專利名稱：抗ctla－4的人單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明背景1.相關申請的交叉參考本發(fā)明要求1998年12月23日申請的美國臨時專利申請系列號60/113，647的優(yōu)先權，其說明書作為整體在本文中引用。
2.本發(fā)明小結根據本發(fā)明，提供了抗人細胞毒性T-淋巴細胞抗原4(CTLA-4)的全人單克隆抗體。且提供了編碼含有重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子之氨基酸序列的核苷酸序列，特別是跨越互補性決定區(qū)(CDR)的連續(xù)重鏈和輕鏈序列，且特別是從FR1內和/或CDR1到CDR3和/或FR4內。還提供了與本文揭示的抗體具有相似結合特性的抗體及具有相似功能性的抗體(或其它拮抗物)。
3.技術背景對病人免疫反應的調節(jié)可對許多人類疾病提供所需的治療，該治療可能導致通過使用常規(guī)藥物很少發(fā)現的作用特異性。上調和下調免疫系統(tǒng)的反應都是可能的。T細胞和B細胞的的作用已被廣泛研究且其特征在于與免疫反應的調節(jié)相聯系。根據這些研究，在許多情況下，T細胞的作用在疾病的預防和治療中似乎是特別重要的。
T細胞具有非常復雜的系統(tǒng)以控制其相互作用。T細胞間的相互作用過程中利用了許多受體和可溶性因子。因此在該免疫反應中任何具體信號可能具有的效應一般是變化的且依賴于在該途徑中涉及的具體因子，受體和反受體。下調反應的途徑與激活所需的途徑同樣重要。導致T-細胞耐受性的胸腺馴育是防止對特定抗原發(fā)生免疫反應的一種機制。其它機制，如抑制性細胞因子的分泌也是已知的。
T細胞的激活不僅需要通過抗原受體(T細胞受體(TCR))的刺激，而且還需要通過諸如CD28的共同刺激表面分子的信號。CD28的配體是B7-1(CD80)和B7-2(CD86)蛋白質，它們在諸如樹突細胞，激活的B-細胞或單核細胞的抗原呈遞細胞上表達且與T細胞CD28或CTLA-4相互作用以傳遞共同刺激信號。Perrin等在免疫學研究14189-99(1995)中用實驗性變應反應性腦脊髓炎(EAE)研究了共同刺激信號的作用。EAE是由Th1細胞針對髓鞘抗原誘導的自身免疫疾病，它在病理學免疫反應誘導中提供了研究B7-介導的共同刺激作用的體內模型。使用B7受體的可溶性融合蛋白配體，以及CD80或CD86特異性的單克隆抗體，Perrin等證實了在EAE中B7共同刺激在決定臨床結果中起顯著的作用。
B7和CD28之間的相互作用是幾個共同刺激性信號途徑之一，這些途徑似乎足以觸發(fā)抗原特異性T-細胞的成熟和增生。缺乏共同刺激及伴隨的IL-2生產不足阻止了T細胞隨后的增生并誘導一種稱為“無變應性”的無反應性狀態(tài)。各種病毒和腫瘤可能阻斷T細胞激活和增生，導致宿主免疫系統(tǒng)對感染的或轉化的細胞活性不足或無反應性。在許多可能的T細胞障礙中，無反應性可能至少部分地對宿主不能清除病原性或腫瘤原性細胞負責。
Chen等，細胞，711093—1102(1992)和Townsend及Allison，科學259368(1993)已描述了B7蛋白質介導抗腫瘤免疫性的用途。Schwarts，細胞711065(1992)對CD28，CTLA-4和B7在IL-2生產和免疫治療中的作用進行了綜述。Harding等，自然，356607—609(1994)證實了CD28介導的信號共同刺激鼠T細胞并防止在T細胞克隆中誘導無反應性。也參見美國專利號5,434,131,5,770,197和5,773,253及國際專利申請?zhí)朩O93/00431,WO95/01994,WO95/03408,WO95/24217和WO95/33770。
從上述情況，很清楚T-細胞需要2類來自抗原呈遞細胞(APC)的信號以激活并隨后分化效應器功能。首先，要有由T-細胞上的TCR與APC上的MHC分子呈遞肽之間的相互作用產生的抗原特異性信號。其次，要有由CD28與B7家族的成員(B7-1(CD80)或B7-2(CD86))相互作用介導的抗原非依賴性信號。確切地說，CTLA-4所適合的免疫反應環(huán)境起始是含糊的。Brunet等，自然328267—270(1987)首先鑒定并克隆了鼠CTLA-4，作為尋找在細胞毒性T淋巴細胞上優(yōu)選表達的分子的部分內容。隨后很快由Dariavach等，歐洲免疫學雜志，181901—1905(1988)鑒定并克隆了人CTLA-4。鼠和人CTLA-4分子具有大約76％的總體序列同源性且在其胞質區(qū)內具有接近完全的序列相同性(Dariavach等，歐洲免疫學雜志，181901—1905(1988))。CTLA-4是免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白質中的一員。Ig超家族是均具有Ig分子可變區(qū)(V)或恒定區(qū)(C)的關鍵結構特征的一組蛋白質。Ig超家族的成員包括但不限于免疫球蛋白本身，主要組織相容性復合物(MHC)類分子(即，MHC I和II型)，和TCR分子。
1991年，Linsley等，實驗醫(yī)學雜志，174561—569(1991)認為CTLA-4是B7的第二種受體。類似地，Harper等，免疫學雜志，1471037—44(1991)證實在小鼠和人類中，CTLA-4和CD28分子在序列，信息表達，基因結構和染色體定位方面密切相關。也參見Balzano等，國際癌癥雜志增刊，728—32(1992)。這一作用的進一步證據通過功能研究獲得。例如，Lenschow等，科學257789—792(1992)證實CTLA-4-Ig誘導胰島移植物的長期存活。Freeman等，科學，262907—909(1993)檢查了CTLA-4在B7缺陷型小鼠中的作用。在Lenschow等，美國國家科學院院報，9011054—11058(1993)中描述了對CTLA-4配體的檢查。Linsley等，科學，257792—795(1992)描述了用可溶形式的CTLA-4進行的體內免疫抑制。Linsley等，實驗醫(yī)學雜志，1761595—604(1992)制備了結合CTLA-4的抗體且它不與CD28交叉反應，推論出CTLA-4與CD28在激活的T淋巴細胞上共同表達且共同協(xié)作調節(jié)T細胞粘附和由B7引起的激活。Kuchroo等，細胞80707—18(1995)證實B7-1和B7-2共同刺激分子有區(qū)別地激活Th1/Th2發(fā)育途徑。Yi-qun等，國際免疫學837—44(1996)證實靜息的與針對可溶性回憶抗原最近激活的記憶T細胞對于來自B7家族成員的共同刺激信號存在不同的要求。也參見de Boer等，歐洲免疫學雜志，233120—5(1993)。
一些小組認為與CD28相比，CTLA-4是另一種或不同的受體/配體相互作用，甚至認為是由BB1抗體識別的第三種B-7復合物。例如，參見，Hathcock等，科學，262905—7(1993)，Freeman等，科學，262907—9(1993)，Freeman等，實驗醫(yī)學雜志1782185—92(1993)，Lenschow等，美國國家科學院院報，9011054—8(1993)，Razi-Wolf等，美國國家科學院院報，9011182—6(1993)，和Boussiotis等，美國國家科學院院報，9011059—63(1993)。但是，參見Freeman等，免疫學雜志，1612708—15(1998)，其中討論的發(fā)現是，BB1抗體結合與CD74的細胞表面形式相同的分子，因此，BB1單克隆抗體結合與B7-1不同的蛋白質，且該表位也存在于B7-1蛋白質上。因此，這一觀察結果需要本領域重新考慮在分析CD80表達和功能中使用BB1 mAb的研究。
始于1993年且在1995年達到高潮，研究者開始進一步描繪CTLA-4在T-細胞刺激中的作用。首先，通過使用抗CTLA-4的單克隆抗體，Walunas等，免疫學，1405—13(1994)提供的證據是CTLA-4可作為T細胞激活的負調節(jié)物而起作用。隨后，Waterhouse等，科學270985—988(1995)證實CTLA-4缺陷型小鼠在其淋巴結和脾中積累帶有上調激活標記的T細胞母細胞。當通過T細胞受體刺激時，該母細胞也滲入肝臟，心臟，肺和胰組織，且血清免疫球蛋白的量上升，其T細胞自發(fā)且強烈增生，然而，它們對由Fas受體的交聯和由γ照射誘導的細胞死亡敏感。Waterhouse等推論CTLA-4充當T細胞活化的負調節(jié)物且對控制淋巴細胞內環(huán)境穩(wěn)定是必不可少的。在相同文獻的評論中，Allison和Krummel，科學，270932—933(1995)認為Waterhouse等的工作指出了CTLA-4用于下調T-細胞反應性或在T-細胞活化和發(fā)育中具有抑制信號作用。Tivol等，免疫，3541—7(1995)也生產了CTLA-4-缺陷性小鼠并證實該小鼠迅速形成具有多器官淋巴細胞滲入和組織破壞的淋巴增生性疾病，特別是具有嚴重心肌炎和胰腺炎。他們推論出CTLA-4在下調T細胞活化和維持免疫學內環(huán)境穩(wěn)定中起關鍵作用。另外，Krummel和Allison，實驗醫(yī)學雜志182459—65(1995)進一步闡述了CD28和CTLA-4在T細胞刺激反應中具有相反的作用。他們產生了抗CTLA-4的抗體且使用高度純化的T細胞研究了其在系統(tǒng)中結合CTLA-4的效力。在其報道中，他們表明在新鮮移出的T細胞上低水平B7-2的存在可部分抑制T細胞增生，且這種抑制受與CTLA-4相互作用的介導。CTLA-4與TCR和CD28的交聯強烈抑制增生和T細胞分泌IL-2。最后，這些結果表明在測定對抗原的反應中，CD28和CTLA-4傳遞似乎由T細胞整合的相反信號。因此，他們得出的結論是T細胞抗原受體刺激的結果由CD28共同刺激信號，以及來自CTLA-4的抑制信號調節(jié)。也參見Krummel等，國際免疫學，8519—23(1996)和美國專利號5811097及國際專利申請?zhí)朩O97/20574。
