專利名稱：影響植物的開花行為的手段和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一些使提供表現(xiàn)出開花行為已被改變的植物成為可能的手段和方法，具體地說，通過改造植物的基因使它在與野生型植物(即未作相應的改造但在其它方面類似的植物)比較時表現(xiàn)出早成花或推遲成花。本發(fā)明還涉及在根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法中可以使用的組織特有的啟動子。
在植物中，成花是有性繁殖的前提條件。所以，它對于繁殖不能無性繁殖的植物，以及形成種子和果實是不可缺少的。植物從僅僅營養(yǎng)生長到成花所經(jīng)歷的時間在農(nóng)業(yè)、園藝和植物繁殖中是非常重要的。在許多情況下，花的數(shù)量也是經(jīng)濟利益所關心的，例如，就各種有用的植物(象西紅柿、黃瓜、夏南瓜、棉花，…)而言，花的數(shù)量越多將可能導致產(chǎn)量增加，或用于采摘的觀賞植物和花的生產(chǎn)增加。
在許多應用中，植物較早成花是有利的。例如，在農(nóng)業(yè)中，各種有用的植物早開花可以縮短播種和收獲之間的時間，從每年可播種兩次。另一種選擇，是開花和收獲之間的時間可以被延長，而作為結果，產(chǎn)量將有可能增加。另外，在植物的繁殖過程中，早成花可以對大幅度縮短繁殖過程作出貢獻，并且因此導致提高經(jīng)濟效益。另外，在園藝和觀賞植物生產(chǎn)方面，早開花的經(jīng)濟效益也是明顯的。
為了闡明在植物中決定成花時間的機理，迄今做過的嘗試不能就其中的決定性因素作出明確的結論。各種因素似乎都被卷入或許非常復雜的生物學系統(tǒng)(Bemier，1988，《植物生理學分子生物學年報》(Ann Rev Plant Phys Plant Mol.Biol)39175-219)。眾所周知，環(huán)境(例如，光的明暗周期、溫度和水的供應)的影響決定許多植物從營養(yǎng)生長到成花的轉(zhuǎn)變過程。雖然人們知道植物是怎樣實現(xiàn)感知這些刺激的的(在這方面，光敏色素系統(tǒng)的光線受體蛋白質(zhì)是起作用的)，但是人們不知道這些刺激是怎樣被轉(zhuǎn)化或翻譯成在頂端分裂組織中誘發(fā)成花的生理信號的。各種理論都被討論過，而且數(shù)量十分可觀的潛在因素都被考慮進去了，例如，開花激素(成花激素/抗花激素)、碳水化合物、細胞分裂素、植物生長素、多胺和鈣離子都在考慮之列(Bemier等人，1993，《植物細胞》(PlantCell)51147-1155)。
在實踐中，通過調(diào)節(jié)外生的刺激(例如，光線的明暗周期、溫度或水的供應)來控制成花時間，可能僅僅被達到有限的程度，例如在溫室中。所以，為了在野外條件下實現(xiàn)在植物生長過程中早成花，必不可少的是使用排除外生的刺激仍能夠早成花的植物。表現(xiàn)出早開花的植物可以通過誘變程序(但是誘變程序并非對所有的物種都適用)，或者通過非常費時而且必須對每個特定的植物種類分開逐一實施的植物繁殖過程，或者通過遺傳工程來生產(chǎn)。
就遺傳工程的適用性而言，前提條件是對開花時間有重大影響的基因座(gene loci)已經(jīng)被識別，以及給相關產(chǎn)品編碼的DNA序列是可利用的?，F(xiàn)在，來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的CONSTANS基因的基因產(chǎn)品是已知的。這個基因的表達引起這個物種開始開花。但是，為了影響開花行為，在轉(zhuǎn)基因植物中對這個基因有選擇的過度表達，從技術上說將是不可行的，因為該基因的組成型表達將導致轉(zhuǎn)基因植物的營養(yǎng)生長階段的嚴重縮短，因此將降低產(chǎn)量。Simon等人(1996，《自然》(Nature)38459-62)描述一種就CONSTANS的表達而言可誘導的系統(tǒng)，該系統(tǒng)從技術上說是不能使用的，因為使用引起誘導作用的類固醇激素在農(nóng)業(yè)上是不能接受的。
就已經(jīng)作為大多數(shù)關于調(diào)節(jié)開花時間的研究課題的物種擬南芥(Arabidopsis thaliana)而言，已經(jīng)有人介紹過各種比野生型植物早開花的突變型植物(見參考文獻Lee等人，1994，《植物細胞》(Plant Cell)675-83)。但是，目前還不可能描述這些突變體的特征。而且，對導致早成花的生物化學原因的闡述也不成功。
Bell等人[1993，《植物分子化學》(Plant Mol.Biol.)23445-451]，描述一種用來自梨酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的cdc25 cDNA轉(zhuǎn)化的煙草植物，這種植物由于這種誘導有絲分裂的蛋白質(zhì)的表達表現(xiàn)出早成花和大幅度提高花的數(shù)量。但是，這些植物是不利的，因為在這些植物中觀察到葉子形態(tài)的劇烈變化。具體地說，這些植物的葉片是卷曲的。所以，這種方法似乎不適合產(chǎn)生表現(xiàn)出開花行為被改變的有用植物。
為了產(chǎn)生表現(xiàn)出早成花的理想植物，人們不得不仍然依靠傳統(tǒng)的育種過程，或者依靠利用誘變作用的方法。在調(diào)節(jié)開花行為方面，蔗糖剪切蛋白質(zhì)的任何功能都尚未被考慮。
確實，蔗糖在頂端分裂組織中作為誘導開花的復雜信號的潛在的組成部分已經(jīng)被反復地討論過(Bemier等人，1993，《植物細胞》(Plant Cell)51147-1155；Lejeune等人，1993，《植物》(Planta)19071-74；Lejeune等人，1991，《植物生理學·生物化學》(PlantPhysiol.Biochem.)29153-157)；但是，蔗糖剪切蛋白質(zhì)對開花行為的任何影響既不是已知的，也不是預期的，因為按照Lejeune等人的發(fā)現(xiàn)(1993，《植物》(Planta)19071-74)，在某些物種中，蔗糖濃度在頂點附近增加與開花的誘導作用有關聯(lián)。
此外，在轉(zhuǎn)基因植物中蔗糖剪切蛋白質(zhì)的表達，通常對所述植物的生長具有很強的負面影響。就煙草植物而言，來自釀酒酵母的酶轉(zhuǎn)化酶的表達，在組成型啟動子的控制下，不管蛋白質(zhì)是否定位在非質(zhì)體、細胞質(zhì)或液泡中都在葉子中引起壞死(Sonnewald等人，1991，《植物雜志》(Plant J.)195-106)。
作為本發(fā)明的基礎的問題是提供一些手段和方法，這些手段和方法使改變植物的開花行為變成可能，具體地說，就是提供一些基因改造植物，這些植物與未作改造的植物相比，將表現(xiàn)出早成花或推遲成花。
這個問題是借助權利要求書中定義的轉(zhuǎn)基因植物、啟動子要素、構建體(constructs)、被轉(zhuǎn)化的宿主細胞、過程和使用得以解決的。
因此，第一方面，本發(fā)明涉及改造過基因的轉(zhuǎn)基因植物，其中改造基因的要點是引入某種構建體(constructs)，這種構建體(constructs)在轉(zhuǎn)基因植物中存在，將導致與未作改造的野生型植物相比蔗糖剪切活性在所述植物的頂端分裂組織中被特異增強。
基因改造可以是任何導致蔗糖剪切活性在植物的頂端分裂組織中被特異增加的基因改造。相應的基因改造可以通過引入包含轉(zhuǎn)基因的構建體實現(xiàn)，所述的轉(zhuǎn)基因給具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)編碼并且被有選擇地表達在頂端的分裂組織中，從而增加存在于頂端分裂組織中的蔗糖剪切蛋白質(zhì)的數(shù)量。除此之外，基因的改造可以導致在植物的頂端分裂組織中蔗糖剪切蛋白質(zhì)的活性增強。例如，這可以受激活蔗糖剪切蛋白質(zhì)的效應蛋白質(zhì)的表達或者使蔗糖剪切蛋白質(zhì)失去活性的抑制蛋白質(zhì)失去活性的效應蛋白質(zhì)的表達的影響。因此，包含在該構建體內(nèi)的轉(zhuǎn)基因可以給具有激活蔗糖剪切蛋白質(zhì)活性的效應蛋白質(zhì)編碼。就使抑制蛋白質(zhì)失去活性而言，該構建體可以包含類似于Faske等人的實驗結果(《植物生理學》(PlantPhysiol)115，(1997)705-715)，與轉(zhuǎn)錄后的水平或DNA水平有關的被雜交到mRNA上的特定的“反義”核酸或?qū)е码s交現(xiàn)象的特定的“有義”核酸的基因信息，兩者都借助與同源性有關的基因沉默導致消除或至少大幅度減少蔗糖剪切蛋白質(zhì)的抑制蛋白質(zhì)的翻譯。這樣的抑制蛋白質(zhì)的實例，是自煙草的非質(zhì)體轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Greiner等人，《植物生理學》(Plant Physiol)116，(1998)，733-742；Krausgrill等人，《植物雜志》(Plant Journal)13，(1998)275-280)和對酸穩(wěn)定的來自馬鈴薯塊莖的轉(zhuǎn)化酶的抑制劑(DeHostos等人，《植物生理學》(Plant Physiol)147，(1995)，334-340)。
在本說明書中，術語“構建體”意味著覆蓋任何可能的基因信息形式，這些基因信息形式把本發(fā)明的思路中必不可少的信息提供給特定的靶細胞。因此，術語“構建體”包括任何核酸分子以及它們的任何類似物，包括在相關的細胞系統(tǒng)就特有的識別而言必不可少的空間結構特點的維護下的堿基序列。因此，術語“構建體”、“核酸”和“核酸分子”覆蓋DNA、RNA、DNA-RNA-雜化物以及它們的合成類似物，例如PNA，即所謂的肽核酸，其中DNA或RNA的糖-磷酸鹽主鏈已被肽主鏈取代。在PNA中，堿基序列被結合到所述的肽主鏈上，同時維持前者的形態(tài)(空間排列)與DNA或RNA分子內(nèi)的形態(tài)相對應。在現(xiàn)在的意義上，唯一必不可少的是由構建體(核酸分子)中的堿基序列提供的信息將被靶細胞識別，并且可以被用來復制和/或轉(zhuǎn)錄。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施例中，改造基因的要點在于把包含轉(zhuǎn)基因的構建體引入植物的基因組，所述的轉(zhuǎn)基因給蔗糖剪切蛋白質(zhì)編碼，尤其是給轉(zhuǎn)化酶(invertase)編碼，其中轉(zhuǎn)基因的表達特異地發(fā)生在頂端的分裂組織中。
在這個特定的意義上，術語“特異”或“特異地”的意思是，對應增強蔗糖剪切活性的起作用的構建體部分(例如，轉(zhuǎn)基因、“反義的(antisense)”或“有意的(sense)”DNA部分，特別是給具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)編碼的轉(zhuǎn)基因)是在植物的頂端分裂組織中而不是在植物的其它部分(例如，成熟的葉子、塊莖或種子)中被轉(zhuǎn)錄和表達(后者非必選)。
此外，“頂端分裂組織特異的”也是在頂端分裂組織中的轉(zhuǎn)基因的表達遠遠高于植物其它部分(例如，成熟的葉子和/或塊莖和/或種子)的情況下被接受的，例如，至少高2～5倍，優(yōu)選5～10倍，特別優(yōu)選高10～100倍。
