專(zhuān)利名稱(chēng)：重組celo病毒及celo病毒dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒載體和病毒DNA。
腺病毒在人類(lèi)疾病中所起的作用已有研究(25)，它可作為分子生物學(xué)領(lǐng)域許多重要發(fā)現(xiàn)，包括mRNA剪接、DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一種模式(綜述見(jiàn)44)，以及最近作為暫時(shí)性基因表達(dá)的有效試劑(12,46)。對(duì)腺病毒生活史已比較了解(綜述見(jiàn)50)。自從利用腺病毒作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體的努力開(kāi)始以來(lái)(18,52,28)，該病毒已成為常用載體，并已開(kāi)發(fā)出通過(guò)在該病毒基因組中產(chǎn)生改變而攜帶新基因的多種方法(2,5,11,15,21,23,26,32,38,41,43,48，綜述見(jiàn)31,49)。由于載體的構(gòu)建和純化很容易，而且由于這些載體具有較強(qiáng)的將新遺傳物質(zhì)暫時(shí)活體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)到多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型的能力，腺病毒載體在臨床基因治療的早期努力中得到廣泛利用。
不幸的是，最初使用的以腺病毒第5型(Ad5)為基礎(chǔ)的載體，有幾個(gè)特性限制了它在初步應(yīng)用上的成功。這些特性包括宿主對(duì)腺病毒的免疫反應(yīng)(綜述見(jiàn)參考文獻(xiàn)55)，以及病毒無(wú)法有效地進(jìn)入某些靶細(xì)胞類(lèi)型(20,58,59)。因此，目前有興趣的是那些能夠激發(fā)較低攻擊性的宿主免疫反應(yīng)，并能夠以較高效率進(jìn)入靶細(xì)胞的腺病毒類(lèi)型。
已知大量可替換的腺病毒血清型，可在一些應(yīng)用中提供勝過(guò)以Ad5-為基礎(chǔ)的載體的優(yōu)勢(shì)。最近已經(jīng)加以修飾而作為載體的其它腺病毒包括綿羊腺病毒287(29,53,56)、牛腺病毒第3型(40,60)和犬腺病毒(30)?？紤]到這些可替換的血清型，將提供一種全新的載體骨架，它在靶宿主中沒(méi)有預(yù)先存在的免疫反應(yīng)，而且，因?yàn)橄俨《镜膹?fù)制性能具有嚴(yán)格的物種特異性(50)，所以通過(guò)使用衍生自親緣關(guān)系遙遠(yuǎn)的腺病毒物種的載體，可獲得一定程度的安全性以防不適當(dāng)?shù)妮d體復(fù)制。
有幾方面的理由尋求這些可替換的病毒亞型。這些病毒，就其在非人類(lèi)宿主上的疫苗應(yīng)用而言，如果適當(dāng)?shù)丶右孕揎?，可激發(fā)出比以人類(lèi)腺病毒為基礎(chǔ)的載體更有效的免疫應(yīng)答。再者，可預(yù)期有復(fù)制能力的病毒將產(chǎn)生更強(qiáng)免疫應(yīng)答；因此在可允許部分或完全復(fù)制的宿主中載體最有效。以人類(lèi)腺病毒為基礎(chǔ)的載體，在幾乎所有的非人類(lèi)宿主中均不會(huì)如此。
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種可替換的腺病毒載體，其作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體和疫苗使用。
為解決本發(fā)明的問(wèn)題，已經(jīng)挑選鳥(niǎo)類(lèi)腺病毒CELO來(lái)加以修飾。1957年CELO(雞胚致死孤兒病毒或禽腺病毒第1型，在39中回顧)被定性為傳染原(57)。CELO病毒的感染少有嚴(yán)重危害健康或經(jīng)濟(jì)的后果?？蓮慕】档碾u群中分離出CELO，且通常實(shí)驗(yàn)性地再導(dǎo)入雞群不會(huì)引起疾病(10)。
CELO病毒在結(jié)構(gòu)上與哺乳動(dòng)物腺病毒(哺乳動(dòng)物腺病毒屬)類(lèi)似，具有70-80nm的二十面體衣殼，該衣殼由六鄰體和五鄰體結(jié)構(gòu)所構(gòu)成(33)；該CELO病毒基因組為一種線(xiàn)形雙鏈DNA分子，該DNA被病毒編碼的核心蛋白聚集在病毒粒子中(33,36)。CELO病毒的基因組比Ad5的更大(44kb約36kb，參考文獻(xiàn)6,WO 97/40180)。CELO病毒粒子在每個(gè)頂點(diǎn)具有兩根不同長(zhǎng)度的纖維(24,33,35)，而大部分其他血清型只有單根纖維(在50中回顧)。CELO病毒不能夠互補(bǔ)Ad5的E1A功能，而且CELO病毒的復(fù)制無(wú)法由Ad5的E1活性促進(jìn)(37)。CELO的完整DNA序列(6,WO 97/40180)顯示出CELO病毒與哺乳動(dòng)物腺病毒屬之間的額外差異，包括缺少與Ad5早期區(qū)域E1A、E1B、E3和E4相對(duì)應(yīng)的序列。CELO基因組包含左末端約5kb的序列和右末端12kb的序列，富含開(kāi)放閱讀框，該框不含與Ad5同源的序列，但很可能編碼該病毒的早期功能。
在將CELO發(fā)展成基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體時(shí)，已經(jīng)考慮到該病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中為天然缺陷的，該特性應(yīng)該限制了與野生型哺乳動(dòng)物腺病毒互補(bǔ)的可能性。CELO病毒粒子比Ad5的病毒粒子具有增加了的DNA包裝能力和高得多的物理穩(wěn)定性。CELO的一個(gè)實(shí)用特性為能夠使該病毒在雞胚中生長(zhǎng)，這是一種低成本、極方便的體系(9,33)。
在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)研究過(guò)CELO的邊界序列，即CELO基因組最左邊的5kb和最右邊的13kb，大部分是未經(jīng)勘察的而且不常見(jiàn)于其他腺病毒。已經(jīng)應(yīng)用病毒遺傳學(xué)以確定在病毒復(fù)制時(shí)這些左末端和右末端CELO序列的必要特征。為了確認(rèn)這些區(qū)域?qū)τ趶?fù)制是必要或不必要的，已經(jīng)在不連續(xù)的步驟中缺失了這些病毒序列。為便于監(jiān)視突變種的復(fù)制，在被缺失的序列位置插入螢光素酶表達(dá)盒。經(jīng)過(guò)修飾的CELO基因組利用在大腸桿菌中的同源重組作用改造成細(xì)菌質(zhì)粒(5)。接著，病毒基因組通過(guò)酶消化作用從質(zhì)粒骨架上釋放出來(lái)之后，轉(zhuǎn)染到一種支持野生型CELO復(fù)制的雞細(xì)胞系中。通過(guò)優(yōu)化聚乙烯亞胺(PEI)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法來(lái)促進(jìn)病毒DNA大分子(大約50kb)的轉(zhuǎn)染(1,3)。此外，對(duì)于所有的突變，利用一種帶有突變種中已缺失的CELO序列的質(zhì)粒進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染，以判定是否該突變是可以互補(bǔ)的。觀(guān)察以初始轉(zhuǎn)染物的裂解物處理過(guò)的細(xì)胞中螢光素酶的產(chǎn)生使我們能夠判定是否已經(jīng)發(fā)生了病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)導(dǎo)病毒顆粒的生產(chǎn)。使用這些策略來(lái)判定左邊和右邊邊界序列的必要部分。像預(yù)期的一樣，有些序列是順式中所需要的，它們可能包含組裝信號(hào)、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或其他轉(zhuǎn)錄信號(hào)。
本發(fā)明涉及重組CELO病毒和CELO病毒DNA，它們的跨CELO野生型病毒基因組核苷酸41731-43684的區(qū)域被完全或部分缺失和/或在該區(qū)域含有插入序列。
已經(jīng)將該CELO病毒(DNA)及其衍生物分別命名為CELO AIM46或CELO AIM46衍生物。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在核苷酸41523-43684區(qū)域內(nèi)完全或部分缺失和/或有插入的CELO AIM46衍生物。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在核苷酸41002-43684區(qū)域內(nèi)完全或部分缺失和/或有插入的CELO AIM46衍生物。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及在核苷酸40065-43684區(qū)域內(nèi)完全或部分缺失和/或插入的CELO AIM46衍生物。
優(yōu)選地，完全缺失以上所限定的區(qū)域以便提供更多空間在該缺失部位插入外來(lái)的DNA。
