專利名稱：監(jiān)控核苷類逆轉錄酶抑制劑抗逆轉錄病毒治療和在治療hiv/aids中指導治療決定的途徑 ...的制作方法
本申請是1998年6月24日提交的美國申請?zhí)?9/104,295的部分繼續(xù)申請，其內容引入本文作為參考。
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本發(fā)明涉及抗逆轉錄病毒藥物敏感性和抗性試驗，試驗用于鑒定治療人類免疫缺陷病毒(HIV)感染和獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的有效藥物制劑。本發(fā)明進一步涉及用表型和基因型敏感性分析法監(jiān)控臨床HIV感染進程及其對抗逆轉錄病毒治療的反應。本發(fā)明還涉及用于實施表型敏感性試驗的新型載體、宿主細胞和組分。本發(fā)明進一步涉及使用各種基因型方法鑒別因感染而對特定抗逆轉錄病毒藥物制劑產生抗性的病人的方法。本發(fā)明還涉及依據其抑制病毒、選擇的病毒序列和/或病毒蛋白的能力篩選候選抗逆轉錄病毒的藥物。本發(fā)明特別涉及到使用表型敏感性試驗和/或基因型試驗確定核苷類逆轉錄酶抑制劑。
HIV感染特點是在發(fā)病過程中高頻率的病毒更新，最終導致CD4細胞的消亡和病情發(fā)展惡化。Wei X，Ghosh SK，Taylor ME，等(1995)Nature343，117-122，and Ho DD，Naumann AU，Perelson AS，等(1995)Nature373,123-126?？鼓孓D錄病毒治療的目的是獲得實質性和持續(xù)地抑制病毒復制，獲得持續(xù)的控制病毒包括使用系列的治療，總體上每一治療包括3種或更多抗逆轉錄病毒藥物的組合。因此選擇開始和后續(xù)的治療應當建立在對抗性和交叉抗性模式充分了解的理性的基礎上，這對于指導治療決定至關重要。組合治療的基本原理涉及到配合劑或添加劑活性以更大限度地抑制病毒復制。然而藥物制劑的耐受性將至關重要，因為治療需要持續(xù)許多年。
在沒有接受治療的病人體內每天產生大約1010新的病毒顆粒，加上HIV逆轉錄酶(RT)沒有核酸外切酶校正功能，不能校正轉錄錯誤，這種高水平的病毒更新導致在HIV基因組的每個位置每天有104到105次突變，結果迅速形成基因組的廣泛突變。鑒于某些模板位置或堿基對取代更傾向于發(fā)生錯誤(Mansky LM，Temin HM(1995)J Virol 69，5087-5094)(Schinazi RF，Lloyd RM，Ramanathan CS，等(1994)Antimicrob AgentsChemother 38，268-274)，數(shù)學模型顯示在感染的個體中每個可能的單個位點每天可能發(fā)生多到10,000次的突變。
如果產生對抗逆轉錄病毒藥物的抗性，抑制劑存在時靶酶必須在保持其功能的條件下發(fā)生改變。導致單個氨基酸取代的點突變可能導致酶形狀、大小的改變，或者活性部位、底物結合部位或周邊區(qū)域的改變。在初始治療之前已經檢測到對抗逆轉錄病毒制劑在低水平上有抗性的突變。(Mohri H，Singh MK，Ching WTW，等(1993)Proc Natl Acad Sci USA90，25-29)(Najera I，Richman DD，Olivares I，等(1994)AIDS Res HumRetroviruses 10，1479-1488)(Najera I，Holguin A，Quinones-Mateu E，等(1995)J Virol 69，23-31)。然而，這些突變株僅占整個病毒量的一小部分，而且與野生型病毒相比可能處于復制和競爭劣勢。(Coffin JM(1995)Science 267，483-489)。抗逆轉錄病毒治療產生的選擇壓力為這些抗藥突變株提供了競爭優(yōu)勢，這樣它們逐漸成為優(yōu)勢準種(Frost SDW.McLeanAR(1994)AIDS 8，323-332)(Kellam P，Boucher CAB，Tinagal JMGH(1994)J Gen Virol 75，341-351)，最終導致病人體內抗藥和抗病毒失敗。
核苷類逆轉錄酶抑制劑目前有7種核苷類似的HIV逆轉錄酶抑制劑zidovudine(瑞得呋啶)(ZVDRetrovir，Glaxo Wellcome，Uxbridge，UK英國)，zalcitabine(塞西太并)(ddCHIVID，Hoffman-LaRoche，Basle，Switzerland瑞士)，didanosine(地達諾森)(ddIVidex，Bristol-Myers Squibb，Syracuse，NY，USA美國)，stavudine(斯太呋啶)(d4TZerit，Bristol-Myers Squibb，Syracuse，NY，USA美國)，和lamivudine(拉咪呋啶)(3TC，Epivir)，和abacavir(愛博開呋)(ABC，Ziagen，Glaxo Wellcome)，adefovir(愛得佛呋)(ADV，Preveon，GileadSciences)在美國和歐洲獲得批準。此外，3種非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)耐呋絡平(nevirapine)(viramune，Boehringer Ingelheim，Ingelheim am Rhein，Germany德國)，地拉呋啶(delavirdine)(Rescriptor，Pharmacia & Upjohn，Kalamazoo，MI，USA美國)和艾發(fā)呋瑞茲(efavirenz)(EPV，)在美國獲得批準。所有的這些制劑都已顯示至少在短期內有抗病毒活性，因此，自然它們會對HIV施加了選擇壓力，在治療過程中產生了抗藥突變株。雖然這些藥物一般用于組合制劑，但許多得到的抗性數(shù)據來源于I/II期單一治療研究。在單一治療過程中所觀察到的突變或許并不能準確反映突變引起的抗性，因為突變是在幾種藥劑的選擇壓力存在下產生的，它們作用于相同的位點和同一基因。
新型突變雖然在體外和體內的研究工作中建立了與導致對逆轉錄酶抑制劑(RTIs)有表型抗性相關的基因型突變模型，但在臨床研究中時常產生的其它抗性突變很少有報道。已經在接受用ZDV加ddI或ddC進行延長的組合治療的病人中鑒定出密碼子62、75、77、116和151位發(fā)生氨基酸取代獨特模式的個體這些個體對2種藥物均有抗性，對stavudine(斯太呋啶)有交叉抗性，對3TC有部分交叉抗性。沒有一致的基因型改變與表型d4T抗性相關，或確與該藥劑病毒治療效果的喪失有關。
與核苷類似的逆轉錄酶(RT)抑制劑相關的突變Zidovudine(瑞得呋啶)在1989年首次報道對ZDV敏感性降低的HIV變異株；其中一些變異株要抑制病毒復制的50％需要ZDV的濃度增加100倍以上(Larder BA.Darby G，Richman DD(1989)Science 243，1731-1734)。ZDV抗性表型在體內表現(xiàn)得相當穩(wěn)定，治療停止1年后有時還能檢測到抗性病毒，(BoucherCA，O′Sullivan E，Mulder JW等(1992)J Infect Disease 165，105-110)，而且與是否使用didanosine(地達諾森)治療無關(Smith MS，Koerber KL，Pagano JS，(1994)J Infect Disease 169，184-188)。
HIV逆轉錄酶核苷酸測序發(fā)現(xiàn)了許多能影響病毒對ZDV敏感性的突變，它可作為在ZDV抗性存在時的基因型標記(Kellam P.Boucher CAB，Tinagal JMGH等(1994)J Gen Virol 75，341-351)(Boucher CAB，Tersmette M，Lange JMA，等(1990)Lancet 336，585-590)(Lopez-GalindezC，Rojas JM，Najera R，等(1991)PNAS 88，4280-4284)。有順序地出現(xiàn)了抗性水平增加的一系列突變，這些順序出現(xiàn)的突變與病毒對ZDV敏感性遞增性減少有關。(同上)(Larder BA，Kellam P.Kemp SD，(1991)AIDS 5，137-144)。密碼子70的取代(精氨酸70—賴氨酸)可能會瞬間顯性，在ZDV單一治療中對于治療病毒失敗起關鍵作用(DeJong MD，Weenstra J，Stilianakis NI，等(1996)PNAS 93，9501-9506)。繼續(xù)用ZDV治療在215密碼子選擇進一步突變，這是個較為穩(wěn)定的突變，已有報道突變發(fā)生蘇氨酸215-賴氨酸和蘇氨酸215-苯丙氨酸的取代，而且可能同時存在(Mayers DL，McCutchan FE，Sanders-Buell EE，等(1992)J Acq Imm DefSynd 5，749-759)。接著可能會出現(xiàn)額外突變的病毒，最常見的是41位密碼子發(fā)生取代(蛋氨酸41-亮氨酸)，接著在67位密碼子(天冬氨酸67-天冬酰胺)和219位密碼子(賴氨酸219-谷氨酰胺)額外突變，或重新出現(xiàn)70位密碼子突變(同上)。
定點突變已用于評價導致不同突變的相互作用(同上)。實驗表明對ZDV高水平抗性(IC50＞1uM)典型地與多位點突變的存在有關。雖然突變常有協(xié)同作用，但也可能有拮抗作用，例如，在用ddI和ddC治療中觀察到的74位密碼子突變(亮氨酸74-纈氨酸)已報道在體外對ZDV215突變有拮抗作用，減少了對ZDV的抗性水平(St Clair MH，Martin JI，Tudor-Williams F，等(1991)Science 253，1557-1559)。也有報道由非核苷類逆轉錄酶抑制劑選擇的181位密碼突變，和lamivudine(拉咪呋啶)與不常見的ddC和ddI引發(fā)的184位密碼子突變在體外對215位密碼突變有拮抗作用(Larder BA，(1992)Antimicrob Agents Chemother 36，2664-2669)(Boucher CAB，Cammack N，Schipper P，et al(1993)Antimicrob AgentsChemother 37，2231-2234)(Tisdale M，Kemp SD，Parry NR，等(1993)PNAS 90，5653-5656)(Larder BA，Kemp SD，Harrigan PR(1995)Science269，696-699)(Zhang D，Cliendo AM，Eron JJ，等(1994)AntimicrobAgents Chemother 38，282-287)。然而，在聯(lián)合治療過程中在體內可以觀察到新型突變模式或額外的“代償性”突變，這就促使了雙重或多重抗藥性(見下)。
對ZDV有抗性的病毒株表現(xiàn)出對包含有3’-疊氮基團如3’-疊氮-2’，3’雙脫氧瑞啶(AZU)的其它核苷類似物的交叉抗性(Rooke R，ParniakAM，Tremblay M，等(1991)Antimicrob Agents Chermother 35，988-991)。一個研究小組已經報道一個HIV實驗室株和一個臨床分離株對缺少3′-疊氮部分的胸腺嘧啶類似物stavudine(斯太呋啶)有交叉抗性(同上)。大多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn)在ZDV單一治療中選擇突變不會影響ddI、ddC和3TC的敏感性(Rooke R，Tremblay M，Soudeyns H，等(1989)AIDS 3，411-415)(id)(Larder BA，Chesebro B，Richman DD(1990)Antimicrob Agents Chemother34，436-441)(id)(Dimitrov DH，Hollinger FB，Baker CJ，等(1993)J InfectDisease 167，818-823)。然而，幾乎沒有報道在持續(xù)ZDV治療后產生對ddI的抗性(id)(Japour AJ，Chatis PA，Eigenrauch HA，等(1991)PNAS 88，3092-3096)，有一個報道稱臨床分離株中對ZDV的敏感性每降低10倍，對ddI的敏感性相應減少2.2倍，對ddC的敏感性減少2倍(Mayers DL，Japour AJ，Arduino JM，等(1994)Antimicrob Agent Chemother 38，307-314)。而且，在基線對ADV有抗性的病人加入ddC和ddI后比那些在基線野生型病毒的病人獲得RNA反應的可能性明顯降低(Holodniy M，Katzenstein D，Mole L，等(1996)J Infect Disease 174，854-857)。
Zalcitabine(塞西太并)和Didanosine(地達諾森)對ddI抗性是通過亮氨酸74-纈氨酸突變來調節(jié)的，突變產生了敏感性6倍至26倍的降低，但通過體外拮抗215位密碼子突變部分恢復了對ZDV的敏感性。該突變還導致對ddC的敏感性降低大約10倍。已有報道在對一組共64人的調查中，74位密碼子的突變頻率從開始治療的0增加到24周時的56％，這些病人CD4細胞平均數(shù)量基線是129/mm，以前接受ZDV治療進而接受ddI治療(Kozal MJ，Kroodsma K，Winterrs MA，等(1994)Annals Intern Med 121，263-268)。同樣，在ACTG143的研究中在接受了ddI單一治療，CD4細胞數(shù)在200-500/mm的首次接受治療和接受過ZDV治療的病人的混合群體中，1年時26個個體中有17人在74位密碼子發(fā)生突變，在本研究中接受ZDV/ddI聯(lián)合治療的病人中55人只有2人在74位密碼子發(fā)生突變(Shafer RW，Iversen AKN，Winters MA，等(1995)JInfect Disease 172，70-78)。
已經從長期接受ddI和ddC治療的幾個病人中分離出在65位密碼子突變(賴氨酸65-精氨酸)的病毒，這與ddI的IC503倍到5倍增加，ddC敏感性5倍到10倍的減少和對3TC敏感性20倍減少有關(id)(Gu Z，Gao Q，F(xiàn)ang H，等(1994)Antimicrob Agents Chemother 38，275-281)。69位密碼子突變(蘇氨酸69-天冬氨酸)是體外ddC選擇最常見的突變，它導致ddC敏感性降低5倍但不引起對其它核苷類似物交叉抗性(id)(Fitzgibbon JE，Howell RM，Haberzettl CA，等(1992)Antimicrob Agents Chemother 36，153-157)。對ddC抗性的形成最近已有綜述(Craig C，Moyle G(1997)AIDS11，271-279)。
聯(lián)合治療-zidovudine(瑞得呋啶)＋zalcitabine(塞西太并)或didanosine(地達諾森)用ZDV/ddC或ZDV/ddI聯(lián)合治療可能影響抗性出現(xiàn)的幾率，并且可能抑制在單一治療中觀察到的一些突變，但可導致新型突變模式的出現(xiàn)(因此可能更為有害)。
在聯(lián)合治療中可能出現(xiàn)新型突變模式。在接受持續(xù)用ZDV加ddI或ZDV/ddC聯(lián)合治療的病人中已經在62、75、77、116和151位密碼子偶爾鑒定出氨基酸取代獨特模式的病毒株這些病毒對兩種藥物均有抗性(id)(Shafer RW，Kozal MJ，Winter MA，等(1994)J Infect Disease 169，722-729)(Shirasaka T，Kavlick MF，Ueno T，等(1995)PNAS 92，2398-2402)，并且使得對stavudine(斯太呋啶)有交叉抗性和對3TC有部分交叉抗性。在用ZDV治療大于1年的病人中ddU的幾率變化從0到＞10％(ibid)。由3TC(184纈氨酸)和耐呋絡平(nevirapine)(181半胱氨酸)選擇的突變在體外可能加到該背景中(Shafer RW，Winters MA，IversenAKN，等(1996)Antimicrob Agents Chemother 40，2887-2890)，體外已有報道184纈氨酸和103天冬氨酸突變(loviride抗性)(Schmit JC，CogniauxJ，Hermans P，等(1996)J Infect Disease 174，962-968)。這些病毒突變體在藥物存在時有復制優(yōu)勢，在單一治療檢測不到這些新型突變的可能原因也許和它們不能與那些優(yōu)勢突變株競爭有關。
