專利名稱：異源雙鏈突變載體及其在細(xì)菌中的應(yīng)用的制作方法
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及雙鏈寡核堿基化合物(下文中為“雙鏈突變載體”)的應(yīng)用，以在某一細(xì)胞內(nèi)的一段DNA序列上特異性地產(chǎn)生變化。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及化合物及它們的使用方法，以在靶原核細(xì)胞的基因組和游離體(質(zhì)粒)上產(chǎn)生特異性的遺傳變化。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及使用細(xì)菌細(xì)胞以發(fā)展更有效的雙鏈突變載體的方法。設(shè)計(jì)雙鏈突變載體(duplex mutational vector,DMV)的結(jié)構(gòu)以在DMV和靶基因之間發(fā)生遺傳交換，即，一段包含在DMV內(nèi)的序列取代了靶基因上的序列。在又進(jìn)一步的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及DMV的特定遺傳結(jié)構(gòu)。
2．發(fā)明背景專利號(hào)5,565,350,1996年10月15日出版，和編號(hào)5,731,181,1998年3月24日出版的美國專利(E.B.Kmiec)，描述了嵌合突變載體(chimeric mutational vectors,,CMV)，該載體具有DNA型及RNA型核堿基以將遺傳變化引入原核細(xì)胞的載體。這些CMV的特點(diǎn)是具有至少3個(gè)連續(xù)的堿基對，其中DNA型和RNA型的核堿基彼此為Watson-Crick配對的，以形成雜合雙鏈。一種設(shè)計(jì)用于修復(fù)編碼肝臟/骨骼/腎臟類型的堿性磷酸酶的基因上的一個(gè)突變的CMV如Yoon,K.等所報(bào)道，1996年3月，Proc.Natl.Acad.Sci.93,2071.堿性磷酸酶基因通過一種質(zhì)粒被過渡引入到CHO細(xì)胞內(nèi)。六小時(shí)以后引入CMV。在引入到CMV內(nèi)的24小時(shí)以后回收質(zhì)粒并分析。結(jié)果顯示大約30至38％的堿性磷酸酶基因被CMV修復(fù)。
一種設(shè)計(jì)用于修正引起鐮狀細(xì)胞病的人類β-球蛋白基因上突變的CMV及其成功的應(yīng)用如Cole-Strauss等所描述，1996，科學(xué)273:1386。一種設(shè)計(jì)用于在一種大鼠肝細(xì)胞內(nèi)的大鼠凝血因子Ⅸ基因上制造一個(gè)突變的CMV如Kren等所公布，1998，自然藥物(Naturemedicine)4,285-290。一種具有第一條鏈上的一個(gè)堿基與第二條鏈上的一個(gè)非互補(bǔ)的堿基配對的CMV的一個(gè)例子如Kren等所提供，1997年6月，肝臟病學(xué)25,1462。
系列編號(hào)為08/640,517的美國專利申請于1996年3月1日遞交，E.B.Kmiec,A.Cole-Strauss和K.Yoon，發(fā)表為WO97/41141,1997年10月6日，及系列編號(hào)08/906,265的申請，1997年8月5日遞交，公布了在治療造血細(xì)胞中的遺傳疾病中有用的方法和CMV，如鐮狀細(xì)胞病、珠蛋白生成障礙性貧血和葡萄糖腦苷脂酶缺乏癥。
以上所引用的Yoon,Cole-Straauss和Kren的科學(xué)出版物，描述了具有被一段插入的DNA片段隔開的兩段2’-O-甲基RNA片段的CMV，其位于與具有5’末端核苷的鏈相對鏈上。美國專利5,565,350描述了一種具有單鏈的2’-O-甲基化RNA片段，其位于具有5’末端核苷的鏈上。一段位于與具有5’末端核苷的鏈相對的鏈上、具有互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸和一段未修飾的核糖核苷酸的連續(xù)片段的寡核苷酸如Kmiec,E.B等所描述，1994，分子和細(xì)胞生物學(xué)，14:7163-7172。該鏈的序列來自抗菌素M13mp19。
使用單鏈的寡核苷酸以在酵母中引入特定突變?nèi)鏨amamoto,T.等所描述，1992，遺傳學(xué)131,811-819。這些寡核苷酸在大約30到50個(gè)堿基之間。類似的結(jié)果如Campbell,C.R.,等所報(bào)道，1989,新生物學(xué)家，l,223-227。全長大約160個(gè)堿基對的雙鏈DNA片段已經(jīng)被報(bào)道將特定的突變引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Hunger-Bertling,K.,等，1990，分子和細(xì)胞生物化學(xué)92,107-116。
申請者們知道隨后包括指導(dǎo)關(guān)于重組誘發(fā)劑寡核苷酸的使用和傳遞系統(tǒng)的臨時(shí)申請由Steer等，系列編號(hào)60/045,288,1997年4月30日歸檔；系列編號(hào)60/054,837,1997年8月5日歸檔；系列編號(hào)60/064,996,1997年11月10日歸檔；以及由Steer & Roy-Chowdhury等，系列編號(hào)60/074,497,1998年2月12日歸檔，標(biāo)題為“通過改變APOB和APOE基因進(jìn)行預(yù)防和治療的方法。”3．附圖簡述

圖1．一種雙鏈發(fā)夾型重組誘發(fā)劑寡體構(gòu)象的一個(gè)例子。特征為a，第一條鏈(strand)；b，第二條鏈；c，第二條鏈的第一段(chain)；1，最5’端核堿基；2,3’末端核堿基；3,5’末端核堿基；4，最3’端核堿基；5，第一末端核堿基；6，第二末端核堿基。
圖2．一種具有一個(gè)突出端的單鏈發(fā)夾型重組誘發(fā)劑核堿基構(gòu)象的一個(gè)例子。其特征如以上，加上d，突出端部分。注意第二條鏈上最5’端核堿基和5’末端核堿基是相同的核堿基。
4．定義本發(fā)明將依據(jù)以下定義進(jìn)行理解。
一種寡核堿基是核堿基的聚合體，該聚合體可以通過Watson-Crick堿基配對與一段具有互補(bǔ)序列的DNA雜交。
核堿基包括一種堿基，其是嘌呤、嘧啶、或它們的衍生物或類似物。核堿基包括肽核堿基(肽核酸的亞單位)、和嗎啉核堿基以及含有一個(gè)戊糖呋喃糖基部分的核堿基，如一種可選擇性替代的核糖核苷或2’-脫氧核糖核苷。核苷是含有戊糖呋喃糖的核堿基，其通過磷酸二酯鍵連接。其它含有戊糖呋喃糖的核堿基可以通過替代的磷酸二酯鍵連接，如硫代磷酸酯或磷酸三酯。
一個(gè)寡核堿基化合物具有單個(gè)的5’和3’末端核堿基，它們是該聚合體的最末端核堿基。核堿基為脫氧核糖型或核糖型。核糖型核堿基是含有戊糖呋喃糖的核堿基，其中2’碳是被羥基、取代的氧或鹵素取代的亞甲基。脫氧核糖型核堿基是除了核糖型核堿基之外的核堿基，包括所有不含有戊糖呋喃糖基部分的核堿基，如肽核酸。
一條寡核堿基鏈通常包括寡核堿基化合物的區(qū)域或片段，其基本上與具有相同長度的互補(bǔ)鏈的所有核堿基雜交。一段核堿基鏈具有一個(gè)3’末端核堿基和一個(gè)5’末端核堿基。一條鏈的3’末端核堿基與其互補(bǔ)鏈5’末端的核堿基雜交。如果一條鏈上的兩個(gè)核堿基是直接共價(jià)連接的，或者它們與互補(bǔ)鏈上直接共價(jià)連接的核堿基雜交，則它們是毗鄰的核堿基。一條核堿基鏈可以包括連接的核堿基，其中該鏈上的每個(gè)核堿基是與其毗鄰的核堿基共價(jià)連接的。可選的，當(dāng)兩個(gè)毗鄰的核堿基是非連接時(shí)，則一條鏈可以被分為兩段。一條鏈的5’(或3’)末端核堿基可以在其5’-0(或3’-0)與接頭連接，該接頭進(jìn)一步與第二條寡核堿基鏈的3’(或5’)末端連接，第二條鏈與第一條鏈互補(bǔ)，籍此兩條鏈形成一條單一的寡核堿基化合物。該接頭可以是一段寡核苷酸、寡核堿基或其它化合物。一條寡核堿基化合物的5’末端和3’末端核堿基的5’-0和3’-0可以被一個(gè)保護(hù)該寡核堿基鏈的保護(hù)基團(tuán)取代。然而，例如，封閉的環(huán)狀寡核苷酸不含有3’或5’末端核苷。注意當(dāng)一條寡核堿基化合物含有一條分開的鏈時(shí)，3’和5’末端核堿基不是一條鏈的末端核堿基。
