專利名稱：受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及影響活體穩(wěn)態(tài)的內(nèi)分泌擾亂子及受該物質(zhì)影響之基因的檢測方法。
背景領(lǐng)域內(nèi)分泌擾亂子(常指環(huán)境激素)統(tǒng)指從環(huán)境中釋放的、已發(fā)現(xiàn)具有激素樣活性或抗激素活性的化學物質(zhì)。已報道由于內(nèi)分泌擾亂子對野生動物生態(tài)系統(tǒng)的影響，導致(其)生殖能力改變(尤其是雄性雌性化)、生殖能力下降、生育率降低、后代存活率降低、生殖行為異常和類似情況。盡管尚未證實，已懷疑由于內(nèi)分泌擾亂子對人類健康的影響，導致人類出現(xiàn)精子數(shù)目減少、子宮內(nèi)膜異位癥、不育、卵巢癌、子宮癌、前列腺癌和類似情況。
環(huán)境部“擾亂內(nèi)分泌的外源化學物工作組”在間期報告(1997年7月)中報導了認為產(chǎn)生內(nèi)分泌紊亂的物質(zhì)(或物質(zhì)群)。然而，此類物質(zhì)據(jù)認為在未來的研究和實驗期間還會增加。
已知確定內(nèi)分泌擾亂子的方法分為兩種，即體外方法和體內(nèi)方法。前者方法示例包括測量與雌激素或雄激素受體結(jié)合活性的方法，和測量激素合成酶系抑制活性的方法。后者方法示例包括測量出生后不同天數(shù)大鼠體內(nèi)多種激素的產(chǎn)生和異常的組織形成的方法，測量青蛙異常變態(tài)的方法和魚異常成熟的方法(分析化學(AnalyticalChemistry)，70(15)528A-532A(1998))。
然而，迄今尚未完全證實疑為內(nèi)分泌擾亂子的物質(zhì)是否確實產(chǎn)生內(nèi)分泌紊亂。另外，倘若它們產(chǎn)生內(nèi)分泌紊亂的話，尚未完全證實其影響機制以及可能會產(chǎn)生危險的攝入量和攝入時程。
例如，當前的受體結(jié)合實驗是必需和重要的初步篩選方法。然而，此方法所得的結(jié)果并不能保證內(nèi)分泌擾亂子的身份。具體地，雌二醇(一種天然雌激素)、二乙基己烯雌酚(一種合成的雌激素)、異黃酮(豆類含有的一種成分，對人無害)和二酚-A(疑為內(nèi)分泌擾亂子的物質(zhì))與雌激素受體結(jié)合，雖然每種物質(zhì)的EC50值各不相同。這樣，不能根據(jù)此分析方法確定每一物質(zhì)的內(nèi)分泌干擾活性程度。同樣，不能根據(jù)任何傳統(tǒng)方法來確定該活性，包括使用酵母或培養(yǎng)細胞的分析系統(tǒng)和稱重小鼠子宮的系統(tǒng)。
換句話說，當前測量激素受體結(jié)合活性或激素合成酶系抑制活性的方法是測定內(nèi)分泌擾亂子的必需條件。但其不是充分條件。另外，體內(nèi)測量對大鼠、青蛙、魚或類似物的生長或變態(tài)之影響的方法敏感性低且復雜，并需要長時間操作大量樣本。
還有，雖然可用上述傳統(tǒng)分析方法來分析可能的內(nèi)分泌擾亂子與受體的關(guān)系，但不能用其分析下游信號傳導系統(tǒng)。
如上所述，為解決環(huán)境激素的問題，需要鑒別內(nèi)分泌擾亂子和確定該物質(zhì)對內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響。這樣，需要一些方法來分析何種信號傳導通路受內(nèi)分泌擾亂子的影響和何種物質(zhì)產(chǎn)生內(nèi)分泌紊亂。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供(1)受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的檢測方法；(2)受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的檢測方法，包括通過該方法對所檢測基因的表達進行測量；(3)DNA陣列，其上固定有受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或源自該基因的DNA片段；和(4)可能產(chǎn)生內(nèi)分泌紊亂的物質(zhì)的檢測方法。
發(fā)明概述經(jīng)過大量研究，本發(fā)明者構(gòu)建了一種快速檢測許多受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的方法，該方法靈敏性高并能同時操作。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一種應用固定有所述基因或其片段的DNA陣列來檢測內(nèi)分泌擾亂子的方法。另外，本發(fā)明者構(gòu)建了一種可能會產(chǎn)生內(nèi)分泌紊亂的物質(zhì)的檢測方法。這樣，本發(fā)明得以完成。
總之，本發(fā)明涉及[1]受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的檢測方法，其特征在于該方法包括制備取自細胞、組織或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本，該細胞、組織或生物已經(jīng)與含一種內(nèi)分泌擾亂子的樣本相接觸；使該核酸樣本與一種DNA陣列雜交，該陣列上固定有可能受該內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或來自受該內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的DNA片段；和通過比較該結(jié)果與用對照樣本制備的核酸樣本所得結(jié)果，選擇受該內(nèi)分泌擾亂子影響的基因；[2]根據(jù)上述[1]的方法，其中應用的基因選自如下(1)核受體基因或與核受體轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)有關(guān)的基因；(2)與激酶類信號傳導有關(guān)的基因；(3)與性腺分化有關(guān)的基因；(4)與受體類激酶有關(guān)的基因；(5)與中間纖維標志有關(guān)的基因；(6)與細胞周期或生長調(diào)節(jié)有關(guān)的基因；(7)癌基因、與癌基因有關(guān)的基因或與腫瘤抑制有關(guān)的基因；(8)與凋亡有關(guān)的基因；(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關(guān)的基因；(10)受體基因與受體有關(guān)的基因；(11)與細胞死亡或分化調(diào)節(jié)有關(guān)的基因；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關(guān)的基因；(13)與促血管生成有關(guān)的基因；(14)與細胞侵襲有關(guān)的基因；(15)與細胞-細胞間的作用有關(guān)的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其調(diào)節(jié)因子的基因或與之有關(guān)的基因；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關(guān)的基因，或來自該基因的DNA片段。
內(nèi)分泌擾亂子的檢測方法，其特征在于該方法包括通過上述[1]或[2]的方法對所檢測基因的表達進行測量；[4]根據(jù)[3]的方法，其中內(nèi)分泌擾亂子選自以下類別(1)二氧芑(dioxins)；(2)有機氯化合物；(3)酚類；(4)鄰苯二甲酸酯；(5)芳香族烴；(6)殺蟲劑；(7)有機錫化合物(organotin)；(8)雌激素；或
(9)全氯五環(huán)癸烷(mirex)、毒殺芬(toxaphene)、丁醛肟威(aldicarb)或開蓬(kepone)；[5]可能干擾內(nèi)分泌的物質(zhì)的檢測方法，其特征在于該方法包括制備取自細胞、組織或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本，該細胞、組織或生物已經(jīng)與懷疑含有可能干擾內(nèi)分泌之物質(zhì)的樣本相接觸；使該核酸樣本與一種DNA陣列雜交，該陣列上固定有受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或來自受該內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的DNA片段；和通過比較該結(jié)果與用對照樣本制備的核酸樣本所得結(jié)果，檢測可能干擾內(nèi)分泌的物質(zhì)；[6]根據(jù)上述[5]的方法，其中將可能干擾內(nèi)分泌的物質(zhì)劃分為(1)二氧芑；(2)有機氯化合物；(3)酚類；(4)鄰苯二甲酸酯；(5)芳香族烴；(6)殺蟲劑；(7)有機錫化合物；(8)雌激素；或(9)全氯五環(huán)癸烷、毒殺芬、丁醛肟威或開蓬；[7]檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的DNA陣列，其上固定有受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或可能受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因，或該基因的DNA片段；[8]根據(jù)上述[7]的DNA陣列，其上固定的基因選自如下(1)核受體基因或與核受體轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)有關(guān)的基因；(2)與激酶類信號傳導有關(guān)的基因；(3)與性腺分化有關(guān)的基因；(4)受體類激酶的基因或與之有關(guān)的基因；(5)中間纖維標志基因或與之有關(guān)的基因；(6)與細胞周期或生長調(diào)節(jié)有關(guān)的基因；(7)癌基因、與癌基因有關(guān)的基因或與腫瘤抑制有關(guān)的基因；(8)與凋亡有關(guān)的基因；