Lamivudine(拉咪呋啶)在單一治療和聯(lián)合治療中所觀察到體內184位密碼子替換(id)(Kuritzkes DR，Quinn JB，Benoit SL，等(1996)AIDS 10，975-981)(BartlettJA，Benoit SL，Johnson VA，等(1996)Annal Intern Med 125，161-172)(Eron JJ，Benoit SL，Jemsek J，等(1995)NEJM 333，1662-1669)(Katlama C，Ingrand K，Loveday C，等(1996)JAMA 276，118-125)(Staszewski S，Loveday C，Picazo JJ，等(1996)JAMA 276，111-117)，就會立刻出現(xiàn)對3TC的抗性(最常見的是蛋氨酸184-纈氨酸)，該突變的出現(xiàn)至少部分地與病毒治療失敗有關(id)(Moyle GJ(1996)Drugs 52，168-185)(GouldenMG，Cammack N，Hopewell PL，等(1996)AIDS 10，101-102)。該突變導致對3TC的高水平的抗性(IC50增加500倍到1000倍)，以及對ddI和ddC某些交叉抗性(敏感性減少4倍到8倍)(id)(Gu Z，Gao Q，LiX，等(1992)J Virol 66，7128-7135)。在體外該突變可能拮抗ZDV(id)(id)(id)，盡管在體外和臨床分離株有報道對ZDV/3TC有雙抗性。此外，可能作為補償，對于ZDV/3TC雙抗性而言諸如135位和333位密碼子突變是必須的，該課題正在研究中(id)。在NUCA3002研究中當對使用過ZDV的病人用3TC治療時，12周后33個病人中有82％的人產生了對3TC有抗性的表型。在10個對3TC有抗性的病人中在ZDV抗性的基線處(通過IC50＞0.2nM確定)有4人體內存在對ZDV更加敏感的病毒株，而6人對ZDV/3TC有雙抗性，這說明體內病毒對ZDV的再次敏感并不普遍。
Stavudine(斯太呋啶)通過定點突變確定的體外HIV對d4T抗性選擇已經在75位密碼子鑒定出一個突變，該突變使得對ddI和ddC的IC50增加7倍，并對其敏感性減少(Lacey SF，Larder BA(1994)Antimicrob Agent Chemother 38，1428-1432)。50位密碼子突變導致d4T敏感性減少30倍，但它對體外已發(fā)現(xiàn)的其它核苷類似物沒有交叉抗性(Gu Z，Gao Q，F(xiàn)ank H，等(1994)Leukemia 8，Suppl.1，166-169)。然而在體內，已有報道一系列氨基酸改變，包括75位密碼子突變但不是50位密碼子取代。在13個沒有接受過ZDV治療病人中在18到22個月治療后對d4T的敏感性最大減少了12倍，然而，有5人對ZDV的敏感性減少了9倍到176倍，有3人對ddI的敏感性減少了7倍至29倍(Lin PF，Samanta H，Rose RE，等(1994)JInfect Disease 170，1157-1164)，這說明在某些病人中使用d4T可能會限制以后的治療選擇。因此，還沒有建立d4T抗性的一致的突變模型。
Abacavir(愛博開呋)由定點突變證實HIV株在體外對Abacavir(愛博開呋)的抗性選擇表明個體株突變僅引起對Abacavir(愛博開呋)的低水平抗性，產生10倍的抗性需要多位點突變(至少3個)。M184V是體外在Abacavir(愛博開呋)存在時最常見的選擇抗性突變，并導致敏感性2-5倍的降低。在L74V和F115Y位的突變也導致對Abacavir(愛博開呋)敏感性喪失(Tisdale M，Alnadaf T，Cousens D(1997)Antimicrob Agent Chemother 41，1094-1098)。觀察到對ddC和ddI交叉抗性，但對d4T或ZDV沒有交叉抗性。來自病人病毒種群的HIV抗性已經歸因于先前與核苷類逆轉錄酶抑制劑抗性有關的突變，ZDV抗性突變(M41L，L210W T215Y)與3TC抗性突變(M184V)二者聯(lián)合表明對Abacavir(愛博開呋)敏感性降低8倍。多核苷抗性復合物(A62V，V75I，F(xiàn)77L，Y116F和Q151M)與敏感性降低17倍有關(Lanier R，Danehower S，Daluge S，等(1998)2ndInternational Workshop onHIV Drug Resistance and Treatment Strategies)。
Adefovir(愛得佛呋)在adefovir(愛得佛呋)存在時體外選擇導致K65R或者K70E突變的出現(xiàn)，這使得對adefovir(愛得佛呋)敏感性16-或9-倍降低。對病人的研究中已經報道了K70E突變，但沒有報道K65R突變。許多AZT抗性、3TC抗性和多藥物抗性的病毒對adefovir(愛得佛呋)敏感(Mulato AS，Lamy PD，Miller MD等(1998)Antimicrob Agent Chemother 42，1620-1628)。
抗性的臨床意義對于HIV感染選擇開始和隨后的治療行動應當堅決，但也應該有計劃并在了解抗性和交叉抗性模型的理性基礎上進行，以便將來有寬闊的治療選擇。
本發(fā)明的一個目的是提供能夠說明病人體內病毒種群是否對給定處方藥物有抗性的藥物敏感性和抗性試驗。本發(fā)明的另一個目的是病人在治療過程中對給定的一種或多種藥物產生抗性時為醫(yī)生提供能夠在治療配方中替代一種或多種藥物的試驗。本發(fā)明的又一個目的是提供一個在治療HIV感染和/或AIDS中能夠選擇有效藥物配方的試驗。本發(fā)明的又一個目的是提供了一個鑒定病人已經產生抗性的藥物，特別是鑒定對核苷類逆轉錄酶抑制劑的抗性。本發(fā)明的又一個目的是提供一種評價作用于特定病毒、病毒基因和/或病毒蛋白的候選藥物制劑生物有效性的試驗和方法，特別是與核苷類逆轉錄酶抑制劑相關的病毒抗藥的試驗和方法。本發(fā)明的再一個目的是提供評價HIV抗逆轉錄病毒藥物抗性和敏感性的方法和組成，顯然本發(fā)明的該目的和其它目的技術要求是作為一個整體。
本發(fā)明涉及運用表型和基因型方法監(jiān)控人類免疫缺陷型病毒感染進程以及它對抗病毒治療反應的方法。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了使HIV對抗病毒治療產生抗性的逆轉錄酶(RT)遺傳變異可以使用表型或基因型方法直接通過病人血漿的HIV RNA迅速確定，這些方法基于使用核苷酸擴增分析，例如聚合酶鏈反應(PCR)，這里基于核苷酸擴增的分析指的是基于PCR的分析。或者，不使用擴增步驟使用評價病毒蛋白的病毒核酸的方法也可使本發(fā)明監(jiān)控和/或改進抗逆轉錄病毒治療。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTI)治療的病人中HIV逆轉錄酶69位密碼子單獨突變/插入或與41和215位密碼子聯(lián)合突變，這些突變的存在與對d4T敏感性降低有關，并且對AZT，ddC，ddI，3TC和abacavir(愛博開呋)的敏感性降低有關，這些突變是在治療開始一段時間后在血漿HIV RNA中發(fā)現(xiàn)的。我們發(fā)現(xiàn)HIV逆轉錄酶在69位密碼子突變/插入附加41和215位密碼子突變可作為形成抗性和最終免疫低下的指示。特別是逆轉錄酶在69位密碼子突變/插入(T69SSA，T69SSG，T69SSS)可能與和AZT(例如M41L，L210W，T215Y)和3TC(M184V)或ddI/ddC(L74V)抗性相關的突變有關，這些突變與核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTI)敏感性降低有關，包括d4T敏感性降低和對AZT，ddC，ddI，3TC和abacavir(愛博開呋)的敏感性降低，還發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶在69位密碼子突變/插入(T69SSA，T69SSG，T69SSS)可能與和62位密碼子(例如A62V)和/或75位密碼子新型突變(例如V75M)對多種核苷類逆轉錄酶抑制劑抗性相關的突變有關，第一次觀察到在69位密碼子突變/插入(T69SSG)和75位密碼子突變(V75M)與d4T敏感性降低(3倍)和AZT敏感性實質性降低(30倍)有關。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在核苷類逆轉錄酶抑制劑(NRTI)治療的病人中與多種核苷類逆轉錄酶抑制劑抗性相關的HIV逆轉錄酶62、75、77、116和151位密碼子突變，該突變的存在與d4T，ddC，ddI和AZT敏感性降低有關。還發(fā)現(xiàn)突變特定地與抗性有關41、67、210、215和219位密碼突變(例如M41L，D67N，L210W，T215Y，K219Q)與AZT抗性；184位密碼突變(M184V)與3TC抗性；69位密碼子(T69D)與ddC抗性；或者215位密碼子新型突變(T215V)伴隨與多種核苷類逆轉錄酶抑制劑抗性相關的在62、75、77、116或151位密碼子突變，它們與d4T，ddC，ddI和AZT敏感性降低有關。本發(fā)明還部分地基于發(fā)現(xiàn)了在核苷酸類逆轉錄酶抑制劑治療的病人中HIV逆轉錄酶與AZT抗性相關的4個或更多的突變，突變是從由41、67、70、210、215和/或219密碼子(例如M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y/F，K219Q)組成的組群中篩選出的，它們單獨突變或與74位(與ddI抗性有關-V74I)，69位(與ddC抗性有關-T69D)，75位(V75M，V75S)和/或219位(K219N)密碼子突變同時存在，這些突變的存在與d4T敏感性降低有關。這些突變是在治療開始一段時間后在血漿HIV RNA中發(fā)現(xiàn)的。通過定點突變構建包含在75位密碼子單位點突變(V75I)的抗性檢測載體發(fā)現(xiàn)并沒有改變d4T的敏感性，但增加了AZT的敏感性，應用定點突變還發(fā)現(xiàn)151位密碼子單位點突變(Q151M)減少了d4T和AZT敏感性。本發(fā)明的又一個發(fā)現(xiàn)是在75和151位密碼子雙位點突變(V75I＋Q151M)減少了對d4T和AZT敏感性，應用定點突變還發(fā)現(xiàn)包含有5個(M41L，D67N，K70R，T215Y，K219Q)或6個(M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y，K219Q)與AZT抗性相關的突變的抗性檢測載體表現(xiàn)出對d4T和AZT敏感性降低，還發(fā)現(xiàn)包含有在62、69和75位密碼子單位點突變(A62V，T69SSA，V75I，V75T)的抗性檢測載體沒有減低對d4T的敏感性。然而，發(fā)現(xiàn)在75位密碼子單位點突變(V75I)或(V75T)對AZT敏感性輕微增加，T69SSA單位點突變輕微減少了AZT的的敏感性而A62V突變對AZT敏感性沒有影響。應用定點突變進一步研究發(fā)現(xiàn)包含有在62和69位密碼子雙位點突變(例如A62V＋T69SSA)的抗性檢測載體d4T敏感性的減少幅度并不比T69SSA單突變大，但可因T69SSA的單突變對AZT的敏感性進一步降低。應用定點突變進一步研究還發(fā)現(xiàn)包含有在62和75位密碼子雙位點突變(例如A62V＋V75I)的抗性檢測載體對d4T敏感性沒有影響，還發(fā)現(xiàn)A62V突變并不改變由V75I突變引起的對AZT敏感性的降低。應用定點突變進一步研究發(fā)現(xiàn)包含有在62、69和75位密碼子3個位點聯(lián)合突變(例如A62V＋T69SSA＋V75I)的抗性檢測載體d4T敏感性的減少幅度并不比T69SSA單突變大，還發(fā)現(xiàn)在62、69和75位密碼子3個位點聯(lián)合突變(例如A62V＋T69SSA＋V75I)中V75I突變完全抵消了由A62V和T69SSA聯(lián)合突變引起的對AZT敏感性的降低。應用定點突變進一步研究還發(fā)現(xiàn)包含有在41、69和215位密碼子3個位點突變(例如M41L＋T69SSA＋T215Y)的抗性檢測載體表現(xiàn)出對d4T和AZT敏感性顯著降低。應用定點突變進一步研究發(fā)現(xiàn)在41、62、69和215位密碼子4個位點聯(lián)合突變(例如M41L＋A62V＋T69SSA＋T215Y)對d4T敏感性的減少幅度比T69SSA單突變或T69SSA＋A62V雙突變的減少幅度大，還發(fā)現(xiàn)在41、62、69和215位密碼子4個位點聯(lián)合突變(例如M41L＋A62V＋T69SSA＋T215Y)中所有4突變聯(lián)合對AZT敏感性的減低幅度比M41L和T215Y突變聯(lián)合的降低幅度更大。應用定點突變進一步研究發(fā)現(xiàn)在41、62、69、184和215位密碼子5個位點聯(lián)合突變(例如M41L＋A62V＋T69SSA＋M184V＋T215Y)中，M184V突變抵消了由M41L，A62V，T69SSA和T215Y突變聯(lián)合引起的對AZT敏感性的降低。應用定點突變在又一個研究中發(fā)現(xiàn)在病人病毒的一個克隆中T69SSA突變發(fā)生回復(T69SSA-SSA69T)，T69SSA突變的回復體降低了d4T的抗性(即增加敏感性)，而且也降低了AZT的抗性(即增加敏感性)。
