專利名稱：檢測細(xì)菌所用的基因和使用該基因檢測細(xì)菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測已知為啤酒-酸敗菌的梳狀菌屬細(xì)菌福瑞森加梳狀菌(Pectinatus frisingensis)或嗜啤酒梳狀菌(Pectinatuscerevisiiphilus)所用的基因，以及使用該基因檢測細(xì)菌的方法。
已知梳狀菌屬的細(xì)菌是啤酒-酸敗菌。該屬中的兩種細(xì)菌，即福瑞森加梳狀菌和嗜啤酒梳狀菌是已知的。為了檢測梳狀菌屬的細(xì)菌，在增殖培養(yǎng)和分離培養(yǎng)之后必須分離細(xì)菌。這至少需要7天的時間。然后，需增殖分離的細(xì)菌，并通過多個定性試驗，如形態(tài)學(xué)觀察，革蘭氏染色，過氧化氫酶試驗，對多種碳源的利用等進(jìn)行檢測以鑒定該細(xì)菌。
這些試驗非常麻煩，既耗時，花費也大。除了這些一般性的鑒定試驗外，還有一種方法可以鑒定這類細(xì)菌，即提取分離細(xì)菌的DNA，將DNA固定于膜上，使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌DNA為探針進(jìn)行雜交試驗。然而，這也需要花幾天的時間，而且難以得到必需的檢測敏感性和選擇性。
最近公開了一種檢測梳狀菌屬細(xì)菌的方法，所述方法使用了與嗜啤酒梳狀菌特異性反應(yīng)的單克隆抗體(ASBC Journal:51(4)158-163,1993)。然而，該方法的檢測敏感性不高。該方法存在的問題是無法檢測福瑞森加梳狀菌。
也有人報道過其它的檢測方法，該方法可通過核糖定型(Ribotyping)法檢測福瑞森加梳狀菌和嗜啤酒梳狀菌，所述核糖定型法能檢測核糖體RNA基因的多態(tài)性(J.Am.Soc.Chem,56(1)19-23,1998)。然而，由于該方法需要分離細(xì)菌，因而會出現(xiàn)檢測敏感性和速度問題。
考慮到這些問題，已研究出更加快速的檢測方法。WO97/20071公開了檢測梳狀菌的方法，所述方法包括提取受試微生物的DNA并以該DNA的互補(bǔ)寡核苷酸為引物進(jìn)行PCR。然而，該技術(shù)中所用16S rRNA基因的堿基序列有時與其它屬微生物的相類似，因此，會帶來以下問題，即除了檢測到特定微生物外，還能檢測到其它微生物。
位于16S rRNA基因和23S rRNA基因之間的間隔區(qū)內(nèi)的基因具有特定的基因序列。盡管使用該基因序列檢測微生物的方法已公開于日本Jozo Ronbunshu 50,22-31(1995),應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，vol.62,No.5,1683-1688(1996),FEMS MICROBIOL LETT,vol.84,No.3,307-312(1991)，日本專利特許公開6-98800等，但目前仍未發(fā)現(xiàn)梳狀菌屬間隔區(qū)的基因序列。
本發(fā)明的目的是提供與啤酒-酸敗相關(guān)的梳狀菌屬所特有的位于16S rRNA基因和23S rRNA基因之間的間隔區(qū)的基因序列，本發(fā)明還提供了通過使用該序列敏感而快速地檢測梳狀菌屬細(xì)菌的方法。
(1)第一項發(fā)明是位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23SrRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，該序列含有SEQ ID NO:1所示的部分或全部堿基序列。
(2)第二項發(fā)明是位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23SrRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，該序列含有SEQ ID NO:2所示的部分或全部堿基序列。
(3)第三項發(fā)明是位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23SrRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，該序列含有SEQ ID NO:3所示的部分或全部堿基序列。
(4)第四項發(fā)明是位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23SrRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，該序列含有SEQ ID NO:4所示的部分或全部堿基序列。
(5)第五項發(fā)明是寡核苷酸，其特征在于位于福瑞森加梳狀菌16SrRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列具有至少一個下列序列組或相應(yīng)的互補(bǔ)序列5’-CCATCCTCTTGAAAATCTC-3’①5’-TCTCRTCTCACAAGTTTGGC-3’②(6)第六項發(fā)明是寡核苷酸，其特征在于位于嗜啤酒梳狀菌16SrRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列具有至少一個下列序列組或相應(yīng)的互補(bǔ)序列5’-CACTCTTACAAGTATCTAC-3’③5’-CCACAATATTTCCGACCAGC-3’④5’-AGTCTTCTCTACTGCCATGC-3’⑤(7)第七項發(fā)明是檢測福瑞森加梳狀菌的方法，其中由(1)或(2)所述的基因序列制成的寡核苷酸被用作引物以合成核酸，并通過基因擴(kuò)增處理核酸以檢測細(xì)菌。
(8)第八項發(fā)明是檢測嗜啤酒梳狀菌的方法，其中由(3)或(4)所述的基因序列制成的寡核苷酸被用作引物以合成核酸，并通過基因擴(kuò)增處理核酸以檢測細(xì)菌。
(9)第九項發(fā)明是檢測福瑞森加梳狀菌的方法，其中由(1)或(2)所述的基因序列制成的寡核苷酸，或由(5)所述的基因序列制成的寡核苷酸和編碼福瑞森加梳狀菌16S rRNA基因的核苷酸序列被用作引物以合成核酸，并通過基因擴(kuò)增處理核酸以檢測細(xì)菌。
(10)第十項發(fā)明是檢測嗜啤酒梳狀菌的方法，其中由(3)或(4)所述的基因序列制成的寡核苷酸，或由(6)所述的基因序列制成的寡核苷酸和編碼嗜啤酒梳狀菌16S rRNA基因的核苷酸序列被用作引物以合成核酸，并通過基因擴(kuò)增處理核酸以檢測細(xì)菌。
(11)第十一項發(fā)明是如(9)所述的方法，其中編碼福瑞森加梳狀菌16S rRNA基因的核苷酸序列具有下列序列5’-CGTATCCAGAGATGGATATT-3’⑥(12)第十二項發(fā)明是如(10)所述的方法，其中編碼嗜啤酒梳狀菌16S rRNA基因的核苷酸序列具有下列序列5’-CGTATGCAGAGATGCATATT-3’⑦

圖1顯示出實施例3中的電泳圖。
圖2顯示出實施例5中的電泳圖。
基因擴(kuò)增技術(shù)是眾所周知的技術(shù)，它是通過Saiki等發(fā)展起來的聚合酶鏈反應(yīng)法(下文簡稱為PCR法；科學(xué)230,1350,1985)進(jìn)行的。
