專利名稱：增加骨礦化的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般地，本發(fā)明涉及藥物學(xué)產(chǎn)品和方法，更具體地，本發(fā)明涉及適用于增加骨礦質(zhì)含量的方法和組合物。這些組合物和方法可用以治療多種疾病，包括例如骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松癥、骨折和其它以低骨礦質(zhì)密度為特征的疾病。
背景技術(shù)：
在一個個體的一生中會出現(xiàn)兩或三個明顯的骨質(zhì)(bone mass)改變期(見Riggs，West J.Med.15463-77，1991)。第一期在男性和女性中均會出現(xiàn)，并持續(xù)至達(dá)到峰值骨質(zhì)。此第一期通過軟骨內(nèi)生長板的線性生長和由于骨膜對合(periosteal apposition)的速度引起的徑向生長來實現(xiàn)。對于小梁骨(扁骨例如椎骨和骨盆)，第二期開始于大約30歲，對于皮質(zhì)骨(例如肢體中的長骨)則開始于大約40歲，并持續(xù)到老年。此期的特征在于緩慢的骨丟失，并且在男性和女性中均會發(fā)生。在女性中，還會出現(xiàn)骨丟失的第三期，其原因極可能是絕經(jīng)后的雌激素缺乏。僅在此期，女性可再從皮質(zhì)骨丟失10％的骨質(zhì)，從小梁區(qū)室丟失25％的骨質(zhì)(見Riggs，同上)。
骨礦質(zhì)含量的丟失可以由多種情況引起，并可以導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)問題。例如，骨質(zhì)疏松癥是一種使人衰弱的疾病，其特征在于患病個體中骨骼骨質(zhì)和礦質(zhì)密度的明顯降低，骨的結(jié)構(gòu)退化包括骨微體系結(jié)構(gòu)(microarchitecture)的降解，和相應(yīng)的骨脆性以及骨折易發(fā)性的增加。人類的骨質(zhì)疏松癥是由臨床上的骨質(zhì)減少(比年輕成年骨的骨礦質(zhì)密度平均值低一個以上至2.5個以下標(biāo)準(zhǔn)差的骨礦質(zhì)密度)發(fā)展來的，在美國有大約2千5百萬人患有骨質(zhì)減少病。在美國另外有7-8百萬名患者已被診斷患有臨床骨質(zhì)疏松癥(定義為比成熟的年輕成年骨的骨礦質(zhì)含量平均值低2.5個以上標(biāo)準(zhǔn)差的骨礦質(zhì)含量)。對于健康護(hù)理系統(tǒng)而言，骨質(zhì)疏松癥是花費最大的疾病之一，在美國每年花費幾百億美元。除了健康護(hù)理相關(guān)的費用外，長期的居住護(hù)理和工作日損失也增加了該疾病的經(jīng)濟(jì)和社會耗費。全球大約7千5百萬人有患骨質(zhì)疏松癥的危險。
在人類群體中骨質(zhì)疏松癥的頻率隨年齡的增加而增加，在高加索人中女性的骨質(zhì)疏松癥頻率尤為突出(在美國，女性骨質(zhì)疏松癥患者占骨質(zhì)疏松癥總患者的80％)。老年人骨骼骨脆性和骨折易發(fā)性的增加由于該群體有較高的意外跌倒危險性而變得更為嚴(yán)重。在美國每年有超過1.5百萬的骨質(zhì)疏松相關(guān)骨折的報道。髖骨、腕和椎骨骨折是骨質(zhì)疏松相關(guān)的最常見損傷。尤其是髖骨骨折對于患者而言是極為不便和費錢的，而且對于婦女髖骨骨折與高死亡率和發(fā)病率相關(guān)。
盡管骨質(zhì)疏松已被確定為由于骨質(zhì)降低引起的骨折危險性提高，但現(xiàn)有的骨骼疾病治療方案尚不能相當(dāng)大程度地增加成年人的骨密度。所有的醫(yī)師都強烈體會到需要能夠增加成年人骨密度的藥物，尤其是增加易于發(fā)生骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松的腕骨、脊柱骨和髖骨的骨密度的藥物。
目前防止骨質(zhì)疏松的策略可以給個體提供一些益處，但不能確保消除該疾病。這些策略包括隨著高齡的開始要節(jié)制身體活動(尤其是負(fù)重活動)，在飲食中包括充足的鈣，并避免食用含酒精或煙草的產(chǎn)品。對于表現(xiàn)為臨床骨質(zhì)減少或骨質(zhì)疏松的患者，所有目前的治療藥物和策略均旨在通過抑制骨吸收進(jìn)程來減少骨質(zhì)的進(jìn)一步喪失，骨吸收是組成型發(fā)生的骨重塑過程中的一個天然組成部分。
例如，目前雌激素被用來延緩骨損失。然而，就是否對患者有長期益處和是否對75歲以上的患者有作用，有一些爭議。而且，雌激素的使用被認(rèn)為會增加患乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的危險性。
高劑量的食物鈣加上或不加維生素D也被建議用于絕經(jīng)后的婦女。然而，高劑量鈣經(jīng)常會有令人不快的胃腸道副作用，而且必須對血清和尿的鈣水平進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(見Khosla和Rigss，Mayo Clin.Proc.70978-982，1995)。
其它建議使用的治療方法包括使用降鈣素、二膦酸酯(bisphosphonate)、促蛋白合成甾類和氟化鈉。然而，這些治療方法均有可能妨礙其使用的不良副作用(例如，盡管骨密度獲得適度增加，但降鈣素和甾類會引起惡心并激發(fā)免疫反應(yīng)，二膦酸酯和氟化鈉可以抑制骨折修復(fù))(見Khosla和Rigss，同上)。
目前實行的治療策略均不涉及刺激或增強新骨質(zhì)生長的藥物。本發(fā)明提供能用于增加骨礦化并因此可以用于治療多種期望增加骨質(zhì)的疾病的組合物和方法。而且，本發(fā)明提供了相關(guān)的其它益處。
發(fā)明概述如上所述，本發(fā)明提供一種新的TGF-β結(jié)合蛋白類型或家族，用于篩選增加骨礦質(zhì)含量和骨礦質(zhì)密度的化合物的方法，增加骨礦質(zhì)含量和骨礦質(zhì)密度的化合物，和在多種疾病的治療或預(yù)防中使用這些化合物的方法。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供分離的核酸分子，其中所述核酸分子選自(a)含有SEQ ID NOs.1、5、7、9、11、13或15，或它們的互補序列的分離核酸分子；(b)在高嚴(yán)緊條件下與(a)的核酸分子特異雜交的分離核酸分子；和(c)根據(jù)(a)或(b)的編碼TGF-β結(jié)合蛋白的分離核酸分子。在本發(fā)明的相關(guān)方面中，提供基于與上述定義序列之一的僅一部分發(fā)生的雜交(例如對于(a)，可以是與選自SEQ ID NO.1的第156-539位或第555-687位核苷酸的至少20、25、50或100個核苷酸的探針發(fā)生的雜交)的分離核酸分子。應(yīng)當(dāng)是很明顯的，用于雜交的必需嚴(yán)緊性可以根據(jù)探針的大小而改變。例如，對于25個堿基的探針，高嚴(yán)緊條件可以包括60mM Tris pH8.0，2mM EDTA，5×Denhardt氏液，6×SSC，0.1％(w/v)N-十二烷基肌氨酸(N-laurylsarcosin)，0.5％(w/v)NP-40(乙基苯基聚乙二醇)，45℃過夜，之后用0.2×SSC/0.1％SDS于45-50℃洗滌兩次。對于低嚴(yán)緊條件下100個堿基的探針，適合的條件可以包括5×SSPE，5×Denhardt氏液，和0.5％SDS于42-50℃過夜，之后用2×SSPE(或2×SSC)/0.1％SDS于42-50℃洗滌兩次。
在本發(fā)明的相關(guān)方面中，提供根據(jù)Wilbur-Lipman算法與SEQ ID NOs.1、5、7、9、11、13或15有50％、60％、75％、80％、90％、95％或98％水平的同源性的分離核酸分子。例如，這樣的核酸分子的代表性例子包括編碼含有SEQ ID NOs.2、6、10、12、14、或16的蛋白質(zhì)的核酸分子，或根據(jù)Lipman-Pearson算法與這些序列有50％、60％、75％、80％、90％、95％或98％水平的同源性的核酸分子。
典型地，分離的核酸分子小于100kb，而且在某些實施方案中，小于50kb、25kb、10kb、或甚至5kb。而且，在其它實施方案中，分離的核酸分子在其它無關(guān)核酸分子的“文庫”(例如，亞克隆BAC，如GenBank登記號AC003098和EMB登記號AQ171546中描述的)中是不存在的。然而，可以在相關(guān)分子的文庫(例如用于改組的文庫，如美國專利5,837,458；5,830,721；和5,811,238中描述的)中找到分離的核酸分子。最后，本文所描述的分離核酸分子不包括編碼Dan、Cerberus、Gremlin或SCGF(美國專利5,780,263)的核酸分子。
本發(fā)明還提供含有上述核酸分子的克隆載體，和含有可操作地與上述核酸分子之一連接的啟動子(例如調(diào)節(jié)序列)的表達(dá)載體。合適啟動子的代表性例子包括組織特異性啟動子和基于病毒的啟動子(例如CMV I-E等基于CMV的啟動子、SV40早期啟動子和MuLV LTR)。表達(dá)載體也可以基于或來源于病毒(例如“病毒載體”)。病毒載體的代表性例子包括單純皰疹病毒載體、腺病毒載體、腺病毒伴隨病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。本發(fā)明還提供含有或包含任何上述載體的宿主細(xì)胞(包括例如人、猴、狗、大鼠或小鼠來源的宿主細(xì)胞)。
在本發(fā)明的其它方面中，提供了制備TGF-β結(jié)合蛋白的方法，包括步驟在足以產(chǎn)生TGF-β結(jié)合蛋白的時間和條件下培養(yǎng)上述含載體的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步的實施方案中，可以對通過該方法產(chǎn)生的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步純化(例如通過柱層析、親和純化以及諸如此類的方法)。因此，根據(jù)本申請的公開可以容易地制備上述核酸分子所編碼的分離蛋白質(zhì)(例如SEQ ID NOs.2、4、6、8、10、12、14或16)。
還應(yīng)該指出的是，上述蛋白質(zhì)或其片段可以以融合蛋白的形式產(chǎn)生。例如，在一個方面，提供了包含第一多肽片段和第二多肽片段的融合蛋白，其中第一多肽片段含有上述核酸分子所編碼的TGF-β結(jié)合蛋白或其至少10、20、30、50或100個氨基酸長的部分，第二多肽片段含有非TGF-β結(jié)合蛋白。在某些實施方案中，該第二多肽可以是適于純化或識別的尾端(tag)(例如含有多個陰離子氨基酸殘基的多肽-見美國專利4,851,341)、標(biāo)記(例如綠色熒光蛋白或堿性磷酸酶)、或毒性分子(例如篦麻毒素)。
在本發(fā)明的另一方面中，提供了能夠特異結(jié)合上述TGF-β結(jié)合蛋白類型(例如人BEER)的抗體。在多種實施方案中，該抗體可以是(例如人或鼠來源的)多克隆抗體或單克隆抗體。在進(jìn)一步的實施方案中，該抗體是保留了整個抗體的結(jié)合特性的抗體片段(例如F(ab’)2，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)ab’，F(xiàn)ab或Fv片段，或甚至是CDR)。本發(fā)明還提供能夠產(chǎn)生或表達(dá)上述抗體的雜交瘤和其它細(xì)胞。
在本發(fā)明的相關(guān)方面中，本發(fā)明提供了檢測TGF-β結(jié)合蛋白的方法，包括步驟在足以允許上述抗體與TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合的時間和條件下孵育所述抗體，并檢測該結(jié)合。在多種實施方案中，抗體可以與固相支持物結(jié)合以利于洗滌或分離，和/或可以是標(biāo)記的(例如用選自酶、熒光蛋白和放射性同位素的標(biāo)記)。
在本發(fā)明的其它方面中，本發(fā)明提供了與根據(jù)SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13、15、17或18或它們的互補序列的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下雜交的分離寡核苷酸。在進(jìn)一步的實施方案中，該寡核苷酸可以在編碼SEQ ID NOs.2、4、6、8、10、12、14或16的序列中找到。在某些實施方案中，該寡核苷酸長至少15、20、30、50或100個核苷酸。在進(jìn)一步的實施方案中，用另一個分子(例如酶、熒光分子或放射性同位素)標(biāo)記該寡核苷酸。本發(fā)明還提供能夠特異擴(kuò)增編碼TGF-β結(jié)合蛋白的上述核酸分子的全部或部分的引物。這里所用術(shù)語“特異擴(kuò)增”應(yīng)當(dāng)理解為是指擴(kuò)增上述TGF-β結(jié)合蛋白，而非其它TGF-β結(jié)合蛋白例如Dan、Cerberus、Gremlin或SCGF(美國專利5,780,263)的引物。
在本發(fā)明的相關(guān)方面中，提供了檢測編碼TGF-β結(jié)合蛋白的核酸分子的方法，包括步驟在高嚴(yán)緊條件下孵育上述寡核苷酸，并檢測所述寡核苷酸的雜交。在某些實施方案中，該寡核苷酸可以是標(biāo)記的和/或與固相支持物結(jié)合的。
在本發(fā)明的其它方面中，提供了能夠切割編碼上述TGF-β結(jié)合蛋白之一(例如SEQ ID NOs.2、6、8、10、12、14或16)的RNA的核酶。該核酶可以由DNA、RNA(包括2’-O-甲基核糖核酸)、核酸類似物(例如具有硫代磷酸酯鍵的核酸)或它們的混合物組成。還提供編碼這些核酶的核酸分子(例如DNA或cDNA)，以及能夠表達(dá)或產(chǎn)生這些核酶的載體。載體的代表性例子包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、粘粒和基于病毒的載體(例如，至少部分從逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、或腺伴隨病毒產(chǎn)生的病毒載體)。本發(fā)明還提供含有這些載體的宿主細(xì)胞(例如，人、狗、大鼠或小鼠細(xì)胞)。在某些實施方案中，可以用載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的更進(jìn)一步的方面，提供通過合成或體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生核酶的方法。在更進(jìn)一步的實施方案中，可以對由此產(chǎn)生的核酶作進(jìn)一步純化和/或?qū)⑵渲瞥伤幬锝M合物(例如該核酶或編碼該核酶的核酸分子和藥物學(xué)上可接受的載體或稀釋劑一起)。同樣，可以將本文描述的反義寡核苷酸和抗體或其它選定分子制成藥物組合物。
在本發(fā)明的其它方面中，提供含有可與根據(jù)SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13或15或其互補序列的核酸分子雜交的核酸分子的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸抑制本文所述的TGF-β結(jié)合蛋白(例如人BEER)的表達(dá)。在多種實施方案中，該寡核苷酸長15、20、25、30、35、40或50個核苷酸。優(yōu)選地，該寡核苷酸的長度小于100、75或60個核苷酸。應(yīng)該易于明了的是，該寡核苷酸可以含有一或多種核酸類似物、核糖核酸或脫氧核糖核酸。而且，該寡核苷酸可以由一個或多個鍵(linkage)修飾，這些鍵包括例如共價鍵如硫代磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、磷酸甲酯鍵、亞甲基(甲基亞胺基)鍵、嗎啉代鍵(morpholino linkage)、酰胺鍵、聚酰胺鍵、短鏈烷基糖間鍵、環(huán)烷基糖間鍵、短鏈雜原子糖間鍵和雜環(huán)糖間鍵。嵌合寡核苷酸的一個代表性例子見美國專利5,989,912。
在本發(fā)明的再一方面，提供用于增加骨礦化的方法，包括向恒溫動物導(dǎo)入有效量的上述核酶。在相關(guān)方面中，該方法包括步驟在利于核酸分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生該核酶的條件下，向患者導(dǎo)入有效量的能產(chǎn)生期望核酶的本文所描述核酸分子或載體。
在本發(fā)明的其它方面，提供轉(zhuǎn)基因非人動物。在一個實施方案中，提供其生殖細(xì)胞和體細(xì)胞含有編碼上述TGF-β結(jié)合蛋白的核酸分子的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述核酸分子可操作地與可有效表達(dá)該基因的啟動子相連，該基因是在胚胎階段導(dǎo)入該動物或該動物祖先的，且條件是所述動物并非人類。在其它實施方案中，提供轉(zhuǎn)基因敲除動物，包括其生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中至少有一個可與編碼上述TGF-β結(jié)合蛋白的核酸分子雜交的內(nèi)源性核酸分子等位基因被破壞的動物，其中與不帶有該破壞的動物相比，該破壞阻止了從所述等位基因轉(zhuǎn)錄信使RNA，且條件是該動物并非人類。在多種實施方案中，該破壞是核酸缺失、替代或插入。在其它實施方案中，該轉(zhuǎn)基因動物是小鼠、大鼠、綿羊、豬或狗。
在本發(fā)明另外方面，提供用于檢測TGF-β結(jié)合蛋白基因表達(dá)的試劑盒，其包括一個含有核酸分子的容器，其中該核酸分子選自(a)含有SEQID Nos1、3、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列的核酸分子；(b)含有(a)之核苷酸序列的互補序列的核酸分子；(c)是長度為至少15、20、30、50、75或100個核苷酸的(a)或(b)的片段的核酸分子。還提供用于檢測TGF-β結(jié)合蛋白的試劑盒，該試劑盒包含一個含有一種本文所述的TGF-β結(jié)合蛋白抗體的容器。
例如，在本發(fā)明的一個方面，提供用于確定所選分子是否能夠增加骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟(a)將一種或多種候選分子與權(quán)利要求1的核酸分子編碼的TGF-β結(jié)合蛋白，以及TGF-β蛋白質(zhì)家族的一個選定成員(例如BMP5或6)相混合，(b)測定該侯選分子是否改變了TGF-β家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(signaling)，或改變了TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員的結(jié)合。在某些實施方案中，該分子改變TGF-β起間充質(zhì)細(xì)胞分化的正調(diào)節(jié)物作用的能力。在本發(fā)明的此方面，該侯選分子可以通過例如減少(如抑制)或增加(如增強)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或結(jié)合來改變信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或結(jié)合。
在另一方面，提供用于確定所選分子是否能夠增加骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟確定所選分子是否抑制TGF-β結(jié)合蛋白與骨或其類似物的結(jié)合。骨或其類似物的代表性例子包括羥基磷灰石和通過活組織檢查獲得的人原始骨樣品。
在以上列舉的方法的某些實施方案中，該所選分子包含在分子混合物中，而且這些方法可以進(jìn)一步包括步驟分離在該測定中發(fā)揮功能的一種或多種分子。在其它實施方案中，將TGF-β蛋白質(zhì)家族結(jié)合在固相支持物上并測量TGF-β結(jié)合蛋白的結(jié)合，或者將TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合在固相支持物上并測量TGF-β蛋白質(zhì)的結(jié)合。
利用諸如以上描述的方法，可以分析多種分子通過抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β蛋白質(zhì)家族的結(jié)合增加骨礦質(zhì)含量的能力。這些分子的代表性例子包括蛋白質(zhì)或肽、有機(jī)分子和核酸分子。
在本發(fā)明的其它相關(guān)方面中，提供用于增加恒溫動物骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟給恒溫動物施用治療上有效量的從本文所列舉分析方法鑒定的分子。在另一方面，提供用于增加恒溫動物骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟給恒溫動物施用治療上有效量的抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β蛋白質(zhì)超家族，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)結(jié)合的分子。適合分子的代表性例子包括反義分子、核酶、核酶基因和特異識別并改變TGF-β結(jié)合蛋白活性的抗體(例如人源化抗體)。
在本發(fā)明的另一方面，提供用于增加恒溫動物骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟(a)向返回骨的細(xì)胞導(dǎo)入指導(dǎo)抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β蛋白質(zhì)家族和骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)結(jié)合的分子表達(dá)的載體，和(b)給恒溫動物施用該含有載體的細(xì)胞。如本文中所用的，應(yīng)該理解，如果細(xì)胞在外周施用后定位在骨基質(zhì)中，則細(xì)胞“返回骨”。在一個實施方案中，該方法還包括，在導(dǎo)入步驟之前，從骨髓分離返回骨的細(xì)胞。在再一實施方案中，返回骨的細(xì)胞選自CD34+細(xì)胞和成骨細(xì)胞。
在本發(fā)明的其它方面，提供抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β蛋白質(zhì)超家族結(jié)合的(優(yōu)選分離的)分子。
在另一些實施方案中，該分子可以以組合物的形式提供，而且可以進(jìn)一步含有骨吸收抑制物。這些抑制物的代表性例子包括降鈣素、雌激素、二膦酸酯、具有抗吸收活性的生長因子和三苯氧胺。
可以用于前述治療方法中的分子的代表性例子包括例如核酶、核酶基因、反義分子和/或抗體(例如人源化抗體)。依據(jù)這些分子的選擇，它們可以用來改變、拮抗或激動本文所述的TGF-β結(jié)合蛋白家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或結(jié)合。
在本發(fā)明的各種實施方案中，上述治療或預(yù)防的分子和方法可以用于疾病例如骨質(zhì)疏松癥、骨軟化、牙周病、壞血病、庫欣病(Cushing’sDisease)、骨折和由于肢體不動和類固醇使用引起的疾病。
參考如下詳細(xì)說明和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將是明顯的。此外，本文給出了各種更為詳細(xì)地描述某些程序和組合物(例如質(zhì)粒等)的文獻(xiàn)，并因此將它們完整地以參考文獻(xiàn)方式并入。
附圖簡要說明

圖1是人Dan、人Gremlin、人Cerberus和人Beer的氨基酸序列比較示意圖。箭頭指示半胱氨酸骨架。
圖2總結(jié)了從對各種組織進(jìn)行TGF-β結(jié)合蛋白基因，具體是人Beer基因表達(dá)研究獲得的結(jié)果。使用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法，從由總RNA合成的第一鏈cDNA擴(kuò)增該基因的一部分(在實施例2A中有更為詳細(xì)的描述)。
圖3總結(jié)了使用與小鼠Beer轉(zhuǎn)錄本互補的cRNA探針進(jìn)行小鼠胚胎切片RNA原位雜交所獲得的結(jié)果(在實施例2B中有更為詳細(xì)的描述)。A組為10.5dpc胚胎的橫向切片。B組是12.5dpc胚胎的縱向切片，C組和D組是15.5dpc胚胎的縱向切片。
圖4說明了通過Western印跡分析顯示的三種不同多克隆抗體對于它們各自抗原的特異性(在實施例4中有更詳細(xì)地描述)。圖4A顯示了抗人Beer抗體對于人Beer抗原，而非人Dan或人Gremlin的特異反應(yīng)性。圖4B顯示了抗人Gremlin抗體對于人Gremlin抗原，而非人Beer或人Dan的特異反應(yīng)性。圖4C顯示了抗人Dan抗體對于人Dan抗原，而非人Beer或人Gremlin的特異反應(yīng)性。
圖5說明了通過Western印跡分析顯示的TGF-β結(jié)合蛋白Beer對BMP-5和BMP-6，而非BMP-4的選擇性(在實施例5中有更詳細(xì)地描述)。
圖6闡明了TGF-β結(jié)合蛋白Beer與BMP-5之間的離子相互作用具有15-30nM范圍的解離常數(shù)。
發(fā)明詳述定義在詳細(xì)陳述本發(fā)明之前，闡明某些術(shù)語的定義并列出和定義下文將用到的縮寫，可能對于本發(fā)明的理解是有用的。
“分子”應(yīng)理解為包括蛋白質(zhì)或肽(例如抗體、重組結(jié)合伴侶(bindingpartner)、具有期望結(jié)合親和性的肽)、核酸(例如DNA、RNA、嵌合核酸分子和核酸類似物如PNA)；和有機(jī)或無機(jī)化合物。
“TGF-β”應(yīng)理解為包括任何已知或新的TGF-β超家族成員，該TGF-β超家族也包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)。
“TGF-β受體”應(yīng)理解為是指對于TGF-β超家族(包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP))的特定成員具有特異性的受體。
“TGF-β結(jié)合蛋白”應(yīng)理解為是指對于TGF-β超家族(包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP))的特定成員或子集具有特異結(jié)合親和性的蛋白質(zhì)。TGF-β結(jié)合蛋白的具體例子包括SEQ ID NOs.1、5、7、9、11、13和15所編碼的蛋白質(zhì)。
抑制“TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β蛋白質(zhì)家族和骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)的結(jié)合”應(yīng)理解為是指，通過除去TGF-β或阻止TGF-β與TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合，從而允許激活TGF-β或骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)，或允許TGF-β家族成員包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)與其各自的受體結(jié)合的分子。該抑制可以通過例如抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β超家族的特定成員結(jié)合的分子來實現(xiàn)。
“載體”是指能夠指導(dǎo)目的蛋白質(zhì)表達(dá)的裝置。載體必須包括可操作地與目的基因連接的轉(zhuǎn)錄啟動子元件。載體可以由脫氧核糖核酸(“DNA”)、核糖核酸(“RNA”)、或兩者的結(jié)合(例如DNA-RNA嵌合物)組成。任選地，載體可以包括聚腺苷酸化序列、一或多個限制性位點、以及一或多個選擇標(biāo)記例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶或潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。此外，依據(jù)所選宿主細(xì)胞和所用載體，還可以在本文所述的載體中并入其它遺傳元件例如復(fù)制起點、其它的核酸限制性位點、增強子、賦予轉(zhuǎn)錄可誘導(dǎo)性的序列、和選擇標(biāo)記。
“分離的核酸分子”是非整合在生物體基因組DNA中的核酸分子。例如，從真核細(xì)胞的基因組DNA中分離的編碼TGF-β結(jié)合蛋白的DNA分子即是分離的DNA分子。分離的核酸分子的另一個例子是非整合在生物體基因組中的化學(xué)合成核酸分子。該分離核酸分子可以是基因組DNA、cDNA、RNA，或至少部分由核酸類似物組成。
“會離的多肽”是基本上不帶有污染細(xì)胞成分例如本質(zhì)上與該多肽相聯(lián)的碳水化合物、脂質(zhì)或其它蛋白性質(zhì)雜質(zhì)的多肽。在某些實施方案中，如果看起來一個特定的蛋白質(zhì)制品在考馬斯亮蘭染色的SDS-PAGE凝膠上表現(xiàn)為單一條帶，則它含有分離的多肽。當(dāng)指有機(jī)分子時，“分離的”意味著采用本領(lǐng)域熟知方法(例如NMR、熔點法)測定時，該化合物具有大于90％的純度。
“硬化性狹窄(Sclerostenosis)”是Hansen(1967)用以指一種疾病的術(shù)語(Hansen，H.G.，Sklerosteose.InOpitz，H.；Schmid，F(xiàn).，Handbuch der Kinderheikunde.BerlinSpringer(出版)6 1967，第351-355頁)，該疾病類似于范布肯姆全身性骨化層肥厚病，但可能有如下不同骨改變的放射性表現(xiàn)，和許多案例中食指和中指的不對稱皮膚并指(趾)現(xiàn)象的存在。在該疾病中下頜具有不尋常的正方形外觀。
“人源化抗體”是重組蛋白質(zhì)，其中鼠單克隆抗體的互補決定區(qū)已從鼠免疫球蛋白的重和輕可變鏈轉(zhuǎn)移至人的可變區(qū)。
正如本文所用，“抗體片段”是指抗體的部分例如F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab等等。無論結(jié)構(gòu)如何，抗體片段與完整抗體所識別的相同抗原結(jié)合。例如，抗TGF-β結(jié)合蛋白單克隆抗體片段與TGF-β結(jié)合蛋白表位結(jié)合。
