專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)表達(dá)嘌呤二氫吲哚蛋白修飾谷類(lèi)籽粒硬度的制作方法
背景技術(shù)：
谷類(lèi)，包括小麥(Triticum aestivum L.em Thell.)，是世界上最重要的糧食作物。除了用于飼喂家畜外，在幾乎每一種文化中，谷類(lèi)籽粒都被磨成面粉。小麥面粉被發(fā)現(xiàn)在世界上廣泛使用但特別在歐洲及北美使用，水稻粉廣泛用于亞洲，高粱粉用于非洲，而玉米粉(或玉米片)用于美洲。
谷類(lèi)植物籽粒在種間及種內(nèi)有變化。谷粒結(jié)構(gòu)指核仁(穎果)的結(jié)構(gòu)，也就是說(shuō)，胚乳在物理上是柔軟還是堅(jiān)硬。通常地，水稻，高粱，大麥及玉米是堅(jiān)硬結(jié)構(gòu)的籽粒而燕麥，黑麥及黑小麥?zhǔn)侨彳浀摹缀跏澜缟先康男←溕a(chǎn)及貿(mào)易(分別約550及100mmt每年)以柔軟或者堅(jiān)硬來(lái)鑒定。一般來(lái)說(shuō)，硬質(zhì)小麥用于制作面包而軟質(zhì)小麥用于制作餅干，蛋糕及糕點(diǎn)(Morris & Rose，谷粒品質(zhì)，Chapman & Hall，紐約，NY,3-54頁(yè)(1996))。非常堅(jiān)硬的硬質(zhì)小麥(T.turgidum)通常用于食用面糊。
除在味道及水吸收方面的不同外，谷粒結(jié)構(gòu)也支配著磨制技術(shù)。典型地，谷粒愈硬，磨制時(shí)亦需要愈多能量，在磨制過(guò)程中淀粉損失越多，磨制后的顆粒大小越大。
一種負(fù)責(zé)谷粒柔軟的15kDa標(biāo)記蛋白，稱(chēng)作friabilin，在軟質(zhì)小麥水洗后的淀粉(water-washed starch)表面大量存在，在硬質(zhì)小麥淀粉中小量存在，在堅(jiān)硬小麥淀粉中(durum wheat starch)不存在(Greenwell& Schofield，谷類(lèi)化學(xué)，63:379-380(1986))。對(duì)friabilin N-末端序列分析表明其為兩或更多獨(dú)立的多肽組成的混合物(Morris等，谷類(lèi)科學(xué)雜志，21:167-174(1994)；和Jolly等，遺傳學(xué)理論及應(yīng)用，86:589-597(1993))。已發(fā)現(xiàn)兩個(gè)主要成份多肽與兩個(gè)分別稱(chēng)作嘌呤二氫吲哚A(puro A)及嘌呤二氫吲哚B(puro B)的脂結(jié)合蛋白相同(Gantier等，植物分子生物學(xué)，25:43-57(1994))。puro A及puroB的轉(zhuǎn)錄物由染色體5D控制(Giroux & Morris，遺傳學(xué)理論及應(yīng)用，95:857-864(1997))。
puro A及puro B在植物蛋白中是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈兏缓彼幔H脂的疏水結(jié)構(gòu)域(Blochet等，Gluten proteins 1990,Bushuk & Tkachuk(編)，美國(guó)谷類(lèi)化學(xué)家協(xié)會(huì)，St.Paul,MN,314-325頁(yè)(1991)；及Wilde等，農(nóng)業(yè)研究，20:971(1993))。friabilin(puro A及puro B)與淀粉顆粒表面的聯(lián)系明顯地通過(guò)極性脂類(lèi)介導(dǎo)。事實(shí)上，膜結(jié)構(gòu)脂類(lèi)，糖脂及磷脂在水洗淀粉表面的出現(xiàn)與friabilin一樣(Greenblatt等，谷類(lèi)化學(xué)，72:172-176(1995))在軟質(zhì)小麥淀粉中存在量很高，硬質(zhì)小麥淀粉中存在數(shù)量低，在堅(jiān)硬小麥淀粉中不存在。
存在的需求是比通過(guò)雜交育種獲得更確定地獲得對(duì)谷類(lèi)植物籽粒結(jié)構(gòu)的修飾。雜交育種時(shí)，有可能親本植物是生殖不相容的。也有這種非常真實(shí)的可能性，即為產(chǎn)生一種雜交植物，需要大量的水，化肥及大面積土地。通過(guò)用改變谷粒結(jié)構(gòu)的核酸序列創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因植物，這些問(wèn)題就能夠避免。本發(fā)明滿(mǎn)足了這種及其它需要。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明鑒定了在小麥(Triticum aestivum)中作為籽粒柔軟度主要成份的puro A及puro B。本發(fā)明也提供向小麥及其它谷類(lèi)植物中引入嘌呤二氫吲哚基因(puroindoline gene)及其同源基因修飾谷粒結(jié)構(gòu)的方法。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供一種從至少一個(gè)具有硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的親本植物產(chǎn)生具有更軟結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法包括引入一種核酸序列的步驟，核酸序列能在嚴(yán)格的條件下與從由SEQ IDNO:1及SEQ ID NO:3組成的組中選擇出的核酸序列雜交，并且可操作地編碼進(jìn)入親本植物細(xì)胞中的嘌呤二氫吲哚蛋白，從含有該核酸序列的細(xì)胞產(chǎn)生植株。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該植物從由硬質(zhì)小麥(durum wheat)，高粱，水稻，大麥及玉米組成的組中選出。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該植物是玉米。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸導(dǎo)入由農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)感染介導(dǎo)。也是在該實(shí)施方案中，嘌呤二氫吲哚蛋白從由puro A及puro B組成的組中選出是優(yōu)選的。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了產(chǎn)生具有硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中該植物來(lái)自具有軟結(jié)構(gòu)籽粒的至少一個(gè)親本植物。該方法包含引入阻止嘌呤二氫吲哚蛋白或同系物表達(dá)進(jìn)親本植物細(xì)胞的核酸序列并從該細(xì)胞產(chǎn)生植株的步驟。在該實(shí)施方案特別優(yōu)選的方面，此植物從由小麥，黑麥，黑小麥及燕麥組成的組中選出。
在該實(shí)施方案的另一個(gè)優(yōu)選的方面是向細(xì)胞中引入核酸序列并通過(guò)可操作地編碼核酶來(lái)阻抑puro A或puro B的表達(dá)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸序列可操作地編碼在嚴(yán)格條件下能與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3互補(bǔ)的核酸序列雜交的反義核酸。依賴(lài)于谷類(lèi)植物，核酸能可操作地編碼一種轉(zhuǎn)座子。本發(fā)明的另一方面，核酸序列通過(guò)農(nóng)桿菌感染引入植物中。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種產(chǎn)生具有硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中該植物來(lái)源于至少一個(gè)具有軟質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的親本植物。此方法包含向親本植物細(xì)胞中引入核酸序列的步驟，其中，該核酸序列能夠在嚴(yán)格的條件下與SEQ ID NO:5所示的核酸序列雜交并且從該細(xì)胞產(chǎn)生植株。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，此植物從由小麥、黑麥、黑小麥及燕麥組成的組中選出。在這個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面，核酸序列通過(guò)農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)感染引入植物中。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種具有軟質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物。此植物來(lái)源于至少一種具有硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的親本植物。該植物包含一種可操作地編碼嘌呤二氫吲哚蛋白的核酸序列，其中該核酸序列能在嚴(yán)格的條件下與從由SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:3組成的組中選出的核酸序列雜交。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該植物從由堅(jiān)硬小麥(durumwheat)，高粱，水稻，大麥及玉米組成的組中選出。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該植物是玉米。
在這個(gè)實(shí)施方案中，嘌呤二氫吲哚(puroindoline)核酸序列通過(guò)轉(zhuǎn)化引入植物并且嘌呤二氫吲哚蛋白從由puro A及puro B組成的組中選出。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化通過(guò)農(nóng)桿菌屬感染完成。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種具有硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物。此植物從至少一種具有軟質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒且包含一種阻止嘌呤二氫吲哚蛋白表達(dá)的核酸序列的親本而得來(lái)。在該實(shí)施方案的一個(gè)特別優(yōu)選的方面，子代植物從由小麥，黑麥，黑小麥及燕麥組成的組中選出。
本實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面，核酸序列被引入一種小麥細(xì)胞中并通過(guò)可操作地編碼一種核酶或轉(zhuǎn)座子以阻止puro A或puro B的表達(dá)。然而，此核酸序列可操作地編碼一種能與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3互補(bǔ)的序列雜交的反義核酸是優(yōu)選的。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸序列通過(guò)農(nóng)桿菌屬感染引入植物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種具有硬質(zhì)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物，它來(lái)源于至少一個(gè)軟質(zhì)籽粒的親本。該植物包含在嚴(yán)格條件下能與由SEQ ID NO:5組成的組中選出的核酸序列雜交的核酸序列。
圖2A是83硬/軟染色體5D重組體及親本SKCS單谷粒硬度讀數(shù)頻率分布直方圖，“Chinese spring”(CS)及“Chinese spring”替代Cheyenne5D(CS(CNN5D))。讀數(shù)為每?jī)蓚€(gè)位點(diǎn)的兩份的平均數(shù)。親代CS及CS(CNN5D)的值分別為60及79。圖2B圖示反映了SKCS單谷粒相對(duì)NIR硬度讀數(shù)。重組體根據(jù)puro B序列類(lèi)型分類(lèi)，其中(+)表示柔軟類(lèi)型親本CS的甘氨酸序列類(lèi)型，(●)表示堅(jiān)硬類(lèi)型親本CS取代的Cheyenne 5D的絲氨酸序列類(lèi)型。
圖3示淀粉表面friabilin相對(duì)數(shù)量，以軟質(zhì)籽粒親本“CS”的軟/硬重組體對(duì)NIR硬度的百分率表示。重組體根據(jù)puro b序列類(lèi)型分類(lèi)，其中(+)表示柔軟類(lèi)型親本CS的甘氨酸序列類(lèi)型，(●)表示堅(jiān)硬類(lèi)型親本CS(CNN5D)的絲氨酸序列類(lèi)型。
定義除非另有說(shuō)明，這里所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬的領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員所通常理解的意義。以下文獻(xiàn)給技術(shù)人員提供一種用于本發(fā)明中的許多術(shù)語(yǔ)的通用定義Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology(微生物學(xué)與分子生物學(xué)詞典)(第二版，1994年)；劍橋科學(xué)與技術(shù)詞典(Walker編，1988)；The Glossaryof Genetics(遺傳學(xué)專(zhuān)用詞匯詞典)，5Th ED，(第五版)，Rieger,R等編，Springer Verlag(1991)；以及Hale & Marham,The Harper CollinsDictionary of Biology(1991)(Harper Collins生物學(xué)詞典)。象這里所用的，如果沒(méi)有以另外的形式特殊說(shuō)明，以下術(shù)語(yǔ)都具有歸屬于所述的意義。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”指植物中的任何細(xì)胞，包括但不限于體細(xì)胞，配子或胚。“胚”指在開(kāi)始萌發(fā)之前的孢子體植物。胚可以通過(guò)有性雜交或自雜交由配子受精而形成?！坝行噪s交”是指一種植物被另外植物受粉的過(guò)程?！白越弧笔侵竿ㄟ^(guò)自花受粉形成種子，也就是，花粉及胚珠來(lái)源于同一植株。術(shù)語(yǔ)“回交”指F1代雜種植株與任一親本雜交。典型地，回交用于轉(zhuǎn)移賦予一種簡(jiǎn)單遺傳的，高度可遺傳的性狀基因進(jìn)入近交系。術(shù)語(yǔ)近交系指回歸親本。期望性狀來(lái)源是供體親本。供體與回歸親本有性雜交后，具有供體親本期望性狀的F1代雜種植株被選出并與回歸親本或自交系重復(fù)雜交(也就是回交)。
胚也能夠由“胚體細(xì)胞發(fā)生”及“克隆”形成。體細(xì)胞胚發(fā)生指直接或間接地從植物細(xì)胞，組織及器官產(chǎn)生胚。間接體細(xì)胞胚發(fā)生的特征在于長(zhǎng)成一塊愈傷組織并在愈傷組織表面形成胚。直接體細(xì)胞胚發(fā)生是指在不干擾愈傷組織階段的條件下，從外植體組織的單一細(xì)胞或細(xì)胞群形成無(wú)性胚。因?yàn)閺挠鷤M織得到的植株易于產(chǎn)生畸形，直接體細(xì)胞胚發(fā)生是優(yōu)選的。
短語(yǔ)“籽粒結(jié)構(gòu)”指用于銷(xiāo)售的小麥的主要分類(lèi)基礎(chǔ)。常用術(shù)語(yǔ)，“籽?！笔谴嬖谟谥参锱咧榈呐呷?。在小麥中，籽?；蚺呷榻Y(jié)構(gòu)由硬質(zhì)基因(Hardness gene)的表達(dá)來(lái)區(qū)分。然而，所有谷類(lèi)籽粒都能在籽粒結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上分類(lèi)。在高粱及玉米中，軟柔軟的胚乳由于基因如opaque-2及floury-2突變形成。盡管，這些突變基因的表達(dá)是隱性的并導(dǎo)致其它的，有害的表型如對(duì)機(jī)械及害蟲(chóng)損傷更大的易感性。