通過特定基因序列的擴(kuò)增反應(yīng)實施該方法。由于該方法顯示出反應(yīng)快速，敏感性和特異性高，便于操作的優(yōu)點，已嘗試在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域使用該方法快速判斷病毒，或在食品領(lǐng)域使用該方法快速檢測有害細(xì)菌。通過使用PCR法，即使受試樣品中僅存在少量核苷酸序列，也能將兩個引物之間的靶核苷酸序列擴(kuò)增幾百倍，并產(chǎn)生大量拷貝以供檢測。為了進(jìn)行PCR法，應(yīng)從受試樣品中的細(xì)菌內(nèi)釋放核酸成分。然而，在PCR法中，當(dāng)靶序列中存在幾個或多個分子時，擴(kuò)增反應(yīng)就能繼續(xù)進(jìn)行。因此，用裂解酶或表面活性劑簡單地預(yù)處理細(xì)菌即可提供PCR法的樣品。為此，檢測細(xì)菌的方法優(yōu)于常規(guī)的方法。
本發(fā)明提供了位于福瑞森加梳狀菌或嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列。通過在PCR法中使用編碼16S rRNA基因的核苷酸序列或選自該序列的寡核苷酸作為核酸合成所用的探針，并通過基因擴(kuò)增處理，本發(fā)明人研究出一種快速而高度敏感的方法，可用于判斷樣品中福瑞森加梳狀菌或嗜啤酒梳狀菌的存在。
受試樣品可以是啤酒或啤酒的半成品，或提取自污水的樣品等等。寡核苷酸引物可以是化學(xué)合成的或天然產(chǎn)物。
如下文所述，在本發(fā)明的方法中，可通過PCR法檢測福瑞森加梳狀菌或嗜啤酒梳狀菌。PCR法中使用的堿基序列是，但不限于例如上述(5),(6),(11)和(12)。PCR法中使用的引物長度是，但不限于19-20個堿基長(對上述(5),(6),(11)和(12)而言)，優(yōu)選為10-50個堿基長。
當(dāng)通過PCR法檢測福瑞森加梳狀菌時，如果聯(lián)合使用①和⑥為引物擴(kuò)增的DNA片斷約為700個堿基對和約為900個堿基對，聯(lián)合使用②和⑥為引物擴(kuò)增的DNA片斷約為700個堿基對和約為900個堿基對的話，即可判定細(xì)菌的存在。當(dāng)通過電泳檢測到這些帶時，可以判定存在福瑞森加梳狀菌。由于在任何情況下，引物的組合特異于福瑞森加梳狀菌，因此可檢測到屬。通過平行使用兩種組合，可以進(jìn)行更精確的測定。通過改變PCR法所用引物的堿基序列，可以改變擴(kuò)增的核苷酸序列的長度。
另一方面，當(dāng)通過PCR法檢測嗜啤酒梳狀菌時，如果聯(lián)合使用③和⑦為引物擴(kuò)增的DNA片斷約為600個堿基對，聯(lián)合使用④和⑦為引物擴(kuò)增的DNA片斷約為650個堿基對，聯(lián)合使用⑤和⑦為引物擴(kuò)增的DNA片斷約為700個堿基對的話，即可判定細(xì)菌的存在。當(dāng)通過電泳檢測到這些帶時，可以判定存在嗜啤酒梳狀菌。由于在任何情況下，引物的組合特異于嗜啤酒梳狀菌，因此可檢測到屬。通過平行使用兩種或更多種組合，可以進(jìn)行更精確的測定。通過改變PCR法所用引物的堿基序列，可以改變擴(kuò)增的核苷酸序列的長度。
在PCR法中，一個循環(huán)的溫度條件是90-98℃熱變性反應(yīng)，其中雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA,37-65℃退火反應(yīng)，其中DNA與引物模板DNA雜交，和50-75℃鏈延伸反應(yīng)，其中DNA聚合酶參與反應(yīng)。通過幾十個循環(huán)即可擴(kuò)增靶序列。PCR反應(yīng)之后，通過電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物，用溴化乙錠等染色核酸。當(dāng)擴(kuò)增的核苷酸序列堿基長度等于上述靶序列的堿基長度時，可以判定受試樣品中存在細(xì)菌。為了檢測擴(kuò)增的核苷酸序列，可以使用層析。
本發(fā)明的序列描述如下SEQ ID NO:1序列長度為624，序列類型為核酸，鏈型為雙鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為福瑞森加梳狀菌DSM6306。
SEQ ID NO:2序列長度為442，序列類型為核酸，鏈型為雙鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為福瑞森加梳狀菌DSM6306。
SEQ ID NO:3序列長度為724，序列類型為核酸，鏈型為雙鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為嗜啤酒梳狀菌DSM20467。
SEQ ID NO:4序列長度為399，序列類型為核酸，鏈型為雙鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為嗜啤酒梳狀菌DSM20467。
SEQ ID NO:5序列長度為19，序列類型為核酸，鏈型為單鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為福瑞森加梳狀菌DSM6306。
SEQ ID NO:6序列長度為20，序列類型為核酸，鏈型為單鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為福瑞森加梳狀菌DSM6306。
SEQ ID NO:7序列長度為19，序列類型為核酸，鏈型為單鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為嗜啤酒梳狀菌DSM20467。
SEQ ID NO:8序列長度為20，序列類型為核酸，鏈型為單鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為嗜啤酒梳狀菌DSM20467。
SEQ ID NO:9序列長度為20，序列類型為核酸，鏈型為單鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為嗜啤酒梳狀菌DSM20467。
SEQ ID NO:10序列長度為20，序列類型為核酸，鏈型為單鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為福瑞森加梳狀菌DSM6306。
SEQ ID NO:11序列長度為20，序列類型為核酸，鏈型為單鏈，拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為線形，分子類型為基因組DNA，來源為嗜啤酒梳狀菌DSM20467。
下列工作實施例將描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不局限于這些實施例。
實施例1制備受試樣品將福瑞森加梳狀菌DSM6306和嗜啤酒梳狀菌DSM20467用作梳狀菌屬的細(xì)菌菌株。為了證實本發(fā)明SEQ ID NO:5,6,7,8,9,10和11所示的福瑞森加梳狀菌和嗜啤酒梳狀菌引物的特異性，使用了表1所示的其它細(xì)菌。在適當(dāng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)這些細(xì)菌，離心收集菌株。根據(jù)SHIN-SEIKAGAKU-JIKKEN-KOZA2，核酸I，分離和純化，p20-21(日本生物化學(xué)學(xué)會編，Tokyo-Kagaku-Dojin)的描述提取菌株的DNA，得到DNA溶液。
表1
實施例2克隆位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)，并測定其堿基序列(1)選擇并合成寡核苷酸引物以通過PCR法擴(kuò)增16S/23S rRNA間隔區(qū)由于福瑞森加梳狀菌16S核糖體RNA基因的堿基序列是已知的(國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志，Vol.40,p19-27(1990))，因此可在第557-576位堿基序列的基礎(chǔ)上選擇引物。