術(shù)語“抗體片段”也包括通過結(jié)合特異抗原形成復(fù)合物來象抗體一樣起作用的任何合成蛋白質(zhì)或遺傳工程蛋白質(zhì)。例如，抗體片段包括由輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的分離片段、由重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的“Fv”片段、通過肽接頭連接輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的重組單鏈多肽分子(“sFv蛋白質(zhì)”)、和由模擬高變區(qū)的氨基酸殘基構(gòu)成的最小識別單位。
“可檢測標(biāo)記(label)”是可以和抗體部分結(jié)合產(chǎn)生對于診斷有用的分子的分子或原子?？蓹z測標(biāo)記的例子包括螯合劑、光敏劑、放射性同位素、熒光試劑、順磁離子、酶和其它標(biāo)記物(marker)部分。
如本文所用，“免疫結(jié)合物(immunoconjugate)”是含有抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體或抗體片段，和可檢測標(biāo)記的分子。免疫結(jié)合物在結(jié)合(conjugation)之后具有與結(jié)合之前大致上相同的，或僅輕微降低的結(jié)合TGF-β結(jié)合蛋白的能力。
縮寫TGF-β-“轉(zhuǎn)化生長因子-β”；TGF-βBP-“轉(zhuǎn)化生長因子-β結(jié)合蛋白”(一種代表性的TGF-βBP稱為“人Beer”)；BMP-“骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)”；PCR-“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”；RT-PCR-在第一步使用逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)將RNA首先轉(zhuǎn)錄成DNA的PCR方法；cDNA-通過將RNA序列拷貝成DNA形式所產(chǎn)生的任何DNA。
如上所述，本發(fā)明提供一種新的TGF-β結(jié)合蛋白類型，以及用于增加恒溫動物的骨礦質(zhì)含量的方法和組合物。簡單地說，本發(fā)明以如下意外發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)編碼TGF-β結(jié)合蛋白家族一個新成員的基因的突變導(dǎo)致了稀有疾病(硬化性狹窄)，該疾病的特征在于與正常個體相比患者骨礦質(zhì)含量高了1-4倍。因此，正如以下將更為詳細(xì)地討論的，該發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致開發(fā)了可以用于篩選抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β蛋白質(zhì)家族和骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)相結(jié)合的分子的方法，以及使用這些分子增加恒溫動物(包括例如人)的骨礦質(zhì)含量的方法。
對稱為硬化性狹窄的疾病的討論硬化性狹窄是Hansen(1967)應(yīng)用于一種疾病的術(shù)語(Hansen，H.G.，Sklerosteose.InOpitz，H.；Schmid，F(xiàn).，Handbuch derKinderheikunde.BerlinSpringer(出版)6 1967，第351-355頁)，該疾病類似于范布肯姆全身性骨化層肥厚病，但骨改變的放射性表現(xiàn)可能不同，而且在許多案例中存在食指和中指的不對稱皮膚并指(趾)現(xiàn)象。
現(xiàn)已知道硬化性狹窄是一種以成年時期廣泛播散性骨硬化損傷(disseminated sclerotic lesions of the bone)為特征的常染色體半顯性疾病。該疾病是進(jìn)行性的。硬化性狹窄還有一個與并指(趾)(兩個或多個指(趾)融合在一起)相關(guān)的發(fā)育問題。硬化性狹窄綜合征與巨型身高相關(guān)，許多患病個體達(dá)到6英尺高或更高。純合子的骨礦質(zhì)含量可以比正常個體高1-6倍，而且骨礦質(zhì)密度可以比正常值(例如，從未患病同胞獲得的值)高1-4倍。
硬化性狹窄綜合征主要在南非荷蘭人血統(tǒng)的Afrikaaner人中發(fā)生。在Afrikaaner群體中大約1/140的個體是該突變基因的攜帶者(雜合子)。該突變表現(xiàn)出100％的外顯率。關(guān)于不帶有相關(guān)病理學(xué)特征(并指(趾)或頭骨過度生長)的雜合子中骨礦質(zhì)密度增加也有軼事報道。
目前，似乎在硬化性狹窄中還沒有垂體一下丘腦軸的異常。尤其是，似乎還沒有生長激素和可的松的過度產(chǎn)生。此外，在患病個體中性激素水平正常。然而，骨更新標(biāo)記(bone turnover markers)(成骨細(xì)胞特異性堿性磷酸酶、骨鈣素、I型原膠原C’前肽(PICP)，以及總的堿性磷酸酶；(見Comier，C.，Curr.Opin.in Rheu.7243，1995))指示有與該疾病相關(guān)的高成骨細(xì)胞活性(hyperosteoblastic activity)，但破骨細(xì)胞活性正常至輕微降低，這是用骨吸收標(biāo)記(吡啶啉、脫氧吡啶啉、N-端肽、尿羥脯氨酸、血漿酒石酸抗性酸性磷酸酶和半乳糖基羥賴氨酸(見Comier，同上))測量的。
硬化性狹窄的特征在于在患病個體的一生中全身骨骼骨的持續(xù)沉積。在純合子中骨礦質(zhì)的持續(xù)沉積導(dǎo)致在缺乏機(jī)械刺激感受器的骨骼區(qū)域(頭骨、頜、顱骨)中骨的過度生長。在患硬化性狹窄的純合子中，頭骨的過度生長導(dǎo)致顱壓迫，并最終由于腦干所受到的過高流體靜壓導(dǎo)致死亡。在骨骼的所有其它部分，出現(xiàn)普通性和彌散性硬化。長骨的皮質(zhì)區(qū)極大地增厚，導(dǎo)致骨長度的顯著增加。小梁連接(trabecular connections)增厚，而這又增加了小梁骨的強度。硬化骨表現(xiàn)出不尋常的X射線不透性。
正如實施例1中將更詳細(xì)描述的，負(fù)責(zé)硬化性狹窄綜合征的這種稀有遺傳突變定位在人第17號染色體編碼TGF-β結(jié)合蛋白家族一個新成員的區(qū)域(該新成員的一個代表性例子稱為“人Beer”)。如下文將更為詳細(xì)地描述的，基于該發(fā)現(xiàn)，骨礦化機(jī)制獲得了更為全面的理解，從而允許開發(fā)測定增加骨礦化的分子的方法，以及這些分子在增加骨礦質(zhì)含量和治療或預(yù)防許多疾病中的應(yīng)用。
TGF-β超家族轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族包含各種(在二級和三級水平上)具有共同的序列元件和結(jié)構(gòu)基序的生長因子。已知該蛋白質(zhì)家族在眾多的細(xì)胞類型上執(zhí)行著廣泛的生物學(xué)反應(yīng)。其中許多在胚胎發(fā)育期間模式的形成和組織的特化中發(fā)揮著重要作用；在成年個體中它們參與例如傷口愈合和骨修復(fù)及骨重塑，以及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。除了三種TGF-β外，該超家族還包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)、活化素、抑制素、生長和分化因子(GDF)以及膠質(zhì)來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)。通過將特定蛋白質(zhì)劃入普通亞家族的一般序列特征，建立初級分類。由于較小群體的成員間更為嚴(yán)格的序列保守性，在亞家族中進(jìn)行其它分層是可能的。在某些情況中，例如對于BMP-5、BMP-6和BMP-7，這可以是此較小群體成員間的高達(dá)75％的氨基酸同源性。這種一致性水平使得單個代表性序列即可說明將此子群體與較大家族的其它成員分開的此子群體的關(guān)鍵生化元件。
TGF-β通過誘導(dǎo)I型和II型受體形成異寡聚體復(fù)合物(hetero-oligomeric complexes)來實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。已經(jīng)測定了TGF-β2的晶體結(jié)構(gòu)。TGF-β2的通常折疊形式含有一個由三個二硫橋形成的穩(wěn)定緊湊的半胱氨酸節(jié)狀結(jié)構(gòu)。通過一個二硫橋穩(wěn)定的二聚化是反向平行的。
TGF-β家族成員通過結(jié)合具有內(nèi)在絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的受體來起始其細(xì)胞作用。該受體家族由兩個亞家族組成，表示為I型和II型受體。TGF-β家族的每個成員均與I型和II型受體的一個特征性組合相結(jié)合，這兩種受體均是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的。在目前的TGF-β受體激活模型中，首先TGF-β與II型受體(TbR-II)結(jié)合，這以具有激活的激酶活性的寡聚形式在細(xì)胞膜中發(fā)生。之后，在缺乏TbR-II時不能與配體結(jié)合的I型受體(TbR-I)被吸收進(jìn)該復(fù)合物中。然后，主要在近膜區(qū)的富含甘氨酸和絲氨酸殘基的域(GS域)中TbR-II使TbR-I磷酸化，并由此激活TbR-I。
迄今已鑒定了7種I型受體和5種II型受體。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)是決定人體骨礦質(zhì)密度的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)骨形成理解方面的主要進(jìn)展是骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)，又稱生骨蛋白質(zhì)(OP)的鑒定，該蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)體內(nèi)軟骨和骨的分化。BMP/OP通過一連串級聯(lián)事件誘導(dǎo)軟骨內(nèi)的骨分化，這些事件包括軟骨的形成、軟骨的過量生長和鈣化、血管入侵、成骨細(xì)胞的分化、和骨的形成。如上所述，BMP/OP(BMP 2-14，和生骨蛋白1和2即OP-1和OP-2)是TGF-β超家族的成員。BMP/OP亞家族成員之間的驚人進(jìn)化保守性提示，它們在動物的正常發(fā)育和機(jī)能中是關(guān)鍵的。而且，多種形式的BMP/OP的存在引出一個重要問題，即關(guān)于此明顯冗余的生物學(xué)意義的問題。BMP/OP除了在胎兒之后(postfetal)的軟骨形成和骨生成中起作用外，還在骨骼形成(包括顱面(craniofacial)組織和牙組織的發(fā)育)以及實質(zhì)器官包括腎的胚胎發(fā)育和器官形成中起著多種作用?，F(xiàn)在我們知道，自然界依靠著剪裁的共同(但稀少)的分子機(jī)制來實現(xiàn)特化組織和器官的形成。BMP/OP超家族是自然界簡約性的一個很好例子，即通過使用在高度保守羧基端區(qū)域的氨基酸基序中具有微小變異的分子同種型(isoform)來規(guī)劃多種特化功能。
BMP的拮抗作用
BMP亞家族和活化素亞家族均受到明顯的翻譯后調(diào)節(jié)。存在一個復(fù)雜的細(xì)胞外控制系統(tǒng)，籍此合成并輸出一個高親和性拮抗劑，隨后該拮抗劑選擇性地與BMP或活化素形成復(fù)合物以破壞它們的生物學(xué)活性(W.C.Smith(1999)TIG 15(1)3-6)。已經(jīng)鑒定了許多這種天然拮抗劑，而且基于序列差異百分?jǐn)?shù)，由于缺乏一級序列的保守性，它們似乎是獨立進(jìn)化的。目前還沒有關(guān)于這類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究。這些拮抗劑的研究突出顯示，其明顯偏好與BMP-2和BMP-4相互作用，并中和之。而且，不同拮抗劑的抑制機(jī)制似乎不同(S.Iemura等(1998)美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95，9337-9342)。
新的TGF-β結(jié)合蛋白1.TGF-β結(jié)合蛋白的背景如上所述，本發(fā)明提供一種新的TGF-β結(jié)合蛋白類型，當(dāng)與人DAN、人Gremlin和人Cerberus以及SCGF(美國專利5,780,263)相比時此新TGF-β結(jié)合蛋白類型具有幾乎一致的半胱氨酸(二硫鍵)支架，但核苷酸水平上幾乎沒有同源性(背景知識一般參見Hsu，D.R.，Economides，A.N.，Wang，X.，Eimon，P.M.，Harland，R.M.，“非洲爪蟾屬背部化(dorsalizing)因子Gremlin鑒定了一個拮抗BMP活性的新分泌蛋白質(zhì)家族”，分子細(xì)胞(Molecular Cell)1673-683，1998)。
該新TGF-β結(jié)合蛋白類型的一個代表性例子在SEQ ID NOs.1、5、9、11、13和15中公開。還應(yīng)當(dāng)理解，這類結(jié)合蛋白的代表性成員包括TGF-β結(jié)合蛋白變體(例如SEQ ID NOs.5和7)。本文中所使用的“TGF-β結(jié)合蛋白變體基因”是指編碼具有SEQ ID Nos2、10、12、14或16的修飾氨基酸序列的多肽的核酸分子。該變體包括天然存在的TGF-β結(jié)合蛋白基因多態(tài)性或等位基因變體，以及含有這些氨基酸序列的保守氨基酸替換的合成基因。TGF-β結(jié)合蛋白基因的其它變體形式是含有上述核苷酸序列的插入或缺失的核酸分子。TGF-β結(jié)合蛋白變體基因可以通過確定該基因是否能與具有SEQ ID Nos1、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列在嚴(yán)緊條件下雜交來鑒定。此外，TGF-β結(jié)合蛋白變體基因應(yīng)編碼具有半胱氨酸骨架(backbone)的蛋白質(zhì)。
作為一種替代方法，TGF-β結(jié)合蛋白變體基因可以通過序列比較來鑒定。正如本文中所用的，當(dāng)以獲得最大對應(yīng)(correspondence)的方式對比(aligning)時，如果兩個氨基酸序列的氨基酸殘基相同，則這兩個氨基酸序列具有“100％的氨基酸序列一致性”。同樣，當(dāng)以獲得最大對應(yīng)的方式對比時，如果兩個核苷酸序列的核苷酸殘基相同，則這兩個核苷酸序列具有“100％的核苷酸序列一致性”。序列比較可以采用標(biāo)準(zhǔn)軟件程序例如DNASTAR(Madison，Wisconsin)生產(chǎn)的LASERGENE生物信息計算軟件包中包括的那些程序來進(jìn)行。其它通過確定最佳對比來比較兩個核苷酸或氨基酸序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(見例如Peruski和Peruski，因特網(wǎng)和新生物學(xué)基因組和分子研究的工具(The Internetand the New BiologyTools for Genomic and Molecular Research)，(ASM Press公司，1997)；Wu等(編)，“核酸及蛋白質(zhì)的信息高速公路和計算機(jī)數(shù)據(jù)庫”，基因生物技術(shù)方法(Methods in GeneBiotechnology)，第123-151頁(CRC Press公司，1997)；和Bishop(編)人類基因組計算指南(Guide to Human Genome Computing)第2版(Academic Press公司，1998))。
TGF-β結(jié)合蛋白變體應(yīng)與SEQ ID Nos2、6、10、12、14或16有至少50％的氨基酸序列一致性，優(yōu)選高于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的一致性?；蛘?，TGF-β結(jié)合蛋白變體可以通過與SEQ ID Nos1、5、9、11、13或15有至少70％的核苷酸序列一致性來鑒定。而且，本發(fā)明還設(shè)想了與SEQ ID NO1有大于75％、80％、85％、90％或95％一致性的TGF-β結(jié)合蛋白基因變體。無論使用何種鑒定TGF-β結(jié)合蛋白變體基因或TGF-β結(jié)合蛋白變體的具體方法，TGF-β結(jié)合蛋白變體或由TGF-β結(jié)合蛋白基因變體編碼的多肽均可以從功能上通過例如其結(jié)合TGF-β蛋白質(zhì)家族選定成員和/或抑制該成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力來表征，或通過其特異結(jié)合抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體的能力來表征。
本發(fā)明包括TGF-β結(jié)合蛋白基因的功能性片段。在本發(fā)明范疇內(nèi)，TGF-β結(jié)合蛋白基因的“功能性片段”是指編碼TGF-β結(jié)合蛋白多肽的(1)具有上述功能活性，或(2)特異地與抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體結(jié)合的部分的核酸分子。例如，本文所述TGF-β結(jié)合蛋白基因的功能性片段包含SEQ IDNos1、5、9、11、13或15核苷酸序列的一部分。
2.TGF-β結(jié)合蛋白基因的分離編碼結(jié)合蛋白基因的DNA分子可以通過使用基于例如SEQ ID No1的寡核苷酸探針，篩選人cDNA或基因組文庫來獲得。
例如，cDNA文庫制備的第一步是采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法分離RNA。一般地，RNA的分離技術(shù)必需提供用于破碎細(xì)胞的方法、抑制RNA酶指導(dǎo)的RNA降解的手段、以及從DNA、蛋白質(zhì)和多糖污染物中分離RNA的方法。例如，總RNA可以通過如下步驟獲得在液氮中冷凍組織，用研缽和研棒磨碎此冷凍組織以裂解細(xì)胞，用酚/氯仿溶液抽提該研碎組織以去除蛋白質(zhì)，并通過用氯化鋰選擇性沉淀從剩余的雜質(zhì)中分離出RNA(見例如Ausubel等(編)，精編分子生物學(xué)實驗指南(Short Protocolsin Molecular Biology)，第三版，第4-1至4-6頁(John Wiley & Sons1995)[“Ausubel(1995)”]；Wu等，基因生物技術(shù)方法，第33-41頁(CRC出版公司1997)[“Wu(1997)”])。
或者，總RNA可以通過如下步驟分離用異硫氰酸胍抽提研碎組織，用有機(jī)溶劑抽提，并使用差速離心從污染物中分離RNA(見例如Ausubel(1995)第4-1至4-6頁；Wu(1997)第33-41頁)。
為了構(gòu)建cDNA文庫，必需從總RNA制品中分離poly(A)+RNA?？梢酝ㄟ^使用oligo(dT)-纖維素層析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從總RNA中分離poly(A)+RNA(見例如Ausubel(1995)第4-11至4-12頁)。
采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)從poly(A)+RNA合成雙鏈cDNA分子。(見例如Wu(1997)第41-46頁)。而且，可以使用商業(yè)上可獲得的試劑盒來合成雙鏈cDNA分子。例如，這些試劑盒可以獲自Life Technologies公司(Gaithersburg，Maryland)，CLONTECH Laboratories公司(PaloAlto，California)，Promega公司(Madison，Wisconsin)和StratageneCloning Systems(La Jolla，California)。
可以對用以獲得TGF-β結(jié)合蛋白cDNA克隆的這種基本方法進(jìn)行修改，方法是構(gòu)建富集TGF-β結(jié)合蛋白特異性cDNA分子的扣除cDNA文庫。構(gòu)建扣除文庫的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(見例如，Sargent，“差異表達(dá)基因的分離(Isolation of Differentially ExpressionGenes)”，酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)152423，1987，以及Wu等(編)“扣除和完整表達(dá)cDNA文庫的構(gòu)建和篩選(Construction and Screeningof Substracted and Complete Expression cDNA Libraries)”基因生物技術(shù)方法(Methods in Gene Biotechnology)，第20-65頁(CRC出版公司，1997))。
多種克隆載體適合用于cDNA文庫的構(gòu)建。例如，可以在來源于噬菌體的載體如λgt10載體中制備cDNA文庫(見例如，Huynh等，“在λgt10和λgt11中構(gòu)建和篩選cDNA文庫(Constructing and Screening cDNALibraries inλgt10 andλgt11)”，DNA克隆實用方法(DNA CloningA Practical Approach)第I卷，Glover(編)，第49頁(IRL Press，1985)；Wu(1997)第47-52頁)。
或者，可以將雙鏈cDNA分子插入質(zhì)粒載體如pBluescript載體(Stratagene Cloning Systems；La Jolla，California)，λGEM-4(Promega公司；Madison，Wisconsin)或其它商業(yè)可獲得的載體。合適的克隆載體還可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)獲得。
為了擴(kuò)增克隆的cDNA分子，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將cDNA文庫插入原核宿主中。例如，可以將cDNA文庫導(dǎo)入大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞中，該細(xì)胞可以從Life Technologies公司(Gaithersburg，Maryland)獲得。
可以通過本領(lǐng)域熟知的方法制備人類基因組DNA文庫(見例如Ausubel(1995)第5-1至5-6頁；Wu(1997)第307-327頁)?；蚪MDNA可以通過如下步驟分離用去污劑Sarkosyl裂解組織，蛋白酶K消化裂解物，通過離心從裂解物中清除不溶性碎片，使用異丙醇從裂解物中沉淀核酸，并在氯化銫密度梯度上純化重懸的DNA。
可以通過基因組DNA的隨機(jī)剪切或通過用限制性內(nèi)切酶部分消化基因組DNA，獲得適合用于產(chǎn)生基因組文庫的DNA片段。根據(jù)常規(guī)技術(shù)，例如使用限制性酶消化提供合適的末端、使用堿性磷酸酶處理以避免DNA分子不合要求的連接、并用合適的連接酶進(jìn)行連接，可以將基因組DNA片段插入載體如噬菌體或粘粒載體中。用于這些操作的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的(見例如Ausubel(1995)第5-1至5-6頁；Wu(1997)第307-327頁)。
編碼TGF-β結(jié)合蛋白的核酸分子還可以使用具有基于上述人TGF-β結(jié)合蛋白基因之核苷酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸引物采取聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來獲得。用PCR篩選文庫的一般方法參見例如，Yu等“使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)篩選噬菌體文庫(Use of Polymerase Chain Reactionto Screen Phage Libraries)”，分子生物學(xué)方法(Methods in MolecularBiology)第15卷PCR操作指南目前的方法和應(yīng)用(PCR ProtocolsCurrent Methods and Applications)，White(編)第211-215頁(Humama出版公司，1993)。而且，使用PCR分離相關(guān)基因的技術(shù)描述于例如Preston“簡并寡核苷酸引物和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在克隆基因家族成員中的應(yīng)用(Use of Degenerate Oligonucleotide Primes and the PolymeraseChain Reaction to Clone Gene Family Member)”，分子生物學(xué)方法，第15卷PCR操作指南目前的方法和應(yīng)用，White(編)第317-337頁(Humama出版公司，1993)。
或者，可以從商業(yè)途徑例如Research Genetics(Huntsville，AL)和美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rokville，Maryland)獲得人類基因組文庫。
可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法(見例如Ausubel(1995)第6-1至6-11頁)，用基于SEQ ID No1的一或多個多核苷酸探針篩選含有cDNA或基因組克隆的文庫。
按下述方法制備的抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體也可以用來從cDNA文庫中分離編碼TGF-β結(jié)合蛋白基因的DNA序列。例如，可以使用該抗體篩選λgt11表達(dá)文庫，或者可以在雜交體選擇和翻譯(hybrid selection andtranslation)后使用該抗體進(jìn)行免疫篩選(見例如Ausubel(1995)第6-12至6-16頁；Margolis等“用抗體和蛋白質(zhì)探針篩選λ表達(dá)文庫(Screeningλexpression libraries with antibody and protein probes)”，DNA克隆2表達(dá)系統(tǒng)(DNA Cloning 2Expression Systems)第2版，Glover等(編)第1-14頁(牛津大學(xué)出版社1995))。
TGF-β結(jié)合蛋白cDNA或TGF-β結(jié)合蛋白基因組片段的序列可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法確定。而且，可以采用成熟技術(shù)如缺失分析(deletion analysis)(一般參見Ausubel(1995))，實現(xiàn)對含有TGF-β結(jié)合蛋白啟動子或調(diào)節(jié)元件的基因組片段的鑒定。
作為替代方法，可以通過采用相互引發(fā)(mutually priming)的長寡核苷酸以及本文所述的核苷酸序列，合成DNA分子，獲得TGF-β結(jié)合蛋白基因(見例如Ausubel(1995)第8-8至8-9頁)。使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的已有技術(shù)使得能夠合成長至少2千堿基對的DNA分子(Adang等，植物分子生物學(xué)(Plant Molec.Biol.)211131，1993；Bambot等，PCR方法和應(yīng)用(PCR Methods and Applications)2266，1993；Dillon等，“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在快速構(gòu)建合成基因中的應(yīng)用(Use of thePolymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of SyntheticGenes)”，分子生物學(xué)方法，第15卷PCR操作指南目前的方法和應(yīng)用，White(編)第263-268頁(Humama出版公司，1993)；Holowachuk等，PCR方法應(yīng)用(PCR Methods Appl.)4299，1995)。
3.TGF-β結(jié)合蛋白基因的制備可以通過采用上述程序，利用具有基于SEQ ID NO1、5、9、11、13或15的核苷酸序列的多核苷酸探針，篩選各種cDNA或基因組文庫，來獲得編碼TGF-β結(jié)合蛋白基因變體的核酸分子。也可以通過合成構(gòu)建TGF-β結(jié)合蛋白基因變體。例如，可以設(shè)計一個核酸分子，其編碼與SEQ IDNos2、6、8、10、12、14或16的氨基酸序列相比具有保守氨基酸改變的多肽。即，可以獲得含有SEQ ID Nos2、6、8、10、12、14或16的一或多個氨基酸替換的變體，其中TGF-β結(jié)合蛋白氨基酸序列中的烷基氨基酸由烷基氨基酸替代，TGF-β結(jié)合蛋白氨基酸序列中的芳香族氨基酸由芳香族氨基酸替代，TGF-β結(jié)合蛋白氨基酸序列中的含硫氨基酸由含硫氨基酸替代，TGF-β結(jié)合蛋白氨基酸序列中的含羥基氨基酸由含羥基氨基酸替代，TGF-β結(jié)合蛋白氨基酸序列中的酸性氨基酸由酸性氨基酸替代，TGF-β結(jié)合蛋白氨基酸序列中的堿性氨基酸由堿性氨基酸替代，或TGF-β結(jié)合蛋白氨基酸序列中的二堿基(dibasic)單羧基氨基酸由二堿基單羧基氨基酸替代。
在通常的氨基酸中，例如，“保守氨基酸替代”可通過下列每組內(nèi)的氨基酸之間的替代來說明(1)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)絲氨酸和蘇氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(6)賴氨酸、精氨酸和組氨酸。在進(jìn)行這些替換時，重要的是盡可能維持圖1描畫的半胱氨酸骨架。