“較軟結(jié)構(gòu)籽粒”(Softer textured grain)指通過(guò)用Perten SKCS4100(Perten Instruments,Reno,NV)測(cè)量；通過(guò)如方法39-70所述的近紅外反射分光術(shù)(NIR)測(cè)量(美國(guó)谷類(lèi)化學(xué)家協(xié)會(huì)批準(zhǔn)方法，第9版，美國(guó)谷類(lèi)化學(xué)家協(xié)會(huì)，St.Paul,MN(1995))；或通過(guò)相當(dāng)技術(shù)測(cè)量，由后代或轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的籽粒比至少其一個(gè)親本產(chǎn)生的籽粒低10個(gè)單位。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，后代或轉(zhuǎn)基因植物的籽粒比至少其一個(gè)親本籽粒低至少20個(gè)單位。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，后代或轉(zhuǎn)基因植物的籽粒比親本籽粒低至少40個(gè)單位。然而，因?yàn)樽蚜Ｓ捕仁且环N數(shù)量性狀，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到籽粒硬度部分地由后代或轉(zhuǎn)基因植物及親本植物生長(zhǎng)的環(huán)境條件決定。
“較硬結(jié)構(gòu)籽粒”(harder textured grain)指通過(guò)用上述技術(shù)測(cè)量，由后代植株產(chǎn)生的籽粒比至少一個(gè)后代植物親本產(chǎn)生的籽粒大10個(gè)單位。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，后代或轉(zhuǎn)基因植物的籽粒比至少一個(gè)親本籽粒大至少20個(gè)單位。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，后代或轉(zhuǎn)基因植物的籽粒比親本籽粒大至少40個(gè)單位。
短語(yǔ)“在嚴(yán)格的條件下雜交”指由二條單鏈核酸形成雙鏈雙螺旋。雙鏈區(qū)可包括一或二條單鏈核酸的全長(zhǎng)，或一單鏈核酸的全部及另一單鏈核酸的亞序列或雙鏈區(qū)域可包括每一核酸的亞序列。一本廣博的用于核酸雜交的通用指南參見(jiàn)Tijssen，生物化學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-用核酸探針雜交Ⅰ及Ⅱ部分，Elsevier,New York,(1993)。通常地，嚴(yán)格條件被選擇為在一確定的離子強(qiáng)度及pH下對(duì)特定核酸序列比其熱熔點(diǎn)Tm值低約5℃。Tm是指(在確定離子強(qiáng)度及pH下)有50％目標(biāo)序列與一完全匹配的探針雜交的溫度。高度嚴(yán)格的條件被選擇為對(duì)一特異探針等于Tm值。有時(shí)術(shù)語(yǔ)“Td”被用于定義至少一半的探針從一完全匹配的目標(biāo)核酸上解離時(shí)的溫度。不管怎樣，一種用于判斷Tm或Td的評(píng)估技術(shù)種類(lèi)是可以得到的，并概略地在Tijssen，出處同上中描述。典型地，估計(jì)在雙螺旋中的G-C堿基對(duì)對(duì)Tm值的貢獻(xiàn)約為3℃，而A-T堿基對(duì)約為2℃，達(dá)到約80-100℃的理論最大值。然而，更精確的Tm及Td模型是可以得到并適合的，其中考慮進(jìn)入G-C累積的相互作用，溶劑影響，所需試驗(yàn)溫度及其它因素等。在一實(shí)施例中，PCR引物被設(shè)計(jì)為其有約60℃的解離溫度(Td)，用公式Td=(((((3×#GC)+(2×# AT))×37)-562)/# bp)-5計(jì)算所得；其中#GC,#AT及#bp分別表示包含于退火引物與模板DNA中的G-C堿基對(duì)數(shù)量，A-T堿基對(duì)數(shù)量，總堿基對(duì)數(shù)量。
一種用于具有100個(gè)以上互補(bǔ)堿基的互補(bǔ)核酸在濾膜上進(jìn)行Southern或Northern雜交的嚴(yán)格雜交條件的實(shí)施例為在42℃下，50％甲醛水溶液(formalin)及1mg(毫克)肝素(heparin)中雜交過(guò)夜進(jìn)行。一種用于這樣核酸的Southern印跡嚴(yán)格洗滌條件的例子為在65℃下，用0.2×SSC洗15分鐘(見(jiàn)Sambrook等，分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第2版)1-3卷。冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港出版社，NY(紐約)1989(Sambrook)，對(duì)SSC緩沖液的描述)。通常在高嚴(yán)格洗滌前用低嚴(yán)格洗滌條件洗滌以除去背景探針信號(hào)。一種低嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)施例為40℃下2×SSC洗滌15分鐘。
通常，信號(hào)與干擾的比率是用無(wú)關(guān)探針在該特定雜交分析中所得信號(hào)的2倍或比之更高，說(shuō)明檢測(cè)到了特異雜交。對(duì)于高度特異性雜交策略，如等位基因-特異雜交，一種等位基因-特異探針通常與包含多態(tài)性核苷酸的標(biāo)記核酸(例如，一種基因組核酸或類(lèi)似物)在高度嚴(yán)格條件下雜交。
短語(yǔ)“引入一種核酸序列”指通過(guò)重組手段引入核酸序列，包括但不限于，農(nóng)桿菌屬-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，基因槍法(biolistic methods)，電穿孔，用于植物技術(shù)中，等等。術(shù)語(yǔ)“核酸”是與DNA,RNA及多聚核苷酸同義的。這樣一種含有該核酸序列的植物這里指R1代植物。R1代植物也可以通過(guò)已被引入該核酸序列植物的克隆，有性雜交或自交產(chǎn)生。
“轉(zhuǎn)基因植物”是通過(guò)重組技術(shù)已經(jīng)引入核酸序列的植物，例如，含有核酸的載體。載體是一種核酸組合物，它能轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)化或感染細(xì)胞，由此引起此細(xì)胞表達(dá)載體-編碼的核酸及任選的不是此細(xì)胞天然的蛋白，或者以一種非該細(xì)胞天然的方式表達(dá)蛋白。載體包括被細(xì)胞表達(dá)的核酸(通常為RNA或DNA)。載體任選地包括幫助核酸能夠進(jìn)入細(xì)胞的材料，例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒粒子，脂質(zhì)體，蛋白包被或其它等。載體含有允許它們?cè)诩?xì)菌或其它非植物有機(jī)體中繁殖及選擇的核酸序列。對(duì)于載體及分子生物學(xué)技術(shù)的描述，見(jiàn)Current Protocols in MolecularBiology(分子生物學(xué)現(xiàn)代方法)，Ausubel等，(編)，現(xiàn)代方法，a jointventure between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley &Sons,Inc.,(全刊及包括1998年增刊)(Ausubel)。
短語(yǔ)“表達(dá)盒”指在載體上被轉(zhuǎn)錄及一啟動(dòng)子指導(dǎo)該轉(zhuǎn)錄的一段核酸序列?！皢?dòng)子”是指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的一段核酸控制序列。象這里所用的，一個(gè)啟動(dòng)子包括臨近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的必需核酸序列，如，就多聚酶Ⅱ類(lèi)型(polymeraseⅡ)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)，為一TATA元件。啟動(dòng)子也任選地包括可以定位于遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)幾千堿基對(duì)部位處的遠(yuǎn)側(cè)增強(qiáng)子或阻遇物元件。啟動(dòng)子可以或者是同源的，即，自然存在地指導(dǎo)目的核酸表達(dá)或異源的，即自然存在地指導(dǎo)從非目的核酸的基因來(lái)源的核酸表達(dá)。具有異源啟動(dòng)子序列的融合基因是可取的，例如，用于調(diào)節(jié)編碼蛋白的表達(dá)。一種“組成型”啟動(dòng)子是一種在大多數(shù)環(huán)境及發(fā)育條件下，在選擇的有機(jī)體組織中有活性的啟動(dòng)子。一種“可誘導(dǎo)的”啟動(dòng)子是一種在選擇的有機(jī)體中，在環(huán)境及發(fā)育條件調(diào)控下的啟動(dòng)子。
短語(yǔ)“可操作地編碼”指在一種啟動(dòng)子及一種二級(jí)核酸序列間的功能連鎖，其中啟動(dòng)子序列起動(dòng)該二級(jí)序列相應(yīng)的RNA的轉(zhuǎn)錄。
短語(yǔ)“阻止一種嘌呤二氫吲哚蛋白的表達(dá)”指一植物細(xì)胞中嘌呤二氫吲哚蛋白的合成的抑制。抑制可以或者在轉(zhuǎn)錄水平，也就是，相應(yīng)mRNA合成階段，或者翻譯水平，也就是蛋白質(zhì)合成階段。本發(fā)明的目的，阻止嘌呤二氫吲哚蛋白表達(dá)通過(guò)引入阻抑mRNA或蛋白質(zhì)合成的核酸序列來(lái)完成。該核酸可編碼阻抑嘌呤二氫吲哚基因表達(dá)的mRNA轉(zhuǎn)錄本并提供一硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒。例如，顯示了反義RNA抑制基因表達(dá)，見(jiàn)，如，Sheehy等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)，85:8805-8809(1998)，及美國(guó)專(zhuān)利4801340號(hào)。有義抑制(Sense suppression)也被用于調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，見(jiàn)，Napoli等，植物細(xì)胞2:279-289(1990)及美國(guó)專(zhuān)利5034323號(hào)。
反義技術(shù)包含從目的嘌呤二氫吲哚基因克隆核酸片段并可操作地連接進(jìn)入一啟動(dòng)子下，結(jié)果轉(zhuǎn)錄出RNA反義鏈(或互補(bǔ)鏈)。該構(gòu)建物接著轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物，RNA反義鏈由此形成。
通常被引入的核酸片段將是與嘌呤二氫吲哚蛋白基因或需抑制的基因的至少一部分基本相同。然而，該序列不需要完全相同來(lái)抑制表達(dá)。引入的序列，相對(duì)于或初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或完全加工的mRNA，也不需是全長(zhǎng)。通常地，較高同源性可以用于彌補(bǔ)應(yīng)用較短序列的不足。此外，引入的序列不需要同樣的內(nèi)含子或外顯子形式，非編碼片段的同源物可以同樣有效。正常地，在約30或40核苷酸到約2000核苷酸間的序列長(zhǎng)度是可以應(yīng)用的，盡管至少約100核苷酸長(zhǎng)度的序列是優(yōu)選的，至少約200核苷酸長(zhǎng)度的序列是更優(yōu)選的，至少約500核苷酸長(zhǎng)度的序列是特別優(yōu)選的。
起催化作用的RNA分子或核酶也能用于抑制基因表達(dá)。設(shè)計(jì)特異與事實(shí)上任何目標(biāo)RNA配對(duì)并在特異位點(diǎn)斷裂磷酸二醋骨架是可能的，由此功能性地滅活目標(biāo)RNA。在完成這種斷裂中，它是一種真正的酶。反義RNA內(nèi)包含的核酶序列賦予其RNA-斷裂活性，由此提高構(gòu)建體的活性。目標(biāo)RNA特異核酶的一般設(shè)計(jì)及應(yīng)用在Haseloff等，自然334:585-591(1988)中已描述。
“轉(zhuǎn)座子”指具有移動(dòng)或跳躍到基因組內(nèi)新的座位去的能力的DNA序列。轉(zhuǎn)座子需要兩種成份催化轉(zhuǎn)位的轉(zhuǎn)座酶及位于轉(zhuǎn)座子末端保證酶發(fā)揮功能的核苷酸序列。轉(zhuǎn)座子是既自主又非自主的。自主性轉(zhuǎn)座子是既能夠轉(zhuǎn)位又能催化非自主元件轉(zhuǎn)位的轉(zhuǎn)座子。自主性轉(zhuǎn)座子的例子為從玉米中分離出的Ac元件及Spm轉(zhuǎn)座子，以上所有都已被克隆并在本領(lǐng)域內(nèi)深入描述，見(jiàn)，如，美國(guó)專(zhuān)利4732856號(hào)及Gierl等，植物分子生物學(xué)13:261-266(1989)。
自主性轉(zhuǎn)座子包含轉(zhuǎn)座酶所需序列及在轉(zhuǎn)座子末端被轉(zhuǎn)座酶識(shí)別的序列(“Ds元件”)。轉(zhuǎn)座酶所需序列(或轉(zhuǎn)座酶基因)是末端序列非依賴(lài)活化的，也就是，如果末端序列被刪除，轉(zhuǎn)座酶基因活性仍然保留，并且酶編碼元件可以用于與一非自主性轉(zhuǎn)座子或Ds元件連接以引發(fā)Ds元件轉(zhuǎn)位。轉(zhuǎn)座酶基因在Ts101及Ts105元件中是明顯的。
在轉(zhuǎn)座酶基因存在時(shí)，僅僅存在于非自主元件末端的DNA序列對(duì)其轉(zhuǎn)座活性是需要的。這些末端在這里指“轉(zhuǎn)座子末端”或“Ds元件”。見(jiàn)，如Coupland等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)86:9385(1989)，其中描述了轉(zhuǎn)座必需的序列。轉(zhuǎn)座子末端內(nèi)部的DNA序列是非必需的并且能包含從事實(shí)上任何來(lái)源的序列，包括外源突變的嘌呤二氫吲哚核酸序列。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入一基因組時(shí)，正確的核酸序列被切除并被突變序列替換。因?yàn)樵撔蛄袃?nèi)的突變，植物產(chǎn)生的嘌呤二氫吲哚蛋白將含有一種突變或如果插入一終止密碼將是截短的形式。
術(shù)語(yǔ)“后代”指一特別植物(自交)或一對(duì)植物(雜交或回交)的后代。后代可以是F1,F2，或任何隨后產(chǎn)生的后代。典型地，雙親是花粉供體及胚珠供體，本發(fā)明中它們通過(guò)雜交產(chǎn)生后代植株。雙親也指本發(fā)明中一種雜交植物的F1親本(F2植株)。最終，親本指與本發(fā)明中的雜種植物回交以產(chǎn)生另一種本發(fā)明中的雜種植物的一種回歸親本。
短語(yǔ)“產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)基因植物”指形成一種本發(fā)明中的植物。該植物通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生，也就是，克隆，體細(xì)胞胚胎發(fā)生或任何其它本領(lǐng)域中技術(shù)人員所應(yīng)用產(chǎn)生植物的技術(shù)。
本發(fā)明全過(guò)程中所使用的植物的常見(jiàn)名稱(chēng)指下述屬的植物品種
短語(yǔ)“嘌呤二氫吲哚蛋白”指一類(lèi)蛋白，包括但不限于“puro A”，或“puro B”。puro A及puro B是富含色氨酸的疏水結(jié)構(gòu)域，它具有親脂性(Bloehet等，Gluten Proteins 1990,Bushak & Tkachuk(編)，美國(guó)谷類(lèi)化學(xué)家協(xié)會(huì)，St.Paul,MN(1991)；及Wilde等，農(nóng)業(yè)研究20:971(1993))。除了在小麥中發(fā)現(xiàn)的嘌呤二氫吲哚蛋白外，用于本發(fā)明中，它也指嘌呤二氫吲哚同源物。同源物指具有同源功能的蛋白質(zhì)，也就是，影響籽粒結(jié)構(gòu)，例如，來(lái)源于燕麥的燕麥蛋白(Avenin)。同源物也指核酸序列或氨基酸序列同源物。
“核酸序列同源物”指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及聚合物其中以或者單或雙鏈形式，含有天然核苷酸的已知相似物，它具有與對(duì)照核酸相似的結(jié)合特性并與天然形成的核苷酸以相似方式新陳代謝。