如本說明書中所用到的，術(shù)語3’和5’具有它們通常的意義。術(shù)語“最3’端的核堿基”、“最5’端的核堿基”、“第一個(gè)末端核堿基”和“第二個(gè)末端核堿基”具有特定的定義。如以上所定義的，最3’端的和第二個(gè)末端核堿基是重組誘發(fā)劑寡核堿基互補(bǔ)鏈上的3’末端核堿基。類似的最5’端的和第一個(gè)末端核堿基是重組誘發(fā)劑寡核堿基互補(bǔ)鏈上的5’末端核堿基。5．發(fā)明概述本發(fā)明基于意外的發(fā)現(xiàn)，即在以前的技術(shù)中所描述的嵌合突變載體在原核細(xì)胞內(nèi)是有功能的。本發(fā)明進(jìn)一步基于意外的發(fā)現(xiàn)，即雜合雙鏈的存在不是突變載體的活性所必需的。意外地發(fā)現(xiàn)，缺少雜合雙鏈上三個(gè)連續(xù)的堿基對的雙鏈突變載體能夠有效地將特定的遺傳變化引入到細(xì)菌內(nèi)。這些載體的術(shù)語為非嵌合型突變載體(non-chimeric mutational vectors,NCMV)。NCMV在原核細(xì)胞中也可以被用于取代CMV。
本發(fā)明進(jìn)一步以意外的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，即一種嵌合突變載體，其在與具有5’末端核堿基和3’末端核堿基的鏈相對的鏈上具有一段單一的核糖型核堿基片段，其優(yōu)于具有兩條核糖型核堿基片段的嵌合突變載體。
本發(fā)明又進(jìn)一步以一種雙鏈突變載體的效率提高這以意外的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，其中一條鏈的序列包括靶基因的序列，第二條鏈的序列包括想要的序列，即，使用者想在靶基因的位置引入的不同序列。這些雙鏈載體的術(shù)語為異源雙鏈突變載體(heteroduplex mutationalvectors,HDMV)。一種HDMV可以是嵌合型的或非嵌合型的。
在HDMV的一個(gè)實(shí)施例中，包括不同的所想要序列的鏈?zhǔn)且粭l具有一個(gè)3’末端和一個(gè)5’末端的鏈。在一個(gè)可選的實(shí)施例中，含有不同的、想要序列的鏈由非核糖型核堿基組成。
本發(fā)明又進(jìn)一步基于發(fā)現(xiàn)活性的顯著提高可以通過構(gòu)建DMV以保護(hù)DMV的鏈免受3’外切酶的作用而實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，3’外切酶的防護(hù)是通過使DMV抗單鏈DNA酶作用而提供的。
DMV可以被用于將特定的遺傳變化引入到原核細(xì)胞和真核細(xì)胞或它們的游離體內(nèi)的靶DNA序列上。這些變化可以被用于作為一種治療或預(yù)防的插入，及作為一種研究工具，在患者體內(nèi)產(chǎn)生在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)的新的顯型特征。6．發(fā)明詳述6.1.嵌合突變載體的遺傳結(jié)構(gòu)雙鏈突變載體(DMV)由核堿基的聚合體組成，該聚合體與具有合適序列的DNA雜交(即，形成嘌呤和嘧啶的Watson-Crick堿基對)。每個(gè)DMV被分為至少12核堿基及不超過75個(gè)核堿基的第一條鏈和第二條鏈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，鏈的長度在20到50個(gè)核堿基之間。這些鏈含有彼此互補(bǔ)的區(qū)域。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，這兩條鏈在每個(gè)核堿基上彼此互補(bǔ)，除了靶序列和想要的序列在其中不同的核堿基。優(yōu)選的是至少有兩段含有至少5個(gè)核堿基的非重疊區(qū)域。
核堿基包括一種堿基，其是嘌呤或嘧啶或它們的類似物或衍生物。存在兩種類型的核堿基。核糖型核堿基是具有2’-羥基、取代的2’-羥基或2’-鹵素-取代的核糖的核糖核酸。所有除了核糖型的核堿基以外的核堿基都是脫氧核糖型核堿基。因此，脫氧型核堿基包括肽核堿基。
在一個(gè)實(shí)施例中，其中的鏈在每個(gè)核堿基上都彼此互補(bǔ)，第一條和第二條鏈的序列包括至少兩個(gè)與靶基因同源的區(qū)域、以及一個(gè)或多個(gè)與靶基因不同的區(qū)域(“突變區(qū)域”)，并將遺傳上的變化引入到靶基因上。該突變區(qū)域在3’和5’方向直接與同源區(qū)域毗鄰。在本發(fā)明特定的實(shí)施例中，這兩個(gè)同源區(qū)域全長至少有3個(gè)核堿基、或至少有6個(gè)核堿基或至少有12個(gè)核堿基。所有同源區(qū)域的全長優(yōu)選的是至少有12個(gè)核堿基，優(yōu)選的是16個(gè)，更優(yōu)選的是全長有20個(gè)核堿基到約60個(gè)核堿基。又更優(yōu)選的是同源和突變區(qū)域一起的全長是25到45個(gè)核堿基之間，更優(yōu)選的是在30到45個(gè)核堿基之間或大約35到40個(gè)核堿基之間。每個(gè)同源區(qū)域的長度可以是8到30個(gè)核堿基，更優(yōu)選的是8到15個(gè)核堿基，最優(yōu)選的是12個(gè)核堿基。
DMV的一條或兩條鏈可以選擇性地含有核糖型核堿基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，僅當(dāng)DMV的第二條鏈由脫氧核糖型核堿基組成時(shí)，第一條鏈才由核糖型核堿基組成。在一個(gè)可選的實(shí)施例中，第一條鏈含有一段單一的、插入兩個(gè)核糖型核堿基片段之間的脫氧核苷型核堿基片段。在上述可選的實(shí)施例中，插入的片段含有突變區(qū)域或者，在HDMV的情況下，該插入?yún)^(qū)域與兩條鏈中的一條內(nèi)的突變區(qū)域互補(bǔ)。
優(yōu)選的，該突變區(qū)域由20或更少的堿基，更優(yōu)選的是6個(gè)或更少的堿基以及最優(yōu)選的是3個(gè)或更少的堿基組成。該突變區(qū)域可以與間隔靶基因(該靶基因與DMA的同源區(qū)域同源)中區(qū)域的序列具有不同的長度，以至可以導(dǎo)致靶基因上的一個(gè)插入或刪除。當(dāng)DMV被用于在靶基因上引入一個(gè)刪除時(shí)，在突變區(qū)域內(nèi)沒有可鑒別的堿基。而且，突變通過在靶基因內(nèi)被隔開的兩段同源區(qū)域并列而完成。為了本發(fā)明的目的，在靶基因上引入一個(gè)刪除的一種DMV的突變區(qū)域的長度被認(rèn)為是所刪除的長度。在一個(gè)實(shí)施例中，突變區(qū)域是從6到1個(gè)堿基的刪除，或更優(yōu)選的是3到1個(gè)堿基?？梢酝ㄟ^單一的DMV引入多個(gè)獨(dú)立的突變，在這種情況下多個(gè)突變區(qū)域在相同的DMV上。可選地，可以同時(shí)使用多個(gè)DMV以將多個(gè)遺傳變化引入到單個(gè)基因上或者，可選地，將多個(gè)遺傳變化引入到相同細(xì)胞的多個(gè)基因上。在本說明書中，突變區(qū)域也稱為異源區(qū)域。當(dāng)所想要的不同序列是一個(gè)插入或刪除時(shí)，兩條鏈的序列具有該想要的不同序列的序列。