TGF-β結(jié)合蛋白氨基酸序列中的保守氨基酸改變可以通過用核苷酸替代SEQ ID NO1中所示的核苷酸來引入。這種“保守氨基酸”變體可以通過例如寡核苷酸指導(dǎo)的誘變、接頭分區(qū)誘變、使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行的誘變等等獲得(見Ausubel(1995)第8-10至8-22頁；以及McPherson(編)，定向誘變實踐方法(Directed MutagenesisA PracticalApproach)(IRL出版社1991))。這些變體的功能性能力可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法例如本文所述試驗方法來測定?；蛘?，TGF-β結(jié)合蛋白變體多肽可以通過其特異結(jié)合抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體的能力來鑒定。
可以進(jìn)行核酸分子的常規(guī)缺失分析以獲得編碼TGF-β結(jié)合蛋白多肽的核酸分子的“功能性片段”。作為一個說明例子，可以用Bal3 I核酸酶消化具有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA分子，獲得一系列嵌套缺失。然后以正確的閱讀框?qū)⑦@些片段插入表達(dá)載體，分離表達(dá)的多肽并檢測其活性，或檢測其結(jié)合抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體的能力。外切核酸酶消化的一個替代方法是使用寡核苷酸指導(dǎo)的誘變引入缺失或終止密碼子以規(guī)定產(chǎn)生期望片段?；蛘?，可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成TGF-β結(jié)合蛋白基因的特定片段。
用于蛋白質(zhì)功能分析的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述于例如，Treuter等，分子普通遺傳學(xué)(Molec.Gen.Genet.)240113，1993；Content等，“人干擾素誘導(dǎo)的42kDa 2-5A合成酶的表達(dá)和初步缺失分析”，生物干擾素系統(tǒng)，關(guān)于干擾素系統(tǒng)的ISIR-TNO會議報告(Biological Interferon Systems，Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems)，Cantell(編)，第65-72頁(Nijhoff 1987)；Herschman，“EGF受體”，動物細(xì)胞增殖控制(Control of Animal Cell Proliferation)，第I卷，Boynton等(編)第169-199(Academic Press 1985)；Coumaileau等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)27029270，1995；Fukunaga等，生物化學(xué)雜志，27025291，1995；Yamaguchi等，生物化學(xué)藥物學(xué)(Biochem.Pharmacol.)501295，1995；和Meisel等，植物分子生物學(xué)(Plant Molec.Biol.)301，1996。
本發(fā)明還考慮到具有保守氨基酸改變的TGF-β結(jié)合蛋白基因功能片段。
可以通過按如上所述方法確定與SEQ ID Nos1、5、9、1、13或15以及2、6、10、12、14或16的核苷酸和氨基酸序列的一致性水平，以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)鑒定TGF-β結(jié)合蛋白變體基因?；诮Y(jié)構(gòu)鑒定變體基因的一個替代方法是，確定編碼可能的TGF-β結(jié)合蛋白基因變體的核酸分子是否能在嚴(yán)緊條件下與具有SEQ ID Nos1、5、9、11、13或15，或其長度不少于15或20個核苷酸的部分的核苷酸序列的核酸分子雜交。作為嚴(yán)緊雜交條件的舉例說明，在如下緩沖液中55-60℃孵育過夜，具有TGF-β結(jié)合蛋白變體序列的核酸分子可以與具有SEQ ID NO1序列的核酸分子的片段結(jié)合，該緩沖液含有例如5×SSPE(1×SSPE＝180mM氯化鈉，10mM磷酸鈉，1mM EDTA(pH7.7))，5×Denhardt氏液(100×Denhardt氏液＝2％(w/v)牛血清白蛋白，2％(w/v)Ficoll，2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮)和0.5％SDS。高度嚴(yán)緊的雜交后洗滌典型地是在0.5×SSC(1×SSC＝150mM氯化鈉，15mM檸檬酸三鈉)或0.5×SSPE中于55-60℃進(jìn)行的。
無論TGF-β結(jié)合蛋白基因變體的具體核苷酸序列如何，該基因都編碼能夠用其功能活性或其特異結(jié)合抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體的能力來表征的多肽。更具體地，TGF-β結(jié)合蛋白基因變體編碼的多肽表現(xiàn)出本文所述人TGF-β結(jié)合蛋白基因所編碼多肽的活性的至少50％，優(yōu)選60％、70％、80％或90％以上。
4.在培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生TGF-β結(jié)合蛋白為了表達(dá)TGF-β結(jié)合蛋白基因，在表達(dá)載體中編碼該多肽的核酸分子必需可操作地與控制轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)節(jié)序列連接，之后導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。除了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列例如啟動子和增強子，表達(dá)載體還可包括翻譯調(diào)節(jié)序列和適用于篩選攜帶該表達(dá)載體的細(xì)胞的標(biāo)記基因。
適用于在真核細(xì)胞中產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體典型地含有(1)編碼細(xì)菌復(fù)制原點和抗生素抗性標(biāo)記的原核DNA元件，以為表達(dá)載體在細(xì)菌宿主中的生長和篩選作準(zhǔn)備；(2)控制轉(zhuǎn)錄起始的真核DNA元件，例如啟動子；和(3)控制轉(zhuǎn)錄本加工的DNA元件，例如轉(zhuǎn)錄終止/多腺苷酸化序列。
本發(fā)明的TGF-β結(jié)合蛋白優(yōu)選在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。哺乳動物宿主細(xì)胞的例子包括非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero；ATCC CRL 1587)，人胚胎腎細(xì)胞(293-HEK；ATCC CRL 1573)，新生倉鼠腎細(xì)胞(BHK-21；ATCC CRL8544)；犬腎細(xì)胞(MDCK；ATCC CCL 34)，中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-K1；ATCC CCL 61)，大鼠垂體細(xì)胞(GH1；ATCC CCL 82)，Hela S3細(xì)胞(ATCCCCL 2.2)，大鼠肝癌細(xì)胞(H-4-II-E；ATCC CRL 1548)，SV40轉(zhuǎn)化的猴腎細(xì)胞(COS-1；ATCC CRL 1650)和鼠胚胎細(xì)胞(NIH-3T3；ATCC CRL 1658)。
對于哺乳動物宿主，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)信號可以來自病毒，例如腺病毒、牛乳頭瘤病毒、猿猴病毒等等，在這些病毒中這些調(diào)節(jié)信號與具有高水平表達(dá)的特定基因相聯(lián)系。適合的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列還可以從哺乳動物基因例如肌動蛋白、膠原蛋白、肌球蛋白和金屬硫蛋白基因獲得。
轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列包括足以指導(dǎo)RNA合成起始的啟動子區(qū)域。適合的真核啟動子包括小鼠金屬硫蛋白I基因的啟動子[Hamer等，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志(J.Molec.Appl.Genet.)1273，1982]，皰疹病毒的TK啟動子[McKnight，細(xì)胞(Cell)31355，1982]，SV40早期啟動子[Benoist等，自然(Nature)290304，1981]，Rous肉瘤病毒啟動子[Gorman等，美國國家科學(xué)院院刊796777，1982]，巨細(xì)胞病毒啟動子[Foecking等，基因(Gene)45101，1980]，和小鼠乳腺瘤病毒啟動子(一般見，Etcheverry，“工程蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)(Expressionof Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture)”，蛋白質(zhì)工程原理和實踐(Protein EngineeringPrinciples and Practice)，Cleland等(編)第163-181頁(John Wiley & Sons公司，1996))。
或者，如果一種原核啟動子受到真核啟動子的調(diào)節(jié)，則可以使用該原核啟動子，例如噬菌體T3 RNA聚合酶啟動子來控制TGF-β結(jié)合蛋白基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)(Zhou等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)104529，1990；Kaufman等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)194485，1991)。
TGF-β結(jié)合蛋白基因還可以在細(xì)菌、酵母、昆蟲或植物細(xì)胞中表達(dá)?？梢杂靡栽谠怂拗骷?xì)胞中表達(dá)TGF-β結(jié)合蛋白多肽的適合啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括能識別T4、T3、Sp6和T7聚合酶的啟動子，λ噬菌體的PR和PL啟動子，大腸桿菌的trp、recA、熱休克、lacUV5、tac、lpp-lacSpr、phoA和lacZ啟動子，枯草芽孢桿菌(B.subtiis)的啟動子，芽孢桿菌屬(Bacillus)噬菌體的啟動子，鏈霉菌屬(Streptomyces)的啟動子，λ噬菌體的int啟動子，pBR322的bla啟動子，以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動子。原核啟動子的綜述見Glick，J.Ind.Microbiol.1277，1987；Watson等，基因分子生物學(xué)(MolecularBiology of the Gene)第4版(Benjamin Cummins 1987)；以及Ausubel等(1995)。
優(yōu)選的原核宿主包括大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilus)。適合的大腸桿菌菌株包括BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、DH1、DH4I、DH5、DH5I、DH5IF’、DH5IMCR、DH10B、DH10B/p3、DH11S、C600、HB101、JM101、JM105、JM109、JM110、K38、RR1、Y1088、Y1089、CSH18、ER1451和ER1647(見例如Brown(編)MolecularBiology Labfax(Academic出版社1991))。合適的枯草芽孢桿菌菌株包括BR151、YB886、MI119、MI120和B170(見例如Hardy，“芽孢桿菌克隆方法”，DNA克隆實踐方法(DNA CloningA Practical Approach)，Glover(編)(IRL出版社1985))。
在原核宿主中表達(dá)蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(見例如William等，“應(yīng)用質(zhì)粒載體在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白質(zhì)以及特異性多克隆抗體的純化”，DNA克隆2表達(dá)系統(tǒng)，第2版，Glover等(編)第15頁(牛津大學(xué)出版社1995)；Ward等，“抗體的遺傳操作和表達(dá)”，單克隆抗體原則和應(yīng)用(Monoclonal AntibodiesPrinciples andApplications)，第137頁(Wiley-Liss公司，1995)；和Georgiou，“細(xì)菌中蛋白質(zhì)的表達(dá)”，蛋白質(zhì)工程原理和實踐，Cleland等(編)第101頁(John Wiley & Sons公司，1996))。
桿狀病毒系統(tǒng)提供了一種將克隆TGF-β結(jié)合蛋白基因?qū)肜ハx細(xì)胞的有效手段。合適的表達(dá)載體以苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)多核型多角體病毒(AcMNPV)為基礎(chǔ)，并含有熟知的啟動子例如果蠅(Drosophila)熱休克蛋白質(zhì)(hsp)70啟動子、苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒的立即早期基因啟動子(ie-1)和遲早期39K啟動子、桿狀病毒p10啟動子、和果蠅金屬硫蛋白啟動子。合適的昆蟲宿主細(xì)胞包括來源于IPLB-sf-21的細(xì)胞系，一種草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)蛹卵巢細(xì)胞系，例如Sf9(ATCC CRL 1711)，Sf21AE和Sf21(Invitrogen公司；San Diego，CA)，以及果蠅Schneider-2細(xì)胞。用于在桿狀病毒系統(tǒng)中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的確立技術(shù)參見Bailey等，“桿狀病毒載體的操作(Manipulation of Baculovirus Vectors)”，分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology)第7卷基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實驗指南(Gene Transfer and Expression Protocols)，Murray(編)第147-168頁(The Humana出版公司1991)；Patel等，“桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)”，DNA克隆2表達(dá)系統(tǒng)，第2版，Glover等(編)第205-244頁(牛津大學(xué)出版社1995)；Ausubel(1995)第16-37至16-57頁，Richardson(編)桿狀病毒表達(dá)實驗指南(Baculovirus ExpressionProtocols)(The Humana出版公司1995)；以及Lucknow，“昆蟲細(xì)胞表達(dá)技術(shù)(Insect Cell Expression Technology)”，蛋白質(zhì)工程原理和實踐，Cleland等(編)，第183-218頁(John Wiley & Sons公司1996)。
用于酵母中表達(dá)的啟動子包括來源于GAL1(半乳糖)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、ADH(醇脫氫酶)、AOX1(醇氧化酶)、HIS4(組氨醇脫氫酶)等的啟動子。已經(jīng)設(shè)計了許多酵母克隆載體，而且這些載體均容易獲得。這些載體包括基于YIp的載體如YIp5，YRp載體如YRp17，YEp載體如YEp13，和YCp載體如YCp19。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解有許多種合適載體可以用于酵母細(xì)胞中的表達(dá)。
還可以將表達(dá)載體導(dǎo)入植物原生質(zhì)體、完整的植物組織、或分離的植物細(xì)胞。培養(yǎng)植物組織的一般方法參見例如Miki等，“向植物導(dǎo)入外源DNA的方法(Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”，植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法(Methods in Plant Molecualr Biologyand Biotechnology)，Glick等(編)，第67-88頁(CRC出版社1993)。
可以采用各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，這些技術(shù)包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒介導(dǎo)的遞送、電穿孔等等。優(yōu)選地，對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選和增殖，以提供含有穩(wěn)定整合在宿主細(xì)胞基因組中的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。將載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)和使用顯性選擇標(biāo)記篩選這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的技術(shù)描述于例如Ausubel(1995)和Murray(編)基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實驗指南(Humana出版社1991)。Ausubel(1995)也提供了用于將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)菌、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞的方法。
表達(dá)和回收哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)的一般方法參見例如Etcheverry，“工程蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)”，蛋白質(zhì)工程原理和實踐，Cleland等(編)，第163頁(Wiley-Liss公司，1996)。回收細(xì)菌系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)參見例如Grisshammer等，“從大腸桿菌細(xì)胞中純化過量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)”，DNA克隆2表達(dá)系統(tǒng)，第2版，Glover等(編)，第59-92頁(牛津大學(xué)出版社1995)。用于從桿狀病毒系統(tǒng)中分離重組蛋白質(zhì)的已確立方法描述于例如Richardson(編)，桿狀病毒表達(dá)實驗指南(Baculovirus Expression Protocols)(The Humana出版公司，1995)。
更為一般地，可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離TGF-β結(jié)合蛋白，例如親和層析、大小排阻層析、離子交換層析、HPLC等等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計分離和純化TGF-β結(jié)合蛋白的其它變化方法。例如可以使用按如下描述獲得的抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體，通過免疫親和純化分離大量蛋白質(zhì)。
5.抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體的產(chǎn)生例如，可以使用表達(dá)載體的產(chǎn)物作為抗原來獲得抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體。尤其有用的抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體“特異結(jié)合”SEQ ID Nos2、6、10、l2、14或16的TGF-β結(jié)合蛋白，而不與其它TGF-β結(jié)合蛋白例如Dan、Cerberus、SCGF或Gremlin結(jié)合。本發(fā)明抗體(包括其片段和衍生物)可以是多克隆抗體，或尤其是單克隆抗體。該抗體可以屬于任何免疫球蛋白類型，即可以是例如IgG，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4；IgE；IgM；或IgA抗體。該抗體可以是動物例如哺乳動物來源的，可以是例如小鼠、大鼠、人或其它靈長類動物的抗體。如果需要，該抗體可以是內(nèi)化抗體(internalising antibody)。
可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法制備抗重組TGF-β結(jié)合蛋白的多克隆抗體(見例如，Green等，“多克隆抗血清的制備”，免疫化學(xué)實驗指南(Immunochemical Protocols)(Manson，編)，第1-5頁(Humana出版社1992)；Williams等，“采用質(zhì)粒載體在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白質(zhì)以及特異性多克隆抗體的純化”，DNA克隆2表達(dá)系統(tǒng)，第2版，Glover等(編)，第15頁(牛津大學(xué)出版社1995))。盡管多克隆抗體典型地是在動物例如大鼠、小鼠、兔、山羊或綿羊中產(chǎn)生的，但本發(fā)明的抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體也可以來源于非人靈長類動物的抗體。在狒狒中產(chǎn)生診斷上和治療上有用的抗體的一般技術(shù)可以參見例如Goldenberg等，國際專利申請公開文本W(wǎng)O 91/11465(1991)，Losman等，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)46310，1990。
所述抗體應(yīng)至少含有一個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。該可變區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是任意大小或氨基酸組成，并且一般在構(gòu)架序列中包含至少一個負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的高變氨基酸序列。一般地，術(shù)語可變(V)區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是免疫球蛋白重(VH)鏈和/或輕(VL)鏈可變結(jié)構(gòu)域的任何適合配置。因此，例如V區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是單體，是能夠以可接受的親和性獨立地與抗原結(jié)合的VH或VL結(jié)構(gòu)域?；蛘撸琕區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是二體，含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚物，其中VH和VL鏈以非共價形式相連(以下縮寫為FV)。然而，如果需要，這些鏈可以直接地例如通過兩個可變結(jié)構(gòu)域之間的二硫鍵，或通過接頭例如肽接頭共價偶聯(lián)，以形成單鏈結(jié)構(gòu)域(以下縮寫為scFV)。
可變區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是任何天然存在的可變結(jié)構(gòu)域，或其工程版本。工程版本是指采用重組DNA工程技術(shù)構(gòu)建的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。該工程版本包括那些例如通過在或向天然抗體的氨基酸序列中插入、缺失或改變，從天然抗體可變區(qū)產(chǎn)生的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。這種類型的具體例子包括那些含有至少一個CDR并任選含有來自一個抗體的一或多個構(gòu)架氨基酸和來自第二個抗體的該可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的其余部分的工程可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。
可變區(qū)結(jié)構(gòu)域可以在C端氨基酸上共價連接至少一個其它抗體結(jié)構(gòu)域或其片段。因此，例如當(dāng)VH域存在于可變區(qū)結(jié)構(gòu)域中時，其可以與免疫球蛋白的CH1域或其片段連接。同樣，VL域可以與CK域或其片段連接。以此方式，例如抗體可以是Fab片段，其中抗原結(jié)合域含有在C端分別共價連接了CH1和CK域的相關(guān)的VH和VL結(jié)構(gòu)域。CH1域可以再增加兩個氨基酸，例如用以提供如同F(xiàn)ab’片段中的鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)域，或提供其它結(jié)構(gòu)域例如抗體CH2和CH3域。
抗體片段的另一種形式是編碼單個互補決定區(qū)(CDR)的多肽。CDR肽(“最小識別單位”)可以通過構(gòu)建編碼目的抗體的CDR的基因來獲得。該基因的制備方法例如使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的RNA合成可變區(qū)(見例如Larrick等，方法酶學(xué)方法手冊(MethodsA Companionto Methods in Enzymology)2106，1991；Courtenay-Luck，“單克隆抗體的遺傳操作”，單克隆抗體生產(chǎn)、工程化和臨床應(yīng)用(MonoclonalAntibodiesProduction，Engineering and Clinical Application)，Ritter等(編)，第166頁(劍橋大學(xué)出版社1995)；和Ward等，“抗體的遺傳操作和表達(dá)”，單克隆抗體原理和應(yīng)用，Birch等(編)，第137頁(Wiley-Liss公司1995))。
用于本發(fā)明的抗體一般可以是單克隆的(通過常規(guī)免疫和細(xì)胞融合程序制備的)，或者對于片段而言是通過采用任何合適的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)技術(shù)例如還原或酶裂解和/或消化，例如通過胃蛋白酶處理獲得的。
更具體地，可以利用各種技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體。嚙齒類動物的針對特異抗原的單克隆抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法獲得(見例如Kohler等，自然256495，1975；和Coligan等(編)，當(dāng)代免疫學(xué)實驗指南(Current Protocols in Immunology)，12.5.1-2.6.7(John Wiley & Sons 1991)[“Coligan”]；Picksley等，“針對大腸桿菌中所表達(dá)蛋白質(zhì)的單克隆抗體的產(chǎn)生(Production ofmonoclonal antibodies against proteins expressed in E.coli.)”，DNA克隆2表達(dá)系統(tǒng)，第2版，Glover等(編)第93頁(牛津大學(xué)出版社1995))。
簡單地說，單克隆抗體可以通過如下步驟獲得給小鼠注射含有TGF-β結(jié)合蛋白基因產(chǎn)物的組合物，通過取出血清樣品驗證存在抗體的產(chǎn)生，取出脾臟以獲得B淋巴細(xì)胞，融合B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生雜交瘤，克隆雜交瘤，篩選產(chǎn)生抗該抗原的抗體的陽性克隆，培養(yǎng)產(chǎn)生抗該抗原抗體的克隆，并從雜交瘤培養(yǎng)物中分離該抗體。
此外，本發(fā)明抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體也可以來源于人單克隆抗體。從經(jīng)遺傳改造應(yīng)答抗原刺激產(chǎn)生特異人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人單克隆抗體。在該技術(shù)中，人的重鏈和輕鏈座位元件被導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系來源的小鼠株中，其中該胚胎干細(xì)胞系含有被定向破壞的內(nèi)源性重鏈和輕鏈座位。該轉(zhuǎn)基因小鼠可以合成特異針對人抗原的人抗體，而且該小鼠可以用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法描述于例如Green等，自然遺傳學(xué)(Nature Genet.)713，1994；Lonberg等，自然368856，1994；和Taylor等，國際免疫學(xué)(Int.Immun.)6579，1994。