已進行的各種其它實驗進一步闡明了CTLA-4的上述功能。例如，Walunas等，實驗醫(yī)學雜志，1832541—50(1996)，通過使用抗-CTLA-4抗體表明CTLA-4信號不能調節(jié)細胞存活或對IL-2的反應，但能抑制CD28依賴性IL-2生產。另外，Perrin等，免疫學雜志，1571333—6(1996)證實抗-CTLA-4抗體在實驗性變應反應性腦脊髓炎(EAE)中惡化該疾病且增大死亡率。疾病惡化與致腦炎的細胞因子TNF-α，IFN-γ和IL-2的生產增強相聯系。因此，他們推斷CTLA-4調節(jié)EAE中自身免疫反應的強度，減弱發(fā)炎性細胞因子生產和臨床疾病癥狀。也參見Hurwitz等，神經免疫學雜志，7357—62(1997)和Cepero等，實驗醫(yī)學雜志，188199—204(1998)(在基因轉移進鼠T-細胞模型后特異性消除CTLA-4表達的抗-CTLA-4發(fā)夾核酶)。
另外，Blair等，免疫學雜志，16012—5(1998)評價了一組CTLA-4單克隆抗體(mAbs)對靜息人CD4+T細胞的功能性影響。他們的結果證實一些CTLA-4 mAb可抑制靜息CD4+細胞的增生反應且細胞周期從G0轉變?yōu)镚1期。CTLA-4的抑制效應在4小時內較明顯，此時細胞表面CTLA-4的表達檢測不到。然而其它CTLA-4 mAbs檢測不到抑制效應，表明mAbs單與CTLA-結合不足以介導T細胞反應的下調。令人感興趣的是，盡管IL-2生產關閉，但抑制性抗-CTLA-4 mAb允許誘導和表達細胞存活基因bcl-X(L)。與這一觀察結果一致，細胞仍然存活且CTLA-4連接后檢測不到細胞程序死亡。
與無反應性相聯系，Perez等，免疫，6411—7(1997)證實了經過阻斷CTLA-4防止誘導T細胞無反應性且推斷CD28或T細胞上的CTLA-4與B7分子的相互作用決定T細胞抗原識別的結果。另外，VanParijs等，實驗醫(yī)學雜志，1861119—28(1997)檢查了白細胞介素12和共同刺激物在體內T細胞無反應性中的作用并發(fā)現在無反應性誘導期間通過抑制CTLA-4接合，抑制T細胞增生，且不能啟動完全的Th1分化。然而，在IL-12和抗CTLA-4抗體存在下與耐受原性抗原接觸的T細胞不發(fā)生無反應性，且行為與遇到免疫原性抗原的T細胞相同。這些結果表明，有兩種方法幫助誘導體內無反應性CTLA-4結合導致阻斷T細胞增生的能力，和缺乏原型性炎癥細胞因子IL-12，它防止T細胞分化成Th1效應器細胞。IL-12與抗-CTLA-4抗體的組合足以將正常耐受原性刺激物轉變?yōu)槊庖咴源碳の铩?br> 與感染相聯系時，McCoy等，實驗醫(yī)學雜志，186183—7(1997)證實抗CTLA-4抗體極大地增強和加速對Nippostrongylusbrasiliensis的T細胞免疫反應，導致成蟲數顯著減少且較早地終止寄生蟲卵的生產。也見Murphy等，免疫學雜志，1614153—4160(1998)(Leishmania donovani)。
對于癌癥，Kwon等，PNAS USA 948099—103(1997)建立了同源鼠前列腺癌模型并檢查了2種不同的操作以通過增強的T細胞共同刺激誘導抗前列腺癌反應(i)經過轉導表達B7.1配體的前列腺癌細胞提供直接共同刺激和(ii)體內抗體介導的T細胞CTLA-4阻斷，它防止T細胞下調。已證實體內抗體介導的CTLA-4阻斷增強抗前列腺癌免疫反應。另外，Yang等，癌癥研究，574036—41(1997)研究了CTLA-4功能的阻斷是否在腫瘤生長的各個階段導致抗腫瘤T細胞反應的增強。根據體外和體內結果，他們發(fā)現在攜帶腫瘤的個體中CTLA-4阻斷增強了產生抗腫瘤T-細胞反應的能力，但在其模型中這種增強效應的表達局限于腫瘤生長的早期。另外，Hurwitz等，美國國家科學院院報，9510067—71(1998)研究了T細胞介導的抗腫瘤反應的產生依賴于由主要組織相容性復合物/抗原與T細胞受體的結合以及CD28與B7的結合。某些腫瘤，如SM1乳腺癌對抗-CTLA-4免疫治療無反應性。因此，通過使用CTLA-4阻斷并結合由表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的SM1細胞組成的疫苗，觀察到原發(fā)性SM1腫瘤消退，盡管單獨使用的一種治療無效。這種結合治療導致對SM1的長期免疫并依賴于CD4(+)和CD8(+)T細胞。這些發(fā)現表明CTLA-4阻斷在宿主產生的抗原呈遞細胞水平上起作用。
對于糖尿病，Luhder等，實驗醫(yī)學雜志，187427—32(1998)在疾病的不同階段將抗-CTLA-4 mAb注射進糖尿病的TCR轉基因小鼠模型中。他們發(fā)現首先激活潛在的致糖尿T細胞時CTLA-4的結合是關鍵性事件；如果發(fā)生結合，則胰島發(fā)病，但仍有幾個月是良性的。如果不結合，則胰島炎更惡化，且很快接著發(fā)生糖尿病。
對于疫苗免疫，Horspool等，免疫學雜志，1602706—14(1998)發(fā)現完整的抗-CTLA-4 mAb而不是Fab片段抑制對pCIA/β-gal的初級體液反應而不影響回憶反應，表明CTLA-4激活抑制Ab生產而不抑制T細胞引發(fā)。CD28和CTLA-4，CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的配體阻斷揭示了不同的且無重疊的功能。在起始免疫時CD80的阻斷完全取消了初級和次級Ab反應，而CD86阻斷抑制初級而不是次級反應。同時阻斷CD80＋CD86比單獨阻斷后一個對于抑制Ab反應具有較小的影響。經過共同注射表達B7的質粒增強共同刺激可增大CTL反應而不是Ab反應，且沒有由Th1向Th2傾斜的證據。這些發(fā)現表明CD28，CTLA-4，CD80和CD86在核酸接種后的T細胞共同刺激中具有復雜的且不同的作用。
至于同種異體移植排斥，Markees等，臨床研究雜志，1012446—55(1998)發(fā)現在皮膚同種異體移植排斥的小鼠模型中，接受最初依賴于存在IFN-γ，CTLA-4和CD4(+)T細胞。在該方法中加入抗CTLA-4或抗-IFN-γ mAb與迅速移植排斥相聯系，而抗IL-4 mAb無影響。
至于與CD28相關的CTLA-4的作用，Fallarino等，實驗醫(yī)學雜志，188205—10(1998)產生了用表達抗原的腫瘤免疫的TCR轉基因/重組酶激活基因-2缺陷型/CD28-野生型或CD28-缺陷型小鼠。來自兩種類型小鼠的引發(fā)的T細胞產生細胞因子且與缺乏B7表達的刺激細胞反應而增生。然而。當CD28+/+T細胞的反應被B7-1的共同刺激增大時，CD28-/-T細胞的反應被強烈抑制。這種抑制可被抗B7-1或CTLA-4的單克隆抗體逆轉。因此，缺乏CD28時，CTLA-4有效地抑制T細胞激活，這表明TCR介導的信號的拮抗作用足以解釋CTLA-4的抑制效應。另外，Lin等，實驗醫(yī)學雜志，188199—204(1998)研究了CD28缺陷型小鼠中心臟同種異體移植的排斥。H-2(g)心臟移植進同種異體野生型或CD28-缺陷型小鼠(H-2(b))。與野生型小鼠相比，在CD28-缺陷型中移植排斥延遲。用CTLA-4-免疫球蛋白(Ig)，或用抗B7-1加抗-B7-2 mAb處理野生型受體明顯延長同種異體移植的存活。相反，用CTLA-4-Ig，抗-B7-1加抗B-7-2 mAb處理CD28-缺陷型小鼠或者阻斷抗-CTLA-4 mAb誘導加速同種異體移植排斥。這種移植排斥速率的增加與更嚴重的單核細胞浸入和未處理的野生型和CTLA-4-Ig-或抗-CTLA-4mAb-處理的CD28-缺陷型小鼠供體心臟中IFN-γ和IL-6轉錄子水平的增加相關。因此，CTLA-4的負調控作用超過了通過配體競爭阻止CD28激活的潛力。即使在缺乏CD28時，CTLA-4在同種異體移植排斥的調節(jié)中起抑制作用。
另外，已研究了CTLA-4表達的進一步鑒定。例如，Alegre等，免疫學雜志，1574762—70(1996)認為表面的CTLA-4被迅速內吞，這可解釋在細胞表面一般檢測到低水平的表達。他們推斷CD28和IL-2在CTLA-4表達的上調中均起重要作用。另外，CTLA-4的細胞表面積累似乎主要由其迅速的內吞來調節(jié)。此外，Castan等，免疫學，90265—71(1997)根據CTLA-4表達的原位免疫組織學分析表明CTLA-4陽性的胚中心T細胞對于免疫調節(jié)是重要的。