“轉(zhuǎn)基因”的意思是依據(jù)本發(fā)明的植物包括至少一個被穩(wěn)定地結合在基因組中的前面定義的構建體，所述的構建體優(yōu)選包含給具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)編碼的轉(zhuǎn)基因。
在本文中，“轉(zhuǎn)基因”意味著在靶植物中通常觀察不到的，或者，換句話說，在不同的基因環(huán)境中通常在靶植物范圍內(nèi)被觀察到的核酸分子。就后者而言，通常已經(jīng)存在于靶植物中的基因在不同于自然的即野生型的基因環(huán)境中還將被找到。例如，在把轉(zhuǎn)基因引入靶細胞的基因組之后，該轉(zhuǎn)基因?qū)⒃诓煌幕蜃险业?。?yōu)選的是，轉(zhuǎn)基因被結合在某個包含各種要素的構建體中，這些要素通常與所述的轉(zhuǎn)基因無關，或者不在這個特定的等級中。根據(jù)本發(fā)明通過基因改良的植物也可以包括補充性的基因改造，例如使之具有抗災害性或植物保護劑的轉(zhuǎn)基因，或者導致提高產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因。
根據(jù)本發(fā)明的植物，優(yōu)選包括至少一個轉(zhuǎn)基因，其中后者特別地與為轉(zhuǎn)基因在所述植物的頂端分裂組織中轉(zhuǎn)錄準備的調(diào)節(jié)性核酸序列要素相結合，具體地說，與頂端分裂組織特有的啟動子以及轉(zhuǎn)達轉(zhuǎn)基因的翻譯產(chǎn)品的非質(zhì)體定位信息的以蛋白質(zhì)為目標的信號序列(后者非必選)相結合。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，轉(zhuǎn)基因為具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)編碼。
可以在本發(fā)明中使用的具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)的特征是能夠在植物(planta)中催化蔗糖的糖苷鍵斷裂。
在本發(fā)明的某個特定實施例中，轉(zhuǎn)基因為優(yōu)選來源于植物的蔗糖合成酶(E.C.2.4.1.13)編碼。給蔗糖合成酶編碼的核酸序列已有人描述，例如，Salanoubat和Belliard(Gene60，(1987)，47-56)，并且可以按照登錄號X67125在EMBL數(shù)據(jù)庫中找到。進一步的蔗糖合成酶編碼序列，可以按照各種各樣的登錄號(例如，AJ 010639(Anabaenasp.)、AJ 011319(L.esculentum)、AJ012080和AJ001071(兩者見P.sativum)、L03366(Oryza sativa)，AJ001117和AJ000153(兩者T.aestivum)、AJ132000和AJ131999(兩者都來自C.plantagineum)、AJ131964和AJ131943(兩者都來自M.truncatula))在NCBI和基因分子庫(GenBank)數(shù)據(jù)庫中找到。
在進一步的實施例中，轉(zhuǎn)基因給蔗糖磷酸化酶(E.C.2.4.1.7)編碼。相應的序列是在WO96/24679等文獻中描述的，或者是可以在NCBI數(shù)據(jù)庫中按照為數(shù)眾多的登錄號(例如，Z22732(A.vitis)、E03420和D90314(兩者見L.mesenteroides)、M77351(S.mutans)、AF 158367(P.saccharophila))找到的。
在進一步的實施例中，轉(zhuǎn)基因給可以作為例如細菌、真菌或植物起源的果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼。給細菌型果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼的序列可以按照各種登錄號，例如，X75079(E.amylovora)，X02730(B.subtilis)，X52988(B.amyloliquefaciens)，L34331(Z.mobilis)，U91484(R.aquatilis)，AF052289(P.syrinqae)和U34874(B.stearothermophilus))在NCBI數(shù)據(jù)庫中找到。另一種細菌型果糖基轉(zhuǎn)移酶已經(jīng)被hiroza和Kuramitsu介紹過(J.Bacteriol.，170，(1988)，810-816)。
真菌型果糖基轉(zhuǎn)移酶可以找到，例如，在登錄號AJ000493(A.foetidus)下以及在德國專利申請DE 19840028.4(A.sydowi)中。來自植物的果糖基轉(zhuǎn)移酶也曾有人描述過，例如，在DE19708774.4(C.scolomus)、DE19749122.7(C.scolomus)和PCT/NL96/00012(H.tuberosus)中。
在本發(fā)明進一步的實施例中，轉(zhuǎn)基因給葡糖基轉(zhuǎn)移酶編碼。在葡糖基轉(zhuǎn)移酶當中有一些可以引用，例如，右旋糖苷蔗糖酶(在登錄號U38181、AF030129下的序列)，淀粉蔗糖酶(WO95/31553、PCT98/05573)和交替蔗糖酶(alternan sucrases)(DE19905069.4)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，轉(zhuǎn)基因為可以作為植物、細菌或真菌起源的轉(zhuǎn)化酶(E.C.3.2.1.26)編碼。例如，給細菌型轉(zhuǎn)化酶編碼的序列可以按照下述的NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號D10465和L33403(Z.mobilis)、AF015307(A.pasteurianis)、AF084030(E.coli)被找到。例如，給真菌型轉(zhuǎn)化酶編碼的序列可以按照登錄號V01311、K00540、X07572、X07570(全部是Saccharomyce cerevisiae)、AF029359和L068044(兩者是A.niger)找到。例如，植物型轉(zhuǎn)化酶可以按照NCBI或基因分子庫(GenBank)的登錄號X73601(A.sativa)、D10265(V.radiata)、AB 004558(L.esculentum)、AJ006067(A.cepa)、AF050631、AF03042(T.aestivum)、AF063246(P.sativum)、X 95821(S.tuberosum)、X81797和X81796(B.vulqaris)、AF155121(O.sativa)、Y16262(D.carota)、AF050128、AF050129、AF043346和AF043347(全部Z.mays)、AF030420(T.aestivum)被找到。
在特別優(yōu)選的實施例中，轉(zhuǎn)基因給來自釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酶編碼，這種轉(zhuǎn)化酶在植物中被定位在非質(zhì)體(apoplast)中(Sonnewald等人，《自然生物工藝學》(Nature Biotechnology)15，(1997)，794-797)。
在進一步特別優(yōu)選的實施例中，轉(zhuǎn)基因給來自釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酶編碼，這種轉(zhuǎn)化酶在植物中被定位在植物細胞的細胞溶膠中(Sonnewald等人，《植物雜志》(Plant J.)1，(1991)，95-106)。
根據(jù)本發(fā)明的植物，可以與自然發(fā)生的植物有明顯區(qū)別，除了其它方面，它們包括至少一個并非自然存在于這些細胞中的構建體的復本，或者如果該構建體包含已經(jīng)存在于目標植物的基因組中的轉(zhuǎn)基因，那么所述的轉(zhuǎn)基因已經(jīng)在該植物的基因組范圍內(nèi)結合在某個并非自然發(fā)現(xiàn)的座位上，即在不同的基因環(huán)境中。
如果被引入目標細胞的構建體包含已經(jīng)存在于該目標細胞中的核酸分子的補充性復本，那么本發(fā)明的植物可以與引入所述的構建體之前的目標植物有明顯的區(qū)別，尤其與自然發(fā)生的植物有明顯區(qū)別，具體地說，它們包含這些核酸分子的一個或多個補充性復本，這些復本在該基因組中被定位在并非自然發(fā)生的座位上。這可以通過，例如，DNA Southern印記分析被確定。
此外，本發(fā)明的植物可以優(yōu)選通過下述特點之一明顯地區(qū)別于自然的植物如果引進的構建體中待轉(zhuǎn)錄的核酸分子部分相對靶植物細胞/靶植物是異種的，那么所述的轉(zhuǎn)基因植物有并非在野生型植物中自然發(fā)生的引進的核酸分子轉(zhuǎn)錄本。這些可以借助RNANorthern印記分析進行檢測。優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的植物，包含某種蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)借助包含在該構建體中的轉(zhuǎn)基因被編碼。這種蛋白質(zhì)可以被檢測，例如，借助免疫學的方法，尤其是借助蛋白質(zhì)印記分析。如果引進的構建體包含一些與靶植物同源的部分(例如，轉(zhuǎn)基因)，那么依據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以與非轉(zhuǎn)基因植物有明顯的區(qū)別，例如通過引進的轉(zhuǎn)基因的補充性表達。此外，轉(zhuǎn)基因的植物將優(yōu)選包含相關的核酸酸分子的多個轉(zhuǎn)錄本。這可以被檢測，例如，通過Northern印記分析。
在現(xiàn)在的意義上，“改造基因的”或“基因改造”意味著包含在植物中的基因信息通過引入構建體被改變，以及意味著該構建體的存在、該構建體或該構建體的某些部分的轉(zhuǎn)錄或者包含在該構建體中的轉(zhuǎn)基因的表達將導致所述植物的表型變更。在這個意義上，“表型變更”意味著植物的一個或多個功能發(fā)生可察覺的變更。例如，依據(jù)本發(fā)明的植物，由于構建體的存在，或者由于包含在構建體中的轉(zhuǎn)基因的表達，表現(xiàn)出蔗糖剪切活性增加。
“蔗糖剪切活性增強”或“蔗糖剪切活性增加”意味著在可以借助已建成的測定方法進行測量的靶組織中相應的酶的活性增強。例如，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，蔗糖剪切活性的增加，可能是由于下述現(xiàn)象之一●具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)的數(shù)量增加，和/或●蔗糖剪切蛋白質(zhì)的活性增加，例如，由于效應蛋白質(zhì)的表達使蔗糖剪切蛋白質(zhì)激活，或使蔗糖剪切蛋白質(zhì)失去活性的抑制蛋白質(zhì)失去活性。
蔗糖剪切活性的增加(例如，在植物組織中)，可以通過測定蔗糖釋放葡萄糖或果糖的過程予以確定，這個釋放過程，受被研究的組織的蔗糖剪切蛋白質(zhì)的活性的催化。優(yōu)選的是，這樣的增加，意味著由于來自通過基因改良的植物細胞的蛋白質(zhì)提取物的催化，即蔗糖剪切活性被釋放的葡萄糖或果糖的量，與受來自未通過基因改良的植物細胞的蛋白質(zhì)提取物催化的葡萄糖或果糖的釋放相比，至少增加10％，優(yōu)選至少增加20％，更優(yōu)選的至少增加50％，特別優(yōu)選至少增加75％。