由于福瑞森加梳狀菌23S核糖體RNA基因的堿基序列是已知的(系統(tǒng)應(yīng)用微生物學(xué)，Vol.15,p487-501(1990),EMBL登記號為X48423)，因此可在第1-20位堿基序列的基礎(chǔ)上選擇引物以得到相應(yīng)的互補(bǔ)序列。委托Sawady Technology有限公司合成這些引物。
(2)通過PCR法擴(kuò)增16S/23S rRNA間隔區(qū)將實施例1中制備的0.1μg福瑞森加梳狀菌DNA溶液置于0.2ml試管(Perkin-Elmer制備)中，在溶液中加入5μl 10×緩沖液(得自rTaqDNA聚合酶試劑盒，Toyobo有限公司)，3μl 25mM MgCl2,5μl 2mM dNTP混合溶液(dATP,dGTP,dCTP和dTTP),0.5μl 5個單位/μl的rTaq聚合酶和各為0.5μl的按實施例2-(1)制備的100mM引物，然后加入無菌蒸餾水至終體積為50μl。將試管置于自動基因擴(kuò)增裝置(PerkinElmer)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。將反應(yīng)重復(fù)30個循環(huán)，每個循環(huán)的條件如下94℃變性2.5分鐘；94℃變性30秒；55℃退火引物30秒；72℃合成反應(yīng)30秒。反應(yīng)之后，使用5μl溶液，通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。用溴化乙錠染色DNA，觀察到擴(kuò)增的DNA。結(jié)果表明擴(kuò)增出約1600bp(下文簡稱為“長”)的DNA和約1400bp(下文簡稱為“短”)的DNA。
(3)克隆并測序間隔區(qū)“長”DNA使用高純度的PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Baringer Manhaim)，PCR反應(yīng)之后從溶液中除去未反應(yīng)的dNTP。在所得100ng擴(kuò)增的DNA中加入2μl質(zhì)粒pCR2.1(包含在TA克隆試劑盒中，INVITROGEN)，1μl連接酶和1μl緩沖液，然后加入無菌水至總體積為10μl。將溶液置于14℃反應(yīng)4小時之后，在大腸桿菌INVα’F感受態(tài)細(xì)胞中加入2μl溶液和2μl 0.5M β-巰基乙醇，置于冰上30分鐘。然后將溶液加熱至42℃達(dá)30秒，對細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中加入250μl SOC培養(yǎng)基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl，10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃將混合物振蕩60分鐘，然后轉(zhuǎn)移至含有50μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml X-Gal的LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將顯出的白色菌落轉(zhuǎn)移至3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。
培養(yǎng)之后，用微量質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN)從細(xì)菌中提取質(zhì)粒。取出部分所得質(zhì)粒，于37℃與限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)反應(yīng)60分鐘，通過瓊脂糖電泳進(jìn)行分離。用溴化乙錠染色DNA，證實“長”DNA片斷的插入。于30℃，將500ng其余質(zhì)粒與限制性酶SmaI(TOYOBO有限公司制備)反應(yīng)60分鐘。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入2μl3M醋酸鈉和500μl100％乙醇，將混合物置于冰上15分鐘，以15000rpm離心15分鐘，除去上清液。在沉淀物中加入500μl70％乙醇，以15000rpm離心混合物15分鐘，除去上清液，減壓干燥10分鐘。加入無菌水以溶解沉淀物，于37℃將混合物與限制性酶XbaI(Baringer Manhaim)反應(yīng)60分鐘。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入等量苯酚/氯仿(等量混合的液體)，輕柔混合，以15000rpm離心混合物15分鐘，回收水層(上層)。
在回收的液體中加入等量水-飽和醚，輕柔混合，以15000rpm離心混合物15分鐘以除去醚層(上層)。在殘留的水層中加入2μl 3M醋酸鈉和500μl 100％乙醇，將混合物置于冰上15分鐘，以15000rpm離心15分鐘，除去上清液。在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm離心混合物15分鐘，除去上清液，減壓干燥殘留物10分鐘。加入20μl無菌蒸餾水。在5μl溶液中加入1μl包含在平端試劑盒(Takara Shuzo有限公司)中的10×緩沖液和3μl無菌蒸餾水，將混合物在70℃維持5分鐘，加入1μl T4 DNA聚合酶，將混合物在37℃維持5分鐘以得到平端。經(jīng)攪拌滅活T4 DNA聚合酶之后，加入40μl連接溶液A和10μl連接溶液B，將混合物在16℃維持30分鐘以進(jìn)行內(nèi)部連接。
在大腸桿菌INVα’F感受態(tài)細(xì)胞中加入2μl所得溶液和2μl 0.5Mβ-巰基乙醇，將混合物置于冰上30分鐘。然后加熱至42℃達(dá)30秒，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中加入250μl SOC培養(yǎng)基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃將混合物振蕩60分鐘，然后鋪于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將顯出的白色菌落接種于3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)之后，用微量質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司)從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。
使用所得質(zhì)粒為模板，進(jìn)行測序反應(yīng)。所用測序引物是IRD41Infrared染料標(biāo)記的M13正向引物和IRD41 Infrared染料標(biāo)記的M13反向引物(由Nisshinbo制備，Aroka有限公司出售)。所用反應(yīng)液體是SequiTherm(商標(biāo))Long-Read(商標(biāo))循環(huán)測序試劑盒-LC(由EPICENTRE TECHNOLOGIES制備)。使用4000L Long ReadIR(商標(biāo))DNA測序系統(tǒng)(由LI-COR制備)測定堿基序列。
