專利名稱：具有膽堿氧化酶活性的多肽及編碼該多肽的核酸的制作方法
背景技術：
發(fā)明領域本發(fā)明涉及具有膽堿氧化酶活性的分離多肽和編碼該多肽的分離核酸序列。本發(fā)明還涉及包含該核酸序列的核酸構建物、載體、和宿主細胞，以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法。
相關技術的描述膽堿氧化酶(EC1.1.3.17)是能夠催化由膽堿通過甜菜醛生物合成甘氨酸甜菜堿的雙功能酶。該酶是含有共價結合的FAD的可溶性酶。膽堿是卵磷脂的天然水解產(chǎn)物。甘氨酸甜菜堿被認為在大量微生物和植物中具有滲透防護作用。除了作為滲透防護劑的生理學作用，甘氨酸甜菜堿在普通代謝中也發(fā)揮作用，由其衍生的甲基被摻入植物的生物堿、哺乳動物和微生物的甲硫氨酸、和微生物的鈷胺素(維生素B12)。此外，甜菜堿可以作為某些微生物的碳源和氮源。
膽堿氧化酶可以應用于臨床生化，用于估計血清和羊水中含膽堿的磷脂。此外，編碼膽堿氧化酶的基因可能適合用于增強感興趣生物系統(tǒng)(如植物)中的滲透耐受性。
JP 54035284公開了由屬于柱孢屬(Cylindrocarpon)、鐮孢屬(Fusarium)、或赤霉屬(Gibberella)的微生物制備膽堿氧化酶。
Deschnium等人(1995，植物分子生物學(Plant MolecularBiology)29897-907)公開了由球形節(jié)桿菌(Arthrobacterglobiformis)克隆膽堿氧化酶基因的方法。Rozwadowski等人(1991，細菌學雜志(Journal of Bacteriology)173472-478)公開了由滋養(yǎng)節(jié)桿菌(Arthrobacter pascens)克隆膽堿氧化酶的方法。JP5317056公開了由單孢高溫放線菌(Thermoactinomyces monosporus)克隆膽堿氧化酶的方法。
本發(fā)明的目的之一是提供具有膽堿氧化酶活性的改進多肽和編碼該多肽的核酸。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有膽堿氧化酶活性、選自下組的分離多肽(a)具有與SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低嚴謹條件下與下述可雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)至少100個核苷酸的(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈；(c)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽包含一個或多個氨基酸取代、缺失、和/或插入的變體；(d)(a)或(b)的等位基因變體；和(e)具有膽堿氧化酶活性的(a)、(b)、或(d)的片段。
本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的分離核酸序列，和包含該核酸序列的核酸構建物、載體、和宿主細胞，以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法。
圖的簡述

圖1A和1B顯示Fusarium venenatum的膽堿氧化酶的cDNA序列和推導的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO1和2)。
發(fā)明詳述具有膽堿氧化酶活性的多肽術語“膽堿氧化酶活性”此處定義為當氧氣存在時催化膽堿氧化產(chǎn)生甘氨酸甜菜醛和過氧化氫的膽堿氧1-氧化還原酶。為了本發(fā)明的目的，根據(jù)Ikuta等人描述的步驟(1977，生化雜志(J.Biochem.)82157-163)，通過測量由膽堿氧化產(chǎn)生的過氧化氫，測定膽堿氧化酶活性。1個單位的膽堿氧化酶活性定義為在標準條件下每分鐘產(chǎn)生1.Oμmol過氧化氫的酶量。
在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有膽堿氧化酶活性、具有與SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸有至少大約65％，優(yōu)選至少大約70％，更優(yōu)選至少大約80％，甚至更優(yōu)選至少大約90％，最優(yōu)選至少大約95％，甚至最優(yōu)選至少大約97％，同一性的氨基酸序列的分離多肽(此后稱為“同源多肽”)。在優(yōu)選的實施方案中，同源多肽具有與SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸有5個氨基酸，優(yōu)選4個氨基酸，更優(yōu)選3個氨基酸，甚至更優(yōu)選2個氨基酸，最優(yōu)選1個氨基酸不同的氨基酸序列。為了本發(fā)明的目的，通過Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比對參數(shù)，測定兩種氨基酸序列的同一性程度缺口罰分10，缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)為Ktuple＝1，缺口罰分＝3，框＝5，對角線＝5。
本發(fā)明多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸或其等位基因變體；或其具有膽堿氧化酶活性的片段。在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽包含SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽由SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸或其等位基因變體；或其具有膽堿氧化酶活性的片段組成。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明多肽由SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸組成。
SEQ ID NO2的片段是在該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個氨基酸的多肽。該多肽優(yōu)選包含至少453個氨基酸殘基，更優(yōu)選至少483個氨基酸殘基，最優(yōu)選至少513個氨基酸殘基。
等位基因變體指占據(jù)相同染色體基因座的基因的兩種或多種變換形式中的任一種。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并可能在種群中導致多態(tài)性?；蛲蛔兛赡苁浅聊?即編碼的多肽沒有變化)，或者可能編碼氨基酸序列變化了的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及具有膽堿氧化酶活性，由在很低嚴謹條件下、優(yōu)選低嚴謹條件、更優(yōu)選中等嚴謹條件、更優(yōu)選中等-高嚴謹條件、甚至更優(yōu)選高嚴謹條件、最優(yōu)選很高嚴謹條件下與核酸探針可雜交的核酸序列編碼的分離多肽，該核酸探針在相同條件下與下述序列可雜交(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈(J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatus，1989，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，紐約)。SEQ ID NO1的亞序列可以是至少100個核苷酸，或者優(yōu)選至少200個核苷酸。此外，亞序列可以編碼具有膽堿氧化酶活性的多肽片段。多肽還可以是具有膽堿氧化酶活性的多肽的等位基因變體或片段。
根據(jù)本領域眾所周知的方法，SEQ ID NO1的核酸序列或其亞序列，以及SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段，可以用于設計鑒定和克隆編碼來自不同屬或種的菌株、具有膽堿氧化酶活性的多肽的DNA的核酸探針。具體而言，根據(jù)標準Southern印漬步驟，這些探針可以用于與感興趣的屬或種的基因組或cDNA的雜交，以鑒定并分離其中的相應基因。這些探針可以比完整序列短很多，但是應當包含至少15個，優(yōu)選至少25個，更優(yōu)選至少35個核苷酸。也可以使用更長的探針。DNA和RNA探針都可以使用。通常(例如用32P、3H、35S、生物素、或鏈霉親和素)標記探針以檢測相應基因。本發(fā)明涵蓋這些探針。
由此，可以對由這樣的其它有機體制備的基因組DNA或cDNA文庫篩選可與上述探針雜交、編碼具有膽堿氧化酶活性的多肽的DNA?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳或者其它分離技術分離來自這樣的其它有機體的基因組或其它DNA?？梢赞D移來自文庫的DNA或分離DNA，并固定在硝酸纖維素或其它合適的載體材料上。為了鑒定克隆或與SEQID NO1同源的DNA或其亞序列，可以將載體材料用于Southern印漬。為了本發(fā)明的目的，雜交指在很低至很高嚴謹條件下，與對應于SEQ IDNOl所示核酸序列、其互補鏈、或其亞序列的經(jīng)標記核酸探針可雜交的核酸序列。使用X線膠片檢測在這些條件下與核酸探針雜交的分子。
在優(yōu)選的實施方案中，核酸探針是編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸序列或其亞序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸探針是SEQ IDNO1。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸探針是E.coliNRRL B-30066所含質粒pFD0808所含核酸序列，其中該核酸序列編碼具有膽堿氧化酶活性的多肽。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸探針是E.coli NRRLB-30066所含質粒pFD0808所含的、編碼SEQ ID NO2的多肽的核酸序列(即SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸)。
對于至少100個核苷酸的長探針，很低至很高嚴謹條件定義為根據(jù)常規(guī)Southern印漬步驟，于42℃在5X SSPE/0.3％ SDS/200μg/ml經(jīng)剪切和變性的鮭魚精DNA/25％(很低和低嚴謹度)或35％(中等和中等-高嚴謹度)或50％(高和很高嚴謹度)甲酰胺中進行預雜交和雜交。
對于至少100個核苷酸的長探針，最后將載體材料用2X SSC/0.2％SDS于至少45℃(極低嚴謹度)，更優(yōu)選到50℃(低嚴謹度)，更優(yōu)選55℃(中等嚴謹度)，更優(yōu)選至少60℃(中等-高嚴謹度)，甚至更優(yōu)選至少65℃(高嚴謹度)，最優(yōu)選至少70℃(很高嚴謹度)，清洗3次，每次15分鐘。
對于大約15-70個核苷酸的短探針，嚴謹條件定義為根據(jù)標準Southern印漬步驟，于比根據(jù)Bolton和McCarthy的算法(1962，美國國家科學院進展(Proceedings of the National Academy of ScienceUSA)481390)計算所得Tm低大約5-大約10℃的溫度，在0.9MNaCl/0.09M Tris-HCl pH7.6/6mM EDTA/0.5％ NP-40/1X Denhardt氏液/1mM焦磷酸鈉/1mM磷酸二氫鈉/0.1mM ATP/0.2mg/ml酵母RNA中，進行預雜交、雜交、和雜交后清洗。
對于大約15-70個核苷酸的短探針，于比計算所得Tm低5-10℃的溫度，將載體材料用6X SCC/0.1％SDS清洗1次，再用6X SCC清洗2次，每次15分鐘。
在第三個實施方案中，本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽包含一個或多個氨基酸取代、缺失、和/或插入的變體。
變體多肽的氨基酸序列可以因一個或多個氨基酸殘基的插入、缺失、和/或取代而與SEQ ID NO2或其成熟多肽的氨基酸序列不同。氨基酸變化優(yōu)選性質小的變化，即不顯著影響蛋白質的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小的缺失，通常為1-大約30個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，諸如氨基末端的甲硫氨酸殘基；多達大約20-25個殘基的小接頭肽；或者通過改變凈電荷或其它功能而有助于純化的小延伸，諸如多聚組氨酸片段、抗原性表位、或結合結構域。
保守性取代的范例是堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸、和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、和色氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、和甲硫氨酸)各組內的取代。通常不改變比活性的氨基酸取代在本領域是已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill于1979年在《蛋白質》(Academic Press，紐約)中描述過。最常見的替換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly以及反向替換。