如果蔗糖剪切活性的增強，是由于具有蔗糖剪切活性的一種或多種蛋白質(zhì)的數(shù)量的增加，那么這種特定的蛋白質(zhì)或這些特定的蛋白質(zhì)的數(shù)量的增加，也可以通過蛋白質(zhì)印記分析(western-blotanalysis)被確定。在這個特定的范圍內(nèi)，“增加”意味著相對植物細胞中蛋白質(zhì)的總量具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)的數(shù)量在與相應的未改造基因植物細胞比較時有所增加。
業(yè)已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，借助特異增強在植物頂端分裂組織中的蔗糖剪切活性，植物的開花行為可以受到影響。
在本發(fā)明特定的實施例中，就將在細胞組織中引起蔗糖剪切活性增強的構建體的頂端分裂組織特有的轉(zhuǎn)錄和表達(后者非必選)而言，該構建體包含把蔗糖剪切活性的增強特異引向頂端分裂組織的啟動子。在這里以及在下文中，“特異的”將具有與前面的說明相同的意思。啟動子可以是具有必要的組織特異性的自然發(fā)生的啟動子，可以來源于這樣的啟動子，或者可以是完全按設計合成的啟動子，例如，借助“制造分子模型(molecular modelling)”的運用。
被描述成屬于頂端分裂組織特有的啟動子已被揭示，例如，在WO97/10339中。此外，在Brassica oleracea(花椰菜)中的突變是已知的，它導致表現(xiàn)出非常顯著的分枝的頂端分裂組織的巨大發(fā)展(Sadik，1962，American J Bot 49290-297)。通過使用這個突變體，可以借助相減雜交(substractive hybridization)提供分裂組織特有的cDNA文庫，以及分離各種分裂組織特異的基因(Medford等人，1991，Plant Cell 3359-370)。由于在蕓苔屬和擬南芥屬之間的高同源性在，識別A.thaliana中相應的基因是可能的。一個克隆攜帶標識meri-5(ATHMERI5G，IDg166777，ACM63166)，并且表現(xiàn)出與木葡聚糖轉(zhuǎn)糖苷內(nèi)切酶(xyloglucanendotransglycosylase)的相似性(Medford等人，1991)。分裂組織特有的表達已經(jīng)借助在擬南芥和煙草中轉(zhuǎn)錄的啟動子-GUS-融合被檢測出來(Medford等人，1991)。就本發(fā)明的特定途徑即蔗糖剪切蛋白質(zhì)在植物的頂端的分裂組織中特有的表達而言，這個啟動子在擬南芥中使用時原來不是充分特有的。
就來自ATK1基因，(一種來自擬南芥的基因，它屬于Knotted1基因族)的3.5kb XbaI/BamHI啟動子片段而言，如果被用在與GUS融合中，那么有可能在轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬植物中檢測發(fā)芽頂端分裂組織(SAM)的特異表達(Dockx等人，《植物分子生物學》(PlantMol.Biol.)，28，(1995)，723-737)。進一步的分裂組織特有的啟動子已經(jīng)被Mudge等人(《澳大利亞植物生理學雜志》(AustralianJournal of Plant Physiology)25，(1998)，637-643)、Yokoyama等人(《ERECTA啟動子》Promoter；《植物雜志》(Plant Journal)15，(1998)，301-310)和Long等人(《STM1基因的啟動子》(Promoterofthe STM1 gene)；《自然》(Natrue)379，(1996)，66-69)描述過。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，頂端分裂組織特有的啟動子像在所附序列表序列識別No.1中描繪的那樣，是來自擬南芥的完整的KNAT啟動子。這個啟動子在這里被初次介紹，并且其本身是本發(fā)明的一部分。如果沒有最后四個核苷酸，在序列識別No.1中給定的序列，對應于自然發(fā)現(xiàn)的來自擬南芥的KNAT1基因的啟動子的序列。KNAT1基因?qū)碜杂衩椎腒notted1(KN1)基因呈現(xiàn)同源性，后者對應形成葉脈的結狀隆起。為了引進適合插入用來在這個啟動子的控制下表達的轉(zhuǎn)基因的限制內(nèi)切核酸酶識別部位，已通過克隆添加最后四個核苷酸。
包含KNAT啟動子(在3’末端再包括一個核苷酸)的KANT1基因的5’不翻譯段的完整序列，是在序列識別NO.2(nt.l-nt.1475)中描繪的。核苷酸1476～1500代表用于KNAT1蛋白質(zhì)的第一個N-端氨基酸的密碼子。
在本發(fā)明進一步的優(yōu)選實施例中，頂端分裂組織特有的啟動子是在序列識別NO.1中給定的序列的功能部分，該部分把編碼核甙酸序列的轉(zhuǎn)錄和表達(后者非必選)置于其控制之下，特異引向植物的頂端分裂組織。
在這種連接中，“功能部分”除了其它方面還涉及一些序列，這些序列盡管缺乏非本質(zhì)的DNA部分，但仍然擁有預期的功能，例如，啟動子的活性和組織或器官的特異性。這包括只包含來自在序列識別NO.1中描繪的序列的一個、兩個或多個部分的啟動子，例如，其中在序列識別NO.1的序列范圍內(nèi)，對于預期的功能并非必不可少的DNA片段已被刪除。相應的啟動子實例是具有來源于序列識別NO.1的序列的啟動子，其中包含在其中的一個或兩個可譯框架(ORF)(nt.1111-1122；nt.1269-1292)，或包括所述的ORF的一個或兩個更大的段落已被刪除。
本發(fā)明還涉及在此描述的啟動子序列和功能部分或片段的自然發(fā)生的變種，以及人造的或合成的啟動子序列，后者是可以設計的，例如從序列識別NO.1的核苷酸序列出發(fā)，通過化學合成考慮植物的特定密碼子使用。
此外，只要就頂端分裂組織而論，象啟動子活性和組織特異性那樣的必不可少的功能被保持，通過核苷酸的添加、取代、刪除、插入或修飾，從序列識別NO.1中給定的序列或其功能部分派生的啟動子也可以被使用。該序列相應的修飾，可以針對以進一步縮小其中包含的啟動子序列，或者，例如，以引進適合克隆的限制核酸內(nèi)切酶剪切部位。例如，從序列識別NO.1中給定的序列或其功能部分派生的啟動子，對起始序列可以呈現(xiàn)至少50％，優(yōu)選至少65％，特別優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，甚至至少95％的同源性，即同一性。
“衍生的啟動子”特別包括具有從序列記錄(sequence protocol)中描繪的序列，或其某些部分在下面定義的嚴格條件下與來自序列記錄或其某些部分的相應的起始序列雜交派生出來的DNA序列的啟動子。
啟動子序列的功能部分還包括與野生型啟動子相比呈現(xiàn)啟動子活性升高或降低的啟動子變化。
在本發(fā)明的進一步的實施例中，人們可以使用來自KNOTTED1發(fā)育同源序列基因的基因家族的KNAT1同源基因之一的啟動子，只要所述的啟動子指導被置于其控制之下的核苷酸序列的頂端分裂組織特有的表達。
因此，本發(fā)明還適合一些給來自一組KNAT1蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)編碼的基因的啟動子，并且對來自擬南芥的KNAT1基因的核苷酸序列的編碼區(qū)總是呈現(xiàn)至少50％，優(yōu)選至少65％，特別優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％的同源性(即同一性)，以使啟動子指導在它們控制下的編碼核苷酸序列的頂端分裂組織特異的表達。
來自擬南芥的KNAT1基因的序列已被Lincoln等人描述過(《植物細胞》(Plant Cell)6，(1994)，1859-1876)，并且已被存放在基因分子庫(GenBank)數(shù)據(jù)庫之中，登錄號為U14174。在本發(fā)明的中，KNAT1同源因優(yōu)選那些對來自擬南芥的KNAT1基因的核苷酸序列的編碼區(qū)，呈現(xiàn)至少50％，優(yōu)選至少65％，特別優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％的序列同一性的基因。
對來自擬南芥的KNAT1基因呈現(xiàn)同源性的DNA序列可以被識別，例如，利用計算機與已知的序列進行序列對比。同源性百分比的確定可以利用市面上出售的計算機程序(例如，“最佳擬合(Bestfit)”程序[威斯康星序列分析包(Wisconsin Sequence AnalysisPackage)])，用于Unix操作系統(tǒng)的第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711))來完成。此最佳擬合程序以Smith和Waterman的算法(《應用數(shù)學進展》(Advances in Applied Mathematics)2，(1981)482-489)為基礎尋找兩個序列之間序列同一性最高的部分。如果使用“最佳擬合”程序來確定特定的序列與基準序列的同一性是否達到某種程度(例如95％)，那么各種參數(shù)優(yōu)選以這樣的方式設定，即在允許在基準序列范圍內(nèi)同源性缺口不超過核苷酸總數(shù)5％的情況下，沿著基準序列的總長度計算同一性百分比。如果使用“最佳擬合”程序，那么所謂的非必選參數(shù)優(yōu)選保持它們的默認值不變。
作為替代，KNAT1同源基因可以用下述方法予以識別，即利用存放在基因分子庫(GenBank)登錄號U14174或其某些部分下的序列，來篩選cDNA或基因組文庫。適當?shù)暮Y選技術對于熟練的科學家是應知的(例如，參閱J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，(1989)，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular cloninga laboratorymanual)，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York)。此外，基于計算機的序列比較，也可以利用存放在基因分子庫(GenBank)登錄號U14174或其某些部分下的氨基酸序列，完成關于氨基酸序同源水平的比較。
在識別KNAT1的同源cDNAs、基因或蛋白質(zhì)之后，屬于這些同源的cDNA、基因或蛋白質(zhì)的啟動子，將按照技術上已知的方法被分離和識別。然后，可以利用下面將詳細描述的報道基因，通過實驗分析這些被分離的啟動子的表達特征。