位于福瑞森加梳狀菌DSM6306的16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)！“長”DNA的基因序列示于SEQ ID NO:1。
(4)克隆并測序間隔區(qū)“短”DNA使用高純度的PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Baringer Manhaim)，按實施例2-(2)所述進(jìn)行PCR反應(yīng)之后，從溶液中除去未反應(yīng)的dNTP。在所得100ng擴(kuò)增的DNA中加入2μl質(zhì)粒pCR2.1(包含在TA克隆試劑盒中，INVITROGEN),1μl連接酶和1μl緩沖液，然后加入無菌水至總體積為10μl。將溶液置于14℃反應(yīng)4小時之后，在大腸桿菌INVα’F感受態(tài)細(xì)胞中加入2μ1溶液和2μl0.5Mβ-巰基乙醇，置于冰上30分鐘。然后將溶液加熱至42℃達(dá)30秒，對細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中加入250μl SOC培養(yǎng)基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃將混合物振蕩60分鐘，然后轉(zhuǎn)移至含有50μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml X-Gal的LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將顯出的白色菌落轉(zhuǎn)移至3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)之后，用微量質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN)從細(xì)菌中提取質(zhì)粒。
取出部分所得質(zhì)粒，于37℃與限制性酶EeoRI(Takara Shuzo)反應(yīng)60分鐘，通過瓊脂糖電泳進(jìn)行分離。用溴化乙錠染色DNA，證實“短”DNA片斷的插入。于30℃，將500ng其余質(zhì)粒與限制性酶SmaI(TOYOBO有限公司制備)反應(yīng)60分鐘。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入2μl3M醋酸鈉和500μl100％乙醇，將混合物置于冰上15分鐘，以15000rpm離心15分鐘，除去上清液。在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm離心混合物15分鐘，除去上清液，減壓干燥10分鐘。加入無菌水以溶解沉淀物，于37℃將混合物與限制性酶XbaI(Baringer Manhaim)反應(yīng)60分鐘。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入等量苯酚/氯仿(等量混合的液體)，輕柔混合，以15000rpm離心混合物15分鐘，回收水層(上層)。在回收的液體中加入等量水-飽和醚，輕柔混合，以15000rpm離心混合物15分鐘以除去醚層(上層)。
在殘留的水層中加入2μl3M醋酸鈉和500μl 100％乙醇，將混合物置于冰上15分鐘，以15000rpm離心15分鐘，除去上清液。在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm離心混合物15分鐘，除去上清液，減壓干燥殘留物10分鐘。加入20μl無菌蒸餾水。在5μl溶液中加入1μl包含在平端試劑盒(Takara Shuzo有限公司)中的10×緩沖液和3μl無菌蒸餾水，將混合物在70℃維持5分鐘，加入1μl T4 DNA聚合酶，將混合物在37℃維持5分鐘以得到平端。經(jīng)攪拌滅活T4 DNA聚合酶之后，加入40μl連接溶液A和10μl連接溶液B，將混合物在16℃維持30分鐘以進(jìn)行內(nèi)部連接。在大腸桿菌INVα’F感受態(tài)細(xì)胞中加入2μl所得溶液和2μl 0.5M β-巰基乙醇，將混合物置于冰上30分鐘。然后加熱至42℃達(dá)30秒，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
在經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中加入250μl SOC培養(yǎng)基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃將混合物振蕩60分鐘，然后鋪于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將顯出的白色菌落接種于3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)之后，用微量質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司)從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。
使用所得質(zhì)粒為模板，進(jìn)行測序反應(yīng)。所用測序引物是IRD41Infrared染料標(biāo)記的M13正向引物和IRD41 Infrared染料標(biāo)記的M13反向引物(由Nisshinbo制備，Aroka有限公司出售)。所用反應(yīng)液體是SequiTherm(商標(biāo))Long-Read(商標(biāo))循環(huán)測序試劑盒-LC(由EPICENTRE TECHNOLOGIES制備)。使用4000L Long ReadIR(商標(biāo))DNA測序系統(tǒng)(由LI-COR制備)測定堿基序列。
位于福瑞森加梳狀菌DSM6306的16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)“短”DNA的基因序列示于SEQ ID NO:2。
實施例3通過PCR法檢測福瑞森加梳狀菌(1)選擇并合成福瑞森加梳狀菌所用引物在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的基礎(chǔ)上，使用DNASIS(商標(biāo)，Hitachi Soft Engineering有限公司)分析福瑞森加梳狀菌的特定序列。結(jié)果選定SEQ ID NO:1所示的位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列第377至395位的序列，和SEQ ID NO:2所示的位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列第195至213位的序列(SEQ ID NO:5)。
另外，類似的分析選定了SEQ ID NO:1所示的位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列第361至380位的序列，和SEQ ID NO:2所示的位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列第179至198位的序列(SEQ ID NO:6)。
另外，通過編碼福瑞森加梳狀菌16S rRNA的基因序列選定SEQ IDNO:10所示的特異性引物。通過與實施例2-(1)相同的方法化學(xué)合成寡核苷酸。