因此，鑒于CTLA-4似乎具有免疫反應性的廣泛且關鍵的作用，需要產生可有效用于免疫治療的抗CTLA-4的抗體。而且，需要產生可用于需重復施用抗體的慢性疾病的抗CTLA-4的抗體。
附圖的簡要描述

圖1提供了根據本發(fā)明的一系列重鏈和κ輕鏈免疫球蛋白分子的核苷酸和氨基酸序列4.1.1(圖1A)，4.8.1(圖1B)，4.14.3(圖1C)，6.1.1(圖1D)，3.1.1(圖1E)，4.10.2(圖1F)，2.1.3(圖1G)，4.13.1(圖1H)，11.2.1(圖1I)，11.6.1(圖1J)，11.7.1(圖1K)，12.3.1.1(圖1L)和12.9.1.1(圖1M)。
圖2提供了來自克隆4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,3.1.1,4.10.2,4.13.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1預測的重鏈氨基酸序列與種系DP-50(3-33)氨基酸序列的序列比較。DP-50種系序列與克隆序列之間的差異以黑體字表示。圖中還顯示了抗體CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
圖3提供了克隆2.1.3預測的重鏈氨基酸序列與種系DP-65(4-31)氨基酸序列之間的序列對比。DP-65種系序列與克隆序列之間的差異以黑體字表示。圖中還以下劃線表示了抗體的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
圖4提供了克隆4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,4.10.2和4.13.1的κ輕鏈氨基酸序列與種系A27氨基酸序列之間的序列對比。A27種系序列與克隆序列之間的差異以黑體字表示。該圖還以下劃線顯示了抗體的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置?？寺?.8.1，4.14.3和6.1.1的CDR1中明顯的缺失以“0”表示。
圖5提供了克隆3.1.1,11.2.1,11.6.1和11.7.1的預期κ輕鏈氨基酸序列與種系012氨基酸序列之間的序列對比。012種系序列與克隆序列之間的差異以黑體字表示。圖中還以下劃線表示了抗體的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
圖6提供了克隆2.1.3預測的κ輕鏈氨基酸序列和種系A10/A26氨基酸序列之間的序列對比。A10/A26種系序列與克隆中的序列之間的差異以黑體字表示。圖中還以下劃線表示了抗體的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
圖7提供了克隆12.3.1的預測κ輕鏈氨基酸序列與種系A17氨基酸序列之間的序列對比。A17種系序列與克隆序列之間的差異以黑體字表示。圖中還以下劃線表示了抗體的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
圖8提供了克隆12.9.1的預測的κ輕鏈氨基酸序列與種系A3/A19氨基酸序列之間的序列對比。A3/A19種系序列與克隆中的序列之間的差異以黑體字表示。該圖中還以下劃線表示了抗體的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
圖9提供了通過對抗體的重鏈和輕鏈進行直接蛋白質測序產生的N-端氨基酸序列的總結。
圖10提供了根據本發(fā)明的某些抗體的某些其它鑒定信息。在圖10A中，概括了與克隆3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.14.3和6.1.1相關的數據。提供的數據涉及濃度，等電聚焦(IEF)，SDS-PAGE，大小排阻色譜，液體色譜/質譜(LCMS)，質譜(MALDI)，輕鏈N-端序列。在圖10B中提供了與IEF相關的其它詳細信息；10C中提供了與SDS-PAGE相關的數據；10D中提供了4.1.1抗體的SEC。
圖11顯示了使用抗-CD80-PE和抗-CD86-PEmAb在Raji細胞上表達B7-1和B7-2。
圖12顯示了用抗-CTLA-4阻斷抗體(BNI3，4.1.1，4.8.1和6.1.1)誘導的T細胞母細胞/Raji測定中IL-2生產的濃度依賴性增強。
圖13顯示了用抗-CTLA-4阻斷抗體(BNI3，4.1.1，4.8.1和6.1.1)誘導的T細胞母細胞/Raji試驗中IFN-γ生產的濃度依賴性增強(相同供體T細胞)。
圖14顯示了在T細胞母細胞/Raji測定中以抗-CTLA-4阻斷抗體誘導的來自6個供體的T細胞中IL-2生產的平均增強值。
圖15顯示了在T細胞母細胞/Raji測定中抗-CTLA-4阻斷抗體誘導的來自6個供體的T細胞中IFN-γ生產的平均增強值。
圖16顯示了用SEA刺激后在72小時時測量的以抗-CTLA-4阻斷mAbs誘導的來自5個供體的hPBMC中IL-2生產的增強。
圖17顯示了用SEA刺激后在72和96小時時測量的以抗-CTLA-4阻斷mAbs誘導的來自3個供體的全血中IL-2生產的增強。
圖18顯示了在鼠纖維肉瘤腫瘤模型中用抗鼠CTLA-4抗體抑制腫瘤生長。
圖19顯示了在72小時T母細胞/Raji和超級抗原(來自6個供體的全血和外周血單核細胞)測定中以本發(fā)明的抗CTLA4抗體(4.1.1和11.2.1)誘導的IL-2生產的增強。
圖20顯示了在72小時T母細胞/Raji測定中以本發(fā)明的抗-CTLA4抗體(4.1.1和11.2.1)誘導的IL-2生產的劑量依賴性增強。
圖21顯示了在用100ng/ml超抗原刺激的72小時超抗原全血測定中以本發(fā)明的抗-CTLA4抗體(4.1.1和11.2.1)誘導的IL-2生產的劑量依賴性增強。
圖22提供了在抗-CTLA-4抗體鏈后一系列增加的核苷酸和氨基酸序列全長4.1.1重鏈(cDNA22(a)，基因組22(b)，和氨基酸22(c))，全長無糖基化的4.1.1重鏈(cDNA 22(d)和氨基酸22(e))，4.1.1輕鏈(cDNA 22(f)和氨基酸22(g))，全長4.8.1重鏈(cDNA 22(h)和氨基酸22(i))，4.8.1輕鏈(cDNA 22(j)和氨基酸22(K))，全長6.1.1重鏈(cDNA 22(1)和氨基酸22(m))，6.1.1輕鏈(cDNA 22(n)和氨基酸22(o))，全長11.2.1重鏈(cDNA 22(p)和氨基酸22(q))，以及11.2.1輕鏈(cDNA 22(r)和氨基酸22(s))。
本發(fā)明概述根據本發(fā)明的第一個方面，提供了能結合CTLA-4的抗體，它包含的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包含由人VH3-33家族基因編碼的從FR1序列內到FR3序列的連續(xù)氨基酸序列且在CDR1序列，CDR2序列或圖2所示的構架序列中包含至少一個氨基酸取代。在優(yōu)選的實施方案中，該氨基酸序列包括選自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO66，SEQ ID NO68，和SEQ ID NO70的序列。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體還包含輕鏈可變區(qū)氨基酸序列，該序列包含選自SEQ ID NO14，SEQ IDNO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO65，SEQ ID NO67，SEQ ID NO69和SEQ ID NO71。
根據本發(fā)明的第二個方面，提供了一種抗體，它包含含有SEQ IDNO1的重鏈氨基酸序列和含有SEQ ID NO14的輕鏈可變氨基酸序列。
根據本發(fā)明的第三個方面，提供了一種抗體，它包含含有SEQ IDNO2的重鏈氨基酸序列和含有SEQ ID NO15的輕鏈可變氨基酸序列。
根據本發(fā)明的第四個方面，提供了一種抗體，它包含含有SEQ IDNO4的重鏈氨基酸序列和含有SEQ ID NO17的輕鏈可變氨基酸序列。
