專利名稱：植物中基因表達(dá)的dsRNA介導(dǎo)的調(diào)節(jié)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改變植物中基因表達(dá)的方法，特別是利用該基因的有義和反義RNA片段，并且涉及利用本發(fā)明的方法獲得的基因表達(dá)改變的植物。
分子生物學(xué)和植物轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展使得能產(chǎn)生具有希望的不同性狀的轉(zhuǎn)基因植物，這些性狀例如，對(duì)昆蟲及真菌或微生物病原體的抗性，對(duì)除草劑的耐受性或增值性狀。這些希望的性狀主要是通過(guò)植物中轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)而獲得的。然而，在某些情況中，修飾植物使得特定基因的表達(dá)改變，從而產(chǎn)生具有希望的表型或具商業(yè)價(jià)值的特性的植物也是希望的?，F(xiàn)有的改變基因表達(dá)的方法通常依賴于有義或反義抑制技術(shù)。例如，矮牽牛屬(Petunia)中查耳酮合酶基因的有義抑制產(chǎn)生色素形成改變的花，番茄中多聚半乳糖醛酸酶基因的反義抑制導(dǎo)致延遲的果實(shí)成熟。遺憾的是，這些方法在改變基因表達(dá)的能力方面常常是易變的且無(wú)法預(yù)測(cè)的，在許多情況下不能實(shí)現(xiàn)特定基因活性的完全破壞。改變基因表達(dá)的其他方法包括催化核糖核苷酸或核酶的應(yīng)用，這在技術(shù)上是有挑戰(zhàn)性的，或者同源基因破壞，雖然在遺傳學(xué)上這是最希望的，但遺憾的是利用現(xiàn)有技術(shù)不足以常規(guī)用于這些目的。
因此，一直需要但尚未找到能有效地且可預(yù)測(cè)地改變植物細(xì)胞中基因表達(dá)，而獲得具有改善的或商業(yè)重要特性的植物的新方法。
本發(fā)明涉及利用分子技術(shù)和遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生具有改善的特性和性狀的植物。特別是，本發(fā)明涉及利用基因的有義和反義RNA片段改變植物細(xì)胞中基因表達(dá)的方法。重要地，這些有義和反義RNA片段能夠形成雙鏈RNA分子。本發(fā)明還涉及用這些方法獲得的植物細(xì)胞，由這些細(xì)胞衍生的植物，這些植物的后代和這些植物產(chǎn)生的種子。在這些植物細(xì)胞或植物中，特定基因之基因表達(dá)的改變比利用本領(lǐng)域已知的現(xiàn)有方法獲得的特定基因之基因表達(dá)的改變更有效、更有選擇性且更可預(yù)測(cè)。
因此本發(fā)明提供一種方法，包括向植物細(xì)胞中引入靶基因的有義RNA片段和該靶基因的反義RNA片段，其中該有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子，其中靶基因在該細(xì)胞中的表達(dá)被改變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA片段包含于兩種不同的RNA分子中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此RNA片段在被引入細(xì)胞之前混合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，此RNA片段在被引入細(xì)胞之前，在能使其形成雙鏈RNA分子的條件下混合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些RNA片段被順序引入所述細(xì)胞中。在又另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些RNA片段包含于一種RNA分子中。在這種情況中，該RNA分子優(yōu)選地能夠折疊，使得其中包含的所述RNA片段形成雙鏈RNA分子。
本發(fā)明另外提供一種方法，包括向植物細(xì)胞中引入能在該細(xì)胞中表達(dá)靶基因的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細(xì)胞中表達(dá)靶基因的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中所述有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子，其中靶基因在該植物細(xì)胞中的表達(dá)被改變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些DNA序列穩(wěn)定地整合于植物細(xì)胞的基因組中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA分子另外含有與所述第一種或第二種DNA序列有效連接的啟動(dòng)子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于兩種不同的DNA分子中。
或者，第一種DNA序列和第二種DNA序列也可包含于一種DNA分子中。在此情況中，第一種DNA序列和第二種DNA序列優(yōu)選地包含于該DNA分子的同一DNA鏈中，并且優(yōu)選地，有義RNA片段和反義RNA片段包含于一種RNA分子中。優(yōu)選地，該RNA分子能夠折疊，使得其中包含的所述RNA片段形成雙鏈區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，有義RNA片段和反義RNA片段包含于或者表達(dá)為兩種RNA分子。在此情況中，第一種DNA序列和第二種DNA序列優(yōu)選地與雙向啟動(dòng)子有效連接，或者，另外，第一種DNA序列與第一種啟動(dòng)子有效連接，而第二種DNA序列與第二種啟動(dòng)子有效連接，其中第一種啟動(dòng)子和第二種啟動(dòng)子是相同的啟動(dòng)子或不同的啟動(dòng)子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于所述DNA分子的互補(bǔ)鏈中。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在所述DNA分子中，第一種DNA序列是第二種DNA序列的互補(bǔ)DNA鏈。
在此情況中，該DNA分子另外含有與所述第一種DNA序列有效連接的第一種啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA分子另外含有位于第一種啟動(dòng)子和第一種DNA序列之間的第一個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，和位于第一種DNA序列3’末端的第二個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，其中第一個(gè)和第二個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)能夠在位點(diǎn)特異性重組酶的存在下，翻轉(zhuǎn)位于第一種和第二種位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的第一種DNA序列，并且優(yōu)選地彼此互為反向。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，由于這種翻轉(zhuǎn)，第一種啟動(dòng)子能夠表達(dá)第二種DNA序列。植物細(xì)胞優(yōu)選地另外含有一種能夠識(shí)別所述位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性重組酶。
在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該DNA分子另外含有與所述第一種DNA序列有效連接的第一種啟動(dòng)子，和與第二種DNA序列有效連接的第二種啟動(dòng)子，其中第一種啟動(dòng)子和第二種啟動(dòng)子含有相同的啟動(dòng)子或不同的啟動(dòng)子。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶基因是所述植物細(xì)胞的天然基因，優(yōu)選的是該植物細(xì)胞的必需基因。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA分子中的啟動(dòng)子包括該天然靶基因的天然啟動(dòng)子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子，例如組織特異性啟動(dòng)子、發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。任選地，該啟動(dòng)子是一種能在啟動(dòng)子任一側(cè)起始DNA序列轉(zhuǎn)錄的趨異啟動(dòng)子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該基因是該植物細(xì)胞中的異源基因，優(yōu)選地穩(wěn)定整合于該植物細(xì)胞的基因組中，或者另外作為染色體外分子存在于該植物細(xì)胞中。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA序列在編碼有義和反義RNA片段的DNA序列之間另外含有一種接頭。接頭包括例如，含有功能基因(如選擇性標(biāo)記基因)或調(diào)節(jié)序列(如內(nèi)含子加工信號(hào))的表達(dá)盒。
本發(fā)明另外還提供
一種植物細(xì)胞，其含有本發(fā)明的有義和反義RNA片段，其中所述RNA片段、植物細(xì)胞產(chǎn)生的植物及其后代，和該植物產(chǎn)生的種子改變了所述植物細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。
本發(fā)明另外還提供通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的植物細(xì)胞。
“雙鏈RNA(dsRNA)”分子包含靶基因的有義RNA片段和相同靶基因的反義RNA片段，兩者都含有彼此互補(bǔ)的核苷酸序列，從而使得有義和反義RNA片段配對(duì)，并形成雙鏈RNA分子。
“互補(bǔ)”是指含有反平行核苷酸序列的兩種核苷酸序列，它們能在反平行核苷酸序列的互補(bǔ)堿基殘基之間形成氫鍵后彼此配對(duì)。
“反平行”在此是指在互補(bǔ)堿基殘基之間通過(guò)氫鍵配對(duì)的兩種核苷酸序列，在一種核苷酸序列中磷酸二酯鍵為5’-3’方向，而在另一種核苷酸序列中為3’-5’方向。
“靶基因”是植物細(xì)胞中的任一基因。例如，靶基因是一種具有已知功能的基因，或者是一種尚未知其功能但已知其全部或部分核苷酸序列的基因?；蛘撸谢虻墓δ芗捌浜塑账嵝蛄幸部啥嘉粗?。靶基因是植物細(xì)胞的天然基因，或者是以前通過(guò)例如遺傳轉(zhuǎn)化引入植物細(xì)胞或該植物細(xì)胞的親代細(xì)胞中的異源基因。異源靶基因穩(wěn)定地整合于植物細(xì)胞的基因組中，或者作為染色體外分子如自主復(fù)制染色體外分子存在于植物細(xì)胞中。
“天然”基因是指存在于未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞基因組中的基因。
“必需”基因是編碼植物生長(zhǎng)或存活所必需的蛋白質(zhì)如生物合成酶、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。
“改變”植物細(xì)胞中靶基因的表達(dá)意思是，應(yīng)用本發(fā)明的方法后，植物細(xì)胞中靶基因的表達(dá)水平不同于應(yīng)用該方法之前其在細(xì)胞中的表達(dá)。改變基因表達(dá)優(yōu)選地意思是，植物中靶基因的表達(dá)降低，優(yōu)選地強(qiáng)烈降低，更優(yōu)選地基因表達(dá)檢測(cè)不到。必需基因表達(dá)的改變可導(dǎo)致植物細(xì)胞或由其衍生的植物中的敲除突變表型。
在本發(fā)明申請(qǐng)書中“分離的”是一種分離的核酸分子，其通過(guò)人工操作與其天然環(huán)境分開存在，因此不是一種天然產(chǎn)物。分離的核酸分子可能以純化的形式存在，或者可能存在于非天然環(huán)境中，如轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。
在此使用的“表達(dá)盒”意思是能在適當(dāng)宿主細(xì)胞中引導(dǎo)特定核苷酸序列表達(dá)的DNA序列，包括與目的核苷酸序列有效地連接的啟動(dòng)子，該核苷酸序列與終止信號(hào)有效地連接。它一般還包含核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列。編碼區(qū)通常編碼目的蛋白，但也可編碼目的功能性RNA，例如有義或反義方向的反義RNA或非翻譯RNA。含有目的核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，意思是其至少一種成分對(duì)于至少另一種成分是異源的。表達(dá)盒也可是天然發(fā)生的，但已以可用于異源表達(dá)的重組形式獲得。然而一般而言表達(dá)盒對(duì)于宿主是異源的，即表達(dá)盒的特定DNA序列不在宿主細(xì)胞中天然存在，并且必須通過(guò)轉(zhuǎn)化事件被引入宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的祖先中。表達(dá)盒中核苷酸序列的表達(dá)可以受組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制，該啟動(dòng)子只有在宿主細(xì)胞接觸某種特定外部刺激物時(shí)才起始轉(zhuǎn)錄。對(duì)于多細(xì)胞生物，如植物，啟動(dòng)子也可能是對(duì)特定組織或器官或發(fā)育階段特異的。
在此使用的“異源的”意思是“不同天然來(lái)源的”，或者表示一種非天然狀態(tài)。例如，如果用從另一種生物尤其是從另一個(gè)種衍生的核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該核酸序列對(duì)于該宿主細(xì)胞是異源的，并且對(duì)于該宿主細(xì)胞的攜帶該核酸序列的后代也是異源的。類似地，異源是指來(lái)源于和插入相同天然、原始細(xì)胞型的核苷酸序列，但它以非天然狀態(tài)存在，例如，不同拷貝數(shù)，或處于不同調(diào)節(jié)元件控制之下。
最廣義地來(lái)說(shuō)，當(dāng)在此對(duì)于核苷酸序列使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本上類似”意思是一種對(duì)應(yīng)于參照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相應(yīng)的序列編碼一種與參照核苷酸序列編碼的多肽有基本上相同的結(jié)構(gòu)和功能的多肽，例如，只發(fā)生不影響多肽功能的氨基酸改變。希望地，基本上類似的核苷酸序列編碼參照核苷酸序列編碼的多肽。基本上類似的核苷酸序列與參照核苷酸序列之間同一性的百分?jǐn)?shù)(互補(bǔ)序列中的互補(bǔ)堿基數(shù)除以互補(bǔ)序列中的堿基總數(shù))希望地為至少80％，更希望地為85％，優(yōu)選地至少90％，更優(yōu)選地至少95％，再更優(yōu)選地至少99％。
“調(diào)節(jié)元件”是指參與核苷酸序列表達(dá)的序列。調(diào)節(jié)元件包含與目的核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子和終止信號(hào)。它們一般還包含該核苷酸序列適當(dāng)翻譯所需的序列。
“植物”指在任何發(fā)育階段的任何植物或植物的部分。其中也包括插條、細(xì)胞或組織培養(yǎng)物和種子。與本發(fā)明聯(lián)合使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“植物組織”包括但不限于，整個(gè)植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物種子、原生質(zhì)體、愈傷組織、細(xì)胞培養(yǎng)物、和組織成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的任何植物細(xì)胞組。