在應用定點突變的進一步研究中，發(fā)現(xiàn)在41、69和215位突變(例如M41L＋T69SSA＋T215Y)引入L210W突變導致對AZT敏感性實質性降低，而若沒有210突變發(fā)現(xiàn)AZT敏感性僅降低140倍。應用定點突變進一步研究還發(fā)現(xiàn)在41、62、69和215位密碼子4個位點突變(例如M41L＋A62V＋T69SSA＋T215Y)表現(xiàn)出對AZT敏感性實質性降低(大于1000倍)，對其它核苷類逆轉錄酶抑制劑的敏感性僅輕微降低。在應用定點突變的進一步研究中，發(fā)現(xiàn)在41、62、69和215位突變(例如M41L＋A62V＋T69SSA＋T215Y)引入L210W突變對藥物的敏感性幾乎沒有影響，表現(xiàn)出的抗性譜與僅有這4種突變存在時所得到的抗性譜相似。在應用定點突變的進一步研究中，發(fā)現(xiàn)在62和69位突變(例如A62V＋T69SSA)引入T215Y突變導致對AZT敏感性實質性降低(大于1000倍)，而若沒有215突變發(fā)現(xiàn)AZT敏感性僅降低7倍，還發(fā)現(xiàn)在62和69位突變(例如A62V＋T69SSA)引入L74V突變導致對AZT的敏感性回復到野生型。在應用定點突變的進一步研究中，發(fā)現(xiàn)在41、69、210和215位突變(例如M41L＋T69SSA＋L210W＋T215Y)引入V75M突變對藥物的敏感性幾乎沒有影響，表現(xiàn)出的抗性譜與僅有這4種突變存在時所得到的抗性譜相似。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內的PCR分析檢測69位密碼突變，以及HIV逆轉錄酶上包括41和/或215位在內的其它密碼子突變，這些突變與對抗逆轉錄病毒治療產生抗性的特定模型和隨后的免疫力降低相關。更加明確地，在本發(fā)明的又一個實施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內的PCR分析檢測69位密碼突變(T69SSA，T69SSG，T69SSS)，以及HIV逆轉錄酶上包括41(M41L)，210(L210W)，215(T215Y)，184(M184V)和/或74(L74V)位在內的其它密碼子突變，正如這里所描述的，這些突變與對抗逆轉錄病毒治療產生抗性的特定模型和隨后的免疫力降低相關。在本發(fā)明的又一個實施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內的PCR分析檢測HIV逆轉錄酶上62、75、77、116或115位密碼子單獨突變，或與之同時存在的包括41、67、210、215、219、184、69和/或215位密碼子在內的其它密碼子突變，正如這里所描述的，這些突變與對抗逆轉錄病毒治療產生抗性和免疫力降低相關，以上所述突變的密碼子包括，但不僅限于(A62V，V75I，F(xiàn)77L，F(xiàn)116Y，Q151M)和(M41L，D67N，L210W，T215Y，K219Q，M184V/I，T69D，T215Y)。在本發(fā)明的又一個實施方案中，可以使用包括表型和基因型分析在內的PCR分析檢測逆轉錄酶上4個或者更多的突變，這些突變組包括41、67、70、210、215和/或219位密碼子(例如M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y/F，K219Q)單獨突變，或與之同時存在的包括71(V74I)，69(T69D)，75(V75M，V75S)和/或219(K219N)位密碼子突變。正如這里所描述的，這些突變與對抗逆轉錄病毒治療產生抗性和免疫力降低相關。一旦在正在接受NRTI抗逆轉錄病毒治療的病人體內檢測到HIV逆轉錄酶上69位密碼單獨突變，或同時還有41和215位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受特定NRTI抗逆轉錄病毒治療的病人體內檢測到69和/或41、210、215、184和/或74位密碼突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受NRTI抗逆轉錄病毒治療的病人體內檢測到62、75、77、116和/或151位密碼單獨突變，或同時還有與AZT、3TC、ddC69抗性相關的突變或T215V突變，就必須考慮改變治療藥物配方。同樣，一旦在正在接受特定NRTI抗逆轉錄病毒治療的病人體內檢測到從由41、67、70、210、215和/或219位密碼組成的群組中篩選出的4個或更多的突變，或同時還有74(V74I)、69(T69D)、75(V75M，V75S)和/或219(K219N)位密碼子突變，就必須考慮改變治療藥物配方?？梢允褂冒ū硇秃突蛐头治鲈趦鹊腜CR分析檢測HIV逆轉錄酶上69位密碼子突變，和與之關聯(lián)的包括41和/或215位密碼子在內的其它密碼子突變，這些突變與對抗逆轉錄病毒治療產生抗性的特定模型和隨后的免疫力降低相關。同樣，可以使用包括表型和基因型分析在內的PCR分析檢測HIV逆轉錄酶上69位密碼子突變，和與之關聯(lián)的包括41、210、215、184和/或74位密碼子在內的其它密碼子突變，這些突變與對抗逆轉錄病毒治療產生抗性的特定模型和隨后的免疫力降低相關?？梢允褂冒ū硇秃突蛐头治鲈趦鹊腜CR分析檢測HIV逆轉錄酶上69位密碼子突變，和與之關聯(lián)的包括62和/或75位密碼子在內的其它密碼子突變，這些突變與對抗逆轉錄病毒治療產生抗性的特定模型和隨后的免疫力降低相關。可以使用包括表型和基因型分析在內的PCR分析檢測HIV逆轉錄酶上62、75、77、116和151位密碼子突變，或者和與之關聯(lián)的包括41、67、210、215、219、184、69位密碼子突變和/或T215V在內的其它密碼子突變，這些突變與對抗逆轉錄病毒治療產生抗性的特定模型和隨后的免疫力降低相關。在使用PCR分析評價抗逆轉錄病毒治療后，應該制定修改治療藥物配方的時間，它有賴于包括病人病毒的負載量、CD4細胞數(shù)量和以前的治療歷史這幾個因素。
本發(fā)明另外一個方面是提供了評價核苷類逆轉錄酶抗逆轉錄病毒藥物有效性的方法，包括(a)將包含有源于病人的片段和指示基因的抗性檢測載體導入宿主細胞；(b)培養(yǎng)來自步驟(a)的宿主細胞；(c)檢測指示基因在靶宿主細胞中的表達，其中指示基因的表達依賴于源于病人的片段；和(d)將來自步驟(c)指示基因的表達與在實施步驟(a)—(c)時不加入NRTI抗HIV藥物的情況下所檢測到的指示基因的表達二者進行比較，其中NRTI、抗HIV藥物的試驗濃度在步驟(a)—(c)；在步驟(b)—(c)；或在步驟(c)中存在。
本發(fā)明還提供了評價對病人進行非核苷類逆轉錄酶抗逆轉錄病毒治療的有效性的方法，包括(a)為NRTI抗HIV藥物繪制藥物敏感性標準曲線；(b)使用如上所述的敏感性試驗確定病人NRTI抗HIV藥物的敏感性；以及(c)將步驟(b)中NRTI抗HIV藥物的敏感性與步驟(a)中確定的標準曲線進行比較，其中NRTI抗HIV敏感性降低表明在病人體內形成了對抗HIV藥物的抗性。
本發(fā)明還提供了評價HIV抗逆轉錄病毒候選藥物藥物化合物的生物有效性的方法，包括(a)將包含有源于病人的片段和指示基因的抗性檢測載體導入宿主細胞；(b)培養(yǎng)來自(a)的宿主細胞；(c)檢測指示基因在靶宿主細胞中的表達，其中指示基因的表達依賴于源于病人的片段；和(d)將來自步驟(c)中指示基因的表達與在實施步驟(a)—(c)時不加抗病毒侯選藥物藥物化合物時所檢測到的指示基因的表達二者進行比較，其中抗病毒侯選藥物藥物化合物的試驗濃度在步驟(a)—(c)在步驟(b)—(c)；或在步驟(c)中存在。
靶細胞中在抗性檢測載體上指示基因的表達最終依賴于源于病人片段序列的行為，指示基因的功能可有可無。
本發(fā)明的另一個方面是為指導針對HIV/AIDS的抗逆轉錄病毒藥物敏感性和抗性試驗。本發(fā)明中用于HIV/AIDS的抗逆轉錄病毒藥物敏感性和抗性試驗的特定抗性檢測載體己被鑒定。
本發(fā)明的另一個方面是提供了鑒定和評價對于治療HIV和/或AIDS有潛力的治療性抗逆轉錄病毒藥物化合物的生物有效性的方法。另一方面，本發(fā)明針對一個新型抗性檢測載體，載體包含有一個源于病人的片段，進一步包含有一個或更多逆轉錄酶基因上的突變和一個指示基因。
附圖簡明描述

圖1抗性檢測載體。用圖形示意包含有一個源于病人的片段和一個指示基因的抗性檢測載體。
圖2雙細胞分析。示意性地表示分析方法。通過將源于病人的片段克隆到一個指示基因病毒載體中構建抗性檢測載體，接著將該抗性檢測載體與一個表達兼嗜性鼠白血病病毒(MLV)外殼蛋白或其它能侵染的病毒或細胞蛋白的表達載體共轉染，這樣產生的假型病毒顆粒包含有源于病人序列的蛋白酶(PR)和逆轉錄酶(RT)基因產物，接著收集顆粒用于感染新鮮細胞。使用缺陷的PR和RT序列表明熒光素酶的活性依賴于有功能的PR和RT。轉染后將蛋白酶抑制劑加入到細胞中，這樣在顆粒成熟過程中就存在抑制劑。另一方面，在病毒顆粒感染的同時或之前在細胞中加入逆轉錄酶抑制劑，該分析設不加藥物和加入寬范圍內不同濃度的藥物多個處理，測定熒光素酶的含量，計算不同藥物測試濃度下抑制百分比(％)。
圖3表型藥物敏感性圖例。通過繪制熒光素酶活性對log10濃度(um)抑制百分比分析數(shù)據。該圖用于計算抑制病毒復制的50％(IC50)和95％(IC95)所需的藥物濃度，抑制曲線向更高藥物濃度移位可以解釋為抗藥性的證據。圖中顯示出一種核苷類逆轉錄酶抑制劑(AZT)、一種非核苷類逆轉錄酶抑制劑(地拉呋啶delavirdine)和一種蛋白酶抑制劑(ritonavir)這3種典型曲線，與基線(治療前)樣品或對照藥物易感病毒相比，例如在基線樣品不易獲得時選用的PNL4—3或HXB—2，藥物敏感性曲線向更高藥物濃度(向右)位移反映了藥物敏感性(抗性)降低。
圖4d4T抗性病人分離株多重核苷類逆轉錄酶抑制劑抗性突變。這4種病毒表現(xiàn)出對d4T敏感性降低(4-12倍)，并包含與多重核苷類逆轉錄酶抑制劑抗性(A62V，V75I，F(xiàn)77L，F(xiàn)116Y，Q151M)相關的逆轉錄酶突變。一些病毒還包含有與AZT(M41L，D67N，L210W，T215Y，K219Q)，3TC(M184V/I)或ddC(T69D)抗性有關的特定的突變，或者以前沒有描述的突變(T215V)，受檢病毒的突變列在受檢病毒圖的下面。括號中的突變表明病毒群體由野生型和突變株混合組成。這里所描述的基因型只是其中的一部分，病人基因型的完整描述見實施例3。
圖5d4T抗性病人分離株T69SSX突變/插入。這4種病毒表現(xiàn)出對d4T敏感性降低(2-10倍)，并在逆轉錄酶上包含有以前沒有描述的突變/插入(T69SSA，T69SSG，T69SSS)。這些病毒還包含有與AZT(M41L，L210W，T215Y)和3TC(M184V/I)或ddI/ddC(L74V)抗性有關的突變，一些病毒還包含有與多重核苷類逆轉錄酶抑制劑抗性有關的突變(A62V)，和/或以前沒有描述的突變(V75M)，受檢病毒的突變列在受檢病毒圖的下面。括號中的突變表明病毒群體由野生型和突變株混合組成。這里所描述的基因型只是其中的一部分，病人基因型的完整描述見實施例4。
圖6d4T抗性病人分離株與AZT抗性相關的突變。這4種病毒表現(xiàn)出對d4T敏感性降低(3-6倍)，并包含有4個或更多的與AZT抗性有關的突變(M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y/F，K219Q)，一些病毒還包含有對ddI(V74I)，ddC(T69D)抗性有關的突變，或以前沒有描述的突變(V75M，V75S，L219N)。受檢病毒的突變列在受檢病毒圖的下面。括號中的突變表明病毒群體由野生型和突變株混合組成。這里所描述的基因型只是其中的一部分，病人基因型的完整描述見實施例4。
圖7定點突變與多重核苷類逆轉錄酶抑制劑抗性相關的突變。通過定點突變構建包含單位點(V75I)、(Q151M)和雙位點(V75I＋Q151M)突變的抗性檢測載體，圖中顯示出包含有這些定點突變的抗性檢測載體對d4T和AZT的表型敏感性。左欄Q151M突變對d4T的敏感性大約減少了3倍，V75I突變不改變對d4T的敏感性。右欄Q151M突變對AZT的敏感性大約減少了5倍，V75I突變對AZT的敏感性提高了大約2倍。
圖8定點突變與AZT抗性相關的突變。通過定點突變構建包含5個(M41L，D67N，K70R，T215Y，K219Q)或6個(M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y，K219Q)與AZT抗性相關的突變的抗性檢測載體，圖中顯示出包含這些定點突變的抗性檢測載體對d4T和AZT的表型易感性。左欄包含5個或6個與AZT抗性相關突變的抗性檢測載體對d4T的敏感性比對照抗性檢測載體小約2倍。右欄包含5個或6個與AZT抗性相關突變的抗性檢測載體對AZT的敏感性比對照抗性檢測載體小約75-180倍。
圖9定點突變在逆轉錄酶62、69和75位氨基酸的單突變。通過定點突變構建包含單位點(A62V，T69SSA，V75I，V75T)突變的抗性檢測載體。圖中顯示出包含這些定點突變的抗性檢測載體對d4T和AZT的表型易感性。左欄T69SSA和V75T突變對d4T的敏感性沒有大的減少(小于2倍)，A62V和V75I突變對d4T的敏感性沒有影響。右欄V75I和V75T突變稍微增加了對AZT的敏感性(大約2倍)，T69SSA突變稍微減少了AZT的敏感性(大約2倍)，A62V突變對AZT的敏感性沒有影響。
圖10定點突變在逆轉錄酶62、69和75位氨基酸的多位點突變。通過定點突變構建包含雙位點(A62V＋T69SSA)、(A62V＋V75I)和三位點(A62V＋T69SSA＋V75I)突變的抗性檢測載體。圖中顯示出包含這些定點突變的抗性檢測載體對d4T和AZT的表型易感性。左欄A62V和T69SSA突變聯(lián)合對d4T敏感性的降低程度并不比單獨的T69SSA突變大，然而，這2個突變對AZT的敏感性降低了約6倍。中間欄A62V和V75I突變聯(lián)合對d4T敏感性沒有影響，A62V不會改變由V75I突變引起的AZT敏感性的降低水平。右欄A62V、T69SSA和V75I突變聯(lián)合對d4T敏感性的降低程度并不比單獨的T69SSA突變大，V75I突變完全抵消了由A62V和T69SSA突變引起的AZT抗性增加的6倍。
圖11病人285克隆T69SSA定點回復體。使用定點突變回復從病人樣品285制得的抗性檢測載體分子克隆中的T69SSA突變。圖中顯示出親本克隆(T69SSA)和回復體克隆(SSA69T)對d4T和AZT的表型易感性。左欄T69SSA突變的回復突變對d4T的抗性減少約3倍。右欄T69SSA突變的回復突變對AZT的抗性減少約30倍。
圖12病人770克隆+/-T69SSG＋V75M.從病人樣770獲得的抗性檢測載體庫是不均一的，由突變體或沒有T69SSG和T75M突變組成。圖中顯示出含有或不含有這些突變的抗性檢測載體對d4T和AZT的表型敏感性。左欄含有T69SSG和T75M突變的抗性檢測載體克隆比沒有這些突變的克隆對d4T的抗性大3倍多。右欄含有T69SSG和T75M突變的抗性檢測載體克隆比沒有這些突變的克隆對AZT的抗性大約30倍。
圖13定點突變在逆轉錄酶41、62、69、184和215位氨基酸的多位點突變。通過定點突變構建包含三位點(M41L＋T69SSA＋T215Y)和四位點(M41L＋A62V＋T69SSA＋T215Y)或五位點(M41L＋A62V＋T69SSA＋M184V＋T215Y)突變的抗性檢測載體。圖中顯示出包含這些定點突變的抗性檢測載體對一組共6種核苷類逆轉錄酶抑制劑(AZT，ddC，DDI，3TC，d4T和Abaeavir(愛博開呋))的表型易感性。M41L＋T69SSA＋T215Y顯著減低所有供試核苷類逆轉錄酶抑制劑的敏感性(2-150倍)，加入A62V突變導致對AZT、d4T和ddI敏感性進一步降低，但不影響對3TC、ddC和Abacavir(愛博開呋)的敏感性。含有M41L＋A62V＋T69SSA＋M184V＋T215Y的抗性檢測載體比含有4個突變M41L＋A62V＋T69SSA＋T215Y的抗性檢測載體對AZT，d4T和ddI更加敏感，加入M184V導致對3TC敏感性降低，但不影響對ddC和Abacavir(愛博開呋)的敏感性。
本發(fā)明涉及監(jiān)控接受抗逆轉錄病毒治療的病人，特別是接受核苷類逆轉錄酶抑制劑抗逆轉錄病毒治療的病人體內HIV感染的臨床進程。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種評價病人抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(i)從HIV感染的病人中采集生物樣品；和(ii)確定生物樣品是否包含有編碼HIV逆轉錄酶的核苷酸，在逆轉錄酶上有一個或多個突變位點，這些突變的確與表型的敏感性/抗性的改變相關。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一種評價病人NRTI抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(i)從HIV感染的病人中采集生物樣品；和(ii)確定生物樣品是否包含有編碼在69位密碼子突變的HIV逆轉錄酶的核苷酸，運用表型敏感性分析本發(fā)明證實了HIV逆轉錄酶在69位密碼單獨突變或與41位和215位密碼聯(lián)合突變與d4T敏感性降低有關。在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一種評價病人NRTI抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(i)從HIV感染的病人中采集生物樣品；和(ii)確定生物樣品是否包含有編碼含有來自一組包括62、75、77、116和/或151位密碼子突變中的一個或更多突變的HIV逆轉錄酶的核苷酸，運用表型敏感性分析本發(fā)明證實了HIV逆轉錄酶在來自62、75、77、116和/或151位組成的密碼子組單獨突變，或與來自一組包括HIV逆轉錄酶上41、67、210、215、219、184、69和/或T215V位密碼子突變中的一個或更多突變同時突變，這些突變與d4T敏感性降低(抗性增加)有關。在上述情況下，感染病人的HIV病毒的表型敏感性/抗性圖和基因型圖已經修改以便反映對抗逆轉錄病毒制劑反應性變化。對于NRTI抗逆轉錄病毒治療，感染病人的HIV病毒可能對這里所描述的一種或多種NRTIs有抗性，但對其它NRTIs沒有抗性，因此在檢測到突變后需要或者增加抗逆轉錄病毒制劑的劑量，或者改換另外的抗逆轉錄病毒制劑，或者在病人治療的藥物化合物中加入一種或多種額外的抗逆轉錄病毒制劑。例如，如果病人在接受Stavudine(斯太呋啶)(d4T)治療時在62、75、77、116和/或151位密碼子單獨突變，或與來自一組包括HIV逆轉錄酶上41、67、210、215、219、184、69和/或T215V位密碼子突變中的一個或更多突變同時突變，，病人治療藥物化合物可能需要做以下修改，(i)或者改換不同的NRTI抗逆轉錄病毒制劑并停止d4T治療；或者(ii)增加d4T的劑量；或者(iii)在病人治療藥物化合物中加入其它抗逆轉錄病毒制劑?？梢酝ㄟ^檢測病毒負載量例如HIV RNA拷貝數(shù)評價經修改的治療的有效性，HIV RNA拷貝數(shù)降低與治療藥物化合物的有效性正相關。