本發(fā)明的經(jīng)過(guò)修飾的病毒，衍生自CELO病毒，在基因組右末端含有缺失和/或插入，具有復(fù)制能力并可攜帶比野生型基因組至少多3.2kb的DNA。
更特別地，本發(fā)明的CELO病毒和CELO病毒DNA攜帶一處野生型CELO序列的缺失供CELO病毒基因組中外來(lái)基因的一種表達(dá)盒的插入，該缺失跨越的區(qū)域大約從核苷酸40,000到病毒基因組右末端的大約200 bp以?xún)?nèi)?？赡鼙煌耆虿糠秩笔Щ驍嗔训膮^(qū)域因此被限定為由最后三個(gè)向右的開(kāi)放閱讀框編碼的99個(gè)以上氨基酸殘基的肽，而正常存在于病毒基因組最后100-200bp內(nèi)的病毒的末端重復(fù)功能仍維持連續(xù)。此外，本發(fā)明的CELO病毒和CELO病毒DNA視需要可在由CELO dUTPase(794-1330)的開(kāi)放閱讀框限定的區(qū)域內(nèi)有一處缺失。
在本發(fā)明所用的CELO核苷酸序列編號(hào)衍生自參考文獻(xiàn)6,WO97/40180，和GenBank U46933，其中描述了野生型CELO病毒基因組的序列。
由于上述所定義的CELO AIM46及其衍生物允許大片段外來(lái)DNA的插入，所以它們可用作生產(chǎn)CELO病毒載體的起始物。
人們驚奇地發(fā)現(xiàn)CELO AIM46可容忍3.3kb的插入序列而不損害病毒的生長(zhǎng)，藉此可預(yù)期大到約10kb的更大DNA的插入序列也可被該病毒接受?？捎杉夹g(shù)人員在常規(guī)實(shí)驗(yàn)中逐漸增加插入序列的大小并判定病毒的生長(zhǎng)參數(shù)從而能夠輕易地測(cè)試最大片段的限制，就像在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中一樣。
除了允許一種基因表達(dá)盒的插入之外，本發(fā)明的重組CELO病毒已經(jīng)顯示能夠在LMH細(xì)胞和雞胚中復(fù)制，而無(wú)互補(bǔ)作用。
本發(fā)明的重組CELO病毒的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它所產(chǎn)生的病毒數(shù)量可與野生型CELO相比擬。還有，發(fā)現(xiàn)AIM46載體轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的能力可與Ad5載體相比擬，證實(shí)CELO載體的有效哺乳動(dòng)物細(xì)胞受體結(jié)合能力和/或進(jìn)入活性。
由于CELO AIM46的41731-43684缺失，僅移走從核苷酸41002開(kāi)始的開(kāi)放閱讀框的一部分，整個(gè)的ORF應(yīng)該是可有可無(wú)的因此可將其缺失。因此，該缺失可包括從核苷酸41002-43684的序列。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將目的基因插入缺失區(qū)域以外的其它基因組位置，所指缺失位置分別從核苷酸41731-43684、41523-43684、41002-43684或40065-43684；在該情況下，載體還可另外提供空間以插入其它外來(lái)的遺傳物質(zhì)。任何證實(shí)為可有可無(wú)的區(qū)域均可選擇，插入外來(lái)DNA的一個(gè)優(yōu)選區(qū)域是在dUTPase開(kāi)放閱讀框(核苷酸794-1330)。
本發(fā)明所指的病毒生長(zhǎng)至野生型水平并形成一種有復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)力的疫苗株系的基礎(chǔ)。CELO AIM46還用于開(kāi)始進(jìn)行CELO細(xì)胞有關(guān)物種和細(xì)胞類(lèi)型向性的分析，獲得該載體開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面的重要信息。CELO AIM46及其包括額外修飾的衍生物，可用于轉(zhuǎn)運(yùn)基因到鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞中，該轉(zhuǎn)運(yùn)的效率比帶有相同標(biāo)記基因的Ad5載體的效率好10-100倍。驚人的是，許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型，例如人類(lèi)、牛、馬、猴、鼠、狗中，CELO AIM46的功能效率可與Ad5載體相比擬，證實(shí)了CELO載體在哺乳動(dòng)物基因運(yùn)送應(yīng)用上的效用。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及重組CELO AIM46病毒及其衍生物的制備。
為了制備重組CELO病毒，CELO病毒DNA被導(dǎo)入支持CELO病毒復(fù)制的細(xì)胞?？墒褂萌魏螛?biāo)準(zhǔn)的基因轉(zhuǎn)移方法以導(dǎo)入DNA，例如轉(zhuǎn)染、顯微注射，等等。優(yōu)選地，病毒DNA通過(guò)聚乙烯亞胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染途徑被導(dǎo)入細(xì)胞中，如同(3)所描述。
支持CELO病毒復(fù)制并因此用于CELO病毒生產(chǎn)的細(xì)胞，可選自永生化細(xì)胞系如LMH(27)或選自原代鳥(niǎo)胚細(xì)胞，特別是腎或肝細(xì)胞。要確認(rèn)有用的細(xì)胞系，可測(cè)試細(xì)胞的傳染能力和擴(kuò)增病毒接種物的能力。
換言之，重組CELO病毒可通過(guò)將CELO病毒導(dǎo)入雞胚來(lái)制備，優(yōu)選地先以CELO病毒DNA轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞，并將該細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，以產(chǎn)生足夠的病毒量供雞胚注射并在其中擴(kuò)增該病毒。
為了制備重組CELO病毒，首先確認(rèn)對(duì)病毒復(fù)制可有可無(wú)的區(qū)域。為此，在質(zhì)粒上克隆CELO基因組的亞片段，該片段大到足以促進(jìn)CELO基因組的重建(例如1,000-15,000bp)并且小到具有至少一個(gè)，優(yōu)選地5-10個(gè)特有的限制位點(diǎn)。所克隆的質(zhì)粒經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)限制酶消化處理，缺失CELO基因組的各個(gè)片段，并在相應(yīng)位置插入報(bào)告基因構(gòu)建體。然后使用標(biāo)準(zhǔn)的連接或重組方法，將這一經(jīng)過(guò)處理的片段插入完整的CELO基因組中，例如細(xì)菌質(zhì)粒中，代替相對(duì)應(yīng)的野生型片段。然后通過(guò)限制消化作用使經(jīng)過(guò)修飾的CELO基因組從質(zhì)粒主鏈中釋放出來(lái)，并導(dǎo)入支持CELO病毒復(fù)制的細(xì)胞內(nèi)，如

圖1示例。
在CELO AIM46的案例中，亞片段含有從核苷酸1-5503和30502-30644和40064-43804的CELO序列。缺失41731-43684的EcoRV片段代之以一種表達(dá)盒，例如螢光素酶表達(dá)盒，以產(chǎn)生pAIM44。以HpaⅠ將其線(xiàn)性化，與野生型CELO DNA重組以產(chǎn)生pAIM46。通過(guò)SpeⅠ消化作用從質(zhì)粒上切下CELO序列，并導(dǎo)入LMH細(xì)胞中，開(kāi)始病毒的復(fù)制。
另外，重組可在支持病毒復(fù)制的鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行，例如LMH細(xì)胞，通過(guò)導(dǎo)入含有用第二個(gè)CELO片段缺失/插入的經(jīng)過(guò)修飾的CELO亞片段，使得在兩個(gè)片段之間有部分重疊的同源性，從而能重組出帶有所需缺失/插入的全長(zhǎng)CELO基因組。
在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)確認(rèn)病毒復(fù)制所必需的CELO基因組區(qū)域。最重要的是，已經(jīng)確認(rèn)病毒基因組左末端的一個(gè)可以缺失并以反式提供的區(qū)域。因此該區(qū)域可用來(lái)建立一種互補(bǔ)的細(xì)胞株。還有，已經(jīng)確認(rèn)該基因組右末端的一個(gè)區(qū)域可以缺失而對(duì)于病毒在細(xì)胞培養(yǎng)或是在胚胎中的復(fù)制并無(wú)可察覺(jué)的影響。已經(jīng)顯示在該區(qū)域可插入外來(lái)基因的表達(dá)盒。已經(jīng)證實(shí)CELO載體能夠組裝成比野生型基因組的大小再多3.2kb的DNA序列，該野生型基因組已經(jīng)比Ad5載體大8kb。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出帶有螢光素酶表達(dá)盒或EGFP表達(dá)盒的有復(fù)制能力的CELO載體。這些載體轉(zhuǎn)導(dǎo)各種鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型的能力被監(jiān)視。如同預(yù)期的，CELO載體在鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞中工作得比Ad5載體好很多。然而，對(duì)測(cè)試過(guò)的所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型中，CELO載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率意外地可與Ad5載體相比擬。
