專利名稱：：編碼α－葡糖苷酶的核酸分子,合成一種改性淀粉的植物,植物的產(chǎn)生,其應用和改性淀紡的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及編碼具有馬鈴薯α-葡糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，以及制備合成改性淀粉的轉(zhuǎn)基因植物細胞及植物的方法。此外，本發(fā)明涉及含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體和宿主細胞，用根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物細胞和植物，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物合成的淀粉，涉及產(chǎn)生所述淀粉的方法?？紤]到植物組分作為可再生資源的逐漸提高的重要性，生物技術(shù)研究努力使基于植物的粗原料符合加工工業(yè)的要求。因此，為了能在盡可能多的應用領域中利用可再生資源，必須能獲得多種材料。油、脂肪和蛋白質(zhì)以及多糖組成了植物的重要可再生資源。多糖中的主要位置不僅被纖維素而且被淀粉所占據(jù)，淀粉是高等植物中最重要的貯藏物質(zhì)之一。玉米、稻和小麥以及馬鈴薯尤其在淀粉生產(chǎn)中起重要作用。多糖淀粉是化學均一單元-葡萄糖分子的多聚體。然而，它是在聚合程度和葡萄糖鏈中分支存在等方面不同的不同形式分子的高度復雜混合物。因此淀粉不是由均一的原料組成。具體地，我們區(qū)分為直鏈淀粉-α-1,4-糖苷鍵連接的葡萄糖分子的基本無分支的多聚體，和支鏈淀粉-其依次組成了不同分支的葡萄糖鏈的復雜混合物。由于額外α-1,6-糖苷鍵的存在產(chǎn)生其它的分支。在用于淀粉生產(chǎn)的典型植物如玉米或馬鈴薯中，合成淀粉由大約25％的直鏈淀粉和大約75％的支鏈淀粉組成。主要取決于分支程度、直鏈淀粉/支鏈淀粉比率、側(cè)鏈的平均長度和分布以及磷酸基的存在的淀粉分子結(jié)構(gòu)，分別對于淀粉及其水溶液的重要功能性質(zhì)是最重要的。必須提到的重要功能性質(zhì)是，例如，可溶性、退減性狀、成膜特性、粘度、顏色穩(wěn)定性、膠凝特性和結(jié)合及粘附特性。淀粉顆粒大小對于不同用途也可能是重要的。富含直鏈淀粉的淀粉的產(chǎn)生對于某些用途也是特別有意義的。此外，植物細胞中所含的改性淀粉可有利地改變植物細胞在某些條件下的性質(zhì)。例如，在進一步加工如淀粉提取之前，在含淀粉器官如種子或塊莖的貯藏期間降低淀粉降解是可行的。生產(chǎn)改性淀粉使含該淀粉的植物細胞或植物器官更適于加工也是有意義的，例如在食品制造中，如由玉米制造爆米花或玉米片，或由馬鈴薯制造炸薯片、炸薯條或馬鈴薯粉。特別有意義的是淀粉在降低冷甜度方面的改進，即在低溫下長時間貯藏后還原糖(特別是葡萄糖)的釋放減少。馬鈴著通常貯存于4-8℃的溫度下，以使貯存期間的淀粉降解減至最小。該過程中釋放的還原糖特別是葡萄糖在炸薯片或炸薯條的生產(chǎn)中導致不希望的產(chǎn)褐色素反應(所謂的美拉(Maillard)反應)。能從植物中分離的淀粉常通過化學修飾以符合特定工業(yè)目的，這種修飾通常需要時間和金錢。因此希望發(fā)現(xiàn)這種可能性，即產(chǎn)生可合成其性質(zhì)已滿足加工工業(yè)特殊需要的淀粉的植物，從而將經(jīng)濟與生態(tài)優(yōu)勢結(jié)合起來。除了植物繁殖法外，產(chǎn)生這類植物的一種可能性是利用遺傳工程方法直接遺傳改變產(chǎn)淀粉植物的淀粉代謝。但是，其前提條件是參與淀粉合成修飾和淀粉降解(淀粉代謝)的酶的鑒定與表征，和編碼這些酶的相應DNA序列的分離。引起淀粉合成的生物化學途徑基本已知。在植物細胞中，淀粉合成在質(zhì)體中發(fā)生。在光合活性組織中，這些質(zhì)體是葉綠體，在無光合活性組織中，淀粉貯藏組織是造粉體。參與淀粉合成的重要酶是，例如分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、顆粒結(jié)合淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、脫支酶、歧化酶、質(zhì)體淀粉磷酸化酶、R1酶(R1蛋白)、淀粉酶或葡糖苷酶。本發(fā)明的一個目的在于提供其它或備擇的遺傳工程方法，用于改變合成淀粉植物(例如黑麥、大麥、燕麥、玉米、小麥、高粱和谷子、西米、稻、豌豆、大豌豆(marrowfatpeas)、木薯、馬鈴薯、番茄、油籽油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆、綠豆、菜豆、香蕉或竹芋(arrowroot))中的淀粉代謝或適當?shù)暮怂岱肿樱璐四苻D(zhuǎn)化植物細胞，使得能合成有利改變的淀粉變種。這些改變的淀粉變種例如在其分支程度、直鏈淀粉/支鏈淀粉比率、磷酸含量、淀粉顆粒大小和/或側(cè)鏈的平均長度和分布(即側(cè)鏈結(jié)構(gòu))等方面顯示改變。本發(fā)明的另一目的在于提供能產(chǎn)生可合成一種經(jīng)修飾的淀粉變種的轉(zhuǎn)基因植物的方法。令人驚訝地，用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物合成一種淀粉，其在物理化學性質(zhì)和/或側(cè)鏈結(jié)構(gòu)方面以特殊方式被修飾，使得通過提供權(quán)利要求書中詳述的應用形式，達到上述的這些目的。因此本發(fā)明涉及一種編碼具有馬鈴薯α-葡糖苷酶功能的蛋白質(zhì)之核酸分子，其選自a)編碼涵蓋SEQIDNO.2所述氨基酸序列或其衍生物或部分的蛋白質(zhì)之核酸分子，b)涵蓋SEQIDNO.1所示核苷酸序列或其衍生物或部分，或相應核苷酸序列的核酸分子；c)可與a)或b)中所述核酸分子雜交，或與它們互補，優(yōu)選地與它們特異性雜交的核酸分子，及d)核酸分子，依照遺傳密碼的簡并性其核苷酸序列背離a)、b)或c)中所述核酸分子的序列。因此，本發(fā)明涉及一種編碼α-葡糖苷酶的核酸分子，其包括SEQIDNO.2或其衍生物或部分的氨基酸序列，如質(zhì)粒的cDNA插入片段(DSMNo.12348)。上述本發(fā)明的α-葡糖苷酶參與馬鈴薯的淀粉代謝，其直接或間接參與淀粉生物合成。就本發(fā)明的α-葡糖苷酶蛋白質(zhì)(或其多肽、氨基酸序列)而言，術(shù)語“衍生物”針對本發(fā)明的目的涵蓋來源于SEQIDNO.2的多肽，其包括至少163個氨基酸殘基，優(yōu)選至少227個，特別是至少293個，非常優(yōu)選大約309-322個氨基酸殘基，其選自由SEQIDNO.2的如下氨基酸殘基18H,25R,34G,37H,38G,39V,41L,42L,44S,45N,46G,47M,48D,51Y,53G,55R,56I,58Y,60V,61I,62G,63G,651,66D,67L,68Y,70F,71A,72G,75P,78V,81Q,83T,86I,87G,88R,89P,90A,92M,93P,94Y,95W,97F,98G,99F,101Q,102C,103R,105G,106Y,115V,116V,119Y,120A,124I,125P,126L,127E,128V,129M,130W,131T,132D,133I,134D,135Y,136M,137D,140K,141D,142F,143T,144L,145D,146P,147V,149F,150P,157F,161L,162H,164N,166Q,168Y,169V,171I,173D,174P,175G,176I,182Y,184T,187R,188G,189M,193V,194F196K,197R,201P,202Y,204G,206V,207W,208P,209G,211V,212Y,214P,215D,216F,217L,219P,224F,225W,228E,229I,232F,237P,239D,240G,242W,244D,245M,246N,247E,249S,250N,251F,252I,254S,260S,263D,265P,266P,267Y,268K,269I,270N,271N,272S,273G,277P,278I,282T,284P,286T,289H,291G,295E,296Y,299H,300N,301L,303G,305L,306E,310T,313A,322P,323F,325L,327R,328S,329T,330F,333S,334G,336Y,337T,339H,340W,341T,342G,343D,344N,345A,346A,348W,350D,351L,353Y,354S,355I,356P,359L,361F,362G,363L,364F,365G,367P,368M,370G,371A,372D,373I,374C,375G,376F,380T,381T,382E,383E,384L,385C,387R,388W,389I,390Q,391L,392G,393A,394F,395Y,396P,397F,399R,400D,401H,402S,406T,409Q,410E,411L,412Y,414W,416S,417V,418A,421A,424V,425L,426G,427L,428R,431L,432L,433P,436Y,438L,439M,440Y,442A,446G,448P,449I,450A,451R,452P,453L,455F,457F,458P,460D,463T,466I,469Q,470F,471L,473G,477M,479S,480P,482L,485G,489V,491A,492Y,494P,496G,497N,498W,501L,504Y,508V,513G,518L,521P,523D,524H,526N,527V,528H,531E,532G,534I,537M,538Q,539G,541A,543T,544T,547A,550T,554L,555L,556V,557V,559S,566G,567E,568L,569F,571D,579G,583G,585W,586T,588V,590F,603S,605V,606V,611A,620K,622T,625G,635Y,658F,664S,669L,671G,674F和678L并且包含至少大約1-69，優(yōu)選至少139，特別是至少194，更優(yōu)選地249，非常特別優(yōu)選地大約263-274個氨基酸殘基，其選自SEQIDNO.2的(此處顯示氨基酸的單字母編碼)1P,2K,3L,4R,5P,6R,7V,8H,9P,10S,11Q,12H,13H,14P,151,16Q,17L,19R,20P,21P,22A,23L,24H,27Y,28S,29F,30R,31Y,32F,35V,36S,43S,49I,50V,57S,64L,84Q,91A,109I,110D,112V,114L,118S,122S,152E,153R,154V,155I,156F,158L,159R,163Q,165D,172V,178I,180N,183D,186R,198D,199N,200M,203Q,205V,210N,221T,222E,223V,226R,230E,231K,236V,238F,243L,259S,262F,275H,280Y,281R,288T,293T,294M,311Y,312S,316N,317V,326V,331L,335R,338S,360S,378S,404K,408P,413S,420A,422K,430Q,437M,444I,445K,447T,461A,464F,465D,468T,4781,481I,487T,510L,511N,512Q,516M,536V,548Q,549R,551A,553K,558L,560S,561S,562K,570V,573D,574D,577Q,580R,581E,584R,591N,592S,593N,594I,595I,598K,599I,601V,602K,609R,612L,613D,615G,616L,618L,619E,623L,630R,631G,632L,634S,637L,638V,639G,641H,642Q,643Q,644G,645N,646T,647T,648M,649K,650E,651S,652L,653K,654Q,656G,6S7Q,659V,660T,661M,666M,668I,670I,679Y,680I,681I,682T,693H,700R,703G,705H,706G,707V,709L,710L,712S,713N,714G,715M,716D,718Y,720G,721R,722I,724Y,726V,727I,728G,729G,730I,731D,732L,733Y,734F,735A,736G,739P,742V,743Q,745T,747I,748G,749R,750P,751A,753M,754P,755Y,756W,757F,758G,759F,761Q,762C,763R,764G,765Y,768V,769V,771Y,772A,775I,776P,777L,778E,779V,780M,781W,782T,783D,784I,785D,786Y,787M,788D,789K,790D,791F,792T,793L,794D,795P,796V,798F,799P,804F,806L,807H,808N,810Q,812Y,813V,814I,816D,817P,818G,819I,821Y,822T,824R,825G,826M,828V,829F,831K和832R就本發(fā)明的α-葡糖苷酶蛋白質(zhì)(多肽、氨基酸序列)而言，術(shù)語“部分”針對本發(fā)明的目的包括一種多肽或寡肽，其由本發(fā)明的核酸分子或其衍生物編碼的α-葡糖苷酶的至少約10-50，優(yōu)選至少100，更優(yōu)選至少200，特別是至少400，最優(yōu)選大約550-675個氨基酸殘基組成。本發(fā)明還涉及一種含有如質(zhì)粒DSMNo.12347的cDNA插入片段的SEQIDNO.1的核酸分子之核酸分子，所述質(zhì)粒DSMNo.12347已于1998年7月24日保藏于DSZM，或其衍生物或部分，特別是編碼區(qū)或其衍生物或部分。