如果沒(méi)有其它指明，特別核酸序列其中也暗含保守地修飾的變異體(例如簡(jiǎn)并密碼替換)及互補(bǔ)序列，以及明確指明的序列。特別地，簡(jiǎn)并密碼替換可通過(guò)產(chǎn)生序列達(dá)到，其中一或多個(gè)選出的密碼(或全部)第三位置用混合堿基和/或脫氧次黃苷殘基替換(Batzer等，核酸研究19:5081(1991)；Ohtsuka等，生物學(xué)化學(xué)雜志260:2605-2608(1985)；及Rossolini等，分子細(xì)胞探針8:91-98(1994))。術(shù)語(yǔ)核酸與基因，cDNA，及基因編碼的mRNA互換使用。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列同源物”指具有相似氨基酸序列的蛋白質(zhì)。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到?jīng)Q定性的氨基酸序列位于蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)。這樣，對(duì)于一種同源蛋白質(zhì)具有對(duì)全長(zhǎng)氨基酸序列不超過(guò)40％同源性但在一功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)多于90％同源性是可能的。除了自然形成的氨基酸外，同源物也包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)于一種天然形成的氨基酸，以及天然形成的蛋白質(zhì)的人工化學(xué)合成的類(lèi)似物。
這里所說(shuō)的氨基酸殘基指或者它們被普遍知道的三字母符號(hào)或者是由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)。核苷酸，同樣地，也稱(chēng)為被普遍接受的單字母符號(hào)。
“保守地修飾的變異體”對(duì)氨基酸及核酸序列都適用。對(duì)于具體的核酸序列，保守地修飾的變異體指那些編碼相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或核酸并不編碼氨基酸序列的那些核酸或指基本上相同的序列。因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，大量功能上相同的核酸編碼任何指定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA,GCC,GCG及GCU都編碼丙氨酸。這樣，在任何丙氨酸被一密碼子確定的位置上，該密碼子可以被改變成任何一個(gè)上述的相應(yīng)密碼子而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸突變稱(chēng)為“沉默突變”，它是一種保守地修飾的變異體。這里編碼一種多肽的任何核酸序列也描述該核酸每一可能的沉默突變。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到核酸上的每一密碼子(除AUG外，它是編碼Met的唯一密碼子)都能被修飾以產(chǎn)生一功能上相同的分子。相應(yīng)地，一種編碼多肽的核酸的每一沉默突變都暗含在每一所描述的序列中。
至于氨基酸序列，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到對(duì)一核酸，肽，多肽的個(gè)別替換，缺失或增加或者蛋白序列改變，增加或缺失單一氨基酸或在編碼區(qū)序列中很小百分比的氨基酸是一種“保守地修飾的變異體”，其中改變導(dǎo)致一氨基酸被一化學(xué)上相似的氨基酸替換。保守替換提供功能上相似氨基酸為本領(lǐng)域所熟知。
下述六組，每一組含有的氨基酸都可以互相間保守替換1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(E)；4)精氨酸(R)，賴(lài)氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V)；及6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
(見(jiàn)，如，creighton，蛋白質(zhì)(1984))。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指通過(guò)分子生物學(xué)家所應(yīng)用的各種技術(shù)將核酸引入植物培養(yǎng)物或者植物器官的植物細(xì)胞中。例如，核酸可以通過(guò)使用諸如電穿孔及顯微注射植物細(xì)胞原生質(zhì)體的技術(shù)直接引入植物細(xì)胞基因組DNA，或DNA構(gòu)建物可以用生物導(dǎo)彈方法直接引入植物細(xì)胞，如DNA微粒轟擊。可選擇地，DNA構(gòu)建物與適宜的T-DNA側(cè)翼區(qū)結(jié)合并引入一常見(jiàn)的根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主載體中。當(dāng)細(xì)胞被該細(xì)菌感染時(shí)，根癌農(nóng)桿菌宿主的毒性功能指導(dǎo)構(gòu)建物及相鄰標(biāo)記插入植物細(xì)胞DNA中。
顯微注射技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知并在科學(xué)及專(zhuān)利文獻(xiàn)中已有很好的描述。用聚乙二醇沉淀引入DNA構(gòu)建體在Paszkowski等，EMBO J.3:2717(1984)中已有描述。電穿孔技術(shù)在Fromm等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)82:5824(1985)中描述。導(dǎo)彈轉(zhuǎn)化技術(shù)在Klein等，自然327:70-73(1987)中描述。
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，包括雙元載體的卸載和使用，也在科技綜述中有很好的描述。見(jiàn)例如，Horsch等，科學(xué)233:496-498(1984)及Fraley等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)80:4803(1983)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及植物嘌呤二氫吲哚基因，尤其是小麥puro A及puro B基因。來(lái)源于嘌呤二氫吲哚基因的核酸序列可用于修飾轉(zhuǎn)基因谷類(lèi)植物及后代谷類(lèi)植物的籽粒結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的嘌呤二氫吲哚基因可以在通常用于生產(chǎn)淀粉，食品和/或飼料的谷類(lèi)品種中表達(dá)，例如小麥，黑麥，燕麥，玉米等。通過(guò)加入嘌呤二氫吲哚基因到谷類(lèi)植物基因組中，該植物籽粒變得比其親本籽粒結(jié)構(gòu)更柔軟。通過(guò)阻抑嘌呤二氫吲哚基因表達(dá)，籽粒會(huì)比其親本谷類(lèi)籽粒變得更堅(jiān)硬。另外，因?yàn)樽蚜＝Y(jié)構(gòu)的定量特性，引入嘌呤二氫吲哚基因的突變形式影響谷類(lèi)植物籽粒結(jié)構(gòu)的修飾。
一般地，下述的在植物維持及育種以及重組DNA技術(shù)中使用的專(zhuān)門(mén)名詞及實(shí)驗(yàn)程序在本領(lǐng)域中廣泛了解并普遍運(yùn)用。標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)用于克隆，DNA及RNA分離，擴(kuò)增及純化。通常涉及DNA連接酶，DNA多聚酶，限制性?xún)?nèi)切酶等的酶反應(yīng)根據(jù)廠(chǎng)商的說(shuō)明進(jìn)行。這些技術(shù)及其它各種技術(shù)一般根據(jù)下述文獻(xiàn)進(jìn)行Sambrook等，Molecular Cloning-ALaboratory Manual(分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，Cold Spring HarborLaboratory(冷泉港實(shí)驗(yàn)室)，冷泉港，紐約(1989)及Dodds & Roberts,Experiments in Plant Tissue Culture(植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn))3RD ED，(第三版)Cambridge University Press(劍橋大學(xué)出版社)(1995)。Ⅰ．嘌呤二氫吲哚蛋白及基因小麥籽粒結(jié)構(gòu)的不同是由于一個(gè)主要基因的表達(dá)所引起，該基因鑒定為Hardness(Ha)(Symes，澳大利亞農(nóng)業(yè)研究雜志16:113-123(1965)；及Baker，農(nóng)作物科學(xué)17:960-962(1977))，它定位于染色體5D短臂上(Mattern等，Proceedings of the 4thInternationalWheat Genetics Symposium(第4屆國(guó)際小麥遺傳研討會(huì)會(huì)刊)，Missouri大學(xué)，Columbia,MO.，第703-707頁(yè)(1973)及Law等，用核技術(shù)改良種子蛋白(Seed Protein Improvement By Nuclear Techniques)，國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)，奧地利維也納，第483-502頁(yè)(1978))。
單一主要基因的存在與小麥(T.aestivum)異源六倍體(2n=6x=42條染色體，基因組AABBDD)的性質(zhì)是矛盾的，因?yàn)樵S多基因以三份同源體存在，每份來(lái)源于一個(gè)基因組。Ha等位基因定位于六倍體小麥5A及5B染色體但不表達(dá)。由于這一原因，缺少D基因組的堅(jiān)硬小麥(T.turgidum L.var.durum)(2n=4x=28染色體，基因組AABB)通常比硬質(zhì)六倍體小麥結(jié)構(gòu)更堅(jiān)硬。
小麥嘌呤二氫吲哚蛋白是在種子胚乳中發(fā)現(xiàn)的，半胱氨酸及色氨酸豐富的脂結(jié)合蛋白。成熟的嘌呤二氫吲哚蛋白A及嘌呤二氫吲哚蛋白B長(zhǎng)148個(gè)氨基酸，分子量分別為16,792及16,387 Dal(道爾頓)。(Gautier等，植物分子生物25:43(1994))。它們具有55％的氨基酸同源性并表現(xiàn)出很強(qiáng)的堿性，兩蛋白的pI點(diǎn)都大于10。
研究表明嘌呤二氫吲哚A及嘌呤二氫吲哚B必須都表達(dá)方能賦予小麥軟質(zhì)特性。puro B的色氨酸豐富區(qū)一個(gè)甘氨酸(Gly)向絲氨酸(Ser)的變化(Gly-46變成Ser-46)已經(jīng)在兩個(gè)硬質(zhì)小麥品種中報(bào)道(Giroux& Morris，遺傳學(xué)理論及應(yīng)用95:857-864(1997))。見(jiàn)SEQ ID NO:5。該序列變化與籽粒硬度緊密連鎖并能減輕脂結(jié)合強(qiáng)度。因?yàn)楦拾彼嵯蚪z氨酸的變化引起的內(nèi)在疏水性的減弱(Thorgeirsson等，生物化學(xué)35:1803-1809(1996))。puro B中的該突變與83染色體5D重組取代體品系的硬籽粒結(jié)構(gòu)間緊密連鎖暗示該蛋白包括在控制籽粒柔軟性中(Giroux & Morris，遺傳學(xué)理論及應(yīng)用95:857-864(1997))。存在于puro B中的變化在兩不同硬質(zhì)品種中是相同的并在兩軟質(zhì)參考品種中是缺失的。該變化可以簡(jiǎn)單表明在friabilin成份puro B及Ha基因間存在緊密連鎖。
任何已分離的嘌呤二氫吲哚或其同源基因都能在本發(fā)明中應(yīng)用。使用的特殊的多聚核苷酸不是本發(fā)明的關(guān)鍵特征，只要在籽粒結(jié)構(gòu)上實(shí)現(xiàn)所需變化。正如上所示，所有嘌呤吲哚蛋白都在Ha座位編碼。在六倍體小麥中，第五組染色體命名為5A、5B及5D。Ha座位發(fā)現(xiàn)于5D染色體上。因?yàn)?倍體堅(jiān)硬小麥(Triticum turgidum)缺失D組染色體，Ha座位是缺失的并且堅(jiān)硬小麥無(wú)一例外地是硬質(zhì)的。
小麥嘌呤二氫吲哚基因已被克隆并在文獻(xiàn)中描述。例如，puro A及puro B兩者的cDNA都已經(jīng)從Triticum aestivum半成熟種子cDNA文庫(kù)中分離并測(cè)序(Gautier等，植物分子生物學(xué)25:43(1994))。
其它嘌呤二氫吲哚或其同源基因的分離，包括無(wú)功能序列的同源物，可以通過(guò)很多技術(shù)完成。例如，在背景技術(shù)中揭示的以該序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸探針，可以用于從cDNA或基因組DNA文庫(kù)中分離所需基因。構(gòu)建基因組文庫(kù)，通過(guò)隨機(jī)斷裂例如用限制性?xún)?nèi)切酶，產(chǎn)生基因組DNA大片段，并與DNA載體連接以形成能夠包裝進(jìn)適當(dāng)載體中的串聯(lián)體。為制備cDNA文庫(kù)，從胚乳中分離mRNA，并從該mRNA制備含有嘌呤二氫吲哚基因轉(zhuǎn)錄本的cDNA文庫(kù)。
選擇地，感興趣的核酸可以用擴(kuò)增技術(shù)從核酸樣品中擴(kuò)增。例如，用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)從基因組DNA,cDNA，基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)中直接擴(kuò)增嘌呤二氫吲哚基因或相關(guān)基因的序列。PCR及其它體外擴(kuò)增方法也可以是很有用的，例如克隆編碼蛋白的核酸序列用于表達(dá)，制備核酸用作探針以檢測(cè)樣品中目的mRNA的存在與否，用于核酸測(cè)序，或其它目的。對(duì)于PCR的綜述見(jiàn)，PCR方法方法及應(yīng)用指南，Innis等(編)，Academic Press,San Diego(1990)。
多聚核苷酸也可以通過(guò)所述技術(shù)文獻(xiàn)中的已知技術(shù)合成。見(jiàn)，如，Carruthers等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411-418(1982)，及Adams等，J.Am.Chem.Soc.105:661(1983)。然后，雙鏈DNA片段可以通過(guò)或者合成互補(bǔ)鏈并在適當(dāng)條件下與該鏈一起退火或用一適宜的引物通過(guò)用DNA多聚酶加入互補(bǔ)鏈來(lái)得到。
如這里所描述的已制備分離的序列可以再被用于修飾嘌呤二氫吲哚基因表達(dá)并由此修飾植物籽粒結(jié)構(gòu)。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到該編碼功能性嘌呤二氫吲哚蛋白的核酸序列不需具有與這里揭示的例證基因相同的序列。這樣，編碼嵌合嘌呤二氫吲哚多肽的基因能應(yīng)用于本發(fā)明中。
如上所示，嘌呤二氫吲哚多肽，象其它蛋白一樣，具有完成不同功能的不同結(jié)構(gòu)域。因此，嘌呤二氫吲哚基因序列不需全長(zhǎng)，只要該蛋白的目的功能結(jié)構(gòu)域表達(dá)即可。嵌合的嘌呤二氫吲哚多肽可以容易地設(shè)計(jì)，如用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的各種重組DNA技術(shù)。例如，該鏈通過(guò)氨基酸替代，添加，缺失等在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平從自然發(fā)生的序列上變化。特別地，半胱氨酸殘基可以添加，缺失或在多肽內(nèi)移動(dòng)以實(shí)現(xiàn)具有目的特性的修飾的嘌呤二氫吲哚多肽。嵌合多肽也可以通過(guò)融合兩或多個(gè)嘌呤二氫吲哚基因的編碼序列產(chǎn)生。所有這些修飾可以用于許多聯(lián)合形式中以產(chǎn)生最終修飾的蛋白鏈。Ⅱ．重組構(gòu)建物的制備在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，為修飾植物籽粒結(jié)構(gòu)，制備了含有分離的嘌呤二氫吲哚基因序列及適于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的重組DNA載體。編碼目的嘌呤二氫吲哚多肽的DNA序列，例如編碼全長(zhǎng)蛋白的cDNA或基因組序列，是可方便地用于構(gòu)建一種能夠引入目的植物中的重組體表達(dá)盒。表達(dá)盒典型地含有該嘌呤二氫吲哚核酸序列可操作地與啟動(dòng)子序列及其它轉(zhuǎn)錄及翻譯起始調(diào)控序列連接，這些調(diào)控序列將指導(dǎo)在轉(zhuǎn)化的植物目的組織(如胚乳)中從嘌呤二氫吲哚基因或其反義基因轉(zhuǎn)錄該序列。