用在這里的術語“正相關”指特定的結果得出特定最有可能的結論，而不是其它結論。
本發(fā)明另外一個優(yōu)選的、非限定性特定實施方案如下一種評價病人NRTI抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(i)從HIV感染的病人中采集生物樣品；(ii)從生物樣品中擴增HIV編碼的RNA，即將RNA反轉錄為cDNA，并用HIV引物擴增HIV序列，這樣擴增出的PCR產物包含有逆轉錄酶基因；(iii)用引物進行PCR擴增，這樣擴增出的PCR產物包含有野生型或69和41和215位密碼突變；以及(iv)通過PCR產物確定是否存在69或41或215位密碼突變或3個突變都存在。本發(fā)明又一個優(yōu)選的、非限定性特定實施方案如下一種評價病人NRTI抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(i)從HIV感染的病人中采集血漿樣品；(ii)從血漿樣品中擴增HIV編碼的RNA，即將RNA反轉錄為cDNA，并用HIV引物擴增HIV序列，這樣擴增出的PCR產物包含有逆轉錄酶基因；(iii)用引物進行PCR擴增，這樣擴增出的PCR產物包含有野生型或在來自一組包括62、75、77、116和151位組成的密碼子中的突變，和/或來自一組包括41、67、210、215、219、184、69位密碼子突變中的一個或更多突變；以及(iv)通過PCR產物確定是否存在62、75、77、116和151位密碼子突變，和/或來自一組包括41、67、210、215、219、184、69位密碼子突變中的一個或更多突變。本發(fā)明又一個優(yōu)選的、非限定性特定實施方案如下一種評價病人NRTI抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(i)從HIV感染的病人中采集血漿樣品；(ii)從血漿樣品中擴增HIV編碼的RNA，即將RNA反轉錄為cDNA，并用HIV引物擴增HIV序列，這樣擴增出的PCR產物包含有逆轉錄酶基因；(iii)用引物進行PCR擴增，這樣擴增出的PCR產物包含有野生型或在69和41、210、215、184或74位密碼子突變；以及(iv)通過PCR產物確定是否存在69位(T69SSA，T69SSG，T69SSS)和41位(M41L)、210位(L210W)、215位(T215Y)、184位(M184V)或74位(L74V)密碼子突變。本發(fā)明又一個優(yōu)選的、非限定性特定實施方案如下一種評價病人NRTI抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(i)從HIV感染的病人中采集血漿樣品；(ii)從血漿樣品中擴增HIV編碼的RNA，即將RNA反轉錄為cDNA，并用HIV引物擴增HIV序列，這樣擴增出的PCR產物包含有逆轉錄酶基因；(iii)用引物進行PCR擴增，這樣擴增出的PCR產物包含有野生型或在41、67、70、210、215和219位密碼子突變；以及(iv)通過PCR產物確定是否存在41位(m41L)、67位(D67N)、70位(K70R)、210位(L210W)、215位(T215Y/F)和219位(K219Q)密碼子突變。
HIV逆轉錄酶存在69位、41位和215位密碼子突變表明現(xiàn)行或將來的核苷類逆轉錄酶抑制劑治療的療效可能需要改變，因為如本發(fā)明所顯示的那樣，69位密碼子突變降低了d4T的敏感性。這里將給出運用本發(fā)明的方法改變核苷類逆轉錄酶抑制劑治療方案。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實HIV逆轉錄酶存在62、75、77、116和/或151位密碼突變表示現(xiàn)行或將來的核苷類逆轉錄酶抑制劑治療的療效可能需要改變，因為如本發(fā)明所顯示的那樣，在62、75、77、116和/或151位密碼子突變降低了d4T的敏感性。同樣，使用本發(fā)明的手段和方法證實HIV逆轉錄酶存在69位(T69SSA，T69SSG，T69SSS)和41位(M41L)、210位(L210W)、215位(T215Y)、184位(M184V)或74位(L74V)位密碼突變表示現(xiàn)行或將來的核苷類逆轉錄酶抑制劑治療的療效可能需要改變，因為如本發(fā)明所顯示的那樣，在69位密碼子的突變/插入，或聯(lián)同41、210、215、184或74位密碼子突變降低了d4T的敏感性。
本發(fā)明又一個優(yōu)選的、非限定性特定實施方案如下一種評價對HIV感染的病人進行抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的病人中采集生物樣品；和(b)確定生物樣品是否包含有編碼HIV逆轉錄酶的核苷酸，逆轉錄酶含有來自一組包括41、67、70、210、215和219位密碼子中的4個或更多突變，或聯(lián)同74位(V74I)、69位(T69D)、75位(V75M，V75S)或219位(K219N)密碼子同時突變。運用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)這4個或更多突變與d4T抗性明確有關。在又一個實施方案中，HIV逆轉錄酶在41、67、70、210、215和219位密碼子突變編碼41L，67N，70R，210W，215Y/F和219Q。在一個進一步的實施方案中，逆轉錄酶在V74I，T69D，V75M，V25S，K219N位密碼子突變，或聯(lián)合HIV逆轉錄酶上41、67、70、210、215和219位密碼子中的4個或更多的突變。
本發(fā)明又一個優(yōu)選的、非限定性特定實施方案如下一種評價對HIV感染的病人進行抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的病人中采集生物樣品；和(b)確定生物樣品是否包含有編碼HIV逆轉錄酶的核苷酸，逆轉錄酶含有來自一組包括67、75、77、116和151位密碼子中的1個或更多突變，或聯(lián)同(E6D，K20R，A33I，T39A，E44D，S68G，Y115F，I167V，E138A，G196A，I202V，T215V，D218E，和T240K)密碼子構成的密碼組中的1個或更多的突變。運用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)HIV逆轉錄酶在62、75、77、116和151位密碼子突變，或聯(lián)合由62、75、77、116和151位密碼子中的1個或更多的突變引起對d4T敏感性的降低。
本發(fā)明提供了一種評價HIV感染的病人抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的病人中采集生物樣品；和(b)確定生物樣品是否包含有編碼HIV逆轉錄酶的核苷酸，逆轉錄酶含有在69位密碼子(T69SSA，T69SSG，T69SSS)突變/插入，或聯(lián)同由V75M，A158S，K20R，V21I，K102M，V179I，V241L，L283I，E297R，E6D，Q174R，D177E，R284K，A288S，E291D密碼子構成的密碼組中的1個或更多的突變。運用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)在69位密碼子突變/插入的存在與d4T敏感性的降低正相關。
本發(fā)明提供了一種評價HIV感染的病人抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的病人中采集生物樣品；和(b)確定生物樣品是否包含有編碼HIV逆轉錄酶的核苷酸，逆轉錄酶含有由41、67、70、210、215和219密碼子構成的密碼組中的4個或更多的突變，或聯(lián)同由P1L，P9R，K20R，T39D，K43E，E44D，K64Y，V75M/S，G99R，L109V，V118I，K173E/T，I202T，R211H/T，D218E，K219N，H221Y，L228H，L283I，R284K和A288T密碼子構成的密碼組中的1個或更多的突變。運用表型敏感性分析發(fā)現(xiàn)由41、67、70、210、215和219密碼子構成的密碼組中的4個或更多突變的存在與d4T敏感性的降低正相關。
本發(fā)明還提供了使用抗性檢測載體的手段和方法，載體含有HIV基因，更進一步地含有藥物篩選所需的核苷類逆轉錄酶抑制劑突變。尤其是，本發(fā)明描述了包含有HIV逆轉錄酶的抗性檢測載體，逆轉錄酶具有藥物篩選所需的69、41和215位密碼突變。本發(fā)明還描述了HIV逆轉錄酶包含有由41、67、70、210、215和219位組成的密碼組中的4個或更多的密碼子突變的抗性檢測載體。本發(fā)明進一步涉及用于分離和鑒定核苷類HIV—1逆轉錄酶抑制劑抗性突變株的新型載體、宿主細胞及化合物成分，以及使用這些載體、宿主細胞和組份實施抗病毒篩選。本發(fā)明還涉及根據其抑制所述突變株的能力篩選候選藥物。
本發(fā)明提供了鑒定能夠影響HIV-1逆轉錄酶功能的化合物的方法，包括將化合物與HIV-1逆轉錄酶完整肽鏈或部分肽鏈接觸，其中69位密碼子改變成編碼SSS，SSG或SSA氨基酸殘基的插入，替換蘇氨酸，其中如果二者能夠結合說明該化合物能夠影響上述逆轉錄酶的功能。
本發(fā)明提供了鑒定能夠影響HIV-1逆轉錄酶功能的化合物的方法，包括將化合物與HIV-1逆轉錄酶完整肽鏈或部分肽鏈接觸，其中將由62、75、77、116和151位組成的密碼組中的1個或多個密碼子突變，這樣編碼的氨基酸殘基就分別不同于原先的丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、苯丙酰胺和谷氨酸，其中如果二者能夠結合說明該化合物能夠影響上述逆轉錄酶的功能。
本發(fā)明還提供了鑒定能夠影響HIV-1逆轉錄酶功能的化合物的方法，包括將化合物與HIV-1逆轉錄酶完整肽鏈或部分肽鏈接觸，其中將由41、67、70、210、215和219位組成的密碼組中的4個或更多個密碼子突變，這樣編碼的氨基酸殘基就分別不同于原先的甲硫氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸或賴氨酸，其中如果二者能夠結合說明該化合物能夠影響上述逆轉錄酶的功能。
用在這里的“源于病人的片段”包括來自于人類和各種動物種的片段，這些動物種包括但不僅限于猩猩、馬、牛、貓和狗。
源于病人的片段可以使用幾種不同的克隆技術中的任何一種參入抗性檢測載體中，這在PCT國際申請編號PCT/US97/01609中有詳細描述，該專利與1997年1月29日歸檔，這里一并參考。例如，克隆可以通過將class II限制性酶切位點引入質粒主鏈和源于病人的片段中，或通過尿嘧啶DNA糖基酶引物克隆。
源于病人的片段可以通過分子克隆或基因擴增的任何方法獲得，或者把要引入抗性檢測載體的源于病人的片段二端通過加入下述的接受位點進行修飾。例如，在諸如PCR的基因修飾的方法中，與病人序列接受位點相對應的限制性酶切位點可用PCR反應的引物加入到二端。同樣，在諸如cDNA克隆的分子克隆方法中，所述的限制性酶切位點可以摻入用于cDNA第一或第二條鏈合成的引物末端，或者在諸如DNA的引物修補的方法中，無論是否是克隆的還是未克隆的DNA，所述的限制性位點可以摻入用于修復反應的引物。設計病人序列的接受位點和引物以便提高源于病人的片段的表現(xiàn)度，設計有病人接受位點的系列抗性檢測載體使得在一個單獨抗性檢測載體中表達度低的源于病人的片段得到重新表達。
“抗性檢測載體”指包含一并由源于病人的片段和一個指示基因組成的DNA或RNA的一個或多個載體?？剐詸z測載體按照1997年1月29日歸檔的PCT國際申請?zhí)朠CT/US97/01609所描述方法制備，這里一并參考，它是擴增或克隆源于病人的片段，并將擴增或克隆的序列在病人序列接受位點插入到指示基因病毒載體中?；蛘?，抗性檢測載體(也指抗性檢測載體系統(tǒng))通過將病人序列接受位點引入包裝載體，擴增或克隆源于病人的片段，并將擴增或克隆的序列在病人序列接受位點插入到包裝載體中，用指示基因病毒載體共轉染該包裝載體。
“指示或指示基因”如1997年1月29日歸檔的PCT國際申請?zhí)朠CT/US97/01609所描述的那樣，指編碼一個可以直接或通過反應提供一個可以測量或可見現(xiàn)象的蛋白、DNA或RNA結構，例如該現(xiàn)象是顏色或可測波長的光，對于用于指示的DNA或RNA是特定DNA或RNA結構的改變或產生。指示基因的優(yōu)選的例子是編碼β-半乳糖苷酶的大腸桿菌lacZ基因，編碼來自例如Photonis pyralis(螢火蟲)或Renilla reniformis(海紫羅蘭)的熒光素酶的luc基因，編碼堿性磷酸酶的大腸桿菌phoA基因，綠熒光蛋白和編碼氯霉素乙酰轉移酶的細菌CAT基因。指示因子和指示基因如1997年1月29日歸檔的PCT國際申請?zhí)朠CT/US97/01609所描述的那樣，可以是有功能的或沒有功能的。
本發(fā)明的表型藥物敏感性和抗性實驗可以如1997年1月29日提交的PCT國際申請?zhí)朠CT/US97/01609所描述的那樣在一種或多個宿主細胞中實施，這里一并參考。病毒藥物敏感性由抑制指示基因表達量的給定百分率所需的抗病毒制劑的濃度所確定(例如，抗病毒制劑的IC50是抑制指示基因表達量50％的濃度)。給定抗病毒藥物的藥物敏感性標準曲線可以使用上述專利申請所描述的方法為病毒區(qū)段繪制，它可以是標準實驗室病毒區(qū)段，或者來自沒有用藥史的病人(即沒有接受抗病毒藥物治療的病人)。相應地，對于一個特定的病人，病毒藥物抗性是病毒藥物敏感性的降低，這可以通過將藥物敏感性與給定標準比較來確定，或者在一段時間內相繼測定一次或多次指示基因表達抑制的增加來確定(即減少指示基因的表達)。