就本發(fā)明的核酸分子(核苷酸或多核苷酸)而言，術(shù)語“衍生物”針對本發(fā)明的目的涵蓋一種包括至少478個核苷酸，優(yōu)選至少668個，特別是至少860個，非常優(yōu)選大約907-945個核苷酸的多核苷酸，其選自SEQIDNO.1的如下核苷酸4A,6A,12A,13C,17G,25C,32A,34C,38A,45T,47A,49C,51T,56G,62C,65C,68T,73C,76G,77G,78A,79T,97G,100G,101G,106A,108T,109C,110A,111T,112G,113G,114G,115G,116T,119T,122T,125T,127A,130A,131G,132C,133A,134A,135T,136G,137G,139A,140T,141G,142G,143A,144T,146T,151T,152A,153T,157G,158G,161A,162T,164G,166A,167T,169A,171T,172T,173A,174C,175A,176A,178G,179T,181A,182T,183T,184G,185G,187G,188G,191T,193A,194T,195T,196G,197A,200T,202T,203A,206T,208T,209T,211G,212C,214G,215G,216A,217C,221C,223C,224C,226G,232G,233T,236T,237G,239A,241C,242A,243G,244T,247A,248C,249T,254T,256A,257T,259G,260G,263G,265C,266C,268G,269C,272C,274A,275T,276G,277C,278C,280T,281A,283T,284G,285G,289T,290T,292G,293G,297T,298C,299A,301C,302A,304T,305G,308G,310T,313G,314G,316T,317A,323A,324T,326T,331G,332A,335T,338A,343G,344T,346G,347T,349G,355T,356A,357T,358G,359C,360A,362A,365C,366T,370A,371T,373C,374C,377T,379G,380A,382G,383T,385A,386T,387G,388T,389G,390G,391A,392C,394G,395A,397A,398T,399T,400G,401A,402T,403T,404A,406A,407T,408G,409G,410A,411T,412G,415T,418A,419A,421G,422A,424T,425T,426C,427A,428C,431T,433G,434A,436C,437C,439G,440T,443A,445T,446T,448C,449C,454G,455A,459G,461T,469T,470T,471T,473T,478A,481C,482T,484C,485A,489G,490A,491A,492T,493G,496C,497A,499A,501A,502T,503A,505G,506T,511A,512T,515T,517G,518A,519T,520C,521C,523G,524G,526A,527T,536A,538A,542C,544T,545A,546T,547G,550A,551C,553T,556A,559A,560G,562G,563G,565A,566T,567G,569A,570A,575A,576T,577G,578T,580T,581T,584T,586A,587A,590G,593A,594T,597T,601C,602C,604T,605A,607C,610G,611G,616G,617T,619T,620G,621G,622C,623C,625G,626G,631G,632T,634T,635A,637T,640C,641C,643G,644A,646T,647T,650T,653A,655C,656C,659C,660T,662C,663T,670T,671T,673T,674G,675G,680A,682G,683A,685A,686T,689A,690G,694T,695T,697C,701A,704T,707T,709C,710C,713T,715G,716A,717T,718G,719G,722T,724T,725G,726G,728T,730G,731A,733A,734T,735G,736A,737A,739G,740A,745T,746C,748A,749A,751T,752T,754A,755T,758C,759T,760T,761C,764C,766C,773C,778T,779C,780T,782C,785T,787G,788A,791A,792T,793C,794C,796C,797C,799T,800A,802A,803A,805A,806T,808A,809A,811A,812A,514T,815C,817G,818G,820G,829C,830C,832A,833T,835A,841A,844A,845C,848T,650C,851C,854C,856A,857C,860C,862A,865C,866A,868T,870T,871G,872G,875A,883G,884A,886T,887A,890A,891T,892G,895C,896A,897T,898A,899A,902T,904T,906T,907G,908G,914T,916G,917A,918A,920C,921T,924A,925G,927C,928A,929C,937G,938C,941T,944T,953C,858A,962G,964C,965C,967T,968T,971T,974T,979A,980G,982T,983C,985A,986C,988T,989T,990T,995G,997T,998C,1000G,1001G,1003A,1006T,1007A,1008C,1009A,1010C,1013C,1015C,1016A,1018T,1019G,1020G,1021A,1022C,1024G,1025G,1027G,1028A,1029T,1030A,1031A,1032T,1033G,1034C,1035T,1036G,1037C,1039A,1042T,1043G,1044G,1046A,1048G,1049A,1052T,1057T,1058A,1059C,1060T,1061C,1063A,1064T,1066C,1067C,1072A,1073T,1076T,1080C,1081T,1082T,1083T,1084G,1085G,1088T,1090T,1091T,1092T,1093G,1094G,1096A,1097T,1099C,1100C,1102A,1103T,1104G,1106T,1108G,1109G,1111G,1112C,1114G,1115A,1116T,1117A,1118T,1120T,1121G,1123G,1124G,1125T,1126T,1127T,1138A,1139C,1141A,1142C,1144G,1145A,1147G,1146A,1151T,1153T,1154G,1157G,1159C,1160G,1162T,1163G,1164G,1165A,1166T,1168C,1169A,1170G,1171C,1172T,1174G,1175G,1177G,1176C,1180T,1181T,1183T,1184A,1186C,1187C,1189T,1190T,1193C,1195A,1196G,1198G,1199A,1201C,1202A,1204T,1205C,1208C,1213G,1216A,1217C,1220C,1225C,1226A,1228G,1229A,1231C,1232T,1234T,1235A,1240T,1241G,1242G,1243G,1244A,1246T,1247C,1249G,1250T,1252G,1253C,1254T,1256C,1259C,1261G,1262C,1264A,1267A,1270G,1271T,1274T,1276G,1277G,1279C,1280T,1281C,1283G,1292T,1294C,1295T,1297C,1298C,1301A,1306T,1307A,1309A,1313T,1315A,1316T,1317G,1318T,1319A,1321G,1322A,1324G,1325C,1328A,1331T,1333A,1336G,1337G,1339A,1342C,1343C,1345A,1346T,1348G,1349C,1351C,1352G,1354C,1355C,1357C,1358T,1360T,1362C,1363T,1364T,1367C,1369T,1370T,1372C,1373C,1376A,1378G,1379A,1387A,1388C,1390T,1393G,1396A,1397T,1403C,1405C,1406A,1407G,1408T,1409T,1412T,1415T,1417G,1418G,1420A,1422A,1424G,1427T,1429A,1430T,1431G,1433T,1435T,1436C,1438C,1439C,1444C,1445T,1448A,1450C,1453G,1454G,1456G,1463C,1465G,1466T,1470T,1471G,1472C,1474T,1475A,1477T,1480C,1481C,1486G,1487G,1488A,1489A,1490A,1492T,1493G,1494G,1496T,1501C,1502T,1504T,1508A,1510T,1511A,1514C,1520C,1522G,1523T,1527T,1533T,1537G,1538G,1540A,1544A,1547T,1549A,1552C,1559C,1561C,1562C,1565C,1567G,1568A,1569T,1570C,1571A,1575T,1577A,1578A,1579G,1580T,1582C,1583A,1586T,1588C,1591G,1592A,1593A,1594G,1595G,1597A,1600A,1601T,1604T,1605G,1606G,1609A,1610T,1611G,1612C,1613A,1614A,1615G,1616G,1619A,1621G,1622C,1625T,1626G,1627A,1628C,1630A,1631C,1636G,1639G,1640C,1645A,1648A,1649C,1652C,1654T,1658A,1660C,1661T,1664T,1666G,1667T,1669G,1670T,1675A,1676G,1689C,1690A,1692C,1696G,1697G,1699G,1700A,1703T,1705T,1706T,1709T,1711G,1712A,1715A,1717G,1724A,1727T,1732A,1733T,1735G,1736G,1745G,1746A,1747G,1748G,1750A,1753T,1754G,1755G,1756A,1757C,1760T,1762G,1763T,1765A,1768T,1769T,1775G,1776C,1781T,1783A,1789A,1796T,1802T,1807T,1806C,1809A,1810G,1811A,1813G,1814T,1816G,1817T,1828T,1830T,1831G,1832C,1836G,1845A,1846T,1848G,1851C,1853T,1855G,1858A,1859A,1862T,1864A,1865C,1868T,1871T,1873G,1874G,1876T,1877T,1881A,1890A,1894T,1897A,1901G,1908G,1925A,1929A,1945A,1953T,1958A,1966G,1972T,1973T,1976T,1984G,1988T,1990T,1991C,1997T,2006T,2009T,2011G,2012G,2020T,2021T,2024A,2027T和2033T其還包括至少大約1-93個核苷酸，優(yōu)選至少187個，特別是至少261個，更優(yōu)選至少336個，以及非常優(yōu)選大約354-369個核苷酸，其選自SEQIDNO.1的如下核苷酸1C,10A,16A,19G,21T,23A,24C,26C,30A,33A,36C,39T,43A,48G,52C,53A,54C,57T,58C,59C,60G,63G,64G,66G,67C,69C,70C,71A,72C,74G,75G,80A,81C,86T,88C,89G,91T,93C,94T,96C,99C,102A,103G,104T,105T,107G,123T,128G,138C,145A,149T,156G,170G,189G,190T,192A,199T,201G,264T,271G,279A,291C,294A,309G,325A,327T,328G,333T,334G,340C,341T,342G,348G,354T,363G,364T,375G,384T,420G,429A,432C,438A,444C,456G,457C,458G,460G,462A,464T,465T,467T,468T,472C,476G,477G,480G,486T,487C,494A,507A,513A,514G,516A,522A,525A,534C,537C,540T,543A,549C,552C,557G,558G,564C,573A,592G,595A,596A,599T,603C,608A,609A,612G,614T,627G,636T,639T,651A,661A,665A,667G,668T,669A,678A,687T,688G,692A,706G,708A,727C,744G,771A,774A,775T,776C,783C,784T,798C,807A,813C,819C,825C,834C,838T,842G,843A,855C,858T,863C,864A,878C,879A,881T,882G,885G,888T,903T,912A,931T,934A,935G,940T,949G,954T,957T,976G,977T,987T,991C,1002C,1004G,1012T,1038T,1041C,1062C,1068T,1079G,1087T,1095A,1132A,1140T,1161C,1167T,1179A,1188A,1203C,1206T,1210A,1211A,1212G,1215C,1223C,1224C,1239T,1258G,1263C,1265A,1275T,1278G,1287T,1288C,1291T,1293A,1296T,1305T,1310T,1311G,1312C,1314T,1330A,1338G,1340C,1341T,1344C,1347T,1353A,1356C,1386G,1389A,1391T,1402A,1416C,1432A,1441A,1443A,1446T,1455A,1459A,1460C,1461C,1467T,1497T,1500C,1503C,1518C,1521T,1528T,1530G,1531A,1534C,1535A,1546A,1557C,1563A,1566A,1575A,1581A,1590T,1596G,1602A,1603T,1607T,1608C,1632A,1641T,1643A,1644G,1650T,1651G,1653A,1657A,1659A,1665T,1668C,1672C,1678A,1680C,1681A,1683C,1684A,1695A,1698A,1704A,1708G,1718A,1719C,1738A,1743G,1749G,1751G,1752G,1758G,1761A,1772A,1773C,1774A,1784T,1785T,1788C,1791T,1792A,1795A,1800G,1801G,1803T,1805A,1812G,1815T,1825C,1834C,1837G,1842A,1843G,1847T,1852C,1857A,1869A,1875A,1878T,1884T,1886T,1891G,1895T,1896G,1902C,1903T,1904A,1905T,1906G,1909C,1911T,1913T,1914T,1915G,1918T,1919C,1920A,1922A,1923C,1924C,1932G,1936A,1940C,1948G,1949A,1955T,1957A,1959G,1960C,1962G,1964G,1969C,1975G,1979C,1981A,1986A,1989C,1995G,1996A,2001A,2002A,2005T,2007G,2008A,2035T,2038A,2040C,2042T,2044A,2045C,2046T,2047T和2048A在如上所示的SEQIDNO.1或SEQIDNO.2的本發(fā)明之核苷酸或氨基酸序列的獨立元件中的位置之編碼中，根據(jù)本發(fā)明的所述序列之衍生物也應理解為這樣的序列，其中，單個序列元件的編碼可背離根據(jù)本發(fā)明的SEQIDNO.1或2的那些。此處決定性的是至少一種序列區(qū)段(“部分”)與本發(fā)明序列的明顯一致。