本發(fā)明的載體在鳥(niǎo)類(lèi)中作為疫苗應(yīng)用，其中病毒的復(fù)制可激發(fā)免疫應(yīng)答。病毒能夠在廉價(jià)的雞胚中繁殖的能力，有助于為這些用途中的任何一種產(chǎn)生大量的載體。
關(guān)于疫苗的應(yīng)用，外來(lái)DNA編碼一種或多種抗原，它們?cè)趥€(gè)體中誘發(fā)免疫應(yīng)答。該抗原可以是衍生自病原體的天然蛋白質(zhì)，或是其免疫原性的片段，例如免疫原性肽。
為驅(qū)動(dòng)該外來(lái)基因的表達(dá)，可使用表達(dá)盒，它通常包含一個(gè)在靶細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子、目的cDNA、一種多聚腺苷酸化信號(hào)以及一個(gè)可選的內(nèi)含子。另外，插入修飾過(guò)的CELO基因組內(nèi)的DNA可包括內(nèi)源性CELO啟動(dòng)子、內(nèi)含子和多聚腺苷酸化信號(hào)，來(lái)驅(qū)動(dòng)目的cDNA表達(dá)。
可通過(guò)常規(guī)方法制備的有效表達(dá)盒的一個(gè)實(shí)例，是在本發(fā)明實(shí)施例12中描述的構(gòu)建體，其衍生自命名為PPM7的質(zhì)粒。它含有巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，接著是帶有PacⅠ、HpaⅠ和KpnⅠ位點(diǎn)的短的多聚連接子，接著是一種兔子β球蛋白內(nèi)含子/聚腺苷酸化信號(hào)。該CMV/β-球蛋白物質(zhì)可衍生自本領(lǐng)域中已有的質(zhì)粒(例如質(zhì)粒pLuc(74)，它帶有螢光素酶基因)，通過(guò)PCR修飾加入側(cè)翼限制位點(diǎn)，例如BamH1，隨后通過(guò)同源重組修飾作用，以PacⅠ/HpaⅠ/KpnⅠ多聚連接子代替螢光素酶cDNA?？蓪⒆詈蟮腂amHⅠ表達(dá)盒克隆到pSP65中以產(chǎn)生pPM7。使用特有的限制位點(diǎn)(PacⅠ/HpaⅠ/KpnⅠ)，將欲克隆到CELO AIM46衍生物中的cDNA先克隆到pPM7內(nèi)。接著制備含有CMV啟動(dòng)子/cDNA/β-球蛋白單元的限制或PCR片段，例如BamHⅠ片段，其通過(guò)同源重組導(dǎo)入被PacⅠ線(xiàn)性化的pAIM46。CMV和β球蛋白序列為重組提供了同源性，因此可利用目的新cDNA代替螢光素酶cDNA。
可修飾上述的表達(dá)盒，例如通過(guò)使用各種其他的病毒或細(xì)胞啟動(dòng)子，包括但不限于SV40增強(qiáng)子啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(RSVLTR)、人類(lèi)β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、CELO病毒主要晚期啟動(dòng)子、腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、大鼠胰島素啟動(dòng)子等，來(lái)代替CMV增強(qiáng)子/啟動(dòng)子。
另外，對(duì)于兔子β-球蛋白內(nèi)含子/多聚腺苷酸化信號(hào)，可包括但不限于得自SV40、得自其他病毒和得自其他細(xì)胞基因的內(nèi)含子/多聚腺苷酸化信號(hào)。
另外，關(guān)于使用表達(dá)盒，外來(lái)的cDNA可以是在一段限定的CELOAIM46區(qū)域或脫氧UTP酶區(qū)域內(nèi)的一處簡(jiǎn)單插入，因此使用內(nèi)源性的CELO調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、內(nèi)含子、多聚腺苷酸化信號(hào)。
在欲從CELO載體中表達(dá)兩種不同的外來(lái)cDNA的情況下，例如編碼得自一種病原體的兩種不同抗原的cDNA，可以使用下列策略在第一個(gè)實(shí)施例中，可將兩個(gè)基因表達(dá)盒(帶有不同的cDNA和不同的調(diào)節(jié)序列)插入CELO基因組中。另外，亦可使用一處內(nèi)部的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，從而用單一的啟動(dòng)子，提供兩種cDNA的表達(dá)，如同例如70；67；71；72所述。因此，用于CELO AIM46的、帶有兩種待表達(dá)的cDNA的代表性表達(dá)盒，包括一個(gè)啟動(dòng)子、第一條cDNA、一處IRES和第二條cDNA，隨后是可選的一個(gè)內(nèi)含子和一種多聚腺苷酸化信號(hào)。
外來(lái)的cDNA，例如抗原cDNA，可利用標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)從病原體的基因組中分離，例如通過(guò)PCR或限制消化作用，可選地包括反轉(zhuǎn)錄作用，將RNA轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA，并導(dǎo)入一種帶有調(diào)節(jié)序列和特有限制位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體內(nèi)，例如pPM7。隨后，在帶有CELO基因組，并具有同樣調(diào)節(jié)序列和相應(yīng)的限制位點(diǎn)的線(xiàn)狀質(zhì)粒，例如質(zhì)粒pAIM46中，重組該抗原表達(dá)盒。所產(chǎn)生的帶有該抗原cDNA的CELO-AIM46載體可以生長(zhǎng)于雞胚并從雞胚中純化。
在WO 97/40180中提供了適用于疫苗應(yīng)用的抗原的實(shí)例，在此全文引用作為參考。
可由疫苗病毒攜帶的抗原的更多實(shí)例有，傳染性腔上囊病病毒(IBDV；64)的抗原和雞球蟲(chóng)的抗原，例如堆型艾美蟲(chóng)(Eimeria acervulina)、波氏艾美蟲(chóng)(Eimeria brunetti)、巨型艾美蟲(chóng)(Eimeria maxima)、和緩艾美蟲(chóng)(Eimeriamitis)、尼氏艾美蟲(chóng)(Eimeria necatrix)、塞前艾美蟲(chóng)(Eimeria praecox)和禽艾美蟲(chóng)(Eimeria tenella)(61,62,63)，抗原的實(shí)例為寄生蟲(chóng)折射體轉(zhuǎn)氫酶、乳酸脫氫酶、EalA和EaSC2(在77中回顧)。
還有些抗原實(shí)例為豬病原體豬α皰疹病毒1型的糖蛋白C(gC，糖蛋白gⅢ)(假性狂犬(Aujeszky′s)病的致病原)(75；76；69)?？墒褂脭y帶gC的CELOAIM46載體，在豬身上誘發(fā)抗-假性狂犬病的應(yīng)答。
如同上文提及的，使用具有復(fù)制競(jìng)爭(zhēng)力的病毒可預(yù)期到強(qiáng)有力的免疫應(yīng)答。因此，一種載體在部分或完全允許其復(fù)制的宿主中是最有用的。根據(jù)這點(diǎn)，本發(fā)明的CELO載體，即CELO AIM46及其衍生物，理論上適合于鳥(niǎo)類(lèi)疫苗的應(yīng)用。
本發(fā)明的重組CELO病毒載體，亦可用于人類(lèi)疫苗的應(yīng)用，在此情況下，外來(lái)的DNA編碼衍生自人類(lèi)病原體的抗原。
以根據(jù)本發(fā)明修飾過(guò)的CELO基因組為基礎(chǔ)的CELO載體，亦可用于哺乳動(dòng)物體系的基因轉(zhuǎn)移；用人類(lèi)腺病毒進(jìn)行人類(lèi)基因治療的經(jīng)驗(yàn)導(dǎo)致對(duì)非-人類(lèi)腺病毒還有爭(zhēng)論。預(yù)先存在的對(duì)人類(lèi)腺病毒免疫應(yīng)答，可損害基于人類(lèi)腺病毒的載體的起始轉(zhuǎn)導(dǎo)，或可能加重對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)?；颊呖赡苋狈?yīng)對(duì)來(lái)自遙遠(yuǎn)物種的腺病毒的免疫經(jīng)驗(yàn)(雖然2/7的患者具有犬腺病毒載體的中和抗體；30)，而宿主對(duì)病毒抗原的應(yīng)答將不會(huì)影響轉(zhuǎn)導(dǎo)的起始。除了某些農(nóng)業(yè)工作者之外，不能期望大部分的人群曾經(jīng)與CELO抗原有免疫接觸。因此CELO載體可能具有勝過(guò)基于較常見(jiàn)的人類(lèi)腺病毒血清型的載體的優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明以CELO為基礎(chǔ)的載體另一個(gè)概念上的優(yōu)點(diǎn)為，CELO就像牛、羊和犬的腺病毒一樣，在人類(lèi)細(xì)胞中是天然復(fù)制缺陷的。因此，在人類(lèi)患者中將不會(huì)出現(xiàn)這些載體的復(fù)制，即使存在野生型人類(lèi)腺病毒的感染也是如此。