DMV是一條在24和150個(gè)核堿基之間的單一的寡核堿基化合物(聚合體)。因此，DMV含有單一的3’末端和單一的5’末端。第一條和第二條鏈可以通過核堿基或非寡核堿基接頭共價(jià)連接。如本說明書中所用到的，這些接頭不被認(rèn)為是這些鏈的一部分。因此，存在一個(gè)限制，如一條不合有核糖型核堿基的鏈不排除在接連到上述鏈中的接頭中含有核糖型核堿基。如本說明書中所用到的，嵌合型、非嵌合型和異源雙鏈突變載體是各種類型的DMV并具有以上特性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，各條鏈的3’末端核堿基被保護(hù)免受3’外切酶的攻擊。這種保護(hù)可以通過幾種目前本工藝的熟練人員了解的技術(shù)或任何將被發(fā)展的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施例中，保護(hù)免受3’外切酶攻擊是通過將一條鏈的最3’端的(末端)核堿基與二者選一條鏈中的最5’端的(末端)核堿基通過核酸酶抗性的共價(jià)接頭連接，這些接頭如聚乙二醇、聚-1,3-丙二醇或聚-1,4-丁二醇。本工藝的熟練人員了解適于連接兩段雜交的核酸鏈的各種接頭的長度。一段具有六到三個(gè)乙烯單元和末端磷?；虻木垡叶冀宇^是合適的。Durand,M.等，1990，核酸研究18,6353；Ma,M.Y-K.,等，1993，核酸研究21,2585-2589。一種優(yōu)選的可選接頭是二-磷酰基丙基-反式-4,4’-茋二甲酰胺(stilbenedicarboxamide)。Letsinger,R.L.,等，1994,J.Am.Chem.Soc.116,811-812；Letsinger,R.L.等，1995,J.Am.Chem.Soc.117,7323-7328，其作為參考結(jié)合于本說明書中。這些接頭可以采用常規(guī)的固相合成的方法被插入到DMV內(nèi)?？蛇x地，DMV的鏈可以分別合成，然后再雜交，鏈間連接的形成是采用了如專利出版物WO97/05284,1997年2月13日，Letsinger R.L.等中所描述的含有硫代磷酰基(thiophoryl)的茋二甲酰胺(stilbenedicarboxamide)。
在進(jìn)一步可選的實(shí)施例中，該接頭可以是一條由抗核酸酶的核堿基(如2’-O-甲基、2’-O-烯丙基或2’-F-核糖核苷酸)組成的單鏈寡核堿基。四核苷酸序列TTTT、UUUU和UUCG以及三核苷酸序列TTT、UUU或UCG是尤其優(yōu)選的核苷接頭。包括一個(gè)三或四胸腺嘧啶寡核苷酸的接頭不是由核酸酶抗性的核堿基組成的，這種接頭不能夠提供對3’外切酶攻擊的防護(hù)。
在一個(gè)可選的實(shí)施例中，3’外切酶保護(hù)可以通過修飾3’末端核堿基達(dá)到。如果一條鏈的3’末端核堿基是一個(gè)3’末端，則一個(gè)空間保護(hù)基團(tuán)可以籍3’-OH、2’-OH或?qū)?’或3’磷酸酯的酯化作用而連接。一種合適的保護(hù)基團(tuán)是一種1,2-(ω-氨基)-烴基二醇或可選的是1,2-羥甲基-(ω-氨基)-烴基?？梢赃M(jìn)行的修飾包括使用一種烯烴或帶支鏈的烷烴或烯烴，以及ω-氨基的取代或用ω-羥基替代ω-氨基。其它合適的保護(hù)基團(tuán)包括一種3’末端磷酸甲酯，Tidd,D.M.,等，1989Br.J.Cancer,60,343-350；以及3’氨基己基，Gamper H.G.,等，1993，核酸研究，21,145-150?？蛇x的，3’或5’末端羥基可以通過與一種取代的磷(如磷酸甲酯或硫代磷酸酯)結(jié)合被衍生。
在又進(jìn)一步可選的實(shí)施例中，3’末端核堿基的防護(hù)可以通過使該鏈的最3’端的核堿基為核酸酶抗性核堿基來實(shí)現(xiàn)。核酸酶抗性核堿基包括肽核堿基和2’取代的核糖核苷酸。合適的取代包括由美國專利編號(hào)5,731,181、和由美國專利編號(hào)5,334,711及Sproat(Sproat)*的編號(hào)5,658,731所教導(dǎo)，它們作為參照結(jié)合于本說明書中，以及專利出版物EP629387和EP679657(其稱為，Martin申請)中所教導(dǎo)的替代，其作為參照結(jié)合于本說明書中。如本說明書中所用到的，一種如Martin申請或Sproat中所描述的一種核糖核苷酸的2’氟、氯或溴的衍生物或一種具有一個(gè)替代的2’-O的核糖核苷酸的術(shù)語為一種“2’-取代的核糖核苷酸”。特定優(yōu)選的2’-替代的核糖核苷酸的實(shí)施例是2’-氟、2’-甲氧基、2’-丙氧基、2’-烯丙氧基、2’-羥基乙氧基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟丙氧基和2’-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。在2’-取代的核糖核苷酸的更優(yōu)選的實(shí)施例中，是2’-甲氧基、2’-甲氧基乙氧基、和2’-丙烯氧基取代的核苷。
術(shù)語“核酸酶抗性的核糖核苷酸”包括含有2’-取代的核糖核苷酸以及也含有除了核糖核苷酸之外的所有2’-羥基核糖核苷，如通過非磷酸酯鍵或替代的磷酸二酯鍵連接的核糖核苷酸。核酸酶抗性的脫氧核糖核苷酸被類似地定義。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，DMV優(yōu)選的是包括至少三個(gè)、更優(yōu)選的是六個(gè)核酸酶抗性的核糖核苷。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，CMV僅含有一個(gè)核酸酶抗性的核糖核苷和脫氧核糖核苷酸。在一個(gè)可選的優(yōu)選實(shí)施例中，每隔一個(gè)核糖核苷均為核酸酶抗性的。
每個(gè)DMV具有一個(gè)3’末端和一個(gè)5’末端。在一個(gè)實(shí)施例中，這些末端是一條鏈的末端核堿基。在一個(gè)可選的實(shí)施例中，一條鏈被分為兩段，它們通過可選的鏈共價(jià)連接，但彼此沒有直接連接。在一個(gè)實(shí)施例中，其中一條鏈被分為兩段，3’和5’末端與可選的鏈上毗鄰的核堿基是Watson-Crick堿基配對的。在這些鏈上，3’和5’末端不是末端核堿基。一種不是一條鏈的末端核堿基的3’末端或5’末端能夠如以上所描述地、選擇性地被一種空間保護(hù)劑取代以避開核酸酶的活性。在又一種選擇性的實(shí)施例中，一條鏈的一個(gè)末端核堿基與一個(gè)核堿基相連，該核堿基不與相應(yīng)鏈上的相應(yīng)核堿基配對并且不是一種鏈間接頭的一部分。該實(shí)施例具有一個(gè)帶有3’或5’“突出端”的“發(fā)夾”構(gòu)象?！巴怀龆恕辈糠种械奈磁鋵藟A基和其它成分不被認(rèn)為是一條鏈的一部分。該突出端部分可能包括自雜交的核堿基或非核堿基部分，如親和配基或標(biāo)記。在DMV的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施例中具有一個(gè)3’突出端，含有5’核堿基的鏈僅由脫氧型核堿基組成，它們同相對鏈上的脫氧型核堿基配對。在DMV的一個(gè)又進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施例中具有一個(gè)3’突出端，含有5’末端核堿基的鏈?zhǔn)遣煌?、想要的序列，而具有突出端的鏈的序列是靶DNA的序列。
本發(fā)明的一個(gè)尤其優(yōu)選的實(shí)施例是一種DMV，其中的兩條鏈并非完全互補(bǔ)。而且一條鏈的序列包括將被修飾的靶DNA的序列，另一條鏈的序列包括不同的、想要的、使用者意圖引入到靶序列位置上的序列。由此可見，在靶和想要的序列不同的核堿基處，一條鏈上的堿基與另一條鏈上的非互補(bǔ)堿基配對。這種DMV在本說明書稱為異源雙鏈突變載體(HDMV)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，想要的序列是一條被分開的鏈中的一段的序列。在第二個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，發(fā)現(xiàn)想要的序列是位于不含有核糖型核堿基的片段或鏈上。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，想要的序列是被分開的鏈中一個(gè)片段的序列，該片段不含有核糖型核堿基。