根據本發(fā)明的第五個方面，提供了一種分離的人單克隆抗體，它能結合CTLA-4。在優(yōu)選的實施方案中，該抗體能與選自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1的抗體競爭結合CTLA-4。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體與選自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的抗體對CTLA-4具有基本上相似的結合特異性。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體選自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體與來自低等哺乳動物種類，優(yōu)選包括小鼠，大鼠和兔的低等哺乳動物種類且更優(yōu)選小鼠和大鼠的CTLA-4無交叉反應性。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體與來自靈長類，優(yōu)選包含Cynomolgous和獼猴的靈長類的CTLA-4交叉反應。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體對CTLA-4具有比CD28，B7-2，CD44和hIgG1高大約100∶1且優(yōu)選大約500∶1或更高的選擇性。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體的結合親和性是大約10-9M或優(yōu)選大約10-10M或更大。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體以低于大約100nM且優(yōu)選低于大約0.38nM的IC50抑制CTLA-4與B7-2之間的結合。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體以低于大約100nM或更大且優(yōu)選低于大約0.50nM的IC50值抑制CTLA-4與B7-1之間的結合。在另一優(yōu)選的實施方案中，在T細胞母細胞/Raji測定中該抗體使IL-2生產增加到大約500pg/ml或更高且優(yōu)選增加到大約3846pg/ml或更高。在另一優(yōu)選的實施方案中，在T細胞母細胞/Raji測定中該抗體使IFN-γ生產增加到大約500pg/ml或更高且優(yōu)選大約1233pg/ml或更高。在另一優(yōu)選的實施方案中，在hPBMC或全血超抗原測定中該抗體使IL-2生產增加到大約500pg/ml或更高。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體在hPBMC或全血超抗原測定中使IL-2生產增加到大約500pg/ml或優(yōu)選1500pg/ml或更高或相對于對照高大約30％或優(yōu)選高50％。
根據本發(fā)明的第六個方面，提供了一種人源化抗體，它與選自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的抗體具有基本上相似的對CTLA-4的結合特異性。在優(yōu)選的實施方案中，該抗體與來自低等哺乳動物種類，優(yōu)選包括小鼠，大鼠和兔的低等哺動物種類且更優(yōu)選小鼠和大鼠的CTLA-4無交叉反應性。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體與來自靈長類，優(yōu)選包括cynomolgous和獼猴的靈長類的CTLA-4交叉反應。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體對CTLA-4的選擇性比CD28，B7-2，CD44和hIgG1高大約100∶1且優(yōu)選大約500∶1或更高。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體的結合親和性是大約10-9M或更大且優(yōu)選大約10-10M或更大。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體以低于大約100nM且優(yōu)選低于大約0.38nM的IC50值抑制CTLA-4和B7-2之間的結合。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體以低于大約100nM或更大且優(yōu)選低于大約0.50nM的IC50值抑制CTLA-4與B7-1之間的結合。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體在T細胞母細胞/Raji測定中使IL-2生產增加到大約500pg/ml或更大且優(yōu)選增加到大約3846pg/ml或更大。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體在T細胞母細胞/Raji測定中使IFN-γ生產增加到大約500pg/ml或更高且優(yōu)選增加到大約1233pg/ml或更高。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體在hPBMC或全血超抗原測定中誘導的IL-2生產為大約500pg/ml或更高。在另一優(yōu)選的實施方案中，該抗體在hPBMC或全血超抗原測定中使IL-2生產增加到大約500pg/ml或優(yōu)選1500pg/ml或更高或相對于對照高大約30％或優(yōu)選50％。
根據本發(fā)明的第7個方面，提供了結合CTLA-4的抗體，它包含在構架上與CDR1，CDR2和CDR3序列有效連接的含有由人VH3-33基因家族編碼的人FR1，FR2和FR3序列的重鏈氨基酸序列，其中CDR1，CDR2和CDR3序列獨立地選自圖2所示的CDR1，CDR2和CDR3。在優(yōu)選的實施方案中，權利要求32的抗體進一步包含對圖2所示的FR1，FR2和FR3序列的任意體細胞突變。
根據本發(fā)明的第8個方面，提供了結合CTLA-4的抗體，它包含在構架上與CDR1，CDR2和CDR3序列有效連接的含有由人VH3-33基因家族編碼的人FR1，FR2和FR3序列的重鏈氨基酸序列，該抗體具有下列特征對CTLA-4具有大約10-9或更高的結合親和性，以大約100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4與B7-1之間的結合；以大約100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4與B7-2之間的結合；在人T細胞測定中使細胞因子生產增加到500pg/ml或更高。
根據本發(fā)明的第9個方面，提供了結合CTLA-4的抗體，它包含在構架上與CDR1，CDR2和CDR3序列有效連接的含有FR1，FR2和FR3序列的重鏈氨基酸序列，其中CDR1，CDR2和CDR3獨立地選自圖2和3所示的CDR1，CDR2和CDR3序列，該抗體具有下列特征對CTLA-4具有大約10-9或更高的結合親和性；以大約100nM或更低的IC50抑制CTLA-4和B7-1之間的結合；以大約100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4和B7-2之間的結合；在人T細胞測定中使細胞因子生產增加到500pg/ml或更高。
根據本發(fā)明的第10個方面，提供了一種測定T細胞刺激的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，包括將人T細胞母細胞的培養(yǎng)物與Raji細胞系共同培養(yǎng)。在優(yōu)選的實施方案中，在與Raji細胞系培養(yǎng)前洗滌T細胞母細胞。
根據本發(fā)明的第11個方面，提供了一種測量T細胞刺激的測定法，包括提供人T細胞母細胞和Raji細胞系的培養(yǎng)物；將該培養(yǎng)物與一種試劑接觸；和測量由該培養(yǎng)物產生的細胞因子。
根據本發(fā)明的第12個方面，提供了篩選T細胞刺激功能部分的功能測定法，包括提供人T細胞母細胞和Raji細胞系的培養(yǎng)物；將該培養(yǎng)物與該部分接觸并評估由該培養(yǎng)物產生的細胞因子。
根據本發(fā)明的第13個方面，提供了一種用于CTLA-4抑制功能的T細胞刺激測定法，包括將含有人T細胞母細胞和Raji細胞系的培養(yǎng)物與一種試劑接觸并評估該培養(yǎng)物的細胞因子生產。
根據本發(fā)明的第14個方面，提供了一種篩選試劑T細胞刺激活性的方法，包括將該試劑與含有人T細胞母細胞和Raji細胞系的細胞培養(yǎng)物接觸；并評估該培養(yǎng)物的細胞因子生產。
在本發(fā)明的第10到第14方面的每一個方面中，在優(yōu)選的實施方案中，在用Raji細胞系培養(yǎng)前洗滌T細胞母細胞。在另一優(yōu)選的實施方案中，該細胞因子是IL-2或IFN-γ。在優(yōu)選的實施方案中，在從培養(yǎng)物分離的上清中測量細胞因子生產。在優(yōu)選的實施方案中，該試劑是一種抗體且優(yōu)選與CTLA-4結合。
根據本發(fā)明的第15個方面，提供了一種測定T細胞刺激的測定法，包括提供用葡萄球菌腸毒素A刺激的人外周血單核細胞的群體或人全血；將該培養(yǎng)物與一種試劑接觸并測量由該細胞群體產生的細胞因子。
根據本發(fā)明的第16個方面，提供了一種篩選T細胞刺激功能部分的功能測定法，包括提供人外周血單核細胞的群體或用葡萄球菌腸毒素A刺激的人全血；將該培養(yǎng)物與該部分接觸，并評價該細胞群體的細胞因子生產。