可以通過各種成熟的技術(shù)從雜交瘤培養(yǎng)物中分離和純化單克隆抗體。這些分離技術(shù)包括用A蛋白Sepharose進(jìn)行的親和層析、大小排阻層析、和離子交換層析(見例如Coligan，第2.7.1-2.7.12頁和第2.9.1-2.9.3頁；Baines等，“免疫球蛋白G(IgG)的純化”，分子生物學(xué)方法，第10卷，第79-104頁(The Humana出版公司1992))。
對于特定應(yīng)用，可能希望制備抗TGF-β結(jié)合蛋白抗體的片段。這些抗體片段可以通過例如抗體的蛋白水解來獲得?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法將整個抗體進(jìn)行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化，獲得抗體片段。作為一個說明例子，可以通過胃蛋白酶酶解抗體提供稱為F(ab’)2的5S片段，產(chǎn)生抗體片段?？梢允褂脦€基還原劑進(jìn)一步裂解該片段，產(chǎn)生單價3.5S Fab’片段。任選地，可以使用封閉二硫鍵斷裂所產(chǎn)生巰基的基團(tuán)，進(jìn)行該裂解反應(yīng)。作為替代方法，使用胃蛋白酶酶解直接產(chǎn)生兩個單價Fab片段和一個Fc片段。這些方法描述于例如Goldenberg，美國專利4,331,647；Nisonoff等，Arch Biochem.Biophys.89230，1960；Porter，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)73119，1959；Edelman等，酶學(xué)方法(Methodsin Enzymology)1422(Academic出版社1967)；和Coligan第2.8.1-2.8.10頁和第2.10.-2.10.4頁。
還可以使用其它裂解抗體的方法，例如分離重鏈以形成單價輕-重鏈片段，片段的進(jìn)一步裂解，或其它酶的、化學(xué)的或遺傳的技術(shù)，只要這些片段能與完整抗體所識別的抗原結(jié)合即可。
或者，抗體可以是通過使用重組DNA技術(shù)，包括對編碼抗體可變和/或恒定區(qū)的DNA的操作和再表達(dá)，獲得的重組或工程抗體。這些DNA是已知的和/或可以容易地從DNA文庫包括例如噬菌體抗體文庫獲得(見Chiswell，D J和McCafferty，J.Tibtech.10 80-84(1992))，或如果需要，可以合成這些DNA?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)和/或化學(xué)方法測序和操作該DNA，以便例如按需要引入密碼子創(chuàng)造半胱氨酸殘基、或修改、添加或缺失其它氨基酸或結(jié)構(gòu)域。
由此，可以制備一或多個含有該DNA的可復(fù)制表達(dá)載體，并用以轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞系，例如非產(chǎn)病毒性(non-producing)雜交瘤細(xì)胞系如小鼠NSO系或細(xì)菌如大腸桿菌系，在其中進(jìn)行抗體的生產(chǎn)。為了獲得有效轉(zhuǎn)錄和翻譯，每個載體中的該DNA序列應(yīng)該包括合適的調(diào)節(jié)序列，尤其是可操作地與可變結(jié)構(gòu)域序列連接的啟動子和前導(dǎo)序列。用于通過此方式生產(chǎn)抗體的具體方法一般是熟知的，并且是常規(guī)使用的。例如，由Maniatis等描述的基本分子生物學(xué)程序(分子克隆(MolecularBiology)，Cold Spring Harbor Laboratoty，紐約，1989)；DNA測序可以按Sanger等的描達(dá)(pNAS 74.5463，(1977))和AmershamInternational plc測序手冊進(jìn)行；而位點定向誘變可以根據(jù)Kramer等(核酸研究12，9441，(1984))的方法和Anglian生物技術(shù)有限公司手冊來進(jìn)行。此外，還有許多出版物詳細(xì)描述了適用于通過操作DNA、構(gòu)建表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化合適細(xì)胞來制備抗體的技術(shù)，例如由Mountain A和Adair，J R在生物技術(shù)和遺傳工程綜述(Biotechnology and GeneticEngineering Reviews)(Tombs，MP編，10，第1章，1992，Intercept，Andover，英國)中和國際專利說明書WO91/09967中所評論的。
如果需要，根據(jù)本發(fā)明的抗體可以具有與之相連的一或多個效應(yīng)或報道分子，而且本發(fā)明擴(kuò)展到這些修飾蛋白質(zhì)。效應(yīng)或報道分子可以通過任何可利用的氨基酸側(cè)鏈、末端氨基酸或，如果存在的話位于抗體中的糖功能基團(tuán)，與抗體相連，當(dāng)然總是假設(shè)這并不會對該分子的結(jié)合性質(zhì)和最終有效性產(chǎn)生不利影響。具體的功能基團(tuán)包括例如任何游離的氨基、亞氨基、巰基、羥基、羧基或醛基?？贵w與效應(yīng)和/或報道分子的連接可以通過這些基團(tuán)和效應(yīng)或報道分子中的合適功能基團(tuán)來實現(xiàn)。該連接可以是直接的或間接的，通過間隔基團(tuán)或橋連基團(tuán)實現(xiàn)。
效應(yīng)分子包括例如抗腫瘤劑、毒素(例如細(xì)菌或植物來源的酶活性毒素和其片段，如篦麻毒素和其片段)、生物學(xué)活性蛋白質(zhì)例如酶、核酸和其片段如DNA、RNA和它們的片段、天然存在的和合成的聚合物如多糖和聚烷撐聚合物(polyalkylene polymer)如聚(乙二醇)和其衍生物、放射性核素尤其是放射性碘、和螯合金屬。合適的報道基團(tuán)包括螯合金屬、熒光化合物或可以通過NMR或ESR光譜學(xué)檢測的化合物。
具體的抗腫瘤劑包括細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制試劑，例如烷化劑如氮芥(nitrogen mustard)(如苯丁酸氮芥、美法侖、氮芥(mechlorethamine)、環(huán)磷酰胺或烏拉莫司汀)和其衍生物、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基硫代磷酰胺、白消安、或順鉑；抗代謝物例如氨甲蝶呤、氟尿嘧啶、5-氟脫氧尿苷、阿糖胞苷、巰基嘌呤、硫代鳥嘌呤、氟乙酸或氟檸檬酸；抗生素，例如博來霉素(如博來霉素硫酸鹽)、阿霉素、道諾紅霉素、絲裂霉素(如絲裂霉素C)、放線菌素(如放線菌素D)、普卡霉素、加利車霉素(calichaemicin)和其衍生物、或埃斯波霉素和其衍生物；有絲分裂抑制劑例如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、長春新堿或長春堿和它們的衍生物；生物堿，例如玫瑰樹堿；多元醇例如taxicin-I或taxicin-II；激素例如雄激素(如屈他雄酮或睪內(nèi)脂)、孕酮(如醋酸甲地孕酮或醋酸甲羥孕酮)、雌激素(二甲基己烯雌酚二磷酸酯(dimethylstiblestrol diphosphate)、聚磷酸雌二醇或雌二醇氮芥磷酸酯(estramustine phosphate))或抗雌激素(如三苯氧胺)；蒽醌例如米托蒽醌；脲例如羥基脲；肼例如甲基芐肼；或咪唑例如達(dá)卡巴嗪。
尤其有用的效應(yīng)基團(tuán)是加利車霉素和其衍生物(見例如南非專利說明書85/8794、88/8127和90/2839)。
鏊合金屬包括具有2-8(包括2和8)配位數(shù)的正二價或三價(di-ortripositive)金屬鏊合物。該金屬的具體例子包括锝(Tc)、錸(Re)、鈷(Co)、銅(Cu)、金(Au)、銀(Ag)、鉛(Pb)、鉍(Bi)、銦(In)、鎵(Ga)、釔(Y)、鋱(Tb)、釓(Gd)和鈧(Sc)。一般地，該金屬優(yōu)選是放射性核素。具體的放射性核素包括99mTc、186Re、188Re、58Co、60Co、67Cu、195Au、199Au、110Ag、203Pb、206Bi、207Bi、111In、67Ga、68Ga、88Y、90Y、160Tb、153Gd和47Sc。
該鏊合金屬可以是例如被任何適合的多齒鏊合劑鏊合的上述金屬類型之一，這些鏊合劑例如無環(huán)或環(huán)狀多胺、多醚(如冠醚和其衍生物)；聚酰胺；卟啉；和碳環(huán)衍生物(carbocyclic derivatiyes)。
一般地，鏊合劑的類型取決于所用金屬。然而，在根據(jù)本發(fā)明的偶聯(lián)物中一組尤其有用的鏊合劑是無環(huán)多胺和環(huán)狀多胺，特別是聚氨基羧酸(polyaminocarboxylic acid)例如二亞乙基三胺五乙酸和其衍生物，和大環(huán)胺(macrocyclic amine)例如環(huán)狀三氮雜(aza)和四氮雜衍生物(例如國際專利說明書WO 92/22583中所描述的)；以及聚酰胺，特別是去鐵銨和其衍生物。
因此，例如當(dāng)希望在抗體中使用巰基作為連接點時，這可以通過與存在于效應(yīng)或報道分子中的巰基反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)來實現(xiàn)。這些基團(tuán)的例子包括a-鹵羧酸或酯(a-halcarboxylic acid or ester)例如碘乙酰胺、二酰亞胺例如順丁烯二酰亞胺、乙烯砜、或二硫化物。這些和其它合適的連接程序一般地和更為具體地描述于國際專利說明書WO 93/06231、WO92/22583、WO 90/091195和WO 89/01476。
篩選增加骨密度的分子的方法如上所討論的，本發(fā)明提供用于篩選和/或分離能夠增加骨密度的化合物的方法。例如，在本發(fā)明的一個方面中，提供用于確定所選分子是否能夠增加骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟(a)將所選分子與TGF-β結(jié)合蛋白和TGF-β蛋白質(zhì)家族的一個選定成員混合，(b)測定該所選分子是否刺激了通過TGF-β蛋白質(zhì)家族進(jìn)行的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、或抑制了TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β蛋白質(zhì)家族的結(jié)合。在某些實施方案中，該分子增強TGF-β作為間充質(zhì)細(xì)胞分化的正調(diào)節(jié)物起作用的能力。
在本發(fā)明的其它方面，提供用于確定所選分子是否能夠增加骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟(a)將所選分子暴露于表達(dá)TGF-β結(jié)合蛋白的細(xì)胞，和(b)測定所述暴露細(xì)胞的TGF-β結(jié)合蛋白的表達(dá)(或活性)是否降低，并由此確定該化合物是否具有增加骨礦質(zhì)含量的能力。在一個實施方案中，該細(xì)胞選自從骨活組織檢查獲得的自發(fā)轉(zhuǎn)化或未轉(zhuǎn)化正常人骨和大鼠頂骨的成骨細(xì)胞。該方法可以通過許多種試驗形式來完成，包括例如對流免疫電泳(CIEP)、放射免疫測定、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、斑點印跡試驗、抑制或競爭試驗、以及三明治試驗(sandwichassays)(見美國專利4,376,110和4,486,530；也見抗體實驗室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，同上)。
在以下的實施例5和6中提供了這些試驗方法的代表性實施方案。簡單地說，首先將TGF-β超家族的家族成員或TGF-β結(jié)合蛋白與固相支持物結(jié)合，隨后加入候選分子。然后，向該測試試驗中加入標(biāo)記的TGF-β超家族的家族成員或TGF-β結(jié)合蛋白，洗滌固相支持物，并測定該固體支持物上結(jié)合的或標(biāo)記的TGF-β超家族成員或TGF-β結(jié)合蛋白的量。本文所描述的適用于增加骨礦質(zhì)含量的分子是那些以統(tǒng)計學(xué)上顯著的方式降低TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β超家族的一個或多個成員結(jié)合的分子。明顯地，在本發(fā)明中適用的試驗方法應(yīng)不限于實施例2和3中所描述的實施方案。尤其是，可以改變許多參數(shù)，例如通過TGF-β與固相支持物的結(jié)合，或完全去除固相等方式來改變。
在本發(fā)明的其它方面，提供用于確定所選分子是否能夠增加骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟(a)將所選分子暴露于表達(dá)TGF-β的細(xì)胞，和(b)測定所述暴露細(xì)胞的TGF-β活性是否發(fā)生改變，并由此確定該化合物是否具有增加骨礦質(zhì)含量的能力。與上述方法相同，可以利用多種方法來評價由于所選測試化合物導(dǎo)致的TGF-β結(jié)合蛋白表達(dá)的改變。
例如，在本發(fā)明的一個方面，提供確定所選分子是否能夠增加骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟(a)將所選分子與TGF-β結(jié)合蛋白和TGF-β蛋白質(zhì)家族的一個選定成員混合，(b)測定該所選分子是否上調(diào)了TGF-β蛋白質(zhì)家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、或抑制了TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β蛋白質(zhì)家族的結(jié)合。在某些實施方案中，該分子增強TGF-β作為間充質(zhì)細(xì)胞(mechemchymal cell)分化的正調(diào)節(jié)物起作用的能力。
與上述方法相同，可以利用許多種方法來評價由于所選測試化合物引起的TGF-β刺激作用。以下實施例6中提供了一個這樣的代表性方法(也見Durham等，Endo.1361374-1380)。
在本發(fā)明的再其它方面，提供確定所選分子是否能增加骨礦質(zhì)含量的方法，包括步驟測定所選分子是否抑制TGF-β結(jié)合蛋白與骨或其類似物的結(jié)合。如本文中所用的，應(yīng)當(dāng)理解骨或其類似物是指羥基磷灰石、或由粉狀形式的骨、壓碎的骨或完整的骨構(gòu)成的表面。與上述方法相同，可以利用許多種方法來評價對TGF-β結(jié)合蛋白定位到骨基質(zhì)的抑制。以下實施例7中提供了一個這樣的代表性方法。
應(yīng)當(dāng)指出的是，盡管本文列舉的這些方法可以指對單一測試分子的分析，但本發(fā)明并不應(yīng)由此受到限制。尤其是，所選分子可以包含在化合物的混合物中。因此，所列舉的方法可以進(jìn)一步包含步驟分離抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的分子。
候選分子對許多種分子都可以測試其抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的能力。代表性例子包括有機(jī)分子、蛋白質(zhì)或肽、和核酸分子，以下將作更為詳細(xì)的討論。盡管從以下討論來看，明顯地本文所述候選分子可以用于本文所述的測定，但也應(yīng)易于明了這些分子還可以用于各種診斷和治療應(yīng)用。
1.有機(jī)分子對于許多有機(jī)分子都可以測定其抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的能力。
例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，合適的有機(jī)分子選自化學(xué)制品庫(chemical library)，其中對化學(xué)制品作單獨測定，或選自組合化學(xué)制品庫，其中對多個化合物同時進(jìn)行測定，然后展開以確定和分離具有最高活性的化合物。
這些組合化學(xué)制品庫的典型例子包括由如下文獻(xiàn)描述的組合化學(xué)制品庫Agrafiotis等，“自動產(chǎn)生具有期望性質(zhì)的化學(xué)化合物的系統(tǒng)和方法(System and method of automatically generating chemical compoundswith desired properties)”，美國專利5,463,564；Armstrong，R.W.，“通過應(yīng)用多成分組合陣列合成法合成有機(jī)化合物組合陣列(Synthesisof combinatorial arrays of organic compounds through the use ofmultiple component combinatorial array syntheses)”，WO 95/02566；Baldwin，J.J.等，“磺胺衍生物和其應(yīng)用”，WO 95/24186；Baldwin，J.J.等，“組合二氫苯并吡喃庫(combinatorial dihydrobenzopyranlibrary)”，WO 95/30642；Brenner，S.，“用于制備組合庫的新試劑盒”，WO 95/16918；Chenera，B.等，“樹脂結(jié)合的芳香族碳環(huán)化合物的文庫制備”，WO 95/16712；Ellman，J.A.，“在固體支持物上固相和組合合成苯(并)二氮革類化合物庫”，美國專利5,288,514；Felder，E.等，“新組合化合物文庫”，WO 95/16209；Lerner，R.等，“編碼的組合化學(xué)文庫”，WO 93/20242；Pavia，M.R.等，“從結(jié)構(gòu)上各異的通用文庫制備和篩選藥物學(xué)上有用的非肽化合物的一種方法”，WO 95/04277；Summerton，J.E.和D.D.Weller，“嗎啉代-亞基組合文庫和方法”，美國專利5,506,337；Holmes，C.，“用于固相合成thiazolidinones、matathiazanones和它們的衍生物的方法”，WO 96/00148；Phillips，G.B.和G.P.Wei，“固相合成苯并咪唑”，Tet.Letters 374887-90，1996；Ruhland，B.等，“結(jié)構(gòu)各異的β內(nèi)酰胺的固體支持組合合成”，美國化學(xué)學(xué)會雜志(J.Amer.Chem.Soc.)111253-4，1996；Look，G.C.等，“從4-噻唑烷組合文庫中鑒定環(huán)加氧酶-1的抑制物”，Bioorg and Med.Chem.Letters 6707-12，1996。
2.蛋白質(zhì)和肽廣泛的蛋白質(zhì)和肽同樣可以用作TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的抑制物候選分子。
a.組合肽文庫可以通過組合肽文庫的篩選獲得可能是TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的抑制物的肽分子。這些文庫可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備(見例如美國專利4,528,266和4,359,535以及專利合作條約公開文本W(wǎng)O92/15679、WO 92/15677、WO 90/07862、WO 90/02809)或從商業(yè)途徑購買(例如New England Biolabs Ph.D.TM噬菌體展示肽文庫試劑盒)。
b.抗體考慮到本文提供的此公開，可以容易地制備抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的抗體。在本發(fā)明范圍內(nèi)，抗體被理解為包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗獨特型抗體、抗體片段(例如Fab和F(ab’)2、Fv可變區(qū)、或互補決定區(qū))。正如以上所討論的，如果抗體以大于或等于107M，優(yōu)選大于或等于108M的Ka與TGF-β結(jié)合蛋白或特定的TGF-β家族成員結(jié)合，而不與或以小于或等于106M的Ka與其它的TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合，則該抗體被理解為是特異針對TGF-β結(jié)合蛋白或特定的TGF-β家族成員的。而且，本發(fā)明的抗體應(yīng)當(dāng)阻斷或抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員的結(jié)合。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定單克隆抗體或結(jié)合伴侶(partner)的親和力，以及結(jié)合的抑制(見Scatchard，Ann.N.Y.Acad.Sci.51660-672，1949)。
簡單地說，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地從各種恒溫動物例如馬、奶牛、各種家禽、兔、小鼠或大鼠產(chǎn)生多克隆抗體。典型地，使用TGF-β結(jié)合蛋白或其13-20個氨基酸的獨特肽(優(yōu)選通過使用戊二醛形成的交聯(lián)與匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián))，聯(lián)合佐劑例如Freund完全或不完全佐劑一起，通過腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、或皮下注射免疫動物。幾次加強免疫后，收集血清樣品并檢測其對所述蛋白質(zhì)或肽的反應(yīng)性。尤其優(yōu)選的多克隆抗血清將在一個這些試驗中給出至少高于背景三倍的信號。依據(jù)動物對蛋白質(zhì)的反應(yīng)性，一旦動物的效價達(dá)到平臺，則通過每周給動物放血或抽血可以容易地獲得更大量的抗血清。
單克隆抗體還可以容易地采用常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生(見以參考文獻(xiàn)方式并入本文的美國專利RE 32,011、4,902,614、4,543,439和4,411,993；也見單克隆抗體，雜交瘤生物學(xué)分析中的一個方面(MonoclonalAntibodies，HybridomasA New Dimension in BiologicalAnalyses)，Plenum出版社，Kennett，McKearn和Bechtol(編)，1980；和抗體實驗室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，Harlow和Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory出版，1988，該文獻(xiàn)也以參考文獻(xiàn)方式并入本文)。
簡單地說，在一個實施方案中，按以上描述，用TGF-β結(jié)合蛋白或其部分免疫受試動物例如大鼠或小鼠。為了增強最終所獲的免疫應(yīng)答，可以將該蛋白與佐劑例如Freund完全或不完全佐劑混合。在最初免疫后的一至三周之間，可以再用一次加強免疫對動物進(jìn)行再免疫，并使用以上描述的試驗檢測其對蛋白質(zhì)的反應(yīng)性。一旦動物對注射蛋白質(zhì)的反應(yīng)性達(dá)到平臺，即可將其處死，并收獲含有大量B細(xì)胞的器官例如脾和淋巴結(jié)。
從被免疫動物獲得的細(xì)胞可以通過病毒例如埃-巴二氏病毒(EBV)感染而永生化(見Glasky和Reading，雜交瘤(Hybridoma)8(4)377-389，1989)?；蛘?，在一個優(yōu)選的實施方案中，為了產(chǎn)生分泌單克隆抗體的“雜交瘤”，將收獲的脾和/或淋巴結(jié)細(xì)胞懸浮物與合適的骨髓瘤細(xì)胞融合。合適的骨髓瘤系包括例如NS-1(ATCC TIB 18)和P3X63-Ag 8.653(ATCCCRL 1580)。
在融合后，可以將細(xì)胞置于含有合適培養(yǎng)基例如RPMI 1640或DMEM(Dulbecoo氏修改的Eagles培養(yǎng)基)(JRH Biosciences，Lenexa，Kansas)以及添加成分例如胎牛血清(即FBS，來自Hyclone，Logan，Utah，或JRH Biosciences)的培養(yǎng)板中。此外，該培養(yǎng)基應(yīng)含有選擇性地允許脾和骨髓瘤融合細(xì)胞生長的試劑例如HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷)(Sigma Chemical公司，St.Louis，Missouri)。在大約7天后，可以對所獲的融合細(xì)胞或雜交瘤進(jìn)行篩選，以確定抗TGF-β結(jié)合蛋白(取決于所用抗原)，并阻斷或抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的抗體的存在。
有許多種試驗可以用以確定抗本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體的存在，包括例如對流免疫電泳、放射免疫測定、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、斑點印跡試驗、Western印跡、免疫沉淀、抑制或競爭試驗、以及三明治試驗(見例如美國專利4,376,110和4,486,530；也見抗體實驗室手冊(AntibodiesA Laboratory Manual)，Harlow和Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory出版，1988)。幾次克隆稀釋和再次試驗之后，可以分離產(chǎn)生抗目的蛋白質(zhì)抗體的雜交瘤。
也可以使用其它技術(shù)構(gòu)建單克隆抗體(見William D.Huse等，“在λ噬菌體中產(chǎn)生具有免疫球蛋白譜的大型組合文庫”，科學(xué)(Science)2461275-1281，1989年12月；也見L.Sastry等，“在大腸桿菌中克隆免疫球蛋白的所有組成成分以產(chǎn)生單克隆催化抗體重鏈可變區(qū)特異性cDNA文庫的構(gòu)建”，美國國家科學(xué)院院刊865728-5732，1989年8月；還見Michelle Alting-Mees等，“單克隆表達(dá)文庫雜交瘤的一種快速替代法”，分子生物學(xué)策略(Strategies in Molecular Biology)31-9，1990年1月)。這些文獻(xiàn)描述了可從Stratagene(La Jolla，California)獲得的一個商業(yè)系統(tǒng)，該商業(yè)系統(tǒng)能夠通過重組技術(shù)產(chǎn)生抗體。簡單地說，從B細(xì)胞群體分離mRNA，用以在λImmunoZap(H)和λImmunoZap(L)載體中構(gòu)建重鏈和輕鏈免疫球蛋白cDNA表達(dá)文庫。這些載體可以單獨進(jìn)行篩選，也可以共表達(dá)以形成Fab片段或抗體(見Huse等，同上；也見Sastry等，同上)。隨后可以將陽性噬菌斑轉(zhuǎn)變成允許從大腸桿菌高水平表達(dá)單克隆片段的非裂解性質(zhì)粒。
同樣，也可以采用常規(guī)酶消化，或重組DNA技術(shù)以插入編碼特異結(jié)合抗體的基因的可變區(qū)，構(gòu)建抗體的部分或片段例如Fab和Fv片段。在一個實施方案中，使用針對可變區(qū)的核苷酸引物從產(chǎn)生目的單克隆抗體的雜交瘤擴(kuò)增編碼可變區(qū)的基因。這些引物可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員合成，或可以從商業(yè)途徑購買。Stratagene(La Jolla，California)出售針對小鼠和人可變區(qū)的引物，包括尤其是針對VHa、VHb、VHc、VHd、CHl、VL和CL區(qū)的引物?？梢允褂眠@些引物擴(kuò)增重鏈或輕鏈可變區(qū)，然后可以將其分別插入載體例如ImmnoZAPTMH或ImunoZAPTML(Stratagene)。之后這些載體可以被導(dǎo)入基于大腸桿菌、酵母或哺乳動物的系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。使用這些技術(shù)，可以產(chǎn)生大量含有融合的VH和VL域的單鏈蛋白質(zhì)(見Bird等，科學(xué)242423-426，1988)。此外，可以使用這些技術(shù)在不改變抗體結(jié)合特異性的情況下，將“鼠”抗體改變成“人”抗體。
一旦獲得合適的抗體，即可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的許多技術(shù)對其進(jìn)行分離或純化(見抗體實驗室手冊，Harlow和Lane(編)，ColdSpring Harbor Laboratory出版社，1988)。合適的技術(shù)包括肽或蛋白質(zhì)親和柱、HPLC或RP-HPLC、在A蛋白或G蛋白柱上純化、或任何這些技術(shù)的組合。
c.突變的TGF-β結(jié)合蛋白正如本文和如下實施例(例如實施例8和9)中所描述的，與天然TGF-β結(jié)合蛋白阻斷特定TGF-β家族成員活性的能力競爭的TGF-β結(jié)合蛋白修改版本應(yīng)該會導(dǎo)致骨密度的增加。因此，結(jié)合TGF-β家族成員但不抑制該TGF-β家族成員功能的TGF-β結(jié)合蛋白突變體將符合此標(biāo)準(zhǔn)。該突變版本必須有效地與TGF-β結(jié)合蛋白的內(nèi)源性抑制功能相競爭。