在又一個(gè)第二優(yōu)選的實(shí)施例中，CMV的第一條鏈不含有介于兩段核糖型核堿基片段之間的脫氧型核堿基的插入片段。在該實(shí)施例中，第二條鏈被分為第一段和第二段，該第一段由非核糖型核堿基組成，并且第一條鏈中與其配對的部分包括小于四個(gè)以及優(yōu)選的是不含有脫氧核糖型核堿基。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，第一鏈含有5’末端核堿基。又一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施例是具有依據(jù)以上所描述的單條核糖型片段的雙鏈突變載體，其中核糖型片段的序列是靶DNA的序列，不同的、想要的序列的序列是第一段的序列。6.2.核堿基間的鍵在一種DMV鏈上的核堿基之間的鍵可以是任何適合于DMV與其靶序列雜交的鍵。這些序列包括在天然核酸中發(fā)現(xiàn)的傳統(tǒng)磷酸二酯鍵。具有這種核苷的寡核苷酸的有機(jī)固相合成如美國專利編號(hào)Re:4,069中所描述。
可選地，核堿基間的鍵可以是取代的磷酸二酯，如硫代磷酸酯、取代的磷酸三酯?？蛇x地，可以使用非磷酸酯、含有磷的鍵。Letsinger的美國專利編號(hào)5,476,925描述了磷酸酰胺酯接頭。3’-磷酸酰胺酯鍵(3’-NP(O-)(O)0-5’)十分適合用于DMV，因?yàn)槠湎啾扔?’-磷酸酰胺酯能夠穩(wěn)定雜交。也可以采用核堿基之間的非磷酸酯鍵。美國專利編號(hào)5,489,677描述了具有毗鄰的N和O的核堿基間鍵以及它們的合成方法。鍵3’-ON(CH3)CH2-5’(亞甲基甲基亞氨基methylenemethylimmino)鍵是一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例。其它適合用于DMV中的鍵如Kmiec的美國專利編號(hào)5,731,181中所描述。缺乏一個(gè)戊糖呋喃糖基序且通過肽鍵連接的核堿基也可以用于本發(fā)明中。含有這種所謂的肽核酸(PNA)的寡核堿基如Nielsen的美國專利編號(hào)5,539,082中所描述。構(gòu)建PNA/核苷嵌合體的方法如WO95/14706中所描述。
對2’位置和核堿基間接頭的修飾的一個(gè)完整的回顧見Freier,S.M.,&Altmarm,K-H.,1997，核酸研究25,4429-4443。6.3.雙鏈突變載體的應(yīng)用雙鏈突變載體(DMV)尤其是非嵌合的突變載體可以被用于將變化引入到細(xì)胞內(nèi)的靶DNA序列上。DMV可以依據(jù)指導(dǎo)進(jìn)行使用并達(dá)到嵌合突變載體中所描述的目的。見，如Kmiec的WO97/41141及Kren,B.T.,等，1998，自然醫(yī)學(xué)4,285-290。
本發(fā)明進(jìn)一步包括了雙鏈突變載體的使用，包括具有轉(zhuǎn)化和重組/修復(fù)功能原核細(xì)胞中的嵌合突變載體。突變載體可以被用于在一種細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒上、細(xì)菌基因上或一種細(xì)菌人工染色體(BAC)上的DNA序列中進(jìn)行特定的變化。細(xì)菌人工染色體已經(jīng)基于細(xì)菌F因子復(fù)制起始點(diǎn)被構(gòu)建，Shizuya,H.,等，1992，自然遺傳學(xué)6.8794-8797；Hosoda,F.,等，1990，核酸研究18,3863-3869，或基于P-1質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)，Ioannou,P.A.,等，1994，自然遺傳學(xué)6,84-90。迄今為止，在一種BAC中引入特定的遺傳變化已經(jīng)需要構(gòu)建一種包括變化的質(zhì)粒，接著進(jìn)行兩次重組事件，Yang,X.W.,等，1997，自然生物技術(shù)15,859-865；Messerle,M.,等，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.94,14759-14763。商業(yè)上可供的基于P1的單拷貝BACpBeloBAC1I，其來自Genome Systems,St.Louis Mo.,適合用于本發(fā)明的該實(shí)施例中。
在細(xì)菌中使用突變載體要求該細(xì)菌具有功能的RecA和MutS基因。RecA功能可以是組成型的，或者可以通過一種與可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(如lac啟動(dòng)子)操作性連接的RecA基因提供，如pAC184□TETRecA中所顯示的。當(dāng)使用一種可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子時(shí)，RecA在細(xì)胞成為轉(zhuǎn)化感受態(tài)之前需要誘導(dǎo)僅約1小時(shí)，然后在電穿孔之后需要大約一小時(shí)。一種可誘導(dǎo)的RecA的采用對于特定的用途是優(yōu)選的，其中一種質(zhì)粒或一種細(xì)菌人工染色體可能由于RecA的連續(xù)存在遺傳上不穩(wěn)定。本工藝的熟練人員將理解一種顯性負(fù)RecA突變體(如在DH5α中所發(fā)現(xiàn)的)是不適合在本發(fā)明中使用的。出乎意料的是，突變載體的活性不能通過引入具有重組酶活性但缺乏其它功能的RecA突變體(如RecAPro67)而被恢復(fù)。
可以通過任何能夠被用于將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌的方法將突變載體引入到細(xì)菌中。在一個(gè)實(shí)施例中，該嵌合體通過電穿孔被引入。細(xì)胞可以通過用于質(zhì)粒的技術(shù)被制成電穿孔感受態(tài)。然后將突變載體和感受態(tài)細(xì)菌一起重懸在無菌的毫微極純度的水中，濃度為每108個(gè)細(xì)菌有10ng到10微克之間的載體。電穿孔在總體積為40微升中進(jìn)行。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，DMV通過電穿孔被引入到細(xì)菌內(nèi)。DMV，大約1-2毫克/毫升，與亞精胺(3nM到200nM之間)一起在室溫下、在2-4微升的體積中預(yù)溫孵，然后與細(xì)菌混合達(dá)到終體積為40微升，并電穿孔。優(yōu)選的亞精胺的濃度為5nM到50nM之間，最優(yōu)選的是10nM。不受理論的束約，這種亞精胺預(yù)溫孵在電穿孔之前使DMV黏附在細(xì)菌上，其被認(rèn)為能夠使定向突變的速度提高。取代亞精胺，可以采用精胺或等價(jià)的線性聚烷基胺。
以下表Ⅰ表示了在細(xì)菌內(nèi)空間突變的速度，和從HuH-7肝癌細(xì)胞系無細(xì)胞提取物獲得的速度之間的比較。然后將抽提處理的DMV電穿孔到RecA缺陷的細(xì)菌內(nèi)，并計(jì)算每個(gè)氨芐抗性的克隆中卡那抗性克隆的數(shù)目。比較顯示在抽提物活性和細(xì)菌系統(tǒng)活性之間存在明顯的相關(guān)。尤其，在兩種系統(tǒng)中，變體Ⅳ和Ⅵb均比Kany.y強(qiáng)，并且在兩種系統(tǒng)中具有3’外切酶防護(hù)末端的非嵌合型突變載體均是有活性的。唯一的不同是變體Ⅶ，其僅含有脫氧核糖核苷酸。變體Ⅶ在無細(xì)胞抽提物中是有活性的，但在細(xì)菌系統(tǒng)中沒有。脫氧寡核糖核苷酸也被發(fā)現(xiàn)在真核細(xì)胞中是無活性的。不受理論的束約，申請者們相信變體Ⅶ在無細(xì)胞系統(tǒng)中有活性是由于相比于含有細(xì)胞的系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中存在的核酸酶的量降低?；谶@些結(jié)果，細(xì)菌嵌合成形術(shù)(chimeraplasty)可以被用于檢測用于真核研究的重組誘發(fā)劑寡核堿基的不同結(jié)構(gòu)。