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中基因表達(dá)的方法。調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中基因表達(dá)的常用方法缺乏可預(yù)測(cè)性，并且根據(jù)所調(diào)節(jié)的基因顯示變化性。本方法解決了這些問(wèn)題，并且提供了植物細(xì)胞中可重復(fù)的及有效的基因調(diào)節(jié)。
本發(fā)明利用靶基因的有義RNA片段和反義RNA片段改變植物細(xì)胞中基因的表達(dá)。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了改變靶基因在植物細(xì)胞中表達(dá)的方法，包括向植物細(xì)胞中引入靶基因的有義RNA片段，和該靶基因的反義RNA片段，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子，其中靶基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)改變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用不同的轉(zhuǎn)化方法將RNA片段引入植物細(xì)胞中。例如，利用如共同未決的申請(qǐng)08/717,676所述的粒子轟擊向宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)移RNA片段。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)如Lebel等人(1995)理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor.Appl.Genet.)91899-906的PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或通過(guò)電穿孔法向原生質(zhì)體或其他細(xì)胞型中引入RNA片段。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用其他技術(shù)，如RNA片段的顯微注射。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些RNA片段包含于兩種不同的RNA分子中。在此情況中，此RNA片段在被引入所述細(xì)胞之前，例如在能使其形成雙鏈RNA分子的條件下混合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些RNA片段被順序引入所述細(xì)胞中。優(yōu)選地，每種RNA分子引入之間的時(shí)間間隔很短，優(yōu)選地少于1小時(shí)。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，這些RNA片段包含于一種RNA分子中。利用一種RNA分子，兩種互補(bǔ)的RNA片段緊密接近，引起配對(duì)，促成了雙鏈形成。在這種情況中，該RNA分子優(yōu)選地能夠折疊，使得其中包含的所述RNA片段形成雙鏈區(qū)。在這種情況中，RNA分子的互補(bǔ)部分彼此識(shí)別，互相配對(duì)，形成雙鏈RNA分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在引入細(xì)胞之前，在能使其形成雙鏈RNA分子的條件下溫育RNA片段。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA分子在有義RNA片段和反義RNA片段之間含有一個(gè)接頭。該接頭優(yōu)選地包含含有功能基因如選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)盒所編碼的RNA序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭包含調(diào)節(jié)序列編碼的RNA序列，例如，含有內(nèi)含子加工信號(hào)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種方法，包括向植物細(xì)胞中引入能在所述細(xì)胞中表達(dá)靶基因的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在所述細(xì)胞中表達(dá)靶基因的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成一種雙鏈RNA分子，其中該細(xì)胞中靶基因的表達(dá)改變。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種DNA序列和第二種DNA序列穩(wěn)定地整合于植物細(xì)胞的基因組中。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種DNA序列和第二種DNA序列存在于植物細(xì)胞中染色體外分子上，如自主復(fù)制分子上。此外，第一種DNA序列穩(wěn)定整合于植物細(xì)胞的基因組中，而第二種DNA序列存在于植物細(xì)胞的染色體外分子上。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA序列包含于兩種不同的DNA分子中。在這種情況中，第一種DNA序列與第一種啟動(dòng)子有效連接，而第二種DNA序列和第二種啟動(dòng)子有效連接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，兩種啟動(dòng)子包含于同一種啟動(dòng)子中，或者另外，包含于不同的啟動(dòng)子中。該DNA分子中任選地也包含終止信號(hào)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA序列包含于一種DNA分子中。優(yōu)選地，第一種和第二種DNA序列包含于DNA分子的相同DNA鏈中，并且優(yōu)選地，有義RNA片段和反義RNA片段包含于或者表達(dá)為DNA分子編碼的一種RNA分子。在此情況中，DNA分子另外含有與第一種或第二種DNA序列有效連接的啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子能轉(zhuǎn)錄第一種和第二種DNA序列。該啟動(dòng)子優(yōu)選地與編碼反義片段的DNA序列有效連接，該序列本身與編碼有義片段的DNA序列有效連接?；蛘?，該啟動(dòng)子與編碼有義片段的DNA序列有效連接，該序列本身與編碼反義片段的DNA序列有效連接。利用一種單RNA分子，兩種互補(bǔ)的RNA片段緊密接近，引起配對(duì)，促成了雙鏈形成。
或者，當(dāng)DNA序列包含于同一DNA鏈中時(shí)，產(chǎn)生兩種不同的RNA分子，例如，一種含有有義RNA片段的RNA分子和一種含有反義RNA片段的RNA分子。在這種情況中，DNA分子優(yōu)選地另外含有能表達(dá)這些RNA片段的調(diào)節(jié)元件。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些調(diào)節(jié)元件包括趨異的、雙向啟動(dòng)子，其位于編碼有義RNA片段的DNA序列和編碼反義RNA片段的DNA序列之間。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，含有相同啟動(dòng)子或不同啟動(dòng)子的兩種不同的啟動(dòng)子置于兩個(gè)DNA序列之間。在又另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA分子包含與第一種DNA序列有效連接的第一種啟動(dòng)子，和與第二種DNA序列有效連接的第二種啟動(dòng)子，其中該DNA序列位于兩個(gè)啟動(dòng)子之間，并且兩種啟動(dòng)子能以相反方向引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA序列另外在編碼兩種互補(bǔ)RNA片段的DNA序列之間含有一種接頭。該接頭優(yōu)選地包含含有功能基因如選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)盒。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該接頭包含調(diào)節(jié)序列，例如包含內(nèi)含子加工信號(hào)。
在又另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，第一種和第二種DNA序列包含于DNA分子的互補(bǔ)DNA鏈中。更優(yōu)選地，在DNA分子中，第一種DNA序列是第二種DNA序列的互補(bǔ)鏈。例如，在此情況中，第一種DNA序列對(duì)應(yīng)于靶基因片段的編碼鏈，并能表達(dá)有義RNA片段，第二種DNA序列對(duì)應(yīng)于靶基因的互補(bǔ)非編碼鏈，能表達(dá)反義RNA片段。因此，在此情況中，優(yōu)選地產(chǎn)生兩種不同的RNA分子。因此，DNA分子含有與第一種DNA序列5’端有效連接的第一種啟動(dòng)子，能表達(dá)第一種DNA序列，和與第一種DNA序列3’端有效連接的第二種啟動(dòng)子，能表達(dá)為第一種DNA序列的互補(bǔ)鏈的第二種DNA序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用兩種不同的啟動(dòng)子，或者另外，用相同的啟動(dòng)子表達(dá)兩種DNA序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA分子另外在啟動(dòng)子的遠(yuǎn)端含有轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)選地，在此情況中，轉(zhuǎn)錄物由一個(gè)啟動(dòng)子的3’端開始，以一個(gè)方向通過(guò)DNA序列，從3’端到5’端通過(guò)第二個(gè)啟動(dòng)子，終止于第二個(gè)啟動(dòng)子5’末端的轉(zhuǎn)錄終止子處。轉(zhuǎn)錄終止子的應(yīng)用可穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄的RNA。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA分子另外含有與所述第一種DNA序列有效連接的啟動(dòng)子，可能還含有位于該啟動(dòng)子與第一種DNA序列之間的第一個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，和位于第一種DNA序列3’末端的第二個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，其中第一個(gè)和第二個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)在能識(shí)別位點(diǎn)特異性識(shí)別位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性重組酶的存在下，能翻轉(zhuǎn)位于第一個(gè)和第二個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的第一種DNA序列。無(wú)重組酶時(shí)，只能產(chǎn)生第一種DNA序列編碼的有義RNA片段。在相應(yīng)重組酶的存在下，位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的DNA序列翻轉(zhuǎn)，并且第二種DNA序列與該啟動(dòng)子有效連接，反義片段得以表達(dá)。在重組酶的持續(xù)存在下，發(fā)生DNA序列的進(jìn)一步翻轉(zhuǎn)，有義和反義RNA片段都積累。因此本發(fā)明也提供進(jìn)一步含有能識(shí)別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性重組酶的植物細(xì)胞。本發(fā)明的這一實(shí)施方案在實(shí)施例5中進(jìn)一步描述。
在本發(fā)明的DNA分子中，DNA序列優(yōu)選地與啟動(dòng)子有效連接。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA分子中的啟動(dòng)子包括待滅活的天然靶基因的天然啟動(dòng)子，以確保雙鏈RNA以與待表達(dá)靶基因相同的發(fā)育時(shí)間存在于相同的組織中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子，例如組織特異性啟動(dòng)子、發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、趨異或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該基因是所述植物細(xì)胞中的異源基因。DNA分子中任選地也包含終止信號(hào)。
一種RNA分子或兩種不同的RNA分子優(yōu)選地能形成一種雙鏈區(qū)，其中RNA片段的互補(bǔ)部分彼此識(shí)別，互相配對(duì)，形成雙鏈RNA分子。利用本領(lǐng)域眾所周知的或以下描述的方法將本發(fā)明的DNA分子轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中。例如，使用微粒轟擊、顯微注射或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。并且，利用電穿孔或化學(xué)處理(如PEG處理)以本發(fā)明的DNA分子轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。
此外，也用病毒載體，例如通過(guò)所謂的農(nóng)桿菌感染法，向植物細(xì)胞中引入本發(fā)明的DNA分子或RNA片段。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)真空滲入或葉表面磨擦向植物細(xì)胞中引入本發(fā)明的DNA分子或RNA片段。
這些方法能產(chǎn)生含有本發(fā)明的有義和反義RNA片段的植物細(xì)胞，其中，所述RNA片段、植物細(xì)胞衍生的植物及其后代，和該植物產(chǎn)生的種子改變了所述植物細(xì)胞中靶基因的表達(dá)。
本發(fā)明中，有義與反義RNA片段之間互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度希望地含有至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)，更希望地至少50個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選地至少500bp長(zhǎng)。優(yōu)選地，互補(bǔ)區(qū)小于5kb，更優(yōu)選地小于2kb。有義與反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)最好含有靶基因的編碼區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，互補(bǔ)區(qū)含有靶基因的非翻譯區(qū)(UTR)，例如5’UTR或3’UIR。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明的有義或反義RNA片段的DNA序列由一種c-DNA分子衍生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，互補(bǔ)序列含有其表達(dá)改變的靶基因的調(diào)節(jié)元件，如啟動(dòng)子或終止信號(hào)。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，有義與反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)與表達(dá)被改變的基因的相應(yīng)序列相同。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，有義與反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)基本上類似于表達(dá)被改變的基因的相應(yīng)序列，并且仍能改變?cè)摶虻谋磉_(dá)。在這種情況中，互補(bǔ)區(qū)與表達(dá)被改變的基因的相應(yīng)序列希望地至少50％相同，更希望地至少70％相同，優(yōu)選地至少90％相同，更優(yōu)選地至少95％相同。因此，應(yīng)用一個(gè)雙鏈RNA分子可以改變一個(gè)基因或多個(gè)基因的表達(dá)，單個(gè)基因包含與雙鏈RNA相同的序列，或基本上類似于雙鏈RNA。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，有義與反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)在有義和反義RNA片段之間不包含任何錯(cuò)配。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，有義與反義RNA片段之間的互補(bǔ)區(qū)在有義與反義RNA片段之間包含至少一個(gè)錯(cuò)配，兩個(gè)RNA片段仍能配對(duì)，并形成雙鏈RNA分子，從而改變了基因的表達(dá)。希望地，在互補(bǔ)區(qū)的有義與反義RNA片段之間有低于50％的錯(cuò)配，更希望地低于30％的錯(cuò)配，優(yōu)選地低于20％的錯(cuò)配，更優(yōu)選地低于10％的錯(cuò)配，再更優(yōu)選地低于5％的錯(cuò)配。