例如，可以使用一種組成型植物啟動(dòng)子片段，它將指導(dǎo)植物所有組織表達(dá)嘌呤二氫吲哚蛋白。這樣的啟動(dòng)子在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育狀態(tài)或細(xì)胞分化過(guò)程中都是有活性的。組成型啟動(dòng)子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，來(lái)源于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)T-DNA上的1′-或2′啟動(dòng)子，以及其它為技術(shù)人員所知道的各種植物基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
選擇地，植物啟動(dòng)子可以受環(huán)境控制。這里所指的這樣啟動(dòng)稱(chēng)作“可誘導(dǎo)的”啟動(dòng)子。環(huán)境條件通過(guò)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的實(shí)例包括病原體侵害，無(wú)氧條件或光的存在。
典型地，用于本發(fā)明中構(gòu)建體的啟動(dòng)子將是“組織-特異性的”并在發(fā)育控制下的，結(jié)果，目的基因僅僅在某一組織中表達(dá)，例如胚乳。指導(dǎo)在種子中表達(dá)的啟動(dòng)子，尤其在胚乳中表達(dá)的啟動(dòng)子是特別優(yōu)選的。這樣啟動(dòng)子的實(shí)例包括來(lái)源于編碼種子貯藏蛋白基因的啟動(dòng)子，例如napin,cruciferin,phaseolin等(見(jiàn)美國(guó)5,420,034號(hào)專(zhuān)利)。其它適用在谷類(lèi)中表達(dá)嘌呤二氫吲哚基因的啟動(dòng)子包括來(lái)源于編碼麥膠蛋白(gliadin)基因，谷類(lèi)醇溶谷蛋白(prolamines)基因(例如，玉米醇溶蛋白(zein)，大麥醇溶蛋白(hordein)，黑麥堿(secalin)及燕麥蛋白(avenin))及淀粉生物合成酶基因的啟動(dòng)子。
來(lái)源于嘌呤二氫吲哚基因的內(nèi)源啟動(dòng)子在指導(dǎo)嘌呤二氫吲哚基因在種子中表達(dá)，尤其胚乳中表達(dá)特別有用。這些種子特異性啟動(dòng)子也能用于指導(dǎo)異源結(jié)構(gòu)基因表達(dá)。這樣該啟動(dòng)子也能用于重組表達(dá)盒以驅(qū)動(dòng)任何期望在種子中表達(dá)的基因進(jìn)行表達(dá)。這些實(shí)例包括編碼對(duì)提高種子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有用的蛋白質(zhì)的基因(例如編碼在脂，蛋白及碳水化合物或淀粉生物合成中涉及的蛋白質(zhì)的基因)。其它基因，包括那些編碼藥用上有用的化合物的基因，以及編碼植物對(duì)真菌或其它種子感染有抵抗作用產(chǎn)物的基因。
嘌呤二氫吲哚基因啟動(dòng)子也能夠用于起動(dòng)抑制內(nèi)源性嘌呤二氫吲哚基因表達(dá)的mRNA分子的轉(zhuǎn)錄。在植物中用重組DNA技術(shù)抑制基因表達(dá)的手段是為人們所熟知的。例如，反義技術(shù)可以方便地使用。見(jiàn)，例如，Sheedy等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)85:8805-8809(1988)，及美國(guó)專(zhuān)利4,801,340號(hào)。催化性RNA分子或核酶也能用于抑制胚乳-特異性基因的表達(dá)。設(shè)計(jì)及運(yùn)用靶RNA-特異的核酶在Haseloff等，自然334:585-591(1988)中已有描述。在有義方向引入核酸構(gòu)型(configured)來(lái)阻止目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄也已證明是一種有效手段。用有義抑制調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一個(gè)應(yīng)用實(shí)例見(jiàn)，Napoli等，植物細(xì)胞2:279-289(1990)及美國(guó)專(zhuān)利5,034,323號(hào)，5,231,020號(hào)及5,283,184號(hào)。
本發(fā)明的嘌呤二氫吲哚啟動(dòng)子典型地長(zhǎng)至少400堿基對(duì)，并通常至少約800bp或1000bp。該啟動(dòng)子長(zhǎng)度典型地少于約3500bp，通常少于約2800bp，并經(jīng)常少于約2000bp。啟動(dòng)子長(zhǎng)度從天然基因翻譯起始密碼子上游計(jì)數(shù)。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到應(yīng)用“大約”來(lái)表達(dá)核酸片段長(zhǎng)度意指包括與這里所述及的長(zhǎng)度變化不大且維持所述啟動(dòng)子功能(也就是，種子-特異基因表達(dá))的各種長(zhǎng)度的片段。
確定嘌呤二氫吲哚啟動(dòng)子，基因組嘌呤二氫吲哚基因克隆的5′部分用于分析啟動(dòng)子序列的序列特征。例如，啟動(dòng)子序列元件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，它通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游20到30bp處。在植物中，在TATA盒(TATA box)上游更遠(yuǎn)的地方，在-80到-100bp位置處，有一典型的啟動(dòng)子元件，它有一系列的腺嘌呤(adenine)圍繞G(或T)NG三核苷酸。Messing等，Genetic Engineering in Plants(植物遺傳工程)，Kosage等(編)，221-227頁(yè)(1983)。
在本發(fā)明的表達(dá)載體制備中，不是啟動(dòng)子及嘌呤二氫吲哚基因的序列也優(yōu)選地應(yīng)用。假如期望正確表達(dá)多肽，在嘌呤二氫吲哚基因編碼區(qū)3′末端的多聚腺苷區(qū)域是應(yīng)該包括的。多聚腺苷區(qū)域能從天然基因中得到，從多種其它植物基因或從T-DNA中得到。
含有嘌呤二氫吲哚基因序列的載體典型地包含賦予植物細(xì)胞可選擇表型的標(biāo)記基因。例如，該標(biāo)記可編碼除草劑抗性，尤其抗除草劑抗性產(chǎn)物，如，對(duì)卡那霉素，G 418，博某霉素(Bleomycin)，潮霉素(hygromycin)的抗性或?qū)Τ輨┑目剐裕鐚?duì)chlorosluforon或膦絲菌素(phosphinothricin)(在bialaphos及Basta中的有效成份)的抗性。Ⅲ．轉(zhuǎn)基因植物制備在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因植物是谷類(lèi)植物，包括但不限于，小麥，黑麥，黑小麥，大麥，玉米，高粱及水稻。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是小麥，高粱及玉米。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是玉米。
以上描述的DNA構(gòu)建體可以通過(guò)一系列傳統(tǒng)技術(shù)引入目的宿主植物基因組中。轉(zhuǎn)化各種高等植物品種的技術(shù)是深入了解的并在科學(xué)及技術(shù)文獻(xiàn)中描述。見(jiàn)，例如，Weising等，遺傳學(xué)年鑒22:421-477(1988)。
該DNA構(gòu)建體可以用生物導(dǎo)彈(biolistic)方法，電穿孔，PEG(聚乙二醇)沉淀，及顯微注射植物細(xì)胞原生質(zhì)體或胚發(fā)生愈傷組織的技術(shù)直接引入植物細(xì)胞基因組DNA中。選擇地，DNA構(gòu)建體可以與適宜的T-DNA側(cè)翼區(qū)結(jié)合并用根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根病農(nóng)桿菌(A.rhizogenes)載體引入。
微粒轟擊技術(shù)在Klein等，自然327:70-73(1987)中已有描述。一種特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)化小麥及其它谷類(lèi)的方法是轟擊未成熟胚來(lái)源的愈傷組織，如Weeks等，植物生理學(xué)102:1077-1084(1993)所述。
顯微注射技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知并在科學(xué)及專(zhuān)利文獻(xiàn)中有很好的描述。用聚乙二醇沉淀引入DNA構(gòu)建體在Paszkowski等，EMBO J.3:2717-2722(1984)中有所描述。電穿孔技術(shù)在Fromm等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)82:5824(1985)中描述。
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)也在科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛描述。見(jiàn)，如Horsch等，科學(xué)233:496-498(1984)，及Fraley等，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)80:4803(1983)。盡管農(nóng)桿菌屬主要于雙子葉植物中有用，某些單子葉植物也能夠被農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化。例如，水稻的農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化由Hiei等，植物雜志6:271-282(1994)；美國(guó)專(zhuān)利5,187,073號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利5,591,616號(hào)；Li等，Science in China(中國(guó)科學(xué))34:54(1991)；及Raineri等，生物/技術(shù)8:33(1990)。Xu等通過(guò)農(nóng)桿菌屬感染轉(zhuǎn)化玉米，大麥，黑小麥及龍須菜(Xu等，Chinese J.Bot.2:81(1990))。
本發(fā)明在小麥及其它谷類(lèi)中尤其有用。很多轉(zhuǎn)化谷類(lèi)的方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述。例如，水稻轉(zhuǎn)化由Toriyama等，生物/技術(shù)6:1072-1074(1988),Zhang等，遺傳學(xué)理論及應(yīng)用76:835-840(1988)，及Shimamoto等，自然338:274-276(1989)描述。轉(zhuǎn)基因玉米再生植株在Fromm等，生物/技術(shù)8:833-839(1990)及Gordon-Kamm等，植物細(xì)胞2:603-618(1990)中描述。相近地，燕麥(Sommers等，生物/技術(shù)10:1589-1594(1992))，小麥(Vasil等，生物/技術(shù)10:667-674(1992)；Weeks等，植物生理學(xué)102:1077-1084(1993)),高粱(Casas等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)90:11212-11216(1993)),水稻(Li等，植物細(xì)胞報(bào)道12:250-255(1993))，大麥(Yuechun和Lemoux，植物生理學(xué)104:37-48(1994))，和黑麥(Castillo等，生物/技術(shù)12:1366-1371(1994))都已通過(guò)轟擊(bombardment)轉(zhuǎn)化成功。
通過(guò)上述任何轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞都可以通過(guò)培養(yǎng)再生成具有轉(zhuǎn)化的基因型從而具有期望表型的完整植株。這樣的再生技術(shù)依賴(lài)于在組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入一定的植物激素，典型地依賴(lài)于殺蟲(chóng)劑(biocide)和/或除草劑(herbicide)標(biāo)記，它已經(jīng)與嘌呤二氫吲哚多聚核苷酸序列一起引入植物細(xì)胞中。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生植株在Evans等，Protoplasts Isolation And Culture,Handbook of Plant Cell Culture,(原生質(zhì)體分離及培養(yǎng)，植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)),Macmillian PublishingCompany(Macmillia出版公司),New York,124-176,1983；及Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,(植株再生，植物原生質(zhì)體)CRC Press,Boca Raton,21-73,1985中已有描述。再生植株也可以從植物愈傷組織，外植體，器官或其中一部分得到。這樣的再生技術(shù)在Klee等，植物生理學(xué)年鑒38:467-486(1987)中概略地予以了描述。
本發(fā)明方法以沒(méi)被天然發(fā)現(xiàn)的方式及環(huán)境條件下將嘌呤二氫吲哚多聚核苷酸摻入轉(zhuǎn)化的植物中特別有用。尤其，嘌呤二氫吲哚蛋白可以非天然植物特征的時(shí)間或數(shù)量表達(dá)。
技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到當(dāng)表達(dá)盒穩(wěn)定地整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物并被確定可操作后，它就可以通過(guò)有性雜交引入其它植物中。一種用于轉(zhuǎn)移期望表型進(jìn)入植物育種群體的技術(shù)是通過(guò)回雜。然而，多種標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)的任何一個(gè)都能使用，依賴(lài)于被雜交的品種。Ⅳ．嘌呤二氫吲哚基因斷裂在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)嘌呤二氫吲哚基因并具有軟質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的植物被轉(zhuǎn)化，結(jié)果是DNA-RNA-蛋白質(zhì)合成的胞內(nèi)途徑破壞。嘌呤二氫吲哚蛋白合成的抑制能夠通過(guò)多種不同機(jī)制實(shí)現(xiàn)，包括但不限于反義核酸，轉(zhuǎn)座子，核酶，定點(diǎn)誘變，化學(xué)誘變及放射。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白合成抑制是用反義核酸。