7．實(shí)施例7.1.材料和方法質(zhì)粒的構(gòu)建用于克隆的所有DNA片段和載體均通過凝膠電泳分離，并采用GenecteanⅡKit(BIORAD101)純化。PCR反應(yīng)的進(jìn)行如以下混合1-100ng靶或基因組DNA、5微升含Mg2+的10x緩沖液(Boehringer Manheim)、0.5微升25mM dNTPs、2.5單位Taq DNA聚合酶(Boehringer Manheim)、20pmal各引物，終體積為50微升。循環(huán)程序?yàn)?4℃持續(xù)5分鐘，接著是30個(gè)循環(huán)94℃持續(xù)30秒、55℃持續(xù)30秒、72℃持續(xù)30秒，接著是在72℃延伸7分鐘。為了構(gòu)建pWE15Kan5，在pWE15載體(Stratagene)的4021位核苷上引入單個(gè)的T→G點(diǎn)突變，其在卡那基因上引入了一個(gè)TAG終止密碼子和一個(gè)新的BfaⅠ位點(diǎn)。突變的卡那片段是從pWE15模板中使用以下的PCR引物構(gòu)建的SetA=Kan3910(5’CAGGGGATCA AGATCTGAT3’(序列編號(hào)1)-下劃線表示BglⅡ位點(diǎn))和Kan4010(5’CAGGGGATCAAGATCTGAT3’(序列編號(hào)2))SetB=Kan4014(5’TCGGCTAGGACTGGGCACA3’(序列編號(hào)3)-下劃線表示Bfal位點(diǎn)以及黑體表示突變位點(diǎn))以及Kan4594(5’TGATAGCGGTCCGCCACA3’(序列編號(hào)4)-下劃線表示RsrⅡ位點(diǎn)。)在用BglⅡ消化產(chǎn)物A和用RsrⅡ消化產(chǎn)物B之后，將兩種產(chǎn)物均用BfaⅠ消化并連接起來。將所得到的突變片段克隆到用BglⅡ和RsrⅡ線性化后的pWE15中，形成pWE15Kans。帶有pWE15Kans質(zhì)粒的大腸桿菌為卡那霉素敏感。
突變的pBR322質(zhì)粒，pBRTsΔ208，在208位上含有一個(gè)堿基刪除，其導(dǎo)致四環(huán)素基因的提早終止。該刪除通過如以上所描述的一種重疊的PCR程序構(gòu)建。帶有突變體的DNA產(chǎn)物的產(chǎn)生通過使用引物setA{5BR22(5’CATCGATAAGCTTTAATGC3’(序列編號(hào)5))和(3BRSPH5’CATAGTGACTGGCATGCTGTCGGA3’(序列編號(hào)6))}和引物setB{3BR496(5’GCTCATGAGCCCGAAGTGGC3’(序列編號(hào)7))和(5BRSPH 5’TCCGACAGCATGCCAGTCACTATG3’(序列編號(hào)8))}。將兩種產(chǎn)物在構(gòu)建的SphⅠ位點(diǎn)處連接起來。用HindⅢ和BamHⅠ消化所得到的片段并將其用于取代野生型pBR322質(zhì)粒內(nèi)的相似區(qū)域。堿基的刪除在208位構(gòu)建了一個(gè)SphⅠ位點(diǎn)。突變的pBR322質(zhì)粒，pBRTsm153(G)，在四環(huán)素基因的密碼子6上含有一個(gè)終止密碼子，該突變質(zhì)粒的構(gòu)建是通過一種重疊的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)程序，使用的片段混合物為PCR引物setA{(5BR(序列編號(hào)5))和3BRBfa(5’CGGCATAACCTAGCCTATGCC(序列編號(hào)9))}和引物setB[(3BR496(序列編號(hào)7))和5BRBfa(5’GGCTAGGTTATGCCGGTACTG3’(序列編號(hào)10))]?；旌袭a(chǎn)物的再擴(kuò)增采用了引物5BR22和3BR496。所得到的產(chǎn)物用HindⅢ和BamHⅠ消化并用于取代野生型pBR322質(zhì)粒內(nèi)的相似區(qū)域。在153位引入一個(gè)G形成了一個(gè)終止密碼子并引入了一個(gè)BfaⅠ消化位點(diǎn)。另外，在四環(huán)素基因325位上構(gòu)建一個(gè)A→G的沉默突變，以使得被改變過的質(zhì)?？梢院鸵吧偷膒BR322質(zhì)粒區(qū)別開來。含有pBRTsΔ208和pBRTsm153(G)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株為四環(huán)素敏感型。pET21aTR的制備通過將EcoRⅠ和StyⅠ片段克隆到類似酶切過的pET2la(+)(Novagen)載體上。pET21aTR能夠?qū)⑺沫h(huán)素抗性傳遞給大腸桿菌菌株。pET21aTsΔ208和pET21aTsm153的制備分別是通過用pBRTsm153(G)和pBRΔ208中的片段取代pET21aTR上的HindⅢ和SalⅠ區(qū)域。帶有pBRTsm153(G)和pBRΔ208的大腸桿菌對四環(huán)素敏感。
pAC184ΔTETRecA+的構(gòu)建pACYC184(New England Bio Labs)載體的四環(huán)素區(qū)域通過AvaⅠ和XbaⅠ的消化被除去并用一種AvaⅠ和XbaⅠ接頭取代{184delTet-1(5’TCGGAGGATCCAATCTCGAGTGCACTGAAAC3’(序列編號(hào)11))與184delTet-2(5’CTAGGTTTCAGTGCACTCGAGATTGGATCCT3’(序列編號(hào)12))}一起退火，以形成中間克隆載體pAC184TET。pAC184TETRecA和pAC184TETRecAm的制備是通過將克隆的RecA或RecAm產(chǎn)物克隆到pAC184TET的BclⅠ位點(diǎn)上。RecA或RecAm插入片段的制備是通過PCR擴(kuò)增pUCRRecA和pUCRRecAm，使用引物5RecALinkBC1I(5’GCGTGATCATGCACCATATGACGATTAAA3’(序列編號(hào)13)和3RecALinkBC1I(5’GCGTGATCAAGGAAGCGGAAGAGCGCCCA3’(序列編號(hào)14))。接頭定義的區(qū)域是分別含有LacO、pUC19的調(diào)控區(qū)域(XXX)、以及野生型RecA和RecA突變體(框內(nèi)刪除-除去氨基酸X到X)的編碼區(qū)域，框內(nèi)含LacZ基因的前五個(gè)氨基酸。
pAC184ΔTETRec變體的構(gòu)建；RecA突變體的編碼區(qū)域的的序列以前已被描述(REF)。pAC184ΔTETRec67、pAC184ΔTETRec616和pAC184ΔTETRec659的制備是通過四個(gè)引物PCR反應(yīng)，使用引物(recAxba-rec67A、rec67B、recAndeI、recA616A、recA616B、RecA659A、RecA659B)。將含有特定突變的Xbal/NdeⅠ片段克隆到pAC184ΔTETRec的Xbal/NdeⅠ盒內(nèi)。分離陽性克隆并進(jìn)行序列測定。
pAC184ΔTETmutS的構(gòu)建MutS基因從由大腸桿菌DH5α中分離的基因組DNA中通過PCR被擴(kuò)增，使用引物MutS5’XbaⅠ(5’GCGTCTAGAGATGAGTGCAATAGAAAATTT3’(序列編號(hào)15)和MutS3’AseⅠ(5’GCGATTAATTTACACCAGACTCTTCAAGC3’(序列編號(hào)16)。MutS PCR產(chǎn)物的純化采用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)，并連接到pGEM-T載體(Promega)內(nèi)以完成pGEM mutS載體的定向TA克隆。通過序列測定鑒定了完整的野生型MutS編碼區(qū)域。將MutS XbaⅠ和AseⅠ插入片段連接到XbaⅠ和NdeⅠ消化的pAC184ΔTetRecA表達(dá)載體上，其取代了MutS的RecA編碼區(qū)域。