例如，本發(fā)明的方法用來(lái)改變參與植物細(xì)胞代謝途徑、參與植物對(duì)病害抗性或易感性、或參與細(xì)胞分化的基因的表達(dá)。這些改變使植物具有商業(yè)重要的改進(jìn)的性狀，如特定代謝途徑的改變，對(duì)病害的抗性，或細(xì)胞分化的改變。靶基因的其他實(shí)例描述于如美國(guó)專利5,107,065、5,283,184和5,034,323中，在此引用作為參考。本發(fā)明的方法也用于改變基因的表達(dá)，以闡明其功能。在這種情況中，例如，通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的或以下所述的轉(zhuǎn)化方法將能夠表達(dá)該基因的有義和反義RNA片段的DNA序列引入植物細(xì)胞中。這些DNA序列例如穩(wěn)定地整合于植物細(xì)胞的基因組中。然后檢查植物細(xì)胞的如表型或代謝改變。此外，也可由植物細(xì)胞再生為植物，并檢查該植物或其后代的如表型或代謝改變。例如，利用這種方法，和對(duì)例如胚致死性、幼苗致死性或其他相關(guān)表型篩選轉(zhuǎn)化植物，發(fā)現(xiàn)必需基因。然后利用對(duì)基因功能的了解，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生性質(zhì)改進(jìn)的作物，或?qū)π碌幕瘜W(xué)試劑篩選。特別是，必需基因是除草劑靶標(biāo)的良好候選物。例如，必需基因序列在植物中過(guò)量表達(dá)，賦予植物對(duì)除草劑的抗性，其抑制該基因編碼的天然存在的酶的功能。也產(chǎn)生必需基因的突變變體，并篩查對(duì)除草劑或?qū)ο嚓P(guān)化合物的耐受性。這些突變變體通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法產(chǎn)生。必需基因編碼的酶也用來(lái)篩查抑制其功能的化合物，如用于體外高流通量篩查。然后測(cè)試抑制化合物的除草劑活性。
本發(fā)明的方法也用來(lái)在事先不了解其核苷酸序列的情況下隨機(jī)改變基因的表達(dá)。在這種情況中，制備能配對(duì)并形成雙鏈RNA分子的隨機(jī)RNA片段文庫(kù)，或編碼能配對(duì)并形成雙鏈RNA分子的RNA片段的隨機(jī)DNA序列文庫(kù)，并用本領(lǐng)域眾所周知的或以下所述的方法將其引入植物細(xì)胞中。對(duì)特定性質(zhì)或表型篩查轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物。例如，用這種篩查發(fā)現(xiàn)了上述必需基因。篩查的另一個(gè)實(shí)例用于在不同條件下未受妨礙的生長(zhǎng)，或者比未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞更不受妨礙的生長(zhǎng)，這些條件例如，較高的鹽度或滲透壓、較高溫度、有毒或有害物質(zhì)如除草劑的存在。這種篩查后，回收雙鏈RNA或編碼雙鏈RNA的DNA分子，并測(cè)定互補(bǔ)RNA片段的序列，從而可以分離其表達(dá)的改變引起特定性質(zhì)或表型的基因。然后例如用該基因通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化改進(jìn)作物或?qū)π碌幕瘜W(xué)試劑篩查。植物轉(zhuǎn)化技術(shù)利用常規(guī)重組DNA技術(shù)將本發(fā)明的DNA分子摻入植物或細(xì)菌細(xì)胞中。通常，本發(fā)明的DNA分子包含于一種轉(zhuǎn)化載體中。可使用大量的這些本領(lǐng)域所知的載體系統(tǒng)，如質(zhì)粒、噬菌體病毒及其他修飾的病毒。表達(dá)系統(tǒng)的成分也可被修飾，例如，用于增強(qiáng)有義和反義RNA片段的表達(dá)。例如，可使用截短序列、核苷酸置換或其他修飾。本領(lǐng)域所知的表達(dá)系統(tǒng)可用來(lái)在適當(dāng)條件下實(shí)際轉(zhuǎn)化任何作物植物細(xì)胞。包含本發(fā)明的DNA分子的轉(zhuǎn)基因優(yōu)選地穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到并整合到宿主細(xì)胞基因組中。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的DNA分子的轉(zhuǎn)基因位于自主復(fù)制載體中。自主復(fù)制載體的實(shí)例是病毒，特別是雙生病毒。轉(zhuǎn)化細(xì)胞優(yōu)選地再生為整個(gè)植物。
按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，包括但不限于玉米、小麥、大麥、黑麥、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、洋白菜、花椰菜、硬花球花椰菜、蘿卜、小蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、胡椒、芹菜、筍瓜、南瓜、大麻、夏季南瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、李子、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、木莓、黑莓、菠蘿、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜子、三葉草、煙草、胡蘿卜、棉花、苜蓿、稻、馬鈴薯、茄子、黃瓜、擬南芥，和木本植物如松柏類和落葉類樹。希望的核苷酸序列被轉(zhuǎn)化到特定植物種后，可以用傳統(tǒng)培育技術(shù)在該種中繁殖或轉(zhuǎn)移到相同種的其他品種中，特別包括商業(yè)品種。A.構(gòu)建植物表達(dá)盒的要求首先在表達(dá)盒中在可在植物中表達(dá)的適當(dāng)啟動(dòng)子之后裝配準(zhǔn)備在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的基因序列。這些表達(dá)盒也可包含轉(zhuǎn)基因表達(dá)所需或選擇的其他任何序列。這些序列包括但不限于，例如，轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)表達(dá)的外部序列，如內(nèi)含子、關(guān)鍵序列和用于將基因產(chǎn)物導(dǎo)向特定細(xì)胞器和細(xì)胞區(qū)室的序列。然后可將這些表達(dá)盒容易地轉(zhuǎn)移至上述植物轉(zhuǎn)化載體中。下面是典型表達(dá)盒的不同成分的描述。1.啟動(dòng)子在表達(dá)盒中使用的啟動(dòng)子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的空間和時(shí)間表達(dá)模式。選擇的啟動(dòng)子將在特定的細(xì)胞型(如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮細(xì)胞)或在特定組織或器官(如根、葉或花)中表達(dá)轉(zhuǎn)基因，此選擇將反映基因產(chǎn)物積累的希望的位置。另外，所選的啟動(dòng)子可在多種誘導(dǎo)條件下引導(dǎo)基因表達(dá)。啟動(dòng)子在其強(qiáng)度即促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的能力方面不同。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)，可使用本領(lǐng)域所知的多種適當(dāng)啟動(dòng)子中的任一種。例如，CaMV 35S啟動(dòng)子、稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或遍在蛋白啟動(dòng)子可用于組成型表達(dá)。例如，來(lái)源于煙草或擬南芥的化學(xué)誘導(dǎo)型PR-1啟動(dòng)子可用于調(diào)節(jié)型表達(dá)(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,689,044)。
一類優(yōu)選的啟動(dòng)子是創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。曾經(jīng)描述了可在創(chuàng)傷部位表達(dá)的多種啟動(dòng)子。這類優(yōu)選的啟動(dòng)子包括Stanford等人，分子普通遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)215200-208(1989)、Xu等人，植物分子生物學(xué)(Plant Molec.Biol.)22573-588(1993)、Logemann等人，植物細(xì)胞(Plant Cell)1151-158(1989)、Rohrmeier和Lehle，植物分子生物學(xué)22783-792(1993)、Firek等人，植物分子生物學(xué)22129-142(1993)和Warner等人，植物雜志(Plant J.)3191-201(1993))所述的啟動(dòng)子。
優(yōu)選的組織特異性表達(dá)模式包括綠色組織特異、根特異、莖特異及花特異模式。適于在綠色組織中表達(dá)的啟動(dòng)子包括調(diào)節(jié)參與光合作用的基因的多種啟動(dòng)子，和已從單子葉植物和雙子葉植物中克隆的多種這類啟動(dòng)子。一種優(yōu)選的啟動(dòng)子是磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC啟動(dòng)子(Hudspeth和Grula，植物分子生物學(xué)12579-589(1989))。用于根特異表達(dá)的一種優(yōu)選啟動(dòng)子是de Framond(FEBS 290103-106(1991)；EP0 452 269)所述的啟動(dòng)子，另一種優(yōu)選的根特異啟動(dòng)子是本發(fā)明所述的來(lái)自于T-1基因的啟動(dòng)子。一種優(yōu)選的莖特異啟動(dòng)子是美國(guó)專利5,625,136所述、能引導(dǎo)玉米trpA基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是以根特異方式表達(dá)核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。其他的優(yōu)選實(shí)施方案是以創(chuàng)傷誘導(dǎo)或病原體感染誘導(dǎo)方式表達(dá)核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物。2.轉(zhuǎn)錄終止子多種轉(zhuǎn)錄終止子均可在表達(dá)盒中使用。它們負(fù)責(zé)超出轉(zhuǎn)基因之外的轉(zhuǎn)錄終止及其正確的聚腺苷酸化。合適的轉(zhuǎn)錄終止子是已知在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄終止子，包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。它們可用于單子葉及雙子葉植物中。3.增強(qiáng)或調(diào)節(jié)表達(dá)的序列已發(fā)現(xiàn)許多序列能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達(dá)，這些序列可與本發(fā)明的基因結(jié)合使用而增強(qiáng)其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。例如，多種內(nèi)含子序列如玉米Adh1基因的內(nèi)含子，顯示能增強(qiáng)表達(dá)，尤其是在單子葉植物細(xì)胞中。另外，已知多種由病毒衍生的非翻譯前導(dǎo)序列也可增強(qiáng)表達(dá)，且其在雙子葉植物細(xì)胞中特別有效。4.編碼序列優(yōu)化通過(guò)改變用于在目的作物種中最佳表達(dá)的編碼序列，可以遺傳改造所選基因的編碼序列。修飾編碼序列以實(shí)現(xiàn)在特定作物種中最佳表達(dá)的方法是眾所周知的(見(jiàn)，例如，Perlak等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)883324(1991)；Koziel等人，生物技術(shù)(Bio/technol.)11194(1993))。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA分子被直接轉(zhuǎn)化到質(zhì)體基因組中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)在美國(guó)專利號(hào)5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申請(qǐng)?zhí)朩O 95/16783中，和McBride等人(1994)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91，7301-7305中有廣泛描述。葉綠體轉(zhuǎn)化的基本技術(shù)包括，例如使用biolistics或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(如氯化鈣或PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)，將側(cè)翼為選擇性標(biāo)記的克隆的質(zhì)體DNA區(qū)與目的基因一起引入適當(dāng)?shù)陌薪M織中。1-1.5kb的側(cè)翼區(qū)，稱為導(dǎo)向序列，利于與質(zhì)體基因組的同源重組，從而允許原質(zhì)體特定區(qū)域的替換或修飾。最初，葉綠體16S rRNA和賦予壯觀霉素和/或鏈霉素抗性的rps12基因中的點(diǎn)突變被用作轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)87，8526-8530；Staub，J.M.和Maliga，P.(1992)植物細(xì)胞4，39-45)。這些標(biāo)記間克隆位點(diǎn)的存在使得產(chǎn)生用于引入外源DNA分子的質(zhì)體導(dǎo)向載體成為可能(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)EMBOJ.12，601-606)。通過(guò)將隱性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因替換為一種顯性選擇標(biāo)記——編碼壯觀霉素解毒酶氨基糖苷3′-腺苷轉(zhuǎn)移酶的細(xì)菌aadA基因，可獲得轉(zhuǎn)化率的大大提高(Svab，Z.和Maliga，p.(1993)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)90，913-917)。以前，該標(biāo)記已成功用于綠藻萊因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)質(zhì)體基因組的高頻轉(zhuǎn)化(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)核酸研究(Nucl.Acids Res.)194083-4089)。用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的其他選擇性標(biāo)記在本領(lǐng)域中公知，并包括于本發(fā)明的范圍之中。