d.蛋白質(zhì)的產(chǎn)生盡管本文已提供了各種基因(或其部分)，但應(yīng)該理解，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，對一或多個這些基因的提及包括與這些基因基本相同的這些基因的衍生物(以及，如果合適的話，包括由這些基因和它們的衍生物編碼的蛋白質(zhì)(包括肽和多肽))。正如本文所用的，如果(a)一個核苷酸序列來源于上述基因的編碼區(qū)并包括例如該序列的若干部分或以上所討論序列的等位基因變異，或者編碼抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的分子，(b)核苷酸序列能夠與本發(fā)明的核苷酸序列在中、高或極高的嚴(yán)緊條件下雜交(見Sambrook等，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloningA Laboratory Mannual)，第2版，Cold Spring HarborLaboratory出版社，紐約，1989)，或(c)由于遺傳密碼子的原因，DNA序列與(a)或(b)中所定義的DNA序列是簡并的，則該核苷酸序列被認(rèn)為是“基本相同的”。而且，本文公開的核酸分子包括互補和非互補序列，前提是該序列在其它方面符合本文提出的標(biāo)準(zhǔn)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，高嚴(yán)緊性是指標(biāo)準(zhǔn)雜交條件(例如，5×SSPE，0.5％SDS，65℃，或相當(dāng)?shù)臈l件)。
使用例如P/C Gene或Intelligenetics軟件包(Intelligenetics，Mountain View，California)的疏水性繪圖功能，或根據(jù)Kyte和Doolittle(分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)157105-132，1982)描述的方法，本文所述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以從一級翻譯產(chǎn)物預(yù)測。
本發(fā)明蛋白質(zhì)可以以酸式鹽或堿式鹽的形式，或以中性形式制備。此外，單個氨基酸殘基可以通過氧化或還原進(jìn)行修飾。而且，可以在氨基酸和核酸序列上進(jìn)行各種替代、缺失或添加，其凈效應(yīng)是保持或進(jìn)一步增強或降低突變或野生型蛋白的生物學(xué)活性。而且，例如由于遺傳密碼子的簡并性，在編碼相同氨基酸序列的核苷酸序列中，可以有相當(dāng)多的變異。
本文公開的蛋白質(zhì)的其它衍生物包括該蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)合物。這可以通過例如合成其加入可能有利于蛋白質(zhì)純化或鑒定的N-端或C-端融合蛋白來實現(xiàn)(見美國專利4,851,341；也見Hopp等，Bio/Technology 61204，1988)?；蛘撸梢詷?gòu)建諸如Flag/TGF-β結(jié)合蛋白的融合蛋白，以有助于該蛋白質(zhì)的鑒定、表達(dá)和分析。
本發(fā)明蛋白質(zhì)可以采用本文所述的多種技術(shù)構(gòu)建。而且，可以通過合成含有突變序列的寡核苷酸在特定位置引入突變，而且該寡核苷酸的兩側(cè)具有限制性位點，使得其能夠與該天然序列片段連接。連接之后，所獲的重組序列編碼具有期望的氨基酸插入、替換或缺失的衍生物。
或者，可以使用寡核苷酸指導(dǎo)的位點特異性(或片段特異性)誘變程序，提供根據(jù)要求的替換、缺失或插入改變了特定密碼子的改變基因。進(jìn)行如上所述改變的示例性方法公開于Walder等(基因42133，1986)；Bauer等(基因3773，1985)；Craik(BioTechniques，1985年1月，12-19)；Smith等(遺傳工程原理和方法(Genetic EngineeringPrinciples and Methods)，Plenum出版社，1981)；和Sambrook等(同上)。還可以通過使用與所期望缺失相鄰的方便限制性內(nèi)切核酸酶位點，構(gòu)建缺失或截短的蛋白質(zhì)衍生物(例如可溶性細(xì)胞外部分)。在限制性消化后，可以補平突出端、然后重新連接該DNA。進(jìn)行如上所述改變的典型方法公開于Sambrook等(分子克隆實驗室指南，第2版，Cold SpringHatbor Laboratory出版社，1989)。
在本發(fā)明核酸分子中產(chǎn)生的突變優(yōu)選保持編碼序列的閱讀框。而且這些突變優(yōu)選不形成能夠雜交產(chǎn)生mRNA二級結(jié)構(gòu)例如環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補區(qū)，這些二級結(jié)構(gòu)將對mRNA的翻譯產(chǎn)生不利影響。盡管可以預(yù)先決定突變位點，但并不必預(yù)先決定突變本身的性質(zhì)。例如，為了篩選在指定位點具有最佳特性的突變，可以在靶密碼子處進(jìn)行隨機(jī)誘變，然后篩選具有指明生物學(xué)活性的表達(dá)突變體。或者，可以通過合成如下寡核苷酸在特定位置引入突變，該寡核苷酸含有突變序列，而且兩翼具有使其能夠與該天然序列的片段連接的限制性位點。連接后，所獲的重組序列編碼具有期望的氨基酸插入、替換或缺失的衍生物。
也可以采用PCR誘變技術(shù)、化學(xué)誘變技術(shù)(Drinkwater和Klinedinst，PNAS 833402-3406，1986)、強制核苷酸錯誤摻入(forced nucleotidemisincorportation)(例如Liao和Wise基因88107-111，1990)、或使用隨機(jī)誘變處理的寡核苷酸(Horwitz等，基因組(Genome)3112-117，1989)來構(gòu)建編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸分子。
本發(fā)明還提供通過培養(yǎng)含有能表達(dá)上述基因的載體的宿主細(xì)胞對上述基因進(jìn)行的操作和表達(dá)。這些載體或載體結(jié)構(gòu)包括合成的或cDNA來源的，可操作地與合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件連接的，編碼目的蛋白質(zhì)的核酸分子。合適的調(diào)節(jié)元件可以從各種來源獲得，包括細(xì)菌、真菌、病毒、哺乳動物、昆蟲或植物基因。適合調(diào)節(jié)元件的選擇取決于所選擇的宿主細(xì)胞，而且可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完成。調(diào)節(jié)元件的例子包括轉(zhuǎn)錄啟動子和增強子或RNA聚合酶結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄終止子、以及核糖體結(jié)合序列，包括翻譯起始信號。
編碼上述任一種蛋白質(zhì)的核酸分子可以容易地由許多種原核和真核宿主細(xì)胞表達(dá)，這些宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動物、酵母或其它真菌、病毒、昆蟲、或植物細(xì)胞。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞以表達(dá)外源DNA的方法是本領(lǐng)域所熟知的(見例如Itakura等，美國專利4,704,362；Hinnen等，美國國家科學(xué)院院刊751929-1933，1978；Murray等，美國專利4,801,542；Upshall等，美國專利4,935,349；Hagen等，美國專利4,784,950；Axel等，美國專利4,399,216；Goeddel等，美國專利4,766,075；和Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory出版社，1989；對于植物細(xì)胞，見Czako和Marton，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)104；1067-1071，1994；和Paszkowski等，生物技術(shù)(Biotech.)24387-392，1992)。
適于實施本發(fā)明的細(xì)菌宿主細(xì)胞包括大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)，和假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(streptomyces)和葡萄球菌屬(staphylococcus)的各個種，以及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的許多其它細(xì)菌種。細(xì)菌宿主細(xì)胞的代表性例子包括DH5α(Stratagene，La Jolla，California)。
細(xì)菌表達(dá)載體優(yōu)選含有在宿主細(xì)胞中起作用的啟動子、一或多個表型選擇標(biāo)記、以及細(xì)菌復(fù)制原點。典型的啟動子包括β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動子系統(tǒng)(見Chang等，自然275615，1978)、T7 RNA聚合酶啟動子(Studier等，酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)18560-89，1990)、λ啟動子(Elvin等，基因87123-126，1990)、trp啟動子(Nichols和Yanofsky，酶學(xué)方法101155，1983)和tac啟動子(Russell等，基因20231，1982)。典型的選擇標(biāo)記包括各種抗生素抗性標(biāo)記例如卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。適用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的許多質(zhì)粒是本領(lǐng)域所熟知的，包括尤其是pBR322(見Bolivar等，基因295，1977)，pUC質(zhì)粒pUC18、pUC19、pUC118、pUC119(見Messing，酶學(xué)方法10120-77，1983；和Vieira和Messing，基因19259-268，1982)，和pNH8A、pNH16a、pNH18a，以及Bluescript M13(Stratagene，La Jolla，California)。
適用于實施本發(fā)明的酵母和真菌宿主細(xì)胞包括尤其是Saccharomycespombe、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢赤酵母屬(Pichia)或克魯維酵母菌屬(kluyveromyces)、以及曲霉屬(Aspergillus)的各個種(McKnight等，美國專利4,935,349)。對于酵母和真菌而言，適合的表達(dá)載體包括尤其是用于酵母的YCp50(ATCC 37419)、和amdS克隆載體pV3(Turnbull，Bio/Technology 7169，1989)、YRp7(Struhl等，美國國家科學(xué)院院刊761035-1039，1978)、YEp13(Broach等，基因8121-133，1979)、pJDB249和pJDB219(Beggs，自然275104-108，1978)，以及它們的衍生物。
用于酵母的優(yōu)選啟動子包括來自酵母糖酵解基因(Hitzeman等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)25512073-12080，1980；Alber和Kawasaki，分子應(yīng)用遺傳學(xué)雜志(J.Mol.Appl.Genet.)1419-434，1982)或醇脫氫酶基因(Young等，用于產(chǎn)生化學(xué)制品的微生物遺傳工程(Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals)，Hollaender等(編)，第355頁，Plenum，紐約，1982；Ammerer，酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)101192-201，1983)的啟動子。對于真菌載體有用的啟動子的例子包括那些來源于構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)糖酵解基因的啟動子，例如adh3啟動子(McKnight等，EMBO J.42093-2099，1985)。該表達(dá)單元還可以包括轉(zhuǎn)錄終止子。適合的終止子的一個例子是adh3終止子(McKnight等，同上，1985)。
如同細(xì)菌載體一樣，酵母載體一般也包括選擇標(biāo)記，其可以是表現(xiàn)顯性表型的許多基因中的任意一種，條件是對于該顯性表型存在一種能夠篩選轉(zhuǎn)化體的表型試驗。優(yōu)選的選擇標(biāo)記是那些補充宿主細(xì)胞的營養(yǎng)缺陷、提供抗生素抗性或使細(xì)胞能夠利用特殊碳源的選擇標(biāo)記，包括leu2(Broach等，同上)、ura3(Botstein等，基因817，1979)或his3(Struhl等，同上)。另一個適合的選擇標(biāo)記是賦予酵母細(xì)胞氯霉素抗性的cat基因。
用于轉(zhuǎn)化真菌的技術(shù)在文獻(xiàn)中有很好的說明，見例如Beggs(同上)、Hinnen等(美國國家科學(xué)院院刊751929-1933，1978)、Yelton等(美國國家科學(xué)院院刊811740-1747，1984)和Russell(自然301167-169，1983)。宿主細(xì)胞的基因型可以含有由表達(dá)載體上存在的選擇標(biāo)記彌補的遺傳缺陷。對于具體宿主和選擇標(biāo)記的選擇是本領(lǐng)域熟知的。
轉(zhuǎn)化酵母的方法也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。例如，通過制備帶有DNA的酵母原生質(zhì)球(見Hinnen等，美國PNAS 751929，1978)或通過用堿式鹽(alkaline salts)例如LiCl處理(見Itoh等，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriology)153163，1983)，可以容易地實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。真菌轉(zhuǎn)化還可以采用聚乙二醇按Cullen等描述的方法(Bio/Technology5369，1987)進(jìn)行。
病毒載體包括那些含有指導(dǎo)編碼上述目的蛋白質(zhì)的分離核酸分子表達(dá)的啟動子的病毒載體。在本發(fā)明的范圍中可以使用許多種啟動子，包括例如諸如MoMLV LTR、RSV LTR、Friend MuLV LTR的啟動子、腺病毒啟動子(Ohno等，科學(xué)265781-784，1994)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶啟動子/增強子、細(xì)小病毒晚期啟動子(Koering等，人類基因治療(Hum.GeneTherap.)5457-463，1994)、皰疹TK啟動子、SV40啟動子、金屬硫蛋白IIa基因增強子/啟動子、巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動子、和巨細(xì)胞病毒的立即晚期啟動子。在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實施方案中，該啟動子是組織特異性啟動子(見例如WO 91/02805；EP 0,415,731；和WO 90/07936)。適合的組織特異性啟動子的代表性例子包括神經(jīng)特異性烯醇化酶啟動子、血小板來源的生長因子β的啟動子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)啟動子、人α1-chimaerin啟動子、突觸蛋白I啟動子和突觸蛋白II啟動子。除了上述啟動子外，為了靶向病毒、細(xì)菌、真菌或寄生物感染的特定細(xì)胞或組織，還可以使用其它的病毒特異性啟動子(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子，包括以上提到的逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子以及其它啟動子如HSV啟動子)，肝炎、皰疹(例如EBV)、和細(xì)菌、真菌或寄生物(例如瘧疾)的特異性啟動子。
適用于實施本發(fā)明的哺乳動物細(xì)胞包括尤其是COS、CHO、SaOS、骨肉瘤細(xì)胞、KS483、MG-63、原始成骨細(xì)胞、和人或哺乳動物的骨髓基質(zhì)。用于實施本發(fā)明的哺乳動物表達(dá)載體包括能夠指導(dǎo)克隆基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的啟動子。優(yōu)選的啟動子包括病毒啟動子和細(xì)胞啟動子。骨特異性啟動子包括骨唾液酸蛋白(sialo-protein)和骨鈣蛋白啟動子。病毒啟動子包括巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子(Boshart等，細(xì)胞(Cell)41521-530，1985)、巨細(xì)胞病毒立即晚期啟動子、SV40啟動子(Subramani等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell Biol.)1854-864，1981)、MMTV LTR、RSV LTR、金屬硫蛋白-1、腺病毒E1a。細(xì)胞啟動子包括小鼠金屬硫蛋白-1啟動子(Palmiter等，美國專利4,579,821)、小鼠VK啟動子(Bergman等，美國國家科學(xué)院院刊817041-7045，1983；Grant等，核酸研究155496，1987)和小鼠VH啟動子(Loh等，細(xì)胞3385-93，1983)。啟動子的選擇至少部分地取決于所期望的表達(dá)水平或待轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞系。
這些表達(dá)載體還可以含有一套位于啟動子下游以及編碼目的肽或蛋白質(zhì)的DNA序列上游的RNA拼接位點。優(yōu)選的RNA拼接位點可以從腺病毒和/或免疫球蛋白基因獲得。在該表達(dá)載體中還含有位于目的編碼序列下游的聚腺苷酸化信號。適合的聚腺苷酸化信號包括SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信號(Kaufman和Sharp，同上)、腺病毒5 E1B區(qū)的聚腺苷酸化信號和人生長激素基因終止子(DeNoto等，核酸研究93719-3730，1981)。該表達(dá)載體可以包括位于啟動子和RNA拼接位點之間的非編碼病毒前導(dǎo)序列，例如腺病毒2的三聯(lián)前導(dǎo)序列。優(yōu)選的載體還可以包括增強子序列例如SV40增強子。表達(dá)載體還可以包括編碼腺病毒VA RNAs的序列。適合的表達(dá)載體可以從商業(yè)途徑獲得(例如Stratagene，La Jolla，California)。
含有克隆DNA的載體結(jié)構(gòu)可以通過例如磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，細(xì)胞14725，1978；Corsaro和Pearson，體細(xì)胞遺傳學(xué)(Somatic CellGenetics)7603，1981；Graham和Van der Eb，病毒學(xué)(Virology)52456，1973)、電穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)或DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等(編)當(dāng)代分子生物學(xué)實驗指南(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons公司，紐約，1987)導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中。為了鑒定穩(wěn)定整合了克隆DNA的細(xì)胞，一般將選擇標(biāo)記與目的基因或cDNA一起導(dǎo)入細(xì)胞。用于哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞的優(yōu)選選擇標(biāo)記包括賦予藥物例如新霉素、潮霉素和氨甲蝶呤抗性的基因。該選擇標(biāo)記可以是可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記。優(yōu)選的可擴(kuò)增選擇標(biāo)記是DHFR基因和新霉素抗性基因。選擇標(biāo)記的綜述見Thilly(哺乳動物細(xì)胞技術(shù)(Mammalian Cell Technology)，ButterworthPublishers，Stoneham，Massachusetts，該文獻(xiàn)以參考文獻(xiàn)形式并入本文)。
在開始表達(dá)目的DNA序列之前，使含有適合載體的哺乳動物細(xì)胞生長一段時間，典型地是1-2天。然后應(yīng)用藥物篩選選擇以穩(wěn)定方式表達(dá)選擇標(biāo)記的細(xì)胞的生長。對于可擴(kuò)增選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可以逐步增加藥物濃度以選擇增加的克隆序列拷貝數(shù)，由此選擇增加的表達(dá)水平。選擇和篩選以期望形式或以期望水平產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的表達(dá)導(dǎo)入序列的細(xì)胞。然后可以克隆滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞，并按比例放大用于生產(chǎn)。
用于轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的操作是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。典型的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和原生質(zhì)體融合介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(見Sambrook等，同上)。裸載體結(jié)構(gòu)也可以在注射至哺乳動物(或其它動物)的肌肉中后被肌細(xì)胞或其它適合的細(xì)胞攝取。
根據(jù)本說明書，本領(lǐng)域已知的許多昆蟲宿主細(xì)胞也可以用于本發(fā)明。例如，Atkinson等(Pestic.Sci.28215-224，1990)綜述了桿狀病毒作為在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源DNA序列的載體的應(yīng)用。
根據(jù)本說明書，本領(lǐng)域已知的許多植物宿主細(xì)胞也可以用于本發(fā)明。例如Sinkar等(J.Biosci.(Bangalore)1147-58，1987)綜述了毛根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)作為在植物細(xì)胞中表達(dá)基因的載體的應(yīng)用。
在本發(fā)明的相關(guān)方面，可以在其生殖細(xì)胞和體細(xì)胞含有編碼目的蛋白質(zhì)的基因，而且該基因可操作地與對于該基因表達(dá)有效的啟動子相連的轉(zhuǎn)基因動物中，表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。或者，以類似的方式，可以制備缺乏目的基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如，“基因敲除”小鼠)?？梢栽诟鞣N非人類動物，包括小鼠、大鼠、兔、綿羊、狗、山羊和豬中制備這樣的轉(zhuǎn)基因動物(見Hammer等，自然315680-683，1985；Palmiter等，科學(xué)222809-814，1983；Brinster等，美國國家科學(xué)院院刊824438-4442，1985；Palmiter和Brinster，細(xì)胞41343-345，1985，和美國專利5,175,383、5,087,571、4,736,866、5,387,742、5,347,075、5,221,778和5,175,384)。簡單地說，通過例如微注射，將包括待表達(dá)的核酸分子以及適合定位的表達(dá)控制序列的表達(dá)載體導(dǎo)入受精卵的原核中。注射DNA的整合通過組織樣品DNA的印跡分析來檢測。優(yōu)選將導(dǎo)入的DNA并入動物的生殖系中，以便其可以被傳遞給該動物的后代。組織特異性表達(dá)可以通過使用組織特異性啟動子，或通過使用允許轉(zhuǎn)基因有調(diào)節(jié)地表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動子例如金屬硫蛋白基因啟動子(Palmiter等，1983，同上)來實現(xiàn)。
可以通過尤其是培養(yǎng)適合的宿主和載體系統(tǒng)產(chǎn)生本發(fā)明重組翻譯產(chǎn)物，分離蛋白質(zhì)。為了分離目的蛋白質(zhì)，然后可以通過各種純化程序，處理該細(xì)胞系的上清液，或者當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)不分泌到上清液中時處理蛋白質(zhì)包涵體或整個細(xì)胞。例如，首先可以采用商業(yè)上可獲得的蛋白質(zhì)濃縮濾器例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置，濃縮上清液。濃縮之后，可以將濃縮物加到適合的純化基質(zhì)例如與適合支持物結(jié)合的抗蛋白質(zhì)抗體上。或者，可以使用陰離子或陽離子交換樹脂來純化蛋白質(zhì)。作為再一種替代方法，可以使用一或多個反相高效液相色譜層析(RP-HPLC)步驟來進(jìn)一步純化該蛋白質(zhì)。分離本發(fā)明蛋白質(zhì)的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
如果根據(jù)SDS-PAGE分析以及之后的考馬斯亮蘭染色，未檢測到其它(非目的)蛋白質(zhì)，則在本發(fā)明的范圍中該蛋白質(zhì)被認(rèn)為是“分離的”。在其它實施方案中，該目的蛋白質(zhì)可以是分離的，以致根據(jù)SDS-PAGE分析以及之后的銀染檢測不到其它(非目的)蛋白質(zhì)。
3.核酸分子在本發(fā)明的其它方面，提供能夠抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的核酸分子。例如，在一個實施方案中，提供特異抑制TGF-β結(jié)合蛋白核酸序列表達(dá)的反義寡核苷酸分子(一般見，Hirashima等，RNA的分子生物學(xué)新的前景(Molecular Biology of RNANewPerspectives)(M.Inouye和B.S.Dudock編，1987，Academic出版社，San Diego，第401頁)；寡核苷酸基因表達(dá)的反義抑制物(OligonucleotidesAntisense Inhibitors of Gene Expression)(J.S.Cohen編，1989，MacMillan出版社，倫敦)；Stein和Cheng，科學(xué)2611004-1012，1993；WO 95/10607；美國專利5,359,051；WO 92/06693；和EP-A2-612844)。簡單地說，構(gòu)建這些分子以使它們與轉(zhuǎn)錄的TGF-β結(jié)合蛋白mRNA序列的一個區(qū)域互補，并能夠形成Watson-Crick堿基配對。所導(dǎo)致的雙鏈核酸將干擾該mRNA的隨后加工，由此阻止蛋白質(zhì)的合成(見實施例10)。
在本發(fā)明的其它方面，提供能夠抑制TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合TGF-β家族成員的核酶。本文所用的“核酶”旨在包括含有用于特異識別的反義序列和RNA切割酶活性的RNA分子。該催化鏈可以以高于化學(xué)計量的濃度切割靶RNA中的特異位點。許多種核酶可以用于本發(fā)明范圍中，包括例如錘頭核酶(如描繪于Forster和Symons，細(xì)胞48211-220，1987；Haseloff和Gerlach，自然328596-600，1988；Walbot和Bruening，自然334196，1988；Haseloff和Gerlach，自然334585，1988)；發(fā)夾核酶(例如描述于Haseloff等，1993年10月19日公布的美國專利5,254,678；以及Hempel等，1990年3月26日出版的歐洲專利公開文本0 360 257)；以及基于四膜蟲(Tetrahymena)核糖體RNA的核酶(見Cech等，美國專利4,987,071)。本發(fā)明核酶典型地由RNA構(gòu)成，但也可以由DNA、核酸類似物(例如硫代磷酸酯)或它們的嵌合物(例如DNA/RNA/RNA)構(gòu)成。
4.標(biāo)記(labels)上文和下文中描述的基因產(chǎn)物和所有的候選分子均可以用各種化合物標(biāo)記，這些化合物包括例如熒光分子、毒素和放射性核素。熒光分子的典型例子包括熒光素、藻膽色素蛋白例如藻紅蛋白、羅丹明、得克薩斯紅和熒光素酶。毒素的典型例子包括蓖麻毒素、相思豆毒蛋白、白喉毒素、霍亂毒素、gelonin、美洲商陸抗病毒蛋白、tritin、志賀菌毒素和假單胞菌外毒素A。放射性核素的典型例子包括Cu-64、Ga-67、Ga-68、Zr-89、Ru-97、Tc-99m、Rh-105、Pd-109、In-111、I-123、I-125、I-131、Re-186、Re-188、Au-198、Au-199、Pb-203、At-211、Pb-212和Bi-212。此外，上述抗體也可以與配體結(jié)合對的一個配偶體標(biāo)記或結(jié)合。代表性例子包括抗生物素蛋白-生物素和核黃素-核黃素結(jié)合蛋白。