這種一致可利用普通技術(shù)人員的知識以簡單的方法，例如使用適當?shù)挠嬎銠C程序加以確定，例如通過將本發(fā)明的序列與待比較的序列進行序列比較(所謂序列排列對比)。這類計算機程序例如為市售的(例如，Omiga,ver1.1.3,OxfordMolecularLtd.,Oxford，英國)，有時它也是序列數(shù)據(jù)庫(例如，EMBL,GenBank)中的組成部分，例如，鑒定最可能的相同性程度，或如果適當?shù)脑?，化學等效物，序列元件，特別是考慮特定的插入和/或缺失，其可引起單獨序列元件或序列區(qū)段的移碼，其可由此影響序列元件或序列區(qū)段的編號。就本發(fā)明的編碼α-葡糖苷酶的核酸分子而言，術(shù)語“衍生物”進一步涵蓋由添加、刪除、插入或重組一種或多種核苷酸而背離SEQIDNO.1的，且符合上述條件的核酸分子。就本發(fā)明的編碼α-葡糖苷酶的核酸分子而言，術(shù)語“衍生物”進一步包括一種本發(fā)明的核酸分子的互補性或反向互補性序列(多核苷酸)，或其衍生物或其部分。關(guān)于根據(jù)編碼α-葡糖苷酶的本發(fā)明之核酸分子的術(shù)語“部分”，涵蓋一種多核苷酸或寡核苷酸，其由編碼α-葡糖苷酶或其部分的本發(fā)明核酸分子的至少大約15-35，優(yōu)選至少大約36-100，更優(yōu)選至少200，特別是至少400，尤其特別是至少800，及最優(yōu)選大約1400-1700個核苷酸組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的術(shù)語“衍生物”和/或“部分”涵蓋如上所述的多核苷酸，或者多肽或寡肽，其顯示獲自馬鈴薯的α-葡糖苷酶基因(即編碼α-葡糖苷酶的核酸分子)或α-葡糖苷酶多肽的功能和/或結(jié)構(gòu)等效物。術(shù)語“功能和/或結(jié)構(gòu)等效物”一般為同義，是指目標創(chuàng)造性分子的等效物或相似的功能，如適當，尤其是指生物學功能。本發(fā)明還涉及重組核酸分子，包括a)一種核苷酸分子，其編碼一種具有α-葡糖苷酶功能的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地來自馬鈴薯，或所述核苷酸序列的部分，以及b)一種或多種核苷酸序列，其編碼一種選自A組的蛋白質(zhì)，包括分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、顆粒結(jié)合淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、脫支酶、歧化酶、質(zhì)體淀粉磷酸化酶、R1酶、淀粉酶、葡糖苷酶，或編碼選自A組的蛋白質(zhì)的核苷酸序列的片段，和可與這些核苷酸序列或其片段之一雜交的核酸分子，優(yōu)選地脫氧核糖核酸分子或核糖核酸分子，特別優(yōu)選地cDNA分子。特別優(yōu)選的是可與這些核苷酸序列或其部分之一特異性雜交的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的核苷酸分子編碼一種具有如SEQIDNO.1所示的馬鈴薯α-葡糖苷酶之功能的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由SEQIDNO.2的核苷酸序列編碼。Seq.IDNo.1:cgaatacgaataaccgacgctaaccatcaacgatgggaagtgccggaagaaattctccaccgtccaccaccgccgtcgccgccgtcaacctccaactcctcatcagaaaaccactccccaattaccctctctaacccaaactcagacctagagttcacccttcacaacaccatcccattcagcttcaccgtccgccggcgctccaccggggatactcttttcgatacttcgccggagttagtcatggggttttgcttctgagtagcaatggcatggatattgtgtatacgggtgataggattagttacaaggtgattggagggttaattgatttgtatttctttgccggaccttcgccggaaatggtggtggatcagtatactcagcttattggtcgtcctgctgctatgccatattggtctttcggatttcaccaatgccggtggggttacaagaatattgatgatgttgaactggtagtggatagttatgcaaagtctagaataccgctggaggttatgtggactgatattgattacatggatggttttaaggacttcacactcgatccagttaacttcccactggagcgggtaattttttttctcaggaagcttcatcagaatgatcagaaatatgtactaatagtagatccaggaattagcatcaacaatacatatgacacctataggagaggcatggaagcagatgtcttcataaaacgcgataatatgccctaccaaggggttgtttggccagggaatgtttattatcctgattttctaaatccagctactgaagtattttggagaaatgaaattgagaagttccaggatctcgtaccttttgatggcctgtggcttgacatgaatgaattgtcaaacttcataacttcccctcctacaccatcatctacctttgatgatcctccctacaagataaacaactctggcgatcacttgcccatcaattatagaacagttccagccacttctacacattttggtgatacaatggagtataatgtccataacctttatggattacttgaatctagagccacttatagtgcattggttaatgtcactggtaaaaggccattcattcttgtaagatcaacttttcttggctctggcagatacacgtcacattggactggagataatgctgctacctggaacgatttggcatactccattcctactatcttgagctttggattgtttggaattccaatggttggagctgatatatgtggtttttcaagtaacactactgaagagctttgccgccgctggattcagcttggagcattctatccatttgcaagagaccactctgctaaggacacaaccccccaagagctctatagttgggattcagttgctgcagcagccaagaaagtccttgggctccgatatcagttacttccatacttttatatgcttatgtacgaggcacatataaaagggactcccattgcacgacccctcttcttctctttccctcaagatgccaagacatttgatatcagcacacagttccttctcggtaaaggtgtcatgatctcacctatacttaagcaaggagcaacctctgttgatgcatatttccctgctggaaactggtttgacctcttcaattactctcgctctgtgagtttgaatcaaggaacatatatgacacttgacgcaccaccagatcatataaatgtacatgttcgtgaagggaacatattggtcatgcaaggggaagcaatgacaacacaagctgctcagaggactgcattcaaactccttgtcgtgctgagcagcagcaaaaacagcacaggagaactatttgtggacgatgacgatgaggtgcagatgggaagagagggagggaggtggacgctagttaagtttaacagcaatatcattggcaataaaattgtggttaaatcagaggttgtgaatggacgatatgcgctggatcaaggattggtccttgaaaaggtgacattattgggatttgaaaatgtgagaggattgaagagctatgagcttgttggatcacaccagcaagggaacacaacaatgaaggaaagtcttaagcagagtggacagtttgttactatggaaatctcagggatgtcaatattgatagggaaagagttcaaattggagctatacatcattacttaacaaatgaattaagttatatacgcttgttgtatgaaattttctttcatttatcaatgcagtttaatttatgataaaaaaaaaaaaaaaaaSeq.IDNo.2:PKLRPRVHPSQHHPIQLHRPPALHRGYSFRYFAGVSHGVLLLSSNGMDIVYTGDRISYKVIGGLIDLYFFAGPSPEMVVDQYTQLIGRPAAMPYWSFGFHQCRWGYKNIDDVELVVDSYAKSRIPLEVMWTDIDYMDGFKDFTLDPVNFPLERVIFFLRKLHQNDQKYVLIVDPGISINNTYDTYRRGMEADVFIKRDNMPYQGVVWPGNVYYPDFLNPATEVFWRNEIEKFQDLVPFDGLWLDMNELSNFITSPPTPSSTFDDPPYKINNSGDHLPINYRTVPATSTHFGDTMEYNVHNLYGLLESRATYSALVNVTGKRPFILVRSTFLGSGRYTSHWTGDNAATWNDLAYSIPTILSFGLFGIPMVGADICGFSSNTTEELCRRWIQLGAFYPFARDHSAKDTTPQELYSWDSVAAAAKKVLGLRYQLLPYFYMLMYEAHIKGTPIARPLFFSFPQDAKTFDISTQFLLGKGVMISPILKQGATSVDAYFPAGNWFDLFNYSRSVSLNQGTYMTLDAPPDHINVHVREGNILVMQGEAMTTQAAQRTAFKLLVVLSSSKNSTGELFVDDDDEVQMGREGGRWTLVKFNSNIIGNKIVVKSEVVNGRYALDQGLVLEKVTLLGFENVRGLKSYELVGSHQQGNTTMKESLKQSGQFVTMEISGMSILIGKEFKLELYIIT根據(jù)本發(fā)明的α-葡糖苷酶核苷酸序列顯示與已知α-葡糖苷酶編碼分子的相對較少的序列同源性(Taylor等，1998，植物學雜志，13:419-424；Sugimoto等，1997，植物分子生物學，33,765-768；EMBLDatenbank-Eintrage:U22450,P10253,D86624)。此外，該氨基酸序列與現(xiàn)有技術(shù)中所述的α-葡糖苷酶明顯不同，特別是在5’區(qū)域，如用SEQIDNo.2的序列對比所示。適用于本發(fā)明并且編碼一種選自A組的蛋白質(zhì)的核苷酸序列是，例如，可溶性淀粉合酶(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ)或顆粒結(jié)合淀粉合酶同工型(例如，Hergersberg,1988,博士論文，Cologne大學；Abel,1995,博士論文，F(xiàn)UBerlin；Abel等人，1996，植物雜志(PlantJorunal)10(6):981-991；Visser等人，1989，植物科學(PlantSci.)64:185-192；vanderLeij等人，1991，分子與普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)228:240-248；EP-A-0779363；WO92/11376；WO96/15248,WO97/26362；WO97/44472；WO97/45545；Delrue等人，1992，細菌學雜志(J.Bacteriol.)174:3612-3620；Baba等人，1993，植物生理學(PlantPhysiol.)103:565-573；Dry等人，1992，植物雜志2,2:193-202,或EMBL數(shù)據(jù)庫條目X74160；X58453；X88789)、分支酶同工型(分支酶Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb)、脫支酶同工型(脫支酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶RI酶)或歧化酶同工型，如WO92/14827、WO95/07335、WO95/09922、WO96/19581、WO97/22703、WO97/32985、WO97/42328、Takaha等人，1993，生物學與化學雜志(J.Biol.Chem.)268:1391-1396或EMBL數(shù)據(jù)庫條目X83969所述，和ADP葡萄糖焦磷酸化酶、質(zhì)體淀粉磷酸化酶同工型，如EP-A-0368506；EP-A-0455316；WO94/28146；DE19653176.4；WO97/11188；Brisson等人，1989，植物細胞(ThePlantCell)1:559-566；Buchner等人，1996，植物(Planta)199:64-73；Camirand等人，1989，植物生理學89(增4):6l；Bhatt和Knowler，實驗植物學雜志(J.Exp.Botany)41(增):5-7；Lin等人，1991，植物生理學95:1250-1253；Sonnewald等人，1995，植物分子生物學(PlantMol.Biol.)27:567-576；DDBJ號D23280；Loberth等人，1998，自然生物技術(shù)(NatureBiotechnology)16:473-477所述?？砂凑毡景l(fā)明適當使用的核苷酸序列是原核或真核來源的，優(yōu)選地是細菌、真菌或植物來源的。對于本發(fā)明，術(shù)語“核苷酸序列的部分”是指根據(jù)本發(fā)明的或?qū)凑毡景l(fā)明使用的核苷酸序列的部分，其長度至少15bp，優(yōu)選地至少150bp，特別優(yōu)選地至少500bp，但通常不超過5000bp，優(yōu)選地2500bp。對于本發(fā)明，術(shù)語“雜交”是指在常規(guī)雜交條件下優(yōu)選地在嚴格條件下的雜交，如Sambrook等人(《分子克隆，實驗室指南》，第二版(1989)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY)所述。特別優(yōu)選地，“特異性雜交”在下列高度嚴格條件下發(fā)生雜交緩沖液2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mMEDTA；50mMNa2HPO4；250μg/ml鯡精DNA；50μg/mltRNA；或0.25M磷酸鈉緩沖液pH7.2；1mMEDTA；7％SDS，雜交溫度T=55-68℃洗滌緩沖液0.2×SSC；0.1％SDS和洗滌溫度T=40-68℃可與根據(jù)本發(fā)明的核酸分子雜交的分子也包括根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的片段、衍生物和等位變體?！捌巍笨衫斫鉃椴恢皇侵搁L度足以編碼所述蛋白質(zhì)功能活性部分的核酸分子的部分。術(shù)語“衍生物”在本發(fā)明說明書中是指，這些分子的序列在一個或多個位置上不同于根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的序列，并顯示與這些序列有高度同源性。同源性是指至少60％，優(yōu)選地超過70％，特別優(yōu)選地超過85％的序列相同性。相對于根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的差異可通過缺失、置換、插入(添加)或重組產(chǎn)生。此外，同源性還指在所述核酸分子與其編碼的蛋白質(zhì)之間存在功能和/或結(jié)構(gòu)等同性。