再者，通過(guò)本發(fā)明的缺失分析，將促進(jìn)產(chǎn)生具有復(fù)制缺陷的CELO載體的能力。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)提供了構(gòu)建表達(dá)CELO互補(bǔ)功能的細(xì)胞株的基礎(chǔ)。
對(duì)于基因治療的應(yīng)用，外來(lái)DNA可包括任何一個(gè)或多個(gè)DNA分子，它們編碼具有治療活性的蛋白質(zhì)。實(shí)例是免疫調(diào)節(jié)蛋白，如細(xì)胞因子，受體、酶、影響凋亡的蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)，例如sFLT、FGF受體等等。對(duì)于腫瘤疫苗的應(yīng)用，外來(lái)DNA編碼一種或多種腫瘤抗原或其片段，優(yōu)選地與一種細(xì)胞因子組合。
在WO 97/40180中提供了人類(lèi)疫苗應(yīng)用、基因治療和腫瘤疫苗應(yīng)用的實(shí)例，在此全文引用作為參考。
對(duì)于疫苗的應(yīng)用，可將本發(fā)明的載體包裝成腸衣包被劑、或供肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)或皮下注射的注射劑。另外，該載體還可以膏藥劑或液體劑形式通過(guò)鼻腔內(nèi)或氣管內(nèi)給藥的方式使用，如氣溶膠或眼內(nèi)滴劑。該載體還可以合并至飼料顆粒內(nèi)或投放在飲用水中來(lái)提供。
導(dǎo)入每例患者、動(dòng)物或胚中的病毒量，可在1-1012個(gè)顆粒的范圍內(nèi)。
病毒制品可含有生理緩沖鹽水或HEPES緩沖鹽水，并可視需要混合以諸如維生素-E乙酸酯、油/水乳劑、氫氧化鋁、磷酸鋁或氧化鋁、礦物油乳劑，如Bayol或Marco152，和皂角苷之類(lèi)的佐劑。
還可使用凍干的病毒做為疫苗(78)。可通過(guò)受控的兩步干燥法包含如10％蔗糖等穩(wěn)定劑(78)。其他的穩(wěn)定劑包括碳水化合物，如山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖，蛋白質(zhì)，如白蛋白或酪蛋白，或其降解產(chǎn)物。
在疫苗應(yīng)用中，為了增強(qiáng)宿主的免疫應(yīng)答，通過(guò)帶有特定抗原的CELO疫苗載體的應(yīng)用所誘發(fā)的免疫應(yīng)答，可通過(guò)再次給予相同抗原或其免疫原性片段來(lái)加強(qiáng)。優(yōu)選地，再次給予的抗原是重組的，可利用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得，或通過(guò)下文所述的方法，使用CELO載體從胚中獲得重組蛋白。載體與抗原的組合應(yīng)用可按照(65,73)的描述完成。優(yōu)選先給予CELO載體，再視需要與免疫刺激佐劑一起給予重組的抗原。
在本發(fā)明的另一方面中，使用CELO病毒來(lái)制備任何目的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的這一實(shí)施例中，以基因工程改造CELO病毒，例如CELOAIM46或其衍生物，如上所述，將編碼目的蛋白質(zhì)的cDNA或優(yōu)選表達(dá)盒，導(dǎo)入本發(fā)明的重組CELO DNA的插入位點(diǎn)之一。病毒可通過(guò)在適當(dāng)細(xì)胞中的復(fù)制而獲得，如上所述，重組病毒優(yōu)選通過(guò)注射入雞胚的尿囊腔中而導(dǎo)入。優(yōu)選地，將大約4×107個(gè)病毒顆粒導(dǎo)入7-9日齡的雞胚尿囊腔中，接著在37℃下培養(yǎng)3-4天。然后從尿囊液、血清、卵黃、羊水中，或從胚胎本身中回收重組的物質(zhì)。
目的蛋白質(zhì)可以是細(xì)胞內(nèi)的或分泌性的蛋白質(zhì)。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中(實(shí)施例11)為報(bào)告蛋白eGFP，該蛋白質(zhì)可通過(guò)裂解尿囊液中堆積的感染細(xì)胞來(lái)回收。對(duì)于分泌性的蛋白質(zhì)，可從胚胎的各種細(xì)胞外液(尿囊液、羊水、血清、卵黃)中回收該物質(zhì)，或使用類(lèi)似回收細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的方法，通過(guò)裂解感染的細(xì)胞來(lái)回收。
在一優(yōu)選的實(shí)施例中，目的蛋白質(zhì)表達(dá)成融合蛋白，其包括該蛋白質(zhì)以及作為穩(wěn)定序列的免疫球蛋白Fc區(qū)。該重組蛋白的分泌可由該蛋白質(zhì)的天然信號(hào)序列指導(dǎo)，該序列除了信號(hào)功能之外，還具有穩(wěn)定作用。Fc區(qū)在細(xì)胞外空間中賦予該蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并提供一種蛋白質(zhì)序列，該序列可用于利用例如蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)A/G層析樹(shù)脂進(jìn)行的重組蛋白的親和純化。包括起穩(wěn)定作用的Fc區(qū)并因此可由CELO表達(dá)的構(gòu)建體已用于制造可溶形式的FGF受體2(sFGFr；66)和VEGF受體1(sFLT；68)。
除了FLT和FGF受體的信號(hào)序列之外，亦可使用來(lái)自或與卵清蛋白、伴清蛋白、抗生物素蛋白和溶菌酶融合的信號(hào)序列。這些蛋白質(zhì)在雞的肝臟和/或輸卵管中合成，并在蛋中積累。因此，這些與目的蛋白融合的蛋白質(zhì)，利用其一部分或全部的密碼序列，可預(yù)期產(chǎn)生分泌性重組蛋白，它們?cè)诎l(fā)育的胚胎中是穩(wěn)定的；此外，使用這類(lèi)序列，例如抗生物素蛋白，提供了有利于層析純化的標(biāo)簽。
圖9 CELO右末端突變的分析；圖9，上圖開(kāi)放閱讀框；圖9，下圖復(fù)制的分析；圖10 CELO AIM46對(duì)于不同動(dòng)物種的向性；圖11利用CELO AIM46衍生物制備重組的GFP；圖12利用CELO AIM46衍生物制備可溶性Fc-穩(wěn)定的重組蛋白；除非另外說(shuō)明，在實(shí)施例中使用下列材料和方法a) CELO基因組的末端片段的克隆克隆CELO的兩個(gè)末端HindⅢ片段。以HindⅢ消化CELO基因組DNA(經(jīng)CsCl純化)，1601bp的左末端片段和959bp的右末端片段從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中純化出來(lái)。用磷酸二酯鍵將腺病毒基因組的5′末端與病毒末端蛋白質(zhì)上的絲氨酸殘基連接(22,47)。必須去除蛋白酶消化之后遺留下的肽以便允許連接和克隆。因此，該末端肽通過(guò)加入NaOH至0.3N并加熱至37℃90分鐘，從DNA片段中去除(22)。然后將該溶液冷卻至室溫，加入Tris pH7.4至0.1M，并加入HCl至0.3M，以中和NaOH。將該片段加熱至56℃20分鐘，并緩慢地冷卻至室溫(1小時(shí))以促進(jìn)重新退火。然后純化該DNA(Qiaquick柱，Qiagen)，加入SpeⅠ連接子(New England Biolabs目錄第1085號(hào))，并在被破壞的EcoRⅠ位點(diǎn)含有SpeⅠ位點(diǎn)(參見(jiàn)圖1A)的pBR327(GenBankL08856，參考文獻(xiàn)51)衍生物中，經(jīng)由SpeⅠ和HindⅢ位點(diǎn)克隆入每個(gè)片段。左末端和右末端的HindⅢ片段都以該方式克隆并進(jìn)行DNA序列分析，證實(shí)每個(gè)片段均具有300bp端。
接著，在含有一個(gè)SpeⅠ位點(diǎn)、一個(gè)被破壞的EcoRⅠ位點(diǎn)和一個(gè)ClaⅠ/BamHⅠ切除的pBR327衍生物中克隆入上述兩個(gè)CELO末端片段以去除第二個(gè)HindⅢ位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒pWü-H35(參見(jiàn)圖1A)。b)克隆整個(gè)CELO基因組將以HindⅢ線(xiàn)性化、以堿性磷酸酶處理的pWü-H35載體與純化的CELO病毒DNA混合，并導(dǎo)入電穿孔誘導(dǎo)的感受態(tài)大腸桿菌JC8679(17,42)。在pWü-H35上的CELO末端序列與CELO基因組DNA的末端之間進(jìn)行重組，產(chǎn)生含有全長(zhǎng)CELO基因組的質(zhì)粒(pCELO)，其側(cè)面具有SpeⅠ位點(diǎn)(圖1B)。c)CELO基因組左末端的修飾含有巨細(xì)胞病毒立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子、螢光素酶cDNA(14)，接著是兔子β球蛋白內(nèi)含子/多聚腺苷酸化信號(hào)的螢光素酶表達(dá)盒，衍生自pCLuc(45)，經(jīng)過(guò)PCR修飾在側(cè)翼加入BamHⅠ位點(diǎn)并克隆到pBlueScriptⅡ(SK)內(nèi)，產(chǎn)生pBlueLuc。對(duì)于大部分的CELO插入序列而言，螢光素酶表達(dá)盒經(jīng)BamHⅠ消化從pBlueLuc中分離出來(lái)，并以Klenow酶處理將其末端鈍化。