(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關(guān)的基因；(10)受體基因與受體有關(guān)的基因；(11)與細胞死亡或分化調(diào)節(jié)有關(guān)的基因；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關(guān)的基因；(13)與促血管生成有關(guān)的基因；(14)與細胞侵襲有關(guān)的基因；(15)與細胞-細胞間的作用有關(guān)的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其調(diào)節(jié)因子的基因或與之有關(guān)的基因；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關(guān)的基因，或來自該基因的DNA片段；和[9]根據(jù)上述[7]或[8]的DNA陣列，其中該基因或來自該基因的DNA片段固定在載玻上。
發(fā)明詳述(1)本發(fā)明檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的方法如此處所用，內(nèi)分泌擾亂子(也稱為外源性內(nèi)分泌擾亂子或環(huán)境激素)是指進入動物活體時可影響活體內(nèi)天然產(chǎn)生的激素的正?；钚缘奈镔|(zhì)。內(nèi)分泌擾亂子包括保持、提高或抑制激素正?；钚缘奈镔|(zhì)?？赡苡绊懠に卣；钚缘奈镔|(zhì)也包括在此定義內(nèi)。
當前，約有70種物質(zhì)(或物質(zhì)群)疑為具有內(nèi)分泌擾亂活性。在相應物質(zhì)之分析方法的基礎(chǔ)上將日本環(huán)境化學協(xié)會第24次會議(1998)摘要中的物質(zhì)劃分如下(1)類別1有機氯化合物(如一般的有機氯化合物、多氯化聯(lián)苯(PCB))；(2)類別2酚類(如一般的酚、二酚-A、2，4-二氯酚、五氯酚)，(3)類別3鄰苯二甲酸酯(如一般的鄰苯二甲酸酯)；(4)類別4芳香烴(如苯并芘、二-2-乙基己基己二酸酯(DEHA)、二苯甲酮、4-硝基甲苯、苯乙烯二聚體和三聚體、1，2-二溴基-3-氯丙烷、正丁苯)；(5)類別5殺蟲劑(如一般的殺蟲劑、2，4，5-T(三氯苯氧乙酸)、2，4-D(二氯苯氧乙酸)、苯菌靈、氨基連三唑、乙肟威)；(6)類別6有機錫化合物；(7)雌激素；不能劃分入上述七種類別的二氧化物；和排除在這些類別之外的物質(zhì)，即全氯五環(huán)癸烷、毒殺芬、丁醛肟威或開蓬(十氯酮)。這些類別和物質(zhì)見表1。
表1


已知這些物質(zhì)具有以下基本活性1)對激素受體的直接活性(如合成的激素制劑、DDT、鄰苯二甲酸酯等)；2)通過其他受體的活性(如二氧化物等)；3)抑制代謝的活性(如類固醇代謝抑制劑、芳香酶或5α-還原酶抑制劑等)和4)通過其他系統(tǒng)的活性(如影響神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的物質(zhì))。這樣，它們的作用模式是不同的。[Kagaku(化學(Chemistry))，53(7)12-15(1998)]。
如此處所用，受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因定義為，與對照相比上述內(nèi)分泌擾亂子提高或抑制其表達的基因。該基因數(shù)可為一個、兩個或更多。其表達受內(nèi)分泌擾亂子直接或間接影響的某物質(zhì)基因或與之有關(guān)的基因，可作為固定在本發(fā)明的DNA陣列上的基因得以選擇?？蓛?yōu)選應用表達得以提高的基因和表達得以抑制的基因。優(yōu)選的此類候選基因(即可能受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因)的例子包括，但不限于，表2所示的基因，劃分如下(1)核受體基因或與核受體轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)有關(guān)的基因(核受體或核受體轉(zhuǎn)錄偶聯(lián))；(2)與激酶類信號傳導有關(guān)的基因(激酶類信號傳導)；(3)與性腺分化有關(guān)的基因(性腺分化)；(4)受體類激酶的基因或與之有關(guān)的基因(受體類激酶)；(5)中間纖維標志基因或與之有關(guān)的基因(中間纖維標志)；(6)與細胞周期或生長調(diào)節(jié)有關(guān)的基因(細胞周期和生長調(diào)節(jié)劑)；(7)癌基因、與癌基因有關(guān)的基因或與腫瘤抑制有關(guān)的基因(癌基因和腫瘤抑制因子)；(8)與凋亡有關(guān)的基因(凋亡)；(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關(guān)的基因(DNA損傷應答、修復或重組)；(10)受體基因與受體有關(guān)的基因(受體)；(11)與細胞死亡或分化調(diào)節(jié)有關(guān)的基因(細胞命運和發(fā)育調(diào)節(jié)因子)；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關(guān)的基因(細胞黏附、遷移和侵襲)；(13)與促血管生成有關(guān)的基因(血管生成的調(diào)節(jié)因子)；(14)與細胞侵襲有關(guān)的基因(侵襲調(diào)節(jié)因子)；(15)與細胞-細胞間的作用有關(guān)的基因(細胞-細胞間的作用)；(16)Rho家族、GTP酶或其調(diào)節(jié)因子的基因或與之有關(guān)的基因(Rho家族、小的GTP酶及其調(diào)節(jié)因子)；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關(guān)的基因(生長因子或細胞因子)。此外，其表達可能直接或間接受內(nèi)分泌擾亂子影響的其他物質(zhì)的基因或與之有關(guān)的基因，也包括在本發(fā)明受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因內(nèi)。
表2




















可能受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因例子還有已知與二乙基己烯雌酚、二酚-A、17β雌二醇及類似物質(zhì)結(jié)合的雌激素受體的基因，和與雌激素受體信號傳導通路有關(guān)的基因。
可如下所述來檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因。
如此處所用，DNA陣列是指其上固定有基因或該基因的DNA片段的支持物，包括所謂的DNA芯片。可以應用能夠用來雜交的任何支持物。一般使用承物玻璃、硅芯片、硝酸纖維素膜或尼龍膜或類似物。例如，可如下制備固定到該支持物上的基因或其DNA片段。以待固定基因或其產(chǎn)物的GenBank序列號所鑒定的堿基序列為基礎(chǔ)，應用引物分析/構(gòu)建軟件比如OligoTM引物分析軟件(Takara Shuzo)可以制備本發(fā)明方法中最佳的PCR擴增引物對。根據(jù)市售PCR試劑盒所附標準方法，通過使用該引物對和基因組DNA、基因組DNA文庫或cDNA文庫模板可以獲得感興趣的PCR擴增片段。產(chǎn)生的DNA片段可用例如Microcon-100(Takara Shuzo)純化。在本發(fā)明的方法中可優(yōu)選使用該純化的DNA片段。此外，根據(jù)已知方法例如通過向支持物中導入氨基，可以把該基因或其片段固定到該支持物上而制備DNA陣列。還有，通過應用制備DNA陣列的儀器比如自GMS制備DNA芯片的儀器來進行固定步驟，可以制備基因高密度排列并固定在其上的DNA陣列。
應用此類DNA陣列使同時測量核酸樣本中的多種核酸分子內(nèi)容物成為可能，并有利于用少量核酸樣本進行測量。
本發(fā)明使用的DNA陣列上固定有任何基因或其DNA片段。優(yōu)選地，使編碼有望具有內(nèi)分泌擾亂活性相關(guān)功能的蛋白質(zhì)的基因或源自該基因的DNA片段得以固定。若使用片段的話，可優(yōu)選使用例如約1kb長的片段，但該片段并不限于特定長度。只要該片段與測試樣本中的核酸特異性雜交，其長度可比上述長度長或短。此類基因的示例包括但不限于，激素受體基因、編碼受體輔因子的基因、編碼與受體信號傳導有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因、編碼與激素的生物合成或代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因和癌基因。
例如，取自對內(nèi)分泌擾亂子敏感的細胞或組織(器官)的mRNA或用該mRNA作模板逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，可用來作為含有因內(nèi)分泌擾亂子影響而發(fā)生表達改變的基因的核酸樣本。此類mRNA在經(jīng)過一段時間后或在接觸內(nèi)分泌擾亂子后不同天數(shù)獲得。
接觸含有內(nèi)分泌擾亂子的樣本的細胞可以是自有機體收集的細胞，或是培養(yǎng)細胞。只要該組織可能受內(nèi)分泌擾亂子的影響，其并不限于特定組織。還有，所用的細胞或組織或有機體的來源并不限于人類。根據(jù)所用的有機體、內(nèi)分泌擾亂子、受此內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或類似物(的不同)，與內(nèi)分泌擾亂子的接觸時間的長短可以變化。