加入到檢測系統(tǒng)的抗病毒藥物所選擇的添加時間依賴于抗病毒藥物的靶。例如，對于HIV蛋白酶抑制劑，包括saquinavir，ritonavir，indinavir和nelfinavir，它們在用抗性檢測載體在合適的濃度范圍內轉染時或之后立刻加入到包裝宿主細胞中，對于HIV逆轉錄酶抑制劑，包括AZT，ddI，ddC，d4T，3TC，耐呋絡平(nevirapine)和地拉呋啶(delavirdine)，它們在用抗性檢測載體病毒顆粒在合適的濃度范圍內轉染時或之前加入到包裝宿主細胞中?；蛘?，抗病毒藥物在整個分析中都存在。在寬范圍濃度內選擇檢測濃度，一般在大約在0.1nM到100uM之間，而且對于下列每種藥物有特定濃度AZT，從大約6nM到大約400uM；ddI從大約15nM到大約1,000uM；3TC，從大約9nM到大約600uM；d4T，從大約6nM到大約400uM；ddC，從大約15nM到大約1,000uM；耐呋絡平(nevirapine)，從大約0.7nM到大約50uM；地拉呋啶(delavirdine)，從大約0.07nM到大約5uM；Saquinavir，從大約0.02nM到大約1.5uM；indinavir，從大約0.02nM到大約1.5uM；nelfinavir，從大約0.02nM到大約1.5uM；和ritonavir，從大約0.05nM到大約3uM。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，在表型藥物敏感性和抗性試驗中，使用包含在69、41和215位密碼子突變的逆轉錄酶的抗性檢測載體檢測侯選核苷類逆轉錄酶抑制劑抗病毒藥物化合物。在本發(fā)明的又一個實施方案中，在表型藥物敏感性和抗性試驗中，使用包含在由62、75、77、116和/或151位組成的密碼子組中選擇的一個或多個密碼子突變的逆轉錄酶的抗性檢測載體檢測侯選核苷類逆轉錄酶抑制劑抗病毒藥物化合物。在本發(fā)明的又一個實施方案中，在表型藥物敏感性和抗性試驗中，使用包含在由M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y/F和/或K219Q位組成的密碼子組中選擇的4個或更多個密碼子突變的逆轉錄酶的抗性檢測載體檢測侯選核苷類逆轉錄酶抑制劑抗病毒藥物化合物。在本發(fā)明的又一個實施方案中，在表型藥物敏感性和抗性試驗中，使用包含69位密碼子(T69SSA，T69SSG，T69SSS中其一)和M41L和T215Y突變，以及在由M184V/I，L74V，A62V，V75M組成的密碼子組中選擇的一個或多個密碼子突變的逆轉錄酶的抗性檢測載體檢測侯選核苷類逆轉錄酶抑制劑抗病毒藥物化合物。侯選抗病毒藥物在合適的濃度范圍范圍和在轉染步驟加入到檢測系統(tǒng)中?；蛘?，可以檢測一種以上的侯選抗病毒藥物，或者侯選抗病毒藥物可以聯(lián)同已經證實的抗病毒藥物一并檢測，已經證實的抗病毒藥物是例如AZT，ddI，ddC，d4T，3TC，地拉呋啶(delavirdine)，耐呋絡平(nevirapine)，saquinavir，ritonavir，indinavir，nelfinavir或正在臨床試驗的藥物，例如Abacavir(愛博開呋)，或amprenavir或efavirenz。侯選抗病毒藥物的有效性將通過測定指示基因的表達或抑制進行評價。在本發(fā)明的另一個方面，藥物敏感性和抗性試驗可用于篩選病毒突變，在鑒定出對已知的抗逆轉錄病毒藥物或侯選抗逆轉錄病毒藥物的抗性突變后，分離抗性突變并分析DNA，這樣就可以組建病毒抗性突變庫，這就能篩選單獨的或聯(lián)用的侯選核苷類逆轉錄酶抑制劑抗逆轉錄病毒藥物。這就使得一個普通的技術人員也能鑒定有效的核苷類逆轉錄酶抑制劑抗逆轉錄病毒藥物，并設計有效的治療配方。
一般材料和方法用于構建載體、轉染和感染細胞的大多數(shù)技術在技術人員中被廣泛使用，多數(shù)專業(yè)人員都熟悉這些描述了特定條件和方法的標準來源的材料。然而，為了方便起見，以下段落可以作為指南。
“質?！焙汀拜d體”用小寫格p后加字母和/或數(shù)字表示。這里的初始質?；蛘呤袌隹梢再I到，或者不受限制地已公開發(fā)表，或者可以根據已發(fā)表的方法從可以得到的質粒進行構建。此外，與那些描述等同的質粒在該領域中公知，對于一般熟習的技術人員也是熟知的。
本發(fā)明中構建載體使用的連接和限制酶切技術在該領域為大家所公知(見Ausubel等，(1987)Current Protocol in Molecular Biology，WileyInterscience or Maniatis等，(1992)in Molecular CloningA laboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y)。分離的質粒、DNA序列或合成的寡聚核苷酸序列被切割、加尾和再連接成想要的形式，所有已摻入人工合成DNA的DNA構建體通過DNA序列分析來確定(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74，5463-5467)。
DNA的“消化”指用限制性酶催化切割DNA，僅作用于DNA特定序列、限制性位點。這里使用的各種限制性酶市場能買到，它們的反應條件、輔因子和其它要求為一般熟悉的技術人員所熟知。為分析目的，在20ul的緩沖液中一般1ug的質粒或DNA片段使用2單位的酶，或者，使用過量的限制性酶確保DNA底物的完全消化。在37℃溫育大約1至2小時的時間通?？尚校M管突變體可能有抗性。每次溫育后，通過酚/氯仿抽提去除蛋白，并且可以再用其中的一種抽提，用乙醇沉淀從水相中回收核酸。可以使用標準方法通過聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳對酶切片段進行大小排阻分離，大小排阻分離的一般描述見酶學方法(Methods Enzymology)65499-560(1980)。
限制性酶切片段可以用大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段處理平端化，反應加入4種三磷酸脫氧核苷(dNTPs)，20℃使用溫育時間15至25分鐘，50mM Tris(pH7.6)50mM NaCl，6mM MgCl2，6mM DDT和5-10dNTPs。即使存在有4種dNTPs，Klenow片段會補平5’粘末端，而切除3’突出的單鏈。如果需要，可通過僅提供dNTPs中的一種或者選擇的dNTPs，根據粘性末端特性進行選擇性修復。用Klenow處理后，混合物用酚/氯仿抽提和酒精沉淀，在合適的條件下用S1核酸酶或Bal-31處理水解任何單鏈部分。
連接在以下標準條件和溫度下在15-50ul的體系中進行20mMTirs-HCl pH7.5，l0mM MgCl2，10mM DTT，33mg/ml BSA，10mM-50mM NaCl，和或者40uM ATP，0.01-0.02(Weiss)單位的T4 DNA連接酶，0℃(用于“粘端”連接)，或者1mM ATP，0.3-0.6(Weiss)單位的T4 DNA連接酶，14℃(用于“平端”連接)。分子間粘端連接通常在33-100ug/ml總DNA濃度(5-100mM總最終濃度)下進行，分子間平端連接(通常使用10-30倍摩爾的過量接頭)在1uM總末端濃度下進行。
“瞬時表達”指在大約轉染的1天到2周內非放大表達。一個特定目的異源蛋白瞬時表達的最佳時間可能依賴于幾個因素而有所不同，這包括例如，可能使用的反式作用因子，翻譯調控機制和宿主細胞。當轉染的特定質粒起作用即轉錄和翻譯時，就開始了瞬時表達。此時進入細胞的質粒DNA轉移到核中，DNA是非整合狀態(tài)，在核中自由存在，被細胞吸收的質粒的轉錄發(fā)生在這一段時間。轉染后質粒DNA可能被降解或由細胞分裂而被稀釋，也會發(fā)生細胞染色質內的隨機整合。
一般來說，載體包含啟動子和控制序列，它們來源于與特定宿主細胞聯(lián)用的宿主細胞相容的種類。適用于原核宿主的啟動子說明性的包括β-內酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜交啟動子例如tac啟動子。然而，其它功能性細菌啟動子也可用。除原核生物外，也可使用真核微生物例如酵母培養(yǎng)，釀酒酵母或正常貝氏酵母是最常用的真核微生物，盡管許多其它的種類也常用。可以通過幾種來源獲得哺乳動物宿主細胞載體的控制轉錄的啟動子，例如，病毒基因組例如多瘤病毒、猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉錄病毒、乙肝病毒和舉細胞病毒，或來自異源哺乳動物的啟動子，例如β-肌動蛋白啟動子。能很方便地獲得早期和晚期啟動子作為猴病毒40(SV40)包含猴病毒40復制起始的猴病毒40限制性片段，可以很方便地獲得人類腺病毒的早期啟動子作為HindIII限制性片段。當然，這里來自宿主細胞或相關種的啟動子也是可用的。
這里使用的載體可以包含選擇基因，又定義為可選擇性標記。選擇基因編碼的蛋白對于轉染了質粒的宿主細胞的存活和生長是必需的。對于哺乳動物細胞適合的選擇性標記的例子包括二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、鳥氨酸脫氨甲酰基酶基因、多種藥物抗性基因(mdr)、腺苷脫氨酶基因和谷氨酰胺合成酶基因。當這些選擇性標記成功地導入哺乳動物細胞時，轉染的哺乳動物細胞在選擇壓力下就能存活。有二類截然不同廣泛使用的選擇配方，第一類是根據細胞的代謝，使用突變的細胞株，它們缺乏生長能力，要依賴于添加培養(yǎng)基。第二類是指顯性選擇，所指的選擇方案用于任何細胞類型，不需要使用突變細胞株。這些方案通常使用藥物捕獲宿主細胞的生長，那些有新型基因的細胞會表達帶有藥物抗性的蛋白，在選擇中存活。這些顯性選擇的例子使用的藥物有新霉素(Southern and Berg(1982)J.Molec.Appl.Genet.1，327)、霉酚酸(Mulligan and Berg(1980)Science 209，1422)或潮霉素(Sugden等(1985)Mol.Cell.Biol.5，410-413)。以上給出的3個例子在真核控制下應用細菌基因分別賦予對相應的藥物新霉素(G418或龍膽素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。
“轉染”指將DNA導入宿主細胞，這樣DNA就表達，不管是否是功能性表達；DNA還可以作為染色體之外的元件，或整合到染色體中復制。無論是否提到，這里轉染宿主細胞所使用的方法是Graham和van derEb(1973)Virology 52，456-457所用的磷酸鈣共沉淀法。轉染另外的方法是電穿孔、DEAE-葡聚糖法、脂質轉染法和biolistics(Kriegler(1990)GeneTransfer and ExpressionA Laboratory Manual，Stockton Press)。
宿主細胞可以用本發(fā)明的表達載體轉染，在經修改以便適合于誘導啟動子、篩選轉化子或擴增基因的傳統(tǒng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。宿主細胞在F12∶DMEM(Gibco)50∶50上培養(yǎng)，添加谷氨酰胺不加抗生素。培養(yǎng)條件，例如溫度、pH及諸如此類，是那些以前用于宿主細胞選擇性表達的條件，對于普通技術人員將一目了然。
以下實施例僅僅表示目前已知的實施本發(fā)明的最佳模式，但不應當解釋為限制本發(fā)明。本說明書引用的所有發(fā)表物和專利在這里均作為一個整體一并參考，就好象每一個發(fā)表物或專利應用都是特定的和單獨的說明一并參考。
實施例1使用抗性檢測載體進行表型藥物敏感性和抗性試驗使用如1997年1月29日歸檔的PCT國際申請?zhí)朠CT/US97/01609所描述的手段和方法實施表型藥物敏感性和抗性試驗，這里一并參考。
在這些實驗中，對應于HIV蛋白酶和逆轉錄酶編碼區(qū)的源于病人的片段可以使用從HIV感染的個體的血漿中存在的病毒顆粒中分離的病毒RNA，通過反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增源于病人的片段，或者通過對抗性檢測載體DNA的親本克隆點突變制各野生型HIV-1型的突變株。使用經典方法實施病毒RNA的分離(例如，RNAgents TotalRNA Isolation System，Promega，Madison WI或RNAzol，Tel-Test，F(xiàn)riendswood，TX)。RT-PCR程序分二步，使用逆轉錄病毒的逆轉錄酶(例如Moloney MuLV逆轉錄酶(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ)，或禽成髓細胞瘤病毒(AMV)逆轉錄酶，(Boehringer Mannheim.Indianapolis，IN))將病毒RNA復制成cDNA，接著使用熱穩(wěn)定DNA聚合酶擴增cDNA(例如，Taq(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ)，Tth(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ)，PrimeZyme(從Thermus brockianus，Biometra，Gottingen中分離，Germany))或者如“長PCR”操作所描述的將熱穩(wěn)定聚合酶聯(lián)用(Bames，WM.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 91，2216-2220)(例如，擴展的高保真PCR系統(tǒng)(Taq＋Pwo)，(Boehringer Mannheim，Indanapolis，IN)或GeneAmp XL PCR Kit(Tth＋Vent)，(Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，NJ))。
用于擴增“檢測”源于病人的片段的引物，ApaI引物(PDSApa)和AgeI引物(PDSAge)，包含ApaI和AgeI識別的位點序列，它們引入到PCR產物的5’和3’末端，這在1997年1月29日歸檔的PCT國際申請?zhí)朠CT/US97/01609分別有描述。
摻入“檢測”源于病人片段的抗性檢測載體是按照1997年1月29日歸檔的PCT國際申請?zhí)朠CT/US97/01609的描述進行構建的，使用病毒RNA作為模板和寡聚核苷酸PDSApa和PDSAge作為引物，通過RT-PCR制備1.5kB的DNA擴增產物，然后用ApaI和AgeI或同切點酶PINAI消化。為了確保和合成的抗性檢測載體相對應的質粒DNA含有特定病人血漿中存在的HIV病毒準種的代表樣品，將在給定的抗性檢測載體構建中獲得的大量(＞100)的獨立的轉化子合并，用于質粒DNA的制備。
編碼兼嗜性MuLV 4070A env基因產物的包裝表達載體能夠在抗性檢測載體宿主細胞中產生抗性檢測載體病毒顆粒，它能有效感染人類靶細胞。除env基因外，編碼所有HIV基因的抗性檢測載體用于轉染包裝宿主細胞(一旦轉染的宿主細胞是指作為抗性檢測載體宿主細胞)。編碼兼嗜性MuLV 4070A env基因產物的包裝表達載體與抗性檢測載體聯(lián)用，能夠在抗性檢測載體宿主細胞中產生傳染性的假型抗性檢測載體病毒顆粒。
使用包裝宿主或由人類胚胎腎細胞株293(Cell Culture Facility，UCSan Francisco，SF，CA)或Jurkat白血病T細胞株(Arthur Weiss.UC SanFrancisco，SF，CA)組成的靶宿主細胞，用抗性檢測載體實施抗性試驗。
使用二種宿主細胞類型用抗性檢測載體實施抗性試驗。抗性檢測載體病毒顆粒由第一個宿主細胞(抗性檢測載體宿主細胞)產生，它是通過用抗性檢測載體和包裝表達載體轉染包裝宿主細胞來制備，接著抗性檢測載體病毒顆粒用于感染第二個宿主細胞(靶宿主細胞)，在該細胞中可以測量指示基因的表達。
構建包含功能熒光基因盒的抗性檢測載體，并用抗性檢測載體DNA轉染宿主細胞。包含源于病人的逆轉錄酶和蛋白酶序列的抗性檢測載體對抗逆轉錄病毒制劑有敏感性或抗性，例如核苷類逆轉錄酶抑制劑、非核苷類逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。無論是否存在蛋白酶抑制劑，通過將抗性檢測載體病毒顆粒轉染宿主細胞產生抗性檢測載體病毒顆粒，在核苷類逆轉錄酶抑制劑或非核苷類逆轉錄酶抑制劑或藥物濃度增加的條件下用于感染靶宿主細胞。藥物存在下感染的靶宿主細胞中產生的熒光酶活性量與藥物不存在時感染的靶宿主細胞中產生的熒光酶活性量二者比較，抑制沒有藥物時檢測熒光素的50％(抑制濃度50％，IC50)所需要的藥物量作為藥物抗性檢測，通過繪制藥物對log10藥物濃度的百分比抑制確定IC50的值。
宿主細胞接種于10厘米直徑的培養(yǎng)皿中，接種幾天后用抗性檢測載體質粒DNA和包膜表達載體轉染。轉染用磷酸鈣沉淀程序完成，含有DNA沉淀劑的細胞培養(yǎng)基在轉染后的1到24小時換成新鮮的培養(yǎng)基。轉染后的1至4天收集包含抗性檢測載體病毒顆粒的細胞培養(yǎng)液，在80℃儲存前濾過0.45mm的濾膜。在收集的細胞培養(yǎng)液中HIV衣殼蛋白(p24)的含量通過制造商描述的EIA方法(SIAC；Frederick，MD)確定。感染前，靶細胞(293和293/T)接種于細胞培養(yǎng)液中，使用來自模擬轉染(不含DNA)或包含沒有包膜表達質粒的抗性檢測載體質粒DNA的轉染的細胞培養(yǎng)液實施對照感染。感染后的1至3天或更多天移去培養(yǎng)基，在每個孔加入細胞裂解液(Promega)，分析細胞裂解物的熒光素活性(Fig.3)。藥物的抑制效果用以下公式計算％熒光酶抑制＝1－(RLUluc[藥物]÷RLUluc)×100其中RLUluc[藥物]是藥物存在時感染細胞中熒光素酶活性的相對光單位，RLUluc是藥物不存在時感染細胞中熒光素酶活性的相對光單位。IC50的值通過S形曲線獲得，曲線是從繪制藥物對log10藥物濃度的百分比抑制的數(shù)據中產生。藥物抑制曲線見(Fig.3)。