左末端CELO區(qū)域的修飾使用pAMI3進(jìn)行，它在pBR327骨架上含有CELO左末端(核苷酸1-5501)和一部分右末端(核苷酸30500-30639，以及核苷酸40065-43804；通過(guò)從pWüHpa中去除一個(gè)Asp718片段而衍生出來(lái))。CELO基因組中的這種缺失，涉及在pAIM3的CELO左末端序列中兩個(gè)酶位置處消化，亞區(qū)域的切除，接著是螢光素酶表達(dá)盒的插入。所有操作均通過(guò)限制性分析和序列分析證實(shí)。該策略被用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAIM7、16、22、23和24(參見(jiàn)表1)。CELO核苷酸序列的編號(hào)是衍生自參考文獻(xiàn)6和GenBankU46933。d)重組CELO基因組的產(chǎn)生使用Asp718和HpaⅠ通過(guò)雙重消化作用，將質(zhì)粒pAIM7、16、22、23和24線(xiàn)性化，并通過(guò)同源重組在大腸桿菌BJ5183中與純化的CELO DNA重組(5,13)，產(chǎn)生CELO基因組質(zhì)粒pAIM11、21、25、26和27。圖1C和表1解釋了所應(yīng)用的技術(shù)圖1C顯示經(jīng)過(guò)修飾的CELO基因組的克隆。步驟1轉(zhuǎn)運(yùn)載體的制備是使用標(biāo)準(zhǔn)連接克隆法處理CELO基因組如pWü-H35(帶有CELO的末端HindⅢ片段)或pWüHpa(帶有CELO的末端HpaⅠ片段)的亞片段，以缺失部分CELO基因組并插入一個(gè)螢光素酶表達(dá)盒。步驟2將線(xiàn)性化的轉(zhuǎn)運(yùn)載體與野生型CELO基因組DNA重組。重組以?xún)煞N方式發(fā)生，或者包括缺失/螢光素酶表達(dá)盒，或者排除缺失/螢光素酶表達(dá)盒，以產(chǎn)生野生型CELO質(zhì)粒。通過(guò)限制酶消化和測(cè)序來(lái)確認(rèn)帝有所需突變的質(zhì)粒，并用于啟始病毒的感染。(測(cè)序所有構(gòu)建體的缺失區(qū)域以確認(rèn)該構(gòu)建體；參見(jiàn)表1)。e)CELO基因組右末端的修飾使用類(lèi)似上述那些方法，產(chǎn)生含CELO左、右HpaⅠ片段的質(zhì)粒，并處理以插入螢光素酶表達(dá)盒，并從33358-43684(pAIM43)或41731-43684(pAIM44)中去除EcoRV片段。這些質(zhì)粒在特有的HpaⅠ位點(diǎn)處線(xiàn)性化，并在BJ5183細(xì)胞中與野生型CELODNA重組，產(chǎn)生pAIM45或pAIM46。f)對(duì)LMH細(xì)胞中重組CELO基因組的評(píng)估和病毒母液的制備以SpeⅠ消化重組CELO質(zhì)粒，從該質(zhì)粒中釋放出病毒基因組，以酚、氯仿提取，然后通過(guò)以TE平衡的凝膠過(guò)濾(Pharmacia Nick Column)純化。
使用改良的PEI技術(shù)制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物(1,3)。通過(guò)以下兩個(gè)步驟用PEI濃縮DNA將分子量2000的PEI(2.5μL 10mM PEI在125μL HBS(150mMNaCl、20mM HEPES,pH7.4)中)逐滴加至以125μL HBS稀釋的3μg DNA中。樣品在室溫下孵育20分鐘。接著將分子量25000的PEI(3.5μL 10mM在125μL HBS中)逐滴加至樣品中，并在室溫下再孵育該復(fù)合物20分鐘。
將雄性來(lái)亨雞肝癌(LMH)細(xì)胞(27)在轉(zhuǎn)染前一天接種在24孔板上(24孔板)，7×104個(gè)細(xì)胞/孔。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)基以400μL補(bǔ)充有10μg/ml多粘菌素B的DMEM(無(wú)血清)代替。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物(90μL/孔)加至細(xì)胞中，37℃4小時(shí)，隨后將該培養(yǎng)基替換為新鮮的、含有血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞裂解液中螢光素酶的活性監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
為測(cè)試病毒的擴(kuò)增作用，按下述制備澄清的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞裂解液。收獲細(xì)胞和上清液，離心收集細(xì)胞，并將細(xì)胞團(tuán)重新懸浮于2ml處理過(guò)的上清液中。將該物質(zhì)凍融3次，在超聲波震蕩浴中震蕩以釋放出病毒顆粒，細(xì)胞碎片通過(guò)離心去除，澄清的裂解液用于在新鮮的LMH細(xì)胞培養(yǎng)基上進(jìn)一步擴(kuò)增。按前述用CsCl梯度進(jìn)行CELO的純化(9)。病毒的定量以蛋白質(zhì)含量為基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)換系數(shù)為1mg/ml蛋白質(zhì)等于3.4×1012個(gè)病毒顆粒/ml(34)。g)表達(dá)CELO AIM46衍生物(CELO AIM53)的EGFP的構(gòu)建pAIM46中的螢光素酶cDNA以EGFP cDNA代替后產(chǎn)生pAIM53。該替換是通過(guò)大腸桿菌中pAIM46與pAIM52之間的同源重組作用完成的，其中pAIM46在螢光素酶cDNA特有的PacⅠ位點(diǎn)處線(xiàn)性化pAIM52是一種帶有EGFP cDNA的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，所述EGFP cDNA受控于在pAIM46的螢光素酶表達(dá)盒中使用的相同的CMV啟動(dòng)子和β-球蛋白內(nèi)含子，以及多聚腺苷酸化信號(hào)，因此提供重組的同源性。h)pPM7的構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pPM7含有巨細(xì)胞病毒立即早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，接著是帶有PacⅠ、HpaⅠ和KpnⅠ位點(diǎn)的短的多聚連接子，然后是兔子β-球蛋白內(nèi)含子/多聚腺苷酸化信號(hào)。它的獲得方法如下由pCLuc(74)產(chǎn)生CMV/β-球蛋白物質(zhì)，經(jīng)PCR修飾在側(cè)翼加入BamHⅠ，并通過(guò)同源重組作用修飾，以PacⅠ/HpaⅠ/KpnⅠ多聚連接子替換螢光素酶cDNA。將最后的BamHⅠ表達(dá)盒克隆到pSP65中產(chǎn)生pPM7。j)重組腺病毒5型的制備AdLuc經(jīng)由側(cè)面的BamHⅠ位點(diǎn)將螢光素酶表達(dá)盒克隆到pDElsp1B內(nèi)(2)，產(chǎn)生pDElsplBluc，其中螢光素酶cDNA具有與E1轉(zhuǎn)錄相同的方位。將pDElsplBLuc與pJM17(2)共同轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞(19)內(nèi)之后，通過(guò)重組作用，產(chǎn)生重組的病毒。轉(zhuǎn)染10天后，制備細(xì)胞裂解液，用于感染新鮮的293單層細(xì)胞，病毒從單個(gè)空斑中擴(kuò)增。使該物質(zhì)再通過(guò)2輪斑點(diǎn)純化、擴(kuò)增，經(jīng)CsCl梯度純化，并通過(guò)蛋白質(zhì)含量定量(1mg/ml蛋白質(zhì)=3.4×1012個(gè)病毒顆粒/ml；參考文獻(xiàn)34)從中制備此處所用的病毒母液。
