專利名稱：濃集所選微生物群的方法和裝置的制作方法
背景-發(fā)明領(lǐng)域本申請基于1998年8月24日提交的臨時專利申請No.60/097,627。
本發(fā)明涉及用來檢測樣品中微生物的產(chǎn)品和方法。更具體地說，本發(fā)明提供了有助于檢測食物樣品、臨床樣品和其它產(chǎn)品中特定的微生物污染是否存在的方法和裝置。
背景-現(xiàn)有技術(shù)測試各種物質(zhì)(如食物、飲料、藥物、化妝品、水以及體液)中微生物污染，尤其是某些病原性細(xì)菌的污染，是非常有必要的。最近爆發(fā)的食物引起的疾病暗示各種食物已經(jīng)被諸如大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌屬、李斯特氏菌屬、空腸彎曲桿菌空腸亞種和圓孢子(Cyclospora)等病原性細(xì)菌污染，因此增強了對迅速分析微生物方法的需求。微生物分析對于評價安全性和質(zhì)量、確定生產(chǎn)效率和與遵守規(guī)章條例是關(guān)鍵的。
微生物測試范圍、意義和需求的增加起了揭示常規(guī)方法有限性和缺點的作用。確定樣品中病原性細(xì)菌存在的經(jīng)典方法通常要花數(shù)天時間來進行。希望能迅速檢測出引起疾病的具體病原菌。
由于大多數(shù)病原菌試驗所需的靈敏度低于每25克產(chǎn)品一個微生物，因此大多數(shù)測試方法依賴于首先的富集步驟。通常大量存在于許多食物中的固有的微生物菌叢通常會干擾病原菌的選擇性分離和鑒定。諸如加熱、冷卻、干燥、冷凍、加入防腐劑等食物加工以及其它原因可能會亞致死性地?fù)p傷細(xì)菌細(xì)胞。這些受損的細(xì)胞對用于選擇性微生物培養(yǎng)基中的組分極其敏感。因此，在許多試驗中，方法從預(yù)富集開始，將樣品培育在營養(yǎng)性非選擇性培養(yǎng)基中，以使受損或受應(yīng)激的細(xì)菌復(fù)蘇。該步驟后是選擇性富集步驟，使感興趣的細(xì)菌生長而抑制固有的微生物菌叢。富集步驟后是常規(guī)的接種方法或各種更先進、迅速的方法如DNA擴增或免疫試驗。
因此希望在早期階段將目標(biāo)生物體從產(chǎn)品中其它菌群分離出來。一種方法是用免疫-磁性分離技術(shù)，該技術(shù)涉及采用對目標(biāo)微生物有特異性的免疫磁性顆粒。將表面附有抗體的磁性珠粒與含有目標(biāo)微生物的樣品混合。該微生物將通過抗體與珠粒表面結(jié)合。用磁鐵從溶液中吸出微生物-磁珠復(fù)合物，以濃集微生物。
美國專利4,230,685描述了外表面結(jié)合有蛋白A的磁性反應(yīng)性的微球。微球與對細(xì)胞、細(xì)菌或病毒有選擇性的抗體反應(yīng)，以便將其從混合群體中分離出來。微生物將附著于抗體，從而與微球相連，然后將微球用于磁性分離步驟中。較佳的微球由白蛋白、蛋白A和磁性顆粒的混合物制得。制備微球，使蛋白A在抗體結(jié)合的外表面上。美國專利4,695,393描述了一種制備這種可用來分離微生物的磁性珠粒的方法。
美國專利5,491,068和5,695,946描述了一種方法，該方法的特征是利用專門的磁性珠粒來抗體捕獲感興趣的微生物。該方法需要將捕獲細(xì)胞培育形成菌落；用菌落提升膜取出菌落中的物質(zhì)；和用標(biāo)記的抗體、PCR或核酸探針檢測膜片上的菌落物質(zhì)。該方法的主要問題是靈敏度低，只能測出1個微生物/克。該低靈敏度是該方法所固有的，它比檢測大多數(shù)食物病原體所需的靈敏度低50-100倍。
美國專利4,677,055描述了一種采用與抗特異性抗原決定簇抗體偶聯(lián)的磁性凝膠來濃集細(xì)菌的方法。該方法涉及獲得含有具有特異性抗原決定簇的微生物的培養(yǎng)基以及使培養(yǎng)基與磁性凝膠顆粒接觸的步驟。該步驟后是用磁性方式分離培養(yǎng)基中的凝膠，并接種到新的培養(yǎng)基中。