實施例2表型敏感性和基因型相關分析病人HIV樣品表型敏感性分析如實施例1中描述構建抗性檢測載體。在表型分析中測定抗性檢測載體，或來源于抗性檢測載體庫的克隆，以便精確和定量確定抗逆轉錄病毒藥物欄的敏感性水平，該抗逆轉錄病毒藥物欄可能包括幾類成員，象核苷類似物逆轉錄酶抑制劑(NRTIs)、非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)和蛋白酶抑制劑(PRIs)。在有新的藥物或新藥物靶時該藥物欄可以擴大。檢查所有檢測藥物敏感性模式，并與已知敏感性模式比較，病人樣品可進一步檢測與觀察到的敏感性模式相關的基因型變化。
病人HIV樣品基因型分析抗性檢測載體DNAs，無論是庫或克隆，可通過實施例2所描述的任何基因型方法進行分析。在本發(fā)明的一個實施方案中，運用病毒RNA純化、RT/PCR和ABI鏈終止子自動測序確定病人HIV樣品序列，確定的序列同數(shù)據庫中存在的對照序列比較，或如果可能，與治療開始之前病人的樣品比較?；蛐蜋z測是找出與對照或治療前序列不同的序列，以及它與觀察到的表型之間的相關性。
點突變的表型敏感性分析通過構建包含在限定的野生型(對藥物敏感)遺傳背景下特定突變的抗性檢測載體評價觀察到的基因型變化與藥物敏感性表型模式變化之間的相關性。突變可以單獨摻入，和/或其它已知的認為能調節(jié)HIV對特定藥物或藥物組敏感性的藥物抗性突變一并摻入。通過任何廣為公知的定點突變的方法將突變引入抗性檢測載體。在本發(fā)明的一個實施方案中，使用大引物PCR的方法進行定點突變，然后使用上述表型敏感性分析檢測包含特定突變或突變組的抗性檢測載體，并將敏感性圖譜與沒有特定突變的遺傳限定的野生型(對藥物敏感)抗性檢測載體二者比較，對所檢測的抗逆轉錄病毒藥物表型敏感性模式觀察到的變化可以歸因于引入到抗性檢測載體中的特定突變。
實施例3
表型敏感性與基因型分析的相關性與多種藥物抗性(MDR)突變相聯(lián)的D4T抗性來自病人96-136，97-240，98-955和98-960的抗性檢測載體的表型分析按照實施例1所描述的方法從標記為96-136，97-240，98-955和98-960的病人樣品中構建抗性檢測載體。病人136和240以前已經用包括d4T的藥物化合物進行了不同時間的治療，病人955和960的藥物治療史還不清楚。使用病毒RNA的分離和RT/PCR制備包含所有蛋白酶和逆轉錄酶1-313位氨基酸的病毒序列的源于病人的片段，源于病人的片段插入指示基因中，從而構建標記為RTV-136，RTV-240，RTV-955和RTV-960的抗性檢測載體。運用表型敏感性分析檢測這些RTVs載體，以便準確和定量地確定抗逆轉錄病毒藥物欄的敏感性水平。抗逆轉錄病毒藥物欄包括已知的幾組成員，包括核苷類逆轉錄酶抑制劑(AZT，3TC，d4T，ddI，ddC和abacavir(愛博開呋))、非核苷類逆轉錄酶抑制劑(地拉呋啶(delavirdine)和耐呋絡平(nevirapine))和蛋白酶抑制劑(indinavir，nelfinavir，ritonavir和saquinavir)。測定每種檢測藥物的IC50，檢驗病人病毒對每種藥物的敏感性，并與已知的敏感性模型比較，觀察到在這些RTV載體庫中的每一種與野生型對照相比對4dT的敏感性均降低。進一步檢查病人樣品可能與觀察到的d4T敏感性模式相關的基因型變化。
確定病人RTVDNAs的基因型通過ABI鏈終止子自動測序分析RTV DNAs，將核苷酸序列與野生型分化B HIV-1(HIV Sequence Database Los Alamos，NM)的相同序列比較，檢查核苷酸序列與對照序列不同的序列。RTV-136在M41L，D67N，V75I，F(xiàn)116Y，Q151M，M184V，T200A，和T215Y位點有突變，RTV-136的所有突變在每個位點是以野生型和突變氨基酸混合存在的。RTV-240在A62V，S68G，V75I，F(xiàn)77L，F(xiàn)116Y，E138A，Q151M，和M184V位點有突變，RTV-955在E6D，K20R，V35I，A62V，D67N，T69D，V75I，F(xiàn)77L，K101E，K103N，Y115F，F(xiàn)116Y，Q151M，I167V，Y181C，M184V，G190A，1202V，R211K，F(xiàn)211K，F(xiàn)214L，T215V，和K219Q位有突變，在101、103、181和190位突變在每個位點是以野生型和突變氨基酸混合存在的。RTV-960在A33I，T39A，M41L，E44D，D67N，T69D，K103N，Q151M，M184I，G190A，L210W，R211K，T215Y，D218E，T240K，和A288S位有突變，在A62V，V75I，F(xiàn)77L，F(xiàn)116Y，和Q151M位突變以前已經描述會導致對核苷類逆轉錄酶抑制劑的廣譜交叉抗性，也稱作多種藥物抗性(MDR)突變。所有這些RTV DNAs包含一個或幾個這些MDR突變。此外，一些RTV DNAs具有與AZT抗性(M41L，D67N，L210W，T215Y，和K219Q)、ddC抗性(T69D)、非核苷類逆轉錄酶抑制劑抗性(K101E，K103N，Y181C，和G190A)、3TC抗性(M184V)相關的突變，或以前沒有發(fā)現(xiàn)特性的突變(E6D，K20R，A33I，T39A，E44D，S68G，Y115F，I167V，E138A，G196A，1202V，T215V，D218E，和T240K)。已經知道在V35I，R211K，和F214L位突變是HIV野生型(對藥物敏感)突變株的多態(tài)性。
定點突變構建包含Q151M單獨突變，或與公認的調節(jié)HIV對核苷類逆轉錄酶抑制劑敏感性的V75I藥物抗性突變聯(lián)合突變的抗性檢測載體。使用定點突變的大引物PCR方法將突變引入抗性檢測載體。(Sakar G andSommar SS(1994)Biotechniques 8(4)，404-407)。運用上述表型敏感性分析檢測含有Q151M突變(Q151M-RTV)的抗性檢測載體，將結果與在151位點是野生型的遺傳限制抗性檢測載體比較，與野生型相比，Q151M-RTV對核苷類逆轉錄酶抑制劑、d4T的表型敏感性模式發(fā)生了改變。在其它野生型背景下(即Q151M單獨突變)，Q151M-RTV比野生型對照RTV對d4T的敏感性要低一些，在Q151M-RTV中還觀察到對AZL ddC和ddI敏感性的顯著變化。還將Q151M突變引入到包含V75I突變的RTV中，將V75I突變加入Q151M背景中導致對AZT敏感性增加和對d4T敏感性降低。V75I單獨突變對d4T敏感性沒有影響，并導致對AZT敏感性增加。還構建了包含A62V單獨突變和與V75I聯(lián)合突變的RTVs載體，這些RTVs與野生型RTV相比它們對d4T敏感性不變，然而二者對AZT的敏感性有輕微增加。
實施例4表型敏感性與基因型分析的相關性與在逆轉錄酶69位氨基酸插入相關的4dT抗性來自病人97-621，97-285，98-690，98-770和98-771的抗性檢測載體的表型分析按照實施例1所描述的方法從標記為97-621，97-285，98-690，98-770和98-771的病人樣品中構建抗性檢測載體。病人樣品285和690是從同一病人間隔6個月獲得的系列樣品，病人285/690，770和771以前已經用包括d4T的藥物化合物進行了不同時間的治療，病人621的藥物治療史還不清楚。
有69SSX插入的病毒樣品的病人治療史病人VL#770(JCW)最初用AZT單一治療，接著ddC加入到配方中，這2種藥物大約使用了8個月時間。后來15個月時間的治療不清楚，接著病人VL#770(JCW)用AZT和3TC聯(lián)用治療了約2年半的時間。病人VL#285/690(JWA)用AZT單一治療了約1年零9個月時間，接著轉入ddI單一治療8個月時間，他又回到AZT單一治療1年零3個月，接著用ddC治療了近2年時間。治療變成AZT和3TC聯(lián)用近1年時間，接著變?yōu)閐4T/3TC/NFV聯(lián)用大約9個月時間。病人VL#771(BMN)最初用AZT，ddC，和PPI，RTV聯(lián)用治療，3TC接著加入到該聯(lián)用藥物中一直到治療轉入d4T和RTV為止，該治療持續(xù)了大約6個月，接著變?yōu)?TC/d4T/ddI和RTV聯(lián)用治療。有約6個月時間沒有接受治療，接著接受AZT，3TC和ddI治療，聯(lián)合治療接著轉換為3TC，d4T和IDV。病人VL#1057(DHW)用AZT單一治療了大約3年，接著變?yōu)閐dI單一治療1年，有大約8個月時間沒有接受治療，接著用AZT和3TC治療了1年，繼續(xù)用AZT治療，但將3TC換為d4T和PRI，加入IDV。接著短期將d4T變回3TC，直到被NNRTI，DEL取代。使用病毒RNA分離和RT/PCR制備包含編碼所有蛋白酶和逆轉錄酶1-313位氨基酸的病毒序列的源于病人的片段，將源于病人的片段插入指示基因病毒載體，以便構建標有RTV-621，RTV-285，RTV-690，RTV-770，和RTV-771的抗性檢測載體。運用表型敏感性分析檢測這些RTVs載體，以便準確和定量地確定抗逆轉錄病毒藥物欄的敏感性水平?？鼓孓D錄病毒藥物欄包括已知的幾組成員，包括核苷類逆轉錄酶抑制劑(AZT，3TC，d4T，ddI，ddC和abacavir(愛博開呋))、非核苷類逆轉錄酶抑制劑(地拉呋啶(delavirdine)和耐呋絡平(nevirapine))和蛋白酶抑制劑(indinavir，nelfinavir，ritonavir和saquinavir)。測定每種檢測藥物的IC50，檢驗病人病毒對每種藥物的敏感性，并與已知的敏感性模型比較，觀察到在這些RTV載體庫中的每一種與野生型對照相比對4dT的敏感性均降低。進一步檢查病人樣品可能與觀察到的d4T敏感性模式相關的基因型變化。
測定患者RTV DNAs的基因型使用ABI鏈終止子技術自動測定抗性試驗載體的核酸序列。所得核酸序列同野生型分枝B HIV-1的保守序列(美國新墨西哥州洛斯阿拉默斯HIV序列數(shù)據庫)比較，找出與對照序列不同的序列。RTV-621含有M41L、A62V、T69SS、V75M、M184V、L210W和T215Y。RTV-621上41、62和75每一個位點出現(xiàn)的核酸序列既有野生型也有突變的核。RTV-285含有下列突變M41L、A62V、T69SSA、L74V、A158S、I178M、M184V、T200A、L210W和T215Y。RTV-690含有下列突變K20R、M41L、A62V、T69SSG、V75M、K102M、K103R、V179I、M184V、T215Y、V241L、L283I和E297I。158和181兩位點每一個位點處的核酸序列既有野生型也有突變型。RTV-770含有下列突變V21I、M41L、T69SSG、V75M、K102M、K103R、V179I、M184V、T215Y、V241L、L283I和E297R。69和75兩位點中任一位點處出現(xiàn)的核酸序列既有野生型也有突變型。RTV-771含有下列位點突變E67D、V35I、M41L、T69SSS、V75M、I135V、Q174R、D177E、M184V、T299I、L210W、R211K、T215Y、R284K、A288S和E291D。174和200兩位點中任一位點處出現(xiàn)的核酸序列既有野生型也有突變型。在逆轉錄酶69位或其附近，所有這些抗性試驗載體的核酸均有額外的氨基酸異常插入。這里將這種異常插入記為T69SSX，X代表甘氨酸(G)、絲氨酸(S)或丙氨酸(A)。以前將A62V突變描述為多藥物抗性突變(MDR)之一。這種多藥物突變對實施例3中所述對于NRTI類藥物的廣譜交叉抗性發(fā)揮一定作用。此外，所有這些抗性試驗載體都具有一些與特定藥物抗性相關的突變集合。與AZT-抗性相關的突變集合M41L、D67N、L210W、T215Y和K219Q；與ddC-抗性相關的突變集合L74V、L74I、T69D；與NNRTI類藥物-抗性相關的突變集合K103N、Y181C和G190A；與3TC-抗性相關的突變有M184V或者以前未鑒定的其它突變V75M、A158S、K20R、V21I、K102M、V179I、V241L、1283I、E297R、E6D、Q174R、D177E、R284K、A288S、E291D。在V35I、K103R、I135V、D177E、I178M、V179I、T200A/I、R211K和F214L的突變屬于已經觀察到在HIV野生型變體上的多態(tài)性。
反向突變應用通稱作反向突變的方法，進一步鑒定T69SSX突變在d4T-抗性中的作用。RTV-285庫中的克隆，其逆轉錄酶含有下列突變M41L、A62V、T69SSA、L74V、A158S、I178M、M184V、T200A、L210W和T215Y。從該庫中分離出一個功能性克隆。應用定點突變手段將69位三體“SSA”特異地突變位單個蘇氨酸“T”。這個回復突變子含有除69位SSA三體插入外285-1克隆上出現(xiàn)的其它全部突變。285-1突變子對d4T和AZT的抗性均表現(xiàn)為顯著增加，d4T增加3倍，AZT增加30倍。鑒定從RTV-770庫中分離的單個克隆，獲得了T69SSA插入突變在NRTI-抗性中作用的進一步證據。RTV-770庫中出現(xiàn)兩類克隆。第一類含有如下突變V21I、M41L、K102M、K103R、V179I、M184V、T215Y、V241I、L283I和E297R；另一類含有第一類的全部突變，同時還含有T69SSG和V75M。那些帶有69和75位突變的第二類突變對d4T和AZT敏感性均顯著增加，d4T增加了4倍，AZT增加了30倍。構建抗性試驗載體，僅含有T69SSA突變的載體，或者還同時含有其它藥物抗性突變或是被懷疑能夠調節(jié)HIV對NRTI類藥物敏感性之突變。與應用大引物PCR方法進行定點突變，向抗性試驗載體導入突變(Saker G and Sommar SS(1994)Biotechniques 8(4)，404-407)。應用以上所述的表型敏感性試驗的方法，對含有突變T69SSA的抗性試驗載體T69SSA-RTV進行測試，所得結果與另一個遺傳背景明確的抗性試驗載體做比較。該抗性試驗載體的第69位點是“T”，為野生型。與野生型抗性試驗載體比較，T69SSA-RTV對d4T的敏感性下降兩倍，還觀察到T69SSA-RTV對AZT的敏感性發(fā)生輕微而顯著的變化。
此外還將T69SSA突變引入到含有V75I的抗性試驗載體上。將V75I引入T69SSA背景導致對AZT敏感性增加而對d4T敏感性下降。V75I單獨突變對d4T敏感性沒有作用，但引起AZT敏感性增加。
此外，還將T69SSA突變引入到含有A62V的抗性試驗載體上。A62V單獨突變對所有被測試的逆轉錄酶抑制劑類藥物的敏感性沒有作用。將A62V引入T69SSA背景對d4T敏感性沒有影響，但對AZT的敏感性則顯著下降(6倍)。
構建了一個含有A62V、T69SSA和V75I的抗性試驗載體。三重突變對AZT的敏感性表現(xiàn)一個非常微小的下降(2倍)(如同T69SSA單獨突變一樣)，而對AZT的敏感性則輕微增加(不到2倍)。
構建若干抗性試驗載體含有T69SSA插入突變，同時含有AZT-抗性突變(M41L、A62V、T215Y)和3TC-抗性突變(M184V)的不同組合。在M41L、T69SSA和T215Y位點含有突變的抗性試驗載體對d4T和AZT的敏感性都有顯著的降低，分別降低了5倍和160倍。向該背景加入A62V突變使得對d4T和AZT的敏感性進一步下降，分別為10倍和超過1000倍。出現(xiàn)M184V對于d4T敏感性沒有影響，但引起AZT敏感性增加。