反義技術(shù)是基于相對(duì)于其正常存在的轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)有義核酸并可操作地與啟動(dòng)子連接。反義核酸可以通過(guò)上述方法構(gòu)建，只要它能夠被轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)于并可阻斷有義基因產(chǎn)生的RNA的翻譯的RNA。對(duì)于反義核酸的綜述，制備反義核酸的方法學(xué)以及用它來(lái)阻斷RNA的翻譯，見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利5,728,926號(hào)，1998年3月17日發(fā)行及美國(guó)專(zhuān)利5,695,992號(hào)，1997年12月9日發(fā)行。
簡(jiǎn)而言之，反義基因通過(guò)刪除有義基因雙鏈編碼區(qū)或其功能片段并以相對(duì)它用于轉(zhuǎn)錄的正常存在方式相反方向插入一啟動(dòng)子下游來(lái)產(chǎn)生。優(yōu)選地，一終止子結(jié)構(gòu)將加入該反義基因3′末端。另外，反義基因也能人工合成，尤其當(dāng)用一有義基因的很小片段斷時(shí)。帶有啟動(dòng)子及終止子序列的反義核酸與一載體相連，并且該載體通過(guò)那些技術(shù)人員熟知的技術(shù)及以上描述的技術(shù)引入植物中。
核酶是另一種以核酸為基礎(chǔ)的翻譯抑制物。有兩種不同形式的核酶。第一種是在Tetrahymena thermophila(四膜蟲(chóng))(稱(chēng)為IVS，或L-19 IVS RNA)中天然存在的并廣泛地在Zaug等，科學(xué)224:574-578(1984)；Zaug和Cech，科學(xué)231:470-475(1986)；Zaug等，自然324:429-433(1986)及P.C.T申請(qǐng)?zhí)朩O88/04300中描述。這些核酶的活性位點(diǎn)由與目標(biāo)RNA序列雜交的8bp(8堿基對(duì))組成。核酶，以自由的鳥(niǎo)苷(G)或鳥(niǎo)苷衍生物形式存在，然后斷裂目標(biāo)RNA。從斷裂形成的RNA片段包含末端5′磷酸基團(tuán)及3′羥基基團(tuán)。
第二類(lèi)核酶在美國(guó)專(zhuān)利5,747,335,1998年5月5日發(fā)布中描述。這類(lèi)核酶包含一個(gè)雜交區(qū)，該雜交區(qū)含有一或多條由至少與一種目標(biāo)RNA的部分序列互補(bǔ)的單鏈RNA形成的臂。至少其中一條臂是與能夠斷裂目標(biāo)RNA并含有至少9個(gè)核苷酸的催化區(qū)域相關(guān)聯(lián)的。如果雜交區(qū)域包含兩或多條RNA臂，在該臂中的核苷酸數(shù)量應(yīng)該比9個(gè)核苷酸更多。
另一種抑制蛋白合成的技術(shù)是向植物基因組中引入一種轉(zhuǎn)座子。該方法在美國(guó)專(zhuān)利5,225,341號(hào)中已有描述，該專(zhuān)利發(fā)布于1993年7月6日。簡(jiǎn)單地說(shuō)，插入一種轉(zhuǎn)座子來(lái)破壞感興趣的基因，例如，嘌呤二氫吲哚A(puro A)。目前，最優(yōu)選的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)為玉米來(lái)源的Ac/Ds系統(tǒng)，盡管從其它品種中得到的元件也可以使用。許多植物，然而，已知含有轉(zhuǎn)座子。它們典型地通過(guò)從體細(xì)胞突變體產(chǎn)生的多樣化來(lái)檢測(cè)。有關(guān)轉(zhuǎn)座子的綜述可以見(jiàn)于Nevers等，Adv.in Bot.Res.12:103-203(1987)。
所需載體將優(yōu)選地包含一種含有設(shè)計(jì)用于起動(dòng)植物中感興趣基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)座子。細(xì)菌或病毒起源的輔助序列，也典型地被包括在內(nèi)以允許該載體克隆進(jìn)入細(xì)菌或噬菌體宿主中。
載體也將典型地含有一種輔助的可選擇的標(biāo)記基因，通過(guò)該標(biāo)記基因可以在培養(yǎng)基中鑒定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。通常，標(biāo)記基因?qū)⒕幋a抗生素抗性蛋白。其它編碼額外功能的輔助DNA序列也可以存在于載體上。例如，就農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化來(lái)說(shuō)，也將包括T-DNA序列以便于隨后轉(zhuǎn)移到植物染色體上。
除了以上概述的基于核酸的策略，其它植物中抑制蛋白質(zhì)合成的方法也為技術(shù)人員所熟知。這些方法包括但不限于，化學(xué)誘變及放射線(xiàn)照射。化學(xué)誘變是使一種化學(xué)物質(zhì)與植物細(xì)胞接觸結(jié)果使DNA鏈損傷。然后該細(xì)胞用其自身的修復(fù)機(jī)制在下一個(gè)準(zhǔn)備用于細(xì)胞分裂的染色體復(fù)制期間退火雙鏈DNA。然而，修復(fù)機(jī)制經(jīng)常是不完善的并在雙鏈DNA中發(fā)生錯(cuò)配。有細(xì)胞分裂時(shí)，其中之一的子代細(xì)胞含有錯(cuò)配的DNA并因此形成突變。
放射也導(dǎo)致突變。植物細(xì)胞優(yōu)選地用X-射線(xiàn)照射，然而，紫外線(xiàn)輻射也引起DNA鏈的斷裂。與化學(xué)誘變相似，細(xì)胞不完美的修復(fù)機(jī)制在子代細(xì)胞中創(chuàng)造突變。當(dāng)用這些細(xì)胞再生植株，該突變就存在于基因組中并能傳給下一代植物。Ⅴ．植物選擇育種當(dāng)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物后，選擇隨之的子代以選擇含有賦予一種特異有益性狀的遺傳材料的后代，例如，籽粒結(jié)構(gòu)，是有益的。在選擇開(kāi)始之前，然而，期望基因組的遺傳圖應(yīng)該被制作。遺傳圖通過(guò)尋找遺傳上互相連鎖(在連鎖群中)的多態(tài)性標(biāo)記，或與基因連鎖或QTL影響感興趣的表型性狀來(lái)制作。標(biāo)記基因排列進(jìn)入連鎖群作為該標(biāo)記將來(lái)之用的參考及精確地定位基因或QTL相關(guān)標(biāo)記是有用的。這些QTL′s中的許多具有多個(gè)的亞基因座及通過(guò)該亞基因座的單倍型。每一種單倍型提供一種在基因座內(nèi)的不同的等位基因組分，因此，與僅僅一個(gè)基因座有兩個(gè)等位基因相比，它拓展這些標(biāo)記基因座的用途到更多的圖譜研究中。A．植物鑒定本發(fā)明的后代及轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)基因型或表型進(jìn)行鑒定。基因型分析是鑒定特殊遺傳物質(zhì)的存在或缺失。為鑒定嘌呤二氫吲哚基因是否成功地引入后代植物中，本發(fā)明的親本植物也需進(jìn)行基因型分析。
表型分析是鑒定表型性狀的缺失或存在。表型性狀是一植物由其遺傳物質(zhì)及環(huán)境因素互作所確定的物理特性。表型性狀可以是或者簡(jiǎn)單的，如孟德?tīng)栃誀?Mendelian)，或者復(fù)雜的，如，數(shù)量性狀。孟德?tīng)栃誀钍峭ㄟ^(guò)帶有顯性基因的雜交植株表現(xiàn)出來(lái)的。例如，需要春化作用這一性狀，這種需要(冬性)對(duì)于不需要(春性)來(lái)說(shuō)是隱性的。
數(shù)量表型性狀是指后代植株的物理特征介于兩個(gè)親本之間的性狀。僅僅為了討論的目的，轉(zhuǎn)基因植物的親本是基因組供體及嘌呤二氫吲哚基因的供體。一種數(shù)量性狀的一個(gè)實(shí)例為小麥籽粒結(jié)構(gòu)。
1．DNA分析a．DNA指紋分析通常，“DNA指紋分析”(DNA Fingerprinting)是一個(gè)廣義的術(shù)語(yǔ)，用于指示那種評(píng)估從各種來(lái)源分離到的DNA中的序列差異的方法。典型地，DNA指紋分析用于分析及比較不同生物物種來(lái)源的DNA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，DNA指紋分析用于評(píng)價(jià)個(gè)體之間，尤其是親本，后代及轉(zhuǎn)基因植株之間的關(guān)系。
由指紋分析得到的DNA序列差異稱(chēng)為DNA多態(tài)性。生物體DNA多態(tài)性存在可以指示這樣一生物體的遺傳起源和作為那種生物體的特征性遺傳標(biāo)記。這樣的多態(tài)性可由基因組的插入，缺失，和/或突變而產(chǎn)生。
在本領(lǐng)域中已知許多用于DNA指紋分析的方法。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)應(yīng)用限制性?xún)?nèi)切酶消化DNA之后經(jīng)過(guò)凝膠電泳，對(duì)消化的DNA進(jìn)行大小分離，將大小分離的DNA與一特異性多核苷酸片段(或“多核苷酸探針”)雜交。這里使用的探針是一種用放射性同位素或其它易于鑒定方式標(biāo)記的生物化學(xué)標(biāo)記。探針用于鑒定DNA，基因，基因產(chǎn)物或蛋白質(zhì)的特異區(qū)域。因此，一種“多核苷酸探針”是能夠用來(lái)鑒定互補(bǔ)核酸序列的核酸分子。多核苷酸探針的序列可能已知，也可能未知。多核苷酸探針結(jié)合的限制性片段分子量大小的差異反應(yīng)了DNA樣品的序列差異，即DNA多態(tài)性。見(jiàn)Tanksley，生物技術(shù)7:257-264(1988)。因此，一種“多態(tài)性DNA片段”是具有獨(dú)特大小和序列的DNA片段，它以另外一種獨(dú)特的分子量大小存在于其它的DNA樣品中或在其它DNA樣品中不存在。
其它產(chǎn)生DNA片段用于指紋分析的方法如使用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增特異的DNA序列。見(jiàn)，如，Williams，核酸研究18:6531-6353(1990)(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù))，Heath，核酸研究21:5782-5785(簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)技術(shù))和PCT申請(qǐng)WO93/06239(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)技術(shù))。也見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利4,683,195號(hào)及美國(guó)專(zhuān)利4,683,202號(hào)(討論P(yáng)CR擴(kuò)增技術(shù))。
一種有用的分析轉(zhuǎn)移的遺傳標(biāo)記存在的技術(shù)，RAPD分析被用于本發(fā)明中分析后代植株的基因型信息。RAPD分析在基因組水平上檢測(cè)重組事件并在特異且隨機(jī)產(chǎn)生的DNA片段的基礎(chǔ)上檢測(cè)。由于它不需要如上所述標(biāo)記的核酸探針或雜交，它可以很快完成。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，基因組DNA從親本及后代中分離。每一基因組DNA樣品用一套引物擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳來(lái)產(chǎn)生DNA圖譜。DNA的瓊脂糖電泳在本領(lǐng)域中是熟知的。如果期望，該P(yáng)CR引物能被用放射性同位素或熒光團(tuán)標(biāo)記以便更好地檢測(cè)低濃度的DNA。然而，在擴(kuò)增過(guò)程中通?？梢援a(chǎn)生足夠的DNA片段，以致于不需要標(biāo)記，DNA圖譜可以通過(guò)溴化乙錠(EB)，染色凝膠而觀(guān)察到，它也是一種標(biāo)準(zhǔn)方法。
假如泳道中母本DNA圖譜與后代DNA泳道中的圖譜相同，那就是沒(méi)有發(fā)生DNA交換，該后代是自花授粉或克隆的結(jié)果。如果后代的DNA圖譜與親本DNA圖譜有任何一點(diǎn)不同，則說(shuō)明基因組發(fā)生了重組。
所有這些PCR為基礎(chǔ)的指紋分析方法導(dǎo)致產(chǎn)生大量特異大小及序列的可復(fù)制的DNA片段，它們可通過(guò)大小，典型地，通過(guò)凝膠電泳分離。通過(guò)大小分離的片段的觀(guān)察或被直接用一種熒光染料觀(guān)察或被標(biāo)記的多核苷酸探針雜交或被PCR過(guò)程中標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物(放射性地或熒光性地)并緊接著在凝膠上檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)物來(lái)實(shí)現(xiàn)。
b．制備及利用標(biāo)記以檢測(cè)多態(tài)性核酸盡管編碼必需蛋白質(zhì)的DNA序列在不同物種之間高度保守，但有一些DNA區(qū)域是不編碼的或編碼部分不具關(guān)鍵功能的蛋白質(zhì)，因此，絕對(duì)保守的核酸序列很難選到。遺傳變異的主要原因是添加，缺失或點(diǎn)突變，存在于植物群體中的個(gè)體基因組的重組及可轉(zhuǎn)座元件。
點(diǎn)突變是典型地造成DNA復(fù)制不精確的原因。在減數(shù)分裂形成生殖細(xì)胞或有絲分裂產(chǎn)生克隆期間，DNA聚合酶轉(zhuǎn)換堿基，或者轉(zhuǎn)換(即一種嘌呤變?yōu)榱硪环N嘌呤或一種嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N嘧啶)或者顛換(也就是嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)猷奏ぜ胺粗?。如果DNA聚合酶之外切功能不能對(duì)錯(cuò)配進(jìn)行校正，這種堿基轉(zhuǎn)變將被保持。在萌發(fā)或下次細(xì)胞分裂(在克隆細(xì)胞時(shí))期間，帶有點(diǎn)突變的DNA鏈就成為互補(bǔ)鏈的模板，堿基改變即摻入到基因組中。
可轉(zhuǎn)座的元件是在基因組中具有轉(zhuǎn)移或跳躍到新位置能力的DNA序列。本領(lǐng)域中已知的幾個(gè)轉(zhuǎn)座子的實(shí)例(見(jiàn)如，F(xiàn)reeling M.，植物生理學(xué)年鑒35:277-298(1984)；Haring等，植物分子生物學(xué)16:449-469(1991)；及Walbot，植物分子生物學(xué)年鑒43:49-82(1992))。
技術(shù)人員能設(shè)計(jì)用于檢測(cè)標(biāo)記的探針核酸，包括PCR引物探針，等位基因-特異探針，RAPD探針等用于檢測(cè)這里所述及的基因座的多態(tài)性核苷酸，以及下面討論的遺傳連鎖序列。適當(dāng)?shù)目寺〖皽y(cè)序技術(shù)的實(shí)例以及足以指導(dǎo)技術(shù)人員通過(guò)許多克隆操作的說(shuō)明可見(jiàn)于Berger &Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques(分子克隆技術(shù)指南)，酶學(xué)方法第152卷Academic Press,Inc.,San Diego,CA(Berger)；Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(分子克隆-實(shí)驗(yàn)手冊(cè))(2ND ED)第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor Press,NY(1989),(Sambrook)；及分子生物學(xué)常用方法，F(xiàn).M.Ansubel等編，常用方法，Current Protocols,a joint venturebetween Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.,(全部及包括1997年增刊)(Ausubel)。提供用于克隆的細(xì)菌及噬菌體目錄，如，由ATCC,The ATCC Catalogue of Bacteria andBacteriophage(ATCC細(xì)菌及噬菌體目錄)，Gherna等(編)(1992)ATCC出版。另外用于測(cè)序，克隆和分子生物學(xué)其它方面的基本程序及潛在的理論因素也見(jiàn)于Lewin,Genes V(基因V),Oxford UniversityPressInc.,NY(1995)(Lewin)；及Watson等，Recombinant DNA(重組DNA),2ND ED(第二版),Scientific American Books(美國(guó)科學(xué)叢書(shū)),NY(1992)。