AdGFP使用AseⅠ/Mlul從pEGFP-Cl(Clontech)中切下一個(gè)含有CMV啟動(dòng)子、EGFP編碼區(qū)和SV40 poly A序列的片段。利用Klenow技術(shù)填滿(mǎn)突出端，并克隆到pDElsp1B的EcoRV位點(diǎn)(2)內(nèi)，該質(zhì)粒中的EGFP表達(dá)盒與E1轉(zhuǎn)錄的方位相同。依上述通過(guò)與pJM17在293細(xì)胞中的重組作用，產(chǎn)生重組的病毒。k)病毒的熱穩(wěn)定性的分析在HBS中將CELO AIM46和AdLuc稀釋成4×109顆粒/100μL的濃度(甘油終濃度為2.4％(體積/體積))，并暴露在從48-68℃范圍的溫度下30分鐘。隨后，測(cè)試一等份病毒將螢光素酶活性轉(zhuǎn)導(dǎo)至A549或CEF38細(xì)胞中的能力。l)免疫熒光法將LMH細(xì)胞接種在包被著明膠的玻片(Labtek,Nunc)上，密度為105個(gè)細(xì)胞/室，并在第二天用CELO AIM46或野生型CELO病毒以500個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞的濃度在含有2％FCS的DMEM中感染。感染后在指定的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，將細(xì)胞在室溫下固定在冷甲醇∶丙酮(1∶1)中，通過(guò)如下的免疫熒光法觀(guān)察CELO蛋白質(zhì)非特異性的結(jié)合位點(diǎn)用PBS+1％BSA在室溫下1小時(shí)封閉。多克隆抗CELO抗體以PBS+1％BSA按1∶1000稀釋?zhuān)⒎跤?小時(shí)。隨后在室溫下以PBS沖洗3次，每次5分鐘，加入與FITC(1∶400稀釋)偶聯(lián)的山羊抗兔(Boehringer-Mannheim)檢測(cè)抗體的PBS+1％BSA溶液。再度沖洗玻片，在最后一次沖洗時(shí)加入DAPI使核呈現(xiàn)，將該玻片封固于MOWIOL上，進(jìn)行熒光顯微鏡檢查。m)抗-CELO病毒粒子多克隆血清的制備以100μg在完全弗氏佐劑中，經(jīng)CsCl純化、熱滅活(70℃,60分鐘)的CELO病毒粒子注射兔子，在2、4和5周時(shí)以100μg在不完全弗氏佐劑中的CELO加強(qiáng)免疫，隨后收集血清。蛋白質(zhì)分析證實(shí)此處所用的收集血清，與所有主要的CELO衣殼蛋白特異地反應(yīng)，但不與未感染的鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞的裂解物反應(yīng)。n)其它試劑如前所述(9)，從感染的雞胚中純化出野生型CELO(FAV-1,Phelps)(鳥(niǎo)類(lèi)腺病毒1型，雞胚致死孤兒病毒；CELO美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心ATCCVR-432；病毒株P(guān)helps；(57))。
LHM細(xì)胞系(27)獲自ATCC第CRL-2117號(hào)，A549細(xì)胞系也獲自ATCC第CCL-185號(hào)，而正常的人類(lèi)真皮成纖維細(xì)胞則獲自Clonetics，并于傳代5-15次之間使用。命名為CEF 38的雞胚成纖維細(xì)胞系，是根據(jù)已知的方法，從成纖維細(xì)胞中建立的；它允許CELO病毒進(jìn)入，但并不支持CELO復(fù)制。所有四種細(xì)胞類(lèi)型均在DMEM/10％FCS中培養(yǎng)。
293細(xì)胞系(19)獲自ATCC(第CRL-1573號(hào))，并培養(yǎng)在含有10％新生牛血清的MEMalpha中。
細(xì)胞系MA-104(恒河猴(Macaca mulatta)(恒河猴腎臟、胚胎、上皮))獲自ATCC(第CRL-2378號(hào))。
細(xì)胞系ED-2(馬，真皮成纖維細(xì)胞)獲自ATCC(第CCL-57號(hào))。
以下細(xì)胞系獲自BFAfV；Riems(Zellbank fur Zellinien in derVeterinarmedizin；BFAf.Viruskrankheiten derTiere,17498 Insel Riems)SPEV(豬，腎臟，胚胎，“verseniert”；目錄第8號(hào))；FLU-R(豬，肺，胎兒；目錄第113號(hào))；WSH-R(野豬，皮膚，胎兒；目錄第388號(hào))；KN-R1(牛，腎臟，胎兒；目錄第028號(hào))；KMU-R(牛，肌肉，胚胎；目錄第098號(hào))；KLU-R1(牛，肺，胚胎；目錄第091號(hào))。
圖2顯示對(duì)復(fù)制的分析。導(dǎo)入CELO基因組內(nèi)的缺失的核苷酸編號(hào)列在圖2的上圖和表2中。利用SpeⅠ將修飾過(guò)的CELO基因組線(xiàn)性化，以便從細(xì)菌質(zhì)粒中釋放出基因組，并單獨(dú)轉(zhuǎn)染到LMH細(xì)胞中，或在帶有野生型CELO序列1-5501的質(zhì)粒(pB5.5)的存在下(“加上左末端”)轉(zhuǎn)染LMH細(xì)胞。轉(zhuǎn)染5天后，收獲細(xì)胞，通過(guò)凍/融和超聲波震蕩將細(xì)胞裂解，細(xì)胞裂解液用于新鮮的LMH培養(yǎng)。該擴(kuò)增作用被重復(fù)兩次，并測(cè)試病毒第三次傳代的等份試樣將螢光素酶活性轉(zhuǎn)導(dǎo)至LMH細(xì)胞中的能力。三次轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差被標(biāo)出。
突變基因組的構(gòu)建首先去除整個(gè)區(qū)域(pAIM11)或缺失開(kāi)放閱讀框(pAIM21、25、26、27)的單個(gè)或一小組。當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入LMH細(xì)胞時(shí)，具有去除了整個(gè)區(qū)域的缺失的pAIM11，在第一次裂解液中螢光素酶是呈陽(yáng)性的，但是不能在后續(xù)的傳代中轉(zhuǎn)移熒光素酶的基因表達(dá)，不管是否有互補(bǔ)的左末端片段的存在。
更具個(gè)別性的突變(pAIM21)，僅中斷未知ORF中的三個(gè)，卻保留完整的dUTPase和REP樣ORF。然而，與pAIM11相似，pAIM21基因組亦不能在后續(xù)的傳代中轉(zhuǎn)移螢光素酶的基因表達(dá)，不管是否有互補(bǔ)的左末端片段的存在(圖2B)。因此，兩種突變作用改變的序列一定是以順式存在于病毒復(fù)制中。pAIM27僅缺失REP，而pAIM25和26缺失dUTPase、REP和一個(gè)未知的開(kāi)放閱讀框。這三個(gè)基因組均在第一次的裂解液中產(chǎn)生螢光素酶活性。后續(xù)的傳代顯示，CELO AIM25、26和27均不能在缺乏互補(bǔ)之下復(fù)制。然而，不像pAIM11和21，如果最初的轉(zhuǎn)染包含了互補(bǔ)的左末端質(zhì)粒，則觀(guān)察到可傳代的螢光素酶活性(圖2B)。這三種互補(bǔ)的病毒(CELO AIM25+、26+和27+)在LMH細(xì)胞中再傳代擴(kuò)增6次后，令人驚訝的是，其轉(zhuǎn)導(dǎo)螢光素酶活性的能力僅適度地下降(結(jié)果未顯示)。PCR和DNA分析顯示在傳代3次的物質(zhì)中，明顯地顯示了大量的野生型CELO，證實(shí)重組已經(jīng)發(fā)生，原始的突變中被缺失的序列被重新導(dǎo)入。因此，產(chǎn)生了大量的野生型CELO，并給帶有螢光素酶突變的CELO提供了互補(bǔ)功能。
總之，左末端序列的一個(gè)區(qū)域(在2981和4334之間)被確認(rèn)為是病毒以順式復(fù)制所必要的。第二個(gè)區(qū)域(在938和2900之間)被確認(rèn)為是病毒復(fù)制所必需的，但可反式提供。形式上，一連串的重組事件是有可能產(chǎn)生包含原來(lái)被缺失的序列和螢光素酶表達(dá)盒的病毒基因組，然而，該模式最簡(jiǎn)單的解釋是在pB5.5和突變CELO基因組之間發(fā)生了簡(jiǎn)單的重組，產(chǎn)生野生型CELO基因組，在后續(xù)的傳代中給該混合物中少量的突變(螢光素酶陽(yáng)性)病毒提供了互補(bǔ)活性。這些病毒基因組中，有一些含有超過(guò)野生型大小的凈插入序列，其中最大的含有1616bp的缺失與3.3kb螢光素酶表達(dá)盒的插入序列組合。因此，野生型的CELO，已經(jīng)比Ad5大8kb，可包裝至少另外1700bp的序列。
將pAIM45和pAIM46單獨(dú)轉(zhuǎn)染到LMH細(xì)胞內(nèi)，或與帶有野生型CELO右末端序列的質(zhì)粒(pB13.3)一起轉(zhuǎn)染。所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物中獲得螢光素酶活性，證實(shí)轉(zhuǎn)染的成功(結(jié)果未顯示)。該物質(zhì)在新鮮的LMH細(xì)胞上后續(xù)的傳代顯示，帶有大范圍右末端缺失的pAIM46，不能產(chǎn)生感染性CELO顆粒，無(wú)論是否有完整的右末端序列的存在(圖3)。不必驚訝，該大范圍缺失作用去除了必要的序列，而且很最可能其中一些必需以順式存在，如同通過(guò)野生型右末端序列的互補(bǔ)的缺乏所證明。相反，pAIM46基因組不管是否存在互補(bǔ)基因組片段，均發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生感染性和可傳代的病毒(圖3)。因此，pAIM46中兩個(gè)中斷的開(kāi)放閱讀框，對(duì)于CELO在細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和在雞胚中生長(zhǎng)，是可有可無(wú)的(參見(jiàn)實(shí)施例5)。