用以上提及的代表性標(biāo)記結(jié)合或標(biāo)記本文所述分子的方法可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完成(見單端孢菌毒素抗體偶聯(lián)物，美國專利4,744,981；抗體偶聯(lián)物，美國專利5,106,951；熒光物質(zhì)和標(biāo)記技術(shù)，美國專利4,018,884；用于診斷和治療的金屬放射性核素標(biāo)記的蛋白質(zhì)，美國專利4,897,255；和用于改良鏊合動力學(xué)的金屬放射性核素鏊合的化合物，美國專利4,988,496；也見Inman，酶學(xué)方法(Methods inEnzymology)第34卷，親和技術(shù)，酶純化B部分，Jakoby和Wilchek(編)，Academic出版社，紐約，第30頁，1974；也見Wilchek和Bayer，“生物分析應(yīng)用中的抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物”，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)1711-32，1988)。
藥物組合物如上所述，本發(fā)明還提供各種藥物組合物，其含有一個抑制TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合TGF-β家族成員的上述分子，以及藥物學(xué)上或生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。一般地，此載體在使用劑量和濃度時對于受體是無毒性的。通常，這些組合物的制備需要該治療劑與如下物質(zhì)合并緩沖液、抗氧化劑例如抗壞血酸、低分子量(少于約10個殘基)多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖包括葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、鏊合劑例如EDTA、谷胱甘肽、及其它穩(wěn)定劑和賦形劑。中性緩沖鹽或與非特異性血清白蛋白混合的鹽是典型的適合稀釋劑。
此外，可以制備用于各種不同途徑給藥的本發(fā)明藥物組合物。而且，可以將本發(fā)明藥物組合物和提供該藥物組合物使用說明的包裝材料一起置于容器中。一般地，該說明包括一個描述該藥劑濃度的明確表述，以及在某些實施方案中，還包括對重新構(gòu)成該藥物組合物可能是必須的賦形劑成分或稀釋劑(例如水、鹽或PBS)的相對量的描述。
治療方法本發(fā)明還提供增加骨礦質(zhì)含量和礦質(zhì)密度的方法。簡單地說，有許多病癥會導(dǎo)致骨礦質(zhì)含量的降低，包括例如疾病、遺傳誘因、導(dǎo)致骨使用缺乏(例如由于骨折)的事故、導(dǎo)致骨吸收或殺死骨形成細(xì)胞的治療、以及正常老化。通過使用抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的本文所述分子，可以治療或預(yù)防這些病癥。如本文所使用的，應(yīng)當(dāng)理解，如果在選定位置骨礦質(zhì)含量以統(tǒng)計學(xué)顯著的方式(例如超過一倍半的標(biāo)準(zhǔn)差)獲得增加，則骨礦質(zhì)含量增加了。
導(dǎo)致骨礦質(zhì)含量降低的多種病癥均可以使用本文所述分子治療?；加羞@些病癥的患者可以通過使用熟知技術(shù)(見例如Harrison氏內(nèi)科醫(yī)學(xué)原理(Harrison’s Principles of Internal Medicine)，McGraw-Hill公司)進(jìn)行臨床診斷來識別?？梢灾委煹募膊〉拇硇岳影ㄆ渲写嬖诠堑牟徽ＩL或發(fā)育的發(fā)育異常。這些病癥的代表性例子包括軟骨發(fā)育不全、鎖骨顱骨發(fā)育不良、內(nèi)生軟骨瘤病、纖維性結(jié)構(gòu)不良、戈謝病、低磷佝僂病、Marfan病、遺傳性多發(fā)性外生骨疣(multiple hereditaryexotoses)、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、成骨不全、骨硬化病、脆弱性骨硬化、硬化損害(sclerotic lesions)、骨折、牙周病、假關(guān)節(jié)和生膿性骨髓炎(pyogenic oseomyelitis)。
其它可以治療或預(yù)防的病癥包括許多引起骨質(zhì)減少(即，造成骨礦質(zhì)含量或密度比青年時期的峰值骨骼礦質(zhì)含量低一個以上標(biāo)準(zhǔn)差的病癥)的原因。這些病癥的代表性例子包括貧血狀態(tài)、類固醇引起的疾病、肝素造成的疾病、骨髓疾病、壞血病、營養(yǎng)不良、鈣缺乏癥、特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、先天性骨質(zhì)減少或骨質(zhì)疏松癥、醇中毒、慢性肝疾病、衰老、絕經(jīng)后狀態(tài)、月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、妊娠、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)、庫欣病、肢端肥大癥、性腺功能減退癥、不活動或廢用(immobilization anddisuse)、反射交感性營養(yǎng)不良綜合征、短暫性區(qū)域骨質(zhì)疏松和骨軟化。
在本發(fā)明的一個方面，可以通過給恒溫動物施用治療上有效量的抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的分子，來增加骨礦質(zhì)含量或密度?？梢灾委煹暮銣貏游锏睦影棺祫游锖筒溉閯游铮ɡ珩R、奶牛、豬、綿羊、狗、貓、大鼠和小鼠。治療分子的代表性例子包括核酶、核酶基因、反義寡核苷酸和抗體(例如人源化抗體)。
在本發(fā)明的其它方面，提供用于增加骨密度的方法，包括步驟向返回骨的細(xì)胞導(dǎo)入指導(dǎo)抑制TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合TGF-β家族成員的分子表達(dá)的載體，并給恒溫動物施用該含有載體的細(xì)胞。簡單地說，返回骨的細(xì)胞可以直接從患者的骨(例如CD34+、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等從骨髓獲得的細(xì)胞)、外周血或培養(yǎng)物獲得。
將指導(dǎo)抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的分子表達(dá)的載體導(dǎo)入細(xì)胞中。適合載體的典型例子包括病毒載體例如皰疹病毒載體(例如美國專利5,288,641)、腺病毒載體(例如WO 94/26914、WO 93/9191；Kolls等，PNAS 91(1)215-219，1994；Kass-Eisler等，PNAS90(24)11498-502，1993；Guzman等，血液循環(huán)(Circulation)88(6)2832-48，1993；Guzman等，Cir.Res.73(6)1202-1207，1993；Zabner等，細(xì)胞75(2)207-216，1993；Li等，人類基因治療4(4)403-409，1993；Caillaud等，歐洲神經(jīng)科學(xué)雜志(Eur.J.Neurosci.)5(10)1287-1291，1993；Vincent等，Nat.Genet.5(2)130-134，1993；Jaffe等，Nat.Genet.1(5)372-378，1992；和Levrero等，基因101(2)195-202，1991)、腺伴隨病毒載體(WO 95/13365；Flotte等，PNAS 90(22)10613-10617，1993)、桿狀病毒載體、細(xì)小病毒載體(Koering等，人類基因治療5457-463，1994)，痘病毒載體(Panicali和Paoletti，PNAS 794927-4931，1982；和Ozaki等，Biochem.Biophys.Res.Comm.193(2)653-660，1993)、和逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如EP 0,415,731；WO90/07936；WO 91/0285；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；美國專利5,219,740；WO 93/11230；WO 93/10218)。同樣可以構(gòu)建含有混合的不同病毒或非病毒來源的不同元件(例如啟動子、包膜序列(envelope sequence)等)的病毒載體。在各種實施方案中，病毒載體本身或含有病毒載體的病毒顆粒均可以用于以下描述的方法和組合物中。
在本發(fā)明的其它實施方案中，可以通過各種技術(shù)施用編碼抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的分子的核酸分子本身，這些技術(shù)包括例如施用與聚L-賴氨酸DNA復(fù)合物偶聯(lián)的脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Cristano等，PNAS 92122-92126，1993)、與滅活腺病毒相連的DNA(Curiel等，人類基因治療3(2)147-154，1992)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)的導(dǎo)入(DMRIE-DOPE，Vical，California)；直接DNA注射(Acsadi等，自然352815-818，1991)；DNA配體(Wu等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)24616985-16987，1989)；脂轉(zhuǎn)染(Felgner等，美國國家科學(xué)院院刊847413-7417，1989)；脂質(zhì)體(Pickering等，Circ.89(1)13-21，1994；和Wang等，PNAS 847851-7855，1987)；微粒轟擊(Williams等，PNAS 882726-2730，1991)；和單獨(Vile和Hart，癌癥研究(CancerRes.)533860-3864，1993)或利用PEG-核酸復(fù)合物直接遞送編碼該蛋白質(zhì)的核酸分子本身。
可以由本發(fā)明載體表達(dá)的分子的代表性例子包括核酶和反義分子，它們每一種均已在上文中作了更為詳細(xì)的討論。
可以直接通過使用X射線(例如雙能X射線吸收測量術(shù)，或“DEXA”)，或通過從骨更新標(biāo)志(成骨細(xì)胞特異性堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、I型原膠C’原前肽(PICP)、和總的堿性磷酸酶；見Comier，C.，Curr.Opin.in Rheu.7243，1995)或骨吸收標(biāo)志(吡啶啉、脫氧吡啶啉、N-端肽、尿羥脯氨酸、血漿酒石酸(tartate)抗性酸性磷酸酶和半乳糖基羥賴氨酸；見Comier，同上)進(jìn)行的推導(dǎo)，確定骨礦質(zhì)含量的增加。還可以從體重或利用其它方法(見Guinness-Hey，Metab.Bone Dis.and Rel.Res.5177-181，1984)計算骨質(zhì)的量。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明了的，給藥的量和頻率當(dāng)然將取決于諸如所治療的指征的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、期望的反應(yīng)、患者的情況等等因素。典型地，本發(fā)明組合物可以通過以上提及的各種技術(shù)來施用。
我們提供以下實施例作為說明，而非限制。
實施例實施例1硬化性狹窄作圖定位于人類第17號染色體長臂對人類負(fù)責(zé)硬化性狹窄(sclerosteosis)的缺陷的遺傳作圖將負(fù)責(zé)該疾病的基因定位在人第17號染色體的區(qū)域，該區(qū)域編碼一個新的TGF-β結(jié)合蛋白家族成員。在硬化性狹窄中，與非患病個體相比，患者骨骼骨表現(xiàn)出在礦質(zhì)密度方面的實質(zhì)增加。頭骨也表現(xiàn)出過度生長。硬化性狹窄患者通常是健康的，盡管他們可能在出生時表現(xiàn)出不同程度的并指(趾)，并在顱骨中表現(xiàn)出不同程度的顱壓迫和神經(jīng)壓迫。
將收集自發(fā)生該疾病的24個南非Afrikaaner家族的DNA樣品應(yīng)用純合性作圖方法，對硬化性狹窄相關(guān)的基因缺陷進(jìn)行連鎖分析(Sheffield等，1994，人類分子遺傳學(xué)(Human Molecular Genetics)31331-1335，“3號染色體上巴-比綜合征座位的鑒定以及對一種有效的純合性作圖方法的評價(Idendification of a Bardet-Biedl syndrome locus onchromosone 3 and evaluation of an efficient approach tohomozygosity mapping)”)。該南非Afrikaaner群體在遺傳上是同質(zhì)的；該群體是幾個世紀(jì)前定居在該地區(qū)的少數(shù)建立者的后裔，自建立之后由于地理和社會障礙該群體一直是隔離的。除了此Afrikaaner群落外，世界各地的硬化性狹窄是稀少的，這提示在該建立群體中存在該基因的突變，而且隨著該群體的增大該基因突變在數(shù)量上也隨之增加。純合性作圖的使用是基于如下假設(shè)在來自近親家族和隔離群體的患病個體中，與隱性突變相鄰的DNA作圖標(biāo)記很可能是純合的。
選擇一套371個來自常染色體的微衛(wèi)星標(biāo)記(Research Genetics，第6套)，用以對來自硬化性狹窄患者樣品的DNA庫進(jìn)行分型。用于該分析的DNA樣品來自24個家族中的29名硬化性狹窄患者，59名未患病家族成員，以及一組來自同一群體的無關(guān)對照個體。這些庫由4-6名個體組成，這些個體或是患病個體、來自近親家族的患病個體、雙親和未患病同胞，或是無關(guān)對照。在無關(guān)個體庫中和在大多數(shù)有患病個體或家族成員的庫中，對所述標(biāo)記的分析顯示，每一個標(biāo)記均有幾種等位基因大小。標(biāo)記D17S1299顯示是純合性的指示在幾個患病個體庫中均顯示為一條帶。
用D17S1299區(qū)域(17q12-q21)中的總共19個標(biāo)記對所有24個硬化性狹窄家族進(jìn)行分型。每個家族的患病個體均顯示出在該區(qū)域是純合的，而且對于核心單元型(core haplotype)這29名個體中的25名是純合的；他們每一個在D17S1787和D17S930之間都具有相同的等位基因。其它4名個體的一條染色體與該單元型相匹配，而第二條染色體與之不匹配。總之，該數(shù)據(jù)有力地說明此3兆堿基區(qū)域含有該硬化性狹窄突變。對此3兆堿基區(qū)域中的大多數(shù)外顯子的序列分析，鑒定了一個定位于新TGF-β結(jié)合蛋白編碼序列中的無義突變(SEQ ID No.1第117位的C＞T突變導(dǎo)致一個終止密碼子)。該突變表現(xiàn)出是Afrikaaner后裔的硬化性狹窄患者和攜帶者所獨有的。該基因的本質(zhì)通過鑒定其內(nèi)含子中的突變(內(nèi)含子的+3位存在A＞T的突變)得到進(jìn)一步證實，該內(nèi)含子的突變在一名單個的患有確診硬化性狹窄的無關(guān)患者中導(dǎo)致不正確的mRNA加工。
實施例2TGF-β結(jié)合蛋白基因表達(dá)的組織特異性A.通過RT-PCR分析人類Beer基因的表達(dá)采用商業(yè)途徑可獲得的試劑盒(“用于第一鏈cDNA合成的Superscript Preamplification System”，Life Technologies，Rockville，MD)，從以下總RNA樣品制備第一鏈cDNA人腦、人肝、人脾、人胸腺、人胎盤、人骨骼肌、人甲狀腺、人腦垂體、人成骨細(xì)胞(NHOst，獲自Clonetics公司，San Diego，CA)、人骨肉瘤細(xì)胞系(Saos-2，ATCC#HTB-85)、人骨、人骨髓、人軟骨、非洲獼猴骨、釀酒酵母、和人外周血單核細(xì)胞。除了以下樣品是內(nèi)部制備的之外，所有其它這些RNA樣品均從商業(yè)途徑(Clontech，Palo Alto，CA)購買人成骨細(xì)胞、人骨肉瘤細(xì)胞系、人骨、人軟骨和非洲獼猴骨。這些內(nèi)部RNA樣品的制備采用了商業(yè)上可獲得的試劑盒(“TRI試劑”，Molecular Research Center公司，Cincinnati，OH)。
在這些樣品和作為對照的人基因組樣品上進(jìn)行PCR。Beer的有義寡核苷酸引物的序列是5’-CCGGAGCTGGAGAACAACAAG-3’(SEQ ID NO19)。Beer的反義寡核苷酸引物的序列是5’-GCACTGGCCGGAGCACACC-3’(SEQ IDNO20)。此外，采用針對人β-肌動蛋白基因的引物進(jìn)行PCR，作為對照。β-肌動蛋白的有義寡核苷酸引物具有序列5’-AGGCCAACCGCGAGAAGATGACC-3’(SEQ ID NO21)。β-肌動蛋白的反義寡核苷酸引物具有序列5’-GAAGTCCAGGGCGACGTAGCA-3’(SEQ ID NO22)。采用標(biāo)準(zhǔn)條件在25ul反應(yīng)中，以61攝氏度作為退火溫度，進(jìn)行PCR。用Beer引物進(jìn)行32個PCR循環(huán)，而用β-肌動蛋白的引物進(jìn)行24個PCR循環(huán)。
擴(kuò)增之后，每個反應(yīng)的12ul通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色進(jìn)行分析。見圖2A。B.小鼠胚胎切片的RNA原位雜交采用廠商的操作指南，將小鼠的全長Beer cDNA(SEQ ID No.11)以反義和有義方向克隆至pCR2.1載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使用Ambion公司(Austin，TX)提供的體外轉(zhuǎn)錄試劑，合成35-S-α-GTP標(biāo)記的cRNA有義和反義轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)Lyons等的操作方法(細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Cell Biol.)1112427-2436，1990)，進(jìn)行原位雜交。
小鼠Beer cRNA探針在發(fā)育中的小鼠胚胎的神經(jīng)管、肢芽、血管和正在骨化的軟骨中檢測到特異表達(dá)信號。圖3的A部分顯示了肢芽(l)的外胚層頂嵴(apical ectodermal ridge)(aer)、血管(bv)和神經(jīng)管(nt)中的表達(dá)。B部分顯示了第4腦室(4)中的表達(dá)。C部分顯示了下頜骨(ma)、頸椎(cv)、枕骨(oc)、腭(pa)、和血管(by)中的表達(dá)。D部分顯示了肋骨(r)和心瓣膜(va)中的表達(dá)。A部分是10.5dpc胚胎的橫切片。B部分是12.5dpc胚胎的縱向切片。C和D部分均是15.5dpc胚胎的縱向切片。ba＝鰓弓、h＝心臟、te＝端腦(前腦)、b＝腦、f＝額鼻塊(frontonasal mass)、g＝腸、h＝心臟、j＝頜、li＝肝、lu＝肺、ot＝聽泡、ao＝、sc＝脊髓、skm＝骨骼肌、ns＝鼻竇、th＝胸腺、to＝舌、fl＝前肢、di＝隔膜實施例3重組Beer蛋白的表達(dá)和純化A.在COS-1細(xì)胞中的表達(dá)采用如下PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼人全長Beer蛋白質(zhì)的DNA序列5’寡核苷酸引物的序列是5’-AAGCTTGGTACCATGC AGCTCCCAC-3’(SEQ IDNO23)，含有一個Hind III限制性酶位點(粗體)，其后是從推測的氨基端起始密碼子(ATG)之前的6個堿基對開始的Beer基因的19個核苷酸。3’寡核苷酸引物的序列是5’-AAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCT-3’(SEQ IDNO24)，含有一個Hind III限制性酶位點(粗體)，之后是一個反向互補終止密碼子(CTA)，再之后是FLAG表位的反向互補序列(下劃線，Sigma-Aldrich公司，St.Louis，MO)，而其側(cè)翼是編碼Beer羧基端5個氨基酸的核苷酸的反向互補序列。將此PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆(“OriginalTA克隆試劑盒”，Invitrogen，Carlsbad，CA)，并通過DNA測序?qū)蝹€克隆進(jìn)行篩選。然后用Hind III消化經(jīng)序列證實的克隆，并使用商業(yè)上可獲得的試劑(“QIAquick凝膠提取試劑盒”，Qiagen公司，Valencia，CA)在1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行純化。然后用T4 DNA連接酶將該片段與經(jīng)HindIII消化、磷酸酶處理的pcDNA3.1質(zhì)粒(Invitrogen，Carlshad，CA)連接起來。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，并在含有100ug/ml氨芐青霉素的LB平板上鋪板。使用相應(yīng)于pcDNA3.1中T7啟動子/引物位置的5’引物，和相應(yīng)于內(nèi)在BEER序列的反向互補序列，且具有5’-GCACTGGCCGGAG CACACC-3’(SEQ ID NO25)序列的3’引物，通過基于PCR的篩選，鑒定帶有正確方向的期望重組體的菌落?？寺∑蔚男蛄型ㄟ^DNA測序證實。
采用COS-1細(xì)胞(ATCC#CRL-1650)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用商業(yè)上可獲得的試劑盒，依據(jù)廠商提供的操作指導(dǎo)(“DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染試劑盒”，SigmaChemical公司，St.Louis，MO)，用50ug表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Beer-Flag進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的最終培養(yǎng)基是含有0.1％胎牛血清的DMEM(LifeTechnologies，Rockville，MD)。培養(yǎng)4天后，取出該培養(yǎng)基。通過SDS-PAGE和Western印跡，使用抗FLAG M2單克隆抗體(Sigma-Aldrich公司，St.Louis，MO)，分析重組BEER蛋白的表達(dá)。重組BEER蛋白使用抗FLAG M2親和柱(“哺乳動物瞬時表達(dá)系統(tǒng)”，Sigma-Aldrich公司，St.Louis，MO)純化。通過SDS-PAGE和Western印跡，使用抗FLAG M2單克隆抗體，分析親和柱曲線成分。B.在SF9昆蟲細(xì)胞中表達(dá)使用如下引物和標(biāo)準(zhǔn)條件，PCR擴(kuò)增人Beer基因序列有義引物5’-GTCGTCGGATCCATGGGGTGGCAGGCGTTCAAGA ATGAT-3’(SEQ IDNO26)反義引物5’-GTCGTCAAGCTTCTACTTGTCATCGTCCTTGTAGTCGTAGGCGTTCTCCAGCTCGGC-3’(SEQ ID NO27)所獲cDNA含有帶有兩處修改的Beer編碼區(qū)。N-端分泌信號被去除，而且FLAG表位尾(Sigma)以符合閱讀框的形式融合到插入片段的C末端。為了轉(zhuǎn)移到桿狀病毒表達(dá)載體中，使用標(biāo)準(zhǔn)方法添加BamHI和HindIII克隆位點，并將該基因亞克隆至pMelBac載體(Invitrogen)中。
采用Bac-N-Blue轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)制備表達(dá)Beer蛋白的重組桿狀病毒，并根據(jù)廠商說明書進(jìn)行純化。
在含有10％胎牛血清的TNM_FH培養(yǎng)基(Invitrogen)中維持SF9細(xì)胞(Invitrogen)。對于蛋白表達(dá)，在轉(zhuǎn)瓶中以大于10的MOI感染SF9培養(yǎng)物。每天采取培養(yǎng)基和細(xì)胞樣品，持續(xù)5天，并通過Western印跡使用抗FLAG M2單克隆抗體(Sigma)或抗Beer兔多克隆抗血清監(jiān)測Beer的表達(dá)。
5天后，通過離心收獲桿狀病毒感染的SF9細(xì)胞，并采用高鹽提取緩沖液(1.5M NaCl，50mM Tris pH7.5)從細(xì)胞沉淀中提取細(xì)胞相連的蛋白質(zhì)。通過離心澄清該提取物(20ml/300ml培養(yǎng)物)，對4升Tris緩沖鹽(150mM NaCl，50mM Tris pH7.5)透析三次，并通過再次離心澄清。將該高鹽組分施加于Hitrap Heparin(Pharmacia；5ml柱床體積)，用HEPES緩沖鹽(25mM HEPES 7.5，150mM NaCl)進(jìn)行大量洗滌，并使用150mMNaCl-1200mM NaCl的梯度洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。在大約800mM NaCl時觀察到Beer的洗脫。向含有Beer的組分補加甘油和DTT分別達(dá)到10％的甘油和1mM的DTT，然后在-80℃凍存。
實施例4抗Beer、Gremlin和Dan的多克隆抗體的制備和檢測A.抗原的制備使用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法和如下寡核苷酸引物擴(kuò)增人Beer、人Gremlin和人Dan的DNA序列。人Beer有義5’-GACTTGGATCCCAGGGGTGCCAGGCGTTC-3’(SEQ ID NO28)反義5’-AGCATAAGCTTCTAGTAGGCGTTCTCCAG-3’(SEQ ID NO29)人Gremlin有義5’-GACTTGGATCCGAAGGGAAAAAGAAAGGG-3’(SEQ ID NO30)反義5’-AGCATAAGCTTTTAATCCAAATCGATGGA-3’(SEQ ID NO31)人Dan有義5’-ACTACGAGCTCGGCCCCACCACCCATCAACAAG-3’(SEQ ID NO32)反義5’-ACTTAGAAGCTTTCAGTCCTCAGCCCCCTCTTCC-3’(SEQ ID NO33)在每一種情況中，列出的引物均擴(kuò)增除去了分泌信號序列的完整編碼區(qū)。這些擴(kuò)增序列包括用于亞克隆至細(xì)菌表達(dá)載體pQE-30(Qiagen公司，Valencia，CA)的BamHI/HindIII位點(對于Beer和Gremlin)和SacI/HindIII位點(對于Dan)的限制性位點。pQE-30在該克隆區(qū)域的5’末端含有一個編碼6×His尾的序列。用該完整結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M-15/pRep(Qiagen公司)，并且通過測序驗證單個克隆。按廠商(Qiagen，The QIAexpression)所述在M-15/pRep中表達(dá)蛋白質(zhì)并對其進(jìn)行純化(6×His親和尾結(jié)合與Sepharose偶聯(lián)的Ni-NTA)。
在6M胍中進(jìn)行溶解，從大腸桿菌相當(dāng)大量地回收Beer蛋白，然后透析使胍濃度降至2-4M以防治在貯存過程中出現(xiàn)沉淀。用6M胍溶解，回收更大量的Gremlin和Dan蛋白，經(jīng)純化后胍濃度為0.5M。B.多克隆抗體的生產(chǎn)和檢測采用標(biāo)準(zhǔn)操作，在兔和雞宿主中制備分別針對這3種抗原的多克隆抗體(R & R抗體，Stanwood，WA；家兔免疫和抗血清回收的標(biāo)準(zhǔn)操作；精編分子生物學(xué)實驗指南(Short Protocols in Molecular Biology)第2版，1992，11.37-11.41。捐贈者Helen M.Cooper和Yvonne Paterson；由Strategic Biosolutions(Ramona，CA)制備雞抗血清，)。
通過Western印跡篩選具有活性的家兔抗血清和雞卵的Igy組分。三個抗體分別通過PAGE分離，并轉(zhuǎn)移至0.45um硝酸纖維素膜上(Novex，San Diego，CA)。將該膜剪成條狀，每個條含有大約75ng的抗原。在3％的印跡級阻斷劑(Blotting Grade Block)(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)中封閉這些條，然后在1×Tris緩沖鹽(TBS)/0.02％TWEEN緩沖液中洗滌3次。將這些條與一抗(免疫前血液、兔抗血清或雞卵IgY在封閉緩沖液中的1∶100-1∶10,000稀釋液)一起孵育1小時，并伴隨輕柔地滾動。經(jīng)第二遍用1×TBS/0.02％TWEEN進(jìn)行的三次洗滌之后，與二抗(過氧化物酶偶聯(lián)的驢抗兔抗體，Amersham Life Science.Piscataway，NJ；或過氧化物酶偶聯(lián)的驢抗雞抗體，JacksonImmunoResearch，West Grove，PA)孵育一小時。最后一輪用1×TBS/0.02％TWEEN進(jìn)行的三次洗滌之后，用Lumi-Light Western印跡底物(RocheMolecular Biochemicals，Mannheim，德國)顯色這些條。C.抗體的交叉反應(yīng)性檢測
按前面部分描述的操作方法，將Beer、Gremlin或Dan的硝酸纖維素條帶與它們各自的兔抗血清或雞卵IgY的稀釋液(1∶5000和1∶10,000)以及其余兩種抗原產(chǎn)生的抗血清或雞卵IgY(稀釋液1∶1000和1∶5000)一起孵育。增加非匹配抗體的水平，以檢測僅在濃度增加時才可能被觀察到的這些抗體的低親和結(jié)合。對于使用上述操作的所有三個結(jié)合事件，顯色反應(yīng)的操作和持續(xù)時間是相同的。對于所有測試的抗原，均未觀察到抗原的交叉反應(yīng)性。