來自玉米且與來自擬南芥的KNATl基因同源的Knottedl(KN1)基因，是第一個由植物無性繁殖的發(fā)育同源序列基因(Hake等人，《歐洲分子生物學定期刊物》(EMBO Journal)8，(1989)，15-22；Vollbrecht等人，《自然》(Nature)350，(1991)，241-243)，并且已被廣泛研究。在關于玉米植物中對形成葉脈紐結形隆起有關的顯性變異的研究過程中，這個基因曾被檢測過。這個特征表型是把相關的基因座命名為KNOTTED的理由(Gelinas等人，《美國植物學雜志》(American Journal of Botany)56，(1969)，671-678；Freeling和Hake，《遺傳學》(Genetics)111，(1985)，617-634)。在分離KN1基因之后，對突變體的詳細研究表明，這種表型是KN1基因在變形葉子的橫向脈管中異常表達的結果(Sinha和Hake，《發(fā)展的生物學》(Developmental Biology)141，(1990)，203-210)。在野生型植物中，KN1是在發(fā)芽頂端分裂組織(SAM)中被表達的，而在正在展開的導管中僅僅達到稀少的程度(Smith等人，《發(fā)展》(Development)116，(1992)，21-30)；此外，這個基因或許被卷入維持分裂組織的無差別狀態(tài)(Smith等人，1992；Sinha等人，《基因和發(fā)展》(Genes & Development)7，(1993)，787-795；Jackson等人，《發(fā)展》(Development)120，(1994)，405-413)。KN1發(fā)育同源域(homoeodomain)的結構就發(fā)育同源蛋白而言是典型的，并且是由N端臂和三個α螺旋組成的，其中第二和第三個螺旋形成典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix)結構(Hake等人，倫敦皇家學會哲學學報—系列B生物科學(Philosophical Transactions of theRoyal Society of London-Series BBiological Sciences 350，(1995)，45-51)。
在此期間，已經(jīng)從玉米(Vollbrecht等人，《自然》(Nature)350，(1991)241-243；Kerstetter等人，《植物細胞》(Plant Cell)6，(1994)，1877-1887)、煙草(Feng和Kung，《生生物物理學研究物化學和通訊》(Biochemical & Biophysical ResearchCommunications)198，(1994)，1012-1019)、稻谷(Matsuoka等人，《植物細胞》(Plant Cell)5，(1993)，1039-1048)、大豆(Ma等人，《植物分子生物學》(Plant Mol.Biol.)24，(1994)，465-473)、番茄(Hareven等人，《細胞》(Cell)84，(1996)，735-744；Janssen等人，《植物分子生物學》(Plant Mol.Biol.)36，(1998)，417-425)以及擬南芥(Lincoln等人，《植物細胞》(Plant Cell)6，(1994)，1859-1876)中分離出大量類似的基因。由于在發(fā)育同源域和ELK域中的大序列同源性(ELK域保留在發(fā)育同源域前面有24個氨基酸的序列，而且就那組類似于KNOTTED1的發(fā)育同源蛋白而言是典型的(Meisel和Lam，《植物分子生物學》(Plant Mol.Biol.)30，(1996)，1-14))，這些基因被分配給KNOTTED1發(fā)育同源序列基因的基因家族(Kerstetter等人，《植物細胞》(Plant Cell)，6，(1994)，1877-1887)。來自擬南芥的KNAT1基因在表達型和功能兩方面，表現(xiàn)非常類似于來自玉米的KN1基因(Lincoln等人，《植物細胞》(Plant Cell)6，(1994)，1859-1876；Chuck等人，《植物細胞》(Plant Cell)8，(1996)，1277-1289)。借助原位雜交，有可能證明在營養(yǎng)生長階段KNAT1 RNA在SAM的邊緣區(qū)和“肋()rib”區(qū)特別集中(Lincoln等人，《植物細胞》(Plant Cell)6，(1994)，1859-1876；Jackson等人，《發(fā)展》(Development)120，(1994)，405-413)。
啟動子的活性可以被測定，例如，借助確定按照本發(fā)明已經(jīng)被置于啟動子的調(diào)節(jié)控制之下的特定的標志基因的表達率。
有代表性的適當?shù)臉酥净驅(qū)嵗莵碜源竽c桿菌(E.coli)的β-葡糖苷酸酶(GUS)基因，或綠熒光蛋白(GFP)基因(Baulcombe等人，《植物雜志》(Plant J.)7(16)，(1993)，1045-1053)。通過比較在植物的各種組織或器官中獲得的上述標志基因的表達率，容易確定器官或組織的特定性(specificity)。
原則上，真核生物的RNA聚合酶II的啟動子的活性，是通過各種反式激活因子(DNA結合蛋白)的增效協(xié)同作用確定的，其中反式激活因子結合到該啟動子序列中存在的各種順式的DNA調(diào)節(jié)要素上。這些因子直接或間接與最終導致在轉(zhuǎn)錄起點附近形成起始前復合物的基礎轉(zhuǎn)錄機構的一個或多個因子相互作用[Drapkin等人，1993，《在細胞生物學方面的流行觀點》(Current Opinion inCell Biology)5469-476]?？磥碇档靡惶岬氖?，真核生物的RNA聚合酶II的啟動子的模塊結構(modular structure)，其中各種順式要素(模塊)的組成部分，決定啟動子的總活性(Tjian和Maniatis，1994，《細胞》(Cell)77，5-8)。這種模塊結構已被闡明，例如關于花椰菜花斑病病毒(CaMV)的35S啟動子的研究(Benfey和Chua，1990，《科學》(Science)250959-966；Benfey等人，1990，《歐洲分子生物學定期刊物》(EMBO Journal)91677-1684；Benfey等人，1990，《歐洲分子生物學定期刊物》(EMBO Journal)91685-1696)。由組織的特有的不同，-343到+8(相對于轉(zhuǎn)錄起始點)的啟動子的各種子限制酶切段呈現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因的煙草植物中，該啟動子已被分成6個子域。因此，受完整的啟動子指導的強組成型表達，被分成各個組織特有的局部活性。
按照本發(fā)明可能引起組織特異性的各個啟動子子域，可以通過融合到包括被置于最小的啟動子的控制之下的報道基因的盒(cassettes，借指DNA序列組件)中被識別。最小的啟動子，是包括在轉(zhuǎn)錄起始點或起始序列上游大約20至30個堿基對的TATA箱(box)(Smale和Baltimore，《細胞》(Cell)57，(1989)，103-113；Zawel和Reinberg，《國家科學院學報》，(Proc.Natl.Acad.Sci.)44，(1993)，67-108；Conaway和Conaway，《生物化學研究年鑒》(Annu.Rev.Biochem)62，(1993)，161-190)。最小的啟動子實例是給-63至+8的D35S啟動子(Frohberg，1994，博士論文(Ph.D.thesis of the FU Berlin，F(xiàn)B Biologie，F(xiàn)ederal Republic of Germany))、-332至+14的最小的馬鈴薯糖蛋白I類啟動子和-176至+4的最小的PetE啟動子(Pwee等人，《植物學雜志》(Plant J.)3，(1993)，437-449)。
此外，按照本發(fā)明的啟動子相關的子域或順式要素，還可以通過刪除分析或誘變進行檢測(Kawagoe等人，1994，《植物學雜志》(Plant J.)5(6)885-890)。這樣的子域或順式要素的功能性檢測，可以借助檢測在植物中轉(zhuǎn)化細胞的報道基因的活性來完成。在本文中，“啟動子序列的功能部分”也包括來自序列識別NO.1中給定的核苷酸序列的這樣的子域或順式要素，這些子域或要素把在它們控制之下的編碼核苷酸序列的表達特異引向的頂端的分裂組織。
人們進一步了解到，子域或順式要素可以通過多聚作用被大大增強。例如，就CaMV 35S啟動子而言，250bp片段的串聯(lián)二聚作用，曾導致啟動子的活性增加10倍(Kay等人，1987，《科學》(Science)2301299-1302)。就CaMV 35S啟動子的子域B5而言，如果這個域是以四聚體而不是以單體的形式存在的，那么可以檢測到該啟動子構建體的活性大幅度增加(Benfey等人，1990，《歐洲分子生物學定期刊物》(EMBO Journal)9；1685-1696)。
因此，在進一步的實施例中，本發(fā)明涉及來自基因識別NO.1中給定的核苷酸序列的子域或順式要素的二聚體和多聚體，以及包括所述的二聚體或多聚體的啟動子。
在本發(fā)明的進一步的實施例中，通過選擇被并入構建體的頂端分裂組織特有的增強子，指導轉(zhuǎn)錄和表達(后者非必選)的組織特異性。此外，通過頂端分裂組織特有的增強子與啟動子相結合，變成可能是也可能不是頂端分裂組織特有的啟動子，該啟動子的活性與不包含所述的增強子的野生型啟動子相比可以得到增強。
通常引起表達的組織特異強化的各種增強子，在文獻中有所描述。這種組織的特異性(tissue specficity)，通常借助特別利用的增強子予以確定(Benfey等人，《科學》(Science)250，(1990)，959-966；Benfey等人《歐洲分子生物學定期刊物》(EMBO Journal)8，(1989)，2195-2202；Chen等人，《歐洲分子生物學定期刊物》(EMBO Journal)7，(1988)，297-302；Simpson等人，《自然》(Nature)323，(1986)，551-554)。
此外，存在像PetE增強子那樣的增強子(Sandhu等人，《植物分子生物學》(Plant Mol.Biol.)37，(1998)，885-896)，這些增強子在組織特有的路徑中不起作用，因此，可以作為只有數(shù)量的要素在頂端分裂組織特有的啟動子(例如，依據(jù)本發(fā)明的啟動子)的前面被利用。至此，相關的構建體的表達將在頂端的分裂組織中被增強，而且不影響該啟動子的組織特異性。
此外，可以使用合成的增強子，這些增強子可從自然發(fā)生的增強子衍生得到，和/或通過各種增強子的合并得到。
就增強構建體中包含的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄而言，構建體還可以包括所謂的“基質(zhì)附著區(qū)”，也叫做“支架附著區(qū)”(參閱，例如，Allen等人，《植物細胞》(Plant Cell)5，(1993)，603-613；WO97/27207；WO98/16650；Vain等人，《植物學雜志》(Plant J.)18(3)，(1999)，233-242)。通過增強轉(zhuǎn)錄，可以導致被強化的翻譯，因此，就植物內(nèi)的靶位置而言，將增加蔗糖剪切蛋白質(zhì)之類的轉(zhuǎn)基因的基因產(chǎn)品的量。
在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了植物的開花行為可以由于蔗糖剪切的活性明確地在頂端的分裂組織中增強而受到影響之后，意外地注意到可以通過在頂端的分裂組織范圍內(nèi)蔗糖剪切活性的分區(qū)特定的強化來實現(xiàn)特定的提前或推遲開花。
意外地發(fā)現(xiàn)，如果通過構建體從中調(diào)節(jié)或引入的蔗糖剪切活性被定位在頂端分裂組織的非質(zhì)體中，那么依據(jù)本發(fā)明的植物與相應的未被改造的野生型植物相比呈現(xiàn)早成花。反之，如果蔗糖剪切活性的增強被定位在頂端分裂組織細胞的細胞質(zhì)中，那么與相應的未被改造的野生型植物相比觀察到遲延成花。
所以，本發(fā)明還包括與相應的未被改造的植物相比呈現(xiàn)早成花或遲延成花的轉(zhuǎn)基因植物。