另一方面，使同樣取自對照細胞、組織或有機體的、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本在嚴格條件下進行雜交?？蓪υ摵怂針颖具M行如下恰當標記，這樣可以輕松確定是否該核酸樣本與DNA或DNA陣列雜交。
例如，可用放射性同位素、熒光物質(zhì)、化學發(fā)光物質(zhì)、被合適的抗體識別的抗原或類似物進行標記?；蛘撸墒紫冗M行雜交而不標記，然后用能發(fā)出熒光或化學發(fā)光的嵌入物質(zhì)來標記。
可根據(jù)已知的方法使所得核酸樣本與DNA陣列上的DNA進行雜交。自然地，根據(jù)DNA陣列上的DNA長度在最佳條件下進行雜交和沖洗步驟。這些步驟可在例如分子克隆，實驗室手冊，第二版，9.52-9.55(1989)頁所屬的條件下進行。
通過比較對照核酸樣本的雜交結(jié)果與取自已接觸了含有一內(nèi)分泌擾亂子的樣本的細胞、組織或有機體的核酸樣本所得結(jié)果，可以檢測兩種核酸樣本中信號強度明顯不同的基因。具體地，使陣列與標記如上的核酸樣本雜交。應用具體的測量儀器比如層析譜或圖象分析儀來檢測雜交陣列的放射活性、熒光、發(fā)光或類似物的信號強度。在信號強度差異的基礎(chǔ)上可以檢測因一內(nèi)分泌擾亂子影響而發(fā)生顯著表達變化的基因。
通過應用能夠檢測多種標記(如兩類熒光)的多波長檢測熒光分析儀，可以比較同一DNA陣列上對照核酸樣本的基因表達和同一DNA陣列上接觸了一內(nèi)分泌擾亂子的細胞、組織或有機體的核酸樣本的基因表達。例如，使取自接觸有一內(nèi)分泌擾亂子的細胞的核酸樣本熒光標記上Cy3-dUTP，而對照樣本熒光標記上Cy5-dUTP。通過等量混合核酸樣本并使該混合物與DNA陣列雜交而表現(xiàn)出的顏色差異，可以檢測兩種核酸樣本基因表達的差異。根據(jù)結(jié)果可檢測因該內(nèi)分泌擾亂子影響而發(fā)生顯著表達變化的基因。
該基因也可用作檢測一內(nèi)分泌擾亂子的指數(shù)。
通過比較作為表達水平指數(shù)的信號強度和用對照樣本制備的核酸樣本所得信號強度，來選擇受一內(nèi)分泌擾亂子影響的基因。例如，通過使含有一內(nèi)分泌擾亂子的樣本的熒光信號值除以對照樣本的熒光信號值來計算數(shù)值。數(shù)值大于1.00表示用受試物質(zhì)處理可促進該基因的表達。數(shù)值小于1.00表示用受試物質(zhì)處理可抑制該基因的表達。數(shù)值等于1.00表示用受試物質(zhì)處理不影響該基因的表達。若促進表達的話，該數(shù)值大于1.10，優(yōu)選1.30，更優(yōu)選2.00。若抑制表達的話，該數(shù)值小于0.90，優(yōu)選0.80，更優(yōu)選0.70。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法可同時、體外、快速并高敏地計策手內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的表達(例如細胞內(nèi)核受體基因和參與下游信號傳導通路的大量基因)。另外，可能會發(fā)現(xiàn)已知基因參與曾經(jīng)未知的信號傳導通路。
(2)如下所述應用受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的表達作為指數(shù)，可以檢測該內(nèi)分泌擾亂子。
制備一種DNA陣列，如上所述其上固定有已證實受一內(nèi)分泌擾亂子影響的基因。
如上所述制備懷疑受該內(nèi)分泌擾亂子影響的細胞、組織或有機體的核酸樣本。再如上所述使該核酸樣本進行雜交。以信號強度之間的差異為基礎(chǔ)可確定基因表達的變化。以結(jié)果為基礎(chǔ)可確定該內(nèi)分泌擾亂子的存在。
在另一實施方案中，可如下確定一內(nèi)分泌擾亂子的存在。制備與已證實受該內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的mRNA相競爭的RNA或DNA。用該RNA或DNA作為內(nèi)標物進行競爭性RT-PCR。然后通過RT-PCR定量確定受影響基因的表達水平。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的方法，用受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因(如細胞內(nèi)核受體基因或大量下游基因的一種)的表達作為指數(shù)可基本并輕松判定該內(nèi)分泌擾亂子存在與否。
(3)可如下檢測可能干擾內(nèi)分泌的物質(zhì)此處所用的可能干擾內(nèi)分泌的物質(zhì)是指可能影響活體內(nèi)天然分泌的激素之正常活性的物質(zhì)。該定義包括活性已得到證實和活性尚未得到證實的物質(zhì)。
按照上述(1)所述方法，通過以上述方式固定已證實受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因來制備檢測可能干擾內(nèi)分泌之物質(zhì)的DNA陣列。
如上所述，從已接觸懷疑含有可能干擾內(nèi)分泌之物質(zhì)的樣本的細胞、組織或有機體制備核酸樣本。再如上所述使該核酸樣本進行雜交。以信號強度之間的差異為基礎(chǔ)可確定基因表達的變化。以結(jié)果為基礎(chǔ)可判定作為內(nèi)分泌擾亂子的物質(zhì)。
不僅在DNA陣列上全部DNA發(fā)生信號變化的情況下，而且在部分DNA發(fā)生變化的情況下，基于所得結(jié)果可認為某物質(zhì)是內(nèi)分泌擾亂子。具體地，若發(fā)現(xiàn)部分DNA發(fā)生強度變化，按照上述(1)的方法可通過再選擇受該物質(zhì)作用影響的基因來優(yōu)化檢測方法，這樣可更確切地檢測與該物質(zhì)一樣產(chǎn)生內(nèi)分泌紊亂的物質(zhì)。
在另一實施方案中，如上所述制備與已證實受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的mRNA相競爭的RNA或DNA。用該RNA或DNA作為內(nèi)標物進行競爭性RT-PCR?；诨虻谋磉_可定量檢測內(nèi)分泌擾亂程度。可優(yōu)選使用任何方法來檢測或定量如上述(1)所述獲得的受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的表達，只要該方法能用于檢測/定量該基因。
(4)本發(fā)明的DNA陣列此處所用的DNA陣列是指其上固定有基因或其DNA片段的支持物，并包括所謂的DNA芯片。
能夠用于雜交的任何支持物可用于本發(fā)明的DNA陣列。一般地，使用承物玻璃、硅芯片、硝酸纖維素或尼龍膜或類似物。優(yōu)選地，可優(yōu)先使用由無孔并具有光滑表面的材料制成的支持物(如玻璃比載玻片)?？墒褂帽砻嫔峡赏ㄟ^共價鍵或非共價鍵固定DNA的任何支持物。優(yōu)選使用表面具有親水或疏水功能基的支持物。支持物表面的優(yōu)選功能基的例子包括但不限于，羥基、氨基、巰基和醛基、羧基和?；Ｔ摴δ芑梢允侵С治锉旧淼谋砻嫣匦?，或可通過表面處理將其導入。表面處理的支持物的例子包括用市售的硅偶聯(lián)劑比如氨基烷基硅處理或用聚陽離子比如多聚賴氨酸或多聚乙烯亞胺處理的玻璃。一些處理的載玻片可購得。
將內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或其DNA片段固定在本發(fā)明的DNA陣列上。該DNA陣列可以是DNA微陣列，其中在變性條件下將基因或其DNA片段的雙鏈DNAs排列并固定到同一支持物上。至少一部分固定的DNA可以是單鏈。此處的DNA陣列可通過在變性條件下將雙鏈DNA點排到同一支持物上來制備。本發(fā)明DNA陣列的排列密度沒有具體的限制。例如，可優(yōu)選使用高密度的DNA陣列比如DNA以100點/平方厘米或更高密度固定在其上的陣列。
本發(fā)明中待排列和固定到支持物上的DNA片段沒有具體限制。大體上，優(yōu)先使用長度為50個堿基或更多的雙鏈多聚核苷酸或其衍生物，通過聚合酶鏈反應(PCR)或類似物進行酶促擴增而制備之，并在固定到支持物上時通過為固定DNA而發(fā)生的變性，將其轉(zhuǎn)化為單鏈DNA或其衍生物。該衍生物可發(fā)生促使其固定到支持物表面上的修飾。衍生物的例子包括但不限于，該DNA 5’端導入功能基比如氨基或巰基的DNA。
例如，用基因組DNA文庫或cDNA文庫作為模板通過PCR或類似方法擴增的DNA可用作固定到支持物上的基因或DNA片段。也可使用以已知的核苷酸序列為基礎(chǔ)合成的寡聚核苷酸。本領(lǐng)域已知能夠用于雜交的非DNA的核酸(例如通過體外轉(zhuǎn)錄制備的RNA)可替代DNA進行固定。根據(jù)已知方法例如通過向支持物導入氨基，使該基因或其DNA片段固定到支持物上，可制備DNA陣列。通過應用DNA陣列制備儀比如自GMS制備DNA芯片的儀器進行固定，可制備本發(fā)明的DNA陣列，其上排列和固定有基因。
使編碼具有參與激素活性發(fā)揮之功能的蛋白質(zhì)的基因或其片段固定到本發(fā)明使用的DNA陣列上。若使用片段的話，雖然該片段的長度沒有具體限制，可優(yōu)選使用例如長度約100b到約1kb的片段。只要該片段與受試樣本的核酸特異性雜交，其長度可短或長于上述長度。此類基因的例子包括但不限于，激素受體基因、編碼受體輔因子的基因、編碼與受體信號傳導有關(guān)蛋白質(zhì)的基因、編碼與激素的生物合成或代謝有關(guān)蛋白質(zhì)的基因、癌基因及類似物。另外，可固定例如根據(jù)上述(1)中的方法所得的手內(nèi)分泌擾亂子影響的基因。還有，既然所有受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因可根據(jù)上述(1)的方法獲得，可制備檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的DNA陣列，其上固定有全部此類基因。