質(zhì)體表達(dá)，其中通過(guò)同源重組將基因插入每個(gè)植物細(xì)胞存在的幾千個(gè)拷貝的環(huán)形質(zhì)體基因組中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的DNA插入質(zhì)體導(dǎo)向載體中或轉(zhuǎn)化入希望的植物宿主的質(zhì)體基因組中。獲得對(duì)含有本發(fā)明的DNA分子的質(zhì)體基因組來(lái)說(shuō)同質(zhì)的植物，它們優(yōu)先地能高表達(dá)該DNA分子。優(yōu)選地，該DNA分子編碼的有義和反義RNA片段能夠配對(duì)，并能在植物質(zhì)體中形成雙鏈RNA分子，從而改變質(zhì)體基因的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，有義和反義片段在互補(bǔ)區(qū)中不包含任何錯(cuò)配。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，有義和反義片段在互補(bǔ)區(qū)中包含至少一個(gè)錯(cuò)配。在該情況中，編碼RNA片段的DNA分子的DNA序列不能互相重組。B.植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建可用于植物轉(zhuǎn)化的多種轉(zhuǎn)化載體為植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知，并且與本發(fā)明有關(guān)的基因可與任何這些載體結(jié)合使用。載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和用于轉(zhuǎn)化的目標(biāo)種。對(duì)于某些目標(biāo)種，優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)化中常規(guī)使用的選擇標(biāo)記包括賦予卡那霉素及相關(guān)抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因(Gene)19259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304184-187(1983))、賦予除草劑phosphinothricin抗性的bar基因(White等人，核酸研究181062(1990)，Spencer等人，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor.Appl.Genet.)79625-631(1990))、賦予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子細(xì)胞生物學(xué)42929-2931)、允許在甘露糖存在下進(jìn)行正選擇的manA基因(Miles和Guest(1984)基因3241-48；美國(guó)專利號(hào)5,767,378)、賦予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBOJ.2(7)1099-1104(1983))、和賦予草甘膦抗性的EPSPS基因(美國(guó)專利號(hào)4,940,935和5,188,642)。1.適用于農(nóng)桿菌(Agrobacterium)轉(zhuǎn)化的載體許多載體可用于應(yīng)用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的轉(zhuǎn)化。它們一般帶有至少一個(gè)T-DNA邊界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))的載體。適用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體包括二元載體pCIB200和pCIB2001，以及二元載體pCIB10及其潮霉素選擇衍生物。(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,639,949)。2.適用于非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體不使用根瘤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化避免了對(duì)所選的轉(zhuǎn)化載體中T-DNA序列的需要，所以除上述包含T-DNA序列的載體外，也可應(yīng)用缺少這些序列的載體。不依賴于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過(guò)粒子轟擊、原生質(zhì)體攝取(如PEG和電穿孔)和顯微注射的轉(zhuǎn)化。載體的選擇主要取決于待轉(zhuǎn)化的種的優(yōu)選。適用于非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35(見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,639,949)。C.轉(zhuǎn)化技術(shù)目的DNA序列被克隆到表達(dá)系統(tǒng)中后，即被轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中。植物轉(zhuǎn)化和再生的方法在本領(lǐng)域中眾所周知。例如，Ti質(zhì)粒載體已用于外源DNA的送遞，以及直接DNA攝取、脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射和微粒轟擊。另外，也可用農(nóng)桿菌屬的細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中眾所周知，包括基于農(nóng)桿菌的技術(shù)和不需要農(nóng)桿菌的技術(shù)。非農(nóng)桿菌的技術(shù)包括原生質(zhì)體或細(xì)胞對(duì)外源遺傳物質(zhì)的直接攝取。這可通過(guò)PEG或電穿孔介導(dǎo)的攝取、粒子轟擊介導(dǎo)的送遞、或顯微注射來(lái)完成。在所有情況中，都用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生為整個(gè)植物。
大多數(shù)單子葉植物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)也已成為常規(guī)。優(yōu)選的技術(shù)包括使用PEG或電穿孔技術(shù)向原生質(zhì)體中直接轉(zhuǎn)移基因，對(duì)愈傷組織的粒子轟擊，以及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。
利用本領(lǐng)域眾所周知的方法，生長(zhǎng)、繁殖并培育轉(zhuǎn)化事件產(chǎn)生的植物，產(chǎn)生具有希望的性狀的后代，并獲得具有希望的性狀的種子。
將參照下列詳細(xì)的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。提供這些實(shí)施例的目的僅僅是說(shuō)明，除非另外指明而不意在限制。
為了構(gòu)建二元載體pPH170，以用于應(yīng)用ds_Luc1/2/3有義/反義構(gòu)建體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，用EcoRI和XbaI消化帶有用于細(xì)菌篩選的卡那霉素抗性基因和用于轉(zhuǎn)基因植物篩選的潮霉素抗性基因的二元質(zhì)粒pSGCHC1的DNA。以四路反應(yīng)用T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)將得到的自pSGCHC1分離的11.6kb片段與mas 1’啟動(dòng)子EcoRI-BamHI片段和有義(BamHI-HindIII)及反義(HindIII-XbaI)ds_Luc螢光素酶基因片段連接。農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化和擬南芥植物的真空滲入通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pPH170引入根瘤農(nóng)桿菌GV3101中，篩選并擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的菌落。用帶有pPH170二元T-DNA載體的農(nóng)桿菌克隆真空滲入組成型(UBQ3啟動(dòng)子(Norris等人(1993)PMB 21895-906)/UBQ3+CaMV35S 5’UTR/luc+；pPH108)或誘導(dǎo)型(擬南芥PR-1啟動(dòng)子/luc+；pPH135，6E系)表達(dá)螢光素酶的四至五周齡擬南芥突變系植物。在潮霉素和卡那霉素上共篩選轉(zhuǎn)化植物，并在控制的人工氣候室條件下生長(zhǎng)，以測(cè)定螢光素酶活性。另外，在BTH誘導(dǎo)48小時(shí)后(BTH處理基本如Lawton等人，植物雜志1071-82所述)，估測(cè)pPH135-6E背景中的螢光素酶活性。在加入螢光素底物后，用基于發(fā)光的測(cè)定法定量組織提取物中的螢光素酶活性。也用CCD-冷成像系統(tǒng)(Hamamatsu)監(jiān)測(cè)植物中的螢光素酶活性。實(shí)施例2擬南芥GL1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)GL1基因編碼正常毛狀體(葉毛)形成起始所需的myb樣轉(zhuǎn)錄因子(Oppenheimer等人(1991)細(xì)胞67483-493)。發(fā)育早期GL1表達(dá)的敲除產(chǎn)生缺乏毛狀體的植物。敲除表型在幼苗中易于鑒定，并且不是致死的。構(gòu)建了用于組成型表達(dá)的三種載體和用于GAL4/C1調(diào)節(jié)表達(dá)的三種載體。對(duì)每種啟動(dòng)子檢測(cè)的三種不同載體是GL1基因片段的有義(+)表達(dá)、反義(-)表達(dá)和有義及反義(+/-)RNA表達(dá)。(+)和(-)載體是用于比較其對(duì)GL1表達(dá)的影響的對(duì)照。在每種情況中，GL1序列(GenBank保藏M79448)從堿基#739-#1781的5’片段用于載體構(gòu)建。GAL4/C1調(diào)節(jié)的表達(dá)將GL1基因片段作為NcoI-SacI片段克隆到雜交誘導(dǎo)型載體構(gòu)建體pJG304-1中。質(zhì)粒pJG304由pBSSK+衍生。質(zhì)粒pBS SK+(Stratagene，LaJolla，CA)用SacI線性化，用綠豆核酸酶處理除去SacI位點(diǎn)，并用T4連接酶再連接形成pJG201。用KpnI從pAT71中除去10XGAL4共有結(jié)合位點(diǎn)/CaMV 35S最小啟動(dòng)子/GUS基因/CaMV終止子盒，并克隆到pJG201的KpnI位點(diǎn)，形成pJG304。質(zhì)粒pJG304用限制性內(nèi)切核酸酶Asp718部分消化，分離全長(zhǎng)線性片段。該片段與摩爾過(guò)量的22個(gè)堿基的寡核苷酸JG-L(5’-GTA CCT CGA GTC TAG ACT CGA G-3’，SEQ ID NO5)連接。用限制性分析鑒定該接頭插入GAL4 DNA結(jié)合位點(diǎn)5’的克隆，該質(zhì)粒被命名為pJG304DXhoI。
通過(guò)合成5’端具有適當(dāng)限制位點(diǎn)的PCR引物，向(+)和(-)片段的末端添加NcoI和SacI位點(diǎn)。通過(guò)首先產(chǎn)生兩個(gè)片段來(lái)產(chǎn)生(+/-)GL1片段(+)片段在5’端含有NcoI位點(diǎn)，在3’端含有HindIII位點(diǎn)，(-)片段在5’端含有HindIII位點(diǎn)，在3’端含有SacI位點(diǎn)。通過(guò)在EcoRI位點(diǎn)處連接得到的片段產(chǎn)生(+/-)單位。表達(dá)單位含有GAL4 DNA結(jié)合域，隨后是最小TATA序列，和方向?yàn)?+)、(-)或(+/-)的GL1基因片段(Guyer等人(1998)遺傳學(xué)(Genetics)149633-639)。組成型表達(dá)使用在雙子葉植物中相對(duì)較強(qiáng)且為組成型的農(nóng)桿菌甘露氨酸合酶mas1’啟動(dòng)子(Velten等人(1984)EMBO J.32723-2730)。如上所述，將GL1(+)、(-)和(+/-)片段連接于pBluescript中1’啟動(dòng)子之后。三種不同的表達(dá)盒作為EcoRI/SalI片段連接于pCIB200中(Uknes等人(1993)植物細(xì)胞5159-169)。實(shí)施例3胱硫醚β-裂合酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)胱硫醚β-裂合酶(CBL)基因編碼一種實(shí)現(xiàn)甲硫氨酸生物合成途徑中一個(gè)步驟的蛋白質(zhì)。CBL催化胱硫醚向高半胱氨酸的轉(zhuǎn)化(Ravanel等人(1998)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)957805-7812綜述)。擬南芥CBL基因的cDNA序列已被鑒定(Ravanel等人(1995)植物分子生物學(xué)29875-882)。其在植物中表達(dá)調(diào)節(jié)的影響用有義RNA表達(dá)(有義構(gòu)建體)、反義RNA表達(dá)(反義構(gòu)建體)和有義及反義RNA表達(dá)(有義/反義構(gòu)建體)的構(gòu)建體檢測(cè)。A.反義構(gòu)建體使用二元BASTA載體pJG261，其含有pJG304DXhoI載體的片段，并以反義方向插入CBL基因部分(核苷酸#13-1159，GenBank保藏#L40511)。
pJG304/aCBL用NcoI和SacI消化質(zhì)粒pJG304DXhoI，切下GUS基因。將pJG304DXhoI的GUS基因替換為也用NcoI和SacI消化的CBLPCR產(chǎn)物。該產(chǎn)物是使用引物DG354(5’-GAT CGA GCT CCA CGAGAA CTG TCT CCG-3’；SEQ ID NO6)和DG357(5’-TCA GCC ATGGGA AGA CAA GTA CAT TGC-3’；SEQ ID NO7)并用pFL61擬南芥cDNA文庫(kù)(Minet等人(1992)植物雜志2417-422)作為模板產(chǎn)生的。由與CBL PCR產(chǎn)物連接的pJG304DXhoI消化的載體構(gòu)建質(zhì)粒pJG304/aCBL。
pJG261/aCBL用XhoI酶切pJG304/aCBL，切下含有GAL4 DNA結(jié)合位點(diǎn)/35S最小啟動(dòng)子/反義CBL/CaMV終止子融合體的盒。該盒與XhoI消化的pJG261(Guyer等人，遺傳學(xué)(1998)，149633-639)連接，產(chǎn)生pJG261/aCBL。B.有義構(gòu)建體除了CBL片段為相反方向外，與反義構(gòu)建體相同。該構(gòu)建體含有ATG起始密碼子和大部分CBL ORF，并用作CBL基因表達(dá)調(diào)節(jié)的對(duì)照。