生物試劑和實(shí)驗(yàn)儀器的制造廠(chǎng)商的產(chǎn)品信息中也提供了已知生物學(xué)方法中有用的信息。這樣的制造廠(chǎng)商包括Sigma Chemical Company(Sigma化學(xué)公司)(Saint Louis,MO)；New England Biolabs(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室)(Beverly,MA)；R & D系統(tǒng)(Minneapolis,MN)；Pharmacia LKB生物技術(shù)(Piscataway,NJ)；Clontech實(shí)驗(yàn)室公司(PaloAlto,CA)；Chemgenes公司，(Waltham MA)Aldrich化學(xué)公司(Milwaukee,WI)；Glen研究公司(Sterling,VA)；GIBCO BRL生命技術(shù)公司(Gaithersberg,MD)；Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland)；Invitrogen(San Diego,CA)；Perkin Elmer(Foster City,CA)；及Stratagene；以及許多其它為技術(shù)人員所知的商業(yè)來(lái)源(source)。
本發(fā)明的核酸組合物，無(wú)論是DNA,RNA,cDNA，基因組DNA或其類(lèi)似物，或這些分子的雜合體，均從生物來(lái)源中分離或體外合成而得到。本發(fā)明的核酸存在于植物，整個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞裂解液或部分純化或基本上很純的形式中。
適合于擴(kuò)增作為分子探針的序列或產(chǎn)生隨后用于亞克隆的核酸片段的體外擴(kuò)增技術(shù)是已知的。足以指導(dǎo)技術(shù)人員通過(guò)這樣體外擴(kuò)增方法的技術(shù)實(shí)例包括多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR),Qβ復(fù)制酶擴(kuò)增及其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如，NASBA)可見(jiàn)于Berger,Sambrook，及Ausubel以及美國(guó)專(zhuān)利4,683,202；PCR ProtocolsA Guide to Methods And Applications(PCR方案，一本方法及應(yīng)用手冊(cè))(Innis等編)，Academic Press Inc.San Diego,CA(1990)(Innis)；Arnheim & Levinson(1990年10月1日)C & EN 36-47；Kwoh等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)87:1874(1990)；Lomell等，臨床化學(xué)雜志35:1826(1989)；Landegren等，科學(xué)241:1077-1080(1988)；Van Brunt,生物技術(shù)8:291-294(1990)；Wu & Wallace，基因4:560(1989)；Barringer等，基因89:117(1990)，及Sooknanan & Malek，生物技術(shù)13:563-564(1995)。改進(jìn)的體外擴(kuò)增核酸的克隆方法在Wallace等，美國(guó)專(zhuān)利5,426,039中已有描述。技術(shù)人員將意識(shí)到基本上任何RNA都能轉(zhuǎn)變成適于限制性?xún)?nèi)切酶消化，PCR擴(kuò)增及用反轉(zhuǎn)錄酶及一種聚合酶測(cè)序的雙鏈DNA，見(jiàn)，Ausubel,Sambrook及Berger，全部出處同上。
用作探針的寡核苷酸，例如，在體外擴(kuò)增方法中，用作基因探針，或作為抑制成份(如核酶)典型地根據(jù)固相亞磷酰胺三醋法化學(xué)合成，該方法由Beaucage & Caruthers,Tetrahedron Letts.,22(20):1859-1862(1981)描述，用Needham-VanDevanter等，核酸研究12:6159-6168(1984)中所述的一種自動(dòng)合成儀合成。寡核苷酸也能通過(guò)技術(shù)人員已知的各種商業(yè)來(lái)源定制和訂購(gòu)。如果需要，可用天然的丙烯酰胺凝膠電泳或如Pearson & Regnier，染色體雜志255:137-149(1983)所描述的陰離子交換HPLC(高效液相色譜)進(jìn)行寡核苷酸的純化。合成的寡核苷酸序列可用Maxam & Gilbert，酶學(xué)方法65:499-560(1980)中所述的化學(xué)降解法進(jìn)行驗(yàn)證。
c．探針標(biāo)記和檢測(cè)用于原位檢測(cè)，體外擴(kuò)增(PCR,LCR等)，雜交技術(shù)(等位基因特異性雜交，原位分析，Southern分析，Northern分析等)或其它任一檢測(cè)步驟中的探針，可以用帶有任何可檢測(cè)的成份，通過(guò)光譜的，化學(xué)的，生化的，免疫化學(xué)的，電子的，光學(xué)的或化學(xué)的手段進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明中的有用標(biāo)記物包括光譜標(biāo)記物，例如熒光染料(例如，熒光素異硫氰酸鹽，Texos紅，羅丹明，地高辛，生物素等)，放射標(biāo)記物(如，3H,125I,35S,14C,32P,33P，等)，酶(例如，辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶等)及其它本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的標(biāo)記物。
一般來(lái)說(shuō)，監(jiān)測(cè)探針-目標(biāo)核酸雜交的檢測(cè)器適用于特殊的標(biāo)記物。典型的檢測(cè)器包括分光光度計(jì)，光電管及光電二極管，顯微鏡，閃爍計(jì)數(shù)器，照相機(jī)，膠片等，以及其中不同的組合。適宜的檢測(cè)器的實(shí)例可以從許多商業(yè)性組織中獲得，這對(duì)技術(shù)人員是很熟悉的。
由于放射性核苷酸的摻入核酸是直接的，該檢測(cè)代表一種優(yōu)選的標(biāo)記策略。摻入放射性標(biāo)記物的實(shí)例技術(shù)包括用一種激酶或磷酸酶進(jìn)行末端標(biāo)記，缺口平移(nick translation)，使用聚合酶摻入有放射性的核苷酸及其它已知的策略。
熒光標(biāo)記物也是優(yōu)選的標(biāo)記物，具有操作時(shí)不需要特別小心的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)選的標(biāo)記物典型地具有下述一或幾個(gè)特點(diǎn)高敏感性，高穩(wěn)定性，低背景，低環(huán)境敏感性和高特異性。現(xiàn)已普遍知道的摻入到本發(fā)明的標(biāo)記物中的熒光半分子包括但不限于Texas red(德克薩斯紅)，羅丹明，和熒光素。具有偶聯(lián)一種元件之功能的單個(gè)的熒光復(fù)合物在本發(fā)明的儀器或檢測(cè)中能夠被較理想地檢測(cè)，或者它可被修飾以摻入到這種功能物包括如丹磺酰氯；熒光素如3,6-二羥-9-二芐吡喃醇中。許多熒光標(biāo)記物都可從公司購(gòu)買(mǎi)，如SIGMA化學(xué)公司(St.Louis,MO)，分子探針，R & D系統(tǒng)(Minneapolis,MN),Pharmacia LKB生物技術(shù)公司(Piscataway,NJ),Clontech實(shí)驗(yàn)室公司(Palo Alto,CA),Chem基因公司，Aldrich化學(xué)公司(Milwaukee,WI),Glen研究公司，GIBCOBRL生物技術(shù)公司(Gaithersberg,MD),Fluka Chemica-BiochemikaAnalytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland)，及應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applies Biosystems)(Foster City,CA)以及其它為技術(shù)人員熟知的商業(yè)來(lái)源。
2．形態(tài)學(xué)和數(shù)量性狀的研究后代和轉(zhuǎn)基因植株的外形也被用來(lái)鑒定本發(fā)明的植株。籽粒結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)性狀及嘌呤二氫吲哚蛋白的表達(dá)通過(guò)產(chǎn)生的后代監(jiān)測(cè)。另外，植物高度，穗長(zhǎng)(玉米中)，葉形等數(shù)量性狀也被監(jiān)測(cè)以保證植物品系保持健康。
數(shù)量性狀的資料對(duì)鑒定后代雜種優(yōu)勢(shì)的表達(dá)或抑制是很重要的。為了可信，每一親本和后代的每一個(gè)數(shù)量性狀至少要做2份，優(yōu)選20份觀(guān)察記錄資料進(jìn)行變異性分析。然后確定每一各種變異性狀至少5％顯著差異(LSD)的植株的結(jié)果及變異系數(shù)，并列表。
除后代雜種優(yōu)勢(shì)的表達(dá)和抑制外，數(shù)量性狀的差異能夠表明遺傳水平的重組，親本及后代的細(xì)胞學(xué)特征也可用于比較鑒定雜種后代。細(xì)胞學(xué)分析包括但不限于染色體作圖來(lái)檢測(cè)雜交后代中是否有親本染色體的存在和原位雜交，如同功酶分析。
熒光原位雜交(FISH)是觀(guān)察DNA序列的一個(gè)重要技術(shù)。該方法與已成為實(shí)驗(yàn)室基因定位研究的常規(guī)方法。例如，F(xiàn)ISH用于將基因定位到特定染色體區(qū)域或確定產(chǎn)生的克隆在染色體上的順序。另外，F(xiàn)ISH也能用于比較親本和后代的染色體。
一類(lèi)叫做“染色體染料”的FISH探針是可以得到的。該類(lèi)探針對(duì)確定染色體結(jié)構(gòu)非常有用，因?yàn)樗麄兓蚨嗷蛏僖恢碌嘏c一給定的染色體的全長(zhǎng)雜交。染料用來(lái)確定一個(gè)細(xì)胞的染色體組，結(jié)構(gòu)異常如轉(zhuǎn)位，及鑒定親本標(biāo)記染色體的起源。
用于FISH中標(biāo)記DNA探針的方法有很多，包括非直接法，即利用酶反應(yīng)將半抗原如生物素或地高辛摻入到DNA中。之后與染色體中期分裂相或分裂間期核進(jìn)行雜交，通過(guò)免疫學(xué)方法將熒光標(biāo)記連到雜交體上。最近，熒光染料可直接摻入探針，不需要中間步驟即可檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)的FISH染料包括熒光素，羅丹明，德克薩斯紅(Texas Red)和CascadeBlue。多重探針FISH分析可利用半抗原或熒光染料標(biāo)記不同探針來(lái)完成。
B．等位基因-特異性雜交(ASH)篩選后代是否具有其親本賦予的特殊序列的一個(gè)特別優(yōu)選的技術(shù)是等位基因特異性雜交，或“ASH”。該技術(shù)的基礎(chǔ)是一短的單鏈寡核苷酸探針與一單鏈目標(biāo)核酸當(dāng)它們的堿基完全互補(bǔ)時(shí)能夠穩(wěn)定退火。雜交可通過(guò)探針上的放射活性或非放射活性標(biāo)記來(lái)檢測(cè)(標(biāo)記探針或其它核酸的方法在下面詳述)。
當(dāng)在不同基因型中一個(gè)DNA片段的堿基組成在一個(gè)或幾個(gè)核苷酸位點(diǎn)不同時(shí)，ASH的標(biāo)記呈現(xiàn)多態(tài)性。對(duì)每種多態(tài)性設(shè)計(jì)兩個(gè)或多個(gè)不同的ASH探針，使它們除了多態(tài)性核苷酸外，DNA序列一致。每一探針與一個(gè)等位基因序列精確相符以使那些探針能夠區(qū)別于所有的兩者之中的一個(gè)等位基因序列。每一探針與目標(biāo)DNA雜交。通過(guò)合適的探針設(shè)計(jì)和嚴(yán)格的條件可以排除雜交中探針和目標(biāo)DNA之間的單一堿基的錯(cuò)配，未結(jié)合探針會(huì)被洗掉。在這種情況下，只有其中一種探針會(huì)與一目標(biāo)樣品雜交，這種樣品是等位基因的純合型或同源型(一種等位基因是通過(guò)探針與靶子之間的DNA同源性來(lái)判斷的)。兩個(gè)等位基因的雜合的或異源的樣品會(huì)與兩個(gè)探針都雜交。每一等位基因都有一個(gè)探針使多態(tài)性成為遺傳上的共顯性從而使它在鑒定接合性(zygosity)時(shí)非常有用。另外，當(dāng)與兩個(gè)探針都不發(fā)生雜交時(shí)，共顯性的ASH系統(tǒng)很有用，以致于對(duì)照實(shí)驗(yàn)可直接鑒定不足夠的目標(biāo)DNA或出現(xiàn)的新等位基因。
當(dāng)通過(guò)雜交確定只有一個(gè)等位基因出現(xiàn)或缺失時(shí)，或者用一個(gè)探針來(lái)發(fā)生雜交時(shí)，ASH標(biāo)記被用作顯性標(biāo)記。二者之一的等位基因可通過(guò)缺乏雜交信號(hào)推斷。異源性靶核酸(如多等位基因植物的染色體DNA)通過(guò)將包含一個(gè)基因組核酸不同多態(tài)性的2個(gè)或多個(gè)探針與其同時(shí)雜交來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
一種ASH探針的設(shè)計(jì)是當(dāng)堿基對(duì)完全互補(bǔ)時(shí)，它能與靶核酸形成一穩(wěn)定的雙螺旋。探針與靶之間一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)配阻止雜交的穩(wěn)定。這一過(guò)程的許多變化證明這是正確的。探針和靶分子任選地或者是RNA或?yàn)樽冃訢NA；靶分子是與探針序列互補(bǔ)的任何長(zhǎng)度的核苷酸。探針設(shè)計(jì)成可與靶DNA任一鏈雜交；探針?lè)肿哟笮〉姆秶诒ＷC不同嚴(yán)格雜交條件下波動(dòng)。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(見(jiàn)如，Mullis & Faloona，酶學(xué)方法155:335-350(1987)及上述文獻(xiàn))可允許在相對(duì)較小的體積中從低濃度的核酸擴(kuò)增ASH的靶序列(Koenraadt & Jones，植物病理學(xué)82:1354-1358(1992)；Iitia等，生物技術(shù)17:566-571(1994))。另外，從基因組DNA來(lái)的靶序列用限制性?xún)?nèi)切酶消化，通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行大小分離。靶序列結(jié)合到膜的表面，或如美國(guó)專(zhuān)利5,468,613號(hào)所述，將ASH探針序列結(jié)合到膜上，典型地會(huì)發(fā)生雜交反應(yīng)。
利用核苷酸等位基因和多態(tài)性，通過(guò)PCR擴(kuò)增基因組DNA的核酸片段，以點(diǎn)雜交的形式將靶DNA轉(zhuǎn)到膜上，與一標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，放射后顯影觀(guān)察得到ASH數(shù)據(jù)。
在一種變化中，ASH技術(shù)被應(yīng)用到多個(gè)多態(tài)性核酸的快速特異檢測(cè)的固相分析中。典型地，ASH探針與一固相支持物相連，靶核酸(如基因組核酸)與探針雜交?？捎靡粺晒鈭F(tuán)標(biāo)記探針或靶序列或全部標(biāo)記。當(dāng)靶序列被標(biāo)記時(shí)，可用結(jié)合的熒光來(lái)檢測(cè)雜交。當(dāng)探針被標(biāo)記時(shí)，可通過(guò)標(biāo)記物的萃滅來(lái)檢測(cè)雜交。當(dāng)探針和靶全部被標(biāo)記時(shí)，可通過(guò)檢測(cè)由于兩個(gè)結(jié)合標(biāo)記物的接近而導(dǎo)致的顏色轉(zhuǎn)移(color shift)來(lái)檢測(cè)雜交。一系列標(biāo)記策略、標(biāo)記物等，尤其是熒光的應(yīng)用在前面已有描述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在一固相支持物合成一種ASH探針陣列。用芯片掩蔽(clip masking)技術(shù)和光保護(hù)化學(xué)有可能產(chǎn)生排列有序的核酸探針。這些排列，如已知的“DNA芯片”或非常大規(guī)模的固定化高分子陣列(“VLSIPSTM”陣列)在兩種大約1平方厘米到幾平方厘米的基質(zhì)上能夠包括數(shù)萬(wàn)個(gè)確定的探針區(qū)。
固相核酸陣列檢測(cè)靶核酸的構(gòu)建和應(yīng)用在文獻(xiàn)中已有描述。見(jiàn)，F(xiàn)odor等，科學(xué)251:767-777(1991)；Sheldon等，臨床化學(xué)39(4):718-719(1993)；Kozal等，自然醫(yī)學(xué)2(7):753-759(1996)及美國(guó)專(zhuān)利5,571,639號(hào)。也見(jiàn)于PCT/US 95/16155(WO96/17958)。簡(jiǎn)而言之，組合策略可合成含有大量探針的陣列用最少數(shù)量的合成步驟來(lái)完成。例如，只利用32步化學(xué)合成反應(yīng)有可能合成并附著所有可能的DNA 8聚體聚寡核苷酸(48或65536個(gè)可能的組合)。一般地，VLSIPSTM程序提供了一個(gè)方法，只用4n個(gè)合成步驟在一個(gè)陣列中就可產(chǎn)生4n個(gè)不同的寡核苷酸探針。
用自動(dòng)亞磷酰胺化學(xué)法和類(lèi)似于計(jì)算機(jī)芯片工業(yè)的光抗(photoresist)技術(shù)的芯片掩蔽技術(shù)在玻璃表面完成寡核苷酸陣列的光-指導(dǎo)的(Light-directed)組合合成。典型地，玻璃表面可用一含有功能團(tuán)如被光不穩(wěn)定(photolabile)保護(hù)基團(tuán)封閉的羥基基團(tuán)或胺基基團(tuán)的硅烷(silane)試劑衍生化。通過(guò)照相平版印刷屏蔽的光解被用來(lái)選擇性地暴露功能基團(tuán)，這些功能基團(tuán)可與5′-光保護(hù)的核苷酸亞磷酰胺反應(yīng)。亞磷酰胺只與那些發(fā)光的位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)(通過(guò)去除光不穩(wěn)定的封閉集團(tuán)而暴露)。這樣，亞磷酰胺只加在前面步驟中選擇性暴露的區(qū)域上。這些步驟不斷重復(fù)，直到理想的序列陣列在固體表面合成出來(lái)。不同寡核苷酸類(lèi)似物在陣列不同位置的組合合成(combinatorial synthesis)是由合成中發(fā)光(illumination)的方式及加入偶聯(lián)劑的順序決定的。用熒光顯微鏡或激光掃描顯微鏡來(lái)監(jiān)測(cè)靶核酸與陣列的雜交。
除利用現(xiàn)有技術(shù)設(shè)計(jì)、制造(build)和使用探針陣列外，技術(shù)人員還可以從專(zhuān)業(yè)的陣列制造商那里定做陣列和陣列閱讀器(array-readingdevices)。
探針的設(shè)計(jì)受到目的應(yīng)用的影響將被意識(shí)到。例如，當(dāng)幾個(gè)等位基因特異性探針與靶序列相互作用在一個(gè)單一陣列進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如單一DNA芯片上，較為理想的是所有探針都具有相似的解鏈溫度。因此，探針的長(zhǎng)度要調(diào)整以便在陣列中的所有探針的解鏈溫度都非常相似(將意識(shí)到當(dāng)不同探針具有不同GC含量時(shí)，需要使不同探針具有不同長(zhǎng)度以達(dá)到一特定的Tm值)。盡管解鏈溫度是探針設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮的一個(gè)主要方面，還需要考慮其它因素來(lái)進(jìn)一步調(diào)整探針的組成(construction)。
C．標(biāo)記輔助篩選當(dāng)基因或QTL和一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物一起被作圖并發(fā)現(xiàn)連鎖不穩(wěn)定時(shí)，有可能利用那些標(biāo)記物來(lái)篩選那些基因或QTL的理想的等位基因-一個(gè)稱(chēng)作標(biāo)記輔助篩選(MAS)的過(guò)程。簡(jiǎn)而言之，在一被篩選的植株來(lái)源-生物樣品中的相應(yīng)于標(biāo)記核酸的一種核酸被檢測(cè)。該檢測(cè)可采用探針核酸與標(biāo)記雜交的形式，如利用等位基因-特異性雜交，southern分析，northern分析，原位雜交，隨著標(biāo)記區(qū)域PCR擴(kuò)增的引物的雜交等。這里介紹了檢測(cè)標(biāo)記物的各種程序。當(dāng)在生物樣品中的一特定標(biāo)記物被鑒定存在(或不存在)，該植株被選擇，即，通過(guò)選擇育種用其制作后代植物。
MAS在植物和動(dòng)物育種中的另一用途是通過(guò)回交育種輔助恢復(fù)回歸親本基因型。用于回歸親本基因型的MAS可與用于使用這些標(biāo)記的期望遺傳材料的MAS相結(jié)合。相應(yīng)地，有可能利用標(biāo)記物將QTLs引入具有另外的理想遺傳背景的谷類(lèi)作物中，利用本發(fā)明的標(biāo)記物來(lái)篩選QTL及其它期望的遺傳背景。
以上所述的任何克隆或擴(kuò)增策略對(duì)產(chǎn)生重疊克隆的連續(xù)序列都是很有用的，因此提供重疊的核酸，該核酸是遺傳上連鎖的核酸在分子水平上表現(xiàn)出的物理位置關(guān)系。這一策略的一個(gè)普遍的例子是在各個(gè)生物測(cè)序工程中，對(duì)重疊克隆進(jìn)行測(cè)序以提供染色體的全部序列。在該程序中，按照上述文獻(xiàn)中的標(biāo)準(zhǔn)步驟構(gòu)建生物體的cDNA或基因組DNA文庫(kù)。分離單個(gè)克隆并測(cè)序，將重疊的序列信息排列以提供該生物體的序列。也見(jiàn)Fleischmann等，科學(xué)269:496-512(1995)中描述的全部基因組的隨機(jī)測(cè)序及全部流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)基因組的排列；Fraser等，科學(xué)270:397-403(1995)中描述的完整的Mycoplasmagenitalium基因組的隨機(jī)測(cè)序及排列；及Bult等，科學(xué)273:1058-1073(1996)中描述的Methanococcus jannaschii基因組的隨機(jī)測(cè)序和排列。Hagiwara & Curtis，核酸研究24(12):2460-2461(1996)中發(fā)展了一種“長(zhǎng)距離測(cè)序儀”(long distance sequencer)的PCR流程，從非常大的克隆中產(chǎn)生重疊核酸以幫助測(cè)序以及一些擴(kuò)增并標(biāo)記這些重疊核酸到適當(dāng)?shù)臏y(cè)序模板的方法。這些方法可與鳥(niǎo)槍測(cè)序(shotgunsequencing)技術(shù)聯(lián)合使用以提高在整個(gè)生物體測(cè)序工程中主要應(yīng)用的鳥(niǎo)槍法的效率。
當(dāng)這些技術(shù)應(yīng)用于本發(fā)明時(shí)，對(duì)鑒定和測(cè)定遺傳上與上述基因座連鎖的基因組核酸序列是很有用的。
Ⅵ．實(shí)施例A．植物培養(yǎng)及籽粒硬度測(cè)量T.aestivum,“Falcon”及“Heron”品種(Symes等，澳大利亞農(nóng)業(yè)研究雜志20,971-979(1969))的軟及硬質(zhì)近似同源品系(NILs)于1995年夏天種植于Lind,WA附近。籽粒硬度用近-遠(yuǎn)紅外線(xiàn)反射的(NIR)分光光度計(jì)(型號(hào)450,Ttchnicon,Tarrytown,NY)，以UDY研磨籽粒(方法39-70A；AACC 1995)測(cè)量。單谷粒硬度讀數(shù)(SKCS)通過(guò)對(duì)300粒谷粒樣品的硬度分析獲得，使用Perten 4100型SKCS，按照制造商建議的操作步驟進(jìn)行(Perten Instruments,Reno,NV)。
按照Law，遺傳學(xué)53:487(1996)所述程序從軟質(zhì)紅小麥“中國(guó)春”(Chinese Spring)和硬質(zhì)紅冬麥品種“Cheyenne”形成83個(gè)純合的染色體5D替換系(Substitution lines)。從“Cheyenne”來(lái)的puro B的46位是絲氨酸。每個(gè)品系均含有20對(duì)正常整倍體的“中國(guó)春”(CS)染色體和1對(duì)重組的“中國(guó)春”/“Cheyenne”5D染色體(CS(CNN5D))?！癓angdon”硬質(zhì)，“Langdon”替換系LDN 5D(5B)，其中“中國(guó)春”5D染色體替換了5B染色體，CS Nulli 5D/Tetra 5A中“中國(guó)春”5D染色體被替換成另一拷貝的5A染色體，它們均按常規(guī)培養(yǎng)方式生長(zhǎng)在溫室中。表1籽粒結(jié)構(gòu)測(cè)定
從表1中可以看出，從硬籽粒品種“Cheyenne”轉(zhuǎn)移突變puro B蛋白造成后代植物(CS(CNN5D))籽粒比親本品系“中國(guó)春”的籽粒明顯堅(jiān)硬。后代植株的SKCS值為79而親本的SKCS為60。相反地，“Langdon”硬質(zhì)小麥(durum wheat)中來(lái)源于“中國(guó)春”的puro A和puro B的表現(xiàn)造成籽粒SKCS值從88降到24；基本上產(chǎn)生了一軟質(zhì)硬小麥(soft durum wheat)。
如上所述，一些硬質(zhì)小麥品種缺少puro B絲氨酸突變?！癋alcon”，一個(gè)這樣的品種，被選擇用于進(jìn)一步研究。用“Falcon”做為硬質(zhì)(hard)等位基因供體，“Heron”做為軟質(zhì)等位基因供體得到互補(bǔ)的軟及硬質(zhì)NILs(近同源品系)(Symes，澳大利亞農(nóng)業(yè)研究雜志16:113-123(1965))。在這套NILs中，當(dāng)或者“Falcon”或者“Heron”作為回歸親本時(shí)，軟和硬質(zhì)品系都存在。每套NILs由回交7代產(chǎn)生并進(jìn)行軟質(zhì)或硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的篩選。示于

圖1的NILs代表利用或者“Falcon”或者“Heron”作為回歸親本創(chuàng)造的一種硬質(zhì)及軟質(zhì)NIL。
檢驗(yàn)了puro A蛋白的有無(wú)與籽粒軟/硬之間的連鎖。44個(gè)“Falcon”/“Heron”硬/軟質(zhì)NILs中的每一個(gè)都通過(guò)SDS-PAGE(如下所述)分離friabilin成份蛋白進(jìn)行鑒定并計(jì)數(shù)(scoring)puro A蛋白的存在。依照基因組DNA中擴(kuò)增puro A的能力(如下所述)，NILs也進(jìn)行了puroA基因含量的鑒定。單個(gè)品系要被分為無(wú)puro A(無(wú)效的，null)的“Falcon”型或帶有puro A的“Heron”型。通過(guò)兩種不同方法獲得的這些NILs表型籽粒硬度示于圖1，其中指明了puro A類(lèi)型。還發(fā)現(xiàn)兩種NILs是含有puro A和那些缺少這種蛋白的種子的混合物。對(duì)每?jī)煞NNILs(AUS 90077及AUS 90254)的10個(gè)單獨(dú)的谷粒進(jìn)行了puro A存在的分析。NIL AUS 90077,NIR硬39，十分之六的谷粒含有puro A。NIL AUS 90254,NIR硬度29，顯示十分之七的谷粒含有puro A。依照這兩個(gè)NILs的中間硬度值，混合物的百分比十分符合預(yù)期的頻率。(軟質(zhì)NIL平均NIR等于15。硬質(zhì)NIL平均NIR等于71。預(yù)期的NIL 90077等于{(6×15)+(4×71)}/10=37.4。預(yù)期的NIL 90254等于{(7×15)+(4×71)}/10=31.8)。每一個(gè)這些NILs混合物的觀(guān)察百分比可能解釋了它們的某些中同硬度值。結(jié)果，在puro A存在及這套遺傳原種(genetic stocks)中的籽粒柔軟性間沒(méi)有重組。
B．puro A,puro B及GSP-1 DNA的分離及PCR擴(kuò)增用Dellaporta等，植物分子生物學(xué)報(bào)道1:19-21(1983)的方案分離小麥胚乳DNA。設(shè)計(jì)識(shí)別存在于硬質(zhì)小麥品種“Wanser”及“Cheyenne”中的puro B的絲氨酸序列變化的引物用于擴(kuò)增13個(gè)軟質(zhì)地小麥和11個(gè)硬質(zhì)地小麥。puro B中的絲氨酸突變是一個(gè)氨基酸即46位甘氨酸(GGC)變?yōu)榻z氨酸(AGC)的改變(Gautier等，植物分子生物學(xué)25:43-57(1994))。采用這種序列改變來(lái)制備甘氨酸或絲氨酸特異的PCR引物(Giroux ＆ Morris，遺傳學(xué)理論及應(yīng)用95:857-864(1997))(SEQ ID NO:9及10)?！坝操|(zhì)”或絲氨酸-特異性3′puroB引物末端帶有T而“軟質(zhì)”或甘氨酸-特異性引物3′末端帶有C。
用小麥品種Gly-46或Ser-46特異序列SEQ ID NO:9,SEQ IDNO:10及SEQ ID NO:11來(lái)擴(kuò)增puro B序列在其它文獻(xiàn)中也有描述(Giroux & Morris，遺傳學(xué)理論及應(yīng)用95:857-864(1997))。如前述(Gautier等，植物分子生物學(xué)25:43-57(1994))用SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8作為引物已完成小麥品種中puro A序列的擴(kuò)增。每套引物的退火溫度保持在58℃。單個(gè)PCR反應(yīng)重復(fù)兩次或多次。
用硬質(zhì)絲氨酸特異性引物(puro B)檢測(cè)到了一大小特異性產(chǎn)物(250bp)用作指示46位絲氨酸的存在。而硬質(zhì)小麥puro B中甘氨酸到絲氨酸的改變是很普遍的，也發(fā)現(xiàn)了某些例外。大多數(shù)(7/11)硬質(zhì)小麥顯出一絲氨酸特異的250 bp帶，而4個(gè)硬質(zhì)小麥品種，“Express”,“Butte86”,“Westbred 926”及“Falcon”沒(méi)有。四種例外的每一個(gè)都顯示出一甘氨酸特異性“軟質(zhì)”小麥puro B帶。所有13個(gè)軟質(zhì)小麥產(chǎn)生甘氨酸特異性帶而沒(méi)有絲氨酸特異性帶。對(duì)每一個(gè)應(yīng)用的基因組DNAs的全puro B編碼序列擴(kuò)增是可能的。
一GSP-1相關(guān)克隆，SR 3.1，檢測(cè)一種RFLP明顯與籽粒硬度連鎖(Jolly等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)93:2408-2413(1996))，然而還沒(méi)有轉(zhuǎn)錄或基因表達(dá)分析的報(bào)導(dǎo)。我們用“Heron”,“Falcon”進(jìn)行Northern雜交分析，實(shí)驗(yàn)中用了4個(gè)硬/軟質(zhì)NILs，發(fā)現(xiàn)GSP-1轉(zhuǎn)錄水平的差異與籽粒硬度不一致。另外，還檢測(cè)了從“中國(guó)春”及CS(CNN5D)來(lái)源的4個(gè)單獨(dú)的硬質(zhì)和軟質(zhì)品系。
