物33-N<400>11ggactagaga cgtgttgctg gggac25<210>12<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物33-C<400>12gtccccagca acacgtctct agtcc25<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物34-N<400>13gaagcccaga tccgttagtt ctggc25<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物34-C<400>14gccagaacta acggatctgg gcttc25<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物58-N<400>15agctgtggtg tttggggccc gc22<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物58-C<400>16gcgggcccca aacaccacag ct22<210>17<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物59-N<400>17ctagagaggt gctgttgaca gctgtg26<210>18<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物59-C<400>18cacagctgtc aacagcagca cctctctag29<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物60-N<400>19ggtgggtggg gtccggttga cgcagagg28<210>20<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物60-C<400>20cctctgcgtc aaccggaccc cacccacc28<210>21<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物61-N<400>21tctgctgggg gaagcgttgg tgggtgg27<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物61-C<400>22ccacccacca acgcttcccc cagcaga27<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物62-N<400>23cagtgtgagg gttagattgg ttctgctg28<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物62-C<400>24cagcagaacc aatctaaccc tcacactg28<210>25<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物63-N<400>25cagtgtgagg tttagagagg tt22<210>26<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物63-C<400>26aacctctcta aacctcacac tg22<210>27<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>BamHⅠ連接子的合成的寡脫氧核苷酸1<400>27cgcggatccg catg14<210>28<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>BamHⅠ連接子的合成的寡脫氧核苷酸2<400>28cggatccgcg10<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>相應(yīng)于hTPO蛋白質(zhì)的N末端序列的KpnI-標(biāo)記的引物<400>29ggggtaccgc caccatggag ctgactgaat tg32<210>30<211>332<212>PRT<213>人類<400>30Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1 5 10 15Arg Asp Set His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val20 25 30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu35 40 45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu50 55 60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65 70 75 80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln85 90 95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu100 105 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe115120 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu130 135 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145 150 155 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro ASh165170 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr180 185 190Thr GIy Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile195 200 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly210 215 220Tyr Leu Ash Arg Ile His Glu Leu Leu Ash Gly Thr Arg Gly Leu Phe225 230 235 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly245 250 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser260 265 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu275 280 285Pro Pro Thr Leu Pro Leu Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro290 295 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305 310 315 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly325 330<210>31<211>996<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼hTPO突變蛋白40433的cDNA序列<400>31agcccggctc ctcctgcttg tgacctccga gtcctcagta aactgcttcg tgactcccat 60gtccttcaca gcagactgag ccagtgccca gaggttcacc ctttgcctac acctgtcctg 120ctgcctgctg tggactttag cttgggagaa tggaaaaccc agatggagga gaccaaggca 180caggacattc tgggagcagt gacccttctg ctggagggag tgatggcagc