(2)通過具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10之序列的引物檢測和鑒定福瑞森加梳狀菌通過PCR，用實施例3中合成的引物(SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10)處理實施例1中制備的細(xì)菌DNA溶液。PCR的溫度條件如下熱變性94℃，30秒退火55℃，30秒鏈延伸反應(yīng)72℃，30秒將一個條件循環(huán)重復(fù)35次。PCR之后，以恒壓l00V對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳30分鐘。同時也電泳pHY標(biāo)記以作為分子量標(biāo)記。電泳之后，在約0.5μg/ml溴化乙錠溶液中染色瓊脂糖凝膠20分鐘，用紫外線觀察凝膠并攝制凝膠照片。通過觀察或凝膠照片，由分子量標(biāo)記的相對遷移距離測定擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度。
如圖1所示，僅在福瑞森加梳狀菌中檢測到約700bp和約900bp的帶。
由此結(jié)果看，當(dāng)SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的寡核苷酸用作PCR引物時，僅在福瑞森加梳狀菌中檢測到具有目的長度的帶。由此可以證明，本發(fā)明的各個寡核苷酸正確地識別了位于福瑞森加梳狀菌16SrRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，和靶向16S rRNA編碼基因的堿基序列。另外，在相同屬的嗜啤酒梳狀菌，和相對嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌中未觀察到具有目的長度的帶。因此，本發(fā)明可以特異性地檢測到福瑞森加梳狀菌，同時測定該細(xì)菌。
實施例4克隆位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)，并測定其堿基序列(1)選擇并合成寡核苷酸引物以通過PCR法擴(kuò)增16S/23S rRNA間隔區(qū)由于嗜啤酒梳狀菌16S核糖體RNA基因的堿基序列已公開于國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志，Vol.40,p19-27(1990)，因此可在第557-576位堿基序列的基礎(chǔ)上選擇引物。
由于嗜啤酒梳狀菌23S核糖體RNA基因的堿基序列仍未公開，但福瑞森加梳狀菌23S核糖體RNA基因的堿基序列已公開于系統(tǒng)應(yīng)用微生物學(xué)，Vol.15,p487-501(1990),EMBL登記號為X48423，因此可選擇引物以得到對應(yīng)于福瑞森加梳狀菌23S核糖體RNA基因第1-20位堿基序列的互補(bǔ)序列。委托Sawady Technology有限公司合成這些引物。
(2)通過PCR法擴(kuò)增16S/23S rRNA間隔區(qū)將實施例1中制備的0.1μg嗜啤酒梳狀菌DNA溶液置于0.2ml試管(Perkin-Elmer制備)中，在溶液中加入5μl 10×緩沖液(得自rTaqDNA聚合酶試劑盒，Toyobo有限公司)，3μl 25mM MgCl2,5μl 2mM dNTP混合溶液(dATP,dGTP,dCTP和dTTP),0.5μl5個單位/μl的rTaq聚合酶和各為0.5μl的按實施例2-(1)制備的100mM引物，然后加入無菌水至終體積為50μl。將試管置于自動基因擴(kuò)增裝置(Perkin Elmer)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。將反應(yīng)重復(fù)30個循環(huán)，每個循環(huán)的條件如下94℃變性2.5分鐘；94℃變性30秒；55℃退火引物30秒；72℃合成反應(yīng)30秒。反應(yīng)之后，使用5μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。用溴化乙錠染色DNA，觀察到擴(kuò)增的DNA。結(jié)果表明擴(kuò)增出約1700bp(下文簡稱為“長”)的DNA和約1400bp(下文簡稱為“短”)的DNA。
(3)克隆并測序間隔區(qū)“長”DNA使用高純度的PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Baringer Manhaim)，PCR反應(yīng)之后從溶液中除去未反應(yīng)的dNTP。在所得10ng擴(kuò)增的DNA中加入2μl質(zhì)粒pCR2.1(包含在TA克隆試劑盒中，INVITROGEN)，1μl連接酶和1μl緩沖液，然后加入無菌水至總體積為10μl。將溶液置于14℃反應(yīng)4小時之后，在大腸桿菌INVα’F感受態(tài)細(xì)胞中加入2μl溶液和2μl 0.5Mβ-巰基乙醇，置于冰上30分鐘。然后將溶液加熱至42℃達(dá)30秒，對細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中加入250μl SOC培養(yǎng)基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃將混合物振蕩60分鐘，然后轉(zhuǎn)移至含有50μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml X-Gal的LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將顯出的白色菌落轉(zhuǎn)移至3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。
培養(yǎng)之后，用微量質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN)從細(xì)菌中提取質(zhì)粒。取出部分所得質(zhì)粒，于37℃與限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)反應(yīng)60分鐘，通過瓊脂糖電泳進(jìn)行分離。用溴化乙錠染色DNA，證實“長”DNA片斷的插入。于30℃，將500ng其余質(zhì)粒與限制性酶SmaI(TOYOBO有限公司制備)反應(yīng)60分鐘。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入2μl3M醋酸鈉和500μl100％乙醇，將混合物置于冰上15分鐘，以15000rpm離心15分鐘，除去上清液。在沉淀物中加入500μl70％乙醇，以15000rpm離心混合物15分鐘，除去上清液，減壓干燥殘留物10分鐘。加入無菌水以溶解沉淀物，于37℃將混合物與限制性酶XbaI(Baringer Manhaim)反應(yīng)60分鐘。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入等量苯酚/氯仿(等量混合的液體)，輕柔混合，以15000rpm離心混合物15分鐘，回收水層(上層)。在回收的液體中加入等量水-飽和醚，輕柔混合，以15000rpm離心混合物15分鐘以除去醚層(上層)。在殘留的水層中加入2μl3M醋酸鈉和500μl100％乙醇，將混合物置于冰上15分鐘，以15000rpm離心15分鐘，除去上清液。