在第四個實施方案中，本發(fā)明涉及與具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽具有免疫化學同一性或部分免疫化學同一性的分離多肽?？赏ㄟ^免疫學交叉反應同一性測試，由眾所周知的Ouchterlony雙向免疫擴散步驟，測定免疫化學特性。具體而言，根據(jù)Harboe和Ingild描述的步驟(在N.H.Axelsen、J.Krll、和B.Weeks編的《定量免疫電泳手冊》(A Manual of QuantitativeImmunoelectrophoresis)中，Blackwell Scientific Publications，1973，第23章；或Johnstone和Thorpe，《(免疫化學實踐》，BlackwellScientific Publications，1982，第27-31頁)，通過免疫兔子(或其它嚙齒類動物)，制備含對有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的表位具有免疫反應性或可與之結合的多克隆抗體的抗血清。具有免疫化學同一性的多肽是使用特異免疫化學技術，以相同方式與該抗血清反應的多肽，諸如沉淀物的完全融合、相同沉淀物形態(tài)、和/或相同電泳遷移率。免疫化學同一性的進一步解釋由Axelsen、Bock、和Krll描述(在N.H.Axelsen、J.Krll、和B.Weeks編的《(定量免疫電泳手冊》中，Blackwell Scientific Publications，1973，第10章)。具有部分免疫化學同一性的多肽是使用特異免疫化學技術，以部分相同方式與該抗血清反應的多肽，諸如沉淀物的部分融合、沉淀物形態(tài)部分相同、和/或電泳遷移率部分相同。部分免疫化學同一性的進一步解釋由Bock和Axelsen描述(在N.H.Axelsen、J.Krll、和B.Weeks編的《定量免疫電泳手冊》中，BlackwellScientific Publications，1973，第11章)。
抗體還可以是單克隆抗體。可以根據(jù)E.Harlow和D.Lane(編，《抗體實驗室手冊》(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港，紐約)的方法制備并使用單克隆抗體。
本發(fā)明多肽具有SEQ ID NO2的成熟多肽的至少20％、優(yōu)選至少40％、更優(yōu)選至少60％、甚至更優(yōu)選至少80％、甚至更優(yōu)選至少90％、最優(yōu)選至少100％的膽堿氧化酶活性。
本發(fā)明多肽可以由任何屬的微生物獲得。為了本發(fā)明的目的，術語“由……獲得”如此處與指定來源一起使用時，指由核酸序列編碼的多肽由該來源或插入了來自該來源的核酸序列的細胞產(chǎn)生。在優(yōu)選的實施方案中，多肽分泌到細胞外。
本發(fā)明多肽可以是細菌多肽。例如，該多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽，諸如芽孢桿菌屬(Bacillus)多肽，如嗜堿性芽孢桿菌(Bacillus alkslophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)形芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽；或者鏈霉菌屬(Streptomyces)多肽，如淺青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈霉菌(Streptomycesmurinus)多肽；或者革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌(E.coli)或假單胞菌(Pseudomonas sp.)多肽。
本發(fā)明多肽可以是真菌多肽，更優(yōu)選酵母多肽，諸如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia屬多肽；或者更優(yōu)選絲狀真菌多肽，諸如頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、線黑粉菌屬(Filibasidium)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)、Magnaporthe屬、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、Neocallimastix屬、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、Piromyces屬、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium、或木霉屬(Trichoderma)多肽。
在優(yōu)選的實施方案中，多肽是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyecs diastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyces Kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多肽。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei、或綠色木霉(Trichoderma viride)多肽。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，多肽是桿孢狀鐮孢(Fusariumbactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾本科鐮孢(Fusariumgraminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusariumheterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖鐮孢(Fusariumoxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusariumroseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusariumsarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、或Fusarium venenatum多肽。
在更優(yōu)選的實施方案中，所述Fusarium venenatum細胞是最初作為禾谷鐮孢ATCC 20334保藏、最近由Yoder和Christianson(1998，真菌遺傳學和生物學(Fungal Genetics and Biology)2362-80)以及O’Donnell等人(1998，真菌遺傳學和生物學(Fungal Genetics andBiology)2357-67)重新分類為Fusarium venenatum的Fusariumvenenatum A3/5；以及Fusarium venenatum的分類學同等物，不論這些物種現(xiàn)在的名稱如何。在另一個優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)usariumvenenatum細胞是Fusarium venenatum A3/5或Fusarium yenenatumATCC 20334的形態(tài)學突變體，公開于WO 97/26330。
可以理解，本發(fā)明涵蓋上述物種的完全和不完全狀態(tài)，和其它分類學同等物，如無性型，而不論這些物種現(xiàn)在的名稱如何。本領域技術人員將容易的領會適當同等物的具體內容。例如，D.L.Hawksworth、P.M.Kirk、B.C.Sutton、和D.N.Pegler(編)在《真菌的Ainsworth和Bisby氏字典》中(1995，第8版，CAB International，UniversityPress，劍橋，英國，第173-174頁)定義了鐮孢的分類學同等物。
這些物種的菌株可以在大量的培養(yǎng)物收藏中心公開獲得，諸如美國典型培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、和北方地區(qū)研究中心(NRRL)的農(nóng)業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物收藏中心(NRRL)。
此外，這些多肽可以使用上述探針由其它來源鑒定并獲得，包括由自然界(如土壤、堆肥、水、等等)分離的微生物。用于由天然棲息地分離微生物的技術在本領域是眾所周知的。然后可以通過對其它微生物的基因組或cDNA文庫相似篩選獲得核酸序列。一旦用探針檢測到了編碼多肽的核酸序列，可以通過本領域普通技術人員已知的技術分離或克隆序列(參閱Sambrook等人，1989，見上文)。
如此處定義的，“分離”多肽是基本上不含其它非膽堿氧化酶多肽的多肽，如通過SDS-PAGE測定至少大約20％純，優(yōu)選至少大約40％純，更優(yōu)選大約60％純，甚至更優(yōu)選大約80％純，最優(yōu)選大約90％純，甚至最優(yōu)選大約95％純。
由本發(fā)明核酸序列編碼的多肽還包括在多肽或其片段的N末端或C末端融合了另一種多肽的融合多肽或可切割融合多肽。融合多肽通過將編碼另一種多肽的核酸序列或其部分與本發(fā)明的核酸序列或其部分融合而產(chǎn)生。產(chǎn)生融合多肽的技術在本領域是已知的，包括連接編碼各多肽的編碼序列，使得它們位于同一讀碼框且融合多肽的表達受同一啟動子和終止子的控制。核酸序列本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列。在優(yōu)選的實施方案中，核酸序列是SEQ ID NO1所示序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸序列是E.coli NRRL B-30066所含質粒pFD0808中所含序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，核酸序列是SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，核酸序列是E.coliNRRL B-30066所含質粒pFD0808中所含成熟多肽編碼區(qū)。本發(fā)明還涵蓋編碼具有SEQID NO2的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽、因遺傳密碼的簡并性而與SEQ ID NO1不同的核酸序列。本發(fā)明還涉及編碼具有膽堿氧化酶活性的SEQ ID NO2的片段的SEQ ID NO1亞序列。
SEQ ID NO1的亞序列是SEQ ID NO1涵蓋，由5’和/或3’末端缺失了一個或多個核苷酸的核酸序列。優(yōu)選的亞序列包含至少1359個核苷酸，更優(yōu)選至少1449個核苷酸，最優(yōu)選至少1559個核苷酸。
本發(fā)明還涉及在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一處突變的突變型核酸序列，其中突變型核酸序列編碼由SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸組成的多肽。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術在本領域是已知的，并包括由基因組DNA的分離方法、由cDNA的制備方法、及其組合?？梢允褂帽娝苤木酆厦告準椒磻?PCR)或表達文庫的抗體篩選以檢測具有共同結構特征的克隆DNA片段，從而由這些基因組DNA克隆本發(fā)明核酸序列。參閱Innis等人，1990，《PCR方法和應用指南》(PCRA Guideto Methods and Application)，Academic Press，紐約。可以使用其它核酸擴增步驟，諸如連接酶鏈式反應(LCR)、連接激活轉錄(LAT)、和基于核酸序列的擴增(NASBA)。核酸序列可以由鐮孢屬的菌株或者其它或相關有機體克隆，因此可以是核酸序列多肽編碼區(qū)的等位基因變體或物種變體。
如此處所用，術語“分離核酸序列”指基本不含其它核酸序列的核酸序列，如通過瓊脂糖電泳測定至少大約20％純，優(yōu)選至少大約40％純，更優(yōu)選至少大約60％純，甚至更優(yōu)選至少大約80％純，最優(yōu)選至少大約90％純。例如，可以通過基因工程中使用的常規(guī)克隆步驟獲得分離核酸序列，并將核酸序列由其天然位置重新安置在可將其復制的不同位點。克隆步驟可能涉及切割并分離包含編碼多肽的核酸序列的期望核酸片段，將片段插入載體分子，并將重組載體摻入將復制多個拷貝或克隆的核酸序列的宿主細胞。核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源、或其任意組合。
本發(fā)明還涉及編碼活性多肽、與SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)(SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸)具有至少大約65％、優(yōu)選大約70％、優(yōu)選大約80％、更優(yōu)選大約90％、甚至更優(yōu)選大約95％、最優(yōu)選大約97％同源性的核酸序列。為了本發(fā)明的目的，通過Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，美國國家科學院進展(Proceedings of the National Academy of Science USA)80726-730)，使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比對參數(shù)，測定兩種核酸序列之間的同源性程度缺口罰分10，缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)為Ktuple＝3，缺口罰分＝3，框＝20。