總之，磁性珠粒存在很多問題。一個問題是由這些珠粒的小體積(3-10微米)和培養(yǎng)基的大體積(25-3000)毫升)引起的。結(jié)果，不可能從如此大的體積中取出磁性珠粒。因此，許多步驟或是使用較少體積的樣品(從而降低了試驗的靈敏度)，或在取出1-5毫升溶液后預(yù)富集一段時間(8-18小時)以便濃集目標(biāo)微生物。與磁性珠粒有關(guān)的另一個問題是，它們被脂肪和蛋白質(zhì)包覆，因此難以用磁鐵來收集。從培養(yǎng)基中分離出珠粒并洗去未吸附的細(xì)菌要使用大量勞力，并且產(chǎn)生實驗室表面和珠粒受污染的危害。
目的和優(yōu)點因此，本發(fā)明的目的是提供一種可使用大體積培養(yǎng)基濃集目標(biāo)微生物的方法和裝置。本發(fā)明的另一目的是提供耗勞力較少的、更迅速的且本身能自動化的方法。
還有其它目的和優(yōu)點可在閱讀了隨后的說明和附圖后明白。
附圖簡述

圖1顯示了用來濃集目標(biāo)微生物的較佳裝置的側(cè)視圖。
圖2顯示了用來濃集目標(biāo)微生物的裝置的另一種設(shè)計的側(cè)視圖。
較佳的實施方案-說明圖1顯示了用來從含有微生物混合物的懸浮液中分離出目標(biāo)微生物的裝置的較佳實施方案。珠粒1由諸如尼龍、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。珠粒上包被了針對諸如沙門氏菌屬、大腸桿菌0157:H7和李斯特氏菌屬等具體微生物的抗體。設(shè)計圓筒形圍欄2來包含這些珠粒。圍欄由框架3支持的覆蓋該框架的柵格4構(gòu)成。柵格的孔徑小于珠粒體積，以確保珠粒留在圍欄2中。然而，孔徑大得足以使細(xì)菌自由進入圍欄。圍欄上部與棒5相連。棒5能使圍欄2在溶液中移動以及隨后將該裝置取出溶液。
圖2顯示了該裝置的不同設(shè)計。包被了抗體的珠粒11被容納在柵格13制得的茶葉袋狀的圍欄12內(nèi)。非燈芯材料的線14與圍欄12上部相連，從而能使圍欄12在溶液中移動，同時不會使線吸收含有細(xì)菌的溶液。柵格13的孔徑小于珠粒體積，以確保珠粒留在圍欄內(nèi)。然而，該孔徑大得足以使細(xì)菌自由進入圍欄。
將待測試目標(biāo)微生物是否存在的食物樣品與合適的預(yù)先富集用的肉湯混合。將預(yù)先富集用的肉湯培育在合適的溫度下。在培育期開始時，或在培育數(shù)小時后，將圍欄2浸入含有樣品的肉湯中，從而使其上固定了單克隆或多克隆抗體的珠粒與選擇的感興趣的細(xì)菌接觸。通過將裝置2降低到溶液中并攪動溶液至少30分鐘至多達數(shù)小時，而實現(xiàn)這個目的。該步驟能使珠粒捕獲細(xì)胞，并產(chǎn)生珠粒-目標(biāo)微生物細(xì)胞的復(fù)合物。下一步驟是從含有食物顆粒和其它混合菌群的懸浮液中分離出結(jié)合有目標(biāo)細(xì)胞的珠粒。這可通過用棒5從溶液中抽出整個裝置來實現(xiàn)。隨后在無菌鹽水或緩沖溶液中洗滌該裝置數(shù)次。每次洗滌后更換洗液，以除去未結(jié)合的微生物。在培育肉湯混合液中加入諸如吐溫20(0.51-0.1％w/v)或魚精蛋白等洗滌劑通常會減少非特異性吸附。吐溫-20還可用于洗滌步驟中，用來除去非特異性結(jié)合的細(xì)胞。在洗滌步驟后，可用許多方法來檢測目標(biāo)微生物的存在。
一些檢測程序可和本發(fā)明結(jié)合使用，以檢測感興趣微生物的存在。例如，可將該裝置插入新的生長肉湯中，該肉湯含有染料指示劑，可用染料特征的變化來確定目標(biāo)微生物的存在與否。無需將微生物從珠粒上分離下來，因為附著于珠粒對其生長沒有影響。因此，細(xì)胞能繼續(xù)在合適的培養(yǎng)基中增殖?；蛘?，可從圍欄中取出珠粒，接種到合適的選擇性或差異性瓊脂表面上。另一種方法是用免疫試驗。大多數(shù)免疫試驗要求每毫升有103-105個細(xì)胞，因此珠粒應(yīng)當(dāng)含有足量的細(xì)胞來進行直接免疫試驗。類似地，該方法可以和DNA雜交以及諸如PCR等擴增技術(shù)組合。