在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm離心混合物15分鐘，除去上清液，減壓干燥殘留物10分鐘。加入20μl無菌蒸餾水。在5μl溶液中加入1μl包含在平端試劑盒(Takara Shuzo有限公司)中的10×緩沖液和3μl無菌蒸餾水，將混合物在70℃維持5分鐘，加入1μl T4 DNA聚合酶，將混合物在37℃維持5分鐘以得到平端。經(jīng)攪拌滅活T4 DNA聚合酶之后，加入40μl連接溶液A和10μl連接溶液B，將混合物在16℃維持30分鐘以進(jìn)行內(nèi)部連接。在大腸桿菌INVα’F感受態(tài)細(xì)胞中加入2μl所得溶液和2μl 0.5M β-巰基乙醇，將混合物置于冰上30分鐘。然后加熱至42℃達(dá)30秒，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
在經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中加入250μl SOC培養(yǎng)基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃將混合物振蕩60分鐘，然后鋪于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將顯出的白色菌落接種于3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)之后，用微量質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司)從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。
使用所得質(zhì)粒為模板，進(jìn)行測序反應(yīng)。所用測序引物是IDRD41Infrared染料標(biāo)記的M13正向引物和IRD41 Infrared染料標(biāo)記的M13反向引物(由Nisshinbo制備，Aroka有限公司出售)。所用反應(yīng)液體是SequiTherm(商標(biāo))Long-Read(商標(biāo))循環(huán)測序試劑盒-LC(由EPICENTRE TECHNOLOGIES制備)。使用4000L Long ReadIR(商標(biāo))DNA測序系統(tǒng)(由LI-COR制備)測定堿基序列。
位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)“長”DNA的基因序列示于SEQ ID NO:3。
(4)克隆并測序間隔區(qū)“短”DNA使用高純度的PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Baringer Manhaim)，按實施例4-(2)所述進(jìn)行PCR反應(yīng)之后，從溶液中除去未反應(yīng)的dNTP。在所得100ng擴(kuò)增的DNA中加入2μl質(zhì)粒pCR2.1(包含在TA克隆試劑盒中，INVITROGEN),1μl連接酶和1μl緩沖液，然后加入無菌水至總體積為10μl。將溶液置于14℃反應(yīng)4小時之后，在大腸桿菌INVα’F感受態(tài)細(xì)胞中加入2μl溶液和2μl 0.5Mβ-巰基乙醇，置于冰上30分鐘。然后將溶液加熱至42℃達(dá)30秒，對細(xì)菌進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中加入250μl SOC培養(yǎng)基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃將混合物振蕩60分鐘，然后轉(zhuǎn)移至含有50μg/ml氨芐青霉素和40μg/ml X-Gal的LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將顯出的白色菌落轉(zhuǎn)移至3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)之后，用微量質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN)從細(xì)菌中提取質(zhì)粒。
取出部分所得質(zhì)粒，于37℃與限制性酶EcoRI(Takara Shuzo)反應(yīng)60分鐘，通過瓊脂糖電泳分離反應(yīng)產(chǎn)物。用溴化乙錠染色DNA，證實“短”DNA片斷的插入。于30℃，將500ng其余質(zhì)粒與限制性酶SmaI(TOYOBO有限公司制備)反應(yīng)60分鐘。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入2μl 3M醋酸鈉和500μl 100％乙醇，將混合物置于冰上15分鐘，以15000rpm離心15分鐘，除去上清液。在沉淀物中加入500μ;70％乙醇，以15000rpm離心混合物15分鐘，除去上清液，減壓干燥殘留物10分鐘。加入無菌水以溶解沉淀物，于37℃將混合物與限制性酶BamHI(TakaraShuzo公司)反應(yīng)60分鐘。在反應(yīng)產(chǎn)物中加入等量苯酚/氯仿(等量混合的液體)，輕柔混合，以15000rpm離心混合物15分鐘，回收水層(上層)。在回收的液體中加入等量水-飽和醚，輕柔混合，以15000rpm離心混合物15分鐘以除去醚層(上層)。在殘留的水層中加入2μl 3M醋酸鈉和500μl 100％乙醇，將混合物置于冰上15分鐘，以15000rpm離心15分鐘，除去上清液。
在沉淀物中加入500μl 70％乙醇，以15000rpm離心混合物15分鐘，除去上清液，減壓干燥殘留物10分鐘。加入20μl無菌蒸餾水。在5μl溶液中加入1μl包含在平端試劑盒(Takara Shuzo有限公司)中的10×緩沖液和3μl無菌蒸餾水，將混合物在70℃維持5分鐘，加入1μl T4 DNA聚合酶，將混合物在37℃維持5分鐘以得到平端。經(jīng)攪拌滅活T4 DNA聚合酶之后，加入40μl連接溶液A和10μl連接溶液B，將混合物在16℃維持30分鐘以進(jìn)行內(nèi)部連接。在大腸桿菌INVα’F感受態(tài)細(xì)胞中加入2μl所得溶液和2μl0.5Mβ-巰基乙醇，將混合物置于冰上30分鐘。然后加熱至42℃達(dá)30秒，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中加入250μl SOC培養(yǎng)基(2.0％胰化蛋白胨，0.5％酵母提取物，10.0mM NaCl,2.5mM KCl,10.0mM MgCl2-6H2O和20.0mM葡萄糖)，于37℃將混合物振蕩60分鐘，然后鋪于含有50μg/ml氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將顯出的白色菌落接種于3ml含有50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)之后，用微量質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司)從大腸桿菌中提取質(zhì)粒。
使用所得質(zhì)粒為模板，進(jìn)行測序反應(yīng)。所用測序引物是IRD41Infrared染料標(biāo)記的M13正向引物和IRD41Infrared染料標(biāo)記的M13反向引物(由Nisshinbo制備，Aroka有限公司出售)。所用反應(yīng)液體是SequiTherm(商標(biāo))Long-Read(商標(biāo))循環(huán)測序試劑盒-LC(由EPICENTRE TECHNOLOGIES制備)。使用4000L Long ReadIR(商標(biāo))DNA測序系統(tǒng)(由LI-COR制備)測定堿基序列。