在本發(fā)明的上下文中，“未被改造的植物”或“野生型植物”涉及用于依據(jù)本發(fā)明的植物產(chǎn)品的起始材料。因此，未被改造的或者野生型的植物的遺傳信息，與依據(jù)本發(fā)明的植物相對應，但是，為了影響開花行為被特別引入的基因信息除外。
“早成花”意為被轉(zhuǎn)化的植物比野生型植物至少早幾天開花，例如，早2～10天，優(yōu)選一周或多周，特別是2～6星期。
“推遲成花”意為被改造的植物比野生型植物晚幾天開花，例如，晚2～10天，優(yōu)選一周或多周，特別是2～6星期。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，構建體包括轉(zhuǎn)基因，被增強的蔗糖剪切活性特有的非質(zhì)體定位可以實現(xiàn)，例如，通過在構建體中提供一個或多個指導用轉(zhuǎn)基因編碼的非質(zhì)體定位的以蛋白質(zhì)為目標的信號序列。例如，可以使用蛋白酶抑制劑II基因的信號序列(Keil等人，《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)14，(1986)，5641-5650；yon Schaewen等人，《歐洲分子生物學定期刊物》(EMBO Journal)9，(1990)，30-33)，或者來自馬鈴薯的僅僅給氨基酸l至33編碼馬鈴薯糖蛋白基因B33的信號序列片段(Rosahl等人，1986，MolGen Genet 203214-220)，或者來自解淀粉歐文氏菌的蔗糖6-果糖轉(zhuǎn)移酶基因的片段(Geier和Geider，1993，Phys Mol Plant Pathol 42387-404)作為信號序列。另一種信號序列已被Oshima等人描述過[《核酸研究》(Nucleic Acid Research)，(1990)，181]。
蔗糖剪切活性在頂端的分裂組織的細胞的細胞質(zhì)中被特異增強，可以具體地通過使用上述的啟動子或啟動子要素得以實現(xiàn)，所述的啟動子或啟動子要素指導引起蔗糖剪切活性在細胞組織中強化的構建體的頂端分裂組織特異的轉(zhuǎn)錄和表達(后者非必選)。這些啟動子和啟動子要素特異地在分裂組織頂端的細胞的細胞質(zhì)中引起構建體的轉(zhuǎn)錄和表達(后者非必選)。
另外，在頂端分裂組織的細胞的細胞質(zhì)中構建體的組織特有的轉(zhuǎn)錄和表達(后者非必選)可以通過在構建體范圍內(nèi)使用頂端分裂組織特有的增強子序列得以實現(xiàn)，這在前面已經(jīng)詳細地提出要點。在后一種情況中，啟動子序列既可以是組織特有的，又可以不是組織特有的。例如，就這種情而言，可以使用在與最小的啟動子相結合時包含頂端分裂組織特有的增強子的構建體。
蔗糖剪切活性分別在頂端分裂組織的非質(zhì)體中和頂端分裂組織的細胞的細胞質(zhì)中的組織和區(qū)室特異的增強，可以通過在本發(fā)明的方法中所使用的構建體范圍內(nèi)，使用像上述的增強子和/或“基質(zhì)附著區(qū)”(“支架附著區(qū)”)那樣的補充性轉(zhuǎn)錄增強子要素，使得到進一步增強。
依據(jù)本發(fā)明的植物，可以屬于任何植物種屬，即可以是單子葉植物或者雙子葉植物。優(yōu)選的是，它們將是農(nóng)業(yè)上有用的植物，即人類為了生產(chǎn)食物或技術應用，尤其是產(chǎn)業(yè)應用的目的耕作的植物。優(yōu)選的是，本發(fā)明涉及生產(chǎn)纖維的植物(例如，亞麻、大麻、棉花)，油料的植物(例如，油菜、向日葵、大豆)，儲備淀粉的植物(例如，小麥、大麥、燕麥、黑麥、馬鈴薯、玉米、稻谷、豆、木薯)，儲備糖的植物(例如，甜菜、甘蔗)和儲備蛋白質(zhì)的植物(例如，豆類、谷類、大豆)。本發(fā)明還涉及果樹和棕櫚科植物。
在進一步的優(yōu)選實施例中，本發(fā)明涉及飼料植物(例如，飼料和牧場植物以及禾本科植物，例如紫花苜蓿、三葉苜蓿、黑麥草)，蔬菜植物(例如，西紅柿，生菜，菊苣)和觀賞性植物(例如，郁金香、風信子)。優(yōu)選的是飼料植物，豆，向日葵，西紅柿。特別優(yōu)選的是煙草、玉米、大豆、甜菜、生菜、油菜和稻谷。油菜是更優(yōu)選的。
本發(fā)明還涉及與野生型植物相比表現(xiàn)出早成花的轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)過程，其中包括
(a)構建體引入植物細胞，其中所述構建體在植物細胞中的存在、完全或部分的轉(zhuǎn)錄或表達導致與野生型植物相比，蔗糖剪切活性在頂端分裂組織的非質(zhì)體中被特異增強；(b)從在步驟(a)中獲得的植物細胞的再生植物；(c)非必選的步驟，從在步驟(b)中獲得的再生植物產(chǎn)生另一些植物。
此外，本發(fā)明涉及與野生型植物相比表現(xiàn)出推遲成花的轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)過程，其中包括(a)構建體引入植物細胞，其中所述構建體在植物細胞中的存在、完全或部分的轉(zhuǎn)錄或表達導致與野生型植物相比，蔗糖剪切活性在頂端分裂組織的細胞的細胞質(zhì)中被特異地增強；(b)從在步驟(a)中獲得的植物細胞再生植物；(c)非必選的步驟，從在步驟(b)中獲得的再生植物產(chǎn)生另一些植物。
就按照上述過程的步驟(a)把基因改造引入植物細胞而論，前面已經(jīng)提及要點，在依據(jù)本發(fā)明的植物方面同樣適用。依據(jù)步驟(b)的植物再生，可以按照熟練的科學家眾所應知的方法予以完成。按照步驟(c)生成另一些植物可以這樣完成，例如，通過無性繁殖(例如，借助插枝、塊莖或愈傷組織培養(yǎng)和整株植物的再生)或者通過有性繁殖。優(yōu)選的是，任何有性繁殖都將在受控的條件下實現(xiàn)，即被選定的具有特殊表征的植物將被雜交和繁殖。
本發(fā)明還涉及通過權利要求的方法所獲植物，以及轉(zhuǎn)基因的繁殖材料，尤其是轉(zhuǎn)基因的種子、轉(zhuǎn)基因的植物部分和轉(zhuǎn)基因的植物細胞，所述材料來自用權利要求的方法所獲得的植物。在文中，“繁殖材料”包括任何適合用于產(chǎn)生子代的無性繁殖或有性繁殖的植物部分。例如，就無性繁殖而言，插枝、愈傷組織培養(yǎng)、根莖或塊莖將是適當?shù)?。其它繁殖材料例如包括水果、種子、秧苗、非體(apoplast)、細胞培養(yǎng)等。優(yōu)選的繁殖材料是種子。
為了制備與野生型植物細胞相比分別表現(xiàn)出早成花或推遲成花的轉(zhuǎn)基因植物，本發(fā)明進一步涉及核酸構建體的運用，這種核酸構建體引起植物中的蔗糖剪切活性增強，并且包括一個或多個在頂端分裂組織的非質(zhì)體中或作為替代在頂端分裂組織的細胞的細胞質(zhì)中引起該構建體或其某些部分的轉(zhuǎn)錄和表達(后者非必選)和/或所述構建體中包含的轉(zhuǎn)基因的翻譯產(chǎn)品的定位的核酸部分。就這點而言，前面就依據(jù)本發(fā)明的植物介紹過的構建體優(yōu)選被使用。
在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明的涉及使用包含轉(zhuǎn)基因的構建體，其中該轉(zhuǎn)基因?qū)?yōu)選給蔗糖剪切蛋白質(zhì)編碼。在特別優(yōu)選實施例中，轉(zhuǎn)基因?qū)⒔o轉(zhuǎn)化酶編碼，而且所述轉(zhuǎn)化酶的表達將出現(xiàn)在頂端分裂組織的特定部分中；由此，與野生型植物相比表現(xiàn)出早成花或推遲成花的轉(zhuǎn)基因植物就可以被制備出來。
本發(fā)明的進一步的目標是上述的啟動子要素，這些啟動子要素是由在序列識別NO.1中描繪的DNA序列或其某些功能部分組成的，或者包括該DNA序列或其某些功能部分。
除了最后四個核苷酸之外，已被提及要點的序列識別NO.1的序列，對應于對來自玉米并且對形成葉脈扭結狀隆起起作用的Knotted1(KN1)基因呈現(xiàn)同源性的來自擬南芥的KNAT1基因的啟動子的自然存在的序列。在序列識別NO.1中，為了引進適合插入打算在這個啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄和表達(非必選)的基因要素，或轉(zhuǎn)基因的限制性內(nèi)切核酸酶的剪切位置，最后四個核苷酸已經(jīng)通過克隆被添加進去。
包含KNAT啟動子(在3’末端包括另一個核苷酸)的KNAT1基因的5’未被翻譯的區(qū)域的完整的序列，是在序列識別NO.2(nt.1到nt.1475)中描繪的。核苷酸1476至1500代表用于該KNAT1蛋白質(zhì)的第一個N端氨基酸的密碼子。
作為包括序列識別NO.1的序列的某個功能部分的啟動子要素的例證，是具有從序列識別NO.1派生出來的序列的啟動子要素，其中包含一個或兩個短可譯框(ORF)(nt.1111-1122；nt.1269-1292)，或包括所述的ORF的一個或兩個比較大的區(qū)域已經(jīng)被刪除。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，后一種啟動子將呈現(xiàn)高于包含序列識別NO.1的完整序列的啟動子的啟動子活性。
此外，本發(fā)明涉及已經(jīng)通過添加、取代、刪除，插入或修飾從在序列識別NO.1中給定的序列或該序列的某些功能部分派生出來的啟動子。特別優(yōu)選的派生的啟動子的特征是，起始序列對頂端分裂組織的功能(例如，啟動子活性和組織特有的)被保留在派生物中。舉例說，相應的序列修飾可能是以進一步縮小包含在其中的啟動子序列、或引進適合克隆的限制性內(nèi)切核酸酶的剪切部位為目標。例如，以在序列識別NO.1中給定的序列或其某些功能部分作為起始序列派生的啟動子，對各自的起始序列可能呈現(xiàn)至少50％，優(yōu)選至少65％，特別優(yōu)選至少80％和本質(zhì)上優(yōu)選至少90％的同源性，即同一性。
具體地說，本發(fā)明包括具有從序列識別NO.1的DNA序列，或者從序列識別NO.1的某個功能部分或至少兩個功能部分的組合的DNA序列，通過核苷酸的添加、取代、刪除，插入或修飾派生出來的DNA序列的啟動子要素，派生的啟動子要素是在嚴格條件下與各個起始序列的雜交產(chǎn)物。
本發(fā)明還包括與相應的野生型啟動子相比呈現(xiàn)增大或者減小的啟動子活性的啟動子變種。
在進一步的實施例中，本發(fā)明還以來自KNOTTED1發(fā)育同源序列基因的基因家族的KNAT1同源基因的啟動子為目標。特別優(yōu)選的是這樣一些啟動子，它們指導被置于它們的控制下的核苷酸的頂端分裂組織特異的表達。
因此，本發(fā)明還涉及一些給來自一組KNAT1蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)編碼，并且對來自擬南芥的KNAT1基因的核甙酸序列的編碼區(qū)呈現(xiàn)至少50％、優(yōu)選至少65％、特別優(yōu)選至少80％和本質(zhì)上優(yōu)選至少90％的同源性(即同一性)的基因的啟動子，其中這些啟動子優(yōu)選在植物中把編碼核甙酸序列的表達置于它們的控制下特異引向頂端分裂組織。這些啟動子對于擬南芥的KNAT1基因的啟動子可以是在某種程度上同源的；因此，它們對于來自擬南芥的KNAT1基因的核甙酸序列的相應的啟動子區(qū)可能呈現(xiàn)至少50％、優(yōu)選至少65％、特別優(yōu)選至少80％或85％、更優(yōu)選至少90％的同源性，即同一性。