構建一個抗性試驗載體，含有突變M41L、T69SSA、T215Y和L210W。向一個含有M41L、T69SSA和T215Y三重突變的抗性試驗載體引入突變L210W，導致AZT的抗性發(fā)生實質性的降低(大于1000倍)。與此相對的，M41L-T69SSA-T215Y-RTV對AZT的敏感性降低了140倍。如果與M41L-T69SSA-T215Y-RTV做比較，L210W對其它的NRTI類藥物敏感性沒有影響。與M41L-T69SSA-T215Y-RTV做比較，M41L-T69SSA-T215Y-L210W-RTV藥物敏感性，對ddC降低了3倍，對ddI降低了3.5倍，對3TC降低了17倍，對d4T降低了10倍，對abacavir降低了14倍，都只是輕微的改變。相對M41L-T69SSA-T215Y-RTV，L2110W突變對NNRTI類藥物、DEL(0.3倍)和NEV(0.42倍)的敏感性沒有附加作用。而M41L-T69SSA-T215Y-RTV對DEL和NEV的敏感性也表現(xiàn)出輕微的增加。
構建一個抗性試驗載體含有如下四個位點的突變M41L、A62V、T69SSA和T215Y。該載體，亦即M41L-A62V-T69SSA-T215Y-RTV，敏感性表型如下對AZT的敏感性發(fā)生實質性的下降(大于1000倍)，對ddC的敏感性處于野生型水平(2.1倍)，對ddI的敏感性輕微下降(3倍)，對3TC的敏感性輕微降低(8倍)，對abacavir的敏感性輕微下降(10倍)。該載體對NNRTI類藥物、DEL(0.2倍)和NEV(0.8倍)的敏感性均增加了。
此外，還將L210W突變引入到另一個載體上。此載體含有另外四個位點突變M41L、A62V、T69SSA和T215Y。該載體，亦即M41L-A62V-T69SSA-T215Y-L210W-RTV，對不同藥物的敏感性表現(xiàn)如下對AZT的敏感性發(fā)生實質性的降低(大于1000倍)，對ddC的敏感性輕度下降(2.1倍)，對ddI的敏感性表現(xiàn)為輕微降低(3倍)，對3TC的敏感性有中等程度降低(22倍)，對d4T的敏感性有中等程度之降低(13倍)，對abacavir的敏感性亦有中等程度之降低(16倍)。此載體對NNRTI類藥物、DEL(0.2倍)和NEV(0.6倍)的敏感性表現(xiàn)出了增加?？剐栽囼炤d體M41L-A62V-T69SSA-T215Y-L210W-RTV的敏感性表型相似于缺乏L210W但含有另外四個突變位點的抗性試驗載體。
將T215Y突變導入含有A62V和T69SSA兩突變的載體。導入T215Y導致該載體對AZT的敏感性發(fā)生實質性降低(1000倍)，與A62V-T69SSA-RTV相比降低1000倍。后者對AZT的敏感性只降低了7倍。觀察對其它抑制劑的敏感性，結果類似于沒有T215Y突變的載體。A62V-T69SSA-T215Y-RTV對ddC的敏感性表現(xiàn)出野生型水平(1.3倍)，對ddI的敏感性輕微下降(2.5倍)，對3TC的敏感性有中度下降(15倍)，對d4T的敏感性輕微下降(7倍)，對abacavir的敏感性輕微下將(10倍)。此載體對NNRTI類藥物，DEL(0.3倍)和NEV(0.6倍)的敏感性增加。
此外，還將突變L74V導入含有A62V和T69SSA的載體。對受試抑制劑的敏感性試驗結果，與在不含有L74V突變的抗性試驗載體上觀察所得結果相似，且與在含有T215以及A62V和T69SSA突變的載體上所測結果相似。最大的變化是在A62V-T69SSA-L74V-RTV上觀測到對AZT的敏感性回復到野生型水平。載體A62V-T69SSA-L74V-RTV對ddC表現(xiàn)出野生型水平敏感性(1.8倍)，對ddI的表現(xiàn)出野生型水平敏感性(1.9倍)，對3TC的敏感性輕微下降(2.5倍)，對d4T的敏感性輕微下將(1.5倍)，對abacavir的敏感性輕微下降(3倍)。該載體對NNRTI類藥物、DEL(0.4倍)和NEV(0.3倍)的敏感性均增加。
構建抗性試驗載體，含有突變M41L、T69SSA、L210W和V75M。將突變V75M導入含有其它四個突變(M41L、T69SSA、L210W和T215Y)的載體，與沒有V75突變的載體比較，對載體的藥物敏感性并沒有影響。M41L-T69SSA-T215Y-L210W-V75M-RTV對AZT的敏感性發(fā)生實質性的下降(大于1000倍)，對ddC的敏感性輕微下降(2.9倍)，對ddI的敏感性輕微下降(3.5倍)，對3TC的敏感性中度降低(17倍)，對d4T的敏感性中度下降(11倍)，對abacavir的敏感性發(fā)生中等程度之下降(19倍)。該載體對NNRTI類藥物、DEL(0.25)和NEV(0.5倍)的敏感性均增加。
實施例5建立敏感性表型與基因型分析之間的關聯(lián)性與AZT-抗性突變之復雜組合相關的d4T突變。
從患者98-757、98-844、98-937、98-964和98-966構建抗性試驗載體并進行表型分析如實例1中所述，從患者樣本98-757、98-844、98-937、98-964和98-966構建抗性試驗載體。所有這些患者以前都接受過時間不等的包括d4T在類的藥物治療。分離病毒RNA，進行逆轉錄-PCR，得到一段來自患者的片段。該片段包括編碼蛋白酶全長和逆轉錄酶1-313位的病毒序列。將此患者來源片段插入一個含有報告基因的病毒載體，獲得若干抗性試驗載體，分別記為RTV-757、RTV-844、RTV-937、RTV-964和RTV-966。應用一種表型試驗方法，在這些抗性試驗載體上準確定量地其對一組抗逆轉錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉錄病毒藥物包括通稱為NRTI類的一些藥物(AZT、3TC、d4T、ddI、ddC和abacavir)、一些NNRTI類藥物(delavirdine和nevirapine)和一些PRI類藥物(indinavir、nelfinavir、ritonavir和saquinavir)。對每一試驗藥物測定其半數(shù)抑制濃度IC50。檢查患者的病毒對每一種藥物的敏感性，并與已知的藥物敏感性模型比較。在每一個這些RTV庫上，觀察d4T的藥物敏感性，較之于野生型對照RTV都發(fā)生了下降。進一步檢查患者樣本，找出與所觀察到的d4T敏感性模型相關的基因型變化。
測定患者RTV DNA的基因型使用ABI鏈終止子技術自動測定抗性試驗載體的核酸序列。所得核酸序列同野生型分枝B HIV-1的保守序列(美國新墨西哥州洛斯阿拉默斯HIV序列數(shù)據庫)比較，找出與對照序列不同的序列。RTV-757含有V35I、D67N、T69D、K70R、V106A、V108I、L109V、Y181C、V189L、T200A、I202T、R211K、T215F、D218E、K219Q、H221Y、L228H、L283I和R284K。106、108和109每一個位點出現(xiàn)的核酸序列既有野生型也有突變的核酸序列。RTV-884含有下列突變M41L、D67N、T69D、I135V、L210W、T215Y和K219N。RTV-937含有下列突變P1L、P9R、K20R、V35T、K64Y、D67N、K70R、V75M、G99R、I135V、K173E、Y188L、R211H、T215F、D218E和K219Q。RTV-964含有下列突變M41L、K43E、D67N、K70R、L74I、V75S、Y181I、R211T、T215Y、D218E和K219N。RTV-966含有下列突變K20R、T39D、M41L、E44D、D67N、L74V、A98S、V118I、1135T、K166R、K173T、M184V、G196E、L210W、R211K、T215Y、D218E、K219R、L228H、V245E、K277R、T286A、A288T和V293I。所有這些抗性試驗載體的核酸都含有一個或數(shù)個突變；這些突變包括以前與AZT-抗性關聯(lián)的突變(M41L、D67N、L210W、T215Y/F和K219Q/R)、與ddC-抗性關聯(lián)的突變(T69D和L74I/V)、與NNRTI類藥物抗性關聯(lián)的突變(V106A、V108I、Y181C/I和Y188L)、與3TC-抗性關聯(lián)的突變(M184V)，或者以前尚未鑒定的突變(P1L、P9R、K20R、T39D、K43E、E44D、K64Y、V75M/S、G99R、L109V、V118I、K173E/T、I202T、R211H/T、D218E、K219E、H221Y、L228H、L283H、R284K和A288)。已知在V35I/T、A98S、1135V/T、K166R、G196E、T200A、R211K、F214L、V245E、K277R、T286A和V293I這些位點的突變是HIV野生型(藥物敏感)的多態(tài)性。
在這些患者樣本上導致d4T敏感性下降的突變并不清楚。有些患者樣本，含有許多與患者身上發(fā)現(xiàn)的突變相同；然而這些患者并不表現(xiàn)出對d4T的敏感性降低。
定點突變用定點突變手段構建抗性試驗載體，含有五個(M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和K219Q)或六個(M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和K219Q)與AZT-抗性相關的突變。測定對NRTI類藥物的敏感性表型。在這些觀察到對AZT(75-180倍)和d4T(2倍)的敏感性顯著下降。
實施例6鑒定HIV-1逆轉錄酶氨基酸變化，預測對核苷類逆轉錄酶抑制劑的反應HIV-1逆轉錄酶69位氨基酸變化的表型與基因型之間的關聯(lián)性在本發(fā)明的一個實施方案中，應用下述方法評價HIV-逆轉錄酶蛋白69位氨基酸變化的效應。這些方法包括(i)從hiv-1感染個體采集生物樣本；(ii)分析生物編碼HIV-1逆轉錄酶的核酸在69位密碼子是否發(fā)生突變。(iii)d4T敏感性下降河AZT敏感性降低，69位密碼子突變相關(T69SSX)；這突變可以單獨存在，或者處于其它NRTI-抗性突變的背景(例如，M41L、A62V、D67N、K70R、L74V、V75I/M、T215Y/F、K219Q)。
生物樣本包括全血、血液組成成分包括外周血單核細胞(PBMC)、血清、血漿(用不同的抗凝劑如EDTA、檸檬酸-右旋糖苷、肝素等制備)、組織切片、腦脊液(CSF)或其它細胞、組織或體液。在本發(fā)明的另一實施方案中，可以直接從生物樣本中分離HIV-1核酸(基因組RNA)或逆轉錄酶蛋白，或者在從生物樣本中分離純化病毒粒子以后進行。要分析HIV-1逆轉錄酶69位氨基酸是否突變，可用如下數(shù)種方法進行，例如直接對編碼逆轉錄酶的病毒核酸進行鑒定，或者直接鑒定病毒逆轉錄酶蛋白本身?？捎萌缦滤械姆椒ù_定逆轉錄酶69位氨基酸利用經典或新式蛋白質測序技術、抗體表位識別技術或其它特異結合蛋白或化合物，直接鑒定逆轉錄酶蛋白；此外，還可以鑒定HIV-1逆轉錄酶蛋白編碼序列擴增產物來確定HIV-1逆轉錄酶蛋白69位氨基酸。對HIV-1核酸進行擴增，可用如下方法進行，包括逆轉錄-PCR、NASBA、SDA、RCR或3SR。具有普通技能的操作人員就將知道這些方法。分析編碼HIV-1逆轉錄酶的核酸69位密碼子是否發(fā)生突變，可直接對核酸測序，包括多引物延伸-鏈終止方法(Sanger，ABI/PE and Visible Genetics)或鏈斷裂方法(Maxam and Gilbert)，或者最近開發(fā)的其它測序技術，例如飛行時間質譜法(MALDI-TOF)、質譜法(Sequenom，Gene Trace Systems)。此外，測定編碼69位氨基酸的核酸序列可以應用各種雜交方法進行，例如基因芯片雜交測序法(Affymetrix)、line probe assay(LiPA；Murex)和差示雜交(Chion)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案中，從生物樣本制備抗性試驗載體進行敏感性表型試驗，分析HIV-1逆轉錄酶69位氨基酸是野生型還是突變型。在一實施方案中，采集血漿樣品，純化病毒RNA，進行逆轉錄擴增出一段來自患者的片段(PDS)。這段片段編碼了病毒蛋白酶和逆轉錄酶區(qū)域。然后，經由DNA連接和細菌轉化，將這個患者來源片段插入含有報告基因的病毒載體，于是獲得一個抗性測試載體。從細菌培養(yǎng)物中分離抗性試驗載體，如實施例1中所述進行表型敏感性試驗。對含有T69SSX突變/插入的患者樣本進行表型敏感性試驗，結果見Figure5。從患者樣本621、690、770、771得到的患者來源的HIV-1蛋白酶和逆轉錄酶區(qū)域核酸序列，應用熒光檢測鏈終止循環(huán)測序法(ABI/PE)測定其序列。該方法被用來測定患者個體樣本中代表各種HIV-1變體混合物序列組合的保守核酸序列(代表準屬)，且用來測定單個變體的核酸序列。
患者樣本的表型敏感性圖和定點突變體表現(xiàn)出d4T敏感性顯著下降和AZT-敏感性增加。這兩者都與下列突變相關編碼HIV-1逆轉錄酶69位的絲氨酸、絲氨酸、絲氨酸(SSS)，絲氨酸、絲氨酸、丙氨酸(SSA)或絲氨酸、絲氨酸、甘氨酸(SSG)編碼系列的突變；以及上述位點一些子集的突變。這些位點包括以前與NRTI類藥物抗性相關的突變(41、67、70、74、75、184、210、215和219)或在這些患者中觀察到但以前從未鑒定過的位點(1、6、9、20、21、33、39、43、44、64、68、99、109、115、118、138、158、167、173、174、177、179、196、202、211、218、221、228、240、241、283、284、288、291和297)。
69位含有插入突變的患者樣本，其表型敏感性圖顯示對AZT、3TC、ddC、ddI、d4T和abacavir。
HIV-1逆轉錄酶62、75、77、116和151氨基酸突變的表型和基因型的關聯(lián)性患者樣本的表型敏感性圖和定點突變體表明如果HIV-1逆轉錄酶62、75、77、116和151這些位點，或者這些位點的子集含有下列氨基酸62V、75I、77L、116F或151M，則對NRTI類藥物敏感性顯著下降(AZT、ddC、ddI、3TC、d4T和abacavir)。在41、67、69、184、210、215和219出現(xiàn)額外突變會進一步修飾(增加或降低)對NRTI類藥物的敏感性。
建立HIV-1逆轉錄酶中以前與AZT-抗性相關的突變對d4T抗性的表型與基因型之間的關聯(lián)性患者樣本的表型敏感性圖和定點突變體表明如果以前與AZT-抗性顯著降低的位點出現(xiàn)突變(41、67、70、210、215和219)，以及以前與其它NRTI類藥物的敏感性降低相關位點的子集(74、75、184)或者與前述在患者的病毒上測定得到的以前并有鑒定突變所相關的位點(1、6、9、20、21、33、39、43、44、64、68、99、109、115、118、138、158、167、173、174、177、179、196、202、211、218、221、228、240、241、283、284、288、291、297)。
此外，還將突變L74V導入含有A62V和T69SSA的載體。對受試抑制劑的敏感性試驗結果，與在不含有L74V突變的抗性試驗載體上觀察所得結果相似，且與在含有T215以及A62V和T69SSA突變的載體上所測結果相似。最大的變化是在A62V-T69SSA-L74V-RTV上觀測到對AZT的敏感性回復到野生型水平。載體A62V-T69SSA-L74V-RTV對ddC表現(xiàn)出野生型水平敏感性(1.8倍)，對ddI的表現(xiàn)出野生型水平敏感性(1.9倍)，對3TC的敏感性輕微下降(2.5倍)，對d4T的敏感性輕微下將(1.5倍)，對abacavir的敏感性輕微下降(3倍)。該載體對NNRTI類藥物、DEL(0.4倍)和NEV(0.3倍)的敏感性均增加。
構建抗性試驗載體，含有突變M41L、T69SSA、L210W和V75M。將突變V75M導入含有其它四個突變(M41L、T69SSA、L210W和T215Y)的載體，與沒有V75突變的載體比較，對載體的藥物敏感性并沒有影響。M41L-T69SSA-T215Y-L210W-V75M-RTV對AZT的敏感性發(fā)生實質性的下降(大于1000倍)，對ddC的敏感性輕微下降(2.9倍)，對ddI的敏感性輕微下降(3.5倍)，對3TC的敏感性中度降低(17倍)，對d4T的敏感性中度下降(11倍)，對abacavir的敏感性發(fā)生中等程度之下降(19倍)。該載體對NNRTI類藥物、DEL(0.25)和NEV(0.5倍)的敏感性均增加。