pJG304/sCBL用NcoI和SacI消化質(zhì)粒pJG304DXhoI，切下GUS基因。將pJG304DXhoI的GUS基因替換為也用NcoI和SacI消化的CBLPCR產(chǎn)物。該產(chǎn)物是使用引物CBL1(5’-CTT GCC ATG GCA CGA GAACTG TCT CCG-3’；SEQ ID NO8)和CBL2(5’-CAT GGA GCT CGAAGA CAA GTA CAT TGC A-3’；SEQ ID NO9)并用pFL61擬南芥cDNA文庫(kù)作為模板產(chǎn)生的。由與CBL PCR產(chǎn)物連接的pJG304DXhoI消化的載體構(gòu)建質(zhì)粒pJG304/sCBL。
pJG21/sCBL用XhoI酶切pJG304/sCBL，切下含有GAL4 DNA結(jié)合位點(diǎn)/35S最小啟動(dòng)子/有義CBL/CaMV終止子融合體的盒。該盒與XhoI消化的pJG261連接，產(chǎn)生pJG261/sCBL。C.有義/反義構(gòu)建體將有義方向的CBL基因片段(#13-1159)插入載體pJG304DXhoI中反義方向CBL基因下游的SaII位點(diǎn)。兩個(gè)拷貝的CBL之間有一個(gè)大約10bp的接頭。
pJG304/dsCBL用SacI消化質(zhì)粒pJG304/aCBL。插入也用SacI消化的CBL PCR產(chǎn)物，使插入的CBL基因?yàn)橛辛x方向。該產(chǎn)物是使用CBL2(5’-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3’；SEQ IDNO9)和CBL3(5’-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGAGAA CTG TCT CCG TCG C-3’；SEQ ID NO10)并用pFL61擬南芥cDNA文庫(kù)作為模板產(chǎn)生的。通過(guò)用HindIII消化鑒定含有希望方向的插入DNA的質(zhì)粒構(gòu)建體。由與CBL PCR產(chǎn)物連接的pJG304/aCBL消化的載體構(gòu)建質(zhì)粒pJG304/dsCBL。用SURE2(Stratagene，LaJolla，CA)作為細(xì)菌宿主穩(wěn)定該構(gòu)建體。
pJG261/dsCBL用XbaI酶切pJG304/dsCBL，切下含有GAL4 DNA結(jié)合位點(diǎn)/35S最小啟動(dòng)子/反義CBL/有義CBL/CaMV終止子融合體的盒。該盒與SpeI消化的pJG261連接，產(chǎn)生pJg261/dsCBL。用XL1-BLUEMRF’(Stratagene，LaJolla，CA)作為細(xì)菌宿主部分穩(wěn)定該構(gòu)建體。通過(guò)瓊脂糖凝膠純化分離該構(gòu)建體的未重排的DNA。D.GAL4結(jié)合位點(diǎn)/最小CaMV 35S/CBL轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生將所述三種pJG261/CBL構(gòu)建體電轉(zhuǎn)化(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)到根瘤農(nóng)桿菌recA-株AGL1中(Lazo等人(1991)生物/技術(shù)9963-967)，并通過(guò)浸潤(rùn)(Bechtold等人(1993)C.R.Acad.Sci.Paris，3161188-1193)轉(zhuǎn)化擬南芥植物(Columbia生態(tài)型)。在含有15mg/升Basta的發(fā)芽培養(yǎng)基(4.3g/升Murashige-Skoog鹽、0.5g/升Mes、1％蔗糖、10μg/升硫胺素、5μg/升吡哆醇、5μg/升煙酸、1mg/升肌醇，pH5.8)上篩選浸潤(rùn)植物的種子。E.應(yīng)用GAL4/C1反式激活蛋白與應(yīng)用GAL4結(jié)合位點(diǎn)/最小35S啟動(dòng)子對(duì)CBL抑制的比較將含有GAL4結(jié)合位點(diǎn)/最小CaMV 35S啟動(dòng)子/CBL構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物移種到土壤中并在溫室中生長(zhǎng)成熟。每個(gè)系中轉(zhuǎn)基因CBL片段的存在由PCR證實(shí)。為了檢測(cè)反義構(gòu)建體，用引物ASV1(5’-TTT GGA GAGGAC AGA CCT GC-3’；SEQ ID NO11)和CBL3(5’-CAT CGA GCTCCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3’；SEQID NO10)證實(shí)大約1200bp產(chǎn)物的存在。鑒定出6個(gè)含有反義構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因系。為了檢測(cè)有義構(gòu)建體，用引物ASV2(5’-GGA TTT TGG TTTTAG GAA TTA GAA-3’；SEQ ID NO12)和CBL3(5’-CAT CGA GCTCCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3’；SEQID NO10)證實(shí)大約1200bp產(chǎn)物的存在。鑒定出13個(gè)含有有義構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因系。為了檢測(cè)有義/反義構(gòu)建體，用引物ASV2(5’-GGA TTT TGGTTT TAG GAA TTA GAA-3’；SEQ ID NO12)和CBL3(5’-CAT CGAGCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3’；SEQ ID NO10)證實(shí)大約1200bp產(chǎn)物的存在。另外，為了檢測(cè)有義/反義構(gòu)建體，用引物ASV1(5’-TTT GGA GAG GAC AGA CCTGC-3’；SEQ ID NO11)和CBL3(5’-CAT CGA GCT CCT CTG TTTAAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3’；SEQ ID NO10)證實(shí)大約1200bp產(chǎn)物的存在。鑒定出11個(gè)含有有義/反義構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因系。
初級(jí)轉(zhuǎn)化子上的花與純合GAL4/C1反式激活蛋白系pAT53-103(Guyer等人，遺傳學(xué)(1998)149633-649)的花粉雜交。將F1種子平板接種于MS+2％蔗糖培養(yǎng)基中(4.3g/升Murashige-Skoog鹽、0.5g/升Mes、2％蔗糖)。對(duì)于平板上的F1子代來(lái)說(shuō)，沒(méi)有一個(gè)含有反義構(gòu)建體的系顯示異常的表型。對(duì)于每個(gè)平板上大約一半的F1子代，含有有義構(gòu)建體的13個(gè)系中有2個(gè)顯示弱的表型。對(duì)于平板平板上的F1子代，含有有義構(gòu)建體的13個(gè)系中的另外11個(gè)不顯示異常表型。對(duì)于每個(gè)平板上大約一半的F1子代，含有有義/反義構(gòu)建體的11個(gè)系中的10個(gè)顯示從弱到強(qiáng)不等的表型。具有強(qiáng)烈表型的植物不能存活，紫色加深，失去綠色素，并且在平板上14天后不能形成葉。具有較弱表型的植物顯一定的紫色，比正常的更顯淡綠，并在平板上14天后形成較小的葉。因此，有義/反義構(gòu)建體在降低內(nèi)源必需基因活性方面比反義或有義構(gòu)建體更有效。F.用兩個(gè)啟動(dòng)子對(duì)CBL表達(dá)的調(diào)節(jié)使CBL基因位于兩個(gè)啟動(dòng)子之間——一個(gè)引起有義鏈的轉(zhuǎn)錄，而另一個(gè)引起反義鏈的轉(zhuǎn)錄。利用該方法，有義和反義RNA都在植物細(xì)胞中產(chǎn)生，并且兩種類型的鏈能彼此雜交，導(dǎo)致雙鏈RNA分子的形成。用ACTIN2作為位于CBL基因兩側(cè)的啟動(dòng)子。對(duì)于所有這些方法，可以選擇在啟動(dòng)子遠(yuǎn)端使用或不使用轉(zhuǎn)錄終止子。如果使用轉(zhuǎn)錄終止子，轉(zhuǎn)錄物將從一個(gè)啟動(dòng)子的3’末端開始，以一個(gè)方向通過(guò)CBL基因，從3’端到5’端通過(guò)第二個(gè)啟動(dòng)子，終止于第二個(gè)啟動(dòng)子5’末端的轉(zhuǎn)錄終止子處。轉(zhuǎn)錄終止子的使用可用來(lái)穩(wěn)定所轉(zhuǎn)錄的RNA。實(shí)施例4螢光素酶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)編碼有義和反義螢光素酶RNA片段的嵌合DNA分子(有義/反義構(gòu)建體)的構(gòu)建使用寡核苷酸引物ds Luc1(5’-CGCGGATCCAAG ATT CAAAGT GCG CTG CTG-3’，SEQ ID NO13；BamHI限制位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出)和ds Luc2(5’-GCGAAG CTTGGC GAC GTA ATC CAC GATCTC-3’，SEQ ID NO14；HindIII限制位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出)，從pPH108質(zhì)粒DNA中擴(kuò)增來(lái)源于質(zhì)粒pLuc+(Promega載體pGL3，Genbank保藏#U47295)的螢火蟲螢光素酶基因的670bp“有義”方向片段。按照使用手冊(cè)在50μl反應(yīng)體積中使用TurboPfu熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Stratagene)，95℃/1分鐘、55℃/1.5分鐘、72℃/2分鐘5個(gè)循環(huán)，隨后95℃/1分鐘、72℃/3.5分鐘25個(gè)循環(huán)。用類似的方法，使用寡核苷酸引物ds_Luc3(5’-CGGTCT AGAAAG ATT CAA AGT GCG CTGCTG-3’，SEQ ID NO15；XbaI限制位點(diǎn)以下劃線標(biāo)出)和ds_Luc2(5’-GCGAAGCTTGGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3’，SEQ IDNO16；HindIII限制位點(diǎn)以下線標(biāo)出)，從pPH108質(zhì)粒DNA中PCR擴(kuò)增來(lái)源于質(zhì)粒pLuc+的螢火蟲螢光素酶基因的669bp“反義”方向片段。通過(guò)由低熔點(diǎn)瓊脂糖(FMC)制備的1％Tris-乙酸鹽凝膠電泳，隨后酚-氯仿抽提切下的含有PCR產(chǎn)物的凝膠片，純化得到的DNA片段。按照標(biāo)準(zhǔn)方法，用BamHI和HindIII消化有義產(chǎn)物(ds_Luc1/2)的DNA，用XbaI和HindIII消化反義產(chǎn)物(ds_Luc3/2)的DNA(限制酶從NewEngland Biolabs獲得)。如上所述凝膠純化得到的粘末端DNA片段。然后通過(guò)三路連接將有義BamHI-HindIII片段和反義HindIII-XbaI片段克隆到BamHI和XbaI消化的克隆載體pLitmus28(New England Biolabs)中。得到的構(gòu)建體命名為pAdF3。用寡核苷酸bar-1(5’-GCG AAG CTTGAT CCA TGA GCC CAG AAC GA-3’，SEQ ID NO17；HindIII限制位點(diǎn)為粗體)和bar-2(5’-GCC AAG CTT CCT AGA ACG CGT GATCTC-3’，SEQ ID NO18；HindIII限制位點(diǎn)為粗體)從質(zhì)粒CSA104 DNA中擴(kuò)增含有bar基因(D’Halluin等人(1992))開放閱讀框的563bp DNA片段。按照使用手冊(cè)在100μl反應(yīng)體積中使用Pfu熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Stratagene)，94℃/1分鐘、55℃/1分鐘、72℃/1分鐘25個(gè)循環(huán)。經(jīng)酚抽提和乙醇沉淀純化后，bar PCR產(chǎn)物用HindIII消化，并如上所述用2％瓊脂糖凝膠凝膠純化。通過(guò)將HindIII bar DNA片段連接到用HindIII消化的質(zhì)粒pAdF3中構(gòu)建質(zhì)粒pAdF1。在這種無(wú)方向克隆產(chǎn)生的兩種可能的構(gòu)建體中，pAdF1的特征在于bar基因的方向，它與pAdF3中存在的螢光素酶基因的“有義”片段相同。從pNOV1416(由Scott Rabe制備的構(gòu)建體；NB171第122頁(yè)；8-17-98)切下含有擬南芥ACT2啟動(dòng)子(An等人(1996)植物雜志10107-121)的BamHI-SalI 1.2kb DNA片段，并克隆到用BamHI和SalI消化的pUC21中，產(chǎn)生構(gòu)建體pAct2。然后通過(guò)BamHI和SpeI消化從pAct2中切下ACT2啟動(dòng)子。
為了構(gòu)建二元載體pAdF4，以用于應(yīng)用ds_Luc1/2/3 RNA有義/反義構(gòu)建體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，用SpeI和SacI消化帶有用于細(xì)菌篩選的卡那霉素抗性基因和用于轉(zhuǎn)基因植物篩選的潮霉素抗性基因的二元質(zhì)粒pSGCHC1的DNA。以三路反應(yīng)用T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)將自pSGCHC1分離的11.6kb片段與Act2啟動(dòng)子BamHI-SpeI片段和含有有義及反義螢光素酶基因片段的pAdF3的BamHI-SacI片段連接。同樣，以三路連接反應(yīng)構(gòu)建二元載體pAdF2，包括上述用SpeI和SacI消化的11.6kb pSGCHC1載體、帶有Act2啟動(dòng)子的SpeI-BamHI片段和在bar基因周圍含有有義和反義螢光素酶基因片段的pAdF1的BamHI-SacI片段。農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化和擬南芥植物的真空滲入通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pAdF2和pAdF4引入根瘤農(nóng)桿菌GV3101中，篩選并擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的菌落。用帶有pAdF2或pAdF4二元T-DNA載體的農(nóng)桿菌克隆真空滲入組成型(UBQ3啟動(dòng)子(Norris等人(1993)PMB21895-906)/UBQ3+CaMV 35S 5’UTR/luc+；pPH108)或誘導(dǎo)型(擬南芥PR-1啟動(dòng)子/luc+；pCIB200，6E系)表達(dá)螢光素酶的四至五周齡擬南芥突變系植物。在潮霉素和卡那霉素上共篩選轉(zhuǎn)化的植物，并在控制的人工氣候室條件下生長(zhǎng)，以測(cè)定螢光素酶活性。另外，在BTH誘導(dǎo)48小時(shí)后(BTH處理基本如Lawton等人(1996)植物雜志1071-82所述)，估測(cè)pCIB200-6E背景中的螢光素酶活性。在加入螢光素底物后，用基于發(fā)光的測(cè)定法定量組織提取物中的螢光素酶活性。也用CCD-冷成像系統(tǒng)(Hamamatsu)監(jiān)測(cè)植物中的螢光素酶活性。注意pPH108中的螢光素酶基因來(lái)自于pGL3(Promega，Genbank保藏#U47295)；pCIB200-6E中的螢光素酶基因來(lái)自于pGL2(Promega，Genbank保藏#X65323)。
用螢光素酶測(cè)定試劑(Promega，目錄號(hào)E1501)進(jìn)行螢光素酶測(cè)定。葉在4℃下用0.1M KPO4 pH7.8緩沖液研磨，并快速沉淀。一等份上清液與螢光素酶測(cè)定試劑混合，并用Monolight 2010發(fā)光計(jì)(BectonDickinson微生物系統(tǒng))定量螢光素酶活性。用有義/反義構(gòu)建體pAdF2和pAdF4轉(zhuǎn)化的pPH108植物的分析結(jié)果示于表1中，而用有義/反義構(gòu)建體pAdF4轉(zhuǎn)化的pCIB200-6E植物的結(jié)果示于表2中。