另外，就本發(fā)明的啟動子及其特定的特點而論，指的是就可供生產(chǎn)本發(fā)明的通過基因改良的植物利用的啟動子而論，前面給出的解釋。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在按照下述的至少一種方法的雜交過程之后，在嚴格條件下的雜交將是可檢測的。雜交按照Church和Gilbert的方法，在PEG緩沖液中(0.25M Na2HPO4，1mM EDTA，1％(w/v)BSA，7％(w/v)SDS，用磷酸調(diào)到pH7.5；G.M.Church，W.Gilbert，(1984)，《基因測序，美國國家科學院學報》(Genomic sequencing，Proc.Natl.Acad.Sci.USA)811991-1995)在42℃下不超過20小時；或者在包含甲酰胺(42℃)或不包含甲酰胺(68℃)的標準雜交緩沖液中不超過20小時(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，(1989)，《分子克隆實驗室手冊》(Molecular cloninga laboratorymanual)，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York)。洗滌在65℃下用3XSSC緩沖液，0.1％SDS(J.Sambrook，E.F.Fritsch，T.Maniatis，(1989)，《分子克隆實驗室手冊》，見上)，洗滌3次，每次30分鐘。
本發(fā)明還包括一些構建體，特別是包括依據(jù)本發(fā)明的啟動子要素、以及把本發(fā)明的啟動子要素用于在植物的頂端分裂組織中基因的組織特有的表達的載體，例如，質(zhì)粒、粘粒、類噬菌體質(zhì)粒、桿粒、病毒或噬菌體基因組、YACs(酵母人工染色體)和BACs(細菌人工染色體)。本發(fā)明還涉及任何種類的宿主細胞，特別是細菌型、真菌型和轉(zhuǎn)基因的植物細胞，以及用其中包含依據(jù)本發(fā)明的啟動子要素的構建體已經(jīng)轉(zhuǎn)化過的轉(zhuǎn)基因植物。
另外，就轉(zhuǎn)基因植物而論，指的是就某些以已經(jīng)用導致蔗糖剪切活性在頂端分裂組織中被特異增強的構建體轉(zhuǎn)化過為特征的植物，見前面給出的解釋。
本發(fā)明的進一步的主題內(nèi)容是轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，該方法的特征是下述步驟(a)把包括依據(jù)本發(fā)明的啟動子要素的構建體，特別是載體，引入植物細胞；(b)從借助步驟(a)獲得的植物細胞再生某種植物；(c)(非必選)，從借助步驟(b)獲得的再生植物生成另一些植物。
本發(fā)明還涉及借助權利要求所述的方法獲得的植物。
此外，本發(fā)明還涉及繁殖材料，這些繁殖材料是在優(yōu)選實施例中是轉(zhuǎn)基因的，特別是可以從依據(jù)本發(fā)明的植物或借助權利要求所述的方法獲得到植物中獲得的種子、植物部分和/或植物細胞。就“繁殖材料”而論，指的是前面給出的解釋。
附1構建體KNAT-AI的示意圖。酵母轉(zhuǎn)化酶基因(SUCII)在頂端分裂組織特有的KNAT啟動子控制下。PI-II＝允許在非質(zhì)體中定位的來自馬鈴薯的蛋白酶抑制劑基因(PI-II)的信號序列的一部分；SUCII＝酵母轉(zhuǎn)化酶；ocs＝來自A.tumefaciens的章魚堿合成酶基因的多腺苷化(polyadenylation)信號。
圖2構建體KNAT-CI的示意圖。酵母轉(zhuǎn)化酶基因(SUCII)在頂端分裂組織特有的KNAT啟動子控制下。SUCII＝酵母轉(zhuǎn)化酶；ocs＝來自A.tumefaciens的章魚堿合成酶基因的多腺苷化(polyadenylation)信號。
圖3酵母轉(zhuǎn)化酶的頂端分裂組織特有異的表達，隨著非質(zhì)體的定位對轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬品系的開花行為的影響。KNAT-AI品系的開花行為是在長日照(A)和短日照(B)條件下，通過T2的生成進行研究的。為了確定轉(zhuǎn)化酶活性(C)，使用T1生成的花序(條形代表標準偏差；數(shù)目＝個體數(shù)；按照斯氏t檢驗的顯著性p＜0.01＝***)。在A和B中Y-軸蓮座葉數(shù)目。在C中Y-軸轉(zhuǎn)化酶活性(毫摩爾己糖/分鐘*克鮮重)。在A-C中X-軸轉(zhuǎn)基因系的編號；WT＝野生型。
圖4酵母轉(zhuǎn)化酶的頂端分裂組織特異的表達，隨著細胞質(zhì)的定位對轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬品系的開花行的影響。KNAT-CI系的開花行為是在長日照(A)和短日照(B)條件下通過T2的生成進行研究的。為了確定轉(zhuǎn)化酶活性(c)，使用T1生成的花序(條形代表標準差；數(shù)目＝個體數(shù)；按照斯氏t檢驗的顯著性p＜0.01＝***)。在A和B中Y-軸蓮座葉數(shù)目。在C中Y-軸轉(zhuǎn)化酶活性(毫摩爾己糖/分鐘*克鮮重)。在A-C中X-軸轉(zhuǎn)基因系的編號；WT＝野生型。
下面將借助非限制性實施例舉例說明本發(fā)明。
來自擬南芥的同源基因的cDNA序列是已知的，并且已經(jīng)被存放在基因分子庫(GenBank)，數(shù)據(jù)庫的登錄號是U14174。這個序列包含來自ATG起始密碼子的384個堿基對5′(Lincoln等人，1994，《植物細胞》(Plant Cell)61859-1876)；但是，KNAT1基因的啟動子還是未知的。
為了分離KNAT1啟動子，用370個堿基對(bp)的DNA片段篩選擬南芥的基因組文庫。這個片段已經(jīng)從擬南芥基因組的DNA，利用引物KNAT-for和KNAT-mut(其序列將在下面給出)通過運用PCR技術被擴增。該序列包括在ATG起始密碼子上游的已知的5′部分。為了產(chǎn)生用于限制性核酸內(nèi)切酶BamHI的識別序列，引物KNAT-mut包括導致ATG起始密碼子突變的序列變更。下面給出引物的序列KNAT-for 5′TGT CAC TTC TTG ACG AAT TCKNAT-mut 5′ATG CAT CCC AGA TGA GAT AAG ATT TG
經(jīng)過擴增的片段是接到EcoRV剪切載體pKS中的平端，并且被用于篩選基因組的λ-噬菌體文庫。
通過雜交對上述片段進行檢驗的噬菌體克隆的DNA的SalI/XbaI消化，產(chǎn)生在DNA實驗中用PCR探針雜交的2.1kbp的片段。這個片段被連接到已經(jīng)被SalI/XbaI打開的pKS載體中。這個克隆被稱為pKANT-KS-nonmut，而這個啟動子區(qū)是完全排序的。這個啟動子序列是在序列識別NO.1中描繪的。
來自StuI剪切部位的啟動子部分3’通過StuI/XbaI限制被除去，而XbaI剪切的填入反應，是借助T4聚合酶完成的。然后，把來自pKNATS的225bp StuI/EcoRI片段(+T4聚合酶反應)平端接入載體是可能的。這個構建體被命名為pKNAT-mut，并且包含大約1.5kbp的啟動子序列(其中包括不超過發(fā)生突變的ATG的5′-NTR)。
2.關于KANT1的特異性的研究由于KNATl啟動子的表達特征尚未在轉(zhuǎn)基因植物中研究過，所以其功能性首先在轉(zhuǎn)錄融合中用轉(zhuǎn)基因的擬南芥屬植物中的GUS報道基因進行實驗。為此，1.5kbp的SalI/XbaI啟動子片段在UIDA基因前面被克隆成等剪切的載體pGPT V-HPT(Becker等人，1992，《植物分子生物學》(Plant Mol Biol)201195-1197)。這種構建體被命名為pKNAT-GUS，并且被轉(zhuǎn)移到隨后用于A.thaliana的轉(zhuǎn)化的A.tumefaciens菌株GV2260中。擬南芥植物的轉(zhuǎn)化是按照已知的方法(Schmidt和Willmitzer，1989，17-24)完成的。轉(zhuǎn)基因植物的分析結果是，在營養(yǎng)生長階段在轉(zhuǎn)基因的擬南芥植物的頂端分裂組織中檢測到受KNAT1啟動子驅(qū)動的UIDA基因的特異的表達?；ㄐ蛘归_之后，UIDA基因的表達在開花期的莖中也可能被檢測到。
3.構建體KNAT-AI和KNAT-CI的合成。
把來自釀酒酵母的SUC2基因的編碼區(qū)(它在煙草植物中已被用于的酵母轉(zhuǎn)化酶的表達(Sonnewald等人，1991，《植物學雜志》(Plant J)195-106))在轉(zhuǎn)錄融合時克隆到用于頂端分裂組織特異表達的NT1啟動子上。為此，載體KNAT-Bin被構建。這種載體包括在載體pBinAR-Hyg中作為SalI(被填滿)/XbaI(被填滿)片段(Abel，1995，《對于馬鈴薯淀粉合成機理研究》(Untersuchungenzur Funktion von Strke-Synthasen in der Kartoffel(Solanumtuberrosum L.))，理學博士論文(Ph.D.thesis.)，F(xiàn)U Berlin，Berlin，聯(lián)邦德國)的大約1.5kb的來自擬南芥的KNAT1基因的啟動子片段，它已通過消化被限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI(被填滿)和Asp718(被填滿)打開，借此除去原本已插在pBinAR-Hyg中的CaMV 35S啟動子。為了使酵母轉(zhuǎn)化酶在非質(zhì)體中定位，包括OCS多腺苷化序列的完整的PI-II/SUCII融合(von Schaewen等人，1990，EMBOJ93033-3044)被轉(zhuǎn)移到載體KNAT-Bin中。這種最終獲得的載體被命名為KNAT-AI(

圖1)。截去頂端的SUCII基因被用于細胞質(zhì)中的定位并且包括發(fā)表的核苷酸序列(登錄號M13627，Kaiser和Botstein，1986，)《分子細胞生物學》(Mol Cell Biol)62382-2391)中的核苷酸段(nt.1795(ATG)到nt.2383(TAA))。這種片段可以作為XbaI(被填滿)/SalI片段被連接到被SamI/SalI打開的KNAT-Bin載體中(圖2)。這種構建體被命名為KNAT-CI，而且象KNAT-AI載體那樣被轉(zhuǎn)移到隨后用于A.thaliana轉(zhuǎn)化的A.tumefaciens-Stamm GV2260中。
4. 轉(zhuǎn)基因植物的分析轉(zhuǎn)化酶的活性來自分別用構建體KNAT-AI和KNAT-CI轉(zhuǎn)化的擬南芥屬植物的種子被播種在包含培養(yǎng)基的潮霉素上，隨后被轉(zhuǎn)移到土壤中。這種轉(zhuǎn)基因的表達特征，是借助確定轉(zhuǎn)化酶的活性針對各種品系的植物被確定的。為了確定轉(zhuǎn)化酶的活性，花芽被使用，因為在KNAT-GUS植物中啟動子的特有的分析表明，在這個區(qū)域GUS的表達被增強(見實施例2)。這是有利的，因為摘除之后花芽將重新形成，所以仍然有可能為接下來的開花實驗收獲種子。
就KNAT-AI和KNAT-CI兩種轉(zhuǎn)化而言，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化酶活性增強的獨立品系都可能被檢測。與野生型相比，在KNAT-AI品系中，轉(zhuǎn)化酶活性被增強不超過3倍(見圖3c)，而在KNAT-CI品系中不超過2倍(見圖4c)。
開花行為來自表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化酶有所增強的被選定的品系的種子被用于兩種獨立的開花實驗。