如上所述，通過應用本發(fā)明的方法和DNA陣列，可體外、快速并高敏地檢測例如細胞內(nèi)核受體基因和與下游信號傳導通路有關(guān)的基因。這樣，可基本上并輕松判定可能干擾內(nèi)分泌之物質(zhì)的存在與否。
以下實施例將進一步詳細說明本發(fā)明，但無意限制本發(fā)明的范圍。
實施例1受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因見表3所示。
表3


如下制備含有3’非翻譯區(qū)、約1kb的這些基因的cDNA片段。
簡而言之，用人類或小鼠的細胞或組織的mRNA(Clontech)做模板，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)來擴增興趣cNDA片段。通過分析堿基序列來證實所擴增的cDNA是興趣片段。乙醇沉淀回收所擴增的片段，以1μM濃度溶于10mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)。另外，同樣制備看家基因β肌動蛋白基因和陰性對照PUC18質(zhì)粒。用制備DNA芯片(GMS)的儀器將這些片段點到已導入氨基(Sigma)的承物玻璃上并通過紫外照射固定。承物玻璃先用0.2％SDS沖洗，隨后用蒸餾水沖洗，干燥后便制成DNA陣列。
實施例2(1)給小鼠給藥將10只雌性小鼠(2天大)分成內(nèi)分泌擾亂子給藥組和不給藥組。以0.1mg/小鼠/天的給藥劑量向每只給藥組的小鼠靜脈注射可能干擾內(nèi)分泌的己烯雌酚(DES)，注射兩天。在第4天去卵巢，用mRNA提取試劑盒(Qiagen)制備mRNA。用混合物進行CDNA合成反應，每一混合物含有約3μg mRNA、寡聚DT引物、Cy3-dUTP(Amersham)(給藥組)或Cy5-dUTP(Amersham)(非給藥組)dNTPS和逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco-BRL)?；旌衔锝?jīng)凝膠濾過，減壓濃縮，溶于4XSSC/0.2％SDS以制備熒光標記的cDNA。
(2)培養(yǎng)細胞的處理在含5％胎牛血清(FBS)的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)人乳腺癌細胞MCF-7。胰酶消化后以2×105個細胞/孔鋪于12孔板內(nèi)。在同樣的培養(yǎng)基中溫育細胞24小時。去除培養(yǎng)基后在含有或沒有10pM 17β-雌二醇、含5％人類血清的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞72小時，該人血清已通過碳-葡聚糖處理而去除類固醇激素。收集細胞并按照實施例2-(1)所述提取mRNAs。
用混合物進行cDNA合成反應，每一混合物含有3μg的mRNA、寡聚dT引物、Cy3-dUTP(接觸17β-雌二醇的細胞)、Cy5-dUTP(不接觸17β-雌二醇的細胞)、dNTPS和逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco-BRL)。該混合物經(jīng)凝膠濾過，減壓濃縮，溶于4XSSC/0.2％SDS以制備熒光標記的cDNA。
(3)使標記的cDNA與DNA陣列雜交將上述(1)制備的等量的Cy3-標記cDNA和Cy5-標記cDNA一起混合并且進行熱變性。將5μl的混合物加到如實施例1制備的DNA陣列上。將蓋玻片放在混合物上且其邊緣用薄膜密封。在40-45℃溫育10小時之后，去除蓋玻片。DNA陣列用0.2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC各沖洗30分鐘，然后風干。應用微陣列掃描儀(GMS)分析在DNA陣列上各個點的熒光信號。而且，對上述(2)中獲得的標記的DNA進行相似的操作。
結(jié)果，觀察到DES給藥小鼠的卵巢和接觸17-β雌二醇的MCF-7細胞有明顯的信號改變。這樣，可發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌擾亂子影響的基因。
實施例3
(1)制備DNA陣列從列在實施例1表3中的基因里選取33個基因。所選基因在表4中列出。β-肌動蛋白基因和pBR322質(zhì)粒分別用作看家基因和作為陰性對照。
表4


應用在表4中列出的相應的引物對，依據(jù)實施例1中描述的方法來制備這些基因的大約100b到1kb的cDNA片段，并且將其點到支持物上以制備DNA陣列。應用人UniGene DNA(遺傳學研究)所含的相應的基因的引物來擴增組織蛋白酶G、NGF受體和CSF1受體基因。
(2)測定內(nèi)分泌擾亂子的影響測定用多種內(nèi)分泌擾亂子對培養(yǎng)細胞處理2或24小時所造成的影響。
處理2小時在含有10％胎牛血清(FBS)的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞。用胰蛋白酶消化后，將2×106細胞種植于10cm培養(yǎng)皿上。將這些細胞在含有5％胎牛血清(FBS)的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，該血清已用活性碳-葡聚糖處理而去除了類固醇激素。在去除培養(yǎng)基后，將這些細胞在含有10nM17-β雌二醇(E2)、10 nM己烯雌酚(DES)或5μM二酚-A(BisA)的相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2小時。作為對照，也同樣制備不在這些化學物質(zhì)中培養(yǎng)的細胞。如實施2(1)中所述收集該處理的細胞，并提取總RNAs。
處理24小時在含有10％胎牛血清(FBS)的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞。用胰蛋白酶消化后，將2×106細胞種植于10cm培養(yǎng)皿上。在相同的培養(yǎng)基中將該細胞溫育24小時。在去除培養(yǎng)基后，將這些細胞在含有5％人血清和10nM17-β雌二醇(E2)、10 nM己烯雌酚(DES)或5μM二酚-A(BisA)的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，該人血清用活性碳-葡聚糖處理已去除類固醇激素。作為對照，也同樣制備不在這些化學物質(zhì)中培養(yǎng)的細胞。如實施2(1)中所述收集該處理的細胞，并提取總RNAs。
(3)用DNA酶處理在上述(2)中制備的總RNAs。制備12μl含有大約100-300μg總RNA、10μl10×AMV緩沖液(生命科學)和10U的DNA酶I(Takara Shuzo)的反應混合物，37℃溫育10分鐘，用苯酚/氯仿提取兩次，然后進行乙醇沉淀。部分用來測定所產(chǎn)生的總RNAs的濃度。
(4)應用在上述(3)制備的總RNAs中的一種來進行逆轉(zhuǎn)錄反應。反應混合物的成分如下所述。
反應混合物A大約130μg總RNA、10μg寡聚-dT引物(TakaraShuzo)和20μl經(jīng)焦碳酸二乙酯(DEPC，Wakeo Pure化學工廠)處理的水。
反應混合物B12μl5×AMV核糖核酸酶緩沖液(生命科學)、0.5mM的dATP、dCTP和dGTP、0.2mMdTTP、60U RNA酶抑制劑(Takara Shuzo)和0.1mMCy3-標記dUTP(Amersham Pharmacia)。
在70℃將反應混合物A溫育10分鐘，然后在冰上冷卻。向其加入反應混合物B，所產(chǎn)生的混合物在42℃下溫育5分鐘。向其加入大約60U的AMVRNA酶(生命科學)。再加入DEPC-處理的水使最終容量達60μl。所產(chǎn)生的RT反應混合物在42℃下溫育70分鐘。向反應混合物加入7.5μl 500mM EDTA溶液和15μl的1M氫氧化鈉。在60℃將該混合物溫育1小時以降解模板RNA。冷卻至室溫后，向該混合物中加入37.5μl 1M的tris-鹽酸(PH7.5)。應用MICROCON YM-30(Millipore)將該溶液濃縮至20μl，向其加入200μl含有1 mM EDTA的10mMtris-鹽酸，然后將產(chǎn)生的混合物濃縮至20μl。這樣獲得的Cy3標記的cDNA溶液用于后來的雜交。
(5)將上述(4)中制備的Cy3標記的cDNA熱變性，并且將整個溶液加到上述(1)制備的DNA陣列上。將蓋玻片放在混合物上并且其邊緣用薄膜密封。在40-45℃溫育10小時之后，去除蓋玻片。DNA陣列用0.2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC各沖洗30分鐘，然后風干。應用微陣列掃描儀(GMS)分析在DNA陣列上各個點的熒光信號。一種物質(zhì)處理的樣本的熒光信號值除以對照樣本的熒光信號值而獲得的代表性數(shù)值見表5。在表5中，數(shù)值高于1.00表示通過該物質(zhì)處理后該基因的表達增強。數(shù)值低于1.00表示通過該物質(zhì)處理后該基因的表達降低。數(shù)值等于1.00表示通過該試驗物質(zhì)處理后該基因的表達未受影響。
表5