位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)“短”DNA的基因序列示于SEQ ID NO:4。
實施例5通過PCR法檢測嗜啤酒梳狀菌(1)選擇并合成嗜啤酒梳狀菌所用引物在SEQ ID NO:3的基礎(chǔ)上，使用DNASIS(商標(biāo)，Hitachi SoftEngineering有限公司)分析嗜啤酒梳狀菌的特定序列。結(jié)果選定SEQID NO:3所示的位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列第135至153位的序列(SEQ ID NO:7)。
另外，類似的分析選定了SEQ ID NO:3所示的位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列第172至191位的序列(SEQ ID NO:8)。
另外，類似的分析選定了SEQ ID NO:3所示的位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列第203至222位的序列(SEQ ID NO:9)。
另外，通過編碼嗜啤酒梳狀菌16S rRNA的基因序列選定SEQ IDNO:11所示的特異性引物。通過與實施例2-(1)相同的方法化學(xué)合成寡核苷酸。
(2)通過具有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11之序列的引物檢測和鑒定嗜啤酒梳狀菌通過PCR，用實施例5-(1)中合成的引物(SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:11)處理實施例1中制備的細(xì)菌DNA溶液。PCR的溫度條件如下熱變性94℃，30秒退火55℃，30秒鏈延伸反應(yīng)72℃，30秒將一個條件循環(huán)重復(fù)35次。PCR之后，以恒壓100V對所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳30分鐘。同時也電泳pHY標(biāo)記以作為分子量標(biāo)記。電泳之后，在約5μg/ml溴化乙錠溶液中染色凝膠20分鐘，用紫外線觀察凝膠并攝制凝膠照片。通過觀察或凝膠照片，由分子量標(biāo)記的相對遷移距離測定擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基長度。
如圖2所示，僅在嗜啤酒梳狀菌中檢測到約600bp的帶。
由此結(jié)果看，當(dāng)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11的寡核苷酸用作PCR引物時，僅在嗜啤酒梳狀菌中檢測到具有目的長度的帶。由此可以證明，本發(fā)明的各個寡核苷酸正確地識別了位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，和靶向16SrRNA編碼基因的堿基序列。另外，在相同屬的福瑞森加梳狀菌，和相對嚴(yán)格厭氧的細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌中未觀察到具有目的長度的帶。因此，本發(fā)明可以特異性地檢測到嗜啤酒梳狀菌，同時測定該細(xì)菌。
通過本發(fā)明，證實了福瑞森加梳狀菌和嗜啤酒梳狀菌16S rRNA基因和23S rRNA基因之間構(gòu)成的間隔區(qū)基因，通過使用部分或全部基因序列提供了快速而可靠地檢測福瑞森加梳狀菌和嗜啤酒梳狀菌的方法。
27Sequence Listing<110>Asahi Breweries,Ltd.<120>檢測細(xì)菌所用的基因和使用該基因檢測細(xì)菌的方法<130>98T3-10<160>11<210>1<211>624<212>DNA<213>福瑞森加梳狀菌<400>1gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggat 60taaaacaatc cgtcgagcac atccggaaca tgtattgttt ggttttgagg gtttctccct 120caaaaaaata gatagaacta atgggggcgt agctcagctg ggagagcacc tgccttgcaa 180gcagggggtc aggagttcaa atctcctcgt ctccaccaga agagaaatgg gcctatagct 240cagctggtta gagcgcacgc ctgataagcg tgaggtcagt agttcaagtc tacttaggcc 300caccataatt gcacattgaa aactacacag aagaaaagca aagaacaatt aatcaccaat 360gccaaacttg tgagaggaga ttttcaagag gatggcgggg aatagttgga ccaagcacaa 420ttaggaaact aaaaacaagc taagacaaaa catataaact taagctaaag gtgatattct 480ggaggagact cgagaatata ataaacttac cagaagcgtt cagatgcaag gaagcatgaa 540agcgaatgaa gaaggcgtat tagtatacgc cgatgagtga gctgaaatga tgacgaagca 600gatgagcggt tatggaaagt ttaa624<210>2<211>442<212>DNA<213>福瑞森加梳狀菌<400>2gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggat 60taaaacaatc cgtcgagcac atccggaaca tgtattgttt ggttttgagg gtttctccct 120caaatattgc acattgaaaa ctacacagaa gaaaagcaaa gaacaattaa tcaccaatgc 180caaacttgtg agaagagatt ttcaagagga tggcggggaa tagttggacc aagcacaatt 240aggaaactaa aaacaagcta agacaaaaca tataaactta agctaaaggt gatattctgg 300