對編碼本發(fā)明多肽的核酸序列的修飾對于合成與本發(fā)明多肽基本相似的多肽可能是必需的。術語與多肽“基本相似”指非天然產(chǎn)生的多肽形式。這些多肽可能因工程方法而與由其天然來源分離的多肽不同，如比活性、熱穩(wěn)定性、最佳pH、等等不同的變體。變體序列可以根據(jù)SEQ ID NO1的多肽編碼部分(如其亞序列)的核酸序列，和/或通過導入仍產(chǎn)生相同氨基酸序列、但符合意欲用于生產(chǎn)酶的宿主有機體的密碼子使用率的核苷酸取代，或通過導入可以產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代而構建。關于核苷酸取代的一般性描述參閱Ford等人，1991，蛋白質表達和純化(Protein Expression and Purification)295-107。
對于本領域技術人員是顯而易見的，這些取代可以位于對分子功能重要的區(qū)域之外，而仍產(chǎn)生活性多肽?？梢愿鶕?jù)本領域已知的步驟，諸如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參閱Cunningham和Wells，1989，科學(Science)2441081-1085)，鑒定對由本發(fā)明的分離核酸序列編碼的多肽活性重要、并因此優(yōu)選不進行取代的氨基酸殘基。在后一種技術中，在分子中每個帶正電的殘基處導入突變，并對產(chǎn)生的突變型分子測試膽堿氧化酶活性，以鑒定對分子活性重要的氨基酸殘基。還可以通過由諸如核磁共振分析、晶體學、或光親和標記(參閱de Vos等人，1992，科學(Science)255306-312；Smith等人，1992，分子生物學雜志(Journal of Molecular Biology)224899-904；Wlodaver等人，1992，F(xiàn)EBS通訊(FEBS Letters)30959-64)等技術進行的三維結構分析測定底物-酶相互作用的位點。
本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽、在很低嚴謹條件下、優(yōu)選低嚴謹條件、更優(yōu)選中等嚴謹條件、更優(yōu)選中等-高嚴謹條件、甚至更優(yōu)選高嚴謹條件，最優(yōu)選很高嚴謹條件下與下述與核酸探針可雜交的分離核酸序列，該核酸探針在相同條件下與SEQ ID NO1的核酸序列或其互補鏈可雜交；或此處定義的其等位基因變體和亞序列(Sambrook等人，1989，見上文)。
本發(fā)明還涉及通過(a)在很低、低、中等、中等-高、高、或很高嚴謹條件下，將DNA與下述序列雜交(i) SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈；和(b)分離核酸序列，由此產(chǎn)生的分離核酸序列。亞序列優(yōu)選至少100個核苷酸的序列，諸如編碼具有膽堿氧化酶活性的多肽片段的序列。產(chǎn)生突變型核酸序列的方法本發(fā)明進一步涉及產(chǎn)生突變型核酸序列的方法，包括在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列或其亞序列中導入至少一個突變，其中突變型核酸序列編碼具有膽堿氧化酶活性、由SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸組成的多肽或其片段。
可以使用本領域的已知方法，通過定點誘變，將突變導入核酸序列，從而用一種核苷酸替換另一種核苷酸。特別有用的是利用包含感興趣插入片段的超螺旋雙鏈DNA載體和含期望突變的兩種合成引物的方法。與載體的相對鏈互補的寡核苷酸引物在溫度循環(huán)過程中借助PfuDNA聚合酶而延伸。摻入引物后，產(chǎn)生了包含交錯缺刻的突變質粒。溫度循環(huán)之后，用對甲基化和半甲基化DNA特異的DpnI處理產(chǎn)物以消化親本DNA模板，并選擇包含突變的合成DNA。還可使用本領域已知的其它方法。核酸構建物本發(fā)明還涉及包含與一種或多種在相容條件下指導編碼序列在合適表達宿主細胞中表達的控制序列可操作連接的本發(fā)明核酸序列的核酸構建物。表達應理解為包括涉及產(chǎn)生多肽的任何步驟，包括(但不限于)轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、和分泌。
“核酸構建物”此處定義為由天然產(chǎn)生的基因分離的、或經(jīng)修飾包含以自然界中不存在的方式組合和并列的核酸片段的單鏈或雙鏈核酸分子。當核酸構建物包含本發(fā)明編碼序列表達需要的所有控制序列時，術語“核酸構建物”與術語“表達盒”同義。術語“編碼序列”此處定義為直接指示其蛋白質產(chǎn)物的氨基酸序列的核酸序列?；蚪M編碼序列的邊界通常由正好位于mRNA開放閱讀框架5’末端上游的核糖體結合位點(原核生物)或ATG起始密碼子(真核生物)和正好位于mRNA開放閱讀框架3’末端下游的轉錄終止子序列確定。編碼序列可以包括(但不限于)DNA、cDNA、和重組核酸序列。
可以以多種方法操作編碼本發(fā)明多肽的分離核酸序列，以提供多肽的表達。在插入載體前對核酸序列的操作可能是希望的或必需的，這取決于表達載體。利用重組DNA方法修飾核酸序列的技術在本領域是眾所周知的。
術語“控制序列”此處定義為包括對本發(fā)明多肽的表達必需或有利的所有成分。每一種控制序列對編碼多肽的核酸序列可以是天然的或外來的。這些控制序列包括(但不限于)前導序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、和轉錄終止子。最低限度控制序列包括啟動子，和轉錄和翻譯終止信號。為了導入有助于將控制序列與編碼多肽的核酸序列編碼區(qū)連接的特異限制性位點，可以與接頭一起提供控制序列。術語“可操作連接”此處定義為其中控制序列被正確置于相對于DNA序列編碼序列的位置使得控制序列指導多肽表達的這樣一種構象。
控制序列可以是恰當?shù)膯幼有蛄?，即由用于表達核酸序列的宿主細胞識別的核酸序列。啟動子序列包含介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可以是在選定的宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變型、截短的、和雜合的啟動子，而且可以由編碼對于宿主細胞是同源的或異源的胞外或胞內多肽的基因獲得。
用于特別是在細菌宿主細胞中指導本發(fā)明核酸構建物轉錄的合適啟動子的范例是由大腸桿菌的lac操縱子、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)的瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌的果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶基因(amyl)、嗜熱脂肪芽孢桿菌的生麥芽糖淀粉酶基因(maltogenicamylase gene，amyM)、解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌的青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌的xylA和xylB基因、和原核生物的β-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，美國國家科學院進展(Proceedings of the National Academy ofScience USA)753727-3731)獲得的啟動子，以及tac啟動子(DeBoer等人，1983，美國國家科學院進展(Proceedings of the NationalAcademy of Science USA)8021-25)?！皝碜灾亟M細菌的有用蛋白質”(科學美國人(Scientific American)24274-94，1980)和Sambrook等人(1989，見上文)描述了其它啟動子。
用于在絲狀真菌宿主細胞中指導本發(fā)明核酸構建物轉錄的合適啟動子的范例是由米曲霉的TAKA淀粉酶基因、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)的天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉的中性α-淀粉酶基因、黑曲霉的酸穩(wěn)定性α-淀粉酶基因、黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶基因(glaA)、米赫根毛霉的脂肪酶基因、米曲霉的堿性蛋白酶基因、米曲霉的磷酸丙糖異構酶基因、構巢曲霉的乙酰胺酶基因、尖鐮孢的類胰蛋白酶蛋白酶基因(WO 96/00787)獲得的啟動子，以及NA2-tpi啟動子(黑曲霉的中性α-淀粉酶基因和米曲霉的磷酸丙糖異構酶基因啟動子的雜合體)，和它們突變的、截短的、和雜合的啟動子。
在酵母宿主中，有用的啟動子由釀酒酵母的烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母的半乳糖激酶(GAL1)基因、釀酒酵母的乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因、和釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶基因獲得。Romanos等人(1992，酵母(Yeast)8423-488)描述了用于酵母宿主細胞的其它有用的啟動子。
控制序列還可以是合適的轉錄終止子序列，即由宿主細胞識別以終止轉錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3’末端可操作連接。在選定的宿主細胞中發(fā)揮功能的任何終止子都可以用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選終止子由米曲霉的TAKA淀粉酶基因、黑曲霉的葡糖淀粉酶基因(glaA)、構巢曲霉的鄰氨基苯甲酸合成酶基因、黑曲霉的α-糖苷酶基因、和尖鐮孢的類胰蛋白酶蛋白酶基因獲得。
用于酵母宿主細胞的優(yōu)選終止子由釀酒酵母的烯醇化酶基因、釀酒酵母的細胞色素C(CYC1)基因、和釀酒酵母的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因獲得。Romanos等人(1992，見上文)描述了用于酵母宿主細胞的其它有用終止子。
控制序列還可以是合適的前導序列，即對宿主細胞進行的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導序列與編碼多肽的核酸序列的5’末端可操作連接。在選定的宿主細胞中發(fā)揮功能的任何前導序列都可以用于本發(fā)明。
用于絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選前導序列由米曲霉的TAKA淀粉酶基因和構巢曲霉的磷酸丙糖異構酶基因獲得。
用于酵母宿主細胞的合適前導序列由釀酒酵母的烯醇化酶(ENO-1)基因、釀酒酵母的3-磷酸甘油酸激酶基因、釀酒酵母的α-因子基因、和釀酒酵母的乙醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)基因獲得。
控制序列還可以是多聚腺苷酸化序列，即與核酸序列的3’末端可操作連接、當轉錄時由宿主細胞識別作為向轉錄的mRNA添加多聚腺苷酸殘基的信號的序列。在選定的宿主細胞中發(fā)揮作用的任何多聚腺苷酸化序列都可以用于本發(fā)明。
用于宿主真菌宿主細胞的優(yōu)選多聚腺苷酸化序列由米曲霉的TAKA淀粉酶基因、黑曲霉的葡糖淀粉酶基因、構巢曲霉的鄰氨基苯甲酸合成酶基因、尖鐮孢的類胰蛋白酶蛋白酶基因、和黑曲霉的α-糖苷酶基因獲得。
Guo和Sherman(1995，分子細胞生物學(Molecular CellularBiology)155983-5990)描述了用于酵母宿主細胞的有用多聚腺苷酸化序列。
控制序列還可以是編碼與多肽的氨基末端連接的氨基酸序列并引導編碼的多肽進入細胞分泌途徑的信號肽編碼區(qū)。核酸序列的編碼序列的5’末端可能包含與編碼分泌多肽的編碼區(qū)在翻譯讀碼框中天然連接的信號肽編碼區(qū)?；蛘?，編碼序列的5’末端可能包含對編碼序列來說是外源的信號肽編碼區(qū)。當編碼序列天然不含信號肽編碼區(qū)時可能需要外源信號肽編碼區(qū)?；蛘?，為了增強多肽的分泌，可以僅僅用外源信號肽編碼區(qū)取代天然信號肽編碼區(qū)。然而，引導表達的多肽進入選定宿主細胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)都可以用于本發(fā)明。
用于細菌宿主細胞的有效信號肽編碼區(qū)是由芽孢桿菌NCIB 11837的生麥芽糖淀粉酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶基因、地衣芽孢桿菌的β-內酰胺酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢桿菌的prsA基因獲得的信號肽編碼區(qū)。Simonen和Palva(1993，微生物學綜述(Microbiological Reviews)57109-137)描述了其它信號肽。
用于絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼區(qū)是由米曲霉的TAKA淀粉酶基因、黑曲霉的中性淀粉酶基因、黑曲霉的葡糖淀粉酶基因、米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因、Humicola insolens的纖維素酶基因、和Humicola lanuginosa的脂肪酶基因獲得的信號肽編碼區(qū)。