(a)實驗I種子被播種到土壤里，并且為了發(fā)芽，對該種子進行歷時4夜(4℃)的春化處理。再過6天之后，把多余的植物去除，以致每罐保留一棵植物。在擬南芥情況下被優(yōu)選用來確定植物年齡的蓮座葉數(shù)被計數(shù)，以便確定在短日照(KT人工氣候室；光量145-150μmol/m2/s；8小時明、16小時暗)和長日照(LT人工氣候室；光量145-150μmol/m2/s；16小時明亮、8小時黑暗)的條件下栽培的開花時間。
轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化酶品系在KT條件下象野生型那樣開花(見圖3b)。從蓮座葉數(shù)上的差異看來與野生型沒有明顯的不同。
但是，在LT誘導條件下，另一種開花行為可能在KNAT-AI品系中被觀察到(見圖3a)。在轉(zhuǎn)化酶已經(jīng)定位在非質(zhì)體中的5個被研究的轉(zhuǎn)基因品系中，有4個品系的植物在比野生型植物少10個蓮座葉片時已經(jīng)開花。在生成T1時只表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化酶活性略有增強的品系9中的植物象野生型植物那樣開花(見圖3c)。
盡管KNAT-AI品系在LT條件下呈現(xiàn)早開花的表型，但是在同樣的條件下KNAT-CI品系開花大大晚于野生型植物(見圖4a)。因此，與野生型相比，在被研究的4個KNAT-CI品系的3個品系中，蓮座葉的平均數(shù)在開花被增加7到9之前形成。只有第4個品系的植物開花行為沒有改變；但是這些植物在開始產(chǎn)生時僅僅表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化酶活性略有增強(見圖4c)。
(b)實驗II種子在短日照條件(8小時光照/16小時黑暗；溫度18℃(白天)，6℃(黑夜))下，在土壤中被預發(fā)芽兩星期。被移植的發(fā)芽種子(子葉大小大約2mm)被栽培在由GS90培養(yǎng)基底和輕粒料的1∶1的混合物組成的土壤中。然后，該植物在下述條件下被栽種在溫室中相對濕度60％至70％；白天溫度20至22℃；夜間溫度18至20℃；光量280至300μmol/m2/s；明/暗周期16小時/8小時。
在溫室條件下，開花行為的改變在KNAT-AI品系(比野生型植物大約早2天開花)和KNAT-CI品系(給比野生型植物大約遲3至5天開花)兩個品系中都可以觀察到。
基因序列表<110>Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung der Wissenschaften e.V<120>影響植物的開花行為的手段和方法<130>EP-83671/PCT<140><141><150>DE19857654.4<151>1998-12-14<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1478<212>DNA<213>擬南芥<220><221>啟動子<222>(1)..(1474)<223>KNAT1基因的啟動子(KNAT啟動子)<220><221>misc feature<222>(1111)..(1122)<223>可譯框(ORF)<220><221>misc-teature<222>(1269)..(1292)<223>可譯框(ORF)<220><221>misc_feature<222>(1475)..(1478)<223>為了引進限制核酸內(nèi)切酶剪切部位在3’端添加的補充性核苷酸<400>1gtcgacctgc aggtcaacgg atctagagcc ctaggatttg acgatttata tataaataaa 60accctaggat tttcgtttct ttttgtataa aaatgaattc ataggcactc tatacgtctc 120atgaatcatg aaatataaat cgagattaaa tagaaaattg aatgttgacc gtggaacaga 180acaagtgttg aaagaagtgt gtttgcagca tggtcttatc atagagccaa tagttggaaa 240ttagcagaat atcgtataat atccactatc ctgtaaagca tttttataat tccttttttt 300ttctcggttt ctaatgtaat cttctatccg ataacaaata ttcggatagt gtgatctctc 360cactaatata catacgaaat tacgaaaact aaaattataa tttcatcgat ttgattaaac 420tccaaaaaca tccaagtctt gcatcaaata tgtacatttc tatcatattg tttataattc 480tttttttgtt atccgtaagt tttaggcaga aacccgtaca gtgaaaccga ggaccagaac 540aagataaacg tagtcccctc tcctaagtat agaattataa tgtgacacat gatcacaatt 600tgttgaacga actctatgtt caaccactag actacaagaa gtatatataa atcatacata 660tttttaa aacttttttc ttgactattc ttttaagaaa aaaaaaacat ttcattacta 720gaaaatagta caaaatatat cattcaacct agcaagaaac catagcctga agtagccgcg 780aagacctagt tgcttaaaca ctgagtggtt catcttaatt cgaatattat aaaccacatt 840ttaattaagt aaattacgta gtcttgttct aatgtataaa atagcctatg agaggaaaac 900agaagagaga agcctttgcc ttatctcttg tcccttctct cttaccttta ttttaatttt 960caaatatttc tttttgctcc caaagcaaac gacgtcttgt caatccactc aagccaccca 1020acttcttcat tattgttaat ctctctctct ctctctcttt ctctcttctt ctctctttct 1080cttttttttt tttttatttt cttctcttcc atgtcacttc cttgacgaat tctatatacc 1140tagttcgttt tttcttcctc aaatatatct ttttcaattt atttggtttt tctttgggtg 1200caacttcacc tcacaaaatt ttctctcttt tttatattaa tttgagttag gcctttttga 1260tttcatagat gagtcgtcta gtcgtctgga tttgatgtgg ttatagtctt acagagacct 1320ttgattgaaa taagaacaaa agcaagaata catacatcct cttcatctta cacccatcct 1380tttttatttt tctagggttt tatttttttt taatttattt ttttttcttt gatttttata 1440ttctctctct ctctcaaatc tttactcatc tgggatcc 1478<210>2<211>1500<212>DNA<213>擬南芥<220><221>啟動子<222>(I)..(1475)<223>KNAT1基因的啟動子(KNAT啟動子)<220><221>misc_feature<222>(1111)..(1122)<223>可譯框(ORF)<220><221>misc_feature<222>(1269)..(1292)<223>可譯框(ORF)<220><221>CDS<222>(1476)..(1499)<223>給KNAT1的N-端氨基酸序列編碼的編碼序列<220><221>misc_feature<222>(1500)<223>KNAT1基因的編碼序列的繼續(xù)<400>2gtcgacctgc aggtcaacgg atctagagcc ctaggatttg acgatttata tataaataaa 60accctaggat tttcgtttct ttttgtataa aaatgaattc ataggcactc tatacgtctc 120atgaatcatg aaatataaat cgagattaaa tagaaaattg aatgttgacc gtggaacaga 180acaagtgttg aaagaagtgt gtttgcagca tggtcttatc atagagccaa tagttggaaa 240ttagcagaat atcgtataat atccactatc ctgtaaagca tttttataat tccttttttt 300ttctcggttt ctaatgtaat cttctatccg ataacaaata ttcggatagt gtgatctctc 360cactaatata catacgaaat tacgaaaact aaaattataa tttcatcgat ttgattaaac 420tccaaaaaca tccaagtctt gcatcaaata tgtacatttc tatcatattg tttataattc 480tttttttgtt atccgtaagt tttaggcaga aacccgtaca gtgaaaccga ggaccagaac 540aagataaacg tagtcccctc tcctaagtat agaattataa tgtgacacat gatcacaatt 600tgttgaacga actctatgtt caaccactag actacaagaa gtatatataa atcatacata 660ttttttttaa aacttttttc ttgactattc ttttaagaaa aaaaaaacat ttcattacta 720gaaaatagta caaaatatat cattcaacct agcaagaaac catagcctga agtagccgcg 780aagacctagt tgcttaaaca ctgagtggtt catcttaatt cgaatattat aaaccacatt 840ttaattaagt aaattacgta gtcttgttct aatgtataaa atagcctatg agaggaaaac 900agaagagaga agcctttgcc ttatctcttg tcccttctct cttaccttta ttttaatttt 960caaatatttc tttttgctcc caaagcaaac gacgtcttgt caatccactc aagccaccca 1020acttcttcat tattgttaat ctctctctct ctctctcttt ctctcttctt ctctctttct 1080cttttttttt tttttatttt cttctcttcc atgtcacttc cttgacgaat tctatatacc 1140tagttcgttt tttcttcctc aaatatatct ttttcaattt atttggtttt tctttgggtg 1200caacttcacc tcacaaaatt ttctctcttt tttatattaa tttgagttag gcctttttga 1260tttcatagat gagtcgtcta gtcgtctgga tttgatgtgg ttatagtctt acagagacct 1320ttgattgaaa taagaacaaa agcaagaata catacatcct cttcatctta cacccatcct 1380tttttatttt tctagggttt tatttttttt taatttattt ttttttcttt gatttttata 1440ttctctctct ctctcaaatc tttactcatc tgggt atg gaa gaa tac cag cat1493Met Glu Glu Tyr Gln His1 5gac aac a1500Asp Asn<210>3<211>8<212>PRT<213>擬南芥<400>3Met Glu Glu Tyr Gln His Asp Asn1 權利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于用構建體導致與野生型植物相比蔗糖剪切活性在植物的頂端分裂組織中被特異增強而發(fā)生轉(zhuǎn)化。