28aggagactcg agaatataat aaacttacca gaagcgttca gatgcaagga agcatgaaag 360cgaatgaaga aggcgtatta gtatacgccg atgagtgagc tgaaatgatg acgaagcaga 420tgagcggtta tggaaagttt aa 442<210>3<211>724<212>DNA<213>嗜啤酒梳狀菌<400>3gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggat 60ttgacaaaaa tctgtcgagt acatccggaa tatgtattgt ttggttttga gggtttctcc 120ctcataaata tatagtagat acttgtaaga gtgtttatgg tatgtttaaa agctggtcgg 180aaatattgtg gtgcaaaaaa atgcatggca gtagagaaga ctggtaaaaa aagaatgaac 240taatgggggc gtagctcaga tgggagagca cctgccttgc aagcaggggg tcaggagttc 300aactctcctc gtctccacca gaagagaaag ggcctatagc tcagctggtt agagcgcacg 360cctgataagc gtgaggtcag tagttcaagt ctacttaggc ccaccaatat tgcacattga 420aaactacaca gaagaaagca aagaacaatt atcaccaatg ccaaacttgt aagagaaatc 480gaggagagaa tggcggggaa tagttggacc aagcacaaat taggaaaaga aacaaacgct 540aagaaacaaa catataaact taagcgaaaa ggtgatattc tggaggaaac ttcagagtat 660ataaacttac cagaagcgtt cagatgcgag gaagggcaaa gctgagagaa gaaagcgtat 660taatatacgc tgatgaacga agcaaagcac tgacaaagca gatggatggt tatgggaagt 720taca724<210>4<211>399<212>DNA<213>嗜啤酒梳狀菌<400>4gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg atcacctcct ttctaaggat 60ttgacaaaaa tctgtcgagt acatccggaa tatgtattgt ttggttttga gggtttctcc 120
29ctcataaata ttgcacattg aaaactacac agaagaaagc aaagaacaat tatcaccaat 180gccaaacttg taagagaaat cgagaagaga atggcgggga atagttggac caagcacaaa 240ttaggaaaag aaacaaacgc taagaaacaa acatataaac ttaagcgaaa aggtgatatt 300ctggaggaaa cttcagagta tataaactta ccagaagcgt tcagatgcga ggaagggcaa 360agcactgaca aagtagatgg atggttatgg gaagttaca399<210>5<211>19<212>DNA<213>福瑞森加梳狀菌<400>5ccatcctctt gaaaatctc 19<210>6<211>19<212>DNA<213>福瑞森加梳狀菌<400>6tctcrtctca caagtttggc 20<210>7<211>19<212>DNA<213>嗜啤酒梳狀菌<400>7cactcttaca agtatctac 19<210>8<211>20<212>DNA<213>嗜啤酒梳狀菌<400>8ccacaatatt tccgaccagc 20<210>9<211>20
30<212>DNA<213>嗜啤酒梳狀菌<400>9agtcttctct actgccatgc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>福瑞森加梳狀菌<400>10cgtatccaga gatggatatt 20<210>11<211>20<212>DNA<213>嗜啤酒梳狀菌<400>11cgtatccaga gatggatatt 20
權(quán)利要求
1．位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，該序列含有SEQ ID NO:1所示的部分或全部堿基序列。
2．位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，該序列含有SEQ ID NO:2所示的部分或全部堿基序列。
3．位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，該序列含有SEQ ID NO:3所示的部分或全部堿基序列。
4．位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列，該序列含有SEQ ID NO:4所示的部分或全部堿基序列。
5．寡核苷酸，其特征在于位于福瑞森加梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列具有至少一個下列序列組或相應(yīng)的互補(bǔ)序列5’-CCATCCTCTTGAAAATCTC-3’①5’-TCTCRTCTCACAAGTTTGGC-3’②
6．寡核苷酸，其特征在于位于嗜啤酒梳狀菌16S rRNA編碼基因和23S rRNA編碼基因之間的間隔區(qū)的基因序列具有至少一個下列序列組或相應(yīng)的互補(bǔ)序列5’-CACTCTTACAAGTATCTAC-3’③5’-CCACAATATTTCCGACCAGC-3’④5’-AGTCTTCTCTACTGCCATGC-3’⑤
7．檢測福瑞森加梳狀菌的方法，所述方法包括將由權(quán)利要求1或2所述的基因序列制成的寡核苷酸用作引物以合成核酸，并通過基因擴(kuò)增處理核酸以檢測細(xì)菌。
8．檢測嗜啤酒梳狀菌的方法，所述方法包括將由權(quán)利要求3或4所述的基因序列制成的寡核苷酸用作引物以合成核酸，并通過基因擴(kuò)增處理核酸以檢測細(xì)菌。
9．檢測福瑞森加梳狀菌的方法，所述方法包括將由權(quán)利要求1或2所述的基因序列制成的寡核苷酸，或由權(quán)利要求5所述的基因序列制成的寡核苷酸和編碼福瑞森加梳狀菌16S rRNA基因的核苷酸序列用作引物以合成核酸，并通過基因擴(kuò)增處理核酸以檢測細(xì)菌。
10．檢測嗜啤酒梳狀菌的方法，所述方法包括將由權(quán)利要求3或4所述的基因序列制成的寡核苷酸，或由權(quán)利要求6所述的基因序列制成的寡核苷酸和編碼嗜啤酒梳狀菌16S rRNA基因的核苷酸序列用作引物以合成核酸，并通過基因擴(kuò)增處理核酸以檢測細(xì)菌。
11．如權(quán)利要求9所述的方法，其中編碼福瑞森加梳狀菌16S rRNA基因的核苷酸序列具有下列序列5’-CGTATCCAGAGATGGATATT-3’⑥
12．如權(quán)利要求10所述的方法，其中編碼嗜啤酒梳狀菌16S rRNA基因的核苷酸序列具有下列序列5’-CGTATGCAGAGATGCATATT-3’⑦
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測已知為啤酒－酸敗菌的梳狀菌屬細(xì)菌福瑞森加梳狀菌或嗜啤酒梳狀菌所用的基因,以及使用該基因檢測細(xì)菌的方法。本發(fā)明提供了與啤酒－酸敗相關(guān)的梳狀菌屬所特有的位于16SrRNA基因和23SrRNA基因之間的間隔區(qū)的基因序列,以及使用該序列快速而敏感地檢測細(xì)菌的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1319136SQ99811321
公開日2001年10月24日 申請日期1999年8月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月11日
發(fā)明者本山靖朗, 尾形智夫, 坂井和久 申請人:朝日啤酒株式會社