在許多情況下，可能由內(nèi)分泌擾亂活性干擾所致的野生動物生殖的異常和人類精子生成能力的降低，認為是由特定階段的內(nèi)分泌活動信號降低和受到干擾所造成的。因此，認為除過度表達的基因外，應注意與對照細胞的表達相比表達受到抑制的基因。例如，如表5所示，在本實施例1所用的基因中，發(fā)現(xiàn)E2刺激后許多認為與雌激素作用密切相關(guān)的基因表達上調(diào)(例如P300/CBP、ACTR、RIP140、TIF2、PDGF受體和VEGF受體基因)，但關(guān)于其通路、機制或類似機理知之甚少。用可干擾內(nèi)分泌的DES處理24小時可活化除C-Myc外幾乎所有的基因。發(fā)現(xiàn)DES處理2小時可抑制N-CoR/SMRT和ARA70(核受體或核受體轉(zhuǎn)錄偶聯(lián))、P38γ(數(shù)據(jù)未列)和JNK2(激酶類信號傳導)及PDGF受體(受體類激酶)基因的表達。另一方面，用懷疑具有內(nèi)分泌擾亂活性的BisA處理2小時可抑制ACTR(核受體或核受體轉(zhuǎn)錄偶聯(lián))和VEGF受體(受體類激酶)基因的表達。認為BisA處理后對基因的影響要小于DES刺激后所觀察到的影響。BisA處理24小時抑制JNK2和BMK2(激酶類信號傳導)及VEGF受體(受體類激酶)基因的表達。這樣，發(fā)現(xiàn)BisA處理后對基因表達的控制方式不同于DES刺激。如上所述，應用本發(fā)明的芯片提供了一種方法，其中，根據(jù)處理物質(zhì)和處理時間的不同發(fā)現(xiàn)表達信號有明顯的變化?？擅黠@檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因尤其是表達受內(nèi)分泌擾亂子抑制的基因。
工業(yè)應用如上所述，本發(fā)明的方法是很有效的，因為其能同時、體外、快速和高敏地檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響的大量基因。而且，本發(fā)明提供可用來快速并高敏地檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的DNA陣列。本發(fā)明的方法也可用來檢測參與未知信號傳導通路的基因。另外，本發(fā)明的高效性還在于，采用據(jù)本發(fā)明方法所得的大量受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的表達作指數(shù)，可判定內(nèi)分泌擾亂子或可能干擾內(nèi)分泌的物質(zhì)存在與否。
序列表SEQ ID NO1所設(shè)計的擴增Smad3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO2所設(shè)計的擴增Smad3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO3所設(shè)計的擴增VEGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO4所設(shè)計的擴增VEGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO5所設(shè)計的擴增ACTR mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO6所設(shè)計的擴增ACTR mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO7所設(shè)計的擴增N-CoR/SMRT mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO8所設(shè)計的擴增N-CoR/SMRT mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO9所設(shè)計的擴增efp mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO10所設(shè)計的擴增efp mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO11所設(shè)計的擴增c-Myc1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO12所設(shè)計的擴增c-Myc1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO13所設(shè)計的擴增維生素D受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO14所設(shè)計的擴增維生素D受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO15所設(shè)計的擴增c-Myc2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO16所設(shè)計的擴增c-Myc2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO17所設(shè)計的擴增Bax mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO18所設(shè)計的擴增Bax mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO19所設(shè)計的擴增JNK1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO20所設(shè)計的擴增JNK1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO21所設(shè)計的擴增p38 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO22所設(shè)計的擴增p38 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO23所設(shè)計的擴增TRIP1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO24所設(shè)計的擴增TRIP1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO25所設(shè)計的擴增ARA70 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO26所設(shè)計的擴增ARA70 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO27所設(shè)計的擴增胰島素受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO28所設(shè)計的擴增胰島素受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO29所設(shè)計的擴增PDGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO30所設(shè)計的擴增PDGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO31所設(shè)計的擴增CSF1受體-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO32所設(shè)計的擴增CSF1受體-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO33所設(shè)計的擴增FGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO34所設(shè)計的擴增FGF受體mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO35所設(shè)計的擴增p38γmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO36所設(shè)計的擴增p38γmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO37所設(shè)計的擴增Bcl-X mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO38所設(shè)計的擴增Bcl-X mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO39所設(shè)計的擴增c-Myc3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO40所設(shè)計的擴增c-Myc3 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO41所設(shè)計的擴增PS2蛋白質(zhì)mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO42所設(shè)計的擴增PS2蛋白質(zhì)mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO43所設(shè)計的擴增乳鐵蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO44所設(shè)計的擴增乳鐵蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO45所設(shè)計的擴增RIP140 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO46所設(shè)計的擴增RIP140 