2.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述構建體包括轉(zhuǎn)基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因給具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)編碼。
4.根據(jù)權利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因給從由轉(zhuǎn)化酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖合成酶、果糖基轉(zhuǎn)移酶和葡糖苷基轉(zhuǎn)移酶組成的一組蛋白質(zhì)中選出的蛋白質(zhì)編碼。
5.根據(jù)權利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因給來自釀酒酵母的轉(zhuǎn)化酶編碼。
6.根據(jù)權利要求2所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因給激活植物細胞內(nèi)蔗糖剪切蛋白質(zhì)的效應蛋白質(zhì)編碼。
7.根據(jù)權利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的構建體根據(jù)植物細胞內(nèi)給抑制蔗糖剪切蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)編碼的植物細胞基因給“有意義的”或“無意義的”核酸編碼。
8.根據(jù)權利要求1至7中所述的任何一項轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的構建體包括頂端分裂組織特定的啟動子。
9.根據(jù)權利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的構建體包括頂端分裂組織特有的KNAT啟動子，該啟動子具有在基因識別NO.1中給定的序列或其中的一個或多個功能部分。
10.根據(jù)權利要求1至9所述的任何一項的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的構建體包括頂端分裂組織特異的增強子序列。
11.根據(jù)權利要求1至10所述的任何一項轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的構建體導致與野生型植物相比蔗糖剪切活性在頂端分裂組織的非質(zhì)體中被特異增強而發(fā)生轉(zhuǎn)化。
12.根據(jù)權利要求11所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于所述的構建體包括轉(zhuǎn)基因。
13.根據(jù)權利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于其中所述的構建體還包括以蛋白質(zhì)為靶信號序列，所述的序列指導由所述的構建體中包含的轉(zhuǎn)基因的表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽的非質(zhì)體定位。
14.根據(jù)權利要求13所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于其中以蛋白質(zhì)作為靶信號序列是從來自馬鈴薯的pin2、來自馬鈴薯的馬鈴薯糖蛋白基因B33的信號序列和來自解淀粉歐文氏菌的蔗糖6-果糖轉(zhuǎn)移酶的信號序列所組成的一組信號序列中選出的。
15.根據(jù)權利要求1至10中所述的任何一項的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于某種構建體導致與野生型植物相比，蔗糖剪切活性在頂端分裂組織的細胞的細胞質(zhì)中被特異增強而發(fā)生變化。
16.根據(jù)權利要求1至15中所述的任何一項的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于是一種產(chǎn)生纖維、儲存油脂、儲存淀粉、儲存糖或儲存蛋白質(zhì)的植物。
17.根據(jù)權利要求1至15中任何一項所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于是一種飼料、蔬菜或觀賞性植物。
18.一種生產(chǎn)與野生型植物相比表現(xiàn)出早成花的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法的特征在于下述步驟(a)把某種構建體引入植物細胞，這種構建體在植物細胞中的存在、完全或部分轉(zhuǎn)錄或表達，導致所述的植物與野生型植物相比，所述的蔗糖剪切活性在植物頂端分裂組織的非質(zhì)體中被特異地增強；(b)利用步驟(a)中獲得的所述的植物細胞再生某種植物；(c)(非必選)利用步驟(b)中獲得的再生植物產(chǎn)生另外一些植物。
19.一種生產(chǎn)與野生型植物相比表現(xiàn)出推遲成花的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法的特征在于下述步驟(a)把某種構建體引入植物細胞，這種構建體在植物細胞中的存在、完全或部分轉(zhuǎn)錄或表達將導致與野生型植物相比，蔗糖剪切活性在所述植物的頂端分裂組織的細胞的細胞質(zhì)中被特異地增強；(b)利用步驟(a)中獲得的植物細胞再生某種植物；(c)非必選地利用步驟(b)中獲得的再生植物產(chǎn)生另外一些植物。
20.根據(jù)權利要求18或19所述的方法，其特征在于所述的構建體包括轉(zhuǎn)基因。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因是具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)。
22.用根據(jù)權利要求18至21所述的任何一項的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物。
23.從根據(jù)權利要求1至17或22所述的任何一項轉(zhuǎn)基因植物中可獲得的轉(zhuǎn)基因繁殖材料、轉(zhuǎn)基因種子、轉(zhuǎn)基因植物部分或轉(zhuǎn)基因植物細胞。
24.在植物中引起蔗糖剪切活性增強的核酸構建體的使用，為了生產(chǎn)與野生型植物相比表現(xiàn)出早成花的轉(zhuǎn)基因植物，所述的構建體包括一個或多個核酸部分，這些核酸部分將引起所述構建體或其中某些部分在頂端分裂組織的非質(zhì)體中的轉(zhuǎn)錄或表達(后者非必選)，和/或引起包含在所述構建體中的轉(zhuǎn)基因的翻譯產(chǎn)品在頂端分裂組織的非質(zhì)體中定位。
25.在植物中引起蔗糖剪切活性增強的核酸構建體的使用，為了生產(chǎn)與野生型植物相比表現(xiàn)出推遲成花的轉(zhuǎn)基因植物，所述構建體包括一個或多個核酸部分，這些核酸部分引起所述構建體或其某些部分在頂端分裂組織的細胞的細胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄或表達(后者非必選)，和/或引起包含在所述構建體中的轉(zhuǎn)基因的翻譯產(chǎn)品在頂端分裂組織的細胞的細胞質(zhì)中定位。
26.根據(jù)權利要求24或25所述的使用，其特征在于所述的核酸構建體包含轉(zhuǎn)基因。
27.根據(jù)權利要求26所述的使用，其特征在于包含在所述的核酸構建體中的轉(zhuǎn)基因給具有蔗糖剪切活性的蛋白質(zhì)編碼。
28.根據(jù)權利要求27所述的使用，其征在于包含在所述的核酸構建體中的轉(zhuǎn)基因給轉(zhuǎn)化酶編碼。
29.一種包含在在序列識別NO.1中描繪的DNA序列或其一個或多個功能部分中的啟動子要素。
30.根據(jù)權利要求29所述包含在在序列識別NO.1中描繪的DNA序列中的啟動子要素，其中兩個可譯框(nt.1111-1122；nt.1269-1292)或包括這些可譯框的區(qū)域已被刪除。
31.一種啟動子要素，包括由在序列識別NO.1中描繪的DNA序列或該序列的一個或多個功能部分作為起始序列，所述的DNA序列是在嚴格條件下與各自的起始序列雜交，借助核苷酸的添加、取代、刪除、插入或修飾派生出來的DAN序列。
32.一種給來自一組KNAT1蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)編碼的基因的啟動子要素，所述的要素對來自擬南芥的KNAT1基因的核苷酸序列的編碼區(qū)呈現(xiàn)65％的同源性，其中所述的啟動子要素把植物中在其控制之下的編碼核苷酸序列的表達特異地引向所述的植物的頂端分裂組織。
33.包括根據(jù)權利要求29至32中所述的任何一項的啟動子要素的構建體。
34.根據(jù)權利要求29至32中所述任何一項在植物的頂端分裂組織中用于編碼核苷酸序列的組織特異表達的啟動子要素的使用。
35.根據(jù)權利要求33所述的構建體改造的宿主細胞，特別是細菌的、真菌的和轉(zhuǎn)基因的植物細胞。
36.包含根據(jù)權利要求35所述的植物細胞的植物。
全文摘要
這項發(fā)明涉及使提供表現(xiàn)出開花行為已被改變的植物成為可能的手段和方法,具體地說,改造過基因的植物與未作相應的改造而且在其它方面類似的野生型植物相比表現(xiàn)出提前或推遲成花;以及在生產(chǎn)這些改造過基因的植物的方法中可以利用的組織特有的啟動子。這項發(fā)明的基礎是一項發(fā)現(xiàn),即植物的開花行為可以受蔗糖剪切活性在植物的頂端分裂組織中被特異增強的影響。在這個意義上,與相應的未作改造的野生型植物相比,蔗糖剪切活性在植物頂端分裂組織的非質(zhì)體中被特異增強將導致早成花;反之,蔗糖剪切活性在頂端分裂組織細胞的細胞質(zhì)中被特異增強將導致推遲成花。
文檔編號C12N15/82GK1330719SQ99814397
公開日2002年1月9日 申請日期1999年12月14日 優(yōu)先權日1998年12月14日
發(fā)明者麥克·拉譜, 阿諾德·G·海爾 申請人:馬克斯－普朗克－科學促進協(xié)會,柏林