同源性還指，目標核酸分子或其所編碼的蛋白質(zhì)之間存在的功能和/或結(jié)構(gòu)等同性。與根據(jù)本發(fā)明的分子同源，并組成這些分子的衍生物的核酸分子，通常是這些分子的變異，它們構(gòu)成行使相同的生物功能的修飾。它們可以是天然發(fā)生的變異，例如其它種的序列，或突變，這些突變可能是天然發(fā)生的或經(jīng)定向誘變引入的。變異另外還可以是合成序列。等位變體可以是天然發(fā)生的變體或合成變體或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以是DNA分子，特別是cDNA分子，或者是基因組分子。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子還可以是RNA分子。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或其片段可以例如從天然來源獲得、利用重組技術(shù)產(chǎn)生或合成產(chǎn)生。為了在植物細胞中以有義或反義方向表達根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，將其與確?？稍谥参锛毎修D(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA元件連接。這些元件特別包括啟動子。在植物細胞中有活性的任何啟動子通常都適于表達。可選擇啟動子，使得表達為組成型的，或僅發(fā)生于特定組織中、植物發(fā)育的特定時間或可能是例如化學或生物誘導性的外界因素所確定的時間。相對于被轉(zhuǎn)化的植物，啟動子可能是同源或異源的，如同核苷酸序列一樣。合適的啟動子的實例是用于組成型表達的花椰菜花葉病毒35SRNA啟動子，用于在馬鈴薯中塊莖特異性表達的patatin啟動子B33(Rocha-Sosa等人，1989,EMBOJ.8:23-29)，或確保只在光合活性組織中表達的啟動子，例如ST-LS1啟動子(Stockhaus等人，1987，美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84:7943-7947；Stockhaus等人，1989,EMBOJ.8:2445-2451)、或用于胚乳特異性表達，小麥HMG啟動子或玉米醇溶蛋白基因的啟動子。終止根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的終止序列可用來正確地終止轉(zhuǎn)錄并向轉(zhuǎn)錄物添加poly-A尾，這被認為具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物的作用。這些元件已在文獻(參見Gielen等人，1989,EMBOJ.8:23-29)中描述，通常在希望時是可交換的。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子能用于產(chǎn)生顯示α-葡糖苷酶活性的增加或減少，或者α-葡糖苷酶和至少另一種淀粉代謝酶活性提高和/或降低的轉(zhuǎn)基因植物細胞和植物。為此，將根據(jù)本發(fā)明的核酸分子引入含有在植物細胞中有效轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)節(jié)核酸序列的適當載體中，并引入植物細胞中。另一方面，能用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子抑制細胞中內(nèi)源性α-葡糖苷酶的合成，或內(nèi)源性α-葡糖苷酶和至少另一種選自A組的蛋白質(zhì)的合成。這可借助于反義構(gòu)建體、體內(nèi)誘變、發(fā)生的共抑制作用或利用適當構(gòu)建的核酶來實現(xiàn)。另一方面，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子能用于在轉(zhuǎn)基因植物細胞中表達α-葡糖苷酶，或表達α-葡糖苷酶和至少另一種選自A組的蛋白質(zhì)，從而導致在每種情況中表達的酶在細胞中的活性都提高。另外，存在利用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子抑制細胞中內(nèi)源性α-葡糖苷酶合成和至少另一種選自A組的蛋白質(zhì)過量表達的可能性。最后，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子也可用于在轉(zhuǎn)基因植物細胞中表達α-葡糖苷酶和抑制至少另一種選自A組的蛋白質(zhì)。于是最后提到的兩個本發(fā)明的實施方案在細胞中導致分別被抑制或表達的酶的活性同時抑制和提高。本發(fā)明還涉及一種包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體。術(shù)語“載體”包括質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體和在遺傳工程中常規(guī)使用的其它載體，它們包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子且適于轉(zhuǎn)化細胞。這些載體優(yōu)選地適用于轉(zhuǎn)化植物細胞。特別優(yōu)選地，它們允許將根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，適當時與側(cè)翼調(diào)節(jié)區(qū)一起，整合到植物細胞基因組中。實例是二元載體如pBinAR或pBinB33，它們能用于土壤桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)編碼一種具有α-葡糖苷酶功能的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或其片段以有義或反義方向存在這一事實區(qū)別根據(jù)本發(fā)明的載體。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)編碼一種或多種選自A組的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或其片段以有義或反義方向存在這一事實區(qū)別根據(jù)本發(fā)明的載體。在再另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)編碼多種選自A組的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或其片段部分以有義方向、部分以反義方向存在這一事實區(qū)別根據(jù)本發(fā)明的載體。極特別優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的載體包含一種或多種確保RNA在原核或真核細胞中轉(zhuǎn)錄和合成的調(diào)節(jié)元件。另外，能利用分子生物學常規(guī)技術(shù)(見，例如，Sambrook等人，1989，《分子克隆，實驗室指南》，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY)向根據(jù)本發(fā)明的DNA序列中引入多個突變，這導致生物學性質(zhì)可被改變的蛋白質(zhì)的合成。一方面，能產(chǎn)生缺失突變體，其中的序列通過可引起類似截短的蛋白質(zhì)合成的編碼DNA序列5’或3’端的漸進缺失產(chǎn)生。例如，DNA序列5’端的這些缺失允許定向產(chǎn)生這樣的酶，由于有關(guān)轉(zhuǎn)運序列或信號序列的去除其不再位于其原始(同源)區(qū)室中而定位于細胞溶膠中，或者由于其它信號序列的添加而定位于一種或多種其它(異源)區(qū)室(例如質(zhì)體、液泡、線粒體、質(zhì)外體)中。另一方面，在改變的氨基酸序列可影響如酶活性或酶調(diào)節(jié)的位置處引入點突變也是可行的。因此，能產(chǎn)生如KM或kcat值改變或不再經(jīng)受細胞中正常存在的調(diào)節(jié)機制如經(jīng)過別構(gòu)調(diào)節(jié)或共價修飾的突變。對于原核細胞中的遺傳工程操作，能向質(zhì)粒中引入根據(jù)本發(fā)明的DNA序列或這些序列的片段，這允許誘變或通過DNA序列重組改變序列。利用標準分子生物學方法(參見Sambrook等人，1989，同前)可進行堿基互換或添加天然或合成序列。為了使DNA部分彼此連接，可將連接體或接頭與這些部分連接。此外，還可進行提供適當限制酶切位點或除去過量DNA或不再需要的限制酶切位點的操作。在適用插入、缺失或置換時，也可使用體外誘變、引物修復、限制酶切或連接。通常使用的分析方法是序列分析、限制酶切分析及適當時其它生物化學和分子生物學方法。本發(fā)明還涉及一種宿主細胞，特別是原核或真核細胞，優(yōu)選地細菌或植物細胞(例如大腸桿菌、土壤桿菌、茄科(Solananceae)、Poideae、黑麥、大麥、燕麥、玉米、小麥、高粱和谷子、西米、稻、豌豆、大豌豆、木薯、馬鈴薯、番茄、油籽油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆、綠豆、菜豆、香蕉或竹芋的細胞)，它們含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，或根據(jù)本發(fā)明的載體或來源于這種細胞，其已用本發(fā)明的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化。本發(fā)明還涉及多種宿主細胞，特別是原核或真核細胞，優(yōu)選地細菌或植物細胞(例如大腸桿菌、土壤桿菌、茄科、Poideae、黑麥、大麥、燕麥、玉米、小麥、高粱和谷子、西米、稻、豌豆、大豌豆、木薯、馬鈴薯、番茄、油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆、綠豆、菜豆、香蕉或竹芋的細胞)，它們除了一種編碼具有β-淀粉酶功能的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或其片段，含有一種或多種編碼選自A組的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或其片段，或可與這些核酸分子雜交的核苷酸序列的重組核酸分子。根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞不僅可用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子產(chǎn)生，而且也可利用連續(xù)轉(zhuǎn)化(例如所謂的“超級轉(zhuǎn)化”)產(chǎn)生，其中在多個連續(xù)細胞轉(zhuǎn)化步驟中使用根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列或包含根據(jù)核苷酸序列的載體，這些核苷酸序列編碼一種具有如下功能的蛋白質(zhì)，分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、顆粒結(jié)合淀粉合酶、可溶性淀粉合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、脫支酶、歧化酶、質(zhì)體淀粉磷酸化酶、R1酶、淀粉酶、葡糖苷酶、其部分，和可與所述核苷酸序列或其部分之一雜交的核酸分子。本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種產(chǎn)生可合成改性淀粉的轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法，其包括向植物細胞基因組中整合根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的載體。通過遺傳工程方法能使根據(jù)本發(fā)明的核酸分子使得參與植物的淀粉代謝，并將其改變，這樣引起改性淀粉的合成，相對于野生型植物中合成的淀粉該改性淀粉在以下方面得到改變，例如，結(jié)構(gòu)、含水量、蛋白含量、脂含量、纖維含量、灰分/磷酸含量、直鏈淀粉/支鏈淀粉比率、分子量分布、分支程度、顆粒大小、顆粒形狀及結(jié)晶，或其物理化學性質(zhì)，如流動及吸收狀態(tài)、膠凝溫度、粘度、增稠能力、溶解度、凝膠結(jié)構(gòu)、透明度、熱穩(wěn)定性、剪切穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性、退減的趨勢、膠凝作用、凍融穩(wěn)定性、復合體形成、碘結(jié)合、薄膜形成、粘合力、酶穩(wěn)定性、可消化性或反應性。通過提高參與淀粉代謝的蛋白質(zhì)的活性，例如過量表達適當?shù)暮怂岱肿?，或提供不再?jīng)歷細胞調(diào)節(jié)機制和/或顯示與其活性有關(guān)的不同溫度依賴性的突變，也能夠提高適當遺傳改造的植物中的產(chǎn)量。特別明顯的產(chǎn)量提高可能是由于提高了一種或多種參與淀粉代謝的蛋白質(zhì)在被轉(zhuǎn)化植物淀粉貯藏組織的特殊細胞中，如在馬鈴薯的塊莖或玉米或小麥的胚乳中的活性。這些參與淀粉代謝的可能性的經(jīng)濟重要性和優(yōu)點是明顯的。當在植物中表達根據(jù)本發(fā)明的核酸分子時，所合成的蛋白質(zhì)原則上能定位于植物細胞的任何希望的區(qū)室中。為了實現(xiàn)在特定區(qū)室(細胞溶膠、液泡、質(zhì)外體、質(zhì)體、線粒體)中的定位，必要時必須缺失(除去)確保定位的轉(zhuǎn)運或信號序列，并且在必要時必須將剩余的編碼區(qū)與確保在特定細胞區(qū)室中定位的DNA序列連接。這些序列已知(見，例如，Braun等人，EMBOJ.11(1992),3219-3227；Wolter等人，美國國家科學院院刊85(1988),846-850；Sonnewald等人，植物雜志1(1991),95-106)。例如，通過使用根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，表達適當?shù)姆戳xRNA、有義RNA以實現(xiàn)共抑制作用、體內(nèi)誘變，或表達適當構(gòu)建的可特異酶切編碼參與淀粉代謝的蛋白質(zhì)之一的轉(zhuǎn)錄物的核酶，優(yōu)選地通過表達一種反義轉(zhuǎn)錄物，能實現(xiàn)參與淀粉代謝的蛋白質(zhì)活性降低的植物細胞的產(chǎn)生。為此，一方面，能使用一種DNA分子，其包含編碼一種參與淀粉代謝的蛋白質(zhì)的所有序列，包括可能存在的任何側(cè)翼序列，也能使用只包含編碼序列部分的DNA分子，這些部分的最小長度為15bp，優(yōu)選地至少100-500bp，特別是超過500bp。通常使用短于5000bp，優(yōu)選地短于2500bp的DNA分子。也能使用顯示與根據(jù)本發(fā)明的DNA分子的序列有高度同源性，但與之不完全相同的DNA序列。最小同源性應當超過約65％。優(yōu)選使用具有75％，特別是80％同源性的序列。用于降低細胞中特定蛋白質(zhì)活性的核酶表達為本領域技術(shù)人員所周知，并在如EP-B1-0321-201中有述。例如，F(xiàn)eyter等人(分子與普通遺傳學250(1996),329-338)描述了植物細胞中核酶的表達。也可通過所謂的“體內(nèi)誘變”在根據(jù)本發(fā)明的植物細胞中減少參與淀粉代謝的蛋白質(zhì)，其中通過細胞轉(zhuǎn)化向細胞中引入雜合RNA-DNA-寡核苷酸(“chimeroplast”)(KippP.B.