細(xì)菌菌株及基因型、培養(yǎng)基、和生長條件用于本研究的大腸桿菌菌株包括RR1、MC1061、WM1100、BMS71-18、和EMSOmutS。細(xì)胞在LB肉湯或LB平板中生長(10)。其中合適的細(xì)胞在以下抗生素的存在下生長卡那霉素(50微克/毫升)、氨芐青霉素、四環(huán)素、氯霉素。為了質(zhì)粒或嵌合體的轉(zhuǎn)染，如以上所描述的(11)使細(xì)胞本質(zhì)上為電感受態(tài)。簡要地，細(xì)胞在LB中生長達(dá)到OD600為0.5-0.7，通過離心(3000Xg,4℃,10分鐘)濃縮達(dá)到初始體積的1/10th，在冰浴的毫微極純度H2O中清洗幾次(4-5)。在最后一次清洗時(shí)，將細(xì)菌沉淀重懸在初始體積的1/500th的水中(對于立即使用)或15％甘油中(在-80℃凍存)。將電感受態(tài)的細(xì)胞立即凍存或放置在冰上直至電穿孔(直到24小時(shí))。
嵌合體的轉(zhuǎn)染含有pWE15Kans(用于靶向卡那霉素基因的轉(zhuǎn)化)、pET21aTsm153(G)或pBR322TsΔ208(用于靶向四環(huán)素基因的轉(zhuǎn)化)的、電感受態(tài)的大腸桿菌菌株MC1061、WM100和RR1分別用1-2微克嵌合的Kany.y、Tetm153或TETΔ208轉(zhuǎn)染，使用標(biāo)準(zhǔn)的電穿孔條件，2.5kV,25F,200 Ohms。在電穿孔之后，立刻將細(xì)胞在1毫升SOC(12)存在下生長、在37℃溫和振蕩1小時(shí)。我們改變轉(zhuǎn)染之后的孵育時(shí)間，以使得在抗生素篩選之前有足夠的時(shí)間進(jìn)行靶向基因的轉(zhuǎn)化。典型地，在SOC培養(yǎng)基中復(fù)蘇之后，再將全部的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入4毫升含有10微克/毫升卡那(Sigma)的LB肉湯中，在37℃振蕩90分鐘。然后將1毫升這種培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入4毫升含有50微克/毫升卡那(Sigma)的LB肉湯中，在37℃振蕩3小時(shí)，在此之后將一滴(100微升)在含有50微克/毫升卡那的LB瓊脂中涂板并在37℃孵育過夜。如以前所描述的，對于每個(gè)細(xì)菌菌株和每個(gè)電穿孔條件，都將繪制出殺死曲線。質(zhì)粒DNA的分析在嵌合處理之后從卡那抗性克隆中分離出來的質(zhì)粒DNA，被用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)菌。細(xì)菌在含有氨芐的LB平板中生長以確定總細(xì)菌，并在含有卡那或四環(huán)素的LB平板中生長以進(jìn)行轉(zhuǎn)化挑選。典型地，從一個(gè)原代分離菌落中分離3-5個(gè)繼代分離菌落并通過RFLP分析。在三次重新涂板之后保留了兩組等位基因，證明了從單個(gè)細(xì)菌進(jìn)化來的克隆包括了轉(zhuǎn)化的和突變的質(zhì)粒的混合物，將其亞克隆并通過測序或限制性酶切進(jìn)行分析。7.2.結(jié)果用于引入卡那抗性的雙鏈突變載體的普遍結(jié)構(gòu)如以下所給出。插入片段、3’同源區(qū)域、以及5’同源區(qū)域分別定為“Ⅰ”、“H-3”和“H-5”。鏈間接頭定為“L”。一種選擇性的chi位點(diǎn)(5’-GCTGGTGG-3’)及其互補(bǔ)序列分別定為X和X’。3’和5’突變子區(qū)域?yàn)閱蝹€(gè)的核苷，分別定為M3’和M5’。變體Ⅰ類似于如Cole-Strauss,1996，科學(xué)273,1386，以及Kren,1998，自然醫(yī)學(xué)4,285-290中所描述的嵌合突變載體。變體Ⅰ在本說明書中是指別處的Kany.y*.對于一種變體特征的符號(hào)“-”表示該變體的特征同變體Ⅰ相同。 以上DMV引起一個(gè)CG轉(zhuǎn)換，其將一個(gè)TAG終止密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)TAC tyr密碼子。注意Ⅰ的第一條鏈缺少一個(gè)外切酶防護(hù)的3’末端，以及Ⅰ的第二條鏈?zhǔn)且粭l被分開的鏈，其第一段是想要的、不同的序列。變體Ⅳ和Ⅴ分別是一種嵌合突變載體和一種非嵌合突變載體，具有由一段核酸酶抗性接頭(2’OMe-U4)提供的3’末端核酸酶防護(hù)。變體Ⅵa和Ⅵb是嵌合的異源雙鏈突變載體。變體Ⅵb是一種在其中想要的、不同的鏈被發(fā)現(xiàn)是在第一段上的變體，該段僅含有DNA-型核苷。
以下表中給出了在一種細(xì)菌系統(tǒng)中，與變體Ⅰ相關(guān)的變體的活性，并給出了一種無細(xì)胞抽提物轉(zhuǎn)變成kanr/105的頻率。與實(shí)驗(yàn)值相比，背景速度是可以忽略的，除了無細(xì)胞系統(tǒng)和細(xì)菌系統(tǒng)中的變體Ⅵa以及細(xì)菌中的變體Ⅶ。對這些變體所報(bào)道的數(shù)據(jù)是背景校正過的。變體Ⅵa和Ⅶ表現(xiàn)出低或無活性。各個(gè)變體Ⅲ-Ⅴ在兩種系統(tǒng)中均強(qiáng)于Ⅰ，Ⅰ屬于在本文中以上所引用的Yoon,Cole-Strauss和Kren的科學(xué)出版物中所描述的類型?；趶倪@些數(shù)據(jù)中的推論，變體Ⅷ是最理想的嵌合體。
*位點(diǎn)特異性速度來自一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)、與其它數(shù)據(jù)一起標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果突變的速度可以通過比較卡那抗性(突變的)和氨芐抗性菌落進(jìn)行確定。在電穿孔以后(采用的是每108個(gè)MC1061細(xì)胞用1微克和2微克突變載體，沒有加入亞精胺)，變體Ⅳ導(dǎo)致一種質(zhì)粒的突變?yōu)橛谢盍Φ募?xì)菌的1％到2％之間。無法確定突變的絕對速度，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)菌含有多個(gè)pWE15Kans質(zhì)粒的拷貝。對于每個(gè)變體，質(zhì)粒從所挑選的卡那抗性克隆中制備、細(xì)菌轉(zhuǎn)化及挑選卡那抗性。從這些繼代轉(zhuǎn)染體中制備質(zhì)粒是同源的。繼代轉(zhuǎn)染體的質(zhì)粒的序列顯示變體Ⅵa和Ⅶ之外所有的預(yù)期的序列。
作為重組誘發(fā)劑寡核堿基量的一種函數(shù)，轉(zhuǎn)化的速度沒有表現(xiàn)出極限。以0.01微克/108細(xì)菌及10、100和1000倍的劑量使用變體Ⅰ的實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出，在電穿孔之后每105個(gè)有活力的細(xì)菌中有5、11、56和320個(gè)轉(zhuǎn)化菌落。用TetΔ208T和Tet153觀察到的速度分別為，在類似的濃度條件下大約低于用變體Ⅰ所觀察到的速度的10倍和2倍。
變體ⅠDMV和10nM亞精胺一起預(yù)誘導(dǎo)導(dǎo)致初級(jí)卡那抗性克隆的數(shù)目大約進(jìn)一步提高八倍。在100nM亞精胺中也可以見到提高，然而，在1nM中沒有明顯提高，而1.0mM則為抑制劑。
變體Ⅱ含有一個(gè)細(xì)菌chi位點(diǎn)(5’GCTGGTG3’)，其插入到顯示為X和X’的H-5’和接頭之間。用chi位點(diǎn)取代最3’端的核苷(5’CGCGC3’)導(dǎo)致一種活力小于變體Ⅰ的三分之一的突變載體的產(chǎn)生。
構(gòu)建并檢測兩種四環(huán)素特異性的DMV。TetΔ208T引起了一個(gè)T的插入，其糾正了一個(gè)移碼突變。Tet153引起了一個(gè)AT轉(zhuǎn)換，其將一個(gè)TAG終止密碼子轉(zhuǎn)換成了一個(gè)TTG亮氨酸密碼子。四環(huán)素抗性嵌合突變載體的結(jié)構(gòu)如以下所給出TetΔ208T Tet153
序列清單(1)一般信息(ⅰ)申請者Kumar,RameshMetz,RichardDiCola,MichaelThompson,Naomi(ⅱ)發(fā)明題目雙鏈突變載體及其在細(xì)菌系統(tǒng)中的使用方法(ⅲ)序列數(shù)目20(ⅳ)聯(lián)系地址(A)地址Kimeragen,Inc.