另外的基因，稱(chēng)為GSP-1，已表明與籽粒柔軟性有關(guān)(Rahman等，歐洲生物化學(xué)雜志223:917-925(1994)；及Jolly等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)93:2408-2413(1996))。從開(kāi)花后14天的“中國(guó)春”的種子中提取RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增GSP-1探針。該探針用以下引物制備5′引物由DNA序列5′GTAGTGAGCACTACTATTGC3′(SEQ IDNO:11)組成，3′引物為5′-GAGCCTTCCCTCCAAGTGC-3′(SEQID NO:12)的反向互補(bǔ)序列。PCR退火溫度為58℃。
SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12擴(kuò)增GSP1b的一內(nèi)部400bp片段(Rahman等，歐洲生物化學(xué)雜志223:917-925(1994))。該400 bp片段用作探針，在高嚴(yán)格條件下與“Falcon”/“Heron”NILs的總RNA及“中國(guó)春”染色體5D替換品系(Giroux & Morris，遺傳學(xué)理論及應(yīng)用95:857-864(1997))雜交。
與“Falcon”/“Heron”NILs一樣，GSP-1轉(zhuǎn)錄與籽粒硬度無(wú)關(guān)。“Langdon”硬質(zhì)與軟質(zhì)的雙體替換品系LND-CS DS5D(5B)也都含有GSP-1轉(zhuǎn)錄物。GSP-1物理上定位于這三組每一個(gè)5號(hào)同源染色體的短臂(Gill等，遺傳學(xué)143:1001-1012(1996))上，其轉(zhuǎn)錄物不單由5D控制。依據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為在影響籽粒柔軟性方面，GSP-1的直接作用是不可能的。
Northern印跡分析Friabilin成份轉(zhuǎn)錄物及蛋白分析在4個(gè)puro B中不含有甘氨酸到絲氨酸轉(zhuǎn)變的硬質(zhì)小麥品種中進(jìn)行。探針是用上述puro A、puro B和GSP-1引物擴(kuò)增的核酸序列。RNA分離，northern凝膠印跡的制備，及探測(cè)(probing)按前述標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Giroux & Morris，遺傳學(xué)理論及應(yīng)用95:857-864(1997))。puro A,puro B及GSP 1探針用隨機(jī)引物法制備(Gibco/BRL，生命技術(shù)公司Gaithersburg,MD)，其特異活性超過(guò)1×109cpm/μg DNA。每次northern印跡放射自顯影曝光前在67℃進(jìn)行2次高嚴(yán)格洗滌。
嘌呤二氫吲哚轉(zhuǎn)錄物水平發(fā)現(xiàn)由染色體5D控制，因?yàn)镃S Nulli 5D/Tetra 5A mRNA不含有嘌呤二氫吲哚轉(zhuǎn)錄本而LDN 5D(5B)mRNA含有轉(zhuǎn)錄本。
含有非-絲氨酸puro B小麥mRNA的Northern印跡表明這四個(gè)硬質(zhì)小麥品種的每一個(gè)都不含有任何可檢測(cè)到的puro A的轉(zhuǎn)錄本。每一個(gè)硬質(zhì)小麥基因型的puro B的轉(zhuǎn)錄水平與軟質(zhì)小麥基因型的相似。C．Triton-X114可溶蛋白的分離及蛋白電泳Friabilin成份在SDS-PAGE凝膠中被分離為二種明顯的成分(Morris等，谷類(lèi)科學(xué)雜志21:167-174(1994))，鑒定為puro A及puro B。對(duì)“中國(guó)春”(軟質(zhì))，“中國(guó)春”的二倍體染色體5D替換系，CS-CNN DS5D(硬質(zhì))(“Cheyenne”硬質(zhì)小麥品種作為5D染色體對(duì)的供體)，“Heron”及“Falcon”進(jìn)行了friabilin成分的分離。
Triton-X100-可溶性蛋白通過(guò)triton-X114的相分配法進(jìn)行分離(Bordier，生物學(xué)化學(xué)雜志256:1604-1607(1981))。壓碎的全部谷粒加入1％(v/v)溶解在Tris緩沖鹽溶液(TBS,10mM Tris,150mMNaCl,pH7.5)中的triton-X114，在4℃混合30分鐘，之后短暫離心(10000g,5分鐘)，將上清轉(zhuǎn)移到37℃再離心30分鐘。下層的去污劑相轉(zhuǎn)移到一個(gè)新管再重復(fù)相分配。相分配后，去污劑富集相中的蛋白用80％(v/v)丙酮沉淀。沉淀物用丙酮，乙醚洗滌并干燥。加入SDS樣品緩沖液(不加還原劑)調(diào)整蛋白上樣量為每道相當(dāng)于1mg全谷粒。SDS-PAGE按標(biāo)準(zhǔn)方法完成，用13.5％T,2.6％C，及0.75mm厚的SE 600膠(Bio-Rad)，凝膠用TCA固定法銀染(Morris等，谷類(lèi)科學(xué)雜志21:167-174(1994))。
仔細(xì)檢查帶型發(fā)現(xiàn)上層帶在“Falcon”中是缺失的，很可能是puroA，因?yàn)閒riabilin帶的缺失與puro A轉(zhuǎn)錄的缺失相對(duì)應(yīng)。該puro A帶在所有軟質(zhì)小麥如“中國(guó)春”和“Heron”及所有puro B絲氨酸型的硬質(zhì)小麥突變體如“Cheyenne”及硬質(zhì)“中國(guó)春”/“Cheyenne”的雙體替換衍生物，CS-CNN DS5D中是存在的?！癊xpress”,“Butte 86”及“Westbred926”中也缺少相應(yīng)于puro A的蛋白帶?！癓angdon”硬質(zhì)缺少任何量的friabilin蛋白，而用“中國(guó)春”5D染色體替換“Langdon”5B染色體對(duì)的LGD-CSDS 5D(5B)則保持有friabilin及籽粒柔軟性。
D．根癌農(nóng)桿菌感染介導(dǎo)的puro A及puro B核酸序列的水稻(oryza cativa)轉(zhuǎn)染上述的puro A及puro B基因用于轉(zhuǎn)化水稻。利用Li等，植物細(xì)胞報(bào)道12:250-255(1993)的修改方法將該基因引入易感水稻中。簡(jiǎn)要地說(shuō)，利用潮霉素(hygromycin)構(gòu)建物pMON 410(來(lái)自Monsanto)和一含有感興趣序列的bluescript載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。另外，pB 822的Kpn片段克隆到pTA818載體，pTA818來(lái)自于Invitrogen載體pcr1000并含有1kb片段RAPD818。最后構(gòu)建好的質(zhì)粒叫做pC822。植株在潮霉素(30mg/L)中篩選，之后用Northern印跡篩選嘌呤二氫吲哚轉(zhuǎn)錄物的存在。
轉(zhuǎn)基因植株結(jié)種后，可用上述方法對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行黃單胞菌屬(Xanthomonas)抗性的檢測(cè)。
E．經(jīng)過(guò)轟擊法轉(zhuǎn)化Triticum aestivum12.5μg的每種DNA包裹到金顆粒上用于轟擊進(jìn)Bobwhite培育品種小麥未成熟胚中，轟擊前，胚胎在含有甘露醇的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí)，轟擊后再培養(yǎng)20小時(shí)，除此之外，基本上按照Weeks等，植物生理學(xué)102:1077-1084(1993)的方法。依照轉(zhuǎn)化體在再生的愈傷組織和綠芽階段對(duì)1mg/L bialaphos的抗性及再生發(fā)根期對(duì)3mg/Lbialaphos的抗性按上文所述的Weeks等的方法對(duì)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩選。
所提供的上述實(shí)例用以說(shuō)明本發(fā)明但不限制其范圍。本發(fā)明的其它變異形式對(duì)本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將是容易明白的并且包含在附加的權(quán)利要求中。這里引用的所有出版物，專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)都作為參考文獻(xiàn)引用。
序列表SEQ ID:1嘌呤二氫吲哚A的cDNASEQ ID:2嘌呤二氫吲哚A的氨基酸序列 SEQ ID NO:3嘌呤二氫吲哚B的cDNASEQ ID NO:4嘌呤二氫吲哚B的氨基酸序列 SEQ ID NO:5絲氨酸替換的嘌呤二氫吲哚B的cDNASEQ ID NO:6替換的嘌呤二氫吲哚B的氨基酸序列 SEQ ID NO:7 puro A正義鏈引物5′-ATGAAGGCCCTCTTCCTCA-3′SEQ ID NO:8 puro A反義鏈引物5′-TCACCAGTAATAGCCAATAGTG-3′SEQ ID NO:9 puro B正義鏈引物5′-ATGAAGACCTTATTCCTCCTA-3′SEQ ID NO:10 puro B反義鏈5′-TCACCAGTAATAGCCACTAGGGAA-3′SEQ ID NO:11 puro B絲氨酸替代序列的反義鏈5′-CCACCAGTAATAGCCACTAGGGAA-3′SEQ ID NO:11 GSP1正義鏈5′GTAGTGAGCACTACTATTGC 3′SEQ ID NO:12 GSP1反義鏈5′-GAGCCTTCCCTCCAAGTGC-3′
權(quán)利要求
1．一種產(chǎn)生具有軟質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所說(shuō)的植物來(lái)源于至少一個(gè)具有硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的親本植物，所說(shuō)的方法包含以下步驟將可操作地編碼嘌呤二氫吲哚蛋白的核酸序列引入來(lái)源于親本植物的細(xì)胞中，其中所說(shuō)的核酸序列在嚴(yán)格條件與從SEQ ID NO:1和SEQID NO:3組成的一組中選出的核酸序列雜交；以及從含有該核酸序列的細(xì)胞產(chǎn)生后代植株。
2．權(quán)利要求1中的方法，其中后代植物從由硬質(zhì)小麥，高粱，水稻，大麥和玉米組成的組中選出。
3．權(quán)利要求2中的方法，其中的后代植物是玉米。
4．權(quán)利要求1中的方法，其中的引入步驟是通過(guò)農(nóng)桿菌屬感染介導(dǎo)的。
5．權(quán)利要求1中的方法，其中的嘌呤二氫吲哚蛋白是從由嘌呤二氫吲哚A和嘌呤二氫吲哚B組成的組中選出。
6．一種產(chǎn)生具有硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所說(shuō)的植物來(lái)源于至少一個(gè)具有軟質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的親本植物，所說(shuō)的方法包含以下步驟引入阻止嘌呤二氫吲哚蛋白表達(dá)的核酸序列進(jìn)入來(lái)源于親本植物的細(xì)胞中；以及從該細(xì)胞產(chǎn)生植株。
7．方法6中的植物，其中植物是從由小麥、黑麥、黑小麥和蒸麥組成的組中選出。
8．權(quán)利要求6中的方法，其中的核酸序列阻止嘌呤二氫吲哚A或嘌呤二氫吲哚B的表達(dá)。
9．權(quán)利要求6中的方法，其中的核酸序列可操作地編碼一種核酶。
10．權(quán)利要求6中的方法，其中核酸序列可操作地編碼一種反義核酸，所說(shuō)的核酸在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3互補(bǔ)的核酸序列雜交。
11．權(quán)利要求6中的方法，其中核酸序列可操作地編碼一種轉(zhuǎn)座子。
12．權(quán)利要求6中的方法，其中引入步驟是由農(nóng)桿菌屬感染介導(dǎo)的。
13．一種產(chǎn)生具有較硬結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所說(shuō)的植物來(lái)源于至少一個(gè)具有軟質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的親本植物，所說(shuō)的方法包含以下步驟將核酸序列引入來(lái)源于親本植物的細(xì)胞中，所說(shuō)的核酸序列在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:5中所示的核酸序列雜交；以及從該細(xì)胞產(chǎn)生植株。
14．方法13中的植物，其中植物是從由小麥、黑麥、黑小麥和燕麥組成的組中選出。
15．權(quán)利要求13中的方法，其中的核酸序列是通過(guò)農(nóng)桿菌屬感染被引入細(xì)胞的。
16．來(lái)源于至少一種具有硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的親本植物的具有軟質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物，其中所說(shuō)的植物含有一個(gè)可操作地編碼嘌呤二氫吲哚蛋白的核酸序列，其中所說(shuō)的核酸序列在嚴(yán)格條件下與一個(gè)從由SEQID NO:1和SEQ ID NO:3組成的組中選出的核酸序列雜交。
17．權(quán)利要求16中的植物，從由硬質(zhì)小麥、高粱、水稻、大麥和玉米組成的組中選出。
18．權(quán)利要求17中的后代植物，其中的植物是玉米。
19．權(quán)利要求16中的后代植物，其中的嘌呤二氫吲哚蛋白是從由嘌呤二氫吲哚A和嘌呤二氫吲哚B組成的組中選出。
20．權(quán)利要求16中的后代植物，其中的核酸序列通過(guò)農(nóng)桿菌感染引入到植物中。
21．來(lái)源于至少一個(gè)具有軟質(zhì)籽粒的親本的具有較硬結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因植物，包含阻止嘌呤二氫吲哚蛋白表達(dá)的核酸序列。
22．權(quán)利要求21中的植物是從由小麥、黑麥、黑小麥和燕麥組成的組中選出。
23．權(quán)利要求21中的植物，其中的核酸序列阻止嘌呤二氫吲哚A和嘌呤二氫吲哚B的表達(dá)。
24．權(quán)利要求21中的植物，其中的核酸序列可操作地編碼一種核酶。
25．權(quán)利要求21中的植物，其中的核酸序列可操作地編碼一種反義核酸，該核酸與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3互補(bǔ)的序列雜交。
26．權(quán)利要求21中的植物，其中的核酸序列可操作地編碼一種轉(zhuǎn)座子。
27．權(quán)利要求21中的植物，其中的核酸序列是通過(guò)農(nóng)桿菌屬感染被引入到后代植物中的。
28．來(lái)源于至少一個(gè)具有軟質(zhì)籽粒的親本的具有硬質(zhì)結(jié)構(gòu)籽粒的轉(zhuǎn)基因小麥植物，它含有在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:5所示的序列雜交的核酸序列。
29．權(quán)利要求28的后代植物，其中的核酸序列可操作地編碼一種轉(zhuǎn)座子。
30．權(quán)利要求28的后代植物，其中的核酸序列是通過(guò)農(nóng)桿菌屬感染引入到后代植物的。
全文摘要
本發(fā)明提供了生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法,當(dāng)與轉(zhuǎn)基因植物來(lái)源的植物相比時(shí),該轉(zhuǎn)基因植物修飾了籽粒結(jié)構(gòu)。通過(guò)引入賦予籽粒柔軟性的數(shù)量性狀,嘌呤二氫吲哚A(puroindolineA)及嘌呤二氫吲哚B(puroindolineB),賦予轉(zhuǎn)基因植物修飾的籽粒結(jié)構(gòu)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK1311817SQ9980905
公開(kāi)日2001年9月5日 申請(qǐng)日期1999年5月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月22日
發(fā)明者C·F·莫里斯, M·J·基羅克斯 申請(qǐng)人:美國(guó)政府農(nóng)業(yè)部, 研究及發(fā)展協(xié)會(huì)有限公司