等人，“第五屆國際植物分子生物學大會”的招貼會議，21-27,1997年9月，新加坡；R.A.Dixon和C.J.Arntzen，“轉(zhuǎn)基因植物的代謝工程”上的會議報告，重要座談會，CopperMoutain,CO,USA,TIBTECH15(1997),441-447；國際專利申請WO95/15972；Kren等人，肝臟病學(Hepatology)25(1997),1462-1468；Cole-Strauss等人，科學273(1996),1386-1389)。用于該目的的RNA-DNA-寡核苷酸的一部分DNA組分與內(nèi)源蛋白質(zhì)的核酸序列同源，但與內(nèi)源蛋白質(zhì)的核酸序列相比顯示一種突變，或者含有被同源區(qū)包圍的異源區(qū)。RNA-DNA-寡核苷酸的同源區(qū)與內(nèi)源核酸分子的堿基配對及隨后的同源重組，使得RNA-DNA-寡核苷酸的DNA組分中包含的突變或異源區(qū)能被轉(zhuǎn)移到植物細胞基因組中。這導致參與淀粉代謝的蛋白質(zhì)活性的降低。此外，也可利用共抑制作用降低在植物細胞中參與淀粉代謝的酶活性。這些方法為本領域技術(shù)人員已知，例如，Jorgensen(生物技術(shù)趨勢(TrendsBiotechnol.)8(1990),340-344)、Neibel等人(現(xiàn)代微生物學與免疫學觀點(Curr.Top.Microbiol.Immunol.)197(1995),91-103)、Flavell等人(現(xiàn)代微生物學與免疫學觀點197(1995),43-46)、Palaqui和Vaucheret(植物分子生物學29(1995),149-159)、Vaucheret等人(分子與普通遺傳學248(1995),311-317)、deBorne等人(分子與普通遺傳學243(1994),613-621)描述了該方法。為了抑制被轉(zhuǎn)化植物中參與淀粉生物合成的多種酶的合成，能使用同時含有反義方向并處于適當啟動子控制下的編碼相關(guān)酶的多種區(qū)域的DNA分子進行轉(zhuǎn)化。每種序列可受其自身啟動子的控制，或者這些序列另外可由一種連接啟動子作為融合體轉(zhuǎn)錄，使得所述蛋白質(zhì)的合成被抑制到大致相同或不同的程度。至于在這種構(gòu)建體中使用的個別編碼區(qū)的長度，以上關(guān)于產(chǎn)生反義構(gòu)建體的敘述也適用于此。原則上，從這種DNA分子中啟動子開始轉(zhuǎn)錄的反義片段的數(shù)量沒有上限。但是，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物長度通常不應超過25kb，優(yōu)選地15kb。因此，根據(jù)本發(fā)明的核酸分子使得轉(zhuǎn)化植物細胞并同時抑制多種酶的合成成為可能。另外，能向一種或多種淀粉生物合成基因缺乏或缺陷的傳統(tǒng)突變體中引入根據(jù)本發(fā)明的核酸分子(Shannon和Garwood,1984，于Whistler,BeMiller和Paschall，《淀粉化學與技術(shù)》，學院出版社，倫敦，第二版25-86)。例如，這些缺陷可能涉及下列蛋白質(zhì)顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSSⅠ)和可溶性淀粉合酶(SSSⅠ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ)、分支酶(BEⅠ、Ⅱa和Ⅱb)、脫支酶(R酶、異淀粉酶、支鏈淀粉酶)、歧化酶和質(zhì)體淀粉磷酸化酶。因此本發(fā)明也涉及可通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其已用根據(jù)本發(fā)明的載體或核酸分子轉(zhuǎn)化，并涉及由這些轉(zhuǎn)化細胞衍生的轉(zhuǎn)基因植物細胞。根據(jù)本發(fā)明的細胞含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，它們優(yōu)選地與確保在植物細胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA元件(如啟動子、增強子、終止子)特別是啟動子連接。根據(jù)本發(fā)明的細胞能與天然存在的植物細胞相區(qū)別，這尤其是根據(jù)它們含有這些細胞中不天然存在的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子這一事實，或者是根據(jù)這種分子整合于細胞基因組中的某一位置，而其否則不會存在，即位于不同基因組環(huán)境中這一事實。另外，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞能與天然存在的植物細胞相區(qū)別，這是根據(jù)它們含有至少一個拷貝的穩(wěn)定整合于其基因組中的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，適當時還含有在細胞中天然存在的這種分子的拷貝這一事實。如果引入細胞中的核酸分子是細胞中已天然存在的分子的額外拷貝，那么根據(jù)本發(fā)明的植物細胞能與天然存在的植物細胞相區(qū)別，特別是根據(jù)額外拷貝或這些另外的拷貝位于基因組中其不天然存在的位點處這一事實。例如，這能通過Southern印跡分析檢查。優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的植物細胞是這樣的細胞，其中參與淀粉代謝的各個酶的酶活性在每種情況中至少提高和/或降低10％，特別優(yōu)選地至少30％，極特別優(yōu)選地至少50％。另外，優(yōu)選地至少根據(jù)下列特征之一能將根據(jù)本發(fā)明的植物細胞與天然存在的植物細胞相區(qū)別如果已被引入的核酸分子相對于植物細胞是異源的，則轉(zhuǎn)基因植物細胞顯示已被引入的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)錄。例如，這能通過Northern印跡分析檢測。例如，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞含有一種或多種由已引入的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。例如，這能通過免疫學方法特別是Western印跡分析檢測。如果已被引入的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子相對于植物細胞同源，則根據(jù)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的額外表達，能將根據(jù)本發(fā)明的細胞與天然存在的細胞相區(qū)別。例如，轉(zhuǎn)基因植物含有更多或更少的根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的轉(zhuǎn)錄物。例如，這能通過Northern印跡分析檢測。“更多”或“更少”在本說明書中意思是比相應的未轉(zhuǎn)化細胞優(yōu)選地至少多或少10％，優(yōu)選地至少多或少20％，特別優(yōu)選地至少多或少50％的轉(zhuǎn)錄物。此外，這些細胞優(yōu)選地顯示由引入的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)含量相應提高或降低(至少10％、20％或50％)。利用本領域技術(shù)人員周知的技術(shù)能使轉(zhuǎn)基因植物細胞再生為完整的植物?？赏ㄟ^再生根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞獲得的植物，和通過由根據(jù)本發(fā)明的植物細胞再生為完整的植物產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，也是本發(fā)明的主題。本發(fā)明的另一主題是含有根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞的植物。原則上，轉(zhuǎn)基因植物可以是任何種的植物，即，不僅可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。植物優(yōu)選地是有益植物和淀粉貯藏植物，如谷物類種(黑麥、大麥、燕麥、玉米、小麥、高粱和谷子等)、西米、稻、豌豆、大豌豆、木薯、馬鈴著、番茄、油籽油菜、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆、綠豆或竹芋。本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明的植物的繁殖材料，例如果實、種子、塊莖、根狀莖、幼苗、插條、愈傷組織、原生質(zhì)體、細胞培養(yǎng)物等。改變參與淀粉代謝的酶的酶促活性導致在通過根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物中合成結(jié)構(gòu)改變的淀粉。大量克隆載體可用于準備向高等植物中引入外源基因，載體含有大腸桿菌復制信號，和用于篩選被轉(zhuǎn)化細菌細胞的標記基因。這些載體的實例是pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。能將希望的序列引入載體的適當限制酶切位點處。用所獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞在適當培養(yǎng)基中生長，然后收獲并裂解?；厥赵撡|(zhì)粒。表征所獲質(zhì)粒DNA的分析方法通常是限制酶切分析、凝膠電泳和其它生物化學及分子生物學方法(Sambrook等人，同前)。每種操作后，能酶切質(zhì)粒DNA，并將獲得的DNA片段與其它DNA序列連接。每種質(zhì)粒DNA序列都能被克隆到同一或其它質(zhì)粒中。有許多技術(shù)可用于向植物宿主細胞中引入DNA這些技術(shù)包括用根癌土壤桿菌(Agrobaeteriumtumefaeiens)或發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)作為轉(zhuǎn)化體用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細胞，利用聚乙二醇(PEG)的原生質(zhì)體融合，注射，DNA電穿孔，利用biolistic法引入DNA，及其它可能性。向植物細胞中注射和電穿孔DNA不需所用質(zhì)?；駾NA的特殊方面。能使用簡單的質(zhì)粒如pUC衍生物。但是，如果欲由這些轉(zhuǎn)化細胞再生為完整植物，則需要選擇性標記基因的存在。根據(jù)向植物細胞中引入希望的基因的方法，可需要其它的DNA序列。例如，如果用Ti或Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細胞，則Ti和Ri質(zhì)粒T-DNA的至少右邊界，但通常是左右邊界必須與欲作為側(cè)翼區(qū)引入的基因相連接。如果用土壤桿菌轉(zhuǎn)化，則必須將欲引入的DNA克隆到特定質(zhì)粒，中間載體或二元載體中。通過與T-DNA序列同源的序列的同源重組，能將中間載體整合到土壤桿菌Ti或Ri質(zhì)粒中。前者也含有T-DNA轉(zhuǎn)移所需的vir區(qū)。中間載體不能在土壤桿菌中復制。也能利用輔助質(zhì)粒(接合)將中間載體轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌中。二元載體能在大腸桿菌和土壤桿菌中復制。它們含有處于左右T-DNA邊界區(qū)之中的一種選擇性標記基因和一種接頭或多接頭。它們可被直接轉(zhuǎn)化到土壤桿菌中(Holsters等人(1978)分子與普通遺傳學163:181-187)。用作宿主細胞的土壤桿菌應含有一種攜帶vir區(qū)的質(zhì)粒。vir區(qū)是向植物細胞中轉(zhuǎn)移T-DNA所必需的。也可存在其它T-DNA。用這樣轉(zhuǎn)化的土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物細胞。T-DNA在轉(zhuǎn)化植物細胞中的應用已進行了大量研究，描述于EP120516；Hoekema，《二元植物載體系統(tǒng)》OffetdrukkerijKantersB.V.,Alblasserdam(1985)，第5章；Fraley等人，植物科學評述(Crit.Rev.PlantSci.)4:146和An等人(1985)EMBOJ.4:277-287。為了向植物細胞中轉(zhuǎn)移DNA，能方便地將植物外植體與根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌共培養(yǎng)。然后能在含有如用于篩選轉(zhuǎn)化細胞的抗生素或殺生物劑的適當培養(yǎng)基中，由被感染的植物材料(例如葉切片、莖切片、根，以及原生質(zhì)體，或在懸浮培養(yǎng)液中生長的植物細胞)再生為完整植物。然后可檢查得到的植物是否存在引入的DNA。用biolistic法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化引入外源DNA的其它可能性也已知(參見，例如，Willmitzer,L,1993，轉(zhuǎn)基因植物。于《生物技術(shù)》，一部多卷綜合論文(H.J.Rehm,G.Reed,A.Puhler,P.Stadler編)第二卷，627-659,VCHWeinheim-NewYork-Basel-Cambridge)。利用根癌土壤桿菌經(jīng)Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化雙子葉植物已較明確，而最近的研究表明，利用基于土壤桿菌的載體甚至也使單子葉植物實際上可被轉(zhuǎn)化(Chan等人，植物分子生物學22(1993),491-506；Hiei等人，植物雜志6(1994),271-282)。用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的備擇系統(tǒng)是利用biolistic法的轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、部分通透細胞的電穿孔和利用玻璃纖維引入DNA。文獻中已描述了用于玉米轉(zhuǎn)化的特別不同的方法(參見，例如，WO95/06128,EP0513849,EP0465875)。EP292435描述了一種方法，利用它能從無粘液、脆性、顆粒狀玉米愈傷組織獲得能育植物。在該說明書中，Shillito等人(生物技術(shù)7(1989),581)發(fā)現(xiàn)，再生為能育植物的能力需要從愈傷組織懸浮培養(yǎng)液開始，由其能制備具有再生植物能力的分裂的原生質(zhì)體培養(yǎng)物。Prioli和Sondahl(生物技術(shù)7(1989),589)也描述了從玉米原生質(zhì)體再生并獲得能育玉米植物。被引入的DNA整合到植物細胞基因組中后，通常穩(wěn)定于此，并且也保持于最初轉(zhuǎn)化的細胞的子代中。其通常含有一種選擇性標記，該選擇性標記介導被轉(zhuǎn)化的植物細胞對殺生物劑或抗生素如卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素或膦絲菌素等的抗性。因此所選的各個標記應使得能在缺乏引入DNA的細胞中篩選被轉(zhuǎn)化的細胞。在植物中，被轉(zhuǎn)化的細胞以常規(guī)方式生長(參見，McCormick等人(1986)植物細胞報道(PlantCellReports)5:81-84)。