(B)街道300Pheasant Run(C)城市Newtown(D)州PA(E)國家美國(F)郵編18940(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型Diskette(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)DOS(D)軟件用于Windows版本2.0的FastSEQ(ⅵ)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請編號(hào)(B)提交日期(C)分類(ⅶ)以前申請數(shù)據(jù)(A)申請編號(hào)(B)提交日期(ⅷ)代理人/代理商信息(A)姓名Hansburg,Daniel
(B)登記編號(hào)36156(C)參考/摘要編號(hào)799-036-888(ⅸ)遠(yuǎn)距離交流信息(A)電話215-504-4444(B)電傳215-504-4545(C)電報(bào)(2)序列編號(hào)1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)1CAGGGGATCA AGATCTGAT19(2)序列編號(hào)2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)2CCCAGTCCTA GCCGAATAG19(2)序列編號(hào)3的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)3TCGGCTAGGA CTGGGCACA19(2)序列編號(hào)4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)4TGATAGCGGT CCGCCACA18(2)序列編號(hào)5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)5
CATCGATAAG CTTTAATGC19(2)序列編號(hào)6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)6CATAGTGACT GGCATGCTGT CGGA24(2)序列編號(hào)7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)7GCTCATGAGC CCGAAGTGGC20(2)序列編號(hào)8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度24個(gè)堿基對(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)8TCCGACAGCA TGCCAGTCAC TATG24(2)序列編號(hào)9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)9CGGCATAACC TAGCCTATGC C21(2)序列編號(hào)10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)10GGCTAGGTTA TGCCGGTACT G21
(2)序列編號(hào)11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)11TCGGAGGATC CAATCTCGAG TGCACTGAAA C31(2)序列編號(hào)12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度31個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)12CTAGGTTTCA GTGCACTCGA GATTGGATCC T31(2)序列編號(hào)13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)13GCGTGATCAT GCACCATATG ACGATTAAA29(2)序列編號(hào)14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)14GCGTGATCAA GGAAGCGGAA GAGCGCCCA29(2)序列編號(hào)15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)15GCGTCTAGAG ATGAGTGCAA TAGAAAATT30(2)序列編號(hào)16的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度29個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)16GCGATTAATT TACACCAGAC TCTTCAAGC29(2)序列編號(hào)17的信息(ⅰ)序列特征(A)長度84個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)17GCTATTCGGC TASGACTGGG CACAAGCTGG TGGTTTTCCA CCAGCTTGTG CCCAGTCSTA60GCCGAATAGC GCGCGTTTTC GCGC84(2)序列編號(hào)18的信息(ⅰ)序列特征(A)長度68個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它
(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)18GCTATTCGGC TASGACTGGG CACAATTTTT TGTGCCCAGT CSTAGCCGAA TAGCGCGCGT60TTTCGCGC68(2)序列編號(hào)19的信息(ⅰ)序列特征(A)長度68個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)19TTCCGACAGC ATTGCCAGTC ACTATTTTTA TAGTGACTGG CAATGCTGTC GGAAGCGCGT60TTTCGCGC68(2)序列編號(hào)20的信息(ⅰ)序列特征(A)長度68個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型；其它(ⅹⅰ)序列描述序列編號(hào)20TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTTTTTA CCGGCATAAC CAAGCCTATG CCTAGCGCGT60TTTCGCGC
權(quán)利要求
1．一種雙鏈突變載體包括a．第一條至少12個(gè)相連的核堿基以及不超過75個(gè)相連的核堿基的寡核堿基鏈，該鏈具有一個(gè)第一末端和一個(gè)第二末端核堿基；b．第二條具有一個(gè)最3’端的核堿基和一個(gè)最5’端的核堿基、并且具有與第一條鏈相等數(shù)目的核堿基的寡核堿基鏈，這第二條鏈視需要而定地被分為第一段和第二段；以及c．一個(gè)3’末端核堿基和一個(gè)5’末端核堿基；其中?。诙l鏈的最3’端的和最5’端的核堿基分別與第一條鏈的第一末端和第二末端核堿基為Watson-Crick堿基配對，ⅱ上述最3’端的核堿基和上述第二末端核堿基是被保護(hù)以免受3’核酸外切酶攻擊的，以及ⅲ第二條鏈至少含有兩個(gè)至少為5個(gè)連續(xù)核堿基的非重疊區(qū)域，它們與第一條鏈的核堿基為Watson-Crick堿基配對，其前提是不多于兩個(gè)毗鄰的Watson-Crick堿基對是由一個(gè)核糖型核堿基和脫氧核糖型核堿基組成的。
2．如權(quán)利要求1中所述的載體，其中第一條鏈至多包括60個(gè)核堿基。
3．如權(quán)利要求1中所述的載體，其中第一條鏈和第二條鏈至多包括2個(gè)毗鄰的核糖型核堿基。
4．如權(quán)利要求1中所述的載體，其中一個(gè)末端核堿基在通過一個(gè)核酸酶抗性接頭與最3’端的或最5’端的核堿基相連，籍此使一個(gè)核堿基免受3’核酸外切酶的攻擊。
5．如權(quán)利要求4中所述的載體，其中核酸酶抗性接頭包括一個(gè)選自以下群體的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
6．如權(quán)利要求4中所述的載體，其中一級(jí)末端和二級(jí)末端核堿基通過核酸酶抗性接頭與最3’端的和最5’端的核堿基相連。
7．如權(quán)利要求6中所述的載體，其中核酸酶抗性接頭包括一個(gè)選自以下群體的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-芪甲酰胺。
8．如權(quán)利要求1中所述的載體，其中第二條鏈或第一段不含有RNA型核堿基。
9．如權(quán)利要求1中所述的載體，其中3’末端核堿基通過一個(gè)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)免受3’核酸外切酶的作用。