表1植物中螢光素酶活性的相對(duì)光單位檢測(cè)了親本系pPH108的不同植物，以測(cè)定不同植物中螢光素酶的平均水平。該系不是純合的，因此顯示最高水平螢光素酶的個(gè)體植物(即植物1、2和3)可能是純合的。
分析了在pPH108背景中含有pAdF2構(gòu)建體的雙轉(zhuǎn)基因植物pPH108(pAdF2)或在pPH108背景中含有pAdF4構(gòu)建體的pPH108(pAdF4)的獨(dú)立T1系。螢光素酶水平隨系而不同，這或許是由于有義/反義構(gòu)建體的表達(dá)水平不同。也分析了獨(dú)立T1事件——用pAdF2(Columbia(pAdF2))或pAdF4(Columbia(pAdF4))轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥Columbia植物，作為對(duì)照。
表2所測(cè)個(gè)體植物中螢光素酶活性的相對(duì)光單位培育親本系pCIB200-6E及獨(dú)立T1雙轉(zhuǎn)基因系pCIB200-6E(pAdF4)的小植物，并取樣。也分析了獨(dú)立T1事件——用構(gòu)建體pAdF4轉(zhuǎn)化的野生型擬南芥Columbia，作為對(duì)照。
實(shí)施例5用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)對(duì)目的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)產(chǎn)生有義和反義RNA片段。位點(diǎn)特異性重組是一種由重組酶介導(dǎo)的DNA切割及再連接方法。重組酶識(shí)別高度特異的DNA序列。某些位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)只用一種蛋白質(zhì)作用于其靶位點(diǎn)。已知有幾種位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)如Cre/lox、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix介導(dǎo)植物中位點(diǎn)特異的重組過(guò)程(Ow和Medberry，1995，植物科學(xué)評(píng)述(Critical Reviews in Plant Sciences)14239-261)。根據(jù)重組底物中重組酶識(shí)別位點(diǎn)的構(gòu)型，重組過(guò)程可導(dǎo)致DNA序列的缺失、翻轉(zhuǎn)或整合。一種具體的這類反應(yīng)，即翻轉(zhuǎn)，與本發(fā)明有關(guān)。將兩個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)以相反方向置于希望的基因表達(dá)盒中。第一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)置于轉(zhuǎn)基因編碼序列的非翻譯前導(dǎo)區(qū)中或5’近端區(qū)域中的啟動(dòng)子下游。第二個(gè)位點(diǎn)以與第一個(gè)位點(diǎn)相反的方向置于轉(zhuǎn)基因編碼序列的3’非翻譯區(qū)或3’近端區(qū)域中。目的DNA序列的編碼或非編碼鏈與啟動(dòng)子有效連接。在重組酶的存在下，側(cè)翼為兩個(gè)方向相反的識(shí)別位點(diǎn)的序列翻轉(zhuǎn)。由于重組過(guò)程，目的基因的編碼鏈和非編碼鏈都與啟動(dòng)子有效連接，有義和反義轉(zhuǎn)錄物都在同一染色體環(huán)境中由同一基因座位產(chǎn)生，并且能形成dsRNA分子。
在某些植物中，位點(diǎn)特異性重組酶如Cre的高水平組成型表達(dá)可導(dǎo)致異常表型(Que等人，1998，植物雜志13401-409)。優(yōu)選地，重組酶的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，重組酶表達(dá)盒被置于用于引入目的轉(zhuǎn)基因序列的同一轉(zhuǎn)化載體中，轉(zhuǎn)基因序列側(cè)翼為方向相反的兩個(gè)重組酶識(shí)別位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，含有側(cè)翼為重組酶識(shí)別位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物與表達(dá)重組酶的系雜交，或用表達(dá)重組酶的載體再轉(zhuǎn)化。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用含有誘導(dǎo)型重組酶表達(dá)盒的重組RNA或DNA病毒感染含有目的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的植物。重組病毒優(yōu)選地在導(dǎo)致異常表型方面缺陷。在以上的實(shí)施方案中，重組酶引起目的序列染色體拷貝的翻轉(zhuǎn)，從而產(chǎn)生希望的dsRNA。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用重組植物DNA病毒產(chǎn)生能形成dsRNA的有義和反義RNA片段。一般而言，植物DNA病毒在染色體表面復(fù)制。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，向植物細(xì)胞中引入一種構(gòu)建體以及表達(dá)重組酶的第二種重組病毒，該構(gòu)建體含有一種盒，其包含能表達(dá)靶基因的RNA片段的DNA序列，側(cè)翼為兩個(gè)倒置的重組酶識(shí)別位點(diǎn)。另外，也可在同一病毒DNA載體中連接重組酶表達(dá)盒和側(cè)翼為倒置識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列。將病毒DNA載體引入植物中后，重組酶基因表達(dá)。重組酶基因的表達(dá)導(dǎo)致側(cè)翼為重組酶識(shí)別位點(diǎn)的病毒DNA序列的翻轉(zhuǎn)，并導(dǎo)致由目的DNA序列產(chǎn)生大量dsRNA，這是由于細(xì)胞中高拷貝數(shù)的病毒基因組。優(yōu)選的重組酶系統(tǒng)是已知可在植物中介導(dǎo)位點(diǎn)特異的重組過(guò)程的Cre/lox、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix(Ow和Medberry，1995，植物科學(xué)評(píng)述14239-261，在此引用作為參考)。實(shí)施例6構(gòu)建植物表達(dá)盒的要求準(zhǔn)備在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的基因序列首先裝配于位于適當(dāng)啟動(dòng)子之后并位于適當(dāng)轉(zhuǎn)錄終止子上游的表達(dá)盒中。植物表達(dá)盒構(gòu)建的所有要求適用于本發(fā)明的DNA分子，并可用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進(jìn)行。啟動(dòng)子選擇在表達(dá)盒中使用的啟動(dòng)子的選擇將決定轉(zhuǎn)基因植物中DNA分子的空間和時(shí)間表達(dá)模式。選擇的啟動(dòng)子將在特定的細(xì)胞型(如葉表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、根皮細(xì)胞)或在特定組織或器官(如根、葉或花)中表達(dá)DNA分子，這種選擇將反映該DNA分子編碼的RNA片段生物合成的希望的定位。另外，所選的啟動(dòng)子可在光誘導(dǎo)的或其他時(shí)間調(diào)節(jié)啟動(dòng)子之下引導(dǎo)DNA分子的表達(dá)。另一個(gè)選擇是所選的啟動(dòng)子可被化學(xué)調(diào)節(jié)。這將提供僅當(dāng)希望時(shí)和用化學(xué)誘導(dǎo)劑處理時(shí)才誘導(dǎo)DNA分子表達(dá)的可能性。轉(zhuǎn)錄終止子多種轉(zhuǎn)錄終止子均可在表達(dá)盒中使用。它們負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄的終止，和優(yōu)選地正確的聚腺苷酸化。合適的轉(zhuǎn)錄終止子是已知在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄終止子，包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子、豌豆rbcS E9終止子。它們可用于單子葉植物和雙子葉植物。增強(qiáng)或調(diào)節(jié)表達(dá)的序列已發(fā)現(xiàn)許多序列能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因表達(dá)，這些序列可與本發(fā)明的DNA分子結(jié)合使用以增強(qiáng)其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。
多種內(nèi)含子序列能增強(qiáng)表達(dá)，尤其在單子葉植物細(xì)胞中。例如，發(fā)現(xiàn)當(dāng)被引入玉米細(xì)胞時(shí)，玉米Adh1基因的內(nèi)含子顯著增強(qiáng)位于同源啟動(dòng)子之下的野生型基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1在與氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中特別有效且增強(qiáng)表達(dá)(Callis等人，基因發(fā)育(GenesDevelep)11183-1200(1987))。在相同的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，玉米bronzel基因的內(nèi)含子在增強(qiáng)表達(dá)方面具有相似的作用(Callis等人，同上文)。內(nèi)含子序列已被常規(guī)摻入植物轉(zhuǎn)化載體，一般在非翻譯前導(dǎo)區(qū)內(nèi)。
已知病毒衍生的多種非翻譯前導(dǎo)序列也可增強(qiáng)表達(dá)，且其在雙子葉植物細(xì)胞中特別有效。具體而言，煙草花葉病毒(TMV，“Q-序列”)、玉米萎黃病斑點(diǎn)病毒(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列在增強(qiáng)表達(dá)方面是有效的(如Gallie等人，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等人，植物分子生物學(xué)1565-79(1990))。實(shí)施例7表達(dá)盒構(gòu)建的實(shí)施例本發(fā)明包括本發(fā)明的DNA分子在可在植物中表達(dá)的任何啟動(dòng)子調(diào)節(jié)下的表達(dá)，而不論該啟動(dòng)子的來(lái)源如何。因此，用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將DNA分子插入任何表達(dá)盒中。然后可將這些表達(dá)盒容易地轉(zhuǎn)移到以下所述的植物轉(zhuǎn)化載體中。
此外，本發(fā)明還包括任何植物可表達(dá)的啟動(dòng)子與DNA分子表達(dá)所需或所選的其他任何序列的聯(lián)合使用。這些序列包括但不限于，轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)表達(dá)的外來(lái)序列(如內(nèi)含子[如Adh內(nèi)含子1]、病毒序列[如TMV-Ω])。組成型表達(dá)CaMV 35S啟動(dòng)子質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建在公開的專利申請(qǐng)EP 0 392 225中描述。pCGN1761含有“雙”35S啟動(dòng)子和tml轉(zhuǎn)錄終止子，在啟動(dòng)子與終止子之間具有唯一的EcoRI位點(diǎn)，并且具有pUC型骨架。構(gòu)建了pCGN1761的一種衍生物，它含有一個(gè)除已有的EcoRI位點(diǎn)外還包含NotI和XhoI位點(diǎn)的修飾過(guò)的多接頭。該衍生物被命名為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于其多接頭內(nèi)eDNA序列或基因序列(包括微生物開放閱讀框序列)的克隆，其目的是在35S啟動(dòng)子控制下在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)。該結(jié)構(gòu)的完整的35S啟動(dòng)子-基因序列-tml終止子盒可從啟動(dòng)子5’側(cè)的HindIII、SphI、SalI和XbaI位點(diǎn)以及終止子3’側(cè)的XbaI、BamHI和BglI位點(diǎn)切割，用于向轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)移。此外，可通過(guò)用HindIII、SphI、SalI、XbaI或PstI進(jìn)行5′切割，并用任何多接頭限制位點(diǎn)(EcoRI、NotI或XhoI)進(jìn)行3′切割，切下雙35S啟動(dòng)子片段，而替換為另一種啟動(dòng)子。
因此，本發(fā)明的DNA分子插入pCGN1761ENX中，用于在CaMV 35S啟動(dòng)子控制下組成型表達(dá)?；瘜W(xué)調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子下的表達(dá)本部分描述了用所選的任何啟動(dòng)子替換pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子；用實(shí)施例的形式描述了化學(xué)調(diào)節(jié)的PR-1a啟動(dòng)子。選擇的啟動(dòng)子優(yōu)選地用限制酶從其來(lái)源切下，但另外也可用帶有合適的末端限制位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果進(jìn)行PCR擴(kuò)增，則在靶載體中克隆擴(kuò)增的啟動(dòng)子之后，應(yīng)該對(duì)啟動(dòng)子重新測(cè)序以檢查擴(kuò)增錯(cuò)誤。從質(zhì)粒pCIB1004(見(jiàn)EP 0 332 104)上切下化學(xué)調(diào)節(jié)型煙草PR-1a啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)移至質(zhì)粒pCGN1761ENX。用NcoI酶切pCIB1004，得到的線性片段的3′突出端通過(guò)T4 DNA聚合酶處理產(chǎn)生平端。然后用HindIII酶切該片段，凝膠純化得到的包含PR-1a啟動(dòng)子的片段，并克隆至已去除雙35S啟動(dòng)子的pCGN1761ENX中。實(shí)現(xiàn)方法是用XhoI酶切，用T4聚合酶產(chǎn)生平端，隨后用HindIII酶切，并分離較大的其中克隆有pCIB1004啟動(dòng)子片段的含載體終止子片段。這產(chǎn)生一種pCGN1761ENX衍生物，其含有PR-1a啟動(dòng)子和tml終止子以及一個(gè)具有唯一EcoRI和NotI位點(diǎn)的間插多接頭。