產(chǎn)生的植物能正常生長，并與具有相同轉(zhuǎn)化種質(zhì)或其它種質(zhì)的植物雜交。得到的雜種具有相應的表型特征。應生長兩代或多代以確保表型特征能穩(wěn)定保持并遺傳。另外應收獲種子等以確保能保持所述表型或其它特征。本發(fā)明的另一主題是一種以本質(zhì)上已知的方式生產(chǎn)淀粉的方法，其中在該方法中處理或結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞、植物細胞、植物、植物部分或繁殖材料。從植物或淀粉貯藏植物器官中提取淀粉的方法為本領域技術(shù)人員所周知。例如，Eckhoff等人(谷物化學(CerealChem.)73(1996)54-57)描述了從玉米粒中提取淀粉的方法。工業(yè)規(guī)模的玉米淀粉提取通常以濕磨法進行。另外，從多種淀粉貯藏植物中提取淀粉的方法描述于例如《淀粉化學與技術(shù)》(編者Whistler,BeMiller和Paschall(1994)，第二版，AcademicPressInc.LondonLtd.；ISBN0-12-746270-8；見，例如，第12章，412-468頁；“玉米與高粱淀粉生產(chǎn)”，Watson,第13章，469-479頁；“木薯、竹芋及西米淀粉生產(chǎn)”，Corbishley和Miller，第14章，479-490頁；“馬鈴薯淀粉生產(chǎn)與應用”，Mitch,第15章，491-506頁；“小麥淀粉生產(chǎn)、改性與應用”，Knight和Oson，第16章，507-528頁；Rohmer和Klem的“稻淀粉生產(chǎn)與應用”)。在從植物材料中提取淀粉的方法中常用的裝置是分離器、傾析器、旋液分離器、噴霧干燥器和流化床干燥器。由于根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的表達，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞和植物合成一種淀粉，例如，與野生型植物中合成的淀粉相比，其物理化學性質(zhì)已改變。本發(fā)明的另一主題是可從根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物、其繁殖材料中或通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的淀粉。本發(fā)明的另一實施方案也包括根據(jù)本發(fā)明的淀粉在工業(yè)上，優(yōu)選地在生產(chǎn)食品、包裝材料或一次性產(chǎn)品生產(chǎn)中的應用。根據(jù)本發(fā)明的淀粉能用本領域技術(shù)人員周知的方法化學和/或物理修飾，其未修飾和或修飾的形式適用于食品或非食品方面的多種用途。根據(jù)本發(fā)明的淀粉的可能應用大體上可分為兩個重要方面。一方面包括通過酶法或化學法獲得的淀粉水解產(chǎn)物，主要是葡萄糖和葡萄糖單元。它們作為原材料用于其它化學修飾和如發(fā)酵的方法。此處重要的是水解法的簡單性與便宜的設計，因為目前基本上用淀粉葡萄糖苷酶酶促進行。利用較少的酶節(jié)約經(jīng)費是可行的。這可能是由于改變了淀粉的結(jié)構(gòu)，例如提高了顆粒的表面積，由于較低程度的分支更好的可降解性，或限制與所用酶接近的空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的淀粉能用作所謂的天然淀粉的另一方面，由于其聚合結(jié)構(gòu)，可分為另外兩個應用領域1．食品工業(yè)淀粉是許多食品的一種傳統(tǒng)添加劑，其功能基本上是結(jié)合含水添加劑或提高粘度或提高膠凝能力。重要特性是流動特性、吸附特性、溶脹溫度、膠凝溫度、粘度、增稠能力、淀粉可溶性、透明度、凝膠結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性、剪切穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性、退減的趨勢、成膜能力、凍融穩(wěn)定性、可消化性和與如無機或有機離子形成復合體的能力。2．非食品工業(yè)在此重要方面，淀粉用作多種制造方法的助劑，或用作產(chǎn)品添加劑。當用淀粉作為助劑時，特別是必須提到紙與紙板制造工業(yè)。淀粉主要用于緩聚目的(保持固態(tài))、結(jié)合填充顆粒和細粉、作為硬化劑及用于脫水。而且，淀粉的有利特性涉及勁度、硬度、聲音、觸感、光澤、平滑度、粘合強度和表面。2.1．紙與紙板制造工業(yè)在造紙方法中，必須區(qū)分四個應用領域，即，表面、包涂、塊狀和噴涂。表面淀粉通常占最大的淀粉量，消費的80％,8％用作包涂淀粉，7％為塊狀淀粉，5％為噴涂淀粉。對淀粉在表面處理方面的要求一般是高白度、適當?shù)恼扯取⒏叨确€(wěn)定的粘度、良好的成膜性和較低的粉塵形成。當用于包涂時，固體含量、適當?shù)恼扯取⒏呓Y(jié)合力和高色素親合力起重要作用。當用作團塊添加劑時，重要的是在紙織物中的快速、均勻、無損耗的分布、高機械強度和完整保持。如果淀粉用于噴涂方面，則適度的固體含量、高粘度和高結(jié)合力是重要的。2.2．粘合劑工業(yè)淀粉的一個重要應用領域是粘合劑工業(yè)，其潛在用途可分為四個部分作為純漿糊的應用、在用專業(yè)化學藥品處理過的漿糊中的應用、淀粉作為合成樹脂和乳聚橡膠的添加劑的應用，和淀粉作為合成粘合劑的補充劑的應用。90％基于淀粉的粘合劑用于波面紙板生產(chǎn)、紙袋生產(chǎn)、紙鋁復合材料的生產(chǎn)、用于信封、郵票的盒紙板和粘合劑的生產(chǎn)等。2.3．紡織工業(yè)和紡織品護理產(chǎn)品工業(yè)淀粉作為助劑和添加劑的一個重要應用領域是紡織品和紡織品護理產(chǎn)品的生產(chǎn)。在紡織工業(yè)中必須區(qū)分下面四個應用領域淀粉作為膠粘劑的應用，即作為助劑用于減輕和加強燃燒性能，以保護其免于紡織中施加的張力，并用于在紡織中增強耐磨性，淀粉作為織物整理劑的應用，特別是在降低質(zhì)量的預處理如漂白、染色等之后，淀粉作為增稠劑在用于預防出血的染料漿制造中的應用，及淀粉作為用于縫紉線的彎曲劑的添加劑的應用。2.4．建筑材料工業(yè)第四個應用領域是淀粉在建筑材料中作為添加劑的應用。一個實例是石膏板的生產(chǎn)，其中與石膏漿混合的淀粉與水膠化，擴散到石膏核心表面，并且石膏板與核心結(jié)合。其它應用領域是與煉油和礦物纖維的混合。在預拌混凝土中，淀粉產(chǎn)品用于延緩結(jié)合。2.5．土壤穩(wěn)定淀粉產(chǎn)品的一個有限市場是土壤穩(wěn)定劑的生產(chǎn)，其用于當土壤被人工破壞時對土壤顆粒的暫時防水保護。根據(jù)本說明書，淀粉與合成膠乳的產(chǎn)品組合在其防止腐蝕和結(jié)硬皮作用方面等同于以前使用的產(chǎn)品，但明顯更便宜。2.6．在作物保護產(chǎn)品和肥料中的應用使用淀粉的一個應用領域是用于改變產(chǎn)品特殊性質(zhì)的作物保護產(chǎn)品。因此，淀粉用于提高作物保護產(chǎn)品和肥料的濕潤性，用于測量有效成分的釋放，用于將液體有效成分、揮發(fā)性有效成分和/或具有異味的有效成分轉(zhuǎn)化為微晶、穩(wěn)定、成形的物質(zhì)，用于混合不相容的化合物，用于通過減少分解延長作用時間。2.7．醫(yī)藥及化妝品工業(yè)另一應用領域是醫(yī)藥及化妝品工業(yè)。在制藥工業(yè)中，淀粉用作片劑的粘合劑或用于稀釋膠囊中的粘合劑。另外，淀粉也用作片劑分解劑，因為它們在吞咽后吸收液體并在短時間內(nèi)膨脹，使有效成分釋放。醫(yī)用潤滑粉和創(chuàng)傷粉由于質(zhì)量原因是基于淀粉的。在化妝品方面，例如，淀粉用作粉狀添加劑如香料和水楊酸的載體。淀粉的一個相對較大的應用領域是牙膏。2.8．淀粉向煤和煤磚中的添加淀粉的一個應用領域是向煤和煤磚中的添加。加入淀粉后，由于較大的數(shù)量，煤能聚集或成塊，從而防止煤磚的早期分解。在燒烤煤中，淀粉添加可達4-6％，在鋁化煤中為0.1-0.5％。另外，淀粉作為粘合劑也是重要的，因為當向煤和煤磚中添加淀粉時，能明顯減少有害物質(zhì)的釋放。2.9．礦石和煤泥滓的制造另外，淀粉能用作礦石和煤泥滓的制造中的絮凝劑。2.10．鑄造助劑另一個應用領域是作為鑄造助劑的添加劑。多種鑄造方法需要由粘合劑處理的沙子制成的核心。現(xiàn)在主要使用的粘合劑是用改性淀粉，在大多數(shù)情況下用溶脹淀粉處理的膨潤土。加入淀粉的目的在于提高流動性并提高結(jié)合力。另外，可溶脹淀粉能滿足生產(chǎn)工程的其它要求，如可用冷水分散，可再水合，易于與沙子混合，并具有較高水結(jié)合力。2.11．在橡膠工業(yè)中的應用在橡膠工業(yè)中，淀粉用于提高技術(shù)與視覺質(zhì)量。原因是表面光澤的改善，觸感與外觀的改善，為此在冷熟化之前將淀粉分散于橡膠材料的粘膠表面，以及橡膠可印性的改善。2.12．皮革替代品的生產(chǎn)改性淀粉另外還可用于皮革替代品的生產(chǎn)。2.13．合成聚合物中的淀粉在聚合物方面，可設想以下應用領域淀粉降解產(chǎn)物在加工方法中的應用(淀粉只是填充物，在合成聚合物與淀粉之間沒有直接的鍵)，或淀粉降解產(chǎn)物在聚合物生產(chǎn)中的應用(淀粉與聚合物形成穩(wěn)定的鍵)。與其它物質(zhì)如滑石相比，淀粉作為純填充物的應用是沒有競爭力的。當?shù)矸鄣奶匦杂绊憦亩@著改變終產(chǎn)物的特性譜時，這有所不同。一個實例是淀粉產(chǎn)物在熱塑塑料如聚乙烯加工中的應用。在此通過按1∶1比例共表達結(jié)合淀粉與合成聚合物，得到母煉膠，用常規(guī)技術(shù)由之生產(chǎn)多種產(chǎn)品和粒狀聚乙烯。通過在聚乙烯薄膜中應用淀粉，能實現(xiàn)中空體中物質(zhì)通透性的提高，水蒸汽通透性提高，抗靜電力的提高，防粘連性能的提高和墨水可印性的提高。當前的缺點涉及透明度不足，拉伸強度降低和彈性降低。另一種可能性是淀粉在聚氨酯泡沫塑料中的應用。通過改變淀粉衍生物和工藝流程優(yōu)化，能以直接方式控制合成聚合物與淀粉羥基的反應。由于淀粉的使用，這產(chǎn)生具有下列特性譜的聚氨酯薄膜熱伸展系數(shù)減小，收縮行為減小，壓力-張力增高，不改變水吸收的情況下對水蒸汽的通透性提高，可燃性降低，極限拉伸強度降低，易燃部分無水滴形成，不含鹵素，老化減緩。仍存在的缺點是可印性降低和沖擊強度降低。當前產(chǎn)品的發(fā)展已不再限于薄膜。也可制造含有50％以上淀粉含量的固體聚合物產(chǎn)品如罐、板和盤。另外，淀粉/聚合物混合物因其生物降解性更高故被認為是有利的。淀粉接枝聚合物因其極高的水結(jié)合能力而變得非常重要。它們是具有按照自由基鏈機制原則接枝的一條淀粉骨架和一條合成單體側(cè)鏈的產(chǎn)物。根據(jù)可達每克淀粉1000克水的較好的結(jié)合與保持能力，結(jié)合高粘度，能區(qū)分當前可利用的淀粉接枝聚合物。這些超級吸收劑的應用領域在最近已大大擴大，在衛(wèi)生領域，是產(chǎn)品尿布和墊布，在農(nóng)業(yè)領域，例如是種子涂層。對于新型遺傳工程淀粉的應用要確定的是，一方面，結(jié)構(gòu)、含水量、蛋白含量、脂含量、纖維含量、灰分/磷酸含量、直鏈淀粉/支鏈淀粉比率、分子量分布、分支程度、顆粒大小、顆粒形狀及結(jié)晶，另一方面，還有影響下列特征的性質(zhì)流動及吸收狀態(tài)、膠凝溫度、粘度、增稠能力、可溶性、凝膠結(jié)構(gòu)、透明度、熱穩(wěn)定性、剪切穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性、退減的趨勢、凝膠形成、凍融穩(wěn)定性、復合體形成、碘結(jié)合、薄膜形成、粘合力、酶穩(wěn)定性、可消化性和反應性。利用遺傳工程方法生產(chǎn)改性淀粉一方面能改變例如植物產(chǎn)生的淀粉的性質(zhì)，這樣不再需要利用化學或物理改變的其它修飾。另一方面，已用遺傳工程方法改變的淀粉可進行進一步的化學修飾，這可導致質(zhì)量的進一步提高，以用于上述某些應用領域。這些化學修飾大都已知。特別是，通過加熱及壓力處理、有機酸或無機酸處理、酶處理、氧化或酯化的修飾，這導致例如磷酸淀粉、硝酸淀粉、硫酸淀粉、黃酸淀粉、乙酸淀粉和檸檬酸淀粉的形成。另外，在強酸存在下一元醇或多元醇可用于制備淀粉醚，產(chǎn)生淀粉烷基醚、鄰烯丙醚、羥烷基醚、O-羧甲基醚、含氮淀粉醚、含磷淀粉醚、含硫淀粉醚、交聯(lián)淀粉或淀粉接枝聚合物。根據(jù)本發(fā)明的淀粉的應用是在工業(yè)用途中，優(yōu)選地用于食品或包裝材料和一次性物品的生產(chǎn)。下面的實施例用來說明本發(fā)明，而決不是限制?？s寫B(tài)E分支酶bp堿基對GBSS顆粒結(jié)合淀粉合酶IPTG異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷SS可溶性淀粉合酶PMSF苯甲基磺酰氟實施例中使用的培養(yǎng)基與溶液20×SSC175.3gNaCl88.2g檸檬酸鈉加重蒸餾水至1000ml用10NNaOH調(diào)至pH7.0緩沖液A50mMTris-HClpH8.02.5mMDTT2mMEDTA0.4mMPMSF10％甘油0.1％連二亞硫酸鈉緩沖液B50mMTris-HClpH7.62.5mMDTT2mMEDTA緩沖液C0.5M檸酸鈉pH7.650mMTris-HClpH7.62.5mMDTT2mMEDTA10×TBS0.2MTris-HClpH7.55.0MNaCl10×TBST10×TBS0.1％(v/v)吐溫20洗脫緩沖液25mMTrispH8.3250mM甘氨酸透析緩沖液50mMTris-HClpH7.050mMNaCl2mMEDTA14.7mMD-巰基乙醇0.5mMPMSF蛋白質(zhì)緩沖液50mM磷酸鈉緩沖液pH7.210mMEDTA0.5mMPMSF14.7mMβ-巰基乙醇在實施例中使用下列方法1．克隆方法載體pBluescriptⅡSK(Stratagene)用于克隆到大腸桿菌中。對于植物的轉(zhuǎn)化，將基因構(gòu)建體克隆到二元載體pBinARHyg(Hofgen和Willmitzer,1990,植物科學6:221-230)和pBinB33-Hyg中。2．細菌菌株與質(zhì)粒對于pBluescript載體pBluescriptⅡKS(Stratagene)和pBinARHyg和pBinB33Hyg構(gòu)建體使用大腸桿菌DH5α株(BethesdaResearchLaboratories,Gaithersburgh,USA)。體內(nèi)切除使用大腸桿菌XL1-Blue株。pBinAR質(zhì)粒pBinAR是二元載體質(zhì)粒pBin19(Bevan,1984)的衍生物，其如下構(gòu)建從質(zhì)粒pDH51中分離包含花椰菜花葉病毒35S啟動子的核苷酸6909-7437的529bp片段作為EcoRⅠ/KpnⅠ片段(Pietrzak等人，1986)，連接于pUC18多接頭的EcoRⅠ與KpnⅠ酶切位點之間，命名為質(zhì)粒pUC18-35S。利用限制性內(nèi)切核酸酶HindⅢ和PvuⅡ，從質(zhì)粒pAGV40(Herrera-Estrella等人，1983)中分離192bp片段，其包含Ti質(zhì)粒pTiACH5(Gielen等人，1984)的DNA(核苷酸11749-11939)。待PvuⅡ酶切位點具有SphⅠ接頭后，將該片段連接于pUC18-35S的SphⅠ與HindⅢ酶切位點之間，將其命名為質(zhì)粒pA7。另外，用EcoRⅠ和HindⅢ切下包含35S啟動子和ocs終止子的完整多接頭，連接于適當酶切的pBin19中。這產(chǎn)生植物表達載體pBinAR(Hofgen和Willmitzer,1990)。pBinB33將馬鈴薯(Solanumtuberosum)patatin基因B33(Rocha-Sosa等人，1989)的啟動子作為DraⅠ片段(核苷酸-1512-+14)連接于SstⅠ酶切的載體pUC19中，該載體已用T4DNA聚合酶處理成平端。這產(chǎn)生質(zhì)粒pUC19-B33。用EcoRⅠ和SmaⅠ從該質(zhì)粒上切下B33啟動子，將其連接于適當酶切的載體pBinAR中。這產(chǎn)生植物表達載體pBinB33。pBinAR-Hyg從質(zhì)粒pA7(參見載體pBinAR的描述)開始，將包含35S啟動子、ocs終止子和位于35S啟動子與ocs終止子之間的多接頭部分的EcoRⅠ-HindⅢ片段引入適當酶切的質(zhì)粒pBin-Hyg中。pBinB33-Hyg從質(zhì)粒pBinB33開始，切下包含B33啟動子、多接頭部分和ocs終止子的EcoRⅠ-HindⅢ片段，連接于適當酶切的載體pBin-Hyg中。這產(chǎn)生植物表達載體pBinB33-Hyg。3．根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化按照Hofgen和Willmitzer(1988，核酸研究16:9877)的方法通過直接轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移DNA。按照Birnboim和Doly(1979，核酸研究7:1513-1523)的方法分離被轉(zhuǎn)化的土壤桿菌的質(zhì)粒DNA，進行適當?shù)南拗泼盖?，然后?jīng)凝膠電泳分析。4．馬鈴薯的轉(zhuǎn)化借助于根癌土壤桿菌C58C1株，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到馬鈴薯植物中(SolanumtuberosumL.cv.Desiree,VereinigteSaatzuchteneG,Ebstorf)(Dietze等人(1995)，《植物的基因轉(zhuǎn)移》24-29頁，編者Potrykus,I.和Spangenberg,G.,SpringerVerlag,Deblaere等人，1985，核酸研究13:4777-4788)。將用解剖刀創(chuàng)傷的不育馬鈴薯培養(yǎng)物的10片小葉子置于補加有2％蔗糖并含有50ml在選擇條件下生長的根癌土壤桿菌過夜培養(yǎng)物的10mlMS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog(1962)植物生理學15:473)中。輕搖培養(yǎng)物3-5分鐘后，在暗處溫育2天多。對于愈傷組織誘導，將葉子置于補加有1.6％葡萄糖、5mg/l萘乙酸、0.2mg/l芐氨基嘌呤、250mg/lclaforan、50mg/l卡那霉素和0.80％Bacto瓊脂的MS培養(yǎng)基中。將葉子在25℃和3000Lux下溫育1周后，將其置于補加有1.6％葡萄糖、1.4mg/l玉米素核糖、20mg/l萘乙酸、20mg/l赤霉酸、250mg/lclaforan、50mg/l卡那霉素和0.80％Bacto瓊脂的MS培養(yǎng)基上，誘導發(fā)芽。5．植物培養(yǎng)方案按下列方案將馬鈴薯植物保持于溫室中光照期25,000Lux和22℃16小時黑暗期15℃8小時大氣濕度60％6．DNA片段的放射性標記按照使用說明書，用BoehringerMannheim(德國)的DNA隨機引物標記試劑盒放射性標記DNA片段。7．淀粉合酶活性的測定如Denyer和Smith,1992，植物186:609-617所述，通過測定ADP[14C葡萄糖]的14C葡萄糖向甲醇/KCl-不溶性產(chǎn)物中的摻入，進行淀粉合酶活性的測定。8．非變性凝膠中可溶性淀粉合酶的檢測為了用非變性凝膠電泳檢測可溶性淀粉合酶的活性，在50mMTris-HClpH7.6、2mMDTT、2.5mMEDTA、10％甘油和0.4mMPMSF中水解馬鈴薯塊莖的組織樣品。電泳在MiniProteanⅡ容器(BioRAD)中進行。1.5mm厚凝膠的單體濃度是7.5％(w/v)，用25mMTris-甘氨酸pH8.4作為凝膠緩沖液和電泳緩沖液。每塊凝膠加樣相同量的蛋白提取物，并在10mA下分離2小時。隨后將活性凝膠在50mMTricine-NaOHpH8.5、25mM乙酸鉀、2mMEDTA、2mMDTT、1mMADP-葡萄糖、0.1％(w/v)支鏈淀粉和0.5M檸檬酸鈉中溫育。用魯戈士溶液染色形成的葡聚糖。9．淀粉分析用下列方法表征轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物形成的淀粉a)馬鈴薯植物的淀粉中直鏈淀粉/支鏈淀粉比率的測定用標準方法從馬鈴薯植物中分離淀粉，并用Hovenkamp-Hermelink等人(馬鈴薯研究(PotatoResearch)31(1988)241-246)所述的方法測定直鏈淀粉支鏈淀粉比率。b)磷酸含量的測定在馬鈴薯淀粉中，某些葡萄糖單元可能在C2、C3和C6位碳原子上磷酸化。為了測定葡萄糖C6位磷酸化的程度，將100mg淀粉在1ml0.7MHCl中95℃水解4小時(Nielsen等人(1994)植物生理學105:111-117)。用0.7MKOH中和后，對50ml水解產(chǎn)物進行目視酶檢測，以測定葡萄糖-6-磷酸。監(jiān)測所測批次(100mM咪唑/HCl；10mMMgCl2；0.4mMNAD；2單位腸系膜明串球菌(Leuconostocmesenteroides)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；30℃)在334nm處的吸光度改變。如Ames,1996，酶學方法(MethodsinEnzymology)Ⅷ,115-118所述測定總磷酸。c)支鏈淀粉側(cè)鏈的分析為了分析淀粉樣品中側(cè)鏈的分布和長度，在100mM檸檬酸鈉緩沖液pH3.5中用0.4單位異淀粉酶(MegazymeInternationalIrelandLtd.,Bray，愛爾蘭)37℃消化1ml0.1％淀粉溶液過夜。除非另外指明，否則其余分析如Tomlinson等人(1997)植物雜志11:31-47所述進行。d)顆粒大小的測定用德國RetschGmbH的“l(fā)umosed”光沉降儀測定顆粒大小。為此，將0.2g淀粉懸浮于約150ml水中并立即測定。廠商提供的程序計算淀粉顆粒的平均直徑，假定平均淀粉密度為1.5g/l。e)膠凝性質(zhì)用德國BrabenderOHG的ViskographE或使用快速粘度分析儀，NewportScientificPtyLtd,InvestmentSupportGroup,WarriewoodNSW2102，澳大利亞，記錄淀粉的膠凝性質(zhì)或粘性。當使用ViskographE時，對溶于450ml水的20g淀粉懸液進行下列加熱程序以3℃/分鐘從50℃加熱到96℃，保持恒定30分鐘，以3℃/分鐘冷卻到30℃，再次保持恒定30分鐘。溫度分布型顯示特征性膠凝性質(zhì)。當用快速粘度分析儀(RVA)測定時，對溶于25ml水的2g淀粉懸液進行下列加熱程序于50℃懸浮60秒，以12℃/分鐘從50℃加熱到95℃，保持恒定2.5分鐘，以12℃/分鐘冷卻到50℃，再次保持恒定2分鐘。RVA溫度分布型顯示所測淀粉的粘度測定參數(shù)，最大粘度(Max)、終末粘度(Fin)、膠凝溫度(T)、最大粘度后發(fā)生的最小粘度(Min)，和最小粘度與終末粘度的差(回退值，Set)(參見表1和圖1)。f)凝膠強度的測定為了用結(jié)構(gòu)分析儀測定凝膠強度，使2克淀粉在25ml水中凝膠化(參見RVA測定)，然后排除空氣在密封容器中25℃貯存24小時。將樣品置于結(jié)構(gòu)分析儀TA-XT2(StableMicroSystems)的探頭(圓形印章)之下，按下列參數(shù)設置測定凝膠強度檢測速度0.5mm刺入深度7mm(印章)接觸面積113mm2壓力/接觸面積2g10．葡萄糖、果糖和蔗糖的檢測為了測定葡萄糖、果糖和蔗糖含量，將馬鈴薯塊莖的小塊莖部分(直徑約10mm)在液氮中冷凍，然后用0.5ml10mMHEPES,pH7.5、80％(v/v)乙醇80℃抽提30分鐘。移出含有可溶物的上清液并測定其體積。該上清液用于測定可溶性糖的量。在具有下列組成的批次中進行可溶性葡萄糖、果糖和蔗糖的定量測定100.0mM咪唑/HCl,pH6.91.5mMMgCl20.5mMNADP+1.3mMATP10-50μl樣品1.0單位酵母葡萄糖-6-磷酸脫氫酶該批次在室溫下溫育5分鐘。隨后在連續(xù)加入下列酶后通過測定340nm的吸光度光測糖1.0單位酵母己糖激酶(測定葡萄糖)1.0單位酵母葡糖磷酸異構(gòu)酶(測定果糖)和1.0單位酵母蔗糖酶(測定蔗糖)應用實施例實施例1編碼馬鈴薯α-葡糖苷酶的cDNA片段的分離通過標準方法制備直接在下面產(chǎn)生幼芽的馬鈴薯塊莖組織的總RNA(Sambrook等，1989，出處同上)。用純化的總RNA作為起始材料用于polyA+RNA(Oligotex,mRNA純化試劑盒，根據(jù)制造商指示)。用5μgpolyA+RNA產(chǎn)生cDNA文庫(λZAPⅡ,Stratagene)。根據(jù)制造商(Stratagene)指示，將此未擴增cDNA文庫(原代文庫)的大約3×105個噬斑形成單位(pfU)種板。用于噬斑雜交放射性標記的探針(隨機引物DNA標記試劑盒，根據(jù)制造商指示)為Genbank保藏號T76451的序列。將濾膜于42℃預雜交(緩沖液5×SSC,0.5％BSA,5×Denhardt,1％SDS,40mM磷酸緩沖液，pH7.2,100mg/ml鯡精DNA,25％甲酰胺)，隨后在相同溫度雜交14個小時。雜交后，將濾膜用3×SSC,0.5％SDS在42℃洗滌20分鐘，共三次，放射自顯影。挑出雜交噬斑，分離的噬菌斑遵照制造商指示用于體內(nèi)切割。分離來自所獲細菌菌落的質(zhì)粒DNA，用于序列分析，鑒定為SEQIDNO.1。用這種方法分離的質(zhì)粒于1998年7月24日保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ),FRG,保藏號DSM12347。實施例2質(zhì)粒p35SαSSⅠ-Hyg的制備將含有編碼馬鈴薯SSSⅠ(Abel,G.(1995),博士論文，F(xiàn)reieUniversitatBerlin)的部分cDNA的1831bpAsp718/XbaⅠ片段以相對于35S啟動子的反義方向引入載體pBinAR-Hyg的Asp718與XbaⅠ酶切位點之間。實施例3質(zhì)粒p35S-SSⅠ-Kan的制備使含有編碼馬鈴薯SSⅠ(Abel,1995，同前)的cDNA的2384bpEcoRⅠ片段成為平端，并以相對于35S啟動子的有義方向引入預先用SmaⅠ酶切的載體pBinAR中。實施例4質(zhì)粒p35SαSSⅡ-Kan的制備使含有編碼馬鈴薯SSⅡ(Abel,1995,此處稱為GBSSⅡ)的部分cDNA的1959bpSmaⅠ/Asp718片段成為平端，并以相對于35S啟動子的反義方向引入載體pBinAR的SmaⅠ酶切位點中。實施例5質(zhì)粒pB33-SSⅡ-Hyg的制備將含有編碼馬鈴薯SSⅡ(Abel,1995，同前)的cDNA的2619bpSmaⅠ/SalⅠ片段以相對于B33啟動子的有義方向引入預先用SmaⅠ和SalⅠ酶切的載體pBinB33-Hyg中。實施例6質(zhì)粒p35SαSSⅢ-Hyg的制備將含有編碼馬鈴薯SSⅢ(Abel等人，1996，植物雜志10(6):981-991)的cDNA的4212bpAsp718/XbaⅠ片段以相對于35S啟動子的反義方向插入載體pBinAR-Hyg的Asp718與XbaⅠ酶切位點之間。實施例7質(zhì)粒p35S-SSⅢ-Kan的制備使含有編碼馬鈴薯SSⅢ(Abel等人，1996，同前)的cDNA的4191bpEcoRⅠ片段成為平端，并以相對于35S啟動子的有義方向引入載體pBinAR的SmaⅠ酶切位點中。實施例8質(zhì)粒pB33αBEαSSⅢ-Kan的制備使含有編碼馬鈴薯BE酶(Kossmann等人，1991，分子與普通遺傳學230(1-2):39-44)的部分cDNA的1650bpHindⅢ片段成為平端，并以相對于B33啟動子的反義方向引入預先用SmaⅠ酶切的載體pBinB33中。用BamHⅠ切開產(chǎn)生的質(zhì)粒。再將含有編碼馬鈴薯SSⅢ酶(Abel等人，1996，同前)的部分cDNA的1362bpBamHⅠ片段以相對于B33啟動子的反義方向引入該酶切位點中。實施例9質(zhì)粒p35SαSSⅡ-αSSⅢ-Kan的制備將含有編碼馬鈴薯SSⅡ(Abel,1995，同前)的部分cDNA的1546bpEcoRⅤ/HincⅡ片段克隆到已用EcoRⅤ/HincⅡ酶切的載體pBluescriptⅡKS中，然后經(jīng)Asp718/BamHⅠ消化切下，以相對于35S啟動子的反義方向引入以相同方式消化的載體pBinAR中。然后，再將含有編碼馬鈴薯SSⅢ(Abel等人，1996，同前)的部分cDNA的1356bpBamHⅠ片段以相對于35S啟動子的反義方向引入載體pBinAR-SSⅡ的BamHⅠ酶切位點中。實施例10質(zhì)粒pB33αSSⅠαSSⅢ-Kan的制備使含有編碼馬鈴薯SSⅠ(Abel,1995，同前)的cDNA的2384bpEcoRⅠ片段成為平端，并以相對于B33啟動子的反義方向克隆到pBinB33載體的SmaⅠ酶切位點中。再將含有編碼馬鈴薯SSⅢ(Abel等人，1996，同前)的部分cDNA的1362bpBamHⅠ片段以相對于B33啟動子的反義方向引入產(chǎn)生的載體的BamHⅠ酶切位點中。實施例11質(zhì)粒p35SαSSⅡ-Hyg的制備使含有編碼SSⅡ(Abel,1995，同前)的部分cDNA的1959bpSmaⅠ/Asp718片段成為平端，并以相對于35S啟動子的反義方向引入pBinAR-Hyg載體的SmaⅠ酶切位點中。實施例12質(zhì)粒向馬鈴薯細胞基因組中的引入將實施例1-11所得到的質(zhì)粒單個和/或連續(xù)地轉(zhuǎn)移到土壤桿菌中，由此如上所述轉(zhuǎn)化馬鈴薯細胞。隨后由被轉(zhuǎn)化的植物細胞再生為完整植物。實施例13改性淀粉的物理化學表征轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物顯示其合成的改性淀粉的物理化學的改變。由這些植物形成的淀粉例如與野生型植物就其磷酸或直鏈淀粉含量、RVA測定的粘度或膠凝化性質(zhì)及其層析行為而言不同。