實施例5Beer與TGF-β超家族蛋白質(zhì)的相互作用采用免疫沉淀方法研究Beer與來自TGF-β超家族的不同系統(tǒng)發(fā)生支的蛋白質(zhì)的相互作用。從商業(yè)途徑獲得純化的TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6和GDNF(R & D system；Minneapolis MN)。典型的操作步驟如下。部分純化的Beer在HEPES緩沖鹽(25mMHEPES 7.5，150mM NaCl)中透析。在300ul IP緩沖液(150mM NaCl，25mM Tris pH7.5，1mM EDTA，1.4mM β-巰基乙醇，0.5％triton X-100和10％甘油)中進(jìn)行免疫沉淀。在存在和不存在500ng FLAG表位標(biāo)記的Beer時，將30ng重組人BMP-5蛋白(R & D system)加在15ul FLAG親和基質(zhì)(Sigma；St.Louis MO)上。4℃孵育這些蛋白質(zhì)4小時，然后在IP緩沖液(每次洗滌1ml)中洗滌與親和基質(zhì)相連的蛋白質(zhì)。將結(jié)合蛋白質(zhì)從親和基質(zhì)上洗脫至60ul 1×SDS PAGE樣品緩沖液中。通過SDS PAGE分離這些蛋白質(zhì)，并采用抗BMP-5抗血清(Research Diagnostics公司)通過Western印跡檢測與Beer相連的BMP-5(見圖5)。Beer配體結(jié)合試驗在100ul PBS/0.2％BSA中加入FLAG-Beer蛋白質(zhì)(20ng)，然后吸附至預(yù)先用抗FLAG單克隆抗體(Sigma，St.Louis MO)包被、用溶于PBS的10％BSA封閉的96孔微滴定板的每個孔中。這在室溫進(jìn)行60分鐘。去除該蛋白質(zhì)溶液，并洗滌這些孔以去除未結(jié)合蛋白質(zhì)。向每個孔加入溶于PBS/0.2％BSA的BMP-5，濃度范圍從10pM至500nM，然后室溫孵育2小時。去除結(jié)合溶液，并用200ul體積的PBS/0.2％BSA洗滌該板三次。然后使用BMP-5抗血清通過ELISA(F.M.Ausubel等(1998)當(dāng)代分子生物學(xué)實驗指南(Current Protocols in Mol.Biol.)第2卷，11.2.1-11.2.22)，檢測BMP-5的水平。通過從總結(jié)合中減掉非特異結(jié)合來計算特異結(jié)合，并通過LIGAND程序(Munson和Podbard，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem)，107，第220-239頁，1980)進(jìn)行分析。
在該方法的一個變化中，改造Beer并將其表達(dá)成人Fc融合蛋白質(zhì)。同樣對配體BMP進(jìn)行改造，并表達(dá)成小鼠Fc融合蛋白質(zhì)。將這些蛋白質(zhì)一起孵育，按Mellor等所述的方法采用均一時間分辨熒光檢測(homogeneous time resolved fluorescence detection)(G.W.Mellor等，J.of Biomol.Screening，3(2)91-99，1998)，進(jìn)行分析。
實施例6抑制TGF-β結(jié)合蛋白與TGF-β家族成員結(jié)合的篩選試驗重復(fù)上述試驗，除了兩處例外。第一，BMP濃度固定在預(yù)先確定的Kd值上。第二，加入固定濃度的候選拮抗劑集合(對于有機(jī)小分子集合為20uM，而在抗體研究中為1uM)。結(jié)合TGF-β結(jié)合蛋白的這些候選分子(拮抗劑)包括商業(yè)來源的或內(nèi)部收集的有機(jī)化合物，這些有機(jī)化合物代表了各種的化學(xué)結(jié)構(gòu)。這些化合物在DMSO中制成貯存液，并在標(biāo)準(zhǔn)試驗條件下以≤1％的終體積加入試驗孔中。與BMP和Beer一起室溫孵育2小時，去除該溶液并按所描述的方法定量結(jié)合的BMP。在沒有化合物或抗體時觀察到的對BMP結(jié)合產(chǎn)生40％抑制的試劑被認(rèn)為是該相互作用的拮抗劑?；诘味ㄑ芯恳詼y定這些試劑的抑制常數(shù)和它們對TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合親和性的影響，進(jìn)一步作為潛在抑制物評價這些試劑。通過使用基于BMP配體作用的試驗的研究(例如BMP/BMP受體競爭研究)，還可以進(jìn)行可比較的特異性對照試驗，以確立該鑒定拮抗劑的選擇性分布圖。
實施例7
對TGF-β結(jié)合蛋白的骨基質(zhì)定位的抑制使用修改的Nicolas方法(Nicolas，V.Calcif Tissue Int.57206，1995)，評價對骨基質(zhì)(羥基磷灰石)定位的抑制。簡單地說，按Nicolas(同上)所述方法制備125I標(biāo)記的TGF-β結(jié)合蛋白。向配有聚丙烯濾膜(Polyfiltroninc，Weymouth MA)的96孔微滴定板的每個孔中加入羥基磷灰石。將TGF-β結(jié)合蛋白加入含有0.2％白蛋白的PBS緩沖液中。用該緩沖液洗滌含有基質(zhì)的孔三次。使用0.3M NaOH洗脫吸附的TGF-β結(jié)合蛋白，并進(jìn)行定量。
通過TGF-β結(jié)合蛋白與測試分子的孵育，以及將該混合物施加到上述基質(zhì)上，進(jìn)行抑制物的鑒定。用含有0.2％白蛋白的PBS緩沖液洗滌該基質(zhì)三次。使用0.3M NaOH洗脫吸附的TGF-β結(jié)合蛋白，并進(jìn)行定量。在沒有化合物或抗體的情況下觀察到對TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合的40％抑制的試劑被認(rèn)為是骨定位抑制劑。通過劑量反應(yīng)研究測定這些抑制劑的抑制常數(shù)和它們對TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合親和性的影響，進(jìn)一步表征這些抑制劑。
實施例8TGF-β結(jié)合蛋白突變體的構(gòu)建A.誘變pBluescript SK中的全長TGF-β結(jié)合蛋白cDNA充當(dāng)誘變模板。簡單地說，使用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)和適合的引物(見以上提供的討論)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生該DNA片段。在廠商提供的緩沖液中，使用57℃退火溫度，進(jìn)行該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)23個循環(huán)。然后將產(chǎn)物暴露于兩個限制性酶，并在使用瓊脂糖凝膠電泳分離后，將其連接回通過酶消化去除了對應(yīng)序列的pRBP4-503中。通過DNA測序驗證該突變體的完整性。B.突變TGF-β結(jié)合蛋白的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)和分離將該突變TGF-β結(jié)合蛋白cDNA轉(zhuǎn)移至實施例3所述的pcDNA3.1哺乳動物表達(dá)載體中。在驗證序列后，用所獲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，并按實施例3所述純化分泌的蛋白質(zhì)。
實施例9動物模型-I超量表達(dá)Beer基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生使用從CITB小鼠基因組DNA文庫(由Research Genetics，Huntsville，AL獲得)分離的～200千堿基(kb)BAC克隆15G5，確定小鼠Beer基因的全部序列以及其5’和3’側(cè)翼區(qū)。將含有該完整基因體以及～17kb的5’側(cè)翼序列和～20kb的3’側(cè)翼序列的41kb SalI片段亞克隆至SuperCosI粘粒載體(Stratagene，La Jolla，CA)的BamHI位點，并在大腸桿菌菌株DH10B中增殖。然后從該粘粒結(jié)構(gòu)，采用常規(guī)手段，凝膠純化含有完整小鼠Beer基因以及分別長17kb和14kb的5’和3’側(cè)翼序列的35kbMluI-AviII限制性片段(序列號6)，用于微注射小鼠受精卵(DNX轉(zhuǎn)基因；美國專利4,873,191)。以5-30％的活產(chǎn)幼崽頻率獲得其中克隆DNA片段隨機(jī)整合在基因組中的建立者動物(founder animal)。通過從少量小鼠組織例如尾尖提取基因組DNA，并進(jìn)行Southern印跡分析，驗證該轉(zhuǎn)基因的存在。DNA的提取采用如下操作程序在含有200mM NaCl，100mMTris pH8.5，5mM EDTA，0.2％SDS和0.5mg/ml蛋白酶K的裂解緩沖液中，55℃過夜消化組織。第二天，該DNA用酚/氯仿(50∶50)抽提一次，用氯仿/異戊醇(24∶1)抽提一次，然后用乙醇進(jìn)行沉淀。重懸在TE(10mMTris pH7.5，1mM EDTA)中后，每份8-10ug DNA樣品用限制性內(nèi)切酶例如EcoRI消化，然后進(jìn)行凝膠電泳并將其轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜例如HyBondN+(Amersham，Arlington Heights，IL)上。然后用放射性標(biāo)記的DNA片段雜交該所獲得的濾膜，該放射性標(biāo)記DNA片段來源于小鼠Beer基因座位并且既能識別來自內(nèi)源性基因座位的片段又能識別來自轉(zhuǎn)基因的具有不同大小的片段。將建立者動物與非轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行配種，產(chǎn)生足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因后代，并在其中測定Beer基因超量表達(dá)的影響。對于這些研究，對各種年齡的動物(例如，1天、3周、6周、4個月)進(jìn)行多種不同的設(shè)計用來查明總的骨骼形成、骨礦質(zhì)密度、骨礦質(zhì)含量、破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活性、軟骨內(nèi)骨化程度、軟骨形成等的試驗。轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄活性可以通過如下步驟進(jìn)行測定從不同組織中提取RNA，并采用RT-PCR進(jìn)行分析，該分析利用了轉(zhuǎn)基因來源的小鼠品系(129Sv/J)和用于DNA微注射的小鼠品系[(C57BL5/J×SJL/J)F2]之間的單核苷酸多態(tài)性。
動物模型-II通過同源重組破壞小鼠的Beer基因在胚胎干(ES)細(xì)胞中進(jìn)行的同源重組可以用以失活小鼠的內(nèi)源性Beer基因，并隨之產(chǎn)生帶有功能缺失突變的動物。將報告基因例如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因通過基因工程插入導(dǎo)向載體，使其表達(dá)可以受到內(nèi)源性Beer基因啟動子和翻譯起始信號的控制。以此方式，可以在帶有定向等位基因的動物中，測定Beer基因表達(dá)的空間和時間模式。
首先通過將磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子驅(qū)動的可藥物篩選的新霉素抗性基因(neo)盒從pGT-N29(New England Biolabs，Beverly，MA)克隆至克隆載體pSP72(Promega，Madson，WI)中，構(gòu)建該導(dǎo)向載體。使用PCR，給該PGKneo盒的側(cè)翼加上噬菌體P1 loxP位點，該位點是P1 Cre重組酶的識別位點(Hoess等，美國PNAS，793398，1982)。這就允許之后在被打靶的ES細(xì)胞或ES細(xì)胞來源的動物中除去該neo抗性標(biāo)記(美國專利4,959,317)。該PCR引物由loxP的34個核苷酸(ntd)序列，與PGKneo盒的5’和3’末端互補的15-25ntd，以及用于克隆至pSP72的限制性酶識別位點(有義引物中為BamHI，反義引物中為EcoRI)組成。有義引物的序列是5’-AATCTGGATCCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGCAGGATTCGAGGGCCCCT-3’(SEQ ID NO34)；反義引物的序列是5’-AATCTGAATTCCACCGGTGTTAATTAAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAGATCTAGAGTCAGCTTCTGA-3’(SEQ ID NO35)。
下一步是將含有該大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因和SV40聚腺苷酸化信號的3.6kb XhoI-HindIII片段從pSVβ(Clontech，Palo Alto，CA)克隆至pSP72-PGKneo質(zhì)粒中。通過從BAC克隆15G5擴(kuò)增一個2.4kb的片段產(chǎn)生小鼠Beer基因座位的同源“短臂”。該片段的3’末端與Beer基因的翻譯起始位點相符，并且在此PCR中使用的反義引物還包括與β-半乳糖苷酶基因的5’末端互補的30ntd，以致該基因的編碼區(qū)可以按符合閱讀框的形式與Beer起始位點融合。用于將該“短臂”引入pSP72-βgal-PGKneo質(zhì)粒的方法是，在β-gal基因上游的一個位點將此質(zhì)粒線性化，然后用該片段和此“短臂”PCR產(chǎn)物進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，篩選該PCR產(chǎn)物通過同源重組整合在其中的質(zhì)粒。用于該“短臂”擴(kuò)增的有義引物包括與pSV70載體互補的30ntd，從而允許該重組事件發(fā)生。該有義引物的序列是5’-ATTTAGGTGACACTATAGAACTCGAGCAGCTGAAGCTTAACCACATGGTGGCTCACAACCAT-3’(SEQ ID NO36)，反義引物的序列是5’-AACGACGGCCAGTGAATCCGTAATCATGGTCATGCTGCCAGGTGGAGGAGGGCA-3’(SEQ ID NO37)。
使用引入稀有限制性酶切割位點SgrAI、FseI、AscI和PacI的引物，通過從BAC克隆15G5擴(kuò)增一個6.1kb的片段產(chǎn)生Beer基因座位的“長臂”。具體地，該有義引物的序列是5’-ATTACCACCGGTGACACCCGCTTCCTGACAG-3’(SEQ ID NO38)；該反義引物的序列是5’-ATTACTTAATTAAACATGGCGCGCCATATGGCCGGCCCCTAATTGCGGCGCATCGTTAATT-3’(SEQ ID NO39)。作為一個中間步驟，將所獲PCR產(chǎn)物克隆至TA載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。
該小鼠Beer基因?qū)蚪Y(jié)構(gòu)還包括第二個選擇標(biāo)記，單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因(HSVTK)，該基因處于勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)元件(RSV LTR)的控制下。該基因的表達(dá)使得哺乳動物細(xì)胞對9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤敏感(并且不能存活)，因此這是一個篩去新霉素抗性的細(xì)胞的方便方法，在新霉素抗性細(xì)胞中該結(jié)構(gòu)是通過非同源重組事件發(fā)生整合的(美國專利5,464,764)。使用允許隨后將片段克隆至“長臂”-TA載體質(zhì)粒的FseI和AscI位點中的引物，從pPS1337擴(kuò)增該RSVLTR-HSVTK盒。對于該PCR，有義引物的序列是5’-ATTACGGCCGGCCGCAAAGGAATTCAAGATCTGA-3’(SEQ IDNO40)；反義引物的序列是5’-ATTACGGCGCGCCCC TCACAGGCCGCACCCAGCT-3’(SEQ ID NO41)。
構(gòu)建該導(dǎo)向載體的最后一步涉及，將含有“長臂”和RSVLTR-HSVTK基因的8.8kb SgrAI-AscI片段克隆至pSP72-“短臂”-βgal-PGKneo質(zhì)粒的SgrAI和AscI位點中。通過AscI或PacI消化，線性化該導(dǎo)向載體，然后通過電穿孔將其導(dǎo)入ES細(xì)胞中。
實施例10反義介導(dǎo)的Beer失活以重疊形式制備具有17個核苷酸的反義寡核苷酸，方式是第一個寡核苷酸的5’末端與Beer轉(zhuǎn)錄本的翻譯起始AUG重疊，然后相繼的寡核苷酸的5’末端在相對Beer AUG的5’方向上前移5個核苷酸(一直到50個核苷酸之外)。使用了相同的堿基組成設(shè)計和制備相應(yīng)的對照寡核苷酸，但其序列被重新分布以抑制其與編碼mRNA的任何有效雜交。通過陽離子脂質(zhì)遞送(P.L.Felgner，美國國家科學(xué)院院刊847413，1987)，將試劑遞送至測試細(xì)胞系統(tǒng)中。在100ul減少血清培養(yǎng)基(Opti-MEM 1減少血清培養(yǎng)基；Life Technologies，Gaithersburg MD)中加入2ug反義寡核苷酸，并將其與(6ul)脂轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectin reagent)(LifeTechnologies，Gaithersburg MD)在此100ul減少血清培養(yǎng)基中混合?；旌线@些物質(zhì)，室溫下30分鐘使其形成復(fù)合物，并將該混合物加到預(yù)先接種的MC3T3E21或KS483細(xì)胞中。培養(yǎng)這些細(xì)胞，并回收mRNA。使用RT-PCR以及Beer特異性引物監(jiān)測Beer的mRNA。此外，將分開的實驗孔收集起來，并通過實施例4所述的Western印跡方法鑒定蛋白質(zhì)的水平。收獲細(xì)胞，將其重懸在裂解緩沖液(50mM Tris pH7.5，20mM NaCl，lmM EDTA，1％SDS)中，并收集可溶性蛋白質(zhì)。將該物質(zhì)加到10-20％的梯度變性SDS PAGE上。把分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上并按以上所述使用抗體試劑進(jìn)行Western印跡。平行地，向同樣的培養(yǎng)物加入對照寡核苷酸，并重復(fù)實驗操作。如果使用反義寡核苷酸進(jìn)行的該處理與拼湊的對照寡核苷酸相比導(dǎo)致mRNA或蛋白質(zhì)水平50％的變化，則Beer mRNA或蛋白質(zhì)水平的降低被認(rèn)為是有意義的。該方法使得能夠選擇性地失活基因以及在隨后的組織培養(yǎng)模型中出現(xiàn)礦化結(jié)表型特征。
序列SEQ ID No.1人Beer cDNA(完整編碼區(qū)加5′和3′UTRs)AGAGCCTGTGCTACTGGAAGGTGGCGTGCCCTCCTCTGGCTGGTACCATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTCGTCTGCCTGCTGGTACACACAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCCAGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGATGCCACGGAAATCATCCCCGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGAGAACAACAAGACCATGAACCGGGCGGAGAACGGAGGGCGGCCTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGATGGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCGGCGCGCCTGCTGCCCAACGCCATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGACCTAGTGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTGCAGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGAGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGACCGAGGCCGCTCGGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCGCGGCCCCGCGCCCGGAGCGCCAAAGCCAACCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAGCCCGCCCGCGCCCCTCCCCACCGGCGGGCGCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGCAACCCAGGGCAGGGGGCTGAGACCTTCCAGGCCCTGAGGAATCCCGGGCGCCGGCAAGGCCCCCCTCAGCCCGCCAGCTGAGGGGTCCCACGGGGCAGGGGAGGGAATTGAGAGTCACAGACACTGAGCCACGCAGCCCCGCCTCTGGGGCCGCCTACCTTTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCACCGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGGGAAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGTTGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGCCCAGAGCACAAGACTGGGGGCAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAACTACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAATAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGCAGAGGTGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAGAATGAATGCAGTTGCATTGATTCAGTGCCAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAACAAACAGAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGAAGAAGCTATGCTGCTTCCCAGCCTGGCTTCCCCGGATGTTTGGCTACCTCCACCCCTCCATCTCAAAGAAATAACATCATCCATTGGGGTAGAAAAGGAGAGGGTCCGAGGGTGGTGGGAGGGATAGAAATCACATCCGCCCCAACTTCCCAAAGAGCAGCATCCCTCCCCCGACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGCAGCCATCACAAACTCACAGACCAGCACATCCCTTTTGAGACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCTAGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACTAAAAGAATATTATTGGGGGAAAAACTACAAGTGCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAAAATCATTTCCAGACAACCTCTTACTTTCTGTGTAGTTTTTAATTGTTAAAAAAAAAAAGTTTTAAACAGAAGCACATGACATATGAAAGCCTGCAGGACTGGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTTTTAAAGAGTTAAGTTACATATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTTAATATTGCTTTATGAATTAACAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAG
SEQ ID No.2人BEER蛋白質(zhì)(全序列)MQLPLALCLVCLLVHTAFRVVEGQGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAYSEQ ID No.3含有硬化性狹窄無義突變的人Beer cDNAAGAGCCTGTGCTACTGGAAGGTGGCGTGCCCTCCTCTGGCTGGTACCATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTCGTCTGCCTGCTGGTACACACAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCTAGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGATGCCACGGAAATCATCCCCGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGAGAACAACAAGACCATGAACCGGGCGGAGAACGGAGGGCGGCCTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGATGGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCGGCGCGCCTGCTGCCCAACGCCATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGACCTAGTGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTGCAGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGAGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGACCGAGGCCGCTCGGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCGCGGCCCCGCGCCCGGAGCGCCAAAGCCAACCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAGCCCGCCCGCGCCCCTCCCCACCGGCGGGCGCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGCAACCCAGGGCAGGGGGCTGAGACCTTCCAGGCCCTGAGGAATCCCGGGCGCCGGCAAGGCCCCCCTCAGCCCGCCAGCTGAGGGGTCCCACGGGGCAGGGGAGGGAATTGAGAGTCACAGACACTGAGCCACGCAGCCCCGCCTCTGGGGCCGCCTACCTTTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCACCGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGGGAAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGTTGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGCCCAGAGCACAAGACTGGGGGCAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAACTACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAATAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGCAGAGGTGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAGAATGAATGCAGTTGCATTGATTCAGTGCCAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAACAAACAGAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGAAGAAGCTATGCTGCTTCCCAGCCTGGCTTCCCCGGATGTTTGGCTACCTCCACCCCTCCATCTCAAAGAAATAACATCATCCATTGGGGTAGAAAAGGAGAGGGTCCGAGGGTGGTGGGAGGGATAGAAATCACATCCGCCCCAACTTCCCAAAGAGCAGCATCCCTCCCCCGACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGCAGCCATCACAAACTCACAGACCAGCACATCCCTTTTGAGACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCTAGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACTAAAAGAATATTATTGGGGGAAAAACTACAAGTGCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAAAATCATTTCCAGACAACCTCTTACTTTCTGTGTAGTTTTTAATTGTTAAAAAAAAAAAGTTTTAAACAGAAGCACATGACATATGAAAGCCTGCAGGACTGGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTTTTAAAGAGTTAAGTTACATATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTTAATATTGCTTTATGAATTAACAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAGSEQ ID No4從硬化性狹窄(Scleroeteosis)獲得的截短人Beer蛋白質(zhì)MQLFLALCLVCLLVHTAFRVVEG*SEQ ID No.5編碼蛋白質(zhì)變體的人Beer cDNA(V101)AGAGCCTGTGCTACTGGAAGGTGGCGTGCCCTCCTCTGGCTGGTACCATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTCATCTGCCTGCTGGTACACACAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCCAGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGATGCCACGGAAATCATCCGCGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGAGAACAACAAGACCATGAACCGGGCGGAGAACGGAGGGCGGCCTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGATGGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCGGCGCGCCTGCTGCCCAACGCCATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGACCTAGTGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTGCAGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGAGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGACCGAGGCCGCTCGGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCGCGGCCCCGCGCCCGGAGCGCCAAAGCCAACCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAGCCCGCCCGCGCCCCTCCCCACCGGCGGGCGCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGCAACCCAGGGCAGGGGGCTGAGACCTTCCAGGCCCTGAGGAATCCCGGGCGCCGGCAAGGCCCCCCTCAGCCCGCCAGCTGAGGGGTCCCACGGGGCAGGGGAGGGAATTGAGAGTCACAGACACTGAGCCACGCAGCCCCGCCTCTGGGGCCGCCTACCTTTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCACCGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGGGAAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGTTGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGCCCAGAGCACAAGACTGGGGGCAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAACTACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAATAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGCAGAGGTGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAGAATGAATGCAGTTGCATTGATTCAGTGCCAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAACAAACAGAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGAAGAAGCTATGCTGCTTCCCAGCCTGGCTTCCCCGGATGTTTGGCTACCTCCACCCCTCCATCTCAAAGAAATAACATCATCCATTGGGGTAGAAAAGGAGAGGGTCCGAGGGTGGTGGGAGGGATAGAAATCACATCCGCCCCAACTTCCCAAAGAGCAGCATCCCTCCCCCGACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGCAGCCATCACAAACTCACAGACCAGCACATCCCTTTTGAGACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCTAGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACTAAAAGAATATTATTGGGGGAAAAACTACAAGTGCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAAAATCATTTCCAGACAACCTCTTACTTTCTGTGTAGTTTTTAATTGTTAAAAAAAAAAAGTTTTAAACAGAAGCACATGACATATGAAAGCCTGCAGGACTGGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTTTTAAAGAGTTAAGTTACATATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTTAATATTGCTTTATGAATTAACAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAGSEQ ID No.6人Beer蛋白質(zhì)變體(V101)MQLPLALCLICLLVHTAFRVVEGQGWQAFKNDATEIIRELGEYPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGFCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRFSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGEAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAYSEQ ID No.7編碼蛋白質(zhì)變體的人Beer cDNA(P38R)AGAGCCTGTGCTACTGGAAGGTGGCGTGCCCTCCTCTGGCTGGTACCATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTCGTCTGCCTGCTGGTACACACAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCCAGGGGTGGCAGGCGTTCAAGAATGATGCCACGGAAATCATCCGCGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGAGAACAACAAGACCATGAACCGGGCGGAGAACGGAGGGCGGCCTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGATGGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCGGCGCGCCTGCTGCCCAACGCCATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGACCTAGTGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGCGTGCAGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGAGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGACCGAGGCCGCTCGGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCGCGGCCCCGCGCCCGGAGCGCCAAAGCCAACCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAGCCCGCCCGCGCCCCTCCCCACCGGCGGGCGCCCCGGCCCTGAACCCGCGCCCCACATTTCTGTCCTCTGCGCGTGGTTTGATTGTTTATATTTCATTGTAAATGCCTGCAACCCAGGGCAGGGGGCTGAGACCTTCCAGGCCCTGAGGAATCCCGGGCGCCGGCAAGGCCCCCCTCAGCCCGCCAGCTGAGGGGTCCCACGGGGCAGGGGAGGGAATTGAGAGTCACAGACACTGAGCCACGCAGCCCCGCCTCTGGGGCCGCCTACCTTTGCTGGTCCCACTTCAGAGGAGGCAGAAATGGAAGCATTTTCACCGCCCTGGGGTTTTAAGGGAGCGGTGTGGGAGTGGGAAAGTCCAGGGACTGGTTAAGAAAGTTGGATAAGATTCCCCCTTGCACCTCGCTGCCCATCAGAAAGCCTGAGGCGTGCCCAGAGCACAAGACTGGGGGCAACTGTAGATGTGGTTTCTAGTCCTGGCTCTGCCACTAACTTGCTGTGTAACCTTGAACTACACAATTCTCCTTCGGGACCTCAATTTCCACTTTGTAAAATGAGGGTGGAGGTGGGAATAGGATCTCGAGGAGACTATTGGCATATGATTCCAAGGACTCCAGTGCCTTTTGAATGGGCAGAGGTGAGAGAGAGAGAGAGAAAGAGAGAGAATGAATGCAGTTGCATTGATTCAGTGCCAAGGTCACTTCCAGAATTCAGAGTTGTGATGCTCTCTTCTGACAGCCAAAGATGAAAAACAAACAGAAAAAAAAAAGTAAAGAGTCTATTTATGGCTGACATATTTACGGCTGACAAACTCCTGGAAGAAGCTATGCTGCTTCCCAGCCTGGCTTCCCCGGATGTTTGGCTACCTCCACCCCTCCATCTCAAAGAAATAACATCATCCATTGGGGTAGAAAAGGAGAGGGTCCGAGGGTGGTGGGAGGGATAGAAATCACATCCGCCCCAACTTCCCAAAGAGCAGCATCCCTCCCCCGACCCATAGCCATGTTTTAAAGTCACCTTCCGAAGAGAAGTGAAAGGTTCAAGGACACTGGCCTTGCAGGCCCGAGGGAGCAGCCATCACAAACTCACAGACCAGCACATCCCTTTTGAGACACCGCCTTCTGCCCACCACTCACGGACACATTTCTGCCTAGAAAACAGCTTCTTACTGCTCTTACATGTGATGGCATATCTTACACTAAAAGAATATTATTGGGGGAAAAACTACAAGTGCTGTACATATGCTGAGAAACTGCAGAGCATAATAGCTGCCACCCAAAAATCTTTTTGAAAATCATTTCCAGACAACCTCTTACTTTCTGTGTAGTTTTTAATTGTTAAAAAAAAAAAGTTTTAAACAGAAGCACATGACATATGAAAGCCTGCAGGACTGGTCGTTTTTTTGGCAATTCTTCCACGTGGGACTTGTCCACAAGAATGAAAGTAGTGGTTTTTAAAGAGTTAAGTTACATATTTATTTTCTCACTTAAGTTATTTATGCAAAAGTTTTTCTTGTAGAGAATGACAATGTTAATATTGCTTTATGAATTAACAGTCTGTTCTTCCAGAGTCCAGAGACATTGTTAATAAAGACAATGAATCATGACCGAAAGSEQ ID No.8人Beer蛋白質(zhì)變體(p38R)MQLPLALCLVCLLVHTAFRVVEGQGWQAFKNDATEIIRELGEYPEPPPELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKFVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCFGGEAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGTEAARPQKGRKPRPRARSAKANQAELENAYSEQ ID No.9Vervet Beer cDNA(完整編碼區(qū))ATGCAGCTCCCACTGGCCCTGTGTCTTGTCTGCCTGCTGGTACACGCAGCCTTCCGTGTAGTGGAGGGCCAGGGGTGGCAGGCCTTCAAGAATGATGCCACGGAAATCATCCCCGAGCTCGGAGAGTACCCCGAGCCTCCACCGGAGCTGGAGAACAACAAGACCATGAACCGGGCGGAGAATGGAGGGCGGCCTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGAGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGAtGGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCAGTCACCGAGTTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCGGCACGCCTGCTGCCCAACGCCATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGCCCGAGTGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGTGTGCAGCTGCTGTGTCCCGGTGGTGCCGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGTCCCGAGGCCGCTCGGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCGCGGCCCCGCGCCCGGGGGGCCAAAGCCAATCAGGCCGAGCTGGAGAACGCCTACTAGSEQ ID No.10Vervet Beer蛋白質(zhì)(全序列)MQLPLALCLVCLLVHAAFRVVEGQGWQAFKNDATEIIPELGEYPEPPFELENNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDVSEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVGSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGPEAARPQKGRKPRPRARGAKANQAELENAYSEQ ID No.11小鼠Beer cDNA(僅有編碼區(qū))ATGCAGCCCTCACTAGCCCCGTGCCTCATCTGCCTACTTGTGCACGCTGCCTTCTGTGCTGTGGAGGGCCAGGGGTGGCAAGCCTTCAGGAATGATGCCACAGAGGTCATCCCAGGGCTTGGAGAGTACCCCGAGCCTCCTCCTGAGAACAACCAGACCATGAACCGGGCGGAGAATGGAGGCAGACCTCCCCACCATCCCTATGACGCCAAAGGTGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTACACCCGCTTCCTGACAGACGGCCCATGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGTTGGTGTGCTCCGGCCAGTGCGGCCCCGCGCGGCTGCTGCCCAACGCCATCGGGCGCGTGAAGTGGTGGCGCCCGAACGGACCGGATTTCCGCTGCATCCCGGATCGCTACCGCGCGCAGCGGGTGCAGCTGCTGTGCCCCGGGGGCGCGGCGCCGCGCTCGCGCAAGGTGCGTCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGGCCGGAGACCGCGCGGCCGCAGAAGGGTCGCAAGCCGCGGCCCGGCGCCCGGGGAGCCAAAGCCAACCAGGCGGAGCTGGAGAACGCCTACTAGAGSEQ ID No.12小鼠Beer蛋白質(zhì)(全序列)MQPSLAPCLICLLvHAAFCAVEGQGWQAFRNDATEVIPGLGEYPEPPPENNQTMNRAENGGRPPHHPYDAKDVSEYSCRELHYTRFLTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRVKWWRPNGFDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGPETARPQKGRKPRPGARGAKANQAELENAYSEQ ID No.13大鼠Beer cDNA(完整編碼區(qū)加上5′UTR)GAGGACCGAGTGCCCTTCCTCCTTCTGGCACCATGCAGCTCTCACTAGCCCCTTGCCTTGCCTGCCTGCTTGTACATGCAGCCTTCGTTGCTGTGGAGAGCCAGGGGTGGCAAGCCTTCAAGAATGATGCCACAGAAATCATCCCGGGACTCAGAGAGTACCCAGAGCCTCCTCAGGAACTAGAGAACAACCAGACCATGAACCGGGCCGAGAACGGAGGCAGACCCCCCCACCATCCTTATGACACCAAAGACGTGTCCGAGTACAGCTGCCGCGAGCTGCACTACACCCGCTTCGTGACCGACGGCCCGTGCCGCAGTGCCAAGCCGGTCACCGAGTTGGTGTGCTCGGGCCAGTGCGGCCCCGCGCGGCTGCTGCCCAACGCCATCGGGCGCGTGAAGTGGTGGCGCCCGAACGGACCCGACTTCCGCTGCATCCCGGATCGCTACCGCGCGCAGCGGGTGCAGCTGCTGTGCCCCGGCGGCGCGGCGCCGCGCTCGCGCAAGGTGCGTCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACCCGCTTCCACAACCAGTCGGAGCTCAAGGACTTCGGACCTGAGACCGCGCGGCCGCAGAAGGGTCGCAAGCCGCGGCCCCGCGCCCGGGGAGCCAAGCCAACCAGGCGGAGCTGGAGAACGCCTACTAGSEQ ID No.14大鼠Beer蛋白質(zhì)(全序列)MQLSLAPCLACLLVHAAFVAVESQGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPPQELENNQTMNRAENGGRPPHHFYDTKDVSEYSCRELHYTRFVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRSRKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGPETARPQKGRKPRPRARGAKANQAELENAYSEQ ID No.15牛Beer cDNA(部份編碼序列)AGAATGATGCCACAGAAATCATCCCCGAGCTGGGCGAGTACCCCGAGCCTCTGCCAGAGCTGAACAACAAGACCATGAACCGGGCGGAGAACGGAGGGAGACCTCCCCACCACCCCTTTGAGACCAAAGACGCCTCCGAGTACAGCTGCCGGGAGCTGCACTTCACCCGCTACGTGACCGATGGGCCGTGCCGCAGCGCCAAGCCGGTCACCGAGCTGGTGTGCTCGGGCCAGTGCGGCCCGGCGCGCCTGCTGCCCAACGCCATCGGCCGCGGCAAGTGGTGGCGCCCAAGCGGGCCCGACTTCCGCTGCATCCCCGACCGCTACCGCGCGCAGCGGGTGCAGCTGTTGTGTCCTGGCGGCGCGGCGCCGCGCGCGCGCAAGGTGCGCCTGGTGGCCTCGTGCAAGTGCAAGCGCCTCACTCGCTTCCACAACCAGTCCGAGCTCAAGGACTTCGGGCCCGAGGCCGCGCGGCCGCAAACGGGCCGGAAGCTGCGGCCCCGCGCCCGGGGCACCAAAGCCAGCCGGGCCGASEQ ID No.16牛Beer蛋白質(zhì)(部分序列—缺信號序列和末尾的6個殘基)NDATEIIPELGEYPEPLPELNNKTMNRAENGGRPPHHPFETKDASEYSCRELHFTRYVTDGPCRSAKPVTELVCSGQCGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRCIPDRYRAQRVQLLCPGGAAPRARKVRLVASCKCKRLTRFHNQSELKDFGPFAARPQTGRKLRPRARGTKASRASEQ ID No.17用以制備小鼠Beer轉(zhuǎn)基因的Mlul-Avill限制性片段CGCGTTTTGGTGAGCAGCAATATTGCGCTTCGATGAGCCTTGGCGTTGAGATTGATACCTCTGCTGCACAAAAGGCAATCGACCGAGCTGGACCAGCGCATTCGTGACACCGTCTCCTTCGAACTTATTCGCAATGGAGTGTCATTCATCAAGGACNGCCTGATCGCAAATGGTGCTATCCACGCAGCGGCAATCGAAAACCCTCAGCCGGTGACCAATATCTACAACATCAGCCTTGGTATCCTGCGTGATGAGCCAGCGCAGAACAAGGTAACCGTCAGTGCCGATAAGTTCAAAGTTAAACCTGGTGTTGATACCAACATTGAAACGTTGATCGAAAACGCGCTGAAAAACGCTGCTGAATGTGCGGCGCTGGATGTCACAAAGCAAATGGCAGCAGACAAGAAAGCGATGGATGAACTGGCTTCCTATGTCCGCACGGCCATCATGATGGAATGTTTCCCCGGTGGTGTTATCTGGCAGCAGTGCCGTCGATAGTATGCAATTGATAATTATTATCATTTGCGGGTCCTTTCCGGCGATCCGCCTTGTTACGGGGCGGCGACCTCGCGGGTTTTCGCTATTTATGAAAATTTTCCGGTTTAAGGCGTTTCCGTTCTTCTTCGTCATAACTTAATGTTTTTATTTAAAATACCCTCTGAAAAGAAAGGAAACGACAGGTGCTGAAAGCGAGCTTTTTGGCCTCTGTCGTTTCCTTTCTCTGTTTTTGTCCGTGGAATGAACAATGGAAGTCAACAAAAAGCAGAGCTTATCGATGATAAGCGGTCAAACATGAGAATTCGCGGCCGCATAATACGACTCACTATAGGGATCGACGCCTACTCCCCGCGCATGAAGCGGAGGAGCTGGACTCCGCATGCCCAGAGACGCCCCCCAACCCCCAAAGTGCCTGACCTCAGCCTCTACCAGCTCTGGCTTGGGCTTGGGCGGGGTCAAGGCTACCACGTTCTCTTAACAGGTGGCTGGGCTGTCTCTTGGCCGCGCGTCATGTGACAGCTGCCTAGTTCTGCAGTGAGGTCACCGTGGAATGTCTGCCTTCGTTGCCATGGCAACGGGATGACGTTACAATCTGGGTGTGGAGCTTTTCCTGTCCGTGTCAGGAAATCCAAATACCCTAAAATACCCTAGAAGAGGAAGTAGCTGAGCCAAGGCTTTCCTGGCTTCTCCAGATAAAGTTTGACTTAGATGGAAAAAAACAAAATGATAAAGACCCGAGCCATCTGAAAATTCCTCCTAATTGCACCACTAGGAAATGTGTATATTATTGAGCTCGTATGTGTTCTTATTTTAAAAAGAAAACTTTAGTCATGTTATTAATAAGAATTTCTCAGCAGTGGGAGAGAACCAATATTAACACCAAGATAAAAGTTGGCATGATCCACATTGCAGGAAGATCCACGTTGGGTTTTCATGAATGTGAAGACCCCATTTATTAAAGTCCTAAGCTCTGTTTTTGCACACTAGGAAGCGATGGCCGGGATGGCTGAGGGGCTGTAAGGATCTTTCAATGTCTTACATGTGTGTTTCCTGTCCTGCACCTAGGACCTGCTGCCTAGCCTGCAGCAGAGCCAGAGGGGTTTCACATGATTAGTCTCAGACACTTGGGGGCAGGTTGCATGTACTGCATCGCTTATTTCCATACGGAGCACCTACTATGTGTCAAACACCATATGGTGTTCACTCTTCAGAACGGTGGTGGTCATCATGGTGCATTTGCTGACGGTTGGATTGGTGGTAGAGAGCTGAGATATATGGACGCACTCTTCAGCATTCTGTCAACGTGGCTGTGCATTCTTGCTCCTGAGCAAGTGGCTAAACAGACTCACAGGGTCAGCCTCCAGCTCAGTCGCTGCATAGTCTTAGGGAACCTCTCCCAGTCCTCCCTACCTCAACTATCCAAGAAGCCAGGGGGCTTGGCGGTCTCAGGAGCCTGCTTGCTGGGGGACAGGTTGTTGAGTTTTATCTGCAGTAGGTTGCCTAGGCATAGTGTCAGGACTGATGGCTGCCTTGGAGAACACATCCTTTGCCCTCTATGCAAATCTGACCTTGACATGGGGGCGCTGCTCAGCTGGGAGGATCAACTGCATACCTAAAGCCAAGCCTAAAGCTTCTTCGTCCACCTGAAACTCCTGGACCAAGGGGCTTCCGGCACATCCTCTCAGGCCAGTGAGGGAGTCTGTGTGAGCTGCACTTTCCAATCTCAGGGCGTGAGAGGCAGAGGGAGGTGGGGGCAGAGCCTTGCAGCTCTTTCCTCCCATCTGGACAGCGCTCTGGCTCAGCAGCCCATATGAGCACAGGCACATCCCCACCCCACCCCCACCTTTCCTGTCCTGCAGAATTTAGGCTCTGTTCACGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCAGTCCTATCCTCTCTTAGGTAGACAGGACTCTGCAGGAGACACTGCTTTGTAAGATACTGCAGTTTAAATTTGGATGTTGTGAGGGGAAAGCGAAGGGCCTCTTTGACCATTCAGTCAAGGTACCTTCTAACTCCCATCGTATTGGGGGGCTACTCTAGTGCTAGACATTGCAGAGAGCCTCAGAACTGTAGTTACCAGTGTGGTAGGATTGATCCTTCAGGGAGCCTGACATGTGACAGTTCCATTCTTCACCCAGTCACCGAACATTTATTCAGTACCTACCCCGTAACAGGCACCGTAGCAGGTACTGAGGGACGGACCACTCAAAGAACTGACAGACCGAAGCCTTGGAATATAAACACCAAAGCATCAGGCTCTGCCAACAGAACACTCTTTAACACTCAGGCCCTTTAACACTCAGGACCCCCACCCCCACCCCAAGCAGTTGGCACTGCTATCCACATTTTACAGAGAGGAAAAACTAGGCACAGGACGATATAAGTGGCTTGCTTAAGCTTGTCTGCATGGTAAATGGCAGGGCTGGATTGAGACCCAGACATTCCAACTCTAGGGTCTATTTTTCTTTTTTCTCGTTGTTCGAATCTGGGTCTTACTGGGTAAACTCAGGCTAGCCTCACACTCATATCCTTCTCCCATGGCTTACGAGTGCTAGGATTCCAGGTGTGTGCTACCATGTCTGACTCCCTGTAGCTTGTCTATACCATCCTCACAACATAGGAATTGTGATAGCAGCACACACACCGGAAGGAGCTGGGGAAATCCCACAGAGGGCTCCGCAGGATGACAGGCGAATGCCTACACAGAAGGTGGGGAAGGGAAGCAGAGGGAACAGCATGGGCGTGGGACCACAAGTCTATTTGGGGAAGCTGCCGGTAACCGTATATGGCTGGGGTGAGGGGAGAGGTCATGAGATGAGGCAGGAAGAGCCACAGCAGGCAGCGGGTACGGGCTCCTTATTGCCAAGAGGCTCGGATCTTCCTCCTCTTCCTCCTTCCGGGGCTGCCTGTTCATTTTCCACCACTGCCTCCCATCCAGGTCTGTGGCTCAGGACATCACCCAGCTGCAGAAACTGGGCATCACCCACGTCCTGAATGCTGCCGAGGGCAGTCCTTCATGCACCGTCAACACCAGTGCTAGCTTCTACGAGGATTCTGGCATCACCTACTTGGGCATCAAGGCCAATGATACGCAGGAGTTCAACCTCAGTGCTTACTTTGAAAGGGCCACAGATTTCATTGACCAGGCGCTGGCCCATAAAAATGGTAAGGAACGTACATTCCGGCACCCATGGAGCGTAAGCCCTCTGGGACCTGCTTCCTCCAAAGAGGCCCCCACTTGAAAAAGGTTCCAGAAAGATCCCAAAATATGCCACCAACTAGGGATTAAGTGTCCTACATGTGAGCCGATGGