專利名稱：角質(zhì)形成細胞衍生的干擾素的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種編碼是干擾素家族成員的多肽的新的人基因，更具體地本發(fā)明提供了編碼稱為“角質(zhì)形成細胞衍生的干擾素”或“KDI”的人多肽的分離的核酸分子。還提供了KDI多肽，生產(chǎn)這種物質(zhì)的載體、宿主細胞及重組方法。本發(fā)明還提供了檢測與免疫系統(tǒng)相關疾病的診斷方法，及治療免疫系統(tǒng)疾病的方法。本發(fā)明還涉及鑒別KDI的興奮劑和拮抗劑的篩選方法。
抗病毒IFN已用于臨床抗病毒治療，例如用于治療AIDS(Lane.Semin.Oncol.18:46-52(Ocl.1991))，病毒性肝炎包括慢性乙肝，丙肝(Woo,M.H.and Brunakis,T.G.,Ann.Parmacother.31:330-337(1997年3月)；Gibas.A.L.Gastroenterologist,1:129-142(1993.6))，丁肝，乳頭瘤病毒(Levine,L.A.等，Urology 47:553-557(1996.4))，皰疹病毒(Ho,M.,Annu.Rev.Med.38:51-59(1987))，腦炎病毒(Wintergerst等，感染，20:207-212(1992,7))，及用于預防鼻炎和呼吸道感染(Ho.M.,Annu.Rev.Med.38:51-59(1987))。
抗寄生蟲IFN已被建議用于抗寄生蟲治療，例如γ-IFN可用于治療Cryptosporidium parvum感染(Rehg,J.E.,J.Infect.Des.174:229-232(1996.7))。
抗細菌IFN已臨床用于抗菌治療。例如γ-IFN已用于治療多抗藥性肺結(jié)核(Condos,R.等，Lancet.349:1513-1515(1997))。
抗癌干擾素療法已用于治療各種癌癥(例如，多毛細胞白血病(Hofmann等，癌癥治療綜述，12(增刊.B):33-37(1985,12))急性骨髓樣白血病(Stone,R.M.等，Am.J.Clin.Oncol.16:159-163(1993,4))，骨肉瘤(Strander,H.等，Acta Oncol,34:877-880(1995))，基細胞癌(Dogan,B.等，癌癥信息91:215-219(1995,5))，神經(jīng)膠質(zhì)瘤(Fetell,M.R.等，癌癥65:78-83(1990.1)，腎細胞癌(Aso.Y.等，Prof.Clin.Biol.Res.303:653～659(1989))，多骨髓瘤(Peest.D.等，Br.J.Haematol.94:425-432(Sept.1996))，黑素瘤(Ikic.D.等.，Int.J.Dermatol.34:872-874(1995.12))和Hodgkin’s病(Rybak,M.E.等，J.Biol.Response Mod.9:1-41(1990.2))。α干擾素和替莫唑胺組合治療癌癥的增效治療進展已經(jīng)報道(專利公開WO9712630,Dugan,M.H.)。
免疫療法IFN已臨床用于免疫治療或更特別地用于(1)例如預防移植體對宿主的排斥，或縮短自身免疫系統(tǒng)疾病的漸進如關節(jié)炎、多發(fā)硬化，(2)糖尿病。β-IFN在美國批準銷售治療多發(fā)硬化(即作為免疫抑制劑)。近來有報道多發(fā)硬化患者Ⅰ型干擾素和白細胞介素-2的產(chǎn)生減少(Wandinger,K.P.等，J.Neurol.Sci.149:87-93(1997))。另外，重組α-IFN免疫療法(與重組人IL-2組合)已成功用于自體骨髓或造血干細胞移植后的淋巴癌患者，其可在翻譯后促進病情好轉(zhuǎn)(Nagler,A.等，Blood 89:3951-3959(1997.7))。
抗變態(tài)反應服用γ-IFN已用于治療哺乳動物變態(tài)反應(參見專利公開WO8701288,Parkin,J.M.和Pinching,A.J.)現(xiàn)也已證實變態(tài)反應哮喘患者體內(nèi)IL-12和IL-12依賴型γ-IFN釋放減少(van der Pouw kraan,T.C.等，免疫雜志158:5560-5565(1997))。因此，IFN通過抑制體液應答而可用于治療變態(tài)反應。
疫苗佐劑干擾素可用作佐劑或輔佐劑以增強或刺激預防或治療接種情況下的免疫應答。(Heath,A.W和Playfair,J.H.L.疫苗10:427-434)1992))。
顯然地，本領域中需要揭示新干擾素蛋白的各種應用，例如免疫治療，以及抗病毒，抗寄生蟲，抗細菌，或抗癌治療中，或需要提高干擾素活性的癥狀。
編碼的多肽具有推導的27個氨基酸的前導序列，在

圖1中下劃線處；推導的成熟KDI蛋白質(zhì)的氨基酸序列在圖1中如28～207位氨基酸所示，在SEQ ID NO:2中如1～207位殘基所示。
圖1(SEQ ID NO:2)的165-183位殘基包括干擾素多肽尤其KDI多肽的特征序列。因此，優(yōu)選的是包括圖1的165-183位殘基的多肽及編碼這種多肽的多核苷酸。
因此，本發(fā)明一方面提供了分離的核酸分子，其包括含有選自以下一組核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO:2中完整氨基酸序列的KDI多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有除N末端甲硫氨酸之外完整SEQ ID NO:2氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的2～207位殘基)的KDI多肽的核苷酸；(c)編碼SEQ ID NO:2中28～207位殘基所示成熟KDI多肽的核苷酸序列；(d)編碼SEQ ID NO:2的165～183位殘基的核苷酸序列；(e)編碼由克隆HKAPI15中所含人cDNA編碼的完整多肽的核苷酸序列；(f)編碼由克隆HKAPI15中所含的人cDNA編碼的除N末端甲硫氨酸之外完整多肽的核苷酸序列；(g)編碼由克隆HKAPI15中所含的人cDNA編碼的成熟多肽的核苷酸序列；和(h)與以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)的任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一實施方案包括分離的核酸分子，其包括具有至少90％，優(yōu)選至少95％,96％,97％,98％或99％相同于上述(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)任一核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或具有在嚴格雜交條件下與(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)中多核苷酸雜交的多核苷酸。此雜交的多核苷酸在嚴格雜交條件下與具有只由A或T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸不雜交。本發(fā)明的另一核酸實施方案涉及分離的核酸分子,其包括編碼具有上述(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)氨基酸序列的KDI多肽的攜帶表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及重組載體，其包括本發(fā)明分離的核酸分子，還涉及含有重組載體的宿主細胞，以及生產(chǎn)這種載體和宿主細胞及用它們通過重組技術生產(chǎn)KDI多肽或肽的方法。
本發(fā)明還提供了分離的KDI多肽，其包括選自以下一組氨基酸序列的氨基酸序列(a)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的全長KDI多肽的氨基酸序列；(b)具有除N末端甲硫氨酸之外的SEQID NO:2所示完整氨基酸序列的全長KDI多肽的氨基酸序列(即SEQID NO:2的2～207位殘基)；(c)SEQ ID NO:2中28～207位殘基所示成熟KDI多肽的氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:2的165～183位殘基所示氨基酸序列；(e)由克隆HKAPI15中含有的人cDNA編碼的全長KDI多肽；(f)由克隆HKAPI15中含有的人cDNA編碼的除N-末端甲硫氨酸之外的全長KDI多肽；和(g)由克隆HKAPI15含有的人cDNA編碼的成熟KDI多肽。本發(fā)明的多肽還包括具有至少80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選95％,96％,97％,98％或99％相同于上述(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中所述氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，以及與上述那些序列具有至少90％，優(yōu)選至少95％相似性的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的另一實施方案涉及肽或多肽，其包括具有以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)所述氨基酸序列的KDI多肽的攜帶表位部分的氨基酸序列。具有本發(fā)明KDI多肽的攜帶表位部分氨基酸序列的肽或多肽包括具有至少6或7個，優(yōu)選至少9個，更優(yōu)選至少30～50個氨基酸的這種多肽的一部分，當然直至并包括本發(fā)明多肽的完整氨基酸序列的任何長度的攜帶表位的多肽也包括在本發(fā)明內(nèi)。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供了分離的抗體，其特異地與具有(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)所述氨基酸序列的KDI多肽結(jié)合。本發(fā)明還提供了分離與具有本文所述氨基酸序列的KDI多肽特異結(jié)合的抗體的方法。這種抗體在以下所述治療中是有效的。
本發(fā)明還提供了含KDI多肽的藥物組合物，其可用于治療免疫系統(tǒng)相關疾病如病毒感染，寄生蟲感染，細菌感染，癌癥，自身免疫系統(tǒng)疾病，多發(fā)硬化、淋巴癌及變態(tài)反應疾病。本發(fā)明還提供了治療各種需要干擾素多肽的個體的方法。
本發(fā)明還提供了含有KDI多肽或KDI多核苷酸的組合物以施用于體外細胞，來自體內(nèi)的細胞及體內(nèi)細胞，或多細胞生物體。在本發(fā)明的某些特別優(yōu)選的實施方案中，組合物含有KDI多核苷酸，用于在宿主機體內(nèi)表達KDI多肽以治療疾病。尤為優(yōu)選的是在患者體內(nèi)表達以治療與干擾素畸變內(nèi)源活性相關的功能異常。
本發(fā)明還提供了鑒別能增強或抑制KDI多肽生物活性的化合物的篩選法，其包括將由KDI多肽增強的受體在存在KDI多肽時與候選化合物相接觸，分析例如在候選化合物和KDI多肽存在時的抗病毒活性，并將此活性與標準活性水平相對比，標準水平是在受體與KDI之間沒有候選化合物的情況下相接觸分析而得。在此分析中，活性高于標準水平表明候選化合物是KDI活性的興奮劑，活性低于標準水平表明候選化合物是KDI活性的拮抗劑。
現(xiàn)已揭示KDI在角質(zhì)形成細胞中表達。因而本發(fā)明的核酸用作雜交探針以示差鑒別生物樣本中存在的組織或細胞類型。相似地，多肽及其抗體用于提供免疫探針以示差鑒別組織或細胞類型。另外，對上述組織或細胞尤其免疫系統(tǒng)的疾病而言，在取自具有相關的疾病患者的某些組織(例如癌及創(chuàng)作組織)或體液(例如血清、血漿、尿、滑液或腦脊液)中可檢測與“標準”KDI基因表達水平相比明顯較高或較低水平KDI基因表達，標準KDI基因表達水平即在無免疫系統(tǒng)疾病的健康組織中KDI的表達水平。因此，本發(fā)明提供了在診斷這種疾病中的有效診斷方法，其包括(a)分析在個體細胞或體液中KDI基因表達水平；(b)對比此KDI基因表達水平與標準KDI基因表達水平，從而根據(jù)對比結(jié)果高于或低于標準水平來指示免疫系統(tǒng)疾病。
本發(fā)明另一方面涉及一種治療需要機體內(nèi)干擾素活性水平增高的患者的方法，包括給予這種患者含有治療有效量的本發(fā)明分離的KDI多肽或其興奮劑的組合物。
本發(fā)明另一方面還涉及一種治療需要機體內(nèi)干擾素活性水平降低的患者的方法，包括給予這種患者含有治療有效量的KDI拮抗劑的組合物。本發(fā)明中使用的優(yōu)選拮抗劑是KDI特異抗體。
圖2示出KDI蛋白質(zhì)與人Ω干擾素mRNA的翻譯產(chǎn)物(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列之間的相同區(qū)域，這通過Bestfit計算機程序確定(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)。
圖3示出KDI氨基酸序列分析。示出了α,β，轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)，親水性和疏水性；兩親性區(qū)；柔性區(qū)；抗原指數(shù)及表面概率。在“抗原指數(shù)-Jameson-Wolf”圖中，正峰值表明KDI蛋白的高抗原區(qū)的位置，即從中可獲得本發(fā)明攜帶表位的肽。
圖4示出本發(fā)明的KDI多肽與干擾素多肽家族一些其它成員的序列對比。所示的是人干擾素β-1(SEQ ID NO:4)，人胎盤干擾素(SEQ ID NO:5)，人Ω干擾素(SEQ ID NO:6)，人α-c干擾素(SEQ ID NO:7)，人α-F干擾素(SEQ ID NO:8)，人干擾素Ⅱ-1(SEQ ID NO:9)，人α干擾素-N(SEQ ID NO:10)，牛TP-1(SEQ ID NO:11),ovi TP-1(SEQ ID NO:12)；豬TP(SEQ IDNO:13)；人干擾素β-2a(IL-6)(SEQ ID NO:14)，牛干擾素β-2(SEQ ID NO:15)，牛干擾素β-1(SEQ ID NO:20)，合成干擾素β-1(SEQ ID NO:21)。此序列對比是通過Megalign常規(guī)Clustal方法用PAM250殘基重量表產(chǎn)生的。Megalign包含在DNAstar suite程序中。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包括編碼具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的角質(zhì)形成細胞衍生的干擾素多肽(KDI)的多核苷酸。圖1所示核苷酸序列(SEQ ID NO:1)是通過對1998年12月1日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),10801 Boulevard大學，Manassas,Virgina 20110-2209，保藏號ATCC 203500的人HKAPI15 cDNA進行測序而獲得的。此保藏的cDNA包含在質(zhì)粒pCMVSport 2.0中(Life Technologies,Gaithersburg MD)，并可通過位于人cDNA側(cè)翼的SalⅠ/NotⅠ限制性酶位點切除。
本發(fā)明的KDI蛋白質(zhì)與干擾素家族的一些成員呈序列同源，特別是人Ω干擾素mRNA的翻譯產(chǎn)物(圖2)(SEQ ID NO:3)。Ω干擾素已示出抑制各種腫瘤細胞體外增殖，刺激天然殺傷細胞活性，增強主要組織相容性Ⅰ類(非Ⅱ類)抗原表達，并抑制用促細胞分裂原或同種異型細胞刺激的淋巴細胞增殖。參見Adolf,G.R.人Ω干擾素綜述，Mult Scler 1995；1 Suppl 1:S44-S47。已測定KDI表達主要在角質(zhì)形成細胞、樹狀細胞和單核細胞中發(fā)現(xiàn)，但在角質(zhì)形成細胞中尤其強。用TNF-α或PolyIC(刺激病毒感染)刺激角質(zhì)形成細胞特異并迅速地刺激KDI轉(zhuǎn)錄物的過表達?；谄浣Y(jié)構與Ω-IFN相似且在對刺激的病毒感染應答中表達增加，確認KDI呈現(xiàn)Ω-IFN和其它干擾素蛋白的許多生物活性，包括抑制腫瘤增殖，抗病毒活性，NK細胞功能及免疫系統(tǒng)增強作用。核酸分子除非特別表明，所有通過對本文DNA分子進行測序測定的核苷酸序列均用自動DNA測序儀(如Model 373 from Applied Biosystems.Inc.Foster City.CA)測定，由本文測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列通過如上測定的DNA序列翻譯推導。因而如本領域已知通過自動方法測定的任何DNA序列一樣，本文測定的核苷酸序列可有一些誤差。自動測定的核苷酸序列與測序DNA分子的真正核苷酸序列典型地至少大約90％，更典型地至少大約95％～99.9％相同。真實序列可通過其它方法更精確測定，包括本領域熟知的人工DNA測序法。本領域也已知測定的核苷酸序列與真實序列相對比有一個插入或缺失將導致核苷酸序列翻譯中讀框移位，由此由測定的核苷酸序列編碼的推導的氨基酸序列從這個插入或缺失點開始將完全不同于由測序的DNA分子真實編碼的氨基酸序列。
核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”對DNA分子或多核苷酸而言是指脫氧核糖核苷酸的序列，對RNA分子或多核苷酸而言是指相應核糖核苷酸(A,G,C和U)的序列，其中在特異的脫氧核糖核苷酸序列中的每個胸腺嘧啶脫氧核苷(T)被尿嘧啶核苷(U)取代。
用本文提供的信息，如圖1中的核苷酸序列，用標準分子生物學方法如用mRNA作起始物克隆cDNA，可獲得編碼KDI多肽的本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明例證了圖1所示核酸分子(SEQ ID NO:1)在衍生自分離的角質(zhì)形成細胞的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)。
圖1的KDI DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)包括編碼207個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的一開放讀框，起始密碼子在圖1所示核苷酸序列(SEQ ID NO:1)的35～37位核苷酸。SEQ ID NO:2所示的KDI蛋白質(zhì)的氨基酸序列大約35％相同于Ω-IFN(圖2)。Ω-IFN的序列可在GenBank獲得，登記號No.gb1A 12140。
熟練技術人員知道由于可能存在上述序列誤差，由保藏的cDNA編碼的包括大約207個氨基酸的真正完整KDI多肽有時可以較長或較短。一般地，真正開放讀框可以在推導自圖1所示(SEQ ID NO:1)N末端甲硫氨酸密碼子的±20個，尤其±10個氨基酸范圍內(nèi)。前導和成熟序列完整KDI蛋白的氨基酸序列包括前導序列和成熟蛋白質(zhì)，如SEQID NO:2所示。本發(fā)明尤其提供了編碼成熟形式KDI蛋白質(zhì)的核酸分子。因此根據(jù)信號假說，一旦生長蛋白鏈經(jīng)過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開始輸出，由哺乳動物細胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號或分泌性前導序列，其裂解自完整多肽以產(chǎn)生分泌的“成熟”形式蛋白質(zhì)。大多數(shù)哺乳動物細胞甚至昆蟲細胞以相同特異性裂解分泌的蛋白質(zhì)。然而在一些情況中，分泌蛋白的裂解不是完全均勻的，則產(chǎn)生兩或多種成熟蛋白質(zhì)。另外，長期以來已知分泌蛋白質(zhì)的裂解特異性由完整蛋白質(zhì)的一級結(jié)構最終確定，即其在多肽的氨基酸序列中是固有的。因而本發(fā)明提供了編碼具有由人克隆HKAPI15(ATCC.保藏號No.203500)中cDNA編碼的氨基酸序列的成熟KDI多肽的核苷酸序列?！熬哂杏扇丝寺KAPI15中的cDNA編碼的氨基酸序列的成熟KDI多肽”是指由包含在保藏載體中的克隆的人DNA序列編碼的完整開放讀框在哺乳動物細胞中(如下述COS細胞)表達而產(chǎn)生的成熟形式的KDI蛋白質(zhì)。
另外，本發(fā)明提供了推測蛋白質(zhì)是否具有分泌前導序列以及前導序列裂解點的方法。例如McGeoch的方法(病毒研究3:271-286(1995))使用來自完整的(未裂解)蛋白質(zhì)的短N-末端荷電區(qū)及隨后的非荷電區(qū)的信息。Heinje的方法(核酸研究14:4683～4690(1986))使用來自圍繞裂解位點，典型地-13～+2殘基的殘基信息，其中+1表示成熟蛋白質(zhì)的氨基末端。這些方法中已知哺乳動物分泌蛋白的推導的裂解位點準確度為75-80％(Heinje，前述)。然而，這兩種方法對于一給定蛋白質(zhì)不總是得出相同推導的切割點。
在本發(fā)明中，完整KDI多肽的推導的氨基酸序列用“PSORT”計算機程序分析，該程序得自京都大學化學研究所的Kenta Nakai博士(參見K.Nakai and M.Kanehisa,Genomics 14:897-911(1992))，其是基于氨基酸序列推測蛋白質(zhì)的細胞定位的專門系統(tǒng)。作為此計算機推測定位的一部分，可將McGeoch和Heinje的方法摻入。以上計算機分析推測一個在完整氨基酸序列內(nèi)的潛在切割位點示于SEQ IDNO:2；即在圖1(SEQ ID NO:2)中27和28位殘基之間。當然，被天然發(fā)生的酶使用的切割位點的準確位置與推測的切割位點可有輕微變化且在物種間可以變化。由此提供了起自大約20～34位殘基的成熟多肽。尤其地，本發(fā)明提供了具有如下SEQ ID NO:2一部分的多肽SEQ ID NO:2中20～207位殘基，SEQ ID NO:2中21～207位殘基，SEQ ID NO:2中22～207位殘基，SEQ ID NO:2中23～207位殘基，SEQ ID NO:2中24～207位殘基，SEQ ID NO:2中的25～207位殘基，SEQ ID NO:2中的26～207位殘基，SEQ IDNO:2中的27～207位殘基，SEQ ID NO:2中的28～207位殘基，SEQ ID NO:2中29～207位殘基，SEQ ID NO:2中30～207位殘基，SEQ ID NO:2中31～207位殘基，SEQ ID NO:2中32～207位殘基，SEQ ID NO:2中33～207位殘基，SEQ ID NO:2中34～207位殘基。本發(fā)明還提供了編碼這種多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的核酸分子可以是RNA形式或DNA形式。此DNA可以是雙鏈或單鏈的。單鏈DNA或RNA可以是編碼鏈，也指作有義鏈，或其可以是非編碼鏈，也指作反義鏈。
在特異實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸長度小于300kb,200kb,100kb,50kb,15kb,10kb或7.5kb。在另一實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包括KDI編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸，但不包括任何KDI內(nèi)含子的全部或部分。在另一實施方案中，包括KDI編碼序列的核酸不含有基因組側(cè)翼基因的編碼序列(即基因組中KDI編碼序列的5’或3’)。
“分離的”核酸分子是指已從其天然環(huán)境中移出的核酸分子，DNA或RNA。例如，本發(fā)明包含于載體中的重組DNA分子是分離的。分離的DNA分子例如包括保存在異源宿主細胞中的重組DNA分子，或溶液中純化的(部分或基本純化的)DNA分子。分離的RNA分子包括本發(fā)明DNA分子的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。然而作為還未與文庫(如基因組或cDNA文庫)的其它成員分離的文庫成員(如含有克隆和文庫其它成員的均勻溶液形式)的克隆中含有的核酸不是分離的，或分離或取自細胞或細胞裂解物的染色體(如染色體組型中“染色體涂片”)不是分離的。如本文所述，根據(jù)本發(fā)明的分離的核酸分子可以是天然、重組或合成產(chǎn)生的。
本發(fā)明分離的核酸分子包括具有開放讀框(ORF)的DNA分子，該讀框起始密碼子在圖1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列35～37位。
本發(fā)明分離的核酸分子還包括具有缺失N末端甲硫氨酸的SEQID NO:2的2～207位所示KDI蛋白編碼序列的DNA分子。
另外，本發(fā)明的分離的核酸分子由于遺傳密碼的簡并包括含有基本不同于上述那些序列，但仍編碼KDI蛋白的序列的DNA分子。當然本領域熟知遺傳密碼和物種特異密碼的優(yōu)先性。因此，本領域技術人員產(chǎn)生上述簡并變體，例如使特殊宿主密碼子表達最佳化(例如利用細菌宿主如E.coli將人mRNA中密碼改變?yōu)槠鋬?yōu)選的)是常規(guī)技術。
本發(fā)明另一方面提供了編碼具有由克隆HKAPI15(ATCC保藏號No.203500)中人cDNA編碼的氨基酸序列的KDI多肽的分離的核酸分子。優(yōu)選地，此核酸分子將編碼由上述保藏的人cDNA編碼的成熟多肽。
本發(fā)明還提供了具有圖1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列，或具有包含于上述保藏的克隆中的KDI cDNA的核苷酸序列的分離的核酸分子，或具有互補于上述序列之一的序列的核酸分子。這種分離的分子，尤其DNA分子用于生產(chǎn)本發(fā)明的KDI多肽，并作為探針檢測用載體轉(zhuǎn)染生產(chǎn)KDI的細胞中的mRNA，即作為標記測定宿主細胞中異源基因的表達。
本發(fā)明還涉及編碼本文所述核苷酸序列一部分的核酸分子，以及所述分離的核酸分子的片段。本發(fā)明尤其提供了具有代表SEQ IDNO:1一部分的核苷酸序列的多核苷酸，其由SEQ ID NO:1的35～655位組成。本發(fā)明其它特別優(yōu)選的多核苷酸片段包括或由SEQ IDNO:1的以下核苷酸殘基組成 38-655,41-655,44-655,47-655,50-655,53-655,56-655,59-655,62-655,65-655,68-655,71-655,74-655,77-655,80-655,83-655,86-655,89-655,92-655,95-655,98-655,101-655,104-655,107-655,110-655,113-655,116-655,119-655,122-655,125-655,128-655,131-655,134-655,137-655,140-655,143-655,146-655,149-655,152-655,155-655,158-655,161-655,164-655,167-655,170-655,173-655,176-655,179-655,182-655,185-655,188-655,191-655,194-655,197-655,200-655,203-655,206-655,209-655,212-655,215-655,218-655,221-655,224-655,227-655,230-655,233-655,236-655,239-655,242-655,245-655,248-655,251-655,254-655,257-655,260-655,263-655,266-655,269-655,272-655,275-655,278-655,281-655,284-655,287-655,290-655,293-655,296-655,299-655,302-655,305-655,308-655,311-655,314-655,317-655,320-655,323-655,326-655,329-655,332-655,335-655,338-655,341-655,344-655,347-655,350-655,353-655,356-655,359-655,362-655,365-655,368-655,371-655,374-655,377-655,380-655,383-655,386-655,389-655,392-655,395-655,398-655,401-655,404-655,407-655,410-655,413-655,416-655,419-655,422-655,425-655,428-655,431-655,434-655,437-655,440-655,443-655,446-655,449-655,452-655,455-655,458-655,461-655,464-655,467-655,470-655,473-655,476-655,479-655,482-655,485-655,488-655,491-655,494-655,497-655,500-655,503-655,506-655,509-655,512-655,515-655,518-655,521-655,524-655,527-655,530-655,533-655,536-655,539-655,542-655,545-655,548-655,551-655,554-655,557-655,560-655,563-655,566-655,569-655,572-655,575-655,578-655,581-655,584-655,587-655,590-655,593-655,596-655,599-655,602-655,605-655,608-655,611-655,614-655,617-655,620-655,623-655,626-655,629-655,632-655,和635-655本發(fā)明尤為優(yōu)選的多核苷酸片段包括或由SEQ ID NO:1的以下核苷酸殘基組成38-68,38-71,38-74,38-77,38-80,38-83,38-86,38-89,38-92,38-95,38-98,38-101,38-104,38-107,38-110,38-113,38-116,38-119,38-122,38-125,38-128,38-131,38-134,38-137,38-140,38-143,38-146,38-149,38-152,38-155,38-158,38-161,38-164,38-167,38-170,38-173,38-176,38-179,38-182,38-185,38-188,38-191,38-194,38-197,38-200,38-203,38-206,38-209,38-212,38-215,38-218,38-221,38-224,38-227,38-230,38-233,38-236,38-239,38-242,38-245,38-248,38-251,38-254,38-257,38-260,38-263,38-266,38-269,38-272,38-275,38-278,38-281,38-284,38-287,38-290,38-293,38-296,38-299,38-302,38-305,38-308,38-311,38-314,38-317,38-320,38-323,38-326,38-329,38-335,38-338,38-341,38-344,38-347,38-350,38-353,38-356,38-359,38-362,38-365,38-368,38-371,38-374,38-377,38-380,38-383,38-386,38-389,38-392,38-395,38-398,38-401,38-404,38-407,38-410,38-413,38-416,38-419,38-422,38-425,38-428,38-431,38-434,38-437,38-440,38-443,38-446,38-449,38-452,38-455,38-458,38-461,38-464,38-467,38-470,38-473,38-476,38-479,38-482,38-485,38-488,38-491,38-494,38-497,38-500,38-503,38-506,38-509,38-512,38-515,38-518,38-521,38-524,38-527,38-530,38-533,38-536,38-539,38-542,38-545,38-548,38-551,38-554,38-557,38-560,38-563,38-566,38-569,38-572,38-575,38-578,38-581,38-584,38-587,38-590,38-593,38-596,38-599,38-602,38-605,38-608,38-611,38-614,38-617,38-620,38-623,38-626,38-629,38-632，和38-635另外，本發(fā)明包括含有SEQ ID NO:1的至少大約30個，優(yōu)選至少大約50個連續(xù)核苷酸的任何部分的多核苷酸。
通常地，具有保藏的cDNA的核苷酸序列或圖1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列的分離的核酸分子的片段是指用作所述診斷探針和引物的長度至少大約15nt，優(yōu)選至少大約20nt，更優(yōu)選至少大約30nt，最優(yōu)選至少大約40nt的片段。當然長度為50～600nt的較大片段(長度為400nt,450nt,500nt,550nt和600nt的片段也屬于所有長度在15和600nt之間片段，但是考慮空間特性不特別列舉)根據(jù)本發(fā)明也是有用的，相當于保藏的cDNA或圖1(SEQ ID NO:1)所示的大部分(如果不是全部)核苷酸序列的片段也是有用的。例如，長度為至少20nt的片段是指包括保藏的cDNA的核苷酸序列或圖1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列的20或更多個連續(xù)堿基的片段，當然可包括非衍生自SEQ ID NO:1(或保藏的cDNA)的融合在SEQ ID NO:1或保藏的cDNA的20＋連續(xù)堿基的任一個末端的額外核酸序列。本發(fā)明優(yōu)選的核酸片段包括編碼如圖3中鑒別的KDI多肽攜帶表位部分的核酸分子，并如下詳述。
本發(fā)明另一方面提供了分離的核酸分子，其包括在嚴格雜交條件下與上述本發(fā)明核酸分子中一部分多核苷酸例如克隆HKAPI15(ATCC保藏號203500)中人cDNA雜交的多核苷酸?！皣栏耠s交條件”是指在含以下成份的溶液中在42℃培養(yǎng)過夜50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl,15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6),5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/ml變性的剪切鮭精DNA，隨后在大約65℃用0.1×SSC將濾膜洗滌2次。
與多核苷酸“一部分”雜交的多核苷酸是指與相關多核苷酸的至少大約15個核苷酸(nt)，優(yōu)選至少大約20nt，更優(yōu)選至少大約30個nt，最優(yōu)選至少大約30-70個nt(例如50個)雜交的多核苷酸(DNA或RNA)。這些多核苷酸如上述用作診斷探針和引物并在下文詳述。
例如“長度至少為20個nt”的一部分多核苷酸是指相關多核苷酸的核苷酸序列的20或更多個連續(xù)核苷酸(如保藏的cDNA或圖1(SEQ ID NO:1)所示核苷酸序列)。當然，只與聚A序列(例如圖1(SEQ ID NO:1)所示KDI cDNA的3’末端聚(A)段序列)或T(或U)殘基的互補序列雜交的多核苷酸不包括在本發(fā)明用于雜交本發(fā)明一部分核酸的多核苷酸內(nèi)，因為這種多核苷酸將與含有聚(A)序列或其互補序列的任何核酸分子(例如實際上任何雙鏈cDNA克隆)雜交。
在特異的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸長度小于100000kb,50000kb,10000kb,1000kb,500kb,400kb,350kb,300kb,250kb,200kb,175kb,150kb,125kb,100kb,75kb,50kb,40kb,30kb,25kb,20kb,15kb,7.5kb，或5kb。
本發(fā)明編碼KDI多肽的核酸分子可包括但非限于那些通過自身編碼完整多肽的氨基酸序列的核酸，及完整多肽的編碼序列及其它序列，如那些編碼加入的前導分泌序列如前蛋白，蛋白原或前蛋白原序列的序列。
本發(fā)明核酸還編碼具有額外的，非編碼序列的上述蛋白質(zhì)序列，例如包括但非限于內(nèi)含子和非編碼5’和3’序列，如轉(zhuǎn)錄的，未翻譯的在轉(zhuǎn)錄，mRNA加工，包括剪接和聚腺苷酸化信號，例如核糖體結(jié)合和mRNA的穩(wěn)定性中起作用的序列；編碼額外氨基酸如那些提供其它功能的氨基酸的額外編碼序列。
因此，編碼多肽的序列可與標記序列，如編碼促進融合多肽純化的肽的序列融合。在本發(fā)明此方面的某些優(yōu)選實施方案中，標記氨基酸序列是6-組氨酸肽，如pQE載體中提供的標記(QIAGEN,Inc.9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA,91311)，其中許多可商購。如Gentz等在Proc.Natl.Acad.Sci USA 86:821-824(1989)中所述，6-組氨酸使融合蛋白便于純化?！癏A”標記是用于純化的另一種肽，其相當于衍生自流感血凝素蛋白的表位，這已由Wilson等，細胞37:767(1984)中所述。如下所述，其它這種融合蛋白包括在N-或C-末端融合Fc的KDI。變體和突變的多核苷酸本發(fā)明還涉及本發(fā)明核酸分子的變體，其編碼KDI蛋白質(zhì)的一部分，類似物或衍生物。變體可天然發(fā)生如天然等位基因變體?！暗任换蜃凅w”是指占據(jù)機體染色體上一基因座的基因的幾個變化形式之一。參見，基因Ⅱ,Lewin,B.,ed.,John Wiley & Sons，紐約(1985)。非天然發(fā)生的變體可用本領域已知誘變技術產(chǎn)生。
這種變體包括通過核苷酸取代，缺失或加入產(chǎn)生的那些變體。取代，缺失或加入可包括一或多個核苷酸。變體可以在編碼區(qū)，非編碼區(qū)或二區(qū)均有改變。在編碼區(qū)內(nèi)改變可產(chǎn)生保守或非保守氨基酸取代、缺失或加入。其中特別優(yōu)選的是沉默取代，加入和缺失，其不改變KDI蛋白或其部分的性質(zhì)和活性。保守取代也是特別優(yōu)選的。
其它實施方案包括一分離的核酸分子，其包括具有至少90％,優(yōu)選至少95％,96％,97％,98％或99％相同于選自以下一組的多核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼具有SEQ ID NO:2中完整氨基酸序列的KDI多肽的核苷酸序列；(b)編碼具有除N-末端甲硫氨酸之外，SEQ ID NO:2完整氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的2-161殘基)的KDI多肽的核苷酸序列；(c)編碼具有SEQ ID NO:2的28～207位殘基所示序列的成熟KDI多肽的核苷酸序列；(d)編碼SEQ ID NO:2的165～183位殘基的核苷酸序列；(e)編碼由包含在克隆HKAPI15中人cDNA編碼的完整氨基酸序列的核苷酸序列；(f)編碼由包含在克隆HKAPI15中人cDNA編碼的除N-末端甲硫氨酸外完整氨基酸序列的核苷酸序列；(g)編碼由包含在克隆HKAPI15中人cDNA編碼的成熟多肽的氨基酸序列的核苷酸序列；和(h)互補于以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)和(h)的任何核苷酸序列的核苷酸序列。
本發(fā)明的其它實施方案包括分離的核酸分子，其包括具有至少90％，優(yōu)選至少95％,96％,97％,98％或99％相同于以上(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)或(h)中任何核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或在嚴格雜交條件下與以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)中的多核苷酸雜交的多核苷酸。雜交的多核苷酸在嚴格雜交條件下，與具有只由A或T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸不雜交。本發(fā)明其它核酸實施方案涉及一分離的核酸分子，其包括編碼具有以上(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中氨基酸序列的KDI多肽的攜帶表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明分離的核酸分子的重組載體，含有重組載體的宿主細胞，生產(chǎn)這種載體和宿主細胞的方法，及利用它們通過重組技術生產(chǎn)KDI多肽或肽的方法。
具有至少例如95％“相同于”編碼KDI多肽的相關核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸是指除了此多核苷酸序列在編碼KDI多肽的相關核苷酸序列的每100個核苷酸中包括至多5個點突變外，此多核苷酸的核苷酸序列相同于相關序列。換言之，為獲得具有至少95％相同于相關核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，相關核苷酸序列中至多5％的核苷酸可以缺失或用其它核苷酸取代，或占相關序列中全部核苷酸數(shù)的5％的核苷酸可以插入相關序列中。相關序列的這些突變可發(fā)生在相關核苷序列的5’或3’末端位置，或發(fā)生于末端位置之間的任何地方，獨立散在相關序列的核苷酸之間或在相關序列內(nèi)一或多個連續(xù)基組中。
事實上，任何特定的核酸分子是否至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于圖1所示核苷酸序列或保藏的cDNA克隆的核苷酸序列，可常規(guī)使用已知計算機程序如Bestfit程序(WisconsinSequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics ComputerGroup,University Research Park,575 Science Drive,Madison,WI 53711)進行測定。Bestfit利用Smith和Waterman的局部同源性算法以發(fā)現(xiàn)二個序列間的最佳同源區(qū)段(Advances in Applied Mathematics2:482-489(1981))。當使用Bestfit或任何其它序列對比程序以測定一特殊序列是否例如95％相同于根據(jù)本發(fā)明的相關序列時，要設立參數(shù)，從而可以在全長相關核苷酸序列之上計算相同性百分率，并且允許相關序列中至多全部核苷酸數(shù)5％的同源性缺口。測定查詢序列〔本發(fā)明的序列〕和樣本序列之間最佳完全匹配，也稱作總體序列對比的一種優(yōu)選方法，可用基本上如Brutlag等的公式的FASTDB計算機程序測定〔Comp.App.Biosci.(1990)6:237-245〕。在一序列對比中，查詢和樣本序列均是DNA序列。RNA序列可通過U轉(zhuǎn)變?yōu)門加以對比。所述總體序列對比結(jié)果以相同性百分率表示。用于DNA序列的FASTDB序列對比以計算百分率的優(yōu)選參數(shù)是Matrix=Unitary,k-tuple=4,Mismatch Penalty=1,Joining Penalty=30,Randomization Group Length=0,Cutoff Score=l,Gap Penalty=5,GapSize Penalty=0.05,Window Size=500，或樣本核苷酸序列的長度，取兩者較短的。
如果樣本序列因為5’或3’缺失而非因為內(nèi)在缺失而比查詢序列短，必須對結(jié)果進行手工校正。這是因為FASTDB程序當計算相同性百分率時未考慮到樣本序列5’和3’的截短。對相對于查詢序列在5’或3’末端截短的樣本序列而言，相同性百分率通過計算樣本序列5’和3’端的未匹配/對比的查詢序列的堿基數(shù)占查詢序列總堿基數(shù)的百分率加以校正。核苷酸是否匹配/對比可通過FASTDB序列對比結(jié)果確定。然后將此百分數(shù)從通過用特殊參數(shù)經(jīng)FASTDB程序計算的相同性百分率中減去，以得到最終相同性百分率。此校正結(jié)果用于本發(fā)明。只計算通過FASTDB序列對比展示的不與查詢序列匹配/對比的在樣本序列5’和3’堿基之外的堿基以用于人為調(diào)節(jié)相同性百分率。
例如，90個堿基的樣本序列與100個堿基的查詢序列相對比測定相同性百分率。缺失發(fā)生在樣本序列的5’端，因而FASTDB序列對比不能示出5’端頭10個堿基的匹配/對比。此10個未配對的堿基代表序列的10％(在5’和3’端未匹配的堿基數(shù)/查詢序列中堿基總數(shù))，所以此10％從經(jīng)FASTDB程序計算的相同性百分率中減去。如果所剩90個堿基完全匹配則最終相同性百分率為90％。在另一實施例中，一90個堿基的樣本序列與100個堿基的查詢序列相對比。這次缺失是內(nèi)部缺失，所以在樣本序列的5’或3’末端沒有不與查詢序列匹配/對比的堿基。在經(jīng)情況中經(jīng)FASTDB計算的相同性百分率不用手工校正。同樣，樣本序列只有5’和3’堿基不與查詢序列匹配/對比時，要手工校正。本發(fā)明不需要進行其它手工校正。
本發(fā)明涉及至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于圖1(SEQ ID NO:1)所示核酸序列的或保藏的DNA的核酸序列的核酸分子，不管它們是否編碼具有KDI活性的多肽。這是因為即使特殊的核酸分子不編碼具有KDI活性的多肽，本領域技術人員仍知怎樣用該核酸分子作為例如雜交探針或聚合酶鏈反應(PCR)引物。本發(fā)明使用的不編碼具有KDI活性多肽的核酸分子特別包括cDNA文庫中分離的等位基因變體。
然而優(yōu)選的是具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于圖1(SEQ ID NO:1)所示核酸序列或保藏的DNA的核酸序列的序列的核酸分子，且該分子編碼具有KDI蛋白質(zhì)活性的多肽。“具有KDI活性的多肽”是指在特定生物學分析中，活性類似于但非必須相同于本發(fā)明KDI蛋白活性的多肽。例如本發(fā)明的KDI蛋白質(zhì)抑制體外骨髓集落形成并可根據(jù)Tiefenthaler M.等的方法(Interferon Cytokine Res,1997,Jun；17(6):327-329，全文并入?yún)⒖?分析。另外，根據(jù)由Mire-Sluis A.R.等報道的分析法(免疫學方法雜志1996.4.9；195(1-2):55-61，并入?yún)⒖?，KDI可抑制GM-CSF誘導的紅白血病細胞系TF-1的增殖?；蛘撸ㄟ^本領域已知的一些分析方法，例如由Sugiyama,K等報道的分析法(YakugakuZasshi 1995 5；115(5):390-393)可分析KDI經(jīng)典抗病毒活性。
在上述分析中，本發(fā)明的KDI蛋白抑制骨髓增殖并示出劑量依賴方式抗病毒活性。因此，“具有KDI蛋白活性的多肽”包括在上述分析中也呈劑量依賴方式相同活性的多肽。盡管劑量依賴活性程度不需相同于KDI蛋白的劑量依賴程度，但優(yōu)選地，“具有KDI蛋白活性的多肽”與KDI蛋白相比給定活性呈基本相似劑量依賴性(即候選多肽將比相關KDI蛋白呈較高活性或其活性降低不超過大約25倍且優(yōu)選不超過10倍)。
當然，由于遺傳密碼的簡并，本領域技術人員將立即意識到大量具有至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于保藏的cDNA的核酸序列或圖1(SEQ ID NO:1)所示核酸序列的序列的核酸分子將編碼“具有KDI蛋白活性”的多肽。事實上，由于這些核苷酸序列的簡并變體都編碼相同多肽，即使不進行上述對比分析，本領域技術人員也知此結(jié)果。本領域技術人員另外還知曉有適量不是簡并變體的這種核酸分子也編碼具有KDI蛋白活性的多肽。這是因為本領域技術人員充分知道有的氨基酸取代較少或不明顯影響蛋白質(zhì)功能(例如用另一個脂族氨基酸置換一個脂族氨基酸)。載體和宿主細胞本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明分離的DNA分子的載體，用重組載體遺傳工程化的宿主細胞，及通過重組技術生產(chǎn)KDI多肽或其片段。載體例如可以是噬菌體，質(zhì)粒，病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒可以是可復制型載體或復制缺陷型載體。在后種情況下，病毒增殖通常只在互補宿主細胞中發(fā)生。
此多核苷酸可與含選擇標志的載體連接以在宿主中增殖。一般地，質(zhì)粒載體以沉淀物如磷酸鈣沉淀物或與荷電脂質(zhì)復合導入。如果載體是病毒，其可用適當包裝細胞系在體外包裝，然后轉(zhuǎn)導入宿主細胞中。
DNA插入片段應有效地與適當啟動子連接，如λ噬菌體PL啟動子，E.coli lac,trp,phoA和tac啟動子，SV40早期和晚期啟動子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs的啟動子。技術人員還知其它適當啟動子。表達構建體還包括轉(zhuǎn)錄起始位點，終止位點及在轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)的翻譯核糖體結(jié)合位點。由構建體表達的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分優(yōu)選包括恰當?shù)匚挥诒环g的多肽起始端的翻譯起始密碼子和多肽末端合適位置的終止密碼子(UAA,UGA或UAG)。
表達載體優(yōu)選包括至少一個選擇標記。這種標記包括對于真核細胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶，G418或新霉素抗性，對于E.coli和其它細菌培養(yǎng)物的四環(huán)素，卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。適當?shù)乃拗鞯拇硇詫嵗ǖ窍抻诩毦毎鏓.coli，鏈霉菌和鼠傷寒沙門氏菌細胞；真菌細胞如酵母細胞；昆蟲細胞如果蠅S2和Spodoptera St9細胞；動物細胞如CHO,COS,293和Bowes黑素瘤細胞；及植物細胞。本領域已知上述宿主細胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
優(yōu)選的細菌載體包括購自QIAGEN公司的pQE70,pQE60和pQE09；購自Stratagene的PBS載體，Phagescript載體，Bluescript載體，pNH8A,pNH16a,pNH18A,pNH46A；和購自Pharmacia的ptrc99a,pKK223-3,pKK233-3,pDR540,pRIT5。優(yōu)選的真核載體是購自Stratagene的pWLNEO,pSV2CAT,pOG44,pXT1和pSG；及購自Pharmacia的pSVK3,pBPV,pMSG和pSVL。本領域技術人員也知其它適當載體。
構建體導入宿主細胞可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染，陽離子脂質(zhì)介導的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導，感染或其它方法進行。這些方法在許多標準實驗手冊中均有闡述，如Davis等，分子生物學基本方法(1986)。
多肽可以修飾形式表達，如融合蛋白，且不僅可包括分泌信號，也可包括其它異源功能區(qū)。例如，額外氨基酸尤其荷電氨基酸區(qū)可加入多肽的N末端，以改良其在純化或隨后的操作和貯存期間在宿主細胞中的穩(wěn)定性及持續(xù)性。肽基序也可加入多肽中以促進純化。這個區(qū)域可在最后制備多肽之前除去。將肽基序加入多肽以實現(xiàn)分泌或排泄，改良穩(wěn)定性及促進純化等，是本領域熟知且常規(guī)技術。一優(yōu)選的融合蛋白包括來自免疫球蛋白的異源區(qū)，其用于穩(wěn)定和純化蛋白質(zhì)。例如，EP-A-0 464 533(加拿大相應專利2045869)揭示了包括各種免疫球蛋白C區(qū)部分與人體蛋白或其部分的融合蛋白。在許多情況中，融合蛋白的Fc部分用于診斷和治療是非常有利的，因此例如產(chǎn)生改良的藥物動力學性質(zhì)(EP-A023262)。另一方面，在融合蛋白在以上述有利方式表達，檢測及純化后，對于某些應用需缺失Fc部分，這是在當Fc部分證實妨礙診斷和治療時，例如融合蛋白被用作免疫反應的抗原時的情況中。在藥物開發(fā)方面，人體蛋白例如hIL-5已經(jīng)與Fc部分融合以通過高通量篩選分析鑒別hIL-5的拮抗劑。參見D.Bennett等，分子識別雜志8:52-58(1995)和K.Johanson等。生物化學雜志270:9459-9471(1995)。
KDI蛋白通知熟知方法包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陽離子或陰離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水作用層析，親和層析，羥磷灰石層析和凝集素層析可從重組細胞培養(yǎng)物中回收并純化。更優(yōu)選地用高效液相層析(HPLC)進行純化。本發(fā)明的多肽包括純化自天然來源包括體液，組織和細胞的產(chǎn)物，其可以是直接分離的或是培養(yǎng)；及通過重組技術產(chǎn)自原核或真核宿主如細菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細胞的產(chǎn)物。根據(jù)用于重組生產(chǎn)過程的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。另外，本發(fā)明的多肽也可包括起始的修飾的甲硫氨酸殘基。因此，本領域熟知由翻譯起始密碼子編碼的N-末端甲硫氨酸一般在所有真核細胞中翻譯之后，高效地從任何蛋白質(zhì)中除去。盡管大多數(shù)蛋白質(zhì)上的N-末端甲硫氨酸也能有效地在大多數(shù)原核細胞中除去，但根據(jù)N-末端甲硫氨酸共價鍵連的氨基酸的性質(zhì)，對一些蛋白質(zhì)而言此原核細胞除去過程是無效的。多肽和片段本發(fā)明還提供了具有由保藏的DNA編碼的氨基酸序列，或SEQID NO:2中氨基酸序列的分離的KDI多肽，或含有上述多肽一部分的肽或多肽。變體和突變多肽為改良或改變KDI多肽的特性，可應用蛋白質(zhì)工程。本領域技術人員已知的重組DNA技術可用于產(chǎn)生新的突變體蛋白或“突變蛋白”，包括單或多個氨基酸取代，缺失，加入或融合蛋白。這種修飾的蛋白可示出例如增強的活性或提高的穩(wěn)定性。另外，它們可以高產(chǎn)量純化并比相應的天然多肽至少在一定純化和貯存條件下呈現(xiàn)更好的溶解性。N-末端和C-末端缺失突變體例如，對一些蛋白質(zhì)包括膜相關蛋白的胞外區(qū)或分泌蛋白的成熟形式而言，本領域已知一或多個氨基酸可從N-末端或C-末端缺失而基本不喪失生物功能。例如，Ron等在生物化學雜志268:2984～2988(1993)報道了修飾的KGF蛋白即使缺失3,8或27個氨基末端的氨基酸殘基，仍具有肝素結(jié)合活性。在本文中，由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)是干擾素多肽家族成員，SEQ ID NO:2N末端氨基酸直至SEQ ID NO:2所示59位半胱氨酸的缺失仍可保留一些生物活性如抗病毒活性或抑制骨髓增殖。具有包括SEQ ID NO:2中Cys-59殘基的進一步N末端缺失的多肽不能保留這種生物功能，因為干擾素相關多肽中的此殘基在一些(非全部)家族成員中是保守的，緊鄰其的亮氨酸殘基(60位殘基)也是如此。在59位的半胱氨酸殘基被認為是形成二硫鍵之所需，以保證為受體結(jié)合及信號轉(zhuǎn)導之所需的結(jié)構穩(wěn)定性。
然而，即使一或多個氨基酸從蛋白質(zhì)N末端缺失導致蛋白質(zhì)一或多種生物功能喪失變化，其它生物活性仍可保留。因此，縮短的蛋白質(zhì)誘導和/或結(jié)合識別完整蛋白質(zhì)的抗體的能力，當少于半數(shù)的完整蛋白質(zhì)殘基從N末端除去時一般仍被保留。缺失完整蛋白質(zhì)N末端殘基的特定多肽是否保留這種免疫活性可通過本文所述常規(guī)方法及本領域已知其它方法測定。
因此本發(fā)明還提供了具有一或多個缺失自SEQ ID NO:2所示KDI氨基酸序列氨基末端直至Cys-59的殘基的多肽，及編碼這種多肽的多核苷酸。本發(fā)明尤其提供了包括SEQ ID NO:2的n-207位殘基的氨基酸序列的多肽，其中n是1～59范圍內(nèi)的整數(shù)，且Cys-59是確信為KDI蛋白活性所需的起自完整KDI多肽(如SEQ ID NO:2所示)N-末端的第一位殘基。
本發(fā)明尤其提供了具有SEQ ID NO:2的如下殘基的氨基酸序列的多肽1～207,2～207,3～207,4～207,5～207,6～207,7～207,8～207,9～207,10～207,11～207,12～207,13～207,14～207,15～207,16～207,17～207,18～207,19～207,20～207,21～207,22～207,23～207,24～207,25～207,26～207,27～207,28～207,29～207,30～207,31～207,32～207,33～207,34～207,35～207,36～207,37～207,38～207,39～207,40～207,41～207,42～207,43～207,44～207,45～207,46～207,47～207,48～207,49～207,50～207,51～207,52～207,53～207,54～207,55～207,56～207,57～207,58～207和59～207，也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
相似地，已知許多C末端缺失突變蛋白的生物功能的實例。例如，γ-干擾素通過缺失蛋白質(zhì)羧基末端8～10個氨基酸殘基呈現(xiàn)活性提高接近10倍(Dobeli等，生物技術學雜志7:199-216(1988))。在本發(fā)明中，由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)是干擾素多肽家族成員，SEQ IDNO:2的C末端氨基酸直至183位的色氨酸殘基缺失仍可保留一些生物活性如抗病毒活性或抑制骨髓增殖。具有包括SEQ ID NO:2的Ile-183的進一步C-末端缺失的多肽呈現(xiàn)不能保留這種生物活性，因為已知干擾素相關多肽中此殘基在許多成員中是保守的，且被認為對受體結(jié)合和信號轉(zhuǎn)導是重要的。另外，在181位半胱氨酸是高保守的且已知是干擾素家族成員抗病毒活性所需的。
然而，即使蛋白質(zhì)C末端的一或多個氨基酸缺失導致一或多種生物活性喪失，但仍可保留其它生物活性。因此縮短的蛋白質(zhì)誘導和/或結(jié)合識別完整蛋白質(zhì)的抗體的能力。當少于半數(shù)的完整蛋白質(zhì)的殘基從C末端除去時一般被保留。缺失完整蛋白質(zhì)C末端殘基的特定多肽是否保留這種免疫活性通過本文所述常規(guī)方法及本領域已知其它方法可易于測定。
因此本發(fā)明還提供了具有缺失自SEQ ID NO:2所示KDI氨基酸序列的羧基末端直至Trp-183的一或多個氨基酸的多肽及編碼這種多肽的多核苷酸。尤其地本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO:2氨基酸序列1～m殘基的氨基酸序列的多肽，其中m是183～207范圍內(nèi)的任何整數(shù)，且殘基Trp-183是確信為KDI蛋白活性所需的完整KDI多肽(如SEQ ID NO:2所示)C末端的第一個殘基位。
更為具體地，本發(fā)明提供了具有SEQ ID NO:2的以下殘基的氨基酸序列的多肽1-183,1-184,1-185,1-186,1-187,1-188,1-189,1-190,1-191,1-192,1-193,1-194,1-195,1-196,1-197,1-198,1-199,1-200,1-201,1-202,1-203,1-204,1-205,1-206和1-207。還提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了具有一或多個缺失自氨基和羧基末端的氨基酸的多肽，其通常被描述為具有SEQ ID NO:2的n-m殘基，其中n和m是如上所述的整數(shù)。另外，本發(fā)明提供了任選地具有N末端甲硫氨酸的這些突變體多肽。此多肽因而也可用公式X-n-m代表，其中X是NH2或Met,n和m是如上述的整數(shù)。當然也提供了編碼這些多肽的多核苷酸。
更為具體地，本發(fā)明優(yōu)選提供了具有SEQ ID NO:2的以下殘基的氨基酸序列的多肽20-183,21-183,22-183,23-183,24-183,25-183,26-183,27-183,28-183,29-183,30-183,31-183,32-183,33-183,34-183,35-183,36-183,37-183,38-183,39-183,40-183,41-183,42-183,43-183,44-183,45-183,46-183,47-183,48-183,49-183,50-183,51-183,52-183,53-183,54-183,55-183,56-183,57-183,58-183,59-183,20-184,21-184,22-184,23-184,24-184,25-184,26-184,27-184,28-184,29-184,30-184,31-184,32-184,33-184,34-184,35-184,36-184,37-184,38-184,39-184,40-184,41-184,42-184,43-184,44-184,45-184,46-184,47-184,48-184,49-184,50-184,51-184,52-184,53-184,54-184,55-184,56-184,57-184,58-184,59-184,20-185,21-185,22-185,23-185,24-185,25-185,26-185,27-185,28-185,29-185,30-185,31-185,32-185,33-185,34-185,35-185,36-185,37-185,38-185,39-185,40-185,41-185,42-185,43-185,44-185,45-185,46-185,47-185,48-185,49-185,50-185,51-185,52-185,53-185,54-185,55-185,56-185,57-185,58-185,59-185,20-186,21-186,22-186,23-186,24-186,25-186,26-186,27-186,28-186,29-186,30-186,31-186,32-186,33-186,34-186,35-186,36-186,37-186,38-186,39-186,40-186,41-186,42-186,43-186,44-186,45-186,46-186,47-186,48-186,49-186,50-186,51-186,52-186,53-186,54-186,55-186,56-186,57-186,58-186,59-186,20-187,21-187,22-187,23-187,24-187,25-187,26-187,27-187,28-187,29-187,30-187,31-187,32-187,33-187,34-187,35-187,36-187,37-187,38-187,39-187,40-187,41-187,42-187,43-187,44-187,45-187,46-187,47-187,48-187,49-187,50-187,51-187,52-187,53-187,54-187,55-187,56-187,57-187,58-187,59-187,20-188,21-188,22-188,23-188,24-188,25-188,26-188,27-188,28-188,29-188,30-188,31-188,32-188,33-188,34-188,35-188,36-188,37-188,38-188,39-188,40-188,41-188,42-188,43-188,44-188,45-188 46-188,47-188,48-188,49-188,50-188,51-188,52-188,53-188,54-188,55-188,56-188,57-188,58-188,59-188,20-189,21-189,22-189,23-189,24-189,25-189,26-189,27-189,28-189,29-189,30-189,31-189,32-189,33-189,34-189,35-189,36-189,37-189,38-189,39-189,40-189,41-189,42-189,43-189,44-189,45-189,46-189,47-189,48-189,49-189,50-189,51-189,52-189,53-189,54-189,55-189,56-189,57-189,58-189,59-189,20-190,21-190,22-190,23-190,24-190,25-190,26-190,27-190,28-190,29-190,30-190,31-190,32-190,33-190,34-190,35-190,36-190,37-190,38-190,39-190,40-190,41-190,42-190,43-190,44-190,45-190,46-190,47-190,48-190,49-190,50-190,51-190,52-190,53-190,54-190,55-190,56-190,57-190,58-190,59-190,20-191,21-191,22-191,23-191,24-191,25-191,26-191,27-191,28-191,29-191,30-191,31-191,32-191,33-191,34-191,35-191,36-191,37-191,38-191,39-191,40-191,41-191,42-191,43-191,44-191,45-191,46-191,47-191,48-191,49-191,50-191,51-191,52-191,53-191,54-191,55-191,56-191,57-191,58-191,59-191,20-192,21-192,22-192,23-192,24-192,25-192,26-192,27-192,28-192,29-192,30-192,31-192,32-192,33-192,34-192,35-192,36-192,37-192,38-192,39-192,40-192,41-192,42-192,43-192,44-192,45-192,46-192,47-192,48-192,49-192,50-192,51-192,52-192,53-192,54-192,55-192,56-192,57-192,58-192,59-192,20-193,21-193,22-193,23-193,24-193,25-193,26-193,27-193,28-193,29-193,30-193,31-193,32-193,33-193,34-193,35-193,36-193,37-193,38-193,39-193,40-193,41-193,42-193,43-193,44-193,45-193,46-193,47-193,48-193,49-193,50-193,51-193,52-193,53-193,54-193,55-193,56-193,57-193,58-193,59-193,20-194,21-194,22-194,23-194,24-194,25-194,26-194,27-194,28-194,29-194,30-194,31-194,32-194,33-194,34-194,35-194,36-194,37-194,38-194,39-194,40-194,41-194,42-194,43-194,44-194,45-194,46-194,47-194,48-194,49-194,50-194,51-194,52-194,53-194,54-194,55-194,56-194,57-194,58-194,59-194,20-195,21-195,22-195,23-195,24-195,25-195,26-195,27-195,28-195,29-195,30-195,31-195,32-195,33-195,34-195,35-195,36-195,37-195,38-195,39-195,40-195,41-195,42-195,43-195,44-195,45-195,46-195,47-195,48-195,49-195,50-195,51-195,52-195,53-195,54-195,55-195,56-195,57-195,58-195,59-195,20-196,21-196,22-196,23-196,24-196,25-196,26-196,27-196,28-196,29-196,30-196,31-196,32-196,33-196,34-196,35-196,36-196,37-196,38-196,39-196,40-196,41-196,42-196,43-196,44-196,45-196,46-196,47-196,48-196,49-196,50-196,51-196,52-196,53-196,54-196,55-196,56-196,57-196,58-196,59-196,20-197,21-197,22-197,23-197,24-197,25-197,26-197,27-197,28-197,29-197,30-197,31-197,32-197,33-197,34-197,35-197,36-197,37-197,38-197,39-197,40-197,41-197,42-197,43-197,44-197,45-197,46-197,47-197,48-197,49-197,50-197,51-197,52-197,53-197,54-197,55-197,56-197,57-197,58-197,59-197,20-198,21-198,22-198,23-198,24-198,25-198,26-198,27-198,28-198,29-198,30-198,31-198,32-198,33-198,34-198,35-198,36-198,37-198,38-198,39-198,40-198,41-198,42-198,43-198,44-198,45-198,46-198,47-198,48-198,49-198,50-198,51-198,52-198,53-198,54-198,55-198,56-198,57-198,58-198,59-198,20-199,21-199,22-199,23-199,24-199,25-199,26-199,27-199,28-199,29-199,30-199,31-199,32-199,33-199,34-199,35-199,36-199,37-199,38-199,39-199,40-199,41-199,42-199,43-199,44-199,45-199,46-199,47-199,48-199,49-199,50-199,51-199,52-199,53-199,54-199,55-199,56-199,57-199,58-199,59-199,20-200,21-200,22-200,23-200,24-200,25-200,26-200,27-200,28-200,29-200,30-200,31-200,32-200,33-200,34-200,35-200,36-200,37-200,38-200,39-200,40-200,41-200,42-200,43-200,44-200,45-200,46-200,47-200,48-200,49-200,50-200,51-200,52-200,53-200,54-200,55-200,56-200,57-200,58-200,59-200,20-201,21-201,22-201,23-201,24-201,25-201,26-201,27-201,28-201,29-201,30-201,31-201,32-201,33-201,34-201,35-201,36-201,37-201,38-201,39-201,40-201,41-201,42-201,43-201,44-201,45-201,46-201,47-201,48-201,49-201,50-201,51-201,52-201,53-201,54-201,55-201,56-201,57-201,58-201,59-201,20-202,21-202,22-202,23-202,24-202,25-202,26-202,27-202,28-202,29-202,30-202,31-202,32-202,33-202,34-202,35-202,36-202,37-202,38-202,39-202,40-202,41-202,42-202,43-202,44-202,45-202,46-202,47-202,48-202,49-202,50-202,51-202,52-202,53-202,54-202,55-202,56-202,57-202,58-202,59-202,20-203,21-203,22-203,23-203,24-203,25-203,26-203,27-203,28-203,29-203,30-203,31-203,32-203,33-203,34-203,35-203,36-203,37-203,38-203,39-203,40-203,41-203,42-203,43-203,44-203,45-203,46-203,47-203,48-203,49-203,50-203,51-203,52-203,53-203,54-203,55-203,56-203,57-203,58-203,59-203,20-204,21-204,22-204,23-204,24-204,25-204,26-204,27-204,28-204,29-204,30-204,31-204,32-204,33-204,34-204,35-204,36-204,37-204,38-204,39-204,40-204,41-204,42-204,43-204,44-204,45-204,46-204,47-204,48-204,49-204,50-204,51-204,52-204,53-204,54-204,55-204,56-204,57-204,58-204,59-204,20-205,21-205,22-205,23-205,24-205,25-205,26-205,27-205,28-205,29-205,30-205,31-205,32-205,33-205,34-205,35-205,36-205,37-205,38-205,39-205,40-205,41-205,42-205,43-205,44-205,45-205,46-205,47-205,48-205,49-205,50-205,51-205,52-205,53-205,54-205,55-205,56-205,57-205,58-205,59-205,20-206,21-206,22-206,23-206,24-206,25-206,26-206,27-206,28-206,29-206,30-206,31-206,32-206,33-206,34-206,35-206,36-206,37-206,38-206,39-206,40-206,41-206,42-206,43-206,44-206,45-206,46-206,47-206,48-206,49-206,50-206,51-206,52-206,53-206,54-206,55-206,56-206,57-206,58-206和59-206
前述每個多肽可另外包括N-末端甲硫氨酸殘基。也提供了編碼每個具有或不具有N-末端甲硫氨酸殘基的這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明還包括由克隆HKAPI15中人cDNA編碼的完整KDI氨基酸序列的一部分組成的多肽，其中此部分不包括克隆HKAPI15中人cDNA編碼的完整氨基酸序列氨基末端1～大約58位氨基酸，或羧基末端1～大約23位氨基酸，或克隆HKAPI15中人cDNA編碼的完整氨基酸序列的上述氨基酸末端和羧基末端缺失的任何組合。本發(fā)明還提供了編碼所有上述缺失突變體多肽的多核苷酸。其他突變體除上述蛋白質(zhì)末端缺失形式之外，本領域技術也將意識到KDI多肽的一些氨基酸序列可不明顯影響蛋白質(zhì)結(jié)構或功能而加以改變。如果涉及這種序列中的差異，應記得在蛋白質(zhì)上有確定活性的關鍵區(qū)。
因此，本發(fā)明還包括KDI多肽的變體，其呈現(xiàn)KDI多肽的活性，或其包括KDI蛋白質(zhì)的如下所述部分的區(qū)域。這種突變體包括缺失，插入，倒位，重復及根據(jù)本領域已知一般規(guī)則選擇的取代類型，對活性只有輕微影響。例如，Bowie,J.V.等在“譯解蛋白質(zhì)序列中信息對氨基酸取代的耐受性”，科學247:1306-1310(1990)中提供了關于怎樣產(chǎn)生表型沉默氨基酸取代的指導，其中作者指明有兩種主要方法研究氨基酸序列對改變的耐受性。第一種方法依賴于進化過程，其中通過自然選擇接納或排斥突變。第二種方法用遺傳工程在克隆的基因的特殊位置進行氨基酸調(diào)換，并進行選擇或篩選以鑒別保留功能的序列。
如作者所述，這些研究揭示蛋白質(zhì)對氨基酸取代非常耐受。作者還指明氨基酸調(diào)換似乎在蛋白質(zhì)的一定位置是允許的。例如，大多數(shù)隱蔽的氨基酸殘基要求非極性側(cè)鏈，而表面?zhèn)孺湹奶卣饕话愫苌偈潜Ｊ氐摹Ｆ渌@種表型沉默取代見于Bowie,J.U.等所述，并在此并入?yún)⒖肌５湫偷谋Ｊ厝〈侵咀灏被酇la,Val,Leu和Ile之間的彼此置換；羥基殘基Ser和Thr的互換，酸性殘基Asp和Glu的置換，酰胺殘基Asn和Gln間的取代，堿性殘基Lys和Arg的置換，及芳香族殘基Phe,Tyr間的置換。
因此，SEQ ID NO:2的多肽或由保藏的cDNA編碼的多肽的類似物或衍生物或片段可以是(ⅰ)其中一或多個氨基酸殘基是用保守或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)取代的，且這種取代的氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的，或(ⅱ)其中一或多個氨基酸殘基包括取代基團，或(ⅲ)其中KDI多肽是與其它化合物如提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)融合的，或(ⅳ)其中額外氨基酸與以上形式的多肽融合的，如IgG Fc融合區(qū)肽或前導或分泌序列或用于純化以上形式多肽的序列或蛋白原序列。這種片段，衍生物及類似物根據(jù)本文教導被本領域技術人員認為包括在本發(fā)明內(nèi)。
因此，本發(fā)明的多肽可以包括通過自然突變或人為操作的一或多個氨基酸取代，缺失或加入。如上所述，氨基酸改變優(yōu)選是較小的，如不明顯影響蛋白質(zhì)折疊或活性的保守氨基酸取代。
本發(fā)明KDI蛋白質(zhì)中為功能所必需的氨基酸可以通過本領域已知方法鑒別，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham和Wells，科學244:1081～1085(1989)。后一種方法在分子中的每個殘基引入單丙氨酸突變。然后測試所得突變體分子的生物活性，如受體結(jié)合或體外增殖活性。
特別感興趣的是用可生產(chǎn)具有所需明顯改良特性如較少聚集性的其它極性或中性氨基酸取代極性氨基酸。聚集在制備藥物配方時不僅降低活性還會產(chǎn)生問題，因為聚集物可以是免疫原性的。(Pinckard等，Clin.Exp.Immunol,2:331-340(1967)；Robbins等，Diabetes 36:838-845(1987)；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier Systems 10:307-377(1993)。
氨基酸的置換也可改變配體對細胞表面受體結(jié)合的選擇性。例如，Ostade等在自然361:266-268(1993)中闡述了導致TNF-α僅與兩種已知TNF受體之一選擇性結(jié)合的一些突變。配體-受體結(jié)合的臨界位點也可通過結(jié)構分析確定，如結(jié)晶，核磁共振或光親和標記。(Smith等，分子生物學雜志224:899-904(1992)及Vos等，科學255:306-312(1992))。
本文所述的每個KDI多肽的特別優(yōu)選的取代是在192位的精氨酸殘基用賴氨酸置換(后文有時稱為“R192K”)，及在193位的半胱氨酸殘基用絲氨酸置換(后文有時稱為“C193S”)。這些取代可在單獨的KDI多肽中發(fā)現(xiàn)，或者它們可在相同KDI多肽中發(fā)生。編碼所有前述KDI多肽的多核苷酸均含有取代。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選是分離形式的且優(yōu)選是基本純化的。重組產(chǎn)生的KDI多肽可以通過Smith與Johnson在基因67:31-40(1988)中所述的一步法而基本純化。本發(fā)明的多肽也可以通過本領域熟知的蛋白質(zhì)純化方法，用本發(fā)明的抗KDI抗體從天然或重組來源中純化。
本發(fā)明還提供了含有選自由以下一組組成的氨基酸序列的分離的KDI多肽(a)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列的全長KDI多肽的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO:2所示完整氨基酸序列除N-末端甲硫氨酸外的全長KDI多肽的氨基酸序列(即SEQ ID NO:2的2～207位殘基)；(c)SEQ ID NO:2所示28～207位殘基所示成熟KDI多肽的氨基酸序列；(d)SEQ ID NO:2中165～183位殘基所示氨基酸序列；(e)由克隆HKAPI15中包含的人cDNA編碼的全長KDI多肽；(f)由克隆HKAPI15中包含的人cDNA編碼的除N末端甲硫氨酸外全長KDI多肽；及(g)由克隆HKAPI15中包含的人cDNA編碼的成熟KDI多肽。
本發(fā)明的多肽還包括與上述那些多肽至少90％，優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少96％,97％,98％或99％相似的多肽。本發(fā)明的多肽還包括與由保藏的DNA編碼的多肽或SEQ ID NO:2的多肽至少80％，優(yōu)選至少90％或95％，更優(yōu)選至少96％,97％,98％或99％相同的多肽，且也包括具有這種多肽至少10,20或30個氨基酸且更優(yōu)選至少50個氨基酸的一部分。
本發(fā)明的另一實施方案涉及一種肽或多肽，其包括具有含有至少一個保守氨基酸取代，但不超過50個，優(yōu)選不超過40個，更優(yōu)選不超過30個，特別優(yōu)選不超過20個保守氨基酸取代的氨基酸序列的KDI多肽的氨基酸序列。當然，這種肽或多肽最優(yōu)選的是包括KDI多肽氨基酸序列的氨基酸序列，其含有至少一個，但不超過10,9,8,7,6,5,4,3,2或1個保守氨基酸序列。
兩種多肽的“相似百分率”是指用Bestfit程序(Wisconsin SequenceAnalysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575,Science Drive,Madison,WI 53711)及確定相似性的默認設定，對比兩種多肽的氨基酸序列產(chǎn)生的相似性值。Bestfit用Smith與Waterman的局部同源性算法(Advances inApplied Mathematics 2:482-489,1981)，以發(fā)現(xiàn)兩序列間相似的最佳區(qū)段。
具有至少例如95％“相同于”參照的IL-20多肽的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽是指除了此多肽序列在參照的IL-20多肽的氨基酸序列的每100個氨基酸中包括至多5個氨基酸改變，此多肽的氨基酸序列相同于查詢序列。換言之，為獲得具有至少95％相同于查詢氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，查詢序列中至多5％的氨基酸殘基可以缺失或用其它氨基酸取代，或占總氨基酸殘基數(shù)5％的氨基酸可插入?yún)⒄招蛄小⒄招蛄械倪@些變化可發(fā)生在參照序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置之間的任何地方，獨立散在參照序列的殘基間或在參照序列間的一或多個連續(xù)組中。
事實上，任何特殊多肽是否至少90％,95％,96％,97％,98％或99％相同于例如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或由保藏的cDNA克隆編碼的氨基酸序列，通常可用已知計算機程序如Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Prive,Madison,W153711)確定。當用Bestfit或其它序列對比程序確定一特殊序列是否例如95％相同于本發(fā)明的參照序列時，當然要設立參數(shù)，如此在全長參照序列之上計算相同性百分率，且允許參照序列中有至多占總氨基酸殘基數(shù)5％的同源缺口。一種優(yōu)選的確定查詢序列(本發(fā)明的序列)與樣本序列間最佳總體配對的方法，也稱作總體序列對比，可以用基本上如Brutlay等的算法的FASTDB計算機程序確定(Comp.App.Biosci(1990)6；237-245)。在序列對比中，查詢和樣本序列均是核苷酸序列或均是氨基酸序列。所述總體序列對比的結(jié)果以相同性百分率表示。用于FASTDB氨基酸序列對比中的優(yōu)選參數(shù)是Matrix=PAM,k-tuple=2,Mismatch Penalty=1,JoiningPenalty=20,Randomization Group Length=0,Cutoff Score=1,WindowSize=序列長，Gap Penalty=5,Gap Size Penalty=0.05,Window Size=500或樣本氨基酸序列的長度，取較短的。
如果樣本序列由于N-或C-末端缺失而不是因為內(nèi)部缺失而比查詢序列短，必須對結(jié)果進行手工校正，這是因為FASTDB程序當計算總體相同性百分率時未考慮到樣本序列N-和C-末端截短。對與查詢序列相比在N端和C端截短的樣本序列，相同性百分率通過計算樣本序列N和C-端的未匹配/對比的查詢序列殘基數(shù)占查詢序列總堿基百分率加以校正。殘基是否配對/對比通過FASTDB序列對比結(jié)果可確定。然后將此百分數(shù)從相同性百分率中減去以得到最終相同性百分率范圍，相同性百分率是用特殊參數(shù)通過以上FASTDB程序計算的。此最終相同性百分率即為本發(fā)明所用。只有未與查詢序列配對/對比的樣本序列的N和C端殘基需要人為調(diào)節(jié)相同性百分率范圍。即只有查詢殘基位在樣本序列最遠的N和C端殘基之外。
例如，90個氨基酸殘基的樣本序列與100個殘基的查詢序列對比確定相同性百分率。缺失發(fā)生在樣本序列的N端，因而FASTDB序列對比未示出N端頭10個殘基的配對/對比。這10個未配對的殘基代表序列的10％(在N和C端未配對的殘基數(shù)/查詢序列中總殘基數(shù))，因此這10％從通過FASTDB程序計算的相同性百分率中減去。如果剩余的90個殘基充分配對，則最終相同性百分率為90％。在另一實施例中，90個殘基的樣本序列與100個殘基的查詢序列相對比。這次缺失是內(nèi)部缺失，因而在樣本序列的N或C端沒有不與查詢序列配對/對比的殘基。在這種情況中，通過FASTDB計算的相同性百分率不用手工校正。同樣，只有樣本序列N和C端外側(cè)的殘基位不與查詢序列配對/對比時，通過FASTDB計算結(jié)果需要手工校正。本發(fā)明不需其它手工校正。
本發(fā)明的多肽可用本領域技術人員熟知的方法用作SDS-PAGE凝膠上或分子篩凝膠過濾柱上的分子量標記。
如下所述，本發(fā)明的多肽還可用于產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體，其用于如下所述檢測KDI蛋白質(zhì)表達的分析中，或作為能增強或抑制KDI蛋白質(zhì)功能的興奮劑與拮抗劑。另外，這種多肽可用于酵母雙重雜交系統(tǒng)以“捕捉”KDI蛋白結(jié)合蛋白，其也是根據(jù)本發(fā)明的候選興奮劑和拮抗劑。此酵母雙重雜交系統(tǒng)見于Fields和Song，自然340:245-246(1989)中所述。攜帶表位部分另一方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明多肽攜帶表位部分的肽或多肽。此多肽部分的表位是本發(fā)明多肽的免疫原性或抗原性表位。“免疫原性表位”是指當整個蛋白質(zhì)是免疫原時激發(fā)抗體應答的蛋白質(zhì)的一部分。另一方面，“抗原性表位”是指抗體能結(jié)合的蛋白質(zhì)分子的一區(qū)域。蛋白質(zhì)免疫原性表位數(shù)通常少于抗原性表位數(shù)。例如參見于Geysen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983)。
為選擇具有抗原性表位的肽或多肽(即含有蛋白質(zhì)分子的抗體能結(jié)合的區(qū)域)，本領域熟知模擬蛋白質(zhì)序列部分的相對短的合成肽通常能激發(fā)與部分模擬的蛋白質(zhì)反應的抗血清。例如見于Sutcliffe,J.G.Shinnick,T.M.,Green,N.and Learner,R.A.(1983)“與蛋白質(zhì)上預確定位點反應的抗體”，科學219:660～666。能激發(fā)蛋白質(zhì)反應性血清的肽通常以蛋白質(zhì)的一級序列代表，能通過一系列簡便化學規(guī)則定性，并被限定為既不是完整蛋白質(zhì)的免疫優(yōu)勢區(qū)(即免疫原性表位)，也不是氨基或羧基端。本發(fā)明的具有抗原性表位的肽與多肽因而用于產(chǎn)生抗體，包括與本發(fā)明多肽特異結(jié)合的單克隆抗體。例如參見Wilson等，細胞37:767-778(1984)，在777頁。
本發(fā)明的攜帶抗原性表位的肽和多肽優(yōu)選含有至少7個，更優(yōu)選至少9個，最優(yōu)選大約15～30個包含于本發(fā)明多肽的氨基酸序列中的氨基酸的序列。可用于產(chǎn)生KDI特異抗體的抗原性多肽或肽的非限制性實例包括包含SEQ ID NO:2中大約Ser49～Ser54氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Cys59～Ala65氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Pro78～Tyr88氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Hisl01～Gln113氨基酸殘基的多肽；包含SEQ IDNO:2中Glnl20～Glu123氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Cys128～Pro155氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Leu160～Arg168氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Asn171～Asp180氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Val186～Cys193氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中Phe 204～Lys207氨基酸殘基的多肽。這些多肽片段通過Jameson-Wolf抗原性指數(shù)分析已確定其攜帶KDI蛋白質(zhì)的抗原性表位，如圖3所示。
本發(fā)明的攜帶表位的肽和多肽可通過常規(guī)方式生產(chǎn)。例如見于Houghten,RA.(1985)“快速固相合成大量肽的常用方法在單獨氨基酸水平抗原-抗體相互作用的特異性”Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5131～5135；此“同時大量肽合成(SMPS)”法還見于Houghten等(1986)在美國專利No.4631211中所述。
本發(fā)明的攜帶表位的肽與多肽根據(jù)本領域熟知方法用于誘導抗體。例如見于Sutcliffe等；前述，Wilson等；前述，Chow,M等Proc.Natl.Accd.Sci.USA 82:910-914；及F.J.等，J.Gen.Virol 66:2347-2354(1985)所述。本發(fā)明的攜帶免疫原性表位的肽，即當整個蛋白質(zhì)是免疫原時，激發(fā)抗體應答的蛋白質(zhì)的那些部分，根據(jù)本領域已知方法鑒別。例如見于Geysen等所述。另外，Geysen(1990)的美國專利No.5194392闡述了一種檢測或確定是表位拓撲學等價物(即“mimotope”)的單體(氨基酸或其它化合物)序列的方法，該單體序列互補于相應抗體的特殊互補位(抗原結(jié)合位點)。Geysen(1989)的美國專利No.443092闡述了一種檢測或確定是配體拓撲等價物的單體的序列的方法，該單體序列互補于相應特定受體的配體結(jié)合位點。相似地，Houghten,R.A.等(1996)關于過烷基化的寡肽混合物的美國專利No.5480971揭示了線性C1-C7-烷基過烷基化寡肽及這種肽的系列及文庫，以及用這種寡肽系列及文庫確定優(yōu)先與相應受體分子結(jié)合的過烷基化的寡肽的序列的方法。因此，本發(fā)明攜帶表位的肽的非肽類似物也可通過這些方法常規(guī)生產(chǎn)。
融合蛋白質(zhì)本領域技術人員將懂得本發(fā)明的KDI多肽和上述其攜帶表位的片段可與免疫球蛋白(IgG)的恒定區(qū)部分組合，產(chǎn)生嵌合多肽。這些融合蛋白促進純化，并呈現(xiàn)體內(nèi)半衰期延長。例如已經(jīng)揭示由人CD4-多肽的頭兩個結(jié)構域和哺乳動物免疫球蛋白的重或輕鏈恒定區(qū)的各個結(jié)構域組成的融合蛋白(EPA394827:Traunecker等；自然331:84-86(1988))。由于IgG部分而具有二硫鍵二聚體結(jié)構的融合蛋白在結(jié)合及中和其它分子方面比單體KDI蛋白或蛋白質(zhì)片段更有效(Fountoulakis等，生物化學雜志270:3958-3964(1995))。
抗體用于本發(fā)明的KDI蛋白質(zhì)特異抗體可針對完整KDI蛋白或其抗原性多肽片段而產(chǎn)生，其可與載體蛋白如動物(如兔或鼠)的白蛋白一起呈遞，或者如果其足夠長(至少大約25個氨基酸)，則不用載體。
本文所用術語“抗體”(Ab)或“單克隆抗體”(Mab)包括能與KDI蛋白特異結(jié)合的完整分子以及抗體片段(例如Fab和F(ab’)2片段)。Fab和F(ab’)2片段缺少完整抗體的Fc片段，從循環(huán)中更快速清除，并可以具有低于完整抗體的非特異組織結(jié)合性(Wahl等，J.Nucl.Med 24:316-325(1983))。因此這些片段是優(yōu)選的。
本發(fā)明的抗體可通過各種方法制備。例如，可將表達KDI蛋白質(zhì)或其抗原性片段的細胞施用于動物，以誘導含有多克隆抗體的血清產(chǎn)生。在一優(yōu)選方法中，預先制備KDI蛋白質(zhì)并純化以使其基本上沒有天然污染物。然后將這種制備物導入動物以產(chǎn)生較高特異活性的多克隆抗血清。
在一更優(yōu)選的方法中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體(或其KDI蛋白質(zhì)結(jié)合片段)。這種單克隆抗體可用雜交瘤技術學制備(Kohler等，自然256:495(1975)；Kohler等，歐洲免疫學雜志6:511(1976)；Kohler等，歐洲免疫學雜志6:292(1976)；Hammerling等，單克隆抗體及T細胞雜交瘤，Elsevier,N.Y.,(1981)PP 563-681)。一般地，這種方法包括用KDI蛋白質(zhì)抗原或優(yōu)選地用表達KDI蛋白質(zhì)的細胞接種動物(優(yōu)選鼠)。通過其結(jié)合抗KDI蛋白質(zhì)抗體的能力可識別適當?shù)募毎＿@種細胞可在任何適當組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)；但優(yōu)選在補加10％胎牛血清(在大約56℃滅活)，并補加大約10g/l非必需氨基酸，大約1000U/ml青霉素，及大約100μg/ml四環(huán)素的Earle改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。提取這種鼠的脾細胞并與適當骨髓瘤細胞系融合。根據(jù)本發(fā)明可使用任何適當?shù)墓撬枇黾毎?，然而?yōu)選應用購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville,Maryland的親代骨髓瘤細胞系(SP20)。在融合后，所得雜交瘤細胞選擇性地保持在HAT培養(yǎng)基中，然后如Wands等所述(Gastroenterology 80:225-232(1981))通過限制稀釋克隆。然后分析通過這種選擇獲得的雜交瘤細胞以鑒別分泌能結(jié)合KDI蛋白質(zhì)抗原的抗體的克隆。
或者，能結(jié)合KDI蛋白質(zhì)抗原的其它抗體可通過用抗獨特型抗體以二步方法生產(chǎn)。這種方法利用抗體本身也是抗原這一事實，且因而能獲得結(jié)合第二種抗體的抗體。根據(jù)這種方法，KDI蛋白質(zhì)特異抗體用于接種動物，優(yōu)選鼠。然后將這種動物的脾細胞用于生產(chǎn)雜交瘤細胞，并篩選此雜交瘤細胞以鑒別能產(chǎn)生抗體的克隆，其結(jié)合KDI蛋白質(zhì)特異抗體的能力可由KDI蛋白質(zhì)抗原阻斷。這種抗體包括KDI蛋白質(zhì)特異抗體的抗獨特型抗體，并能用于接種動物以誘導其它KDI蛋白特異抗體形成。
應意識到本發(fā)明的Fab和F(ab’)2及其它抗體片段可根據(jù)本文所示方法使用。這種片段典型地用酶如木瓜蛋白酶(以產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(以產(chǎn)生F(ab’)2片段)，通過蛋白酶解而產(chǎn)生。或者，KDI蛋白結(jié)合片段可通過應用重組DNA技術學或合成化學而產(chǎn)生。
對人體內(nèi)應用抗KDI而言，可優(yōu)選使用“人化的”嵌合單克隆抗體。這種抗體可用衍生自上述產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞的遺傳構建體產(chǎn)生。本領域已知生產(chǎn)嵌合抗體的方法。參見Morrison，科學229:1202(1985)；Oi等，生物技術4:214(1986)；Cabilly等，美國專利No.4816567；Taniguchi等，EP171496；Morrison等，EP173494；Neuberger等，WO 8601533；Robinson等，WO8702671；Boulianne等，自然312:643(1984)；Neuberger等，自然314:268(1985)。
免疫系統(tǒng)相關疾病治療本領域熟練技術人員還意識到，由于本發(fā)明的KDI蛋白是干擾素家族的一成員，當KDI加入個體的細胞，組織或機體時，此蛋白質(zhì)將對個體的靶細胞發(fā)揮生理作用。因而應意識到由于個體干擾素活性的標準或正常水平的降低導致的疾病，尤其免疫系統(tǒng)疾病，可通過施用KDI多肽治療。因此，本發(fā)明還提供了治療需要提高干擾素水平的個體的方法，包括給這種個體施用包含一定量的本發(fā)明分離的KDI多肽的藥物組合物，所述的量能有效提高這種個體干擾素活性。
介導α-IFN和β-IFN生物活性的人工類IFN受體復合物除與KDI結(jié)合外也與Ω-IFN結(jié)合。由此，KDI能臨床用于抗病毒治療，例如治療AIDS，病毒性肝炎包括慢性乙肝，丙肝，乳頭瘤病毒，病毒性腦炎及預防鼻炎及呼吸道感染。
KDI還用于治療各種癌癥(例如多毛細胞白血病，急性骨髓瘤，骨肉瘤，基細胞癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，腎細胞癌，多發(fā)骨髓瘤，黑色素細胞瘤，及Hodgkin病)。
KDI被認為可刺激天然殺傷細胞活性。由此，KDI可用于治療寄生蟲及細菌感染，例如治療Cryptosporidium parvum感染及耐受多種藥物的肺結(jié)核。
KDI還被認為可用作免疫治療制劑，尤其用作免疫抑制劑。例如，據(jù)信KDI抑制用促細胞分裂原或同種異體細胞，骨髓樣祖細胞及其它骨髓細胞刺激的淋巴細胞增殖。由此，KDI當在化療前施用時用作防護劑，并另外可用于治療淋巴細胞，骨髓樣祖細胞及骨髓干細胞的過高增殖，例如治療慢性多毛細胞白血病。KDI多肽也可用于防止移植物與宿主的排斥，或縮短自身免疫疾病的進程如關節(jié)炎，多發(fā)硬化，(2)或糖尿病(3)。KDI還用于治療哺乳動物變態(tài)反應，例如通過抑制體液應答進行。
KDI可用作佐劑或共佐劑增強或刺激預防性或治療性接種情況下的免疫應答。
另外，本發(fā)明還提供了治療患者感染的方法，包括給需要抗感染治療的患者施用有效量的本發(fā)明多肽。在一優(yōu)選的實施方案中，感染是病毒，細菌或寄生蟲感染。在一尤為優(yōu)選的實施方案中，感染是病毒感染。
另外，本發(fā)明還提供了治療癌癥患者的方法，包括給需要抗癌治療的患者施用有效量的本發(fā)明多肽。
另外，本發(fā)明還提供了免疫治療癌癥患者的方法，包括給需要抗癌治療的患者施用有效量的本發(fā)明多肽。
另外，本發(fā)明還提供了免疫治療患者的方法，包括給需要免疫治療的患者施用有效量的本發(fā)明多肽。
配方KDI多肽組合物將以公認良好醫(yī)學實踐，考慮到個體患者的臨床條件(尤其單用KDI多肽治療的副作用)，KDI多肽組合物的釋放位點，施用方法，施用程序及其它已知臨床因素而加以配制。文中KDI多肽的“有效量”通過這種考慮加以確定。
一般而言，非腸道施用的每劑KDI多肽的藥物有效量在大約1μg/每公斤體重/天～10mg/每公斤體重/天范圍內(nèi)，當然如上所述這要進行治療性判斷。優(yōu)選地，劑量至少為0.01mg/每公斤體重/天，更優(yōu)選對人而言在大約0.01～10mg激素/每公斤體重/天之間。如果連續(xù)提供，KDI多肽典型地以大約1μg/每公斤體重/小時～50μg/每公斤體重/小時的速度施用，每天注射1～4次或連續(xù)皮下灌注，例如用微泵。也可使用靜脈袋溶液。治療時間需根據(jù)所需效果觀測治療后發(fā)生的反應而加以變化。
含有本發(fā)明KDI的藥物組合物可以口服，直腸，非腸道，腦池內(nèi)，陰道內(nèi)，腹膜內(nèi)，局部(以粉末，軟膏，滴劑或皮貼)，頰部施用或口服或鼻噴?！八幬锟山邮茌d體”是指非毒性固體，半固體或液體充填劑，稀釋劑，膠囊化物或任何類型的配方輔劑。文中術語“非腸道”是指施用模式包括靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，臀部內(nèi)，皮下及關節(jié)內(nèi)注射與灌注。
KDI多肽也適于通過持續(xù)釋放系統(tǒng)施用。適當?shù)某掷m(xù)釋放組合物例如包括有形形式的半通透聚合物基質(zhì)例如薄膜或微膠囊。適當?shù)尼尫呕|(zhì)包括聚交酯(美國專利No.3773919,EP58481),L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman,U.等，生物聚合物22:547-556(1983))，聚(2-羥乙基甲基丙烯酸)(R.Langer等，J.BiomedMater Res 15:167-277(1981)，及R.Langer Chem.Tech.12:98-105(1982))，乙烯乙烯基醋酸酯(R.Langer等，Id.)或聚-D-3-羥基丁酸(EP133988)。持續(xù)釋放KDI多肽組合物也包括脂質(zhì)截留的KDI多肽。含有KDI多肽的脂質(zhì)體通過已知方法制備，參見DE3218121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)82:3688-3692(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)77:4030-4034(1980)；EP52322；EP36676；EP88046；EP143949；EP142641；日本專利公開83-118008；美國專利4485045和4544545；及EP102324。通常地，脂質(zhì)體是小的均勻片形的〔大約200-800A(埃)〕，其中脂質(zhì)含量高于大約30mol％膽固醇，選擇調(diào)整的比例以使KDI多肽治療最佳化。
在一實施方案中，對非腸道施用而言，KDI多肽通常通過以所需純度，以單位劑量可注射形式(溶液，懸浮液或乳狀液)與藥物可接受載體混合而配制，該載體在所用劑量及濃度對受體無毒性，且可與配方其它中配料相容。例如，配方優(yōu)選不包括氧化劑及其它已知對多肽有害的化合物。
通常地，通過將KDI多肽均勻及密切地與液體載體或細分散的固定載體或二者接觸而制備配方。然后如果需要，將產(chǎn)物制成所需形狀。優(yōu)選地此載體是非腸道載體，更優(yōu)選與受體血液等滲的溶液。這種載體例如包括水，生理鹽水，Ringer’s液及葡萄糖液。本發(fā)明還使用非水相載體如固定的油及油酸乙酯，以及脂質(zhì)體。
載體適當?shù)睾形⒘刻砑觿┤缭鰪姷葷B性及化學穩(wěn)定性的物質(zhì)。這種物質(zhì)在所用劑量及濃度對受體是無毒的，且包括緩沖劑如磷酸，檸檬酸，琥珀酸，乙酸，及其它有機鹽及其鹽；抗氧化劑如抗壞血酸(VC)；低分子量(少于10個殘基)多肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；疏水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸及精氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；平衡離子如鈉離子；和/或非離子表面活性劑如Polysorbates,Poloxamers，或PEG。
KDI多肽典型地以大約0.1mg/ml～100mg/ml，優(yōu)選1-10mg/ml濃度，pH大約為3～8條件配制在這種載體中。應知道使用前述的某些賦形劑，載體或穩(wěn)定劑將導致KDI多肽鹽產(chǎn)生。
用于治療的KDI多肽必須是無菌的。通過無菌過濾膜(例如0.2微米膜)過濾很容易達到無菌。治療性KDI多肽組合物通常置于具有便攜無菌設備的容器中，如靜脈內(nèi)溶液包或具有可通過皮下注射針穿刺塞子的小瓶。
KDI多肽通常以單位劑量或多劑量含量貯存，例如封蠟安瓿或小瓶，以水溶液或凍干配方貯存以重配。凍干配方例如是在10ml小瓶中充填5ml過濾的無菌1％(w/v)KDI多肽水溶液，然后將所得混合物凍干。灌注液通過用無菌注射用水注入凍干的KDI多肽而制備。
本發(fā)明還提供了藥物包或試劑盒，其包括一或多種本發(fā)明藥物組合物的配料充填的一或多個容器，這種容器中還附有政府機構對藥物或生物制品的生產(chǎn)，使用或銷售調(diào)節(jié)的告示，該告示反映了政府機構對人施用的這些藥物或生物制品的生產(chǎn)，使用及銷售的認可。另外，本發(fā)明的多肽可與其它治療性化合物聯(lián)合應用。
興奮劑及拮抗劑-分析和分子本發(fā)明還提供了篩選化合物的方法，以鑒別那些增強或破壞KDI對細胞的作用，如其與KDI結(jié)合分子如受體分子的相互作用的化合物。興奮劑是一種提高KDI天然生物功能或與KDI功能相似的化合物，而拮抗劑降低或消除其功能。
本發(fā)明此實施方案另一方面提供了鑒別受體蛋白或其它與KDI多肽特異結(jié)合的配體結(jié)合蛋白的一種方法。例如，細胞區(qū)室，如細胞膜或其制備物可從表達結(jié)合KDI的分子中制備。將此制備物與標記的KDI保溫。根據(jù)本領域已知常規(guī)方法分離并定性KDI和與受體或其它結(jié)合蛋白結(jié)合的KDI復合物?；蛘?，KDI多肽可與固體支持物結(jié)合，由此從細胞中溶解的結(jié)合分子可與柱結(jié)合，然后根據(jù)常規(guī)方法洗脫及定性。
在本發(fā)明關于興奮劑與拮抗劑的分析中，細胞區(qū)室如細胞膜或其制備物可從表達結(jié)合KDI的分子的細胞中制備，該分子如通過KDI調(diào)節(jié)的信號或調(diào)節(jié)途徑的分子。此制備物用標記的KDI在沒有或有可能是KDI拮抗劑或興奮劑的候選分子情況下進行培養(yǎng)。候選分子與結(jié)合分子的結(jié)合能力通過標記配體結(jié)合降低而反映。無緣由結(jié)合的分子，即不誘導KDI對KDI結(jié)合分子的結(jié)合作用，是良好的拮抗劑。與KDI結(jié)合良好且激發(fā)與KDI相同或相近作用的分子是興奮劑。
測定潛在的興奮劑與拮抗劑的類KDI作用例如可通過在候選分子與細胞或適當?shù)募毎苽湮锵嗷シ磻螅_定第二信使系統(tǒng)活性，并對比KDI或分子激發(fā)同KDI相同作用的能力而進行。用于此目的的第二信使系統(tǒng)包括但非限于AMP鳥苷酸環(huán)化酶，離子通道或磷酸肌苷水解第二信使系統(tǒng)。
另一種對KDI拮抗劑的分析例如是競爭分析，其是在適當條件下組合KDI和潛在拮抗劑及膜結(jié)合的KDI受體分子或重組KDI受體分子，以進行競爭抑制分析。KDI可被標記如經(jīng)放射標記，這樣可準確確定與受體分子結(jié)合的KDI分子數(shù)目，以評價潛在拮抗劑的效力。
潛在拮抗劑包括與本發(fā)明多肽結(jié)合的小的有機分子，肽，多肽及抗體，從而抑制或消除其活性。潛在拮抗劑還可以是與結(jié)合分子上相同位點結(jié)合的小的有機分子，肽，多肽如密切相關的蛋白質(zhì)或抗體，而不誘導KDI誘導的活性，從而通過使KDI不能結(jié)合阻止KDI功能。
其它潛在拮抗劑包括反義分子。反義技術通過反義DNA或RNA或通過三螺旋形成用于控制基因表達。反義技術例如由Okano,J.Neurochem.56:560(1990)“寡脫氧核苷酸作為基因表達的反義抑制物”CRC出版社，Boca Raton,FL(1988)所揭示。三螺旋形成例如見于Lee等，核酸研究6:3073(1979)；Coony等，科學241:456(1988)；及Dervan等，科學251:1360(1991)所揭示。這些方法基于多核苷酸與互補DNA或RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸的5’編碼區(qū)可用于設計長度大約為10～40個堿基對的反義RNA寡核苷酸。設計一與參與轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)互補的DNA寡核苷酸，從而阻止轉(zhuǎn)錄和KDI產(chǎn)生。此反義RNA寡核苷酸與mRNA體內(nèi)雜交并破壞mRNA分子翻譯為KDI多肽。上述寡核苷酸也可輸入細胞，這樣反義RNA或DNA可在體內(nèi)表達從而抑制KDI蛋白產(chǎn)生。
興奮劑和拮抗劑可以與如上所述藥物可接受載體組合應用。
拮抗劑例如可用于抑制干擾素活性，例如在化療后刺激骨髓和造血原細胞增殖，任何上述拮抗劑均可與如后文所述藥物可接受載體組合應用。
本發(fā)明參考以下例證非限制性的實施例將更易于理解。
實施例1在E.coli克隆和表達KDI新的pHE4系列細菌表達載體，尤其pHE4a載體在本實施例中用于細菌表達。(QIAGEN,Inc.9259 Eton Avenue,Chatsworth,CA，91311)pHE4-5/KDI載體質(zhì)粒DNA含有插入在單一限制酶位點NdeⅠ和Asp 718之間的編碼圖1所示多核苷酸的DNA。此構建體為本領域技術人員的方便于1998年2月25日保藏于ATCC，保藏號No.209645。
pHE4a細菌表達載體包括供選擇的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，E.coli復制起點，T5噬菌體啟動子序列，2個lac操縱基因序列，Shine-Delgarno序列，及乳糖操縱子阻抑物基因(lacIq)。這些元件的排列使得編碼多肽的插入DNA片段表達具有與多肽氨基端共價鍵連的6個His殘基(即“6×His標記”)的多肽。
編碼成熟KDI蛋白的DNA序列用PCR寡核苷酸引物擴增，引物與KDI蛋白所需部分的氨基端序列及保藏構建體中cDNA編碼序列3’的序列退火。含有促進在pHE4a載體中克隆的限制位點的額外核苷酸分別加至5’和3’引物序列中。
為克隆KDI蛋白編碼區(qū)，5’引物序列為5’GGCCGCATATGCTGGACTGTAACTTACTG3’(SEQ ID NO:6)，下劃線處為NdeⅠ限制位點，本領域技術人員將意識到蛋白質(zhì)編碼序列中5’引物起始點可以變化，以擴增編碼完整KDI蛋白任何所需部分的DNA區(qū)段。3’引物序列為5’GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC3’(SEQ ID NO:17)，劃線處為Asp 718限制位點。
擴增的KDI DNA片段用NdeⅠ和Asp 718酶切，并然后將與線性化質(zhì)粒連接在一起。KDI DNA插入限制的pHE4a載體中使KDI蛋白編碼區(qū)在IPTG可誘導的啟動子的下游及在起始AUG和6個組氨酸密碼子的框架內(nèi)。
用如Sambrook等所述標準方法(分子克隆實驗手冊，2nd Ed；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989))，將連接混合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli細胞中。本發(fā)明實施例中使用的是含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4的E.coli菌株M15/rep4，其表達lac阻抑物并賦予卡那霉素抗性(“Kanr”)。這個唯一適于表達KDI蛋白的菌株可以商購(QIAGEN.Inc，前述)。通過其在有氨芐青霉素和卡那霉素的LB平板上的生長能力鑒別轉(zhuǎn)化體。從抗性克隆中分離質(zhì)粒DNA，并通過限制性分析，PCR及DNA測序確定克隆的DNA的正確性。
含有所需構建體的克隆在補加氨芐青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中生長過夜(O/N)。此O/N培養(yǎng)物以大約1∶25～1∶250的稀釋度用于接種大培養(yǎng)基。細胞生長至600nm光密度(OD 600)為0.4和0.6之間。然后加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，通過滅活lacⅠ阻抑物，誘導從lac阻抑物敏感啟動子轉(zhuǎn)錄。接著將細胞另外培養(yǎng)3～4小時。然后經(jīng)離心收集細胞。
細胞然后在4℃，在6M鹽酸胍pH8中攪拌3～4小時。經(jīng)離心除去細胞碎片，并將含有KDI多肽的上清加樣于鎳-腈-三乙酸(“Ni-NTA”)親和樹脂柱中(QIAGEN,Inc.)。具有6×His標記的蛋白質(zhì)與Ni-NTA樹脂高親和性結(jié)合，并可用簡便的一步法純化(詳見The QIAexpressionist,1995,QIAGEN,Inc)。簡而言之，上清在6M鹽酸胍，pH8中加樣于柱上，該柱首先用10體積的6M鹽酸胍，pH8洗滌，然后用10體積的6M鹽酸胍pH6洗滌，最后用6M鹽酸胍pH5洗脫KDI。
然后通過用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或50mM乙酸鈉緩沖液pH6，加上200mM NaCl將純化的蛋白質(zhì)透析復性?；蛘撸说鞍踪|(zhì)當固定在Ni-NTA柱上時可被充分重折疊。建議條件如下在含有蛋白酶抑制劑的500mM NaCl,20％甘油，20mM Tris/HCl pH7.4中，以線性6M～1M尿素梯度復性。復性應進行1.5小時或更長。復性后，蛋白質(zhì)可通過加入250mM咪唑洗脫。咪唑通過最后用PBS或50mM乙酸鈉緩沖液pH6加上200mM NaCl透析而除去，純化的蛋白質(zhì)在4℃貯存或在-80℃冷凍。
當其以包涵體形式存在時，以下另一種方法可用于純化在E.coli中表達的KDI，除非特別指出，以下步驟均在4～10℃進行。
在E.coli發(fā)酵生產(chǎn)階段結(jié)束時，細胞培養(yǎng)物冷卻至4～10℃，并通過以15000rpm持續(xù)離心收集細胞(Heraeus Sepatech)?；诿繂挝恢丶毎牡鞍踪|(zhì)的期望產(chǎn)量及所需純化的蛋白質(zhì)量，將適量重的細胞糊懸浮于含有100mM Tris,50mM EDTA,pH7.4的緩沖液中，用高剪切混合儀將細胞分散為均勻懸浮液。
然后將此溶液在4000～6000psi兩次流經(jīng)顯微流化儀(Microfluidics,Corp或APV Gaulin.Inc.)將細胞裂解。勻漿然后與NaCl液混合至終濃度為0.5M NaCl，隨后以7000xg離心15分鐘。所得沉淀再用0.5M NaCl,100mM Tris,50mM EDTA,pH7.4洗滌。
所得洗滌的包涵體用1.5M鹽酸胍(GnHCl)溶解2～4小時，在7000xg離心15分鐘后，棄去沉淀并將含KDI多肽的上清在4℃培養(yǎng)過夜，以進行下一步的GuHCl提取。
在高速離心(30000xg)除去不溶顆粒后，通過快速混合GnHCl提取物與20體積的含50mM乙酸鈉，pH4.5,150mM NaCl,2mMEDTA的緩沖液，經(jīng)強力攪拌，將GnHCl溶解的蛋白質(zhì)重折疊。重折疊的稀釋蛋白質(zhì)溶液在進一步純化之前，在4℃不混合保持12小時。
為澄清重折疊的KDI多肽溶液，使用具有適當表面積(如Filtron)的0.16μm膜濾器，用40mM乙酸鈉，pH6.0平衡的提前制備的切向過濾裝置。過濾的樣品加樣于陽離子交換樹脂(如PorosHS-50,Perseptive Biosystems)上。該柱用40mM乙酸鈉，pH6.0洗滌，并用含有250mM，500mM,1000mM和1500mM NaCl的相同緩沖液分步洗脫。連續(xù)監(jiān)測流出物在280mm的吸光度。收集各級組分并進行進一步SDS-PAGE分析。
將含有KDI多肽的組分集中并與4體積的水混合。稀釋的樣品然后加樣于提前制備的一系列強陰離子(Poros HQ-50,PerseptiveBiosystems)和弱陰離子(Poros CM-20,Perseptive Bio systems)交換樹脂串聯(lián)柱上。該柱用40mM乙酸鈉pH6.0平衡。兩個柱均用40mM乙酸鈉，pH6.0,200mM NaCl洗滌。CM-20柱然后在0.2M NaCl,50mM乙酸鈉，pH6.0至1.0M NaCl,50mM乙酸鈉，pH6.5范圍，用10柱體積線性梯度洗脫。在A280之下恒定監(jiān)測流出物收集各級組分。然后集中含有KDI多肽的組分(例如通過16％SDS-PAGE確定)。
所得KDI多肽在上述重折疊及純化步驟后呈95％以上的純度。當加樣5μg純化的蛋白質(zhì)時，在Commassie藍染色的16％SDS-PAGE凝膠中未觀測到主要污染帶。純化的蛋白質(zhì)也進行內(nèi)毒素/LPS污染測試，典型地根據(jù)LAL分析LPS污染物少于0.1ng/ml。
本發(fā)明人已產(chǎn)生了多個KDI表達構建體，以促進各種大小及各種系統(tǒng)中KDI多肽的生產(chǎn)?；贓.coli的構建體如下(1)pQE9:KDI.S27-K207(表達SEQ ID NO:2的27-207位氨基酸)；(2)pHE4:KDI.S27-K207(表達SEQ ID NO:2的27-207位氨基酸)；(3)pHE4:KDI.A23-K207(表達SEQ ID NO:2的23-207位氨基酸)；(4)pHE4.KDI.G24-K207(表達SEQ ID NO:2的24-207位氨基酸)；(5)pHE4.KDI.C30-K207(表達SEQ ID NO:2的30-207位氨基酸)。
實施例2在桿狀病毒表達系統(tǒng)中克隆和表達KDI蛋白質(zhì)在此實施例中，質(zhì)粒穿梭載體pA2GP用于將編碼KDI的克隆的DNA插入桿狀病毒中，以表達KDI蛋白質(zhì)，所用的桿狀病毒前導序列及標準方法如Summer等，桿狀病毒載體及昆蟲細胞培養(yǎng)方法手冊，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555(1987)所述。此表達載體含有苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(AcMNPV)的強多角體蛋白啟動子，后接桿狀病毒gp67蛋白的分泌性信號肽(前導序列)及常規(guī)限制位點如BamHⅠ,XbaⅠ和Asp718。猴病毒40(SV40)的聚腺苷酸化位點用于有效地聚腺苷酸化。為便于選擇重組的病毒，此質(zhì)粒含有在弱果蠅啟動子控制下相同方向的E.coli β-半乳糖苷酶基因，后接多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號。插入的基因位于與野生型病毒DNA經(jīng)細胞介導的同源重組的病毒序列兩側(cè)翼，以產(chǎn)生表達克隆的多核苷酸的活病毒。
本領域技術人員充分意識到許多其它桿狀病毒載體可代替以上載體而使用，如pAc373,pVL941和pAc IM1，只要此構建提供適當?shù)霓D(zhuǎn)錄，翻譯，分泌等的定位信號，包括所需信號肽及框內(nèi)AUG。這種載體例如由Luckow等，病毒學170:31-39(1989)所述。
編碼保藏的克隆中的成熟KDI多肽的缺失AUG起始密碼子及SEQ ID NO:2所示天然相關的前導序列的cDNA序列，用相應于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物擴增，5’引物序列為5’GGCCGGGATCCGCCATCATGAGCACCAAACCTGATATG3’(SEQ ID NO:18)，劃線處為Bam HⅠ限制酶位點。3’引物序列為5’GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCTGAATAGAGC3’(SEQ IDNO:19)，劃線處為Asp718限制酶位點。
擴增的片段用商購的試劑盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.,LaJolla,CA)從1％瓊脂糖凝膠中分離出。該片段然后用BamHⅠ和Asp718酶切，并再在1％瓊脂糖凝膠上純化。
此質(zhì)粒用限制酶BamHⅠ和Asp 718酶切，并任選地，用本領域已知常規(guī)方法，用牛腸磷酸酸去磷酸化。該DNA然后用商購試劑盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.,La Jolla,CA)從1％瓊脂糖凝膠中分離。
片段和去磷酸化的質(zhì)粒用T4DNA連接酶連在一起。用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli HB 101或其它適當E.coli宿主如XL-1 Blue(Statagene Cloning Systems,La Jolla,CA)并涂布于培養(yǎng)平板上。用BamHⅠ和Asp 718酶切個各菌落的DNA，然后經(jīng)凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物，鑒定細菌含有具有人KDI基因的質(zhì)粒?？寺〉钠蔚男蛄型ㄟ^DNA測序確定。此質(zhì)粒在此稱為pA2GPKDI。
用Felgner等，Proc Natl Acad Sci USA 84:7413-7417(1987)所述脂轉(zhuǎn)染法，將5μg質(zhì)粒pA2GPKDI與1.0μg商購線性化的桿狀病毒DNA(“Baculo GoldTMbaculovirus DNA”,Pharmingen,San Diego,CA)共轉(zhuǎn)染。將1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg質(zhì)粒pA2GPKDI混合在含50μl無血清Grace’s培養(yǎng)基的微滴定平板的無菌孔中(Life Technologies Inc.,Gaithersburg,MD)隨后加入10μl Lipofectin和90μl Grace’s培養(yǎng)基，混合，并在室溫培養(yǎng)15分鐘。轉(zhuǎn)染混合物然后滴加入Sf9昆蟲細胞中(ATCC CRL 1711)，該細胞種植于具有1ml無血清Grace’s培養(yǎng)基的35mm組織培養(yǎng)平板中。此平板在27C培養(yǎng)5小時，然后從平板中除去轉(zhuǎn)染溶液，并加入1ml補加10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基，在27℃持續(xù)培養(yǎng)4天。
四天后，收集上清，并如Summer和Smith(前述)所述進行噬斑分析。具有“Blue Gal”(Life Technoligies Inc.,Gaithersburg)的瓊脂糖凝膠使產(chǎn)生蘭染噬斑的gal表達克隆易于鑒別及分離。(關于此類“噬斑分析”可見于昆蟲細胞培養(yǎng)使用手冊及由LifeTechnologies Inc.,Gaithersburg,P 9-10所分類的桿狀病毒學)。在適當培養(yǎng)后，用微量移液管的尖端(如Eppendorf)挑取蘭染的噬斑。含有重組病毒的瓊脂然后重懸浮于含200μl Grace’s培養(yǎng)基的微離心管中，并將含有重組桿狀病毒的懸浮液施加于種植于35mm平皿中的昆蟲Sf9細胞中。4天后收集這些培養(yǎng)平皿的上清，然后在4℃貯存。此重組病毒稱為V-KDI。
為檢定KDI基因的表達，Sf9細胞在補加10％熱滅活的FBS的Grace’s培養(yǎng)基中生長。以感染復數(shù)(MOI)大約為2用重組桿狀病毒V-KDI感染細胞，如果放射標記的蛋白質(zhì)是所需的，6小時后除去培養(yǎng)基，并用減去甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900IⅡ培養(yǎng)基(可購自Life Technologies Inc.,Rockvile,MD)置換。42小時后，加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(可購自Amersham)。將細胞進一步培養(yǎng)16小時，然后經(jīng)離心收集，上清中蛋白質(zhì)以及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE，隨后經(jīng)自動放射自顯影(如果是放射標記的)分析。
純化的蛋白質(zhì)氨基端的氨基酸序列的微測序可用于確定KDI蛋白質(zhì)氨基端序列。
其它桿狀病毒表達構建體如下構建(1)pA2:KDI(表達SEQ IDNO:2的1-207位殘基)；(2)pA2.KDI.M7-K207(表達SEQ IDNO:2的7-207位殘基)；(3)pA2gp.KDI.L28-K207(表達SEQID NO:2的28-207位殘基)；(4)pA2gp.KDI.C30-K207(表達SEQ ID NO:2的30-207位殘基)；(5)pA2.KDI.M1-R192(表達SEQ ID NO:2的1-192位殘基)。
實施例3在哺乳動物細胞中克隆和表達KDI典型的哺乳動物表達載體包括啟動子元件，其引導mRNA轉(zhuǎn)錄開始，蛋白質(zhì)編碼序列，為轉(zhuǎn)錄終止和轉(zhuǎn)錄物聚腺苷酸化所需的信號。其它元件包括增強子，Kozak序列及側(cè)翼于供體和受體RNA剪切位點的間插序列。用SV 40的早期和晚期啟動子，反轉(zhuǎn)錄病毒如RSV,HTLVI,HIVI的長末端重復(LTRs)和巨細胞病毒(CMV)的早期啟動子可實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)錄。然而，也可使用細胞元件(例如人肌動蛋白啟動子)。適用于本發(fā)明的表達載體例如包括pSVL和pMSG載體(Pharmacia，Uppsala,Sweden),pRSVcat(ATCC 37152),pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)?？捎玫牟溉閯游锼拗骷毎ㄈ薍ela,293,H9和Jurkat細胞，鼠NIH3T3和C127細胞，Cos1,Cos7和CV1，鵪鶉QC1-3細胞，鼠L細胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
或者，基因可在含有整合入染色體中的基因的穩(wěn)定細胞系中表達。用選擇標記如dhfr,gpt，新霉素，潮霉素，可鑒別共轉(zhuǎn)染及分別轉(zhuǎn)染的細胞。
轉(zhuǎn)染的基因也可擴增以表達大量編碼的蛋白質(zhì)，DHFR(二氫葉酸還原酶)標記用于開發(fā)攜帶相應基因的幾百個或者甚至幾千個拷貝的細胞系。其它有效選擇標記是谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，生物化學雜志277:227-279(1991)；Bebbington等，生物/技術學10:169-175(1992))。使用這些標記，哺乳動物細胞在選擇性培養(yǎng)基中生長，并選擇最高抗性的細胞，這些細胞系含有整合入染色體中的擴增的基因，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和NSO細胞通常用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。
表達載體pC1和pC4含有Rous肉瘤病毒(Cullen等，分子和細胞生物學，438-447(1985,3))的強啟動子(LTR)，加上CMV-增強子的片段(Boshart等，細胞41:521-530(1985))。例如具有BamHⅠ,XbaⅠ和Asp 718限制酶切位點的多克隆位點，促進相應基因的克隆。除3’內(nèi)含子之外，載體還含有鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化及終止信號。
在CHO細胞中克隆及表達載體pC4-Sig用于表達KDI多肽，質(zhì)粒pC4-Sig是質(zhì)粒pSV2-dhfr(ATCC登錄號No.37146)的衍生物。其含有位于多克隆位點上游的趨化因子β-8(見US95/09508)的分泌前導序列的編碼區(qū)，且被設計在插入的異源DNA框內(nèi)。此質(zhì)粒含有在SV40早期啟動子控制下的鼠DHFR基因。用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的，缺失二氫葉酸活性的CHO或其它細胞，可通過將細胞在補加化療劑氨甲喋呤的選擇性培養(yǎng)基(α減MEM,Life Technologies)生長加以選擇。抗氨甲喋呤(MTX)細胞中的DHFR基因的擴增已被充分論證(參見如Alt,F.W.,Kellems,R.M.,Bertino,JR.和Schimke,R.T.1978，生物化學雜志253:1357-1370,Hamlin,J.L.和Ma,C 1990,Biochem,et BiophysActa,1097:107-143,Page,M.J.和Sydenham,M.A.1991，生物技術學9:64-68)。細胞在MTX濃度增高下生長，由于DHFR基因擴增，導致定向酶DHFR的過量產(chǎn)生，引發(fā)對藥物的抗性。如果第二個基因連于DHFR基因，其通常同時被擴增及過表達。本領域已知此方法可用于開發(fā)攜帶1000以上拷貝的擴增基因的細胞系。隨后，當除去氨甲喋呤時，可獲得含有整合入宿主細胞一或多條染色體中的擴增的基因的細胞系。
質(zhì)粒pC4含有表達相應基因的Rouse肉瘤病毒(Cullen等，分子和細胞生物學，1985.3.:438-447)的長末端重復序列(LTR)的強啟動子，加上分離自人巨細胞病毒(CMV)(Boshart等，細胞41:521-530(1985))的立即早期基因增強子的片段。啟動子的下游是下述使基因整合的單限制酶切位點BamHⅠ,XbaⅠ和Asp 718。除這些克隆位點外，質(zhì)粒還含有3’內(nèi)含子和鼠前胰島素原基因的聚腺苷酸化位點。其它高效啟動子也可用于表達，例如人β-肌動蛋白啟動子，SV40早期或晚期啟動子，或其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復序列，例如HIV和HTLVI。Clontech的Tet-off和Tet-on基因表達系統(tǒng)及相似系統(tǒng)可用于在哺乳動物細胞中以可調(diào)節(jié)的方式表達KDI多肽。(Gossen.M.,& Bujard,H.1992,Proc.Natl Acad Sci USA89:5547-5551)。為mRNA的聚腺苷酸化，其它例如人生長素或珠蛋白基因的信號也可使用。攜帶整合入染色體的相應基因的穩(wěn)定細胞系也可在共轉(zhuǎn)染后用選擇標記如gpt,G418或潮霉素選擇。在開始時使用一個以上選擇標記例如G 418加上氨甲喋呤是有利的。
質(zhì)粒pC4用限制酶BamHⅠ和Asp 718酶切，然后用牛腸磷酸酶經(jīng)本領域已知方法去磷酸化。載體然后從1％瓊脂糖凝膠中分離出。
編碼KDI多肽的DNA序列用相當于基因所需部分的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物擴增。5’引物含有下劃線處的BamHⅠ位點，Kozak序列及AUG起始密碼子，5’引物序列為5’-GGCCGGGATCCGCCATCATGAGCACCAAACCTGATATG3’(SEQ ID NO:18)。3’引物含有下劃線處的Asp 718限制位點，其序列如下5’GGCCGCGGTACCTTATTTCCTCCCTGAATAGAGC3’(SEQ ID NO:19)。
擴增的片段用內(nèi)切核酸酶BamHⅠ和Asp718酶切，然后再在1％瓊脂糖凝膠上純化。分離的片段與去磷酸化的載體然后用T4 DNA連接酶連接。然后轉(zhuǎn)化E.coli HB101或XL-1 Blue細胞，并用例如限制酶分析鑒別含有插入質(zhì)粒pC4中的片段的細菌。
缺失活性DHFR基因的CHO細胞用于轉(zhuǎn)染。將5μg的表達質(zhì)粒pC4與0.5μg的質(zhì)粒pSVneo用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner等，前述)共轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒pSV2-neo含有顯性選擇標記，Tn5的neo基因，其編碼賦予包括G418的一組抗生素抗性的酶。將細胞種植于補加1mg/mlG418的α減MEM培養(yǎng)基中。2天后，細胞用胰蛋白酶消化，并種植于補加10,25或50ng/ml氨甲喋呤加上1mg/ml G418的α減MEM培養(yǎng)基中的雜交瘤克隆平板(Greiner，德國)中。10-14天后，將單個克隆用胰蛋白酶消化，并種植于具有不同氨甲喋呤濃度(50nM,100nM,200nM,400nM,800nM)的6孔培養(yǎng)皿或10ml燒瓶中。然后將在最高氨甲喋呤濃度生長的克隆移至含有更高濃度氨甲喋呤(1μM,2μM,5μM,10μM,20μM)的新6孔平板上。重復相同步驟直至獲得在100～200μM濃度生長的克隆。所需基因產(chǎn)物的表達通過例如SDS-PAGE及Western印跡或反相HPLC分析進行分析。
其它哺乳動物表達載體構建如下(1)pC4:KDI(表達SEQ IDNO:2的1-207殘基)；(2)pC4sp:KDI.C30-K207(表達后接SEQID NO:2的30-207位殘基的異源信號肽(趨化因子β-8(MPIF-1)信號肽))；及(3)pC4sp:KDI.L28-K207(表達后接SEQ ID NO:2的28～207位殘基的異源信號肽(趨化因子β-8(MPIF-1)信號肽))。
應清楚本發(fā)明除前述闡述及實施例外還可以其它方式實施。根據(jù)以上教導及在權利要求范圍內(nèi)可對本發(fā)明做各種修改及變化。
所有引證的出版物(包括專利，專利申請，雜志，實驗手冊，書或其它文件)均并入?yún)⒖肌?br> 關于微生物保藏的說明(PCT細則13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
序列表<110>人體基因組科學有限公司等<120>角質(zhì)形成細胞衍生的干擾素<130>PF482<140>未給出<141>1999-07-21<150>60/093,643<151>1998-07-21<160>21<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1170<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(35)..(655)<400>1ccacgcgtcc gggatttttt agcttgcaaa aaaa atg agc acc aaa cct gat atg 55Met Ser Thr Lys Pro Asp Met1 5att caa aag tgt ttg tgg ctt gag atc ctt atg ggt ata ttc att gct 103Ile Gln Lys Cys Leu Trp Leu Glu Ile Leu Met Gly Ile Phe Ile Ala10 15 20ggc acc cta tcc ctg gac tgt aac tta ctg aac gtt cac ctg aga aga 151Gly Thr Leu Ser Leu Asp Cys Asn Leu Leu Asn Val His Leu Arg Arg25 30 35gtc acc tgg caa aat ctg aga cat ctg agt agt atg agc aat tca ttt 199Val Thr Trp Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe40 45 50 55cct gta gaa tgt cta cga gaa aac ata gct ttt gag ttg ccc caa gag 247Pro Val Glu Cys Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu60 65 70ttt ctg caa tac acc caa cct atg aag agg gac atc aag aag gcc ttc 295Phe Leu Gln Tyr Thr Gln Pro Met Lys Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe75 80 85tat gaa atg tcc cta cag gcc ttc aac atc ttc agc caa cac acc ttc 343Tyr Glu Met Ser Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe90 95 100aaa tat tgg aaa gag aga cac ctc aaa caa atc caa ata gga ctt gat 391Lys Tyr Trp Lys Glu Arg His Leu Lys Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp105 110 115cag caa gca gag tac ctg aac caa tgc ttg gag gaa gac gag aat gaa 439Gln Gln Ala Glu Tyr Leu Asn Gln Cys Leu Glu Glu Asp Glu Asn Glu120 125 130 135aat gaa gac atg aaa gaa atg aaa gag aat gag atg aaa ccc tca gaa 487Asn Glu Asp Met Lys Glu Met Lys Glu Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu140 145 150gcc agg gtc ccc cag ctg agc agc ctg gaa ctg agg aga tat ttc cac 535Ala Arg Val Pro Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His155 160 165agg ata gac aat ttc ctg aaa gaa aag aaa tac agt gac tgt gcc tgg 583Arg Ile Asp Asn Phe Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp170 175 180gag att gtc cga gtg gaa atc aga aga tgt ttg tat tac ttt tac aaa 631Glu Ile Val Arg Val Glu Ile Arg Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys185 190 195ttt aca gct cta ttc agg agg aaa taagaatcat ctaccttcaa gcaagaatta 685Phe Thr Ala Leu Phe Arg Arg Lys200 205acagagattg tggctacgca aatgcaccaa aaaagggtga aatatatctg aaatgtacct 745ggttctgccc ttggaagcca cttcctgctc atgccactaa cagcatgctg ccaaactgtt 805cagattcaag attattccaa gcgcagggcc caaatgttat agccaaagaa agtcttatga 865taaaagtgag gcaaatttca gccaagaagt tagaagagat gtttaaaaga acaagaacaa 925attgtggatc atggtatatg caggctatca gcagaaggat cagacaataa aatgagttag 985tgcaaaccat ttagtaaaaa taactatcag cagagttgtt ccagattaaa aatagtacta 1045caagcttgta aaggagttag gacatgcaag ctactgagca taaaatatat acttgctatt 1105tttcatgact ttctctaata aagtctttga ctgttctctc taataaaaaa aaaaaaaaaa 1165aaaaa 1170<210>2<211>207<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ser Thr Lys Pro Asp Met Ile Gln Lys Cys Leu Trp Leu Glu Ile1 5 10 15Leu Met Gly Ile Phe Ile Ala Gly Thr Leu Ser Leu Asp Cys Asn Leu20 25 30Leu Asn Val His Leu Arg Arg Val Thr Trp Gln Asn Leu Arg His Leu35 40 45Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu Cys Leu Arg Glu Asn Ile50 55 60Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln Tyr Thr Gln Pro Met Lys65 70 75 80Arg Asp Ile Lys Lys Ala Phe Tyr Glu Met Ser Leu Gln Ala Phe Asn85 90 95Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp Lys Glu Arg His Leu Lys100 105 110Gln Ile Gln Ile Gly Leu Asp Gln Gln Ala Glu Tyr Leu Asn Gln Cys115 120 125Leu Glu Glu Asp Glu Asn Glu Asn Glu Asp Met Lys Glu Met Lys Glu130 135 140Asn Glu Met Lys Pro Ser Glu Ala Arg Val Pro Gln Leu Ser Ser Leu145 150 155 160Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp Asn Phe Leu Lys Glu Lys165 170 175Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Ile Arg Arg180 185 190Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala Leu Phe Arg Arg Lys195 200 205<210>3<211>238<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr1 5 10 15Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu20 25 30Leu Ser Arg Asn Thr Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser35 40 45Pro Phe Leu Cys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu50 55 60Met Val Lys Gly Ser Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Glu Leu100 105 110His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly115 120 125Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Val Pro Gln Leu Ser Ser
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Gly Arg Ile Ser35 40 45His Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu50 55 60Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe65 70 75 80His Glu Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu100 105 110Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly115 120 125Val Glu Glu Ile Ala Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg130 135 140Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser145 150 155 160Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser165 170 175Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys Gly Leu Arg Arg Lys Asp Met Pro Leu180 185 190Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr Lys Ser Ile195 200 205Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg210 215 220Arg Ala Trp Ile Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser225 230 235 240Cys Leu Lys Asp Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp245 250 255Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met260 265 270Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala275 280 285Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln290 295 300Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Thr Gln Glu Val Gly Val Glu Glu305 310 315 320Ile Ala Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe325 330 335Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Met Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala340 345 350Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr355 360 365Asn Leu Gln Lys Gly Leu Arg Arg Lys Asp370 375<210>11<211>195<212>PRT<213>Homo sapiens<400>11Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Arg Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Glu Asp His Met Leu20 25 30Gly Ala Arg Glu Asn Leu Arg Leu Leu Ala Arg Met Asn Arg Leu Ser35 40 45Pro His Pro Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu50 55 60Met Val Glu Gly Asn Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Ile Ser Val Leu65 70 75 80His Glu Met Leu Gln Gln Cys Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu100 105 110Gln Gln Gln Leu Glu Asp Leu Asp Ala Cys Leu Gly Pro Val Met Gly115 120 125Glu Lys Asp Ser Asp Met Gly Arg Met Gly Pro Ile Leu Thr Val Lys130 135 140Lys Tyr Phe Gln Gly Ile His Val Tyr Leu Lys Glu Lys Glu Tyr Ser145 150 155 160Asp Cys Ala Trp Glu Ile Ile Arg Met Glu Met Met Arg Ala Leu Ser165 170 175Ser Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Arg Lys Met Gly Gly Asp Leu180 185 190Asn Ser Leu195<210>12<211>196<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Leu Ser Gln Arg Leu Met Leu20 25 30Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys Leu Leu Glu Pro Met Asn Arg Leu Ser35 40 45Pro His Ser Cys Leu Gln Asp Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu50 55 60Met Val Glu Gly Asp Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser85 90 95Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu100 105 110Gln Gln Gln Leu Glu Asp Leu Asp Thr Cys Cys Arg Gly Gln Val Met115 120 125Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val130 135 140Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr145 150 155 160Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu165 170 175Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp180 185 190Leu Asn Ser Pro195<210>13<211>170<212>PRT<213>Homo sapiens<400>13Met Ala Gln Ile Tyr Leu Val Met Ala Gly Val Met Leu Cys Ser Ile1 5 10 15Ser Val Cys Phe Leu Asp Gln Asn Leu Ser Ala Val His Cys Val Glu20 25 30Lys Arg Glu Ile Phe Lys His Leu Gln Glu Ile Lys Lys Ile Pro Ser35 40 45Gln Leu Cys Leu Lys Asp Arg Ile Asp Phe Lys Phe Pro Trp Lys Arg50 55 60Glu Ser Ile Thr Gln Leu Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr65 70 75 80Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe His Thr Glu His Ser Ser85 90 95Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Leu Asp Gln Leu Leu Ser Ser Leu Asp100 105 110Leu Gly Leu Arg Arg Leu Glu His Met Lys Lys Asp Asn Met Asp Cys115 120 125Pro His Val Gly Ser Ala Leu Arg Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Gly Leu130 135 140Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg145 150 155 160Val Glu Ile Glu Arg Cys Phe Ser Leu Thr165 170<210>14<211>212<212>PRT<213>Homo sapiens<400>14Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu1 5 10 15Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro20 25 30Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln Pro Leu Thr35 40 45Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Ile50 55 60Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser65 70 75 80Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala85 90 95Lys Glu Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu100 105 110Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr115 120 125Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg Ala Val Gln130 135 140Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys Ala Lys Asn145 150 155 160Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu165 170 175Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met Thr Thr His180 185 190Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser Leu Arg Ala195 200 205Leu Arg Gln Met210<210>15<211>186<212>PRT<213>Homo sapiens<400>15Met Thr His Arg Cys Leu Leu Gln Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Leu Arg Phe Gln Gln Arg20 25 30Arg Ser Leu Ala Leu Cys Gln Lys Leu Leu Arg Gln Leu Pro Ser Thr35 40 45Pro Gln His Cys Leu Glu Ala Arg Met Asp Phe Gln Met Pro Glu Glu50 55 60Met Lys Gln Ala Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ile Leu Val Ile65 70 75 80Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ile Phe Ash Ile Leu Thr Arg Asp Phe Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Ser Glu Thr Ile Ile Glu Asp Leu Leu Glu Glu Leu100 105 110Tyr Glu Gln Met Asn His Leu Glu Pro Ile Gln Lys Glu Ile Met Gln115 120 125Lys Gln Ash Ser Thr Met Gly Asp Thr Thr Val Leu His Leu Arg Lys130 135 140Tyr Tyr Phe Asn Leu Val Gln Tyr Leu Lys Ser Lys Glu Tyr Asn Arg145 150 155 160Cys Ala Trp Thr Val Val Arg Val Gln Ile Leu Arg Asn Phe Ser Phe165 170 175Leu Thr Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Glu180 185<210>16<21l>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>16ggccgcatat gctggactgt aacttactg 29<210>17<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>17ggccgcggta ccttatttcc tcctgaatag agc 33<210>18<21l>38<212>DNA<213>Homo sapiens<400>18ggccgggatc cgccatcatg agcaccaaac ctgatatg 38<210>19<21l>33<212>DNA<213>Homo sapiens<400>19ggccgcggta ccttatttcc tcctgaatag agc 33<210>20<211>156<212>PRT<213>Homo sapiens<400>20Met Thr Tyr Arg Cys Leu Leu Gln Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser1 5 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Leu Arg Phe Gln Gln Arg20 25 30Gln Ser Leu Lys Glu Cys Gln Lys Leu Leu Gly Gln Leu Pro Ser Thr35 40 45Ser Gln His Cys Leu Glu Ala Arg Met Asp Phe Gln Met Pro Glu Glu50 55 60Met Lys Gln Glu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ile Leu Val Met65 70 75 80Tyr Glu Val Leu Gln His Ile Phe Gly Ile Leu Thr Arg Asp Phe Ser85 90 95Ser Thr Gly Trp Asn Ser Thr Thr Glu Asp Thr Ile Val Pro His Leu100 105 110Gly Lys Tyr Tyr Phe Ash Leu Met Gln Tyr Leu Glu Ser Lys Glu Tyr115 120 125Asp Arg Cys Ala Trp Thr Val Val Gln Val Gln Ile Leu Thr Asn Val130 135 140Ser Phe Leu Met Arg Leu Thr Gly Tyr Val Arg Asp145 150 155<210>21<211>166<212>PRT<213>Homo sapiens<400>21Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln35 40 45Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65 70 75 80Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160Thr Gly Tyr Leu Gly Asn16權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其包含至少95％相同于選自以下一組的成員的核酸序列(a)編碼SEQ ID NO:2的1～207位殘基所示多肽的核苷酸序列；(b)編碼SEQ ID NO:2的2～207位殘基所示多肽的核苷酸序列；(c)編碼SEQ ID NO:2的28～207位殘基所示多肽的核苷酸序列；(d)編碼SEQ ID NO:2的30～207位殘基所示多肽的核苷酸序列；(e)編碼SEQ ID NO:2的165～183位殘基所示多肽的核苷酸序列；(f)編碼由包含于克隆HKAPI15中人cDNA編碼的完整多肽的核苷酸序列；(g)編碼由包含于克隆HKAPI15中人cDNA編碼的除N端甲硫氨酸外完整多肽的核苷酸序列；(h)編碼由包含于克隆HKAPI15中人cDNA編碼的成熟多肽的核苷酸序列；(i)與以上(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)中任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。
2.一種分離的多核苷酸，其包含選自以下一組的核酸序列(a)編碼SEQ ID NO:2的1～207位殘基所示多肽的生物學活性片段的核苷酸序列；及(b)與(a)核苷酸序列互補的核苷酸序列。
3.權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有編碼具有SEQID NO:2的165～183位氨基酸序列的KDI多肽的核苷酸序列，如圖1(SEQ ID NO:1)所示。
4.權利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸具有編碼具有SEQID NO:2的28～207位氨基酸序列的KDI多肽的核苷酸序列，如圖1(SEQ ID NO:1)所示。
5.一種分離的核酸分子，其包含具有至少95％相同于選自以下一組的序列的核苷酸序列的多核苷酸(a)編碼包含SEQ ID NO:2的n～207位殘基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n是1～59范圍內(nèi)的一整數(shù)；(b)編碼包含SEQ ID NO:2的1～m位殘基的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中m是183～207范圍內(nèi)的一整數(shù)；(c)編碼具有由SEQ ID NO:2的n～m位殘基組成的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中n和m是分別在(a)和(b)中限定的整數(shù)；(d)編碼由包含于HKPI15中人cDNA編碼的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽N端缺失1～58之間的氨基酸；(e)編碼由包含于HKAPI15中人cDNA編碼的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽C端缺失1～23之間的氨基酸；(f)編碼由包含于HKAPI15中人cDNA編碼的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有(d)和(e)中所述N及C端缺失的任意組合。
6.一種分離的核酸分子，其包含在嚴格雜交條件下，與具有相同于權利要求1(a),(b),(c),(d),(e),(f),(g)或(h)中核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸，其中所述多核苷酸在嚴格雜交條件下與具有只由A殘基或T殘基組成的核苷酸序列的多核苷酸不雜交。
7.一種分離的核酸分子，其包含編碼具有權利要求1的(a),(b),(c),(d),(e),(f)或(g)中氨基酸序列的KDI多肽攜帶表位部分的氨基酸序列的多核苷酸。
8.權利要求7的分離的核酸分子，其包含編碼選自以下一組的KDI多肽攜帶表位部分的核酸序列包含SEQ ID NO:2中大約Ser49～Ser54氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Cys59～Ala65氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Pro78～Tyr88氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約His101～Gln113氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Gln120～Glu123氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Cys128～Pro155氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Leu160～Arg168氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Asn171～Asp180氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Val186～Cys193氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Phe204～Lys207氨基酸殘基的多肽。
9.一種生產(chǎn)重組載體的方法，包括將權利要求1的分離的核酸分子插入載體。
10.一種通過權利要求9的方法生產(chǎn)的重組載體。
11.一種生產(chǎn)重組宿主細胞的方法，包括將權利要求10的重組載體導入宿主細胞。
12.一種通過權利要求11的方法生產(chǎn)的重組宿主細胞。
13.一種生產(chǎn)KDI多肽的重組方法，包括在所述多肽被表達的條件下培養(yǎng)權利要求12的重組宿主細胞，并回收所述多肽。
14.一種分離的KDI多肽，其包含至少95％相同于選自以下一組的成員的氨基酸序列(a)SEQ ID NO:2的1～207位殘基所示多肽；(b)SEQ ID NO:2的2～207位殘基所示多肽；(c)SEQ ID NO:2的28～207位殘基所示多肽；(d)SEQ ID NO:2的165～183位殘基所示多肽；(e)由包含于克隆HKAPI15中人cDNA編碼的完整多肽；(f)由包含于克隆HKAPI15中人cDNA編碼的除N端甲硫氨酸外的完整多肽；(g)由包含于克隆HKAPI15中人cDNA編碼的成熟多肽。
15.一種分離的多肽，其包含KDI蛋白攜帶表位部分，其中所述部分選自以下一組包含SEQ ID NO:2中大約Ser49-Ser54氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Cys59-Ala65氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Pro78-Tyr88氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約His101-Gln113氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Gln120-Glu123氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Cys128-Pro155氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Leu160-Arg168氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Asn171-Asp180氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Val186-Cys193氨基酸殘基的多肽；包含SEQ ID NO:2中大約Phe204-Lys207氨基酸殘基的多肽。
16.一種分離的抗體，其與權利要求14的KDI多肽特異結(jié)合。
17.一種分離的核酸分子，其包含具有至少95％相同于SEQ IDNO:1的至少50個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸。
18.一種分離的多肽，其包含SEQ ID NO:2的1～207位殘基所示多肽生物學活性片段的氨基酸序列。
19.一種藥物組合物，其包含在藥物可接受載體中的權利要求14的多肽。
20.一種治療患者病毒感染的方法，包括給患者施用權利要求19的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及是干擾素家族成員的新KDI蛋白。具體地,提供了編碼稱為“KDI”的人干擾素多肽的分離的核酸分子,還提供了KDI多肽,用于產(chǎn)生該多肽的載體,宿主細胞和重組方法。本發(fā)明進一步涉及鑒別KDI活性的興奮劑和拮抗劑的篩選方法。本發(fā)明還提供了治療免疫系統(tǒng)相關疾病的治療方法。
文檔編號C12N15/09GK1319137SQ99811157
公開日2001年10月24日 申請日期1999年7月21日 優(yōu)先權日1998年7月21日
發(fā)明者史蒂文·M·魯賓, 保羅·A·穆爾, 戴維·W·拉弗勒 申請人:人體基因組科學有限公司