根據本發(fā)明的第17個方面，提供了CTLA-4抑制功能的T細胞刺激測定法，包括將人外周血單核細胞群體或用葡萄球菌腸毒素A刺激的人全血與一種試劑接觸并評估該細胞群體的細胞因子生產。
根據本發(fā)明的第18個方面，提供了一種篩選一種試劑的T細胞刺激活性的方法，包括將該試劑與人外周血單核細胞的群體或用葡萄球菌腸毒素A刺激的人全血接觸；并評估該細胞群體的細胞因子生產。
在本發(fā)明的第15到第18方面中的每一個方面，在優(yōu)選的實施方案中，細胞因子是IL-2。在另一優(yōu)選的實施方案中，在從該培養(yǎng)物分離的上清中測量細胞因子生產。在一個優(yōu)選的實施方案中，該試劑是抗體且優(yōu)選與CTLA-4結合。
優(yōu)選實施方案的詳細描述根據本發(fā)明，提供了抗人CTLA-4的全人源單克隆抗體。提供了包含重鏈和輕鏈免疫球蛋白分子的編碼核苷酸序列和氨基酸序列，特別是相應于從FR1和CDR1到CDR3和FR4的連續(xù)重鏈和輕鏈序列。還提供了具有相似結合特性的抗體和與本文公開的抗體具有相似功能的抗體(或其它拮抗劑)。還提供了表達該免疫球蛋白分子和單克隆抗體的雜交瘤。
定義除非本文另有限定，本發(fā)明中所用的科技術語具有本領域的普通技術人員通常理解的意義。而且，除非說明書另有需要，單數術語應包括復數且復數術語應包括單數。一般來說，用于本文的命名法和本文所述的技術，細胞和組織培養(yǎng)，分子生物學，和蛋白質及寡聚或多聚核苷酸化學和雜交是眾所周知的且是本領域中常用的。重組DNA，寡核苷酸合成和組織培養(yǎng)及轉化(例如，電穿孔，脂轉染)均使用標準技術。酶反應和純化技術按廠家說明書進行或按本領域常規(guī)完成或按本文所述進行。上述技術和方法一般按本領域熟知的常規(guī)方法進行且按本說明書中引用和討論的各種普通和更專業(yè)的參考文獻中所述進行。例如，參見，Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(第2版，冷泉港實驗室出版社，紐約冷泉港(1989))，本文引用以供參考。用于本文的命名法，本文的實驗方法和技術，及本文所述的分析化學，合成有機化學，和藥物及制藥化學是熟知的且是本領域中常用的。化學合成，化學分析，藥物制備，配制和傳遞及病人的治療均使用標準技術。
用于本說明書時，下面的術語，除非另有說明，應理解為具有如下含義本文使用的術語“分離的多核苷酸”是指基因組，cDNA或合成來源的多核苷酸或其某種組合，相對于其來源，該“分離的多核苷酸”(1)與天然情況下發(fā)現該“分離的多核苷酸”的全部或部分多核苷酸不相聯，(2)與天然情況下不與其相連的多核苷酸有效連接，或(3)天然情況下不以更大序列的一部分出現。
本文提及的術語“分離的蛋白質”指cDNA，重組RNA或合成來源的蛋白質或其某種組合，相對于其來源，或衍生來源，該“分離的蛋白質”(1)與天然發(fā)現的蛋白質不相聯，(2)游離于相同來源的其它蛋白質，例如，游離于鼠蛋白，(3)由來自不同物種的細胞表達，或(4)在天然狀況下不出現。
本文使用的術語“多肽”作為泛指術語是指天然蛋白質，片段，或多肽序列的類似物。因此，天然蛋白質，片段和類似物是多肽類中的種。根據本發(fā)明優(yōu)選的多肽包含圖1所示的人重鏈免疫球蛋白分子和人κ輕鏈免疫球蛋白分子，以及由含有重鏈免疫球蛋白分子與諸如κ輕鏈免疫球蛋白分子的輕鏈免疫球蛋白分子組合，和相反組合形成的抗體分子，以及其片段和類似物。
本文使用的術語“天然存在的”用于某物質時是指該物質可在自然界找到的事實。例如，存在于生物(包括病毒)中的，可從天然來源分離出的且未經實驗人員或其它人員有目的修飾的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文使用的術語“有效連接”是指所述成份的位置關系使其以目的方式發(fā)揮功能。與編碼序列“有效連接的”調控序列是指其連接方式使得在與調控序列相適應的條件下實現編碼序列的表達。
本文所用的術語“調控序列”指對實現與其連接的編碼序列的表達和加工所必需的多核苷酸序列。該調控序列的特性依賴于宿主生物而有所區(qū)別；在原核生物中，該調控序列一般包括啟動子，核糖體結合位點和轉錄終止序列；在真核生物中，一般來說，該調控序列包括啟動子和轉錄終止序列。術語“調控序列”最少打算包括其存在對表達和加工是必需的所有成份，且也可包括其存在是有益的其它成份，例如，先導序列和融合配偶體序列。
本文提及的術語“多核苷酸”指至少10個堿基長的核苷酸的多聚體形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一類型的核苷酸的修飾形式。該術語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。
本文提及的術語“寡核苷酸”包括以天然存在和非天然存在的寡核苷酸鍵連接起來的天然存在的和修飾的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的亞群，一般包括200個堿基長或更短。優(yōu)選的寡核苷酸是10至60個堿基長，更優(yōu)選12,13,14,15,16,17,18,19或20至40個堿基長。寡核苷酸通常是單鏈的，例如，用于探針；但寡核苷酸也可以是雙鏈的，例如，用于構建基因突變體。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義的寡核苷酸。
本文提及的術語“天然存在的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的術語“修飾的核苷酸”包括具有修飾的或取代糖基的核苷酸及類似物。本文提及的術語“寡核苷酸鍵”包括諸如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，phosphoroanilothioate，phoshoraniladate，酰胺磷酸等的寡核苷酸鍵。例如，參見，LaPlanche等，核酸研究，149081(1986)；Stec等，美國化學協(xié)會雜志，1066077(1984)；Stein等，核酸研究，163209(1988)；Zon等，抗癌藥設計，6539(1991)；Zon等，寡核苷酸和類似物實踐探討，第87—108頁(F.Eckstein編輯，牛津大學出版社，英國牛津(1991)；Stec等，美國專利號5,151,510；Uhlmann和Peyman化學回顧90543(1990)，本文引用其公開內容以供參考。如果需要，寡核苷酸可包括檢測標記。
本文提及的術語“選擇性雜交”指可檢測地且特異性地結合。根據本發(fā)明的多核苷酸，寡核苷酸及其片段在使與非特異性核酸可檢測的結合的可見量最小化的雜交和洗滌條件下與核酸鏈選擇性地雜交。高度嚴格條件可用于實現本領域已知的和本文所討論的選擇性雜交條件。一般來說，本發(fā)明的多核苷酸，寡核苷酸及其片段與目的核酸序列之間的核酸序列同源性至少為80％，更典型地優(yōu)選至少85％，90％，95％，99％和100％的逐漸增加的同源性。兩個氨基酸序列如果其序列之間具有部分或完全的相同性，則它們是同源的。例如，85％的同源性是指當兩序列進行對比達到最大匹配時85％的氨基酸是相同的。缺口(在匹配的任意兩個序列之間)允許達到最大匹配；缺口長度優(yōu)選5個或更少，更優(yōu)選2個或更少。擇一且優(yōu)選的是，當本文使用該術語時，如果使用具有突變數據矩陣和6或更大的缺口罰分的程序ALIGN它們具有至少5分的對比值(標準偏差單位)時，2個蛋白質序列(或其衍生的至少30個氨基酸長的多肽序列)是同源的。參見，Dayhoff，M.O.，蛋白質序列和結構圖表，第101—110頁(第5卷，國家生物醫(yī)學研究基金(1972))及該卷的增刊，第1—10頁。兩個序列或其部分如果使用ALIGN程序最佳對比時其氨基酸大于或等于50％的相同性時是更優(yōu)選的具有同源性。本文使用的術語“相應于”是指一個多核苷酸序列與對照多核苷酸序列的全部或部分是同源的(即，是相同的，在進化上不嚴格相關)，或指一個多肽序與一個對照多肽序列是相同的。相反，本文所用的術語“互補于”是指互補序列與對照多核苷酸序列的全部或部分是同源的。例如，核苷酸序列“TATAC”相應于對照序列“TATAC”且互補于對照序列“GTATA”。