10．一種異源雙鏈突變載體包括a．第一條至少12個(gè)相連的核堿基以及不超過75個(gè)相連的核堿基的寡核堿基鏈，該鏈具有一個(gè)第一和一個(gè)第二末端核堿基；b．第二條具有一個(gè)最3’端和一個(gè)最5’端的核堿基、并且具有與第一條鏈相等數(shù)目的核堿基的寡核堿基鏈，這第二條鏈視需要而定地被分為第一段和第二段；以及c．第一3’末端核堿基和一個(gè)5’末端核堿基；其中ⅰ．第二條鏈的最3’端的和最5’端的核堿基分別與第一條鏈的第一末端和第二末端核堿基為Watson-Crick堿基配對，ⅱ第二條鏈的最3’端的核堿基和第一條鏈的第二末端核堿基是被保護(hù)以免受3’核酸外切酶攻擊的，以及ⅲ第二條鏈至少含有兩個(gè)至少為5個(gè)連續(xù)核堿基的非重疊區(qū)域，它們與第一條鏈的核堿基為Watson-Crick堿基配對，前提是第一條鏈至少有一個(gè)核堿基與第二條鏈的非互補(bǔ)核堿基配對。
11．如權(quán)利要求10中所述的載體，其中第一條鏈至多包括50個(gè)核堿基。
12．如權(quán)利要求10中所述的載體，其中第一條鏈至多有3個(gè)核堿基與第二條鏈的非互補(bǔ)核堿基配對。
13．如權(quán)利要求12中所述的載體，其中非互補(bǔ)的核堿基是脫氧核糖型核堿基。
14．如權(quán)利要求12中所述的載體，其中第一條鏈至多有一個(gè)核堿基與第二條鏈的非互補(bǔ)核堿基配對。
15．如權(quán)利要求12中所述的載體，其中第二條鏈由一個(gè)第一段和一個(gè)第二段組成，并且第一段包括一個(gè)錯(cuò)配的核堿基。
16．如權(quán)利要求15中所述的載體，其中第一段不含有核糖型核堿基。
17．如權(quán)利要求15中所述的載體，其中第一段含有5’末端核堿基。
18．如權(quán)利要求12中所述的載體，其中第一條鏈含有至少10個(gè)核糖型寡核堿基。
19．如權(quán)利要求18中所述的載體，其中第一條鏈不含有脫氧核糖型寡核堿基。
20．如權(quán)利要求10中所述的載體，其中最5’端的核堿基通過一段核酸酶抗性接頭與第二末端核堿基相連，籍此使得上述第二末端核堿基被保護(hù)免受3’核酸外切酶的攻擊。
21．如權(quán)利要求10中所述的載體，其中最3’端的核堿基通過一段核酸酶抗性接頭與第一末端核堿基相連，籍此使得上述3’末端核堿基被保護(hù)免受3’核酸外切酶的攻擊。
22．如權(quán)利要求21中所述的載體，其中最5’端的核堿基通過一段核酸酶抗性接頭與第二末端核堿基相連，籍此使得上述第二末端核堿基被保護(hù)免受3’核酸外切酶的攻擊。
23．如權(quán)利要求21中所述的載體，其中的接頭包括選自以下群體的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
24．如權(quán)利要求10中所述的載體，其中第一段不含有核糖型核堿基。
25．如權(quán)利要求10中所述的載體，其中3’末端核堿基通過一個(gè)保護(hù)基團(tuán)被保護(hù)免受3’核酸外切酶的攻擊。
26．一種不具有插入片段的嵌合雙鏈突變載體包括；a．第一條至少12個(gè)相連的核堿基以及不超過75個(gè)相連的核堿基的寡核堿基鏈，該鏈具有一個(gè)第一和一個(gè)第二末端核堿基；b．第二條具有一個(gè)最3’端和一個(gè)最5’端的核堿基、并且具有與第一條鏈相等數(shù)目的核堿基的寡核堿基鏈，這第二條鏈被分為第一段和第二段；以及c．一個(gè)3’末端核堿基和一個(gè)5’末端核堿基；其中ⅰ．第二條鏈的最3’端的和最5’端的核堿基分別與第一條鏈的第一末端和第二末端核堿基為Watson-Crick堿基配對，ⅱ第一段的核堿基為脫氧型核堿基，并且第一條鏈中與之配對的核堿基為核酸酶抗性核糖型核堿基，ⅲ第二條鏈至少含有兩個(gè)至少為5個(gè)連續(xù)核堿基的非重疊區(qū)域，它們與第一條鏈的核堿基為Watson-Crick堿基配對。
27．如權(quán)利要求26中所述的載體，其中第一段含有5’末端核堿基。
28．如權(quán)利要求27中所述的載體，其中第一段中至多有一個(gè)核堿基是與第一條鏈中的非互補(bǔ)核堿基配對的。
29．如權(quán)利要求26中所述的載體，其中最3’端的核堿基和第一末端核堿基通過一個(gè)接頭連接，該接頭含有選自以下群體的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
30．如權(quán)利要求26中所述的載體，其中最5’端的核堿基和第二末端核堿基通過一個(gè)接頭連接，該接頭含有選自以下群體的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
31．一種不具有插入片段的含有一段突出端的嵌合雙鏈突變載體包括a．第一條至少12個(gè)相連的核堿基以及不超過75個(gè)相連的核堿基的寡核堿基鏈，該鏈具有一個(gè)第一和一個(gè)第二末端核堿基；以及b．一段具有一個(gè)最3’端的核堿基和一個(gè)5’末端核堿基的寡核堿基；以及c．一段加在第二末端核堿基上的3’突出端；其中ⅰ．該段的最3’端的和5’末端核堿基分別與第一條鏈的第一末端和第二末端核堿基為Watson-Crick堿基配對，ⅱ該段的核堿基為脫氧型核堿基，并且該鏈中與之配對的核堿基為核酸酶抗性核糖型核堿基，ⅲ第二條鏈至少含有兩個(gè)至少為5個(gè)連續(xù)核堿基的非重疊區(qū)域，它們與第一條鏈的核堿基為Watson-Crick堿基配對。
32．如權(quán)利要求31中所述的載體，其中第一段中至少有一個(gè)核堿基與第一條鏈中的非互補(bǔ)核堿基配對。
33．如權(quán)利要求32中所述的載體，其中第一段中至多有一個(gè)核堿基與第一條鏈中的非互補(bǔ)核堿基配對。
34．如權(quán)利要求31中所述的載體，其中最3’端的核堿基和第一末端核堿基通過一個(gè)接頭連接，該接頭包括一個(gè)選自以下群體的部分，其包括2’-甲氧基-尿苷、2’-烯丙氧基-尿苷、2’-氟-尿苷、2’-甲氧基-胸苷、2’-烯丙氧基-胸苷、2’-氟-胸苷、聚乙二醇和反式-4,4’-茋甲酰胺。
35．一種在一種細(xì)菌內(nèi)將一段靶DNA序列轉(zhuǎn)換成一段不同的、想要的序列的方法，其包括在該細(xì)菌中引入一種雙鏈突變載體，該載體包括a．第一條至少12個(gè)相連的核堿基以及不超過75個(gè)相連的核堿基的寡核堿基鏈，該鏈具有一個(gè)第一和一個(gè)第二末端核堿基；b．第二條與第一條鏈具有相等數(shù)目的核堿基的寡核堿基鏈；以及，該鏈視需要而定地分為第一段和第二段。c．一個(gè)3’末端核堿基和一個(gè)5’末端核堿基，其中?。诙l鏈的最3’端的和最5’端的核堿基分別與第一末端和第二末端核堿基為Watson-Crick堿基配對，以及ⅱ第二條鏈至少含有兩個(gè)至少為5個(gè)連續(xù)核堿基的非重疊區(qū)域，它們與第一條鏈的核堿基及3’末端或5’末端核堿基為Watson-Crick堿基配對；其中至少有一條鏈的序列包含不同的、想要的序列。
36．如權(quán)利要求35中所述的方法，其中第二條鏈的最3’端的核堿基被保護(hù)避免3’核酸外切酶的攻擊。
37．如權(quán)利要求35中所述的方法，其中第一條鏈的第二末端核堿基被保護(hù)避免3’核酸外切酶的攻擊。
38．如權(quán)利要求35中所述的方法，其中第一條鏈中至少有一個(gè)堿基與第二條鏈的非互補(bǔ)核堿基配對。
39．如權(quán)利要求38中所述的方法，其中突變的寡核堿基鏈的序列包括靶DNA的序列，以及包括不同的、想要的序列的寡核堿基鏈的序列。
40．如權(quán)利要求39中所述的方法，其中第一條鏈的序列包括靶DNA的序列，以及第二條鏈包括5’末端核堿基。
41．如權(quán)利要求39中所述的方法，其中第一條鏈的序列包括靶DNA的序列，以及第二條鏈不包括核糖型核堿基。
42．如權(quán)利要求35中所述的方法，其進(jìn)一步包括在細(xì)菌中瞬時(shí)產(chǎn)生功能RecA的步驟。
43．如權(quán)利要求35中所述的方法，其中一個(gè)末端核堿基和一個(gè)遠(yuǎn)端核堿基被保護(hù)避免3’核酸外切酶的攻擊。
44．如權(quán)利要求35中所述的方法，其中DNA靶序列是一種細(xì)菌人工染色體或一種質(zhì)粒的序列。
45．一種核酸，包括RecA基因操作性地與一種可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子連接。
46．一種細(xì)菌，包含如權(quán)利要求45中所述的核酸。
全文摘要
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)重組誘發(fā)劑寡核堿基在含有一段鏈轉(zhuǎn)移活性(RecA)和錯(cuò)配修復(fù)活性(MurS)的原核細(xì)胞中是有活性的。采用該系統(tǒng),一類術(shù)語為異源雙鏈突變載體的雙鏈突變載體,在原核細(xì)胞中表現(xiàn)出比以前所檢測的多種類型的突變載體的活性更高。通過將一段核酸酶抗性的寡核苷酸(如四－2’－O－甲基－尿苷)替代四胸苷接頭,來連接重組誘發(fā)劑的寡核苷酸的兩條鏈并除去含有DNA的插入片段,得到了活性的進(jìn)一步提高。本權(quán)利要求涉及含有以上優(yōu)點(diǎn)的雙鏈突變載體上。在一個(gè)可選的實(shí)施例中,本權(quán)利要求涉及雙鏈突變載體在原核細(xì)胞中的使用。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1309721SQ99808541
公開日2001年8月22日 申請日期1999年5月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月12日
發(fā)明者R·庫馬, R·A·梅茨 申請人:金默拉根有限公司