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO47所設(shè)計的擴增TIF2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO48所設(shè)計的擴增TIF2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO49所設(shè)計的擴增JNK2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO50所設(shè)計的擴增JNK2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO51所設(shè)計的擴增BaxδmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO52所設(shè)計的擴增BaxδmRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO53所設(shè)計的擴增BMK-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO54所設(shè)計的擴增BMK-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO55所設(shè)計的擴增BMK-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO56所設(shè)計的擴增BMK-2 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO57所設(shè)計的擴增Src-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO58所設(shè)計的擴增Src-1 mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO59所設(shè)計的擴增P300/CBP mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO60所設(shè)計的擴增P300/CBP mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO61所設(shè)計的擴增β肌動蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
SEQ ID NO62所設(shè)計的擴增β肌動蛋白mRNA的寡聚核苷酸引物。
序列表<110>Takara Shuzo co..Ltd.<120>檢測受環(huán)境內(nèi)分泌影響之基因的方法<130>661516<150>.JP 10-310285<151>1998-10-30<160>62<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增Smad3 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>1caggtgtccc atcggaagg 19<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增Smad3 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>2ctctctggta gtggtaggga tt 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增VEGF受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>3tacaagatcg acgttagctc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增VEGF受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>4cagccaaatt cacagttaaa 20<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增ACTR mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>5gctttgaaga tataatccga aggt24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增ACTR mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>6ggcctggtga tgacagagta gataa 25<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增N-CoR/SMRT mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>7tatggaggac cctatgaaag tgta24<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增N-CoR/SMRT mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>8ttacgaccat gttctactag acctt 25<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增efp mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>9cgccgtgaag acgtgcttgg 20<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增efp mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>10tcttggtcag gctctgttca atctc 25<210>11<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增c-Myc-1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>11cgccaagctc gtctca 16<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增c-Myc-1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>12tcaactgttc tcgtcgtttc 20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增vit D受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>13caaacgctgt gtggacatcg g 21<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增vit D受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>14ttctggatca tcttggcata gag 23<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增c-Myc-2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>15gtagtaattc cagcgagagg 20<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增c-Myc-2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>16ctatgggcaa agtttcgtg 19<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增Bax mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>17tgttttctga cggcaacttc 20<210>18<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增Bax mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>18gagcactccc gccacaa 17<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增JNK1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>19gagcagaagc aagcgtgac 19<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增JNK1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>20gacattgatg tacgggtgtt 20<210>21<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增p38 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>21gtgcccgagc gttacca 17<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增p38 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>22aaagttcatc ttcggcatct 20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增TRIP1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>23aaatgctaaa gttcgcctat 20<210>24<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增TRIP 1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>24acatggactc