序列表<110>HoechstScheringAgrEvoGmbH<120>編碼α-葡糖苷酶的核酸分子，合成改性淀粉的植物，植物的制備，其用途，及改性淀粉<130>AGR1998/M225<150>DE19836097.5<151>1998-07-31<160>2<170>patentInVer.2.1<210>1<211>2272<212>DNA<213>馬鈴薯<400>1CGAATACGAATAACCGACGCTAACCATCAACGATGGGAAGTGCCGGAAGAAATTCTCCAC60CGTCCACCACCGCCGTCGCCGCCGTCAACCTCCAACTCCTCATCAGAAAACCACTCCCCA120ATTACCCTCTCTAACCCAAACTCAGACCTAGAGTTCACCCTTCACAACACCATCCCATTC180AGCTTCACCGTCCGCCGGCGCTCCACCGGGGATACTCTTTTCGATACTTCGCCGGAGTTA240GTCATGGGGTTTTGCTTCTGAGTAGCAATGGCATGGATATTGTGTATACGGGTGATAGGA300TTAGTTACAAGGTGATTGGAGGGTTAATTGATTTGTATTTCTTTGCCGGACCTTCGCCGG360AAATGGTGGTGGATCAGTATACTCAGCTTATTGGTCGTCCTGCTGCTATGCCATATTGGT420CTTTCGGATTTCACCAATGCCGGTGGGGTTACAAGAATATTGATGATGTTGAACTGGTAG480TGGATAGTTATGCAAAGTCTAGAATACCGCTGGAGGTTATGTGGACTGATATTGATTACA540TGGATGGTTTTAAGGACTTCACACTCGATCCAGTTAACTTCCCACTGGAGCGGGTAATTT600TTTTTCTCAGGAAGCTTCATCAGAATGATCAGAAATATGTACTAATAGTAGATCCAGGAA660TTAGCATCAACAATACATATGACACCTATAGGAGAGGCATGGAAGCAGATGTCTTCATAA720AACGCGATAATATGCCCTACCAAGGGGTTGTTTGGCCAGGGAATGTTTATTATCCTGATT780TTCTAAATCCAGCTACTGAAGTATTTTGGAGAAATGAAATTGAGAAGTTCCAGGATCTCG840TACCTTTTGATGGCCTGTGGCTTGACATGAATGAATTGTCAAACTTCATAACTTCCCCTC900CTACACCATCATCTACCTTTGATGATCCTCCCTACAAGATAAACAACTCTGGCGATCACT960TGCCCATCAATTATAGAACAGTTCCAGCCACTTCTACACATTTTGGTGATACAATGGAGT1020ATAATGTCCATAACCTTTATGGATTACTTGAATCTAGAGCCACTTATAGTGCATTGGTTA1080ATGTCACTGGTAAAAGGCCATTCATTCTTGTAAGATCAACTTTTCTTGGCTCTGGCAGAT1140ACACGTCACATTGGACTGGAGATAATGCTGCTACCTGGAACGATTTGGCATACTCCATTC1200CTACTATCTTGAGCTTTGGATTGTTTGGAATTCCAATGGTTGGAGCTGATATATGTGGTT1260TTTCAAGTAACACTACTGAAGAGCTTTGCCGCCGCTGGATTCAGCTTGGAGCATTCTATC1320CATTTGCAAGAGACCACTCTGCTAAGGACACAACCCCCCAAGAGCTCTATAGTTGGGATT1380CAGTTGCTGCAGCAGCCAAGAAAGTCCTTGGGCTCCGATATCAGTTACTTCCATACTTTT1440ATATGCTTATGTACGAGGCACATATAAAAGGGACTCCCATTGCACGACCCCTCTTCTTCT1500CTTTCCCTCAAGATGCCAAGACATTTGATATCAGCACACAGTTCCTTCTCGGTAAAGGTG1560TCATGATCTCACCTATACTTAAGCAAGGAGCAACCTCTGTTGATGCATATTTCCCTGCTG1620GAAACTGGTTTGACCTCTTCAATTACTCTCGCTCTGTGAGTTTGAATCAAGGAACATATA1680TGACACTTGACGCACCACCAGATCATATAAATGTACATGTTCGTGAAGGGAACATATTGG1740TCATGCAAGGGGAAGCAATGACAACACAAGCTGCTCAGAGGACTGCATTCAAACTCCTTG1800TCGTGCTGAGCAGCAGCAAAAACAGCACAGGAGAACTATTTGTGGACGATGACGATGAGG1860TGCAGATGGGAAGAGAGGGAGGGAGGTGGACGCTAGTTAAGTTTAACAGCAATATCATTG1920GCAATAAAATTGTGGTTAAATCAGAGGTTGTGAATGGACGATATGCGCTGGATCAAGGAT1980TGGTCCTTGAAAAGGTGACATTATTGGGATTTGAAAATGTGAGAGGATTGAAGAGCTATG2040AGCTTGTTGGATCACACCAGCAAGGGAACACAACAATGAAGGAAAGTCTTAAGCAGAGTG2100GACAGTTTGTTACTATGGAAATCTCAGGGATGTCAATATTGATAGGGAAAGAGTTCAAAT2160TGGAGCTATACATCATTACTTAACAAATGAATTAAGTTATATACGCTTGTTGTATGAAAT2220TTTCTTTCATTTATCAATGCAGTTTAATTTATGATAAAAAAAAAAAAAAAAA2272<210>2<211>682<212)PRT<213>馬鈴薯<400>2ProLysLeuArgProArgValHisProSerGlnHisHisProIleGln151015LeuHisArgProProAlaLeuHisArgGlyTyrSerPheArgTyrPhe202530AlaGlyValSerHisGlyValLeuLeuLeuSerSerAsnGlyMetAsp354045IleValTyrThrGlyAspArgIleSerTyrLysValIleGlyGlyLeu505560IleAspLeuTyrPhsPheAlaGlyProSerProGluMetValValAsp65707580GlnTyrThrGlnLeuIleGlyArgProAlaAlaMetProTyrTrpSer859095PheGLyPheHisGlnCysArgTrpGlyTyrLysAanIleAspAspVal100105110GluLeuValValAspSerTyrAlaLysSerArgIleProLeuGluVal115120125MetTrpThrAspIleAspTyrMetAspGlyPheLysAspPheThrLeu130135140AspProValAsnPheProLeuGluArgValIlePhePheLeuArgLys145150155160LeuHisGlnAspAspGlnLysTyrValLeuIleValAspProGlyIle165170175SerIleAsnAsnThrTyrAspThrTyrArgArgGlyMetGluAlaAsp180185190Va1PheIleLysArgAspAsnMetProTyrGlnGlyValValTrpPro195200205GlyAsnValTyrTyrProAspPheLeuAsnProAlaThrGluValPhe210215220TrpArgAsnGluIleGluLysPheGlnAspLeuValProPheAspGly225230235240LeuTrpLeuAspMetAsnGluLeuSerAsnPheIleThrSerProPro245250255ThrProSerSerThrPheAspAspProProTyrLysIleAsnAsnSer260265270GlyAspHisLeuProIleAsnTyrArgThrValProAlaThrSerThr275280285HisPheGlyAspThrMetGluTyrAsnValHisAsnLeuTyrGlyLeu290295300LeuGluSerArgAlaThrTyrSerAlaLeuValAsnValThrGlyLys3053l0315320ArgProPheIleLeuValArgSerThrPheLeuGlySerGlyArgTyr325330335ThrSerHisTrpThrGlyAspAsnAlaAlaThrTrpAsnAspLeuAla340340350TyrSerIleProThrIleLeuSerPheGlyLeuPheGlyIleProMet355360365ValGlyAlaAspIleCysGlyPheSerSerAsnThrThrGluGluLeu370375380CysArgArgTrpIleGlnLeuGlyAlaPheTyrProPheAlaArgAsp385390395400HisSerAlaLysAspThrThrProGlnGluLeuTyrSerTrpAspSer405410415ValAlaAlaAlaAlaLysLysValLeuGlyLeuArgTyrGlnLeuLeu420425430ProTyrPheTyrMetLeuMetTyrGluAlaHisIleLysGlyThrPro435440445IleAlaArgProLeuPhePheSerPheProGlnAspAlaLysThrPhe450455460AspIleSerThrGlnPheLeuLeuGlyLysGlyValMetIleSerPro465470475480IleLeuLysGlnGlyAlaThrSerValAspAlaTyrPheProAlaGly485490495AsnTrpPheAspLeuPheAsnTyrSerArgSerValSerLeuAsnGln500505510GlyThrTyrMetThrLeuAspAlaProProAspHisIleAsnValHis515520525ValArgGluGlyAsnIleLeuValMetGlnGlyGluAlaMetThrThr530535540GlnAlaAlaGlnArgThrAlaPheLysLeuLeuValValLeuSerSer545550555560SerLysAsnSerThrGlyGluLeuPheValAspAspAspAspGluVal565570575GlnMetGlyArgGluGlyGlyArgTrpThrLeuValLysPheAsnSer580585590AsnIleIleGlyAsnLysIleValValLysSerGluValValAsnGly595600605ArgTyrAlaLeuAspGlnGlyLeuValLeuGluLysValThrLeuLeu610615620GlyPheGluAsnValArgGlyLeuLysSerTyrGluLeuValGlySer625630635640HisGlnGlnGlyAsnThrThrMetLysGluSerLeuLysGlnSerGly645650655GlnPheValThrMetGluIleSerGlyMetSerIleLeuIleGlyLys660665670GluPheLysLeuGluLeuTyrIleIleThr675680權(quán)利要求1．一種編碼具有馬鈴薯α-葡糖苷酶功能的蛋白質(zhì)之核酸分子，其選自a)編碼一種蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)涵蓋SEQIDNO.2所述的氨基酸序列或其衍生物或部分，b)一種涵蓋SEQIDNO.1所述的核苷酸序列，或其衍生物或部分，或一種相應的核苷酸序列的核酸分子；c)一種核酸分子，其可與a)或b)所述核酸分子雜交或互補，優(yōu)選地可特異性地與a)或b)所述核酸分子雜交；和d)核酸分子，由于遺傳密碼的簡并性其核苷酸序列背離a)、b)或c)所述核酸分子的序列。2．一種重組核酸分子，其包含a)一種編碼權(quán)利要求1的具有馬鈴薯α-葡糖苷酶功能的蛋白質(zhì)之核酸分子；和b)一種或多種核苷酸序列，其編碼一種選自A組的蛋白質(zhì)，包括具有下列功能的蛋白質(zhì)分支酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、顆粒結(jié)合淀粉合酶、可溶性淀粉合酶、脫支酶、歧化酶、質(zhì)體淀粉磷酸化酶、R1酶、淀粉酶、葡糖苷酶，所述核苷酸序列的片段，或可與所述核苷酸序列雜交的核酸分子。3．權(quán)利要求1或2的核酸分子，其為脫氧核糖核酸分子。4．權(quán)利要求2的核酸分子，其為cDNA分子。5．權(quán)利要求1的核酸分子，其為核糖核酸分子。6．一種核酸分子，其可與一種或多種權(quán)利要求1-5的核酸分子雜交，優(yōu)選地特異性雜交。7．一種含有權(quán)利要求1-6中一項或多項的核酸分子的載體。8．一種含有權(quán)利要求1-6中一項或多項的核酸分子的載體，其中編碼具有可溶性淀粉合酶Ⅲ的功能的蛋白質(zhì)或其部分的核苷酸序列為有義或反義反向。9．一種含有權(quán)利要求1-6中一項或多項的核酸分子的載體，其中編碼選自A組的一種或多種蛋白質(zhì)之核苷酸序列或其部分為有義或反義反向。10．一種含有權(quán)利要求1-6中一項或多項的核酸分子的載體，其中編碼選自A組的一種或多種蛋白質(zhì)之核苷酸序列部分呈有義方向，部分呈反義反向。11．一種含有權(quán)利要求1-6中一項或多項的核酸分子的載體，該分子與在原核或真核細胞中確保RNA轉(zhuǎn)錄和合成的調(diào)節(jié)元件連接，所述RNA任選地可翻譯。12．一種用權(quán)利要求1-6中一項或多項核酸分子或用權(quán)利要求7-11中的一項或多項載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞或來自這類細胞的宿主細胞。13．一種產(chǎn)生合成改性淀粉的轉(zhuǎn)基因植物細胞的方法，其中如權(quán)利要求1-6中的一項或多項核酸分子或權(quán)利要求7-11中的載體整合入植物細胞的基因組。14．一種可通過權(quán)利要求13的方法獲得的植物細胞。15．一種產(chǎn)生合成改性淀粉的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中從權(quán)利要求14的細胞中再生完整植物。16．一種植物，其含有權(quán)利要求14的植物細胞。17．權(quán)利要求16的植物，其是有用的植物。18．權(quán)利要求16-17中一項或多項的植物，它是一種淀粉貯藏植物。19．權(quán)利要求16-18中一項或多項的植物，它是小麥、玉米、馬鈴薯或稻植物。20．權(quán)利要求16-19中一項或多項的植物的繁殖材料。21．一種通過本質(zhì)上已知的方法制備淀粉的方法，其中權(quán)利要求14的植物細胞，權(quán)利要求16-19中一項或多項的植物，或權(quán)利要求20的繁殖材料結(jié)合于該方法中。22．一種淀粉，其可獲自權(quán)利要求12或14中的細胞，權(quán)利要求16-19中一項或多項的植物，權(quán)利要求20的繁殖材料或權(quán)利要求21的方法。23．權(quán)利要求22中的淀粉在工業(yè)中，優(yōu)選地在食品、包裝材料或一次性物品生產(chǎn)中的應用。24．權(quán)利要求1-6中一項或多項的核酸分子或權(quán)利要求7-11中一項或多項的載體在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因細胞，優(yōu)選地細菌或植物細胞中的應用。25．權(quán)利要求14中的植物細胞，權(quán)利要求16-19中一項或多項的植物，或權(quán)利要求20的繁殖材料在淀粉生產(chǎn)中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及編碼具有α－葡糖苷酶活性的來自馬鈴薯的蛋白質(zhì)之核酸分子。本發(fā)明還涉及制備合成改性淀粉的轉(zhuǎn)基因植物細胞及植物的方法。本發(fā)明還涉及含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的載體和宿主細胞,用根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物細胞和植物,根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物合成的淀粉。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生所述淀粉的方法。文檔編號C12N15/82GK1316003SQ99810309公開日2001年10月3日申請日期1999年7月30日優(yōu)先權(quán)日1998年7月31日發(fā)明者C·弗羅伯格申請人:阿溫提斯作物科學有限公司