向該載體中插入本發(fā)明的DNA分子，隨后將融合產(chǎn)物(即啟動(dòng)子-基因-終止子)轉(zhuǎn)移至選擇的任何轉(zhuǎn)化載體中，包括本申請(qǐng)所述的轉(zhuǎn)化載體，從而引起DNA分子的化學(xué)誘導(dǎo)型表達(dá)。組成型表達(dá)肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子已知肌動(dòng)蛋白的幾個(gè)同種型可在大多數(shù)細(xì)胞型中表達(dá)，因此肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子的較佳選擇。尤其是，稻Actl基因的啟動(dòng)子已被克隆和表征(McElroy等人，植物細(xì)胞2163-171(1990))。發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子的1.3kb片段含有在稻原生質(zhì)體中表達(dá)所需的所有調(diào)節(jié)元件。此外，已構(gòu)建了多種基于Actl啟動(dòng)子的表達(dá)載體，以特別用于單子葉植物(McElroy等人，分子普通遺傳學(xué)231150-160(1991))。其中摻入了Actl-內(nèi)含子1、Adhl 5′側(cè)翼序列和(玉米乙醇脫氫酶基因的)Adhl-內(nèi)含子1和CaMV 35S啟動(dòng)子的序列。顯示最高表達(dá)的載體是35S和Actl內(nèi)含子或Actl 5′側(cè)翼序列和Actl內(nèi)含子的融合體。McElroy等人(分子普通遺傳學(xué)231150-160(1991))所述的啟動(dòng)子表達(dá)盒易于為了本發(fā)明DNA分子的表達(dá)而修飾，且尤其適用于單子葉植物宿主。例如，可從McElroy結(jié)構(gòu)中切下含啟動(dòng)子片段，用它來(lái)替換pCGN1761ENX中的雙35S啟動(dòng)子，然后該載體可用于特定基因序列的插入。將這樣構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)移至合適的轉(zhuǎn)化載體。在個(gè)別報(bào)道中，也發(fā)現(xiàn)含有第一種內(nèi)含子的水稻Actl啟動(dòng)子可引導(dǎo)在培養(yǎng)的大麥細(xì)胞中的高表達(dá)(Chibbar等人，植物細(xì)胞報(bào)道(Plant Cell Rep.)12506-509(1993))。
將本發(fā)明的DNA分子插入該啟動(dòng)子下游，隨后將融合產(chǎn)物(即啟動(dòng)子-基因-終止子)轉(zhuǎn)移到選擇的任何轉(zhuǎn)化載體中，包括本申請(qǐng)書中所述的載體。組成型表達(dá)遍在蛋白啟動(dòng)子遍在蛋白是已知可在多種細(xì)胞型中積累的另一種基因產(chǎn)物，其啟動(dòng)子已從幾個(gè)種中克隆，用于轉(zhuǎn)基因植物(如向日葵-Binet等人，植物科學(xué)7987-94(1991)，玉米-Christensen等人，植物分子生物學(xué)12619-632(1989))。已在轉(zhuǎn)基因單子葉系統(tǒng)中研究了玉米遍在蛋白，并且其序列和為單子葉植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建的載體公開于專利公開文本EP 0 342 926中。另外，Taylor等人(植物細(xì)胞報(bào)道12491-495(1993))描述了一種載體(pAHC25)，其包含玉米遍在蛋白啟動(dòng)子和第一種內(nèi)含子，經(jīng)微粒轟擊引入時(shí)在多種單子葉植物細(xì)胞懸液中具有高活性。遍在蛋白啟動(dòng)子適于在轉(zhuǎn)基因植物尤其單子葉植物中表達(dá)本發(fā)明的DNA分子。合適的載體是通過(guò)引入適當(dāng)遍在蛋白啟動(dòng)子和/或內(nèi)含子序列而修飾的pAHC25衍生物或本申請(qǐng)所述的任何轉(zhuǎn)化載體。
因此將本發(fā)明的DNA分子插入這類啟動(dòng)子中，融合產(chǎn)物(即啟動(dòng)子-基因-終止子)用于植物轉(zhuǎn)化，引起DNA分子的組成型表達(dá)。根特異的表達(dá)本發(fā)明的DNA分子的一種優(yōu)選表達(dá)模式是根表達(dá)。只在根組織中表達(dá)核苷酸序列具有只改變根中靶基因的表達(dá)而不同時(shí)改變?nèi)~和花組織及種子中的表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。一種合適的根啟動(dòng)子是由de Framond(FEBS290103-106(1991))并在公開的專利申請(qǐng)EP 0 452 269中描述的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子被轉(zhuǎn)移至合適的載體如pCGN1761ENX中，并向該載體中插入DNA分子。隨后將完整的啟動(dòng)子-基因-終止子盒轉(zhuǎn)移至目的轉(zhuǎn)化載體中。創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子已描述了許多這類啟動(dòng)子(例如，Xu等人，植物分子生物學(xué)22573-588(1993)，Logemann等人，植物細(xì)胞1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植物分子生物學(xué)22783-792(1993)，F(xiàn)irek等人，植物分子生物學(xué)22129-142(1993)，Warner等人，植物雜志3191-201(1993))，且均都適用于本發(fā)明。Logemann等人(同上文)描述了雙子葉植物馬鈴薯wun1基因的5′上游序列。Xu等人(同上文)證明雙子葉植物馬鈴薯的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(pin2)在單子葉植物水稻中有活性。此外，Rohrmeier和Lehle(同上文)描述了玉米Wipl cDNA的克隆，其為創(chuàng)傷誘導(dǎo)型，并可用來(lái)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離同源啟動(dòng)子。類似地，F(xiàn)irek等人(同上文)和Warner等人(同上文)描述了單子葉植物藥用蘆筍(Asparagus officinalis)的創(chuàng)傷誘導(dǎo)基因，它在局部創(chuàng)傷和病原體侵入部位表達(dá)。使用本領(lǐng)域眾所周知的克隆技術(shù)，可將這些啟動(dòng)子轉(zhuǎn)移至適當(dāng)載體中，與本發(fā)明的DNA分子融合，并用來(lái)在害蟲侵害部位表達(dá)這些基因。木髓偏好的表達(dá)專利申請(qǐng)WO 93/07278描述了玉米trpA基因的分離，該基因優(yōu)先在木髓細(xì)胞中表達(dá)。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，可將該啟動(dòng)子或其部分轉(zhuǎn)移至如pCGN1761的載體中，替換35S啟動(dòng)子，并用來(lái)以木髓偏好的方式引導(dǎo)本發(fā)明的DNA分子的表達(dá)。實(shí)際上，包含木髓偏好的啟動(dòng)子或其部分的片段可被轉(zhuǎn)移至任何載體中，并可為用于轉(zhuǎn)基因植物而修飾。DNA分子的木髓偏好的表達(dá)通過(guò)向該載體中插入DNA分子而實(shí)現(xiàn)?；ǚ厶禺惖谋磉_(dá)專利申請(qǐng)WO 93/07278另外描述了在花粉細(xì)胞中表達(dá)的玉米鈣依賴的蛋白激酶(CDPK)基因的分離。該基因序列和啟動(dòng)子從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)延伸可達(dá)1400bp。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，可將該啟動(dòng)子或其部分轉(zhuǎn)移至如pCGN1761的載體中，替換35S啟動(dòng)子，并用來(lái)以花粉特異的方式引導(dǎo)本發(fā)明的DNA分子的表達(dá)。實(shí)際上，包含花粉特異的啟動(dòng)子或其部分的片段可被轉(zhuǎn)移至任何載體中，并可為用于轉(zhuǎn)基因植物而修飾。葉特異的表達(dá)Hudspeth和Grula(植物分子生物學(xué)12579-589(1989))描述了一種編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，該基因的啟動(dòng)子可用來(lái)以葉特異的方式引導(dǎo)本發(fā)明的DNA分子在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)。實(shí)施例8植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建許多轉(zhuǎn)化載體可用于植物轉(zhuǎn)化，并且本發(fā)明的DNA分子可插入上述任何表達(dá)盒中，使其能在適當(dāng)條件下在希望的細(xì)胞中表達(dá)該DNA分子。然后將含核苷酸序列的表達(dá)盒摻入以下所述的任一適當(dāng)轉(zhuǎn)化載體中。
所用載體的選擇將取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和用于轉(zhuǎn)化的目標(biāo)物種。對(duì)于某些目標(biāo)物種，優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)化中常規(guī)使用的選擇標(biāo)記包括賦予卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304184-187(1983))、賦予除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究181062(1990)，Spencer等人，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)79625-631(1990))、賦予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子細(xì)胞生物學(xué)42929-2931)和賦予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))。(1)適用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體的構(gòu)建許多載體可用于應(yīng)用根瘤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。它們一般具有至少一個(gè)T-DNA邊界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))的載體。以下描述了兩種典型載體的構(gòu)建。
pCIB200和pCIB2001的構(gòu)建二元載體pCIB200和pCIB2001用于構(gòu)建農(nóng)桿菌使用的重組載體，按以下方法構(gòu)建。通過(guò)用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，細(xì)菌學(xué)雜志164446-455(1985))切下四環(huán)素抗性基因，隨后插入一個(gè)來(lái)自pUC4K的帶有NPTII的AccI片段(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等人，自然304184-187(1983)；McBride等人，植物分子生物學(xué)14266-276(1990))，產(chǎn)生pTJS75kan。使XhoI接頭與pCIB7的EcoRV片段連接，該片段包含左和右T-DNA邊界、植物選擇性nos/nptII嵌合基因和pUC多接頭(Rothstein等人，基因53153-161(1987))，并將XhoI消化片段克隆入SalI消化的pTJS75kan中產(chǎn)生pCIB200(參見(jiàn)EP 0332104)。pCIB200含有下列單一多接頭限制位點(diǎn)EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，它是通過(guò)向多接頭中插入其他限制位點(diǎn)而產(chǎn)生的。pCIB2001多接頭的單一限制位點(diǎn)是EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。除包含這些單一限制位點(diǎn)外，pCIB2001還有植物和細(xì)菌卡那霉素的選擇性、用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的左和右T-DNA邊界、在大腸桿菌和其他宿主之間轉(zhuǎn)移的RK2衍生的trfA功能以及也源自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接頭適用于含有其自身調(diào)節(jié)信號(hào)的植物表達(dá)盒的克隆。
優(yōu)選地使用多接頭，將含本發(fā)明的DNA分子的上述任一種植物表達(dá)盒插入pCIB2001中。
pCIB10入其潮霉素篩選衍生物的構(gòu)建二元載體pCIB10含有編碼植物中篩選所需卡那霉素抗性的基因、T-DNA右和左邊界序列，并且摻入寬宿主范圍的質(zhì)粒pRK252的序列，使其在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中均可復(fù)制。其構(gòu)建由Rothstein等人描述(基因53153-161(1987))。已構(gòu)建了pCIB10的多種衍生物，其中摻入了Gritz等人(基因25179-188(1983))所述的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。這些衍生物能使在僅有潮霉素(pCIB743)或同時(shí)有潮霉素和卡那霉素(pCIB715、pCIB717)時(shí)篩選轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。該載體用來(lái)轉(zhuǎn)化含有本發(fā)明的DNA分子的表達(dá)盒。(2)適用于非農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的載體的構(gòu)建不使用根瘤農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化避免了對(duì)所選的轉(zhuǎn)化載體中T-DNA序列的需要，所以除如上所述包含T-DNA序列的載體外，還可使用缺少這些序列的載體。不依賴于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過(guò)粒子轟擊、原生質(zhì)體攝取(如PEG和電穿孔)、顯微注射的轉(zhuǎn)化或花粉轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利5,629,283)。載體的選擇主要取決于待轉(zhuǎn)化種的優(yōu)選。下面，描述了某些典型載體的構(gòu)建。
pCIB3064的構(gòu)建pCIB3064是一種pUC衍生載體，適用于與除草劑basta(或phosphinothricin)篩選結(jié)合的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。質(zhì)粒pCIB246包含與大腸桿菌GUS基因有效地融合的CaMV 35S啟動(dòng)子和CaMV 35S轉(zhuǎn)錄終止子，在PCT公開申請(qǐng)WO 93/07278中有述。該載體的35S啟動(dòng)子在起始位點(diǎn)5′端包含兩個(gè)ATG序列。用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)突變這些位點(diǎn)以去除ATG，產(chǎn)生限制位點(diǎn)SspI和PvuII。新限制位點(diǎn)距唯一的SalI位點(diǎn)96bp和37bp，距實(shí)際起始位點(diǎn)101bp和42bp。產(chǎn)生的pCIB246的衍生物命名為pCIB3025。然后通過(guò)SalI和SacI消化從pCIB3025上切下GUS基因，使末端變?yōu)槠蕉耍⒃龠B接，產(chǎn)生質(zhì)粒pCIB3060。質(zhì)粒pJIT82從John Innes Centre，Norwich獲得，切下含有產(chǎn)綠色鏈霉菌(Streptomyces viridochromogenes)bar基因的400bp的SmaI片段，將其插入pCIB3060的HpaI位點(diǎn)(Thompson等人，EMBO J.62519-2523(1987))。這產(chǎn)生了pCIB3064，其含有位于CaMV 35S啟動(dòng)子和終止子控制下的用于除草劑篩選的bar基因、氨芐青霉素抗性基因(用于在大腸桿菌中篩選)和具有單一SphI、PstI、HindIH、BamHI位點(diǎn)的多接頭。該載體適用于含有自身調(diào)節(jié)信號(hào)的植物表達(dá)盒的克隆，用來(lái)引導(dǎo)本發(fā)明的DNA分子的表達(dá)。