gccgttct18<210>25<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增ARA 70 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>25agttgcataa gccgtcac 18<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增ARA 70 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>26actagccaat ctgataggtc 20<210>27<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增胰島素受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>27gctgccacca atacgtcatt 20<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增胰島素受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>28gcatcctgcc catcgaact 19<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增PDGF受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>29tcaccattcc atgccgagta acaga 25<210>30<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增PDGF受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>30aggacagtgg gcggtgggta gg 22<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增CSF1受體-2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>31ccaccctgaa tgaagtcaac20<210>32<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增CSF1受體-2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>32ggtggatgga ttaagactga 20<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增FGF受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>33cagactccgg cctctatgct 20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增FGF受體mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>34gggcttccag aacggtcaac 20<210>35<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增p38γmRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>35tgatcgggct gctggacgta ttc 23<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增p38γmRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>36agagggcttg cattggtcag gatag 25<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增Bcl-X mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>37ccgggagctg gtggttgact tt 22<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增Bcl-X mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>38ttcttaccca gccgccgttc t 21<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增c-Myc-3 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>39gtagtaattc cagcgagagg20<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增c-Myc-3 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>40ctatgggcaa agtttcgtg 19<210>41<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增pS2蛋白質(zhì)mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>41ggcccagaca gagacgtgta 20<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增pS2蛋白質(zhì)mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>42gctcgatggt attaggatag aa 22<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增乳鐵蛋白mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>43ggagctgcgc aagtgtaac 19<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增乳鐵蛋白mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>44attagtaatg cctgcgacat 20<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增RIP 140 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>45gcctctttgc ttcagtcatt 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增RIP140 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>46ttggcttagg tatagtctgg 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增TIF2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>47tccaaggcaa gatcacgtct 20<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增TIF2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>48aagccaacga tgaccctaat 20<210>49<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增JNK2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。tatagtgtcc aagtggcaga ctcaa 25<210>50<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增JNK2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物．<400>50atgtatgggt gacgcagagc ttc 23<210>51<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增BoxδmRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物．<400>51gatgattgcc gccgtggaca caga24<210>52<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增BoxδmRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物．<400>52ggtgagcact cccgccacaa agatg 25<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增BMK-1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物．<400>53ttaaagcccg ctccttcgat gtgac25<210>54<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增BMK-1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物．