用于酵母宿主細胞的有用信號肽由釀酒酵母的α-因子基因和釀酒酵母的轉化酶基因獲得。Romanos等人(1992，見上文)描述了其它有用的信號肽編碼區(qū)。
控制序列還可以是編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽編碼區(qū)。產(chǎn)生的多肽稱為前酶或前多肽(或某些情況中稱酶原)。前多肽通常是無活性的，而且可以由前多肽通過前肽的催化或自催化切割轉變成成熟的有活性多肽。前肽編碼區(qū)可以由枯草芽孢桿菌的堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌的中性蛋白酶基因(nprT)、釀酒酵母的α-因子基因、米赫根毛霉的天冬氨酸蛋白酶基因、和嗜熱毀絲霉的漆酶基因(WO 95/33836)獲得。
當信號肽和前肽區(qū)都存在于多肽的氨基末端時，前肽區(qū)緊靠多肽的氨基末端，而信號肽區(qū)緊靠前肽區(qū)的氨基末端。
可能還需要添加能夠相對于宿主細胞的生長調控多肽表達的調控序列。調控系統(tǒng)的范例是應答化學或物理刺激(包括存在調控化合物)導致基因表達開放或關閉的調控系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調控系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱子系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉的葡糖淀粉酶啟動子、和米曲霉的葡糖淀粉酶啟動子作為調控序列。調控序列的其它范例是能夠用于擴增基因的調控序列。在真核系統(tǒng)中，這些包括當氨甲喋呤存在時擴增的二氫葉酸還原酶基因和當重金屬存在時擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核酸序列應與調控序列可操作連接。
本發(fā)明還涉及用于改變編碼本發(fā)明多肽的內源基因表達的核酸構建物。該構建物可以包含改變內源基因表達必需的最小數(shù)目成分。在一個實施方案中，該核酸構建物優(yōu)選包含(a)靶向序列、(b)調控序列、(c)外顯子、和(d)剪接供體位點。將核酸構建物導入細胞后，構建物通過同源重組插入細胞基因組中的內源基因位點。靶向序列指導元件(a)-(d)整合到內源基因中，使得元件(b)-(d)與內源基因可操作連接。在另一個實施方案中，核酸構建物包含(a)靶向序列、(b)調控序列、(c)外顯子、(d)剪接供體位點、(e)內含子、和(f)剪接受體位點，其中靶向序列指導元件(a)-(f)的整合，使得元件(b)-(f)與內源基因可操作連接。然而，構建物可以包含其它成分，諸如選擇標記。
在這兩個實施方案中，這些成分的導入產(chǎn)生了內源基因表達改變了的新的轉錄單位。在本質上，新的轉錄單位是通過靶向構建物導入的序列和內源基因的融合產(chǎn)物。在內源基因改變了的一個實施方案中，基因被激活。在該實施方案中，使用同源重組，通過插入將引起基因以高于相應親本細胞的水平表達的調控序列，從而取代、破壞、或滅活與親本細胞內源基因正常相連的調控序列。使用本領域眾所周知的方法(參閱美國專利號5,641,670)，通過在構建物中包含可擴增的選擇標記，可以進一步擴增激活的基因。在內源基因改變了的另一個實施方案中，基因表達被降低了。
靶向序列可以位于內源基因內、直接與基因相鄰、位于上游基因內、或位于內源基因上游且相距一定距離?？梢允褂靡环N或多種靶向序列。例如，環(huán)形質?；駾NA片段優(yōu)選采用單個靶向序列，而線性質?；駾NA片段優(yōu)選采用兩個靶向序列。
構建物的調控序列可以包含一種或多種啟動子、增強子、支架附著區(qū)或基質結合位點、負調控元件、轉錄結合位點、或這些序列的組合。
構建物還包含內源基因的一個或多個外顯子。外顯子定義為拷貝成RNA、并存在于成熟mRNA分子中的DNA序列，因此外顯子序列與內源基因的編碼區(qū)處于同一讀碼框。外顯子可以任選的包含編碼一個或多個氨基酸和/或部分編碼氨基酸的DNA。或者，外顯子包含對應于5’非翻譯區(qū)的DNA。當外源外顯子編碼一個或多個氨基酸和/或部分氨基酸時，核酸構建物被設計成在轉錄和剪接后，讀碼框與內源基因編碼區(qū)處于同一讀碼框，因此由第二個外顯子衍生的mRNA部分的正確讀碼框沒有改變。
構建物的剪接供體位點指導一個外顯子與另一個外顯子的剪接。通常，第一個外顯子位于第二個外顯子的5’，且位于第一個外顯子3’側翼且有交疊的剪接供體位點識別位于第二個外顯子5’側翼的剪接受體位點。剪接受體位點和剪接供體位點一樣，是指導一個外顯子與另一個外顯子發(fā)生剪接的序列。剪接系統(tǒng)利用剪接受體位點與剪接供體位點聯(lián)合作用以除去內含子。表達載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號的重組表達載體?？梢詫⑸鲜龈鞣N核酸和控制序列連接在一起，以產(chǎn)生重組表達載體，該載體可以包含一個或多個方便的限制性位點，使得能夠在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列?；蛘呖梢酝ㄟ^將本發(fā)明核酸序列或包含該核酸序列的核酸構建物插入用于表達的適當載體而表達本發(fā)明核酸序列。在產(chǎn)生表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使得編碼序列與用于表達的適當控制序列可操作連接。
重組表達載體可以是能夠方便地進行重組DNA步驟并能夠表達核酸序列的任何載體(如質?；虿《?。載體的選擇通常取決于載體與將要導入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線性或閉環(huán)質粒。
載體可以是自主復制的載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制不依賴染色體的復制，如質粒、染色體外元件、微小染色體、或人工染色體。載體可以包含確保自我復制的任何手段?；蛘咻d體可以是當導入宿主細胞后整合到基因組中并與它所整合的染色體一起復制的載體。此外可以使用單個載體或質粒或者兩個或多個載體或質粒(它們共同包含將要導入宿主細胞基因組中的總DNA)或者轉座子。
本發(fā)明載體優(yōu)選包含一種或多種能夠容易選擇轉化細胞的選擇標記。選擇標記是其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、重金屬抗性、使營養(yǎng)缺陷型變成原養(yǎng)型、等等的基因。細菌選擇標記的范例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，諸如青霉素、卡那霉素、氯霉素、或四環(huán)素抗性。用于酵母宿主細胞的合適標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇標記包括(但不限于)amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲酰轉移酶)、bar(膦絲菌素乙?；D移酶)、hph(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酰轉移酶)、和trpC(鄰氨基苯甲酸合成酶)、及其等同物。優(yōu)選用于曲霉細胞的是構巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水鏈霉素(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發(fā)明載體優(yōu)選包含能夠使載體整合到宿主細胞基因組或能夠使載體在細胞中不依賴基因組而自主復制的元件。
為了整合到宿主細胞基因組中，載體可以依賴編碼多肽的核酸序列或用于通過同源或非同源重組將載體整合到基因組中的任何其它載體元件?；蛘咻d體可以包含用于通過同源重組整合到宿主細胞基因組中的其它核酸序列。上述其它核酸序列使得載體能夠在染色體中的精確位點整合到宿主細胞基因組中。為了提高在精確位點整合的可能性，整合元件應當優(yōu)選包含足夠數(shù)目的核酸，諸如100-10,000個堿基對，優(yōu)選400-10,000個堿基對，最優(yōu)選800-10,000個堿基對，這些核酸序列與相應的靶序列高度同源以增強同源重組的幾率。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核酸序列。另一方面，載體可以通過非同源重組整合到宿主細胞基因組中。
為了自主復制，載體還可以包含使得載體能夠在所述宿主細胞中自主復制的復制起點。細菌復制起點的范例是使得能夠在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的復制起點和使得能夠在芽孢桿菌中復制的pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的復制起點。用于酵母宿主細胞中的復制起點的范例是2μ復制起點、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的組合、以及ARS4和CEN6的組合。復制起點可以是具有使其在宿主細胞中的功能為溫度敏感型的突變的復制起點(參閱Ehrlich，1978，美國國家科學院進展(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA)751433)。
可以在宿主細胞中插入超過一個拷貝的本發(fā)明核酸序列，以提高基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。核酸序列拷貝數(shù)的增加可以通過在宿主細胞基因組中整合至少另外一個拷貝的序列或者通過在核酸序列中包含可擴增的選擇標記基因，可以通過在適當選擇劑存在時培養(yǎng)細胞，選擇包含選擇標記基因的擴增拷貝、因此核酸序列的其它拷貝的細胞，從而獲得。
用于連接上述元件以構建本發(fā)明重組表達載體的步驟對于本領域技術人員是眾所周知的(參閱Sambrook等人，1989，見上文)。宿主細胞本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、可有利的用于多肽的重組生產(chǎn)的重組宿主細胞。可以將包含本發(fā)明核酸序列的載體導入宿主細胞，使得維持載體作為上述染色體的整合部分或作為自我復制的染色體外載體。術語“宿主細胞”涵蓋因復制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。宿主細胞的選擇在很大程度上依賴編碼多肽的基因及其來源。
宿主細胞可以是單細胞微生物(如原核生物)或非單細胞微生物(如真核生物)。
有用的單細胞細胞是細菌細胞，諸如革蘭氏陽性細菌，包括(但不限于)芽孢桿菌屬細胞，如嗜堿性芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)形芽孢桿菌、Bacillus clausii、凝結芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌；或鏈霉菌屬細胞，如淺青紫鏈霉菌和鼠灰鏈霉菌，或者革蘭氏陰性細菌，諸如大腸桿菌和假單胞菌。在優(yōu)選的實施方案中，細菌宿主細胞是遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、或枯草芽孢桿菌細胞。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述芽孢桿菌屬細胞是嗜堿性的芽孢桿菌。
可以通過原生質體轉化(參閱Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學(Molecular General Genetics)168111-115)、使用感受態(tài)細胞(參閱Young和Spizizin，1961，細菌學雜志(Journal ofBacteriology)81823-829)、Dubnau和Dayidoff-Abelson的方法(1971，分子生物學雜志(Journal of Molecular Biology)56209-221)、電穿孔(參閱Shigekawa和Dower，1988，生物技術(Biotechniques)6742-751)、或綴合(參閱Koehler和Thorne，1987，細菌學雜志(Journal of Bacteriology)1695771-5278)，將載體導入細菌宿主細胞。
宿主細胞可以是真核生物，諸如哺乳動物、昆蟲、植物、或真菌細胞。
在優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是真菌細胞?！罢婢比绱颂幩冒ㄗ幽揖T(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、和接合菌門(Zygomycota)(由Kawksworth等人在《Ainsworth和Bisby氏真菌字典》(Ainsworth and Bisby’sDictionary of The Fungi)中定義的，第8版，1995，CABInternational，University Press，劍橋，英國)，以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人記錄的，1995，見上文，第171頁)和所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，見上文)。
在更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞?！敖湍浮比绱颂幩冒óa(chǎn)子囊孢子酵母(內孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子酵母、和屬于半知菌綱的酵母(芽孢綱(Blastomycete))。因為酵母的分類將來可能改變，為了本發(fā)明的目的，應當如《酵母的生物學和活性》(Biology and Activities of Yeast)(F.A.Skinner、S.M.Passmore、和R.R.Davenport編，應用細菌學學會第9次座談會(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series NO.9)，1980)所述定義酵母。