實施例5建立敏感性表型與基因型分析之間的關聯(lián)性與AZT-抗性突變之復雜組合相關的d4T突變。
從患者98-757、98-844、98-937、98-964和98-966構建抗性試驗載體并進行表型分析如實例1中所述，從患者樣本98-757、98-844、98-937、98-964和98-966構建抗性試驗載體。所有這些患者以前都接受過時間不等的包括d4T在類的藥物治療。分離病毒RNA，進行逆轉錄-PCR，得到一段來自患者的片段。該片段包括編碼蛋白酶全長和逆轉錄酶1-313位的病毒序列。將此患者來源片段插入一個含有報告基因的病毒載體，獲得若干抗性試驗載體，分別記為RTV-757、RTV-844、RTV-937、RTV-964和RTV-966。應用一種表型試驗方法，在這些抗性試驗載體上準確定量地其對一組抗逆轉錄病毒藥物的敏感性水平。這組抗逆轉錄病毒藥物包括通稱為NRTI類的一些藥物(AZT、3TC、d4T、ddI、ddC和abacavir)、一些NNRTI類藥物(delavirdine和nevirapine)和一些PRI類藥物(indinavir、nelfinavir、ritonavir和saquinavir)。對每一試驗藥物測定其半數(shù)抑制濃度IC50。檢查患者的病毒對每一種藥物的敏感性，并與已知的藥物敏感性模型比較。在每一個這些RTV庫上，觀察d4T的藥物敏感性，較之于野生型對照RTV都發(fā)生了下降。進一步檢查患者樣本，找出與所觀察到的d4T敏感性模型相關的基因型變化。
測定患者RTV DNA的基因型使用ABI鏈終止子技術自動測定抗性試驗載體的核酸序列。所得核酸序列同野生型分枝B HIV-1的保守序列(美國新墨西哥州洛斯阿拉默斯HIV序列數(shù)據庫)比較，找出與對照序列不同的序列。RTV-757含有V35I、D67N、T69D、K70R、V106A、V108I、L109V、Y181C、V189L、T200A、I202T、R211K、T215F、D218E、K219Q、H221Y、L228H、L283I和R284K。106、108和109每一個位點出現(xiàn)的核酸序列既有野生型也有突變的核酸序列。RTV-884含有下列突變M41L、D67N、T69D、I135V、L210W、T215Y和K219N。RTV-937含有下列突變P1L、P9R、K20R、V35T、K64Y、D67N、K70R、V7bM、G99R、I135V、K173E、Y188L、R211H、T215F、D218E和K219Q。RTV-964含有下列突變M41L、K43E、D67N、K70R、L74I、V75S、Y181I、R211T、T215Y、D218E和K219N。RTV-966含有下列突變K20R、T39D、M41L、E44D、D67N、L74V、A98S、V118I、I135T、K166R、K173T、M184V、G196E、L210W、R211K、T215Y、D218E、K219R、L228H、V245E、K277R、T286A、A288T和V293I。所有這些抗性試驗載體的核酸都含有一個或數(shù)個突變；這些突變包括以前與AZT-抗性關聯(lián)的突變(M41L、D67N、L210W、T215Y/F和K219Q/R)、與ddC-抗性關聯(lián)的突變(T69D和L74I/V)、與NNRTI類藥物抗性關聯(lián)的突變(V106A、V108I、Y181C/I和Y188L)、與3TC-抗性關聯(lián)的突變(M184V)，或者以前尚未鑒定的突變(P1L、P9R、K20R、T39D、K43E、E44D、K64Y、V75M/S、G99R、L109V、V118I、K173E/T、I202T、R211H/T、D218E、K219E、H221Y、L228H、L283H、R284K和A288)。已知在V35I/T、A98S、I135V/T、K166R、G196E、T200A、R211K、F214L、V245E、K277R、T286A和V293I這些位點的突變是HIV野生型(藥物敏感)的多態(tài)性。
在這些患者樣本上導致d4T敏感性下降的突變并不清楚。有些患者樣本，含有許多與患者身上發(fā)現(xiàn)的突變相同；然而這些患者并不表現(xiàn)出對d4T的敏感性降低。
定點突變用定點突變手段構建抗性試驗載體，含有五個(M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和K219Q)或六個(M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y和K219Q)與AZT-抗性相關的突變。測定對NRTI類藥物的敏感性表型。在這些觀察到對AZT(75-180倍)和d4T(2倍)的敏感性顯著下降。
實施例6鑒定HIV-1逆轉錄酶氨基酸變化，預測對核苷類逆轉錄酶抑制劑的反應HIV-1逆轉錄酶69位氨基酸變化的表型與基因型之間的關聯(lián)性在本發(fā)明的一個實施方案中，應用下述方法評價HIV-逆轉錄酶蛋白69位氨基酸變化的效應。這些方法包括(i)從hiv-1感染個體采集生物樣本；(ii)分析生物編碼HIV-1逆轉錄酶的核酸在69位密碼子是否發(fā)生突變。(iii)d4T敏感性下降河AZT敏感性降低，69位密碼子突變相關(T69SSX)；這突變可以單獨存在，或者處于其它NRTI-抗性突變的背景(例如，M41L、A62V、D67N、K70R、L74V、V75I/M、T215Y/F、K219Q)。
生物樣本包括全血、血液組成成分包括外周血單核細胞(PBMC)、血清、血漿(用不同的抗凝劑如EDTA、檸檬酸-右旋糖苷、肝素等制備)、組織切片、腦脊液(CSF)或其它細胞、組織或體液。在本發(fā)明的另一實施方案中，可以直接從生物樣本中分離HIV-1核酸(基因組RNA)或逆轉錄酶蛋白，或者在從生物樣本中分離純化病毒粒子以后進行。要分析HIV-1逆轉錄酶69位氨基酸是否突變，可用如下數(shù)種方法進行，例如直接對編碼逆轉錄酶的病毒核酸進行鑒定，或者直接鑒定病毒逆轉錄酶蛋白本身。可用如下所列的方法確定逆轉錄酶69位氨基酸利用經典或新式蛋白質測序技術、抗體表位識別技術或其它特異結合蛋白或化合物，直接鑒定逆轉錄酶蛋白；此外，還可以鑒定HIV-1逆轉錄酶蛋白編碼序列擴增產物來確定HIV-1逆轉錄酶蛋白69位氨基酸。對HIV-1核酸進行擴增，可用如下方法進行，包括逆轉錄-PCR、NASBA、SDA、RCR或3SR。具有普通技能的操作人員就將知道這些方法。分析編碼HIV-1逆轉錄酶的核酸69位密碼子是否發(fā)生突變，可直接對核酸測序，包括多引物延伸-鏈終止方法(Sanger，ABI/PE and Visible Genetics)或鏈斷裂方法(Maxam and Gilbert)，或者最近開發(fā)的其它測序技術，例如飛行時間質譜法(MALDI-TOF)、質譜法(Sequenom，Gene Trace Systems)。此外，測定編碼69位氨基酸的核酸序列可以應用各種雜交方法進行，例如基因芯片雜交測序法(Affymetrix)、line probe assay(LiPA；Murex)和差示雜交(Chion)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)先實施方案中，從生物樣本制備抗性試驗載體進行敏感性表型試驗，分析HIV-1逆轉錄酶69位氨基酸是野生型還是突變型。在一實施方案中，采集血漿樣品，純化病毒RNA，進行逆轉錄擴增出一段來自患者的片段(PDS)。這段片段編碼了病毒蛋白酶和逆轉錄酶區(qū)域。然后，經由DNA連接和細菌轉化，將這個患者來源片段插入含有報告基因的病毒載體，于是獲得一個抗性測試載體。從細菌培養(yǎng)物中分離抗性試驗載體，如實施例1中所述進行表型敏感性試驗。對含有T69SSX突變/插入的患者樣本進行表型敏感性試驗，結果見Figure5。從患者樣本621、690、770、771得到的患者來源的HIV-1蛋白酶和逆轉錄酶區(qū)域核酸序列，應用熒光檢測鏈終止循環(huán)測序法(ABI/PE)測定其序列。該方法被用來測定患者個體樣本中代表各種HIV-1變體混合物序列組合的保守核酸序列(代表準屬)，且用來測定單個變體的核酸序列。
患者樣本的表型敏感性圖和定點突變體表現(xiàn)出d4T敏感性顯著下降和AZT-敏感性增加。這兩者都與下列突變相關編碼HIV-1逆轉錄酶69位的絲氨酸、絲氨酸、絲氨酸(SSS)，絲氨酸、絲氨酸、丙氨酸(SSA)或絲氨酸、絲氨酸、甘氨酸(SSG)編碼系列的突變；以及上述位點一些子集的突變。這些位點包括以前與NRTI類藥物抗性相關的突變(41、67、70、74、75、184、210、215和219)或在這些患者中觀察到但以前從未鑒定過的位點(1、6、9、20、21、33、39、43、44、64、68、99、109、115、118、138、158、167、173、174、177、179、196、202、211、218、221、228、240、241、283、284、288、291和297)。
69位含有插入突變的患者樣本，其表型敏感性圖顯示對AZT、3TC、ddC、ddI、d4T和abacavir。
HIV-1逆轉錄酶62、75、77、116和151氨基酸突變的表型和基因型的關聯(lián)性患者樣本的表型敏感性圖和定點突變體表明如果HIV-1逆轉錄酶62、75、77、116和151這些位點，或者這些位點的子集含有下列氨基酸62V、75I、77L、116F或151M，則對NRTI類藥物敏感性顯著下降(AZT、ddC、ddI、3TC、d4T和abacavir)。在41、67、69、184、210、215和219出現(xiàn)額外突變會進一步修飾(增加或降低)對NRTI類藥物的敏感性。
建立HIV-1逆轉錄酶中以前與AZT-抗性相關的突變對d4T抗性的表型與基因型之間的關聯(lián)性患者樣本的表型敏感性圖和定點突變體表明如果以前與AZT-抗性顯著降低的位點出現(xiàn)突變(41、67、70、210、215和219)，以及以前與其它NRTI類藥物的敏感性降低相關位點的子集(74、75、184)或者與前述在患者的病毒上測定得到的以前并有鑒定突變所相關的位點(1、6、9、20、21、33、39、43、44、64、68、99、109、115、118、138、158、167、173、174、177、179、196、202、211、218、221、228、240、241、283、284、288、291、297)。與導入RTV的特定突變相關的表型的表在含有特定突變的基于HIV的抗性測試載體中觀察到的平均敏感性降低倍數(shù)(檢測的復制子數(shù))
權利要求
1.一種評價HIV感染的病人核苷類逆轉錄酶抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的病人采集血漿樣品；和(b)確定血漿樣品是否包含編碼在69位密碼子有突變/插入的HIV逆轉錄酶的核酸；其中突變的存在與對d4T敏感性降低相關。
2.權利要求1的方法，其中在69位密碼子的突變/插入編碼絲氨酸-絲氨酸-丙氨酸。
3.權利要求1的方法，其中在69位密碼子的突變/插入編碼絲氨酸-絲氨酸-甘氨酸。
4.權利要求1的方法，其中在69位密碼子的突變/插入編碼絲氨酸-絲氨酸-絲氨酸。
5.權利要求1的方法，其中逆轉錄酶在41和215位密碼子有額外突變。
6.權利要求5的方法，其中在41位密碼子突變編碼亮氨酸(L)，215位密碼子突變編碼酪氨酸(Y)。
7.權利要求1的方法，其中HIV感染的病人正接受抗逆轉錄病毒制劑的治療。
8.一種評價HIV感染的病人抗逆轉錄病毒治療有效性的方法，包括(a)從HIV感染的病人采集生物樣品；和(b)確定該生物樣品是否包含編碼在選自62、75、77、116和151位的密碼子中具有1個或多個密碼子突變的HIV逆轉錄酶的核酸；其中突變的存在與對d4T敏感性降低相關。
9.權利要求8的方法，其中突變的62位密碼子編碼纈氨酸(V)。
10.權利要求8的方法，其中突變的75位密碼子編碼異亮氨酸(I)。
11.權利要求8的方法，其中突變的77位密碼子編碼亮氨酸(L)。
12.權利要求8的方法，其中突變的116位密碼子編碼酪氨酸(Y)。
13.權利要求8的方法，其中突變的151位密碼子編碼蛋氨酸(M)。
14.權利要求8的方法，其中HIV感染的病人正接受抗逆轉錄病毒制劑的治療。
15.權利要求8的方法，其中該逆轉錄酶在選自41、67、210、215、219、184、69和215或它們的組合的1個或多個密碼子中具有額外突變。
16.一種評價候選HIV抗逆轉錄病毒藥物化合物生物有效性的方法，包括(a)將含有患者來源片段和一個報告基因的抗性測試載體導入宿主細胞，這個患者來源片段又進一步包括一個在選自62、75、77、116和151的一個或數(shù)個密碼子的突變；和一個在選自41、67、210、215、219、184、和/或69的一個或數(shù)個密碼子的突變；(b)培養(yǎng)來自步驟a的宿主細胞；(c)檢測報告基因在靶宿主細胞中的表達；(d)比較步驟(c)與不加抗逆轉錄病毒侯選藥物實施步驟(a)-(c)時二者所測的報告基因表達；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中存在測試濃度的抗逆轉錄病毒侯選藥物。
17.一種評估HIV抗逆轉錄病毒候選藥物化合物生物有效性的方法，包括(a)向宿主細胞中導入一個帶有一個患者來源片段以及一個報告基因的抗性試驗載體，該患者來源片段進一步包括一個69位密碼子的突變/插入和一個41位和215位密碼子的突變；(b)培養(yǎng)步驟(a)中的宿主細胞；(c)檢測報告基因在靶宿主細胞中的表達；(d)比較步驟(c)與不加抗逆轉錄病毒侯選藥物實施步驟(a)-(c)時二者所測的報告基因表達；其中，在步驟(a)-(c)；步驟(b)-(c)；或步驟(c)中存在測試濃度的抗逆轉錄病毒侯選藥物。
18.一種抗性試驗載體，含有一段HIV患者來源的片段和一個報告基因，這一患者來源片段又進一步包括在69位密碼子有一個突變的逆轉錄酶，其中，報告基因的表達依賴于該患者來源片段。
19.一種抗性試驗載體，包括一段HIV患者來源片段和一個報告基因，該患者來源片段又進一步包括一個在選自62、75、77、116和151中的一個或幾個密碼子的突變的逆轉錄酶，其中，報告基因的表達依賴于該患者來源片段。
20.權利要求5的方法，其中，逆轉錄酶在210位密碼子處有一個額外的突變。
21.權利要求20的方法，其中，在210位密碼子處的突變編碼色氨酸(W)。
22.權利要求5的方法，其中，逆轉錄酶在62位密碼子處有一個額外的突變。
23.權利要求22的方法，其中，在62位密碼子處的突變編碼纈氨酸(V)。
24.權利要求22的方法，其中，逆轉錄酶在210位密碼子處有一個額外的突變。
25.權利要求22的方法，其中，在62位密碼子的突變編碼色氨酸(W)。
26.權利要求20的方法，其中，逆轉錄酶在75位密碼子處有一個額外的突變。
27.權利要求26的方法，其中，在75位密碼子的突變編碼絲氨酸(S)或蛋氨酸(M)。
28.權利要求1的方法，其中，逆轉錄酶在62位和215位密碼子處有一個額外的突變。
29.權利要求28的方法，其中，在62位密碼子處的突變編碼纈氨酸(V)，且在215位密碼子處的突變編碼酪氨酸(Y)。
30.權利要求1的方法，其中，逆轉錄酶在62位和74位密碼子處有一個額外的突變。
31.權利要求30的方法，其中，在62位密碼子處的突變編碼纈氨酸(V)且在74位密碼子處的突變編碼纈氨酸(V)。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于鑒定人類免疫缺陷型病毒(HIV)感染和獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的藥物治療方案的有效性的抗病毒藥物敏感和抗性測試,本發(fā)明還涉及檢測HIV感染的臨床進程及其對抗逆轉錄病毒治療,特別是使用表型敏感性測試或基因型測試的核苷類逆轉錄酶抑制劑治療的響應的手段和方法。
文檔編號C12Q1/68GK1332804SQ99813479
公開日2002年1月23日 申請日期1999年6月24日 優(yōu)先權日1998年6月24日
發(fā)明者赫里斯托斯·J·彼得羅普洛斯, 珍尼特·惠特科姆 申請人:病毒科學公司