<400>54ggcggtcggc acctgggtac act23<210>55<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增BMK-2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>55ggtggccatc aagaagatcc ctaat 25<210>56<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增BMK-2 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>56cctcacgcct tgcatggaag tcct24<210>57<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增Src-1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>57gtatgaatga aggacccaat aactc 25<210>58<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增Src-1 mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>58ctggcaggat ctccgatttg a 21<210>59<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增p300/CBP mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>59ttcagtcacc aacgtgccaa atatg25<210>60<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增p300/CBP mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>60ttagagctgc gggatcaggt gtt 23<210>61<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增β-肌動蛋白mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>61caagagatgg ccacggctgc t 21<210>62<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>為擴增β-肌動蛋白mRNA所設(shè)計的寡聚核苷酸引物。<400>62tccttctgca tcctgtcggc a 2權(quán)利要求
1.檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的方法，其特征在于該方法包括制備取自細胞、組織或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本，該細胞、組織或生物已經(jīng)與含一種內(nèi)分泌擾亂子的樣本相接觸；使該核酸樣本與一種DNA陣列雜交，該陣列上固定有可能受該內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或來自受該內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的DNA片段；和通過比較該結(jié)果與用對照樣本制備的核酸樣本所得結(jié)果，選擇受該內(nèi)分泌擾亂子影響的基因；
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中應用的基因選自如下(1)核受體基因或與核受體轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)有關(guān)的基因；(2)與激酶類信號傳導有關(guān)的基因；(3)與性腺分化有關(guān)的基因；(4)受體類激酶基因或與之有關(guān)的基因；(5)中間纖維標志基因或與之有關(guān)的基因；(6)與細胞周期或生長調(diào)節(jié)有關(guān)的基因；(7)癌基因、與癌基因有關(guān)的基因或與腫瘤抑制有關(guān)的基因；(8)與凋亡有關(guān)的基因；(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關(guān)的基因；(10)受體基因與受體有關(guān)的基因；(11)與細胞死亡或分化調(diào)節(jié)有關(guān)的基因；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關(guān)的基因；(13)與促血管生成有關(guān)的基因；(14)與細胞侵襲有關(guān)的基因；(15)與細胞-細胞間的作用有關(guān)的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其調(diào)節(jié)因子的基因或與之有關(guān)的基因；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關(guān)的基因，或來自該基因的DNA片段。
3.檢測內(nèi)分泌擾亂子的方法，其特征在于該方法包括通過權(quán)利要求1或2的方法對所檢測基因的表達進行測量；
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中內(nèi)分泌擾亂子選自以下類別(1)二氧芑；(2)有機氯化合物；(3)酚類；(4)鄰苯二甲酸酯；(5)芳香族烴；(6)殺蟲劑；(7)有機錫化合物；(8)雌激素；或(9)全氯五環(huán)癸烷、毒殺芬、丁醛肟威或開蓬。
5.可能干擾內(nèi)分泌的物質(zhì)的檢測方法，其特征在于該方法包括制備取自細胞、組織或生物、含有mRNA或其cDNA的核酸樣本，該細胞、組織或生物已經(jīng)與懷疑含有可能干擾內(nèi)分泌之物質(zhì)的樣本相接觸；使該核酸樣本與DNA陣列雜交，該陣列上固定有受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或來自受該內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的DNA片段；和通過比較該結(jié)果與用對照樣本制備的核酸樣本所得結(jié)果，檢測可能干擾內(nèi)分泌的物質(zhì)；
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中將可能干擾內(nèi)分泌的物質(zhì)劃分為(1)二氧芑；(2)有機氯化合物；(3)酚類；(4)鄰苯二甲酸酯；(5)芳香族碳氫化合物；(6)殺蟲劑；(7)有機錫化合物；(8)雌激素；或(9)全氯五環(huán)癸烷、毒殺芬、丁醛肟威或開蓬。
7.檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的DNA陣列，其上固定有受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或可能受內(nèi)分泌擾亂子影響的基因，或該基因的DNA片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的DNA陣列，其上固定的基因選自如下(1)核受體基因或與核受體轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)有關(guān)的基因；(2)與激酶類信號傳導有關(guān)的基因；(3)與性腺分化有關(guān)的基因；(4)受體類激酶的基因或與之有關(guān)的基因；(5)中間纖維標志基因或與之有關(guān)的基因；(6)與細胞周期或生長調(diào)節(jié)有關(guān)的基因；(7)癌基因、與癌基因有關(guān)的基因或與腫瘤抑制有關(guān)的基因；(8)與凋亡有關(guān)的基因；(9)與DNA損傷應答、修復或重組有關(guān)的基因；(10)受體基因與受體有關(guān)的基因；(11)與細胞死亡或分化調(diào)節(jié)有關(guān)的基因；(12)與細胞黏附、遷移或侵襲有關(guān)的基因；(13)與促血管生成有關(guān)的基因；(14)與細胞侵襲有關(guān)的基因；(15)與細胞-細胞間的作用有關(guān)的基因；(16)Rho家族、GTP酶或其調(diào)節(jié)因子的基因或與之有關(guān)的基因；和(17)生長因子或細胞因子的基因或與之有關(guān)的基因，或來自該基因的DNA片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的DNA陣列，其中該基因或來自該基因的DNA片段固定在承物玻璃片上。
全文摘要
檢測受內(nèi)分泌擾亂子影響之基因的方法,其特征在于(該方法)包括制備源自細胞、組織或有機體、含mRNA的核酸樣本或其cDNA,該細胞、組織或有機體已接觸了含該內(nèi)分泌擾亂子的樣本;使該核酸樣本與已固定有可能受該內(nèi)分泌擾亂子影響的基因或其DNA片段的DNA陣列雜交;然后比較所得結(jié)果與用其他源自對照樣本的核酸樣本所得結(jié)果,從而選擇受該內(nèi)分泌擾亂子影響的基因。
文檔編號C12N15/12GK1331754SQ99814877
公開日2002年1月16日 申請日期1999年10月28日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月30日
發(fā)明者近藤昭宏, 佐川裕章, 峰野純一, 君塚房夫, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社