在甚至更優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或Yarrowia屬的細胞。
在最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、或卵形酵母細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母宿主細胞是Yarrowia lipolytica細胞。
在另一個更優(yōu)選的實施方案中，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人定義的，1995，見上文)的亞門的所有絲狀形態(tài)。絲狀真菌的特點通常在于由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、和其它復雜多糖組成的菌絲壁。通過菌絲的延長進行營養(yǎng)生長，碳代謝是專性需氧的。正相反，酵母(諸如釀酒酵母)的營養(yǎng)生長是通過單細胞菌體的出芽進行的，碳代謝可以是發(fā)酵性的。
在甚至更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是(但不限于)頂孢霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢霉屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium屬、或木霉屬的物種的細胞。
在最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀鐮孢、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、或Fusarium venenatum細胞。在甚至最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌親本細胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)細胞。在另一個最優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、產(chǎn)紫青霉、Thielavia terrestris、Trichodermaharzianum、康寧木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei、或綠色木霉細胞。
可以通過已知本質上包括原生質體的形成、原生質體的轉化、和細胞壁的再生的方法轉化真菌細胞。用于轉化曲霉屬宿主細胞的合適步驟描述于EP 238 023和Yelton等人，1984，美國國家科學院進展(Proceedings of National Academy of Sciences USA)811470-1474。用于轉化鐮孢屬物種的合適方法描述于Malardier等人，1989，基因(Gene)78147-156和WO 96/00787?？梢允褂肂ecker和Guarente(J.N.Abelson和M.I.Simon編，酵母遺傳學和分子生物學指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)，酶學方法(Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187頁，Academic Press公司，紐約；Ito等人，1983，細菌學雜志(Journal of Bacteriology)153163；和Hinnen等人，1978，美國國家科學院進展(Proceedingsof the National Academy of Sciences USA)751920)描述的步驟轉化酵母。生產(chǎn)方法本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)其野生型形式能夠產(chǎn)生所述多肽的菌株，以產(chǎn)生包含該多肽的上清液；和(b)回收多肽。優(yōu)選菌株是鐮孢屬菌株，更優(yōu)選Fusarium venenatum。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞；和(b)回收多肽。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，其中所述宿主細胞包含在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼區(qū)中具有至少一個突變的突變型核酸序列，其中突變型核酸序列編碼具有SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸的多肽；和(b)回收多肽。
本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)已經(jīng)摻入了包含調控序列、外顯子、和/或與編碼多肽的內源核酸序列的另一外顯子可操作連接的剪接供體位點的新轉錄單位的同源重組細胞；和(b)回收多肽。該方法基于基因激活技術的使用，例如美國專利號5,641,670中描述的。
在本發(fā)明的生產(chǎn)方法中，使用本領域已知的方法，在適合于產(chǎn)生多肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)和在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中進行的小量或大量發(fā)酵(包括連續(xù)、成批、補料分批、或固態(tài)發(fā)酵)，在合適的培養(yǎng)基中和在能夠表達和/或分離多肽的條件下，培養(yǎng)細胞。在包含碳源、氮源、和無機鹽的合適培養(yǎng)基中，使用本領域已知步驟進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可以由供應商處購買，或者可以根據(jù)發(fā)表的組成成分配制(如美國典型培養(yǎng)物收藏中心的目錄)。如果多肽分泌到培養(yǎng)基中，可以由培養(yǎng)基直接回收多肽。如果多肽是不分泌的，則可以由細胞裂解物回收多肽。
可以使用對多肽特異的本領域已知方法檢測多肽。這些檢測方法可以包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成、或酶底物的消失。例如，酶實驗可以用于測定此處所述多肽的活性。
可以通過本領域的已知方法回收產(chǎn)生的多肽。例如，可以通過傳統(tǒng)步驟由培養(yǎng)基回收多肽，包括(但不限于)離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀。
可以通過本領域的多種已知步驟純化本發(fā)明多肽，包括(但不限于)層析(如離子交換、親和、疏水、層析聚焦、和大小排阻層析)、電泳步驟(如制備性等電聚焦)、差異溶解(如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE、或抽提(參閱《蛋白質純化》(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，紐約，1989)。植物本發(fā)明還涉及經(jīng)編碼具有本發(fā)明膽堿氧化酶活性之多肽的核酸序列轉化、以表達和產(chǎn)生可回收量的多肽的轉基因植物、植物部分、或植物細胞。可以由植物或植物部分回收多肽?；蛘撸亟M多肽的植物或植物部分可以用于改進食品或飼料的質量，如改進營養(yǎng)價值、口感、和流變特性，或者用于破壞抗營養(yǎng)因子。
轉基因植物可以是雙子葉或單子葉植物。單子葉植物的范例是草，諸如牧場草(blue grass，Poa)，飼料草，諸如羊茅(festuca)、黑麥草(lolium)，溫帶草，諸如Agrostis，和谷類，如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高梁、和玉蜀黍(玉米)。
雙子葉植物的范例是煙草、豆類，諸如白羽扇豆、馬鈴薯、制糖甜菜、豌豆、蠶豆、和大豆，和十字花科植物(蕓苔科)，諸如花椰菜、油籽油菜、和密切相關的模型生物擬南芥(Arabidopsisthaliana)。
植物部分的范例是莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子、和塊莖。特定植物組織，諸如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體、和細胞質，同樣被認為是植物部分。此外，任何植物細胞(無論組織來源如何)被認為是植物部分。
本發(fā)明的范圍同樣包括這些植物、植物部分、和植物細胞的后代。
可以根據(jù)本領域已知方法構建表達本發(fā)明多肽的轉基因植物或植物細胞。簡而言之，通過將編碼本發(fā)明多肽的一種或多種表達構建物摻入植物宿主基因組，并將產(chǎn)生的經(jīng)修飾植物或植物細胞繁殖成轉基因植物或植物細胞，從而構建這樣的植物或植物細胞。
方便的，表達構建物是包含編碼本發(fā)明多肽、與在選定的植物或植物部分中表達核酸序列需要的適當調控序列可操作連接的核酸序列的核酸構建物。此外，表達構建物可以包含可用于鑒定已經(jīng)整合了表達構建物的宿主細胞的選擇標記和將構建物導入所述植物需要的DNA序列(后者依賴將要使用的DNA導入方法)。
根據(jù)例如何時、何地、和如何表達期望多肽，確定調控序列(諸如啟動子和終止子序列)和任選的信號或轉運序列。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達可以是組成性的或誘導型的，或者可以是發(fā)育、階段、或組織特異的，而且基因產(chǎn)物可以靶向特定組織或植物部分，諸如種子或葉。調控序列描述于例如Tague等人(1988，植物生理學(Plant Physiology)86506)中。
為了組成性表達，可以使用35S-CaMV啟動子(Franck等人，1980，細胞(Cell)21285-294)。器官特異的啟動子可以是例如來自貯存組織，諸如種子、馬鈴薯塊莖、和果實的啟動子(Edwards和Coruzzi，1990，遺傳學年鑒(Ann.Rev.Genet.)24275-303)，或來自代謝組織，諸如分生組織的啟動子(Ito等人，1994，植物分子生物學(Plant Mol.Biol.)24863-878)，種子特異啟動子，諸如來自水稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白、或清蛋白啟動子(Wu等人，1998，植物和細胞生理學(Plant and Cell Physiology)39885-889)，來自蠶豆(Vicia faba)的豆球蛋白B4和未知種子蛋白基因的蠶豆啟動子(Conrad等人，1998，植物生理學雜志(Journal of PlantPhysiology)152708-711)，來自種子油體蛋白的啟動子(Chen等人，1998，植物和細胞生理學(Plant and Cell Pysiology)39935-941)，來自Brassica napus的貯存蛋白napA啟動子，或者本領域已知的任何其它種子特異啟動子，如WO 91/14772中描述的。此外，啟動子可以是葉特異啟動子，諸如來自水稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等人，1993，植物生理學(Plant Physiology)102991-1000)、綠藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，植物分子生物學(Plant Molecular Biology)2685-93)、或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等人，1995，分子和普通遺傳學(Molecular and General Genetics)248668-674)，或者創(chuàng)傷誘導型啟動子，諸如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等人，1993，植物分子生物學(Plant Molecular Biology)22573-588)。
還可以使用啟動子增強子元件以在植物中實現(xiàn)更高的酶表達。例如，啟動子增強子元件可以是置于啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內含子。例如，Xu等人(1993，見上文)公開了使用水稻actinl基因第一個內含子增強表達。
選擇標記基因和表達構建物的任何其它部分可以選自本領域可獲得的那些。
根據(jù)本領域已知的傳統(tǒng)技術將核酸構建物摻入植物基因組，包括土壤桿菌介導的轉化、病毒介導的轉化、微量注射、顆粒轟擊、biolistic轉化、和電穿孔(Gasser等人，1990，科學(Science)2441293；Potrykus，1990，生物技術(Bio/Technology)8535；Shimamoto等人，1989，自然(Nature)338274)。
目前選擇根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導的基因轉移方法用于產(chǎn)生轉基因的雙子葉植物(綜述參閱Hooykas和Schilperoort，1992，植物分子生物學(Plant Molecular Biology)1915-38)。然而該方法同樣可以用于轉化單子葉植物，但是這些植物通常優(yōu)選其它轉化方法。目前選擇胚性愈傷組織或發(fā)育胚的顆粒轟擊(用轉化DNA包被的顯微金或鎢顆粒)方法用于產(chǎn)生轉基因的單子葉植物(Christou，1992，植物雜志(Plant Journal)2275-281；Shimamoto，1994，生物技術的現(xiàn)行觀點(Current OpinionBiotechnology)5158-162；Vasil等人，1992，生物技術(Bio/Technology)10667-674)。用于轉化單子葉植物的另一種方法基于的是Omirulleh等人(1993，植物分子生物學(PlantMolecular Biology)21415-428)描述的原生質體轉化。
轉化之后，選擇已經(jīng)摻入了表達構建物的轉化體，并根據(jù)本領域眾所周知的方法再生成完整植株。
本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下，培養(yǎng)包含編碼具有本發(fā)明膽堿氧化酶活性之多肽的核酸序列的轉基因植物或植物細胞；和(b)回收多肽。除去或降低膽堿氧化酶活性本發(fā)明還涉及產(chǎn)生親本細胞的突變型細胞的方法，該方法包括破壞或缺失編碼所述多肽的核酸序列或其調控序列，產(chǎn)生在相同條件下培養(yǎng)時生產(chǎn)的多肽比親本細胞少的突變型細胞。
通過對在細胞中表達具有膽堿氧化酶活性的多肽需要的核酸序列進行修飾或滅活，可以方便的完成具有降低的膽堿氧化酶活性的菌株的構建。將要修飾或滅活的核酸序列可以是例如編碼該多肽或其對展示膽堿氧化酶活性重要的部分的核酸序列，或該核酸序列可具有由該核酸序列的編碼序列表達多肽需要的調控功能。這些調控或控制序列的范例可以是啟動子序列或其功能性部分，即足以影響多肽表達的部分。上文描述了可能修飾的其它控制序列。
可以通過對細胞進行誘變，并選擇或篩選其中膽堿氧化酶生產(chǎn)能力降低了的細胞，進行核酸序列的修飾或滅活。可以通過使用合適的物理或化學誘變劑，通過使用合適的寡核苷酸，或通過對DNA序列進行PCR產(chǎn)生的誘變，進行特異或隨機的誘變。此外，可以通過使用這些誘變劑的任意組合進行誘變。
適合于本發(fā)明目的的物理或化學誘變劑的范例包括紫外線(UV)照射、羥胺、N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、O-甲基羥胺、亞硝酸、甲烷磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸、和核苷酸類似物。
使用這些試劑時，通常通過在合適條件下在選定誘變劑存在時溫育待誘變細胞，并選擇展示膽堿氧化酶活性或產(chǎn)量降低的細胞，進行誘變。
可以通過在編碼多肽的核酸序列或其轉錄或翻譯需要的調控元件中導入、取代、或除去一個或多個核苷酸，實現(xiàn)本發(fā)明多肽生產(chǎn)的修飾或滅活。例如，可以插入或除去核苷酸，從而導入終止密碼子、除去起始密碼子、或改變開放閱讀框架?？梢愿鶕?jù)本領域的已知方法，通過定點誘變或PCR產(chǎn)生的誘變，實現(xiàn)這些修飾或滅活。雖然從理論上說，可以在體內(即直接在表達待修飾核酸序列的細胞上)進行修飾，但優(yōu)選如下文所述在體外進行修飾。
消除或降低選定宿主細胞的產(chǎn)量的方便方法的范例是通過基因取代或基因中斷。在基因中斷方法中，在體外對對應于感興趣的內源基因或基因片段的核酸序列進行誘變以產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后用該序列轉化宿主細胞以產(chǎn)生缺陷型基因。通過同源重組，缺陷核酸序列取代了內源基因或基因片段。可能期望缺陷型基因或基因片段還編碼可以用于選擇其中編碼多肽的基因已經(jīng)被修飾或破壞的轉化體的標記。
或者，可以通過已建立的反義技術，使用與多肽編碼序列互補的核苷酸序列，進行核酸序列的修飾或滅活。更具體的說，可以通過導入與編碼多肽的核酸序列互補的、可以在細胞中轉錄并能夠與細胞中產(chǎn)生的多肽mRNA雜交的核苷酸序列，從而降低或消除細胞的多肽產(chǎn)量。在能使互補的反義核苷酸序列與多肽mRNA雜交的條件下，翻譯的多肽的量由此被降低或消除。
根據(jù)本發(fā)明的方法，待修飾細胞優(yōu)選微生物來源，例如適合于產(chǎn)生對細胞是同源或異源的期望蛋白質產(chǎn)物的真菌菌株。
本發(fā)明進一步涉及親本細胞的突變型細胞，所述突變型細胞包含對編碼多肽的核酸序列或其調控序列的破壞或缺失，得到產(chǎn)生的多肽比親本細胞少的突變型細胞。
如此產(chǎn)生的多肽缺陷的突變型細胞作為用于表達同源和/或異源多肽的宿主細胞特別有用。因此，本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)同源或異源多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)突變型細胞；和(b)回收多肽。術語“異源多肽”此處定義為宿主細胞的非天然多肽、經(jīng)修飾改變了天然序列的天然蛋白質、或作為通過重組DNA技術對宿主細胞操作的結果其表達在量上改變了的天然蛋白質。
在其它方面，本發(fā)明涉及通過細胞發(fā)酵生產(chǎn)基本上不含膽堿氧化酶活性的蛋白質產(chǎn)物的方法，包括在發(fā)酵進行之前、之中、或之后，向發(fā)酵肉湯中加入有效量的能夠抑制膽堿氧化酶活性的試劑，發(fā)酵產(chǎn)生本發(fā)明多肽以及感興趣蛋白質產(chǎn)物的細胞，由發(fā)酵肉湯回收感興趣的產(chǎn)物，并任選的對回收的產(chǎn)物進行進一步純化。
在其它方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)基本上不含膽堿氧化酶活性的蛋白質產(chǎn)物的方法，包括在能夠表達所述產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)細胞，對產(chǎn)生的培養(yǎng)肉湯進行組合pH和溫度處理以顯著降低膽堿氧化酶活性，并由培養(yǎng)肉湯回收產(chǎn)物?；蛘撸梢詫τ膳囵B(yǎng)肉湯回收的酶制劑進行組合pH和溫度處理。組合pH和溫度處理可以任選的與膽堿氧化酶抑制劑處理聯(lián)合使用。
根據(jù)本發(fā)明的這個方面，除去至少60％，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少85％，仍更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少99％的膽堿氧化酶活性是可能的。使用該方法可以完全除去膽堿氧化酶活性。
組合pH和溫度處理優(yōu)選在pH范圍6.5-7和溫度范圍35-70℃進行足夠時間以達到期望效果，通常30-60分鐘是足夠的。
可以通過本領域的已知方法進行用于培養(yǎng)和純化感興趣產(chǎn)物的方法。
用于生產(chǎn)基本上不含膽堿氧化酶的產(chǎn)物的方法在真核多肽(特別是真菌蛋白質，諸如酶)的生產(chǎn)中特別令人感興趣。酶可以選自如淀粉水解酶、脂肪水解酶、蛋白質水解酶、纖維素水解酶、氧化還原酶、或植物細胞壁降解酶。這些酶的范例包括氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、碳水化合物酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環(huán)糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、鹵過氧化物酶(haloperoxidase)、半纖維素酶、轉化酶、異構酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠水解酶、過氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。膽堿氧化酶缺陷細胞還可以用于表達藥用異源蛋白質，諸如激素、生長因子、受體等等。
可以理解，術語“真核多肽”不僅包括天然多肽，還包括如經(jīng)氨基酸取代、缺失、或添加修飾或其它這些修飾以增強活性、熱穩(wěn)定性、pH耐受性等等的酶等多肽。
在其它方面，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的、基本上不含膽堿氧化酶活性的蛋白質產(chǎn)物。用途本發(fā)明還致力于使用具有膽堿氧化酶活性的多肽的方法。
本發(fā)明多肽可以用于測量膽堿、卵磷脂、膽堿酯酶活性、和磷脂酶C和D活性的化學發(fā)光檢測實驗。參閱Anaokar等人，1979，臨床化學(Clinical Chemistry)25103-107；Artiss等人，1979，微量化學雜志(Microchemistry Journal)24239-258；Immamura和Horiuti，1978，生化雜志(Journal of Biochemistry)83677-680；和Okabe等人，1977，臨床化學學報(Clin.Chim.Acta)8087-94)。
編碼本發(fā)明多肽的核酸序列可以用于增強有機體(特別是植物，如Arabidopsis)的冷和鹽耐受力。參閱Rozwadowski等人，1991，細菌學雜志(Journal of Bacteriology)173472-478；Hayashi等人，1998，植物、細胞、和環(huán)境(Plant，Cell，and Environment)21232-239；WO 96/1003；WO 96/29857；和WO 97/24026。
本發(fā)明由下列實施例進一步描述，這些實施例不應當理解為本發(fā)明范圍的限制。
實施例作為緩沖液和底物使用的化學藥品是至少試劑級的商品。實施例1發(fā)酵和菌絲組織將Fusarium venenatum CC1-3，即鐮孢屬菌株ATCC 20334(Wiebe等人，1991，真菌學研究(Mycol.Research)951284-1288)的形態(tài)學突變體，在2升實驗室等級發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，使用補料分批發(fā)酵方案，NUTRIOSETM(Roquette Freres，S.A.，Beinheim，法國)(作為碳源)和酵母提取物。在飼料中提供磷酸銨。將pH維持在6-6.5，將溫度維持在30℃，積極溶氧。
在接種后的第2、4、6、和8天收獲菌絲樣品，并在液氮中速凍。將樣品保存于-80℃，直至為了提取RNA而進行裂解。實施例2cDNA文庫的構建根據(jù)Timberlake和Barnard的方法(1981，細胞(Cell)2629-37)，由實施例1中所述菌絲樣品提取總細胞RNA，并在將1％甲醛-瓊脂糖凝膠印漬轉膜后，通過Northern雜交分析RNA樣品(Davis等人，1986，《分子生物學的基本方法》(Basic Methods in MolecularBiology)，Elsevier Publishing有限公司，紐約)。使用mRNA分離試劑盒mRNA Separator KitTM(Clontech Laboratories公司，PaloAlto，CA)，根據(jù)制造商的指示，由總RNA分離多聚腺苷酸化的mRNA部分。使用大約5μg poly(A)+mRNA，根據(jù)Gubler和Hoffman的方法(1983，基因(Gene)25263-269)合成雙鏈cDNA，但其中使用NotI-(dT)18引物(Pharmacia Biotech Inc，.Piscataway，NJ)起始第一條鏈的合成。用綠豆核酸酶(Boehringer Mannheim公司，Indianapolis，IN)處理cDNA，并用T4 DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)補平末端。
將cDNA用NotI消化，通過瓊脂糖凝膠電泳大小分離(大約0.7-4.5kb)，并連接經(jīng)NotI和EcoRI切割并小牛腸堿性磷酸酶(BoehringerMannheim公司，Indianapolis，IN)去磷酸化的pZEr0-2.1(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。用連接混和物轉化E.coli TOP10的感受態(tài)細胞(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。在含卡那霉素(終濃度50μg/ml)的2YT瓊脂平板(Miller，1992，《細菌遺傳學短期課程關于大腸桿菌及相關細菌的實驗室手冊》(A Short Course in BacterialGenetics.A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coliand Related Bacteria)，冷泉港出版社，冷泉港，紐約)上選擇轉化體。
使用質?？寺≥d體pZErO-2.1，構建了兩個獨立的定向cDNA文庫。文庫A使用來自第4天收獲的菌絲的mRNA構建，文庫B使用來自第6天的mRNA構建。兩個文庫都沒有為了檢驗細胞中基因表達模式的代表性“快照”而進行擴增。反而將文庫鋪板，測定滴度，并通過BNA測序分析來自兩個文庫的獨立克隆。
文庫A(第4天的細胞)包含大約7.5×104個獨立克隆，文庫B(第6天的細胞)包含大約1.2×105個克隆。由每個文庫40個克隆分離小量DNA，并檢驗cDNA插入片段的存在和大小。在此分析中，文庫A的40個克隆中的39個(97.5％)包含大小范圍為600-2200bp(平均1050bp)的插入片段。相似的，文庫B的40個克隆中的39個(97.5％)包含大小范圍為800-3600bp(平均1380bp)的插入片段。實施例3模板的制備和核苷酸測序由實施例2中所述每種cDNA文庫，由轉化平板直接挑取1192個轉化體菌落，轉移到含200μl添加50μg/ml卡那霉素的2YT肉湯(Miller，1992，見上文)的96孔微量滴定板中。平板在不搖動下于37℃溫育過夜。溫育后每個孔加入100μl無菌的50％甘油。將轉化體轉接每個孔含1ml添加50μg/ml卡那霉素的Magnificent BrothTM(MacConnellResearch，San Diego，CA)的第二份深盤96孔微量培養(yǎng)平板(AdvancedGenetic Technologies公司，Gaithersburg，MD)。將第一塊微量滴定板凍存于-80℃。將第二份深盤平板在旋轉搖床上劇烈振蕩(300rpm)于37℃溫育過夜。為了防止溢出和交叉污染并且使得充分換氣，將每塊第二份培養(yǎng)平板用聚丙烯墊(Advanced Genetic Technologies公司，Gaithersburg，MD)和塑料微量滴定盤蓋覆蓋。
使用經(jīng)Utterback等人(1995，基因組科學和技術(Genome Sci.Technol.)11-8)修改的Advanced Genetic Technologies公司(Gaithersburg，MD)的96孔微量制備試劑盒方案，由每個孔分離DNA。用Perkin-Elmer Applied Biosystems377XL型自動化DNA測序儀(Perkin-Elmer Applied Biosystems Model 377 XL Automatic DNASequencer)(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)，使用染料終止物化學法(Giesecke等人，1992，病毒學方法雜志(Journal of Virology Methods)3847-60)和反向lac測序引物，進行單向DNA測序。實施例4DNA序列資料的分析詳查核苷酸序列數(shù)據(jù)的質量，將顯示不恰當剪接或不清楚水平超過2％的樣品丟棄或重復。借助FACTURATM軟件(Perkin-Elmer AppliedBiosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)手工整理載體序列。另外，當模糊堿基數(shù)目增加時，在每個樣品末端截短序列。使用AutoAssemblerTM軟件(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)將所有序列相互比較以確定多樣性。最后，使用GeneAssistTM軟件(Perkin-Elmer Applied Biosystems公司，F(xiàn)oster City，CA)，以經(jīng)修改的Smith-Waterman算法，使用閾值70的BLOSUM62矩陣，以三種讀碼框翻譯所有序列并搜索非冗余數(shù)據(jù)庫(non-redundant data base，NRDB)。NRDB由Genpept、Swiss-Prot、和PIR數(shù)據(jù)庫匯集而成。實施例5膽堿氧化酶cDNA克隆的鑒定如實施例4所述，通過使用Applied Biosystems377XL型自動化DNA測序儀根據(jù)制造商的指示進行隨機cDNA克隆的部分測序，并將推導的氨基酸序列與球形節(jié)桿菌膽堿氧化酶(TREMBL 59117)的氨基酸序列比較，鑒定了一個推定的膽堿氧化酶克隆。根據(jù)該克隆與球形節(jié)桿菌膽堿氧化酶氨基酸序列的比對，推測其是全長的。選擇含pFD0808、命名為E.coli FD0808的該克隆進行核苷酸序列分析。實施例6來自E.coli FD0808 的Fusarium venenatum膽堿氧化酶cDNA的核苷酸測序和鑒定用Applied Biosystems377XL型自動化DNA測序儀，使用染料終止物化學法，進行DNA測序。使用轉座子插入策略(Primer IslandTransposition Kit，Perkin-Elmer/Applied Biosystems公司，F(xiàn)osterCity，CA)產(chǎn)生毗連序列。將來自E.coliFD0808的膽堿氧化酶克隆進行測序，平均冗余度6.7。
該膽堿氧化酶克隆編碼1629bp的開放閱讀框架，編碼543個氨基酸、分子量60,057的多肽。核苷酸序列(SEQ ID NO1)和推導的氨基酸序列(SEQ ID NO2)顯示于圖1。使用SignalP程序(Nielsen等人，1997，蛋白質工程(Protein Engineering)101-6)，預測沒有信號肽。
使用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)，以同一性表和下列多重比對參數(shù)，進行膽堿氧化酶序列的比較性比對缺口罰分10，缺口長度罰分10。成對比對參數(shù)為Ktuple＝1，缺口罰分＝3，框＝5，對角線＝5。
比較性比對顯示Fusarium venenatum膽堿氧化酶與球形節(jié)桿菌膽堿氧化酶(TREMBL 59117)具有28.2％的同一性，與苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)膽堿脫氫酶(EMBL U39940)具有23.9％的同一性。在Fusarium venenatum膽堿氧化酶內存在3個潛在的N連接糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr)，根據(jù)預測蛋白質的比對，這些位點之一在球形節(jié)桿菌膽堿氧化酶中是保守的。
生物材料的保藏下列生物材料已經(jīng)根據(jù)布達佩斯條約保藏于農(nóng)業(yè)研究機構專利培養(yǎng)物收藏中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection)，北方地區(qū)研究中心(Northern Regional ResearchCenter)，北方大學街1815號(1815 University Street)，Peoria，伊利諾斯州(Illinois)，61604，美國，保藏號如下保藏物編號 保藏日期E.coli TOP10(pFD0808) NRRL B-30066 1998年10月27日該菌株已經(jīng)進行了保藏，在該專利申請的待審期內，保證根據(jù)37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122授權的專利和商標委員會所確定的人能夠獲得該培養(yǎng)物。該保藏物代表了保藏菌株的基本上純的培養(yǎng)物。在提交了該申請的副本或其后續(xù)申請的國家中，可以按照該國專利法的要求提供該保藏物。但是，應當明白保藏物的可獲得性并不構成對以侵犯由政府行為授予的專利權來實施本發(fā)明的許可。
由于此處公開的特殊實施方案意欲作為此處描述和要求的發(fā)明的多個方面的例示，所以本發(fā)明并非限制在這些實施方案的范圍之內。任何相當?shù)膶嵤┓桨妇鶎儆诒景l(fā)明的范圍之內。甚至于本領域技術人員根據(jù)上述描述顯然能夠理解本發(fā)明除了此處所示和所述之外的各種變化。這些變化也屬于所附權利要求的范圍之內。當發(fā)生沖突時，以本說明書包括定義為準。
此處引用的多處參考文獻完整引入作為參考。序列表<110>Debbie YaverRandy M.BerkaMichael W.Rey<120>具有膽堿氧化酶活性的多肽及編碼該多肽的核酸<130>5735.204-WO<140>To Be Assigned<141>1999-11-18<150>09/199,229<151>1998-11-24<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1863<212>DNA<213>Fusarium venenatum<400>1ctctgtccta ctgtacctac ctttcattca cttacaccag ccttcaacat gaccaccgag 60tttcttcctg cttcagccag ctctgcttac gattacatta tcgtgggtgg tggcacggct 120ggttgtgttc tagcttctcg tctctctgcc tacctccctg agcgcaaggt ccttgtcatt 180gagggtggtc cctcggactt cggtctcaac aatgttctta accttcgaga gtggttgtcg 240ctcctcggtg gtgacctcga ctacgactac cccacaactg agcagcccaa tggcaacagt 300catatccgac actcgcgagc caaggttctc ggtggttgct cctcgcacaa caccctcatc 360tccttccgcc ccttccgcca cgatatggac cgttgggtct ccaagggttg caagggatgg 420gactttgaaa ccgtcatgcg cagcgtcgac aacctgcgca accagctgaa ccccgtccac 480ccccgtcacc gtaaccagtt gactaaggac tgggtcaagg cttgctccga ggccatgggt 540attcccatca tccacgactt caaccacgag atctcagaga agggccaatt gacccaaggt 600gctggcttct tctccgtctc ttacaatccc gacaccggcc accgcagcag tgcttccgtc 660gcttacatcc accctatcct tcgaggcgac gagcgacgcc ccaacctgac tgttcttacc 720gaagcccatg tctcaaaggt cattgttgag aacgatgtcg ctacgggcat caacatcacc 780ctcaagtctg gcgaaaagca cactctccat gctcgcaagg agactattct gtgcgccggt 840gcggtcgata cacccagact cctcctccac tctggtattg gccccaaggc tcagctcgag 900tctctcaaca tccccgttgt caaggacatc cctggtgttg gcgaaaacct cttggatcac 960cccgagacca tcatcatgtg ggagctgaac aaggccgtcc ctgccaacca gaccactatg 1020gactctgatg ctggtatctt ccttcgacgg gagcctaaga atgctgccgg caacgacggt 1080gatgctgccg atgtcatgat gcactgctac caaattcctt tccacctcaa cacagagcgt 1140cttggatacc ccaagattaa ggatggttac gctttctgca tgacacccaa cattcctcgc 1200cctcgctctc gtggccgtat ctttttgacc tcggccgacc ctactgtcaa gccttccctc 1260gacttccgct acttcaccga ccccgagggt tacgatgcgg ctactcttgt tcacggtatc 1320aaggctgctc gtaagatcgc ccagcagagc cccttcaagg agtggctcaa gcaggaggtc 1380gcccctggcc ccaagattca gaccgatgag gagattagcg agtacgcccg tcgtgtcgct 1440cacaccgtct accaccctgc cggtaccacc aagatgggcg ataccgagcg agatgagatg 1500gctgttgtca accccgaact caaggtccgc ggcatcaaca agctccgaat tgttgatgct 1560ggtatcttcc ccgagatgcc cactatcaac cccatggtga cggtgcttgc ttgcggcgag 1620cgggctgccg agctcattgc tgccgaggac ggctggaagc ccaagcactc ccgactgtaa1680agtgtttcgg atggtttcct gatcctccgc gagcgactcg gctcgagaga gttgttgtta1740tggatatctg tatgattaaa tgattagcgt atgattgcat tcgtagcgag tatagtatta1800ctgccgcata taggtagttg gaacaaaaat aaaacaatcc aaaccaaaaa aaaaaaaaaa1860aaa 1863<210>2<211>543<212>PAT<213>Fusarium venenatum<400>2Met Thr Thr Glu Phe Leu Pro Ala Ser Ala Ser Ser Ala Tyr Asp Tyr1 5 10 15Ile Ile Val Gly Gly Gly Thr Ala Gly Cys Val Leu Ala Ser Arg Leu20 25 30Ser Ala Tyr Leu Pro Glu Arg Lys Val Leu Val Ile Glu Gly Gly Pro35 40 45Ser Asp Phe Gly Leu Asn Asn Val Leu Asn Leu Arg Glu Trp Leu Ser50 55 60Leu Leu Gly Gly Asp Leu Asp Tyr Asp Tyr Pro Thr Thr Glu Gln Pro65 70 75 80Asn Gly Asn Ser His Ile Arg His Ser Arg Ala Lys Val Leu Gly Gly85 90 95Cys Ser Ser His Asn Thr Leu Ile Ser Phe Arg Pro Phe Arg His Asp100 105 110Met Asp Arg Trp Val Ser Lys Gly Cys Lys Gly Trp Asp Phe Glu Thr115 120 125Val Met Arg Ser Val Asp Asn Leu Arg Asn Gln Leu Asn Pro Val His130 