為證實(shí)pAIM46和CELO AIM46所攜帶的基因組的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了PCR分析以便證實(shí)質(zhì)粒中構(gòu)建的缺失/插入保留在擴(kuò)增過(guò)的CELO AIM46病毒的基因組中。
PCR所用的引物如下OAIM24:(CCGAGAATCCACCAATCGTA)是在CELO右末端(在核苷酸41699處)雜交的正義寡核苷酸鏈。
OAIM25:(CAGCGTGTCGCTATACGCAA)是在CELO右末端(在核苷酸43752處)雜交的反義寡核苷酸鏈。
OAIM26:(GCGATGACGAAATTCTTAGC)是在螢光素酶表達(dá)盒中雜交的正義寡核苷酸鏈。
使用引物OAIM24和25的PCR，以野生型CELO為模板應(yīng)產(chǎn)生一段2053bp的產(chǎn)物，以AIM46為模板應(yīng)產(chǎn)生一段3422bp的產(chǎn)物。使用引物OAIM24和26的PCR，以AIM46為模板應(yīng)產(chǎn)生一段958bp的產(chǎn)物，而以野生型CELO為模板則沒(méi)有產(chǎn)物產(chǎn)生。
野生型CELO與CELO AIM46的PCR分析結(jié)果顯示在圖4以M標(biāo)示的泳道標(biāo)記物DNA，(EcoRⅠ/HindⅢ切割的λDNA)；泳道2-6使用引物OAIM24+OAIM26，其中泳道2無(wú)關(guān)的目標(biāo)DNA；泳道3野生型CELO DNA；泳道4質(zhì)粒pAIM46 DNA；泳道5和6分離自CELOAIM46的DNA；泳道7-11使用引物OAIM24和OAIM26，其中泳道7無(wú)關(guān)的DNA；泳道8野生型CELO DNA；泳道9質(zhì)粒pAIM46 DNA；泳道10和11分離自CELO AIM46 DNA的DNA。一些標(biāo)記分子(左側(cè))和預(yù)期的PCR產(chǎn)物(右側(cè))標(biāo)示出DNA的大小(以bp計(jì))。
如圖4所示，質(zhì)粒pAIM46和分離自病毒CELO AIM46的DNA都產(chǎn)生預(yù)期的PCR產(chǎn)物?？缭饺笔?插入位點(diǎn)的引物產(chǎn)生的預(yù)測(cè)PCR產(chǎn)物為pAIM46目標(biāo)DNA(圖4，泳道4)和衍生自?xún)煞NCELO AIM46制品的DNA(圖4，泳道5和6)的產(chǎn)物為3422bp，而以野生型CELO DNA為模板的PCR，產(chǎn)生2039bp的預(yù)期DNA分子(圖4，泳道3)。再者，識(shí)別螢光素酶插入序列的引物產(chǎn)生的958bp預(yù)期產(chǎn)物，是來(lái)自pAIM46衍生的DNA或來(lái)自CELOAIM46的兩種分離物(圖4，泳道9-11)，而不是來(lái)自野生型CELO衍生的DNA(圖4，泳道8)。
將帶有螢光素酶表達(dá)盒的重組腺病毒5型(AdLuc)和CELO AIM45暴露在一種熱滴定下(從42-68℃暴露30分鐘)。隨后，測(cè)試每種樣品將螢光素酶活性轉(zhuǎn)移至人A549或鳥(niǎo)CEF細(xì)胞中的能力。圖6顯示免疫熒光測(cè)定法監(jiān)測(cè)野生型CELO與CELO AIM46的復(fù)制。用CELO AIM46(上排)或野生型CELO(下排)感染LMH培養(yǎng)物，500個(gè)顆粒/細(xì)胞。在感染后的指定時(shí)間點(diǎn)，固定細(xì)胞樣品，并通過(guò)免疫熒光法使用抗CELO病毒粒子的抗血清來(lái)監(jiān)測(cè)CELO病毒粒子蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
如以前對(duì)Ad5所證實(shí)，病毒衣殼，以及由此病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力對(duì)熱是敏感的(4,8,16)。人類(lèi)細(xì)胞的Ad5轉(zhuǎn)導(dǎo)，當(dāng)暴露在48℃下30分鐘時(shí)，會(huì)以超過(guò)100的系數(shù)下降，而在52℃和更高的溫度下會(huì)失活(圖6)。與之強(qiáng)烈對(duì)比的是，CELO AIM46的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力不受56℃加熱的影響，而且該病毒在暴露于60℃下30分鐘時(shí)，才開(kāi)始喪失活性(圖6)。發(fā)現(xiàn)野生型CELO的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用表現(xiàn)出類(lèi)似的熱穩(wěn)定性，表明在CELO AIM46中導(dǎo)入的改變，并未明顯地改變病毒粒子的穩(wěn)定性。
總之，發(fā)現(xiàn)CELO AIM46能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞，比人類(lèi)Ad5載體的效率高大約100倍。驚人的是，CELO AIM46也能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞類(lèi)型，其效率與基于Ad5的載體相當(dāng)。
將pAIM69和pAIM70單獨(dú)轉(zhuǎn)染至LMH細(xì)胞內(nèi)，或與帶有野生型CELO右末端序列的質(zhì)粒(pB13.3)一起轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解物中獲得螢光素酶活性，證實(shí)轉(zhuǎn)染的成功。在新鮮LMH細(xì)胞上的后續(xù)傳代顯示，AIM69和AIM70能夠在缺乏完整的右末端序列時(shí)，產(chǎn)生感染性CELO顆粒(圖9)。如同CELOAIM46所示，在pAIM69中兩個(gè)被破壞的開(kāi)放閱讀框因此對(duì)于CELO在細(xì)胞生長(zhǎng)是可有可無(wú)的。在AIM70中被破壞的另一個(gè)開(kāi)放閱讀框，顯然對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)也是可有可無(wú)的。
以每個(gè)細(xì)胞10,000、3,000、1,000、300、100、30或10個(gè)顆粒的量，使上文列舉的細(xì)胞類(lèi)型與AdLuc或CELO AIM46接觸(參見(jiàn)方法部分的24孔板操作)。所有細(xì)胞均培養(yǎng)在外加10％胎牛血清的Dulbecco′s改良型Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中(DMEM,2mM谷氨酰胺，100 IU青霉素，100μg/ml鏈霉素和10％(體積/體積)胎牛血清(FCS)，所有血清在56℃下60分鐘加熱滅活)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前，將細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)大約18小時(shí)，5×104個(gè)細(xì)胞/孔。轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，將培養(yǎng)基換成包含指定病毒顆粒的含有2％馬血清的DMEM(500μl/孔)。37℃下4小時(shí)之后，將培養(yǎng)基換成DMEM/10％FCS。感染24小時(shí)后，測(cè)定螢光素酶活性。在圖10a-10h中給出的值，代表三次轉(zhuǎn)導(dǎo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。依據(jù)上文先前的描述，進(jìn)行病毒的生長(zhǎng)、純化和定量(實(shí)施例7)。
表1CELO重組構(gòu)建中所使用的質(zhì)粒
luc*=螢光素酶表2含有CELO變體的質(zhì)粒
表3雞胚中CELO病毒的產(chǎn)量1
注釋1．將野生型CELO或CELO AIM46(100μl HBS含8×108個(gè)顆粒)注射至9日齡雞胚的尿囊腔中。37℃培養(yǎng)4天后，收集尿囊液，并依前述通過(guò)CsCl密度梯度純化病毒(9)。2．病毒的產(chǎn)量按經(jīng)過(guò)純化的病毒蛋白質(zhì)來(lái)表示。蛋白質(zhì)的測(cè)定按Bradford測(cè)定法使用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行。