pSOG19和pSOG35的構(gòu)建pSOG35是一種應(yīng)用大腸桿菌基因二氫葉酸還原酶(DHFR)作為選擇性標(biāo)記提供氨甲喋呤抗性的轉(zhuǎn)化載體。用PCR擴(kuò)增35S啟動(dòng)子(～800bp)、玉米Adh1基因的內(nèi)含子6(～550bp)和pSOG10的18bp的GUS非翻譯前導(dǎo)序列。也PCR擴(kuò)增編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶II型基因的250bp片段，將這兩個(gè)PCR片段與pBI221(Clontech)的包含pUC19載體骨架和胭脂氨酸合酶終止子的SacI-PstI片段裝配。這些片段的裝配產(chǎn)生pSOG19，它含有與內(nèi)含子6序列融合的35S啟動(dòng)子、GUS前導(dǎo)序列、DHFR基因和胭脂氨酸合酶終止子。pSOG19中的GUS前導(dǎo)序列替換為玉米萎黃病斑點(diǎn)病毒(MCMV)的前導(dǎo)序列產(chǎn)生載體pSOG35。pSOG19和pSOG35攜帶氨芐青霉素抗性的pUC基因，并且具有可用于克隆外源序列尤其是本發(fā)明的DNA分子的HindIII、SphI、PstI和EcoRI位點(diǎn)。
葉綠體轉(zhuǎn)化每板七個(gè)，按1″環(huán)形排列于T瓊脂培養(yǎng)基上，使煙草c.v.′Xanthi nc′的種子萌發(fā)，播種12-14天后，基本如所述(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)，用質(zhì)粒pPH143和pPH145的DNA包被的1μm鎢顆粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轟擊。將轟擊的秧苗在T培養(yǎng)基上溫育兩天，之后切下葉子，遠(yuǎn)軸側(cè)朝上置于亮光下(350-500μmol光子/m2/s)，置于含有500μg/ml壯觀霉素二鹽酸(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培養(yǎng)基平板上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)。轟擊三至八周后在漂白葉下出現(xiàn)的抗性苗被亞克隆至相同的選擇培養(yǎng)基上，使之形成愈傷組織，分離并亞克隆第二批苗。用Southern印跡標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook等人(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港)評(píng)價(jià)獨(dú)立亞克隆中轉(zhuǎn)化的質(zhì)體基因組拷貝的完全分離(同質(zhì)體狀態(tài))。BamHI/EcoRI消化的總細(xì)胞DNA(Mettler，I.J.(1987)植物分子生物學(xué)報(bào)道5，346-349)在1％Tris-硼酸(TBE)瓊脂糖凝膠上分離，轉(zhuǎn)移至尼龍膜上(Amersham)，用32p-標(biāo)記的隨機(jī)引物DNA序列探查，該序列對(duì)應(yīng)于pC8的0.7kbBamHI/HindIII DNA片段，包含一部分rps7/12質(zhì)體導(dǎo)向序列。同質(zhì)的苗在含壯觀霉素的MS/IBA培養(yǎng)基(McBride，K.E.等人(1994)PNAS 91，7301-7305)上無(wú)菌生根，并轉(zhuǎn)移到溫室中。
序列表<110>Novartis AG<120>基因表達(dá)的調(diào)節(jié)<130>S-30496A<140><141><150>US 09/084,942<151>1998-05-26<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>1cgcggatcct ggaagacgcc aaaaaca27<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸cggaagctta ggctcgccta atcgcagtat ccggaatg 38<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>3cggtctagag gaagacgcca aaaacata28<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>4cggaagctta ggctcgccta atcgcagtat ccggaatg 38<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>5gtacctcgag tctagactcg ag 22<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸gatcgagctc cacgagaact gtctccg 27<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>7tcagccatgg gaagacaagt acattgc 27<210>8<211>27<212><213>人工庫(kù)列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>8cttgccatgg cacgagaact gtctccg 27<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>9catggagctc gaagacaagt acattgca28<210>10<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>10catcgagctc ctctgtttaa accacgagaa ctgtctccgt cgc 43<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>11tttggagagg acagacctgc 20<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>12ggattttggt tttaggaatt agaa24<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>13cgcggatcca agattcaaag tgcgctgctg 30<210>14<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>14gccgaagcttg gcgacgtaat ccacgatctc30<210>15<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>15cggtctagaa agattcaaag tgcgctgctg 30<210>16<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>16gcgaagcttg gcgacgtaat ccacgatctc 30<210>17<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>17gcgaagcttg atccatgagc ccagaacga29<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述寡核苷酸<400>18gccaagcttc ctagaacgcg tgatctc 2權(quán)利要求
1.一種改變植物細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，包括向植物細(xì)胞中引入該靶基因的有義RNA片段和該靶基因的反義RNA片段，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述RNA片段包含于兩種不同的RNA分子中。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述RNA片段包含于一種RNA分子中。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述RNA分子能夠折疊，使得其中所含的RNA片段形成雙鏈區(qū)。
5.一種改變植物細(xì)胞中靶基因表達(dá)的方法，包括向植物細(xì)胞中引入能在該細(xì)胞中表達(dá)靶基因的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細(xì)胞中表達(dá)靶基因的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述靶基因是所述植物細(xì)胞的一種必需基因。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述靶基因是穩(wěn)定整合于所述植物細(xì)胞基因組中的異源基因。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述異源基因作為染色體外分子存在于所述植物細(xì)胞中。
9.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列穩(wěn)定地整合于所述植物細(xì)胞的基因組中。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于兩種不同的DNA分子中。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述DNA分子另外含有與第一種DNA序列有效連接的第一種啟動(dòng)子和與第二種DNA序列有效連接的第二種啟動(dòng)子。
12.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于一種DNA分子中。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于所述DNA分子的同一DNA鏈中。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述有義RNA片段和反義RNA片段表達(dá)為一種RNA分子。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述RNA分子能夠折疊，使得其中所含的RNA片段形成雙鏈區(qū)。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述DNA分子另外含有與第一種或第二種DNA序列有效連接的啟動(dòng)子。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述啟動(dòng)子是天然靶基因的天然啟動(dòng)子、異源啟動(dòng)子、組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異啟動(dòng)子或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述DNA分子另外在編碼有義RNA片段和反義RNA片段的DNA序列之間含有一個(gè)接頭。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述接頭包含一種包含功能基因如選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)盒。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述接頭包含調(diào)節(jié)序列如內(nèi)含子加工信號(hào)。
21.權(quán)利要求13的方法，其中所述有義RNA片段和反義RNA片段表達(dá)為兩種RNA分子。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述第一種DNA序列與第一種啟動(dòng)子有效連接，而第二種DNA序列與第二種啟動(dòng)子有效連接。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列與一種雙向啟動(dòng)子有效連接。
24.權(quán)利要求12的方法，其中所述第一種DNA序列和第二種DNA序列包含于所述DNA分子的互補(bǔ)鏈中。
25.權(quán)利要求24的方法，其中在所述DNA分子中第一種DNA序列是第二種DNA序列的互補(bǔ)DNA鏈。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述DNA分子另外含有與第一種DNA序列有效連接的第一種啟動(dòng)子。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述DNA分子另外在第一個(gè)啟動(dòng)子和第一種DNA序列之間含有第一個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，在第一種DNA序列3’末端含有第二個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)，其中第一個(gè)和第二個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)在位點(diǎn)特異性重組酶的存在下能翻轉(zhuǎn)位于第一個(gè)和第二個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的第一種DNA序列。
28.權(quán)利要求27的方法；其中由于這種翻轉(zhuǎn)第一種啟動(dòng)子能表達(dá)第二種DNA序列。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述植物細(xì)胞另外含有一種能識(shí)別位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性重組酶。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所述DNA分子另外含有與第二種DNA序列有效連接的第二種啟動(dòng)子。
31.一種植物細(xì)胞，其含有能表達(dá)靶基因的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能表達(dá)靶基因的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子，并且當(dāng)該DNA序列表達(dá)時(shí)，植物細(xì)胞中靶基因的表達(dá)改變。
32.由權(quán)利要求31的植物細(xì)胞產(chǎn)生的一種植物及其后代。
33.權(quán)利要求32的植物產(chǎn)生的種子。
34.一種植物細(xì)胞，其獲得方法是向植物細(xì)胞中引入能在該細(xì)胞中表達(dá)靶基因的有義RNA片段的第一種DNA序列，和能在該細(xì)胞中表達(dá)靶基因的反義RNA片段的第二種DNA序列，其中有義RNA片段和反義RNA片段能形成雙鏈RNA分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用基因的有義和反義RNA片段改變植物中靶基因表達(dá)的方法。有義和反義RNA片段能夠配對(duì)并形成雙鏈RNA分子,從而改變基因的表達(dá)。本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的方法獲得的植物、其后代和產(chǎn)生的種子。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1307641SQ99807888
公開日2001年8月8日 申請(qǐng)日期1999年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月26日
發(fā)明者P·B·海費(fèi)茨, D·A·帕頓, J·Z·萊文, 闕求登, A·J·迪弗拉蒙德, M·M·杜恩, 陳政雄 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司