acggggacaa 240ctgggaccca cttgcctctc atccctcctg gggcagcttt ctggacaggt ccgtctcctc 300cttggggccc tgcagagcct ccttggaacc cagcttcctc cacagggcag gaccacagct 360cacaaggatc ccaatgccat cttcctgagc ttccaacacc tgctccgagg aaaggtgcgt 420ttcctgatgc ttgtaggagg gtccaccctc tgcgtcaggc gggccccacc caccacagct 480gtccccagca acacgtctct agtcctcaca ctgaacgagc tcccaaacag gacttctgga 540ttgttggaga caaacttcac tgcctcagcc agaactactg gctctgggct tctgaagtgg 600cagcagggat tcagagccaa gattcctggt ctgctgaacc aaacctccag gtccctggac 660caaatccccg gatacctgaa caggatacac gaactcttga atggaactcg tggactcttt 720cctggaccct cacgcaggac cctaggagcc ccggacattt cctcaggaac atcagacaca 780ggctccctgc cacccaacct ccagcctgga tattctcctt ccccaaccca tcctcctact 840ggacagtata cgctcttccc tcttccaccc accttgccca cccctgtggt ccagctecac 900cccctgcttc ctgacccttc tgctccaacg cccaccccta ccagccctct tctaaacaca 960tcctacaccc actcccagaa tctgtctcag gaaggg996<210>32<211>996<212>DNA<213>人工序列<220><223>編碼hTPO突變蛋白40434的cDNA序列<400>32agcccggctc ctcctgcttg tgacctccga gtcctcagta aactgcttcg tgactcccat 60gtccttcaca gcagactgag ccagtgccca gaggttcacc ctttgcctac acctgtcctg 120ctgcctgctg tggactttag cttgggagaa tggaaaaccc agatggagga gaccaaggca 180caggacattc tgggagcagt gacccttctg ctggagggag tgatggcagc acggggacaa 240ctgggaccca cttgcctctc atccctcctg gggcagcttt ctggacaggt ccgtctcctc 300cttggggccc tgcagagcct ccttggaacc cagcttcctc cacagggcag gaccacagct 360cacaaggatc 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ccagcctgga tattctcctt ccccaaccca tcctcctact 840ggacagtata cgctcttccc tcttccaccc accttgccca cccctgtggt ccagctccac 900cccctgcttc ctgacccttc tgctccaacg cccaccccta ccagccctct tctaaacaca 960tcctacaccc actcccagaa tctgtctcag gaaggg99權(quán)利要求
1．由SEQ ID NO:30所示的人類血小板生成素(hTPO)衍生的人類血小板生成素衍生物；該衍生物至少有一個(gè)額外的N-連接糖基化位點(diǎn)；該衍生物選自下組[Asn108]hTPO；[Asn117]hTPO；[Asn147]hTPO ；[Asn153]hTPO；[Asn164]hTPO；[Asn193]hTPO；[Asn117,Asn147]hTPO；[Asn117,Asn167]hTPO；[Asn108,Asn147]hTPO；[Asn108,Asn164]hTPO；[Asn147,Asn164]hTPO；[Asn117,Asn147,Asn164]hTPO；[Asn108,Asn147,Asn164]hTPO；[Asn108,Asn117,Asn164]hTPO；[Asn157,Asn164]hTPO；[Asn162,Ser164]hTPO；[Asn162,Thr164]hTPO；[Asn153,Ser155,Asn164]hTPO；[Asn153,Thr155,Asn164]hTPO；[Asn159,Ser161,Asn164]hTPO；[Asn159,Thr161,Asn164]hTPO；[Asn166,Ser168]hTPO；[Asn166,Thr168]hTPO；[Asn164,Asn168]hTPO。
2．權(quán)利要求1的人類血小板生成素衍生物，它是[Asn164]hTPO、[Asn193]hTPO、[Asn108,Asn117,Asn164]hTPO或[Asn157,Asn164]hTPO。
3．編碼權(quán)利要求1的人類血小板生成素衍生物的重組基因。
4．編碼權(quán)利要求2的人類血小板生成素衍生物的重組基因。
5．含有權(quán)利要求3的重組基因的真核表達(dá)載體。
6．權(quán)利要求5的真核表達(dá)載體，它是p40433、p40434、p40449、p40458、pD40433、pD40434、pD40449或pD40458。
7．被權(quán)利要求6的表達(dá)載體p40433轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系CHOK-1/p40433(保藏號(hào)KCTC0495BP)。
8．被權(quán)利要求6的表達(dá)載體pD40434轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系CHOdhfr-/pD40434(保藏號(hào)KCTC0630BP)。
9．被權(quán)利要求6的表達(dá)載體pD40449轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系CHOdhfr-/pD40449(保藏號(hào)KCTC0631BP)。
10．被權(quán)利要求6的表達(dá)載體pD40458轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系CHOdhfr-/pD40458(保藏號(hào)KCTC0632BP)。
11．制備權(quán)利要求1所述的人類血小板生成素衍生物的方法，其中含有權(quán)利要求3的重組基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系被用于獲得權(quán)利要求1所述的人類血小板生成素衍生物。
12．用于治療血小板減少癥的含有權(quán)利要求1所述的人類血小板生成素衍生物的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型的人類血小板生成素(hTPO)的衍生物及其制備方法,特別是天然hTPO的特定位點(diǎn)的氨基酸被其它某些氨基酸,如天冬氨酸所取代,而在天然hTPO中引入了糖鏈,制備出在體內(nèi)高活性地增加血小板生成的新型hTPO衍生物。因此,本發(fā)明的新型hTPO衍生物可用于與抗癌治療或骨髓移植有關(guān)的血小板減少癥的治療。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1306573SQ99807757
公開日2001年8月1日 申請(qǐng)日期1999年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月30日
發(fā)明者鄭周永, 樸祥圭, 朱相銘, 安惠敬, 林承旭, 張又翼, 樸勝國, 高麗旭, 樸芝洙 申請(qǐng)人:株式會(huì)社大熊制藥