135 140Pro Arg His Arg Asn Gln Leu Thr Lys Asp Trp Val Lys Ala Cys Ser145 150 155 160Glu Ala Met Gly Ile Pro Ile Ile His Asp Phe Asn His Glu Ile Ser165 170 175Glu Lys Gly Gln Leu Thr Gln Gly Ala Gly Phe Phe Ser Val Ser Tyr180 185 190Asn Pro Asp Thr Gly His Arg Ser Ser Ala Ser Val Ala Tyr Ile His195 200 205Pro Ile Leu Arg Gly Asp Glu Arg Arg Pro Asn Leu Thr Val Leu Thr210 215 220Glu Ala His Val Ser Lys Val Ile Val Glu Asn Asp Val Ala Thr Gly225 230 235 240Ile Asn Ile Thr Leu Lys Ser Gly Glu Lys His Thr Leu His Ala Arg245 250 255Lys Glu Thr Ile Leu Cys Ala Gly Ala Val Asp Thr Pro Arg Leu Leu260 265 270Leu His Ser Gly Ile Gly Pro Lys Ala Gln Leu Glu Ser Leu Asn Ile275 280 285Pro Val Val Lys Asp Ile Pro Gly Val Gly Glu Asn Leu Leu Asp His290 295 300Pro Glu Thr Ile Ile Met Trp Glu Leu Asn Lys Ala Val Pro Ala Asn305 310 315 320Gln Thr Thr Met Asp Ser Asp Ala Gly Ile Phe Leu Arg Arg Glu Pro325 330 335Lys Asn Ala Ala Gly Asn Asp Gly Asp Ala Ala Asp Val Met Met His340 345 350Cys Tyr Gln Ile Pro Phe His Leu Asn Thr Glu Arg Leu Gly Tyr Pro355 360 365Lys Ile Lys Asp Gly Tyr Ala Phe Cys Met Thr Pro Asn Ile Pro Arg370 375 380Pro Arg Ser Arg Gly Arg Ile Phe Leu Thr Ser Ala Asp Pro Thr Val385 390 395 400Lys Pro Ser Leu Asp Phe Arg Tyr Phe Thr Asp Pro Glu Gly Tyr Asp405 410 415Ala Ala Thr Leu Val His Gly Ile Lys Ala Ala Arg Lys Ile Ala Gln420 425 430Gln ser pro Phe Lys Glu Trp Leu Lys Gln Glu Val Ala Pro Gly Pro435 440 445Lys Ile Gln Thr Asp Glu Glu Ile Ser Glu Tyr Ala Arg Arg Val Ala450 455 460His Thr Val Tyr His Pro Ala Gly Thr Thr Lys Met Gly Asp Thr Glu465 470 475 480Arg Asp Glu Met Ala Val Val Asn Pro Glu Leu Lys Val Arg Gly Ile485 490 495Asn Lys Leu Arg Ile Val Asp Ala Gly Ile Phe Pro Glu Met Pro Thr500 505 510Ile Asn Pro Met Val Thr Val Leu Ala Cys Gly Glu Arg Ala Ala Glu515 520 525Leu Ile Ala Ala Glu Asp Gly Trp Lys Pro Lys His Ser Arg Leu530 535 540
權利要求
1.具有膽堿氧化酶活性、選自下組的分離多肽(a)具有與SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低嚴謹條件下與選自下述的序列可雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)至少100個核苷酸的(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈；(c)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽包含一個或多個氨基酸取代、缺失、和/或插入的變體；(d)(a)或(b)的等位基因變體；和(e)具有膽堿氧化酶活性的(a)、(b)、或(d)的片段。
2.權利要求1的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸有至少65％同一性的氨基酸序列。
3.權利要求2的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸有至少70％同一性的氨基酸序列。
4.權利要求3的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列。
5.權利要求4的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸有至少90％同一性的氨基酸序列。
6.權利要求5的多肽，其具有與SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸有至少95％同一性的氨基酸序列。
7.權利要求1-6任一項的多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
8.權利要求1-7任一項的多肽，其由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其片段組成。
9.權利要求8的多肽，其由SEQ ID NO2的氨基酸序列組成。
10.權利要求9的多肽，其由SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸組成。
11.權利要求1的多肽，其由在低嚴謹條件下與下述序列可雜交的核酸序列編碼(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)至少100個核苷酸的(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈。
12.權利要求11的多肽，其由在低嚴謹條件下與下述序列可雜交的核酸序列編碼(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈。
13.權利要求1的多肽，其由在中等嚴謹條件下與下述序列可雜交的核酸序列編碼(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)至少100個核苷酸的(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈。
14.權利要求13的多肽，其由在中等嚴謹條件下與下述序列可雜交的核酸序列編碼(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈。
15.權利要求1的多肽，其由在高嚴謹條件下與下述序列可雜交的核酸序列編碼(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)至少100個核苷酸的(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈。
16.權利要求15的多肽，其由在高嚴謹條件下與下述序列可雜交的核酸序列編碼(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的互補鏈。
17.權利要求1的多肽，其中該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽包含一個或多個氨基酸取代、缺失、和/或插入的變體。
18.權利要求1的多肽，其由E.coli NRRL B-30066所含質粒pFD0808中所含核酸序列編碼。
19.權利要求1-18任一項的多肽，其具有SEQ ID NO2的膽堿氧化酶活性的至少20％。
20.具有與權利要求1-19任一項的多肽相同的膽堿氧化酶活性的多肽。
21.包含編碼權利要求1-20任一項之多肽的核酸序列的分離核酸序列。
22.包含在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變的核酸序列的分離核酸序列，其中突變型核酸序列編碼由SEQ IDNO2的第1位至第543位氨基酸組成的多肽。
23.通過(a)在低嚴謹條件下將DNA與下述序列雜交(i)SEQ IDNO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)至少100個核苷酸的(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈；和(b)分離核酸序列，由此產(chǎn)生的分離核酸序列。
24.權利要求23的分離核酸序列，其通過(a)在中等嚴謹條件下將DNA與下述序列雜交(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)至少100個核苷酸的(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈；和(b)分離核酸序列，由此而產(chǎn)生的。
25.權利要求24的分離核酸序列，其通過(a)在高嚴謹條件下將DNA與下述序列雜交(i)SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸，(ii)含SEQ ID NO1的第49位至第1677位核苷酸的基因組DNA序列，(iii)至少100個核苷酸的(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)、或(iii)的互補鏈雜交；和(b)分離核酸序列，由此而產(chǎn)生的。
26.包含與一種或多種指導在合適表達宿主中產(chǎn)生多肽的控制序列可操作連接的權利要求21的核酸序列的核酸構建物。
27.包含權利要求26的核酸構建物的重組表達載體。
28.包含權利要求26的核酸構建物的重組宿主細胞。
29.產(chǎn)生突變型核酸序列的方法，包括(a)在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中導入至少一個突變，其中突變型核酸序列編碼具有SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸的多肽；和(b)回收突變型核酸序列。
30.通過權利要求29的方法產(chǎn)生的突變型核酸序列。
31.產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)包含編碼多肽的權利要求30的突變型核酸序列的菌株，以產(chǎn)生包含多肽的上清液；和(b)回收多肽。
32.產(chǎn)生權利要求1-20任一項的多肽的方法，包括(a)培養(yǎng)菌株，以產(chǎn)生包含多肽的上清液；和(b)回收多肽。
33.產(chǎn)生權利要求1-20任一項的多肽的方法，包括(a)在適合于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含具有編碼多肽之核酸序列的核酸構建物的宿主細胞；和(b)回收多肽。
34.產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)宿主細胞，其中宿主細胞包含在SEQ ID NO1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個突變的突變型核酸序列，其中突變型核酸序列編碼具有SEQ ID NO2的第1位至第543位氨基酸的多肽；和(b)回收多肽。
35.產(chǎn)生權利要求1-20任一項的多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)已經(jīng)摻入了包含調控序列、外顯子、和/或與編碼多肽的內源核酸序列的另一個外顯子可操作連接的剪接供體位點的新轉錄單位的同源重組細胞；和(b)回收多肽。
36.產(chǎn)生細胞突變體的方法，包括破壞或缺失編碼權利要求1-20任一項的多肽的核酸序列或其控制序列，導致產(chǎn)生的多肽比細胞少的突變體。
37.通過權利要求36的方法產(chǎn)生的突變體。
38.權利要求37的突變體，其中進一步包含編碼異源蛋白質的核酸序列。
39.產(chǎn)生異源多肽的方法，包括(a)在有助于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)權利要求38的突變體；和(b)回收多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有膽堿氧化酶活性的分離多肽和編碼該多肽的分離核酸序列。本發(fā)明還涉及包含該核酸序列的核酸構建物、載體、和宿主細胞,以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法。
文檔編號C12N1/19GK1354789SQ99813647
公開日2002年6月19日 申請日期1999年11月18日 優(yōu)先權日1998年11月24日
發(fā)明者D·亞芙, R·M·博卡, M·W·雷 申請人:諾沃奇梅茲生物技術有限公司