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Parasitol)7卷；28(7)；1121-3078．Talsma H.,et al.,1997，國(guó)際制藥學(xué)雜志(Int.J.of Pharmaceutics)157,233-238序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)者(A)姓名Boehringer Ingelheim International GmbH(B)街道Binger Strasse 173(C)城市Ingelheim am Rhein(D)國(guó)家德國(guó)(Germany)(F)郵政編碼(ZIP):55216(G)電話(huà)06132/772282(H)電傳06132/774377(ⅱ)發(fā)明標(biāo)題重組CELO病毒及CELO病毒DNA(ⅲ)序列數(shù)目3(ⅳ)機(jī)讀形式(A)介質(zhì)類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專(zhuān)利發(fā)布(PatentIn Release)#1.0，第#1.30版(EPO)(2)序列識(shí)別信息1號(hào)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸學(xué)線(xiàn)形(ⅱ)分子類(lèi)型合成的DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列識(shí)別1號(hào)CCGAGAATCC ACCAATCGTA 20(2)序列識(shí)別信息2號(hào)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈
(D)拓樸學(xué)線(xiàn)形(ⅱ)分子類(lèi)型合成的DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列識(shí)別2號(hào)CAGCGTGTCG CTATACGCAA 20(2)序列識(shí)別信息3號(hào)(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類(lèi)型核酸(C)鏈單鏈(D)拓樸學(xué)線(xiàn)形(ⅱ)分子類(lèi)型合成的DNA(ⅹⅰ)序列說(shuō)明序列識(shí)別3號(hào)GCGATGACGA AATTCTTAGC 20
權(quán)利要求
1．重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于野生型CELO病毒基因組中跨41731-43684的核苷酸區(qū)域被完全或部分缺失，并/或包含外來(lái)DNA的插入。
2．權(quán)利要求1的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于該缺失跨核苷酸41523-43684的區(qū)域。
3．權(quán)利要求1的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于該缺失跨核苷酸41002-43684的區(qū)域。
4．權(quán)利要求1的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于該缺失跨核苷酸40065-43684的區(qū)域。
5．權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于它除了包含權(quán)利要求1-4所定義的缺失，還包含核苷酸794-1330區(qū)域的完全或部分缺失或在該區(qū)域內(nèi)包含外來(lái)DNA的插入。
6．權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的重組CELO病毒DNA，其包含在可于原核或真核細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒內(nèi)。
7．權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于它包含外來(lái)DNA的插入代替缺失。
8．權(quán)利要求7的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于它包含外來(lái)DNA的插入以替代權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所指的區(qū)域或?qū)⑺鐾鈦?lái)DNA插入在所述區(qū)域內(nèi)，和/或以所述外來(lái)DNA的插入替代權(quán)利要求5中所定義的缺失。
9．權(quán)利要求7或8的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于該外來(lái)DNA編碼一種衍生自動(dòng)物病原體的抗原。
10．權(quán)利要求9的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所指病原體是鳥(niǎo)類(lèi)的病原體。
11．權(quán)利要求7或8的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所述外來(lái)DNA編碼人類(lèi)蛋白質(zhì)。
12．權(quán)利要求11的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所述DNA編碼一種有治療活性的蛋白質(zhì)。
13．權(quán)利要求12的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所述外來(lái)DNA編碼一種免疫刺激性蛋白。
14．權(quán)利要求13的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于該免疫刺激性蛋白是一種細(xì)胞因子。
15．權(quán)利要求11的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于該外來(lái)DNA編碼一種腫瘤抗原或其片段。
16．權(quán)利要求12的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于該外來(lái)DNA編碼一種調(diào)節(jié)血管生成的蛋白質(zhì)。
17．權(quán)利要求11的重組CELO病毒或CELO病毒DNA，其特征在于所述外來(lái)DNA編碼一種衍生自人類(lèi)病原體的抗原。
18．一種制備權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的重組CELO病毒的方法，其特征在于在質(zhì)粒來(lái)源的CELO病毒DNA上進(jìn)行所述缺失并可任選插入，和將該重組CELO病毒DNA導(dǎo)入可支持病毒復(fù)制的宿主內(nèi)。
19．權(quán)利要求18的方法，其特征在于所指宿主是一種原代細(xì)胞或一種永生化細(xì)胞系的細(xì)胞。
20．權(quán)利要求18的方法，其特征在于所指宿主是一種鳥(niǎo)類(lèi)胚胎。
21．權(quán)利要求19的方法，其特征在于權(quán)利要求19中所定義的細(xì)胞用重組CELO病毒DNA轉(zhuǎn)染并持續(xù)培養(yǎng)以產(chǎn)生一定量的病毒，所指病毒的量接種在一種鳥(niǎo)類(lèi)胚胎內(nèi)并擴(kuò)增。
22．權(quán)利要求21的方法，其特征在于所指胚胎是雞胚。
23．一種抗動(dòng)物傳染病的疫苗，其包括權(quán)利要求9的CELO病毒。
24．一種抗鳥(niǎo)類(lèi)傳染病的疫苗，其包括權(quán)利要求10的CELO病毒。
25．一種抗人類(lèi)傳染病的疫苗，其包括權(quán)利要求17的CELO病毒。
26．一種藥用組合物，其含有權(quán)利要求12的CELO病毒。
27．權(quán)利要求13、14或15中任一項(xiàng)的CELO病毒，其用于制備腫瘤疫苗。
28．一種制備目的重組蛋白的方法，其特征在于將權(quán)利要求7的重組CELO病毒導(dǎo)入鳥(niǎo)類(lèi)的胚胎中，使該病毒擴(kuò)增以產(chǎn)生目的蛋白，和回收該蛋白質(zhì)，其中所述外來(lái)DNA編碼所述目的蛋白。
29．權(quán)利要求28的方法，其中編碼目的蛋白的DNA與編碼免疫球蛋白Fc區(qū)的DNA分子融合。
30．權(quán)利要求29的方法，其中所述外來(lái)DNA還包括信號(hào)序列。
31．權(quán)利要求30的方法，其中所述目的蛋白是分泌蛋白，所述信號(hào)序列是其天然信號(hào)序列。
32．權(quán)利要求30的方法，其中所述信號(hào)序列衍生自一種天然分泌至雞胚中的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)不同于所述目的蛋白。
33．權(quán)利要求32的方法，其中所述信號(hào)序列衍生自卵清蛋白、抗生物素蛋白、伴清蛋白或溶菌酶。
全文摘要
重組CELO病毒或在CELO病毒基因組右末端含有一處缺失的該病毒DNA,其允許大片段外來(lái)DNA的插入。該病毒可作為動(dòng)物特別是鳥(niǎo)類(lèi)的一種疫苗使用,也可用于人類(lèi)的基因治療和疫苗應(yīng)用。該病毒還可用于重組蛋白的生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/861GK1319140SQ99811232
公開(kāi)日2001年10月24日 申請(qǐng)日期1999年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月22日
發(fā)明者馬修·科滕, 安妮－伊莎貝爾·米喬, 格哈德·克里斯托福里, 阿米莉亞·康派格尼 申請(qǐng)人:貝林格爾·英格海姆國(guó)際有限公司