下面的術語用于描述2個或多個核苷酸或氨基酸序列之間的序列關系“對照序列”，“比較窗口”，“序列相同性”，“序列相同性百分數”和“基本相同”?！皩φ招蛄小笔怯米餍蛄斜容^基礎的確定序列；對照序列可以是更大序列的亞群，例如，在序列表中給出的全長cDNA或基因序列的片段或可包含完整cDNA或基因序列。一般來說，對照序列是至少18個核苷酸或6個氨基酸長，通常是至少24個核苷酸或8個氨基酸長，且通常是至少48個核苷酸或16個氨基酸長。由于2個多核苷酸或氨基酸序列分別可能(1)含有兩分子之間相似的序列(即，全部多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，和(2)還含有2個多核苷酸或氨基酸序列之間有差異的序列，因此，2個(或多個)分子之間的序列比較一般經過在一個“比較窗口”內比較兩個分子的序列以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性來進行。本文所用的“比較窗口”指至少18個連續(xù)的核苷酸位置或6個氨基酸的概念性片段，其中一個多核苷酸序列或氨基酸序列可與至少18個連續(xù)的多核苷酸或6個氨基酸序列的對照序列進行比較且其中在比較窗口中的多核苷酸序列的位置與對照序列(不包含添加或缺失)相比可含有20％或更少的添加，缺失，取代等(即，缺口)以實現兩序列的最佳對比。用于對比比較窗口的序列最佳對比可用Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，分子生物學雜志，48443(1970)的同源性對比算法，Pearson和Lipman，美國國家科學院院報，852444(1988)的相似性檢索方法，這些算法的計算機補充(Wisconsin遺傳軟件包釋放7.0中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA(遺傳計算機集團公司，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，Geneworks或MacVector軟件包)，或經過檢查并選擇由各種方法產生的最佳序列比較法來進行。
術語“序列相同性”指在比較窗中兩個多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即，根據核苷酸與核苷酸或殘基與殘基)。術語“序列相同性百分數”是經過比較在比較窗口中的2個最佳對比序列，測定在兩序列中均存在的相同核酸堿基(即，A，T，C，G，U或I)或殘基的位置數以獲得匹配位置的數目，用匹配的位置數除以比較窗口中的位置總數(即，窗口大小)并將結果乘以100得到序列相同性的百分數來計算的。本文所用的術語“基本上相同”指多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中，多核苷酸或氨基酸包括與對照序列相比在至少18個核苷酸(6個氨基酸)位置的比較窗口中，通常是在至少24—48個核苷酸(8—16個氨基酸)位置的窗口中有至少85％序列相同性，優(yōu)選至少90—95％序列相同性，更通常是至少99％序列相同性的序列，其中序列相同性百分數經過比較在比較窗口中的對照序列與該序列來計算，該序列在占對照序列總共20％或較少的序列中可包括缺失或添加。對照序列可以是更大序列的亞序列群。
本文所用的20個常規(guī)氨基酸及其縮寫按常規(guī)用法。參見，免疫學—合成(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren，編輯，SinauerAssociates，Sunderland，Mass.(1991))，本文引用以供參考。20個常規(guī)氨基酸的立體異構體(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，如α-，α-雙取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其它非常規(guī)氨基酸也可以是本發(fā)明多肽的合成組份。非常規(guī)氨基酸的例子包括4-羥基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基賴氨酸，ε-N-乙酰賴氨酸，O-磷酰絲氨酸，N-乙酰絲氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基組氨酸，5-羥基賴氨酸，σ-N-甲基精氨酸和其它相似氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥脯氨酸)。在本文使用的多肽標記中，按照標準用法和常規(guī)左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
同樣，除非另有所說，單鏈多核苷酸序列的左手端是5′端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向稱為5′方向。新生RNA轉錄子5′向3′的添加方向稱為轉錄方向；與RNA具有相同序列的DNA鏈上的序列區(qū)且其5′端位于RNA轉錄子的5′端稱為“上游序列”；與RNA具有相同序列的DNA鏈上的序列區(qū)且其3′端位于RNA轉錄子的3′端稱為“下游序列”。
應用于多肽時，術語“基本相同”指使用諸如程序GAP或帶錯誤缺口權重的BESTFIT進行最佳序列對比時兩個肽序列具有至少80％的序列相同性，優(yōu)選至少90％序列相同性，更優(yōu)選至少95％序列相同性，且最優(yōu)選至少99％的序列相同性。優(yōu)選的是，不相同的殘基位置區(qū)別在于有保守氨基酸取代。保守氨基酸取代指具有相似側鏈的殘基互換。例如，具有脂肪族側鏈的氨基酸組是甘氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族羥基側鏈的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香側鏈的氨基酸組是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有堿性側鏈的氨基酸基團是賴氨酸，精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的氨基酸基團是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代基團是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所述，本發(fā)明預期包含在抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中進行輕微的變化，只要該變化能使氨基酸序列保留至少75％，更優(yōu)選至少80％,90％,95％且更優(yōu)選99％。特別是包括保守氨基酸取代。保守取代是在其側鏈相關的氨基酸家族中進行的取代。遺傳編碼的氨基酸一般分成下列家族(1)酸性二谷氨酸，天冬氨酸；(2)堿性二賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性二丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不帶電極性二甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。更優(yōu)選的家族是絲氨酸和蘇氨酸是脂肪族羥基家族；天冬酰胺和谷安是含酰胺家族；丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸是脂肪族；苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸是芳香族。例如，預期用異亮氨酸或纈氨酸單獨取代亮氨酸，用谷氨酸取代滅冬氨酸，用絲氨酸取代蘇氨酸是合理的，用結構相關的氨基酸對氨基酸的相似取代對所得分子的結合或特性不會有顯著的影響，特別是如果該取代不涉及構架位點內的氨基酸時更是如此。經過測定多肽衍生物的特定活性可較容易地測定氨基酸改變是否會產生功能性肽。本文詳細描述了該測定法。本領域的普通技術人員可較容易地制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。優(yōu)選的片段或類似物的氨基和羧基端靠近功能域的邊界。經過比較核苷酸和/或氨基酸序列數據與公眾的或專賣的序列數據庫可鑒定結構和功能域。優(yōu)選的是，使用計算機比較方法鑒定在已知結構和/或功能的其它蛋白質中出現的序列基序或預期的蛋白質構象結構域。鑒定折疊成已知三維結構的蛋白質序列的方法是已知的。Bowie等，科學，253164(1991)。因此，上述例子證實本領域的技術人員可認識序列基序和結構構象以用于限定根據本發(fā)明的結構和功能域。
優(yōu)選的氨基酸取代是那些(1)降低對蛋白水解敏感性；(2)降低氧化敏感性，(3)改變形成蛋白質復合物的結合親和性，(4)改變結合親和性和(4)賦予或修飾該類似物的理化或功能特性的取代。類似物可包括非天然存在的肽序列的各種序列突變體。例如，可在天然存在的序列上(優(yōu)選在形成分子內接觸的結構域外的肽部分)進行單個或多個氨基酸取代(優(yōu)選保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代應基本上不改變親本序列的結構特征(例如，取代氨基酸應不會斷裂在親本序列中存在的螺旋、或破壞作為親本序列特征的其它類型的二級結構)。本領域認識到的肽二級和三級結構的例子在下列文獻中描述蛋白質，結構和分子原理(Creighton編輯，W.H.Freeman和Company，紐約(1984))；蛋白質結構引言(C.Branden和J.Tooze編輯，Garland Publishing，紐約(1991))；和Thornton等，自然354105(1991)，分別作為參考文獻在本文中引用。
本文使用的術語“多肽片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但其中剩下的氨基酸序列與從，例如，全長cDNA序列推出的天然存在的序列中的相應位置相同。片段一般是至少5,6,8，或10個氨基酸長，優(yōu)選至少14個氨基酸長，更優(yōu)選至少20個氨基酸長，通長至少50個氨基酸長，且甚至更優(yōu)選至少70個氨基酸長。本文所用的術語“類似物”指由至少25個氨基酸的片段組成的多肽，該氨基酸與推斷的氨基酸序列的一部分基本上相同且其具有至少一種下列特性(1)在合適的結合條件下與CTLA-4特異性結合，(2)阻斷CTLA-4與其它受體結合的能力，或(3)在體外或體內抑制表達CTLA-4的細胞生長的能力。一般來說，多肽類似物相對于天然存在的序列包括保守的氨基酸取代(或添加或缺失)。該類似物一般是至少20個氨基酸長，優(yōu)選至少50個氨基酸長或更長且通常與全長的天然存在的多肽一樣長。
肽類似物通常用于制藥工業(yè)，作為與模板肽具有類似特征的非肽藥物。這些類型的非肽化合物稱為“肽模擬物”或“模擬肽”。Fauchere，藥物研究進展雜志，1529(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans等，藥物化學雜志，301229(1987)，本文作為參考文獻引用。該化合物通常借助于計算機化的分子模型來形成。結構上類似于治療上有用的肽的肽模擬物可用于產生相當的治療或預防效果。一般來說，肽模擬物在結構上相似于模板肽(即，具有生化特征或藥物學活性的肽)，如人抗體，但有一個或多個肽鍵以本領域熟知的方法任選被由下列基團組成的鍵取代-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(順式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-，和CH2SO-。共有序列的一個或多個氨基酸被相同類型的D-氨基酸系統(tǒng)取代(例如，D-賴氨酸代替C-賴氨酸)可用于產生更多穩(wěn)定的肽。另外，含有共有序列或基本上相同的共有序列變異的約束肽可用本領域已知的方法產生(Rizo和Gierasch，生化年鑒，61387(1992)，本文引用以供參考)；例如，經過增加能形成分子內二硫鍵以環(huán)化多肽的內部半胱氨酸殘基。
“抗體”或“抗體肽”指完整抗體或與完整抗體競爭特異性結合的其結合片段。結合片段以重組DNA技術，或經過酶或化學裂解完整抗體產生。結合片段包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，和單鏈抗體。非“雙特異性”或“雙功能”抗體的抗體理解為其各個結合位點相同。當過量抗體使結合反受體的受體量減少至少大約20％,40％,60％或80％且更通常是大于大約85％(在體外競爭結合試驗中測量)時，抗體顯著抑制受體與反受體的附著。
術語“表位”包括能特異性結合免疫球蛋白或T-細胞受體的任何蛋白決定族。表位決定族通常由分子的具有化學活性的表面集合，如氨基酸或糖側鏈組成并通常具有特定的三維結構特征，以及特定的帶電特性。當解離常數為≤1μM，優(yōu)選≤100nM且最優(yōu)選≤10nM時，認為抗體特異性地結合抗原。
本文使用的術語“試劑”指化合物，化合物的混合物，生物學大分子，或從生物學材料制備的提取物。
本文使用的術語“標記”或“標記的”指摻入可檢測的標記，例如，經過摻入放射性標記的氨基酸或將可用標記的抗生物素蛋白檢測的生物素部分附著在多肽上(例如，可用光學或比色法檢測的含熒光標記或酶活性的鏈霉抗生物素蛋白)。在某些情況下，標記或標記物也可以是治療性的。標記多肽和糖蛋白的各種方法是本領域已知的且均可使用。多肽標記物的例子包括但不限于放射性同位素或放射性核素(例如，3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I)，熒光標記(例如，FITC，羅丹明，鑭磷光體)，酶標記(例如，辣根過氧化物酶，β-半乳糖苷酶，熒光素酶，堿性磷酸酶)，化學發(fā)光物，生物素基團，被第二報道基因識別的預定多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列，第二抗體的結合位點，金屬結合結構域，表位標記)。在有些實施方案中，標記以各種長度的間隔臂附著以減小潛在的空間障礙。
本文使用的術語“藥用試劑或藥品”指當適當施用給患者時能誘導所需治療效果的化合物或組合物。本文的其它化學術語按本領域的常規(guī)用法使用，例如見，McGraw-Hill化學術語詞典(Parker，S.Ed.，McGraw-Hill，San Francisco(1985)，本文作為參考文獻引用)。
本文使用的術語“抗腫瘤劑”指具有抑制人體腫瘤，特別是惡性(癌)病變，如癌，肉瘤，淋巴瘤，或白血病的發(fā)育或進展的功能特性。抑制癌轉移通常是抗腫瘤劑的一個特性。
本文使用的“基本上純”是指物質種類以占優(yōu)勢的種類存在(即，按摩爾計算，它比組合物中的任何其它種類更豐富)，且優(yōu)選基本上純化的餾份是一種組合物，其中該物質種類占所存在的所有大分子種類的至少大約50％(按摩爾算)。一般來說，基本上純的組份含有在組合物中存在的所有大分子種類的至少大約80％，更優(yōu)選超過大約85％,90％,95％和99％。更優(yōu)選的是，該物質種類純化成基本上勻質(在組合物中以常規(guī)檢測方法檢測不到污染物種類)，其中該組合物基本上由單一大分子種類組成。
術語患者包括人和獸醫(yī)受試者?？贵w結構基本抗體結構單位已知包含四聚體。各四聚體由2個相同的多肽鏈對組成，每對具有一個“輕鏈”(大約25kDa)和一個“重鏈”(大約50—70kDa)。各鏈的氨基末端部分包括主要負責抗原識別的大約100到110或更多氨基酸的可變區(qū)。各鏈的羧基末端部分限定了一個主要負責效應器功能的恒定區(qū)。人輕鏈分類的κ和λ輕鏈。重鏈分類為μ，δ，γ，α或ε，且分別將抗體同種型限定為IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區(qū)和恒定區(qū)以大約12或更多個氨基酸的“J”區(qū)連接，該重鏈也包括大約10多個氨基酸的“D”區(qū)。一般參見，基礎免疫學，第7章(Paul，W.編輯，第二版，Raven出版社，紐約(1989))(將其全文作為參考文獻引用用于所有目的)。各輕/重鏈對的可變區(qū)形成抗體結合位點。
因此，完整的IgG抗體具有2個結合位點。除了雙功能或雙特異性抗體外，2個結合位點是相同的。
所有這些鏈顯示出相同的相當保守的構架區(qū)(FR)的一般結構，該構架區(qū)由3個外部可變區(qū)，也稱為互補性決定區(qū)域CDR連接。每對中兩條鏈的CDR經構架區(qū)排列，能與特異性表位結合。從N端到C端，輕鏈和重鏈均包含結構域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。各結構域中氨基酸的排列按Kabet，免疫學目的的蛋白質的序列，(國家衛(wèi)生組織，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia & Lesk，分子生物學雜志，196901—917(1987)；Chothia等，自然，342878—883(1989)的限定。
雙特異性或雙功能抗體是一種人工雜交抗體，它具有兩種不同的重/輕鏈對和2個不同的結合位點。雙特異性抗體可經過各種方法生產，包括雜交瘤的融合或Fab′片段的連接。例如，參見Songsivilai和Lachmann，臨床實驗免疫學，79315—321(1990)，Kostelny等，免疫學雜志，1481547—1553(1992)。此外，雙特異性抗體可形成“diabodies”(Holliger等，“‘Diabodies’小的雙價和雙特異性抗體片段”，PNAS USA，906444—6448(1993))或“Janusins”(Traunecker等，“在HIV感染的細胞上雙特異性單鏈分子(Janusins)靶向細胞毒性淋巴細胞”，EMBO J103655—3659(1991)和Traunecker等，“Janusin雙特異性試劑的新分子設計”，國際癌癥雜志增刊751—52(1992))。雙特異性抗體的生產與常規(guī)抗體的生產相比是勞動強度更高的過程，且雙特異性抗體的產量和純度一般更低。雙特異性抗體不以具有單個結合位點的片段的形式(例如，Fab，Fab′和Fv)存在。
人抗體和抗體的人源化人抗體避免了與具有鼠或大鼠可變和/或恒定區(qū)的抗體相關的某些問題。存在該鼠或大鼠來源的蛋白質可能導致該抗體的迅速清除或可導致患者產生抗該抗體的免疫反應。為了避免使用鼠或大鼠產生的抗體，有人假定可通過將人抗體功能引入嚙齒類使得嚙齒類可產生具有全人序列的抗體，以此形成人源化抗體或產生全人抗體。
人抗體在YAC中克隆和重建兆堿基大小的人基因座并將它們導入小鼠種系的能力提供了解釋極大型或粗略定位的基因座的功能成份以及產生有用的人類疾病模型的有力方法。而且，將該技術用于以其人類等價物取代小鼠基因座可提供對發(fā)育期間人基因產物表達和調節(jié)，其與其它系統(tǒng)的聯系和其涉及的疾病誘導和進展的獨特認識。
該策略的重要實際應用是小鼠體液免疫系統(tǒng)的“人源化”。將人免疫球蛋白(Ig)基因座導入內源性Ig基因已被滅活的小鼠提供了研究抗體的程序化表達和裝配的機制以及其在B-細胞發(fā)育中的作用的機會。而且，該策略可提供生產全人單克隆抗體(Mab)的理想來源，它是實現人類疾病的抗體療法的重要里程碑。預期全人抗體可使體內對小鼠或小鼠產生的Mab的免疫原性和過敏反應減到最小并因此增加了施用抗體的效力和安全性。預期使用全人抗體在需要重復抗體用藥的慢性和復發(fā)性人類疾病，如炎癥，自身免疫和癌癥的治療中提供顯著的優(yōu)勢。
針對這一目的的一種方案是用人Ig基因座的大片段改造小鼠抗體生產缺陷型的小鼠品系預期該小鼠在缺乏小鼠抗體的情況下會產生大型人抗體庫。大量人Ig片段可保存大量的可變基因多樣性以及抗體生產和表達的適當調節(jié)。經過研究小鼠抗體多樣化和選擇及對人蛋白質缺乏免疫學耐受性的機制，在這些小鼠品系中再生的人抗體庫應產生針對包括人抗原的任何目的抗原的高親和性抗體。使用雜交瘤技術，容易產生和篩選具有所需特異性的抗原特異性人Mab。
我們于1994年公開的所生產的首例XenoMouseTM品系證實了這種一般策略。見Green等，自然遺傳學，713—21(1994)。用含核心可變和恒定區(qū)序列的分別含人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的245kb和190kb大小的種系表形片段的酵母人工染色體(YAC)改造XenoMouseTM品系，如上所述。含人Ig的YAC被證實與小鼠抗體重排和表達的系統(tǒng)相容且能取代滅活的小鼠Ig基因。其誘導B-細胞形成的能力，產生類似成人的全人抗體庫的能力和產生抗原特異性人Mab的能力證實了這一點。這些結果也表明導入更大部分的含更大數目的V基因，其它調控元件和人Ig恒定區(qū)的人Ig基因座可基本上重演針對感染和免疫的特征性人體液反應的全部組成成份。最近，Green等的工作通過導入兆堿基大小的分別含人重鏈基因座和κ輕鏈基因座的種系表形YAC片段導入超過大約80％的人抗體庫以產生XenoMouseTM小鼠。參見，Mendez等，自然遺傳學，15146—156(1997)，Green和Jakobovits，實驗醫(yī)學雜志，188483—495(1998)，和1996年12月3日申請的美國專利申請系列號08/759,620，本文分別作為參考文獻引用。
在下列文獻中進一步討論和描繪了該方案1990年1月12日申請的美國專利申請系列號07/466,008，1990年11月8日申請的07/610,515，1992年7月24日申請的07/919,297，1992年7月30日申請的07/922,649，1993年3月15日申請的08/031,801，1993年8月27日申請的08/112,848，1994年4月28日申請的08/234,145，1995年1月20日申請的08/376,279，1995年4月27日申請的08/430,938，1995年6月5日申請的08/464,584，1995年6月5日申請的08/464,582，1995年6月5日申請的08/463,191，1995年6月5日申請的08/462,837，1995年6月5日申請的08/486,853，1995年6月5日申請的08/486,857，1995年6月5日申請的08/486,859，1995年6月5日申請的08/462,513，1996年10月2日申請的08/724,752，1996年12月3日申請的08/759,620。也參見Mendez等，自然遺傳學，15146—156(1997)和Green及Jakobovits，實驗醫(yī)學雜志，188483—495(1998)。也參見1996年6月12日授權公開的歐洲專利號EP0463151B1，1994年2月3日公開的國際專利申請?zhí)朩O94/02602，1996年10月31日公開的國際專利申請?zhí)朩O96/34096，和1998年6月11日公開的WO98/24893。上面引用的各專利，申請和參考文獻的公開內容以其全文在本文中作為參考文獻引用。
在一個可供選擇的方案中，包括GenPharm國際有限公司的其他人使用了“小基因座”方案。在小基因座方案中，通過包括來自Ig基因座的片段(單個基因)模仿外源性Ig基因座。因此，一個或多個VH基因，一個或多個DH基因，一個或多個JH基因，μ恒定區(qū)，第二恒定區(qū)(優(yōu)選γ恒定區(qū))形成插入動物中的構建體。該方案在下列文獻中有描述Surani等的美國專利號5,545,807，均屬于Lonberg和Kay的美國專利號5,545,806；5625825,5625126,5633425,5661016,5770429,5789650和5814318，Krimpenfort和Berns的美國專利號5591669，Berns等的美國專利號5612205,5721367,5789215，Choi和Dunn的美國專利號5643763，GenPharm國際公司的1990年8月29日申請的美國專利申請系列號07/574,748，1990年8月31日申請的07/575,962，1991年12月17日申請的07/810,279，1992年3月18日申請的07/853,408，1992年6月23日申請的07/904,068，1992年12月16日申請的07/990860，1993年4月26日申請的08/053,131,1993年7月22日申請的08/096762，1993年11月18日申請的08/155,301，1993年12月3日申請的08/161,739，1993年12月10日申請的08/165,699，1994年3月9日申請的08/209741，本文引用其公開內容作為參考。也參見歐洲專利號0546073B1，國際專利申請?zhí)朩O92/03918，WO92/22645，WO92/22647，WO92/22670，WO93/12227，WO94/00569，WO94/25585，WO96/14436，WO97/13852和WO98/24884，其說明書作為整體在此引用以供參考。還參見Taylor等，1992，Chen等，1993，Tuaillon等，1993，Choi等，1993，Lonberg等(1994)，Taylor等，(1994)，和Tuaillon等，(1995)，Fishwild等，(1996)，其公開內容作為整體在此引用以供參考。
上面引用的Surani等且轉讓給醫(yī)學研究顧問(“MRC”)的發(fā)明人通過使用小基因座研究產生了具有Ig基因座的轉基因小鼠。上面引用的GenPharm國際公司的工作的發(fā)明人，Lonberg和Kay在本發(fā)明人的領導下建議滅活內源性小鼠Ig基因座并結合大量復制Surani等的工作。
小基因座方案的優(yōu)勢是其快速，可產生包括Ig基因座部分的構建體并導入動物。然而，相對應的是，小基因座方案的明顯缺點在于，理論上，通過包括少數V，D，和J基因導入的多樣性不夠。事實上，已公開的工作似乎支持了這一觀點。通過使用小基因座方案產生的動物B-細胞形成和抗體生產似乎受到阻礙。因此，圍繞本發(fā)明的研究一般是針對導入大部分的Ig基因座以實現更大的多樣性且努力重建動物的免疫庫。
人抗小鼠抗體(HAMA)反應產生了制備嵌合或其它人源化抗體的工業(yè)。由于嵌合抗體具有人恒定區(qū)和小鼠可變區(qū)，因此預期可觀察到某些人抗嵌合抗體(HACA)反應，特別是在慢性病或多劑量使用抗體的情況下。因此，需要提供抗CTLA-4的全人抗體以消除這些顧慮和/或HAMA或HACA反應的影響。
人源化和展示技術正如上面關于人抗體產生所討論的，產生具有免疫原性降低的抗體具有優(yōu)勢。在一定程度上，使用合適的文庫及人源化技術和展示技術可實現這點。預期使用本領域熟知的技術可人源化或靈長類化鼠抗體或來自其它物種的抗體。例如，參見Winter和Harris，當今免疫學，1443—46(1993)和Wright等，Crit.Reviews in Immunol.12125—168(1992)。經過重組DNA技術用相應的人序列取代CH1，CH2，CH3，鉸鏈區(qū)，和/或構架區(qū)可改造目的抗體(見WO92/02190和美國專利號5,530,101,5,585,089,5693.761,5693792,5714350，和5777085)。另外，使用Ig cDNa構建嵌合免疫球蛋白基因在本領域中是已知的(Liu等，PNAS，843439(1987)和免疫學雜志，1393521(1987))。從雜交瘤或其它產生抗體的細胞中分離mRNA并用于產生cDNA。目的cDNA可使用特異性引物經聚合酶鏈反應擴增(美國專利號4683195和4683202)。另外，可制備并篩選文庫以分離目的序列。然后將編碼抗體可變區(qū)的DNA序列融合到人恒定區(qū)序列上。人恒定區(qū)基因的序列可參見Kabat等(1991)，免疫學目的的蛋白質序列，N.I.H.
發(fā)明者D·C·漢森, M·J·尼維, E·E·穆勒, J·H·漢克, S·C·吉爾曼, C·G·戴維斯, J·R·科瓦蘭 申請人:輝瑞大藥廠, 阿布格尼克斯公司