從上文公開的內(nèi)容看出，本發(fā)明方法的特征在于使用容納在圍欄中的免疫珠粒來從樣品中選出目標(biāo)微生物。該珠粒必需能從測試樣品中有效地捕獲目標(biāo)微生物，同時不會捕獲可能以多得多的數(shù)量存在的其它微生物。然而，所用的抗體無需對目標(biāo)微生物具有完全的特異性，因為在試驗最后還可進行額外的選擇步驟?？贵w結(jié)合部位的取向必須朝外，以使抗體的結(jié)合部分與目標(biāo)微生物之間接觸。珠粒大小必須大于微生物的體積，以便將珠粒留在圍欄內(nèi)，同時使目標(biāo)微生物進入圍欄附著于珠粒。珠粒與目標(biāo)微生物之間的接觸時間必須足夠長，以便發(fā)生強的相互作用。發(fā)現(xiàn)數(shù)小時的相互作用才能產(chǎn)生最佳的結(jié)果，即產(chǎn)生強相互作用，獲得高捕獲效率。培育步驟完成后，通過取出裝有珠粒的圍欄，可從溶液中取出珠粒。洗滌圍欄和珠粒數(shù)次，并將珠粒轉(zhuǎn)移到檢測系統(tǒng)中。
結(jié)論、分支和范圍因此，可以看出該新的裝置和方法可以利用大體積的培養(yǎng)基來濃集目標(biāo)微生物，無需僅用磁性珠粒所需的一部分預(yù)先富集用的肉湯或是少量富集肉湯。本發(fā)明提供了勞動強度低、更快速且本身能自動化的方法和裝置。在試驗各步驟期間用于容納珠粒的許多不同的設(shè)計均可利用。
顯然，在參看了上述技術(shù)后能對本發(fā)明作許多改進和變化。雖然上文的描述包含了許多具體特征，但是它們不應(yīng)被理解成對本發(fā)明范圍的限制，它們只是為本發(fā)明的一些較佳實施方案提供了說明。本發(fā)明可以本文具體描述以外的方式來實施。
權(quán)利要求
1．一種從含有微生物混合群體的懸浮液中分離特定的目標(biāo)微生物的裝置，該裝置包含多個包被了至少一種用來捕獲目標(biāo)微生物的抗體材料的珠粒；和由包圍所述珠粒的柵格材料制成的圍欄，柵格的孔徑小于所述珠粒的體積并大于微生物的體積。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述珠粒用樹脂材料制成。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述珠粒用非樹脂材料制成。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，它還包含在懸浮液中攪動所述圍欄的手段。
5．一種從含有微生物混合群體的懸浮液中分離目標(biāo)微生物的方法，該方法包括將多個包被了至少一種抗體材料的珠粒浸在該懸浮液中，所述珠粒被柵格制成的圍欄所截留，柵格的孔徑小于所述珠粒的體積并大于微生物的體積，從而使目標(biāo)微生物被所述珠粒捕獲；和在將所述圍欄從懸浮液中拉出后，洗滌所述珠粒以除去未與所述珠粒結(jié)合的微生物。
6．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中在所述洗滌中應(yīng)用至少一種洗滌劑。
7．根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，該方法還包括在懸浮液中攪動容納了所述珠粒的所述圍欄。
全文摘要
本發(fā)明描述了從微生物混合物中濃集目標(biāo)微生物的方法和裝置。由諸如尼龍、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的珠粒(1)包被了針對特定微生物的抗體。珠粒(1)容納在柵格材料(4)圍成的圍欄(2)中。柵格的孔徑小于珠粒體積以確保珠粒留在柵格材料內(nèi),并且大于微生物的體積以使微生物與珠粒相互作用。棒(5)與圍欄(2)的上部相連,以便能在含有目標(biāo)微生物的生長培養(yǎng)基中攪動該裝置。
文檔編號C12M1/26GK1320060SQ99811364
公開日2001年10月31日 申請日期1999年8月23日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月24日
發(fā)明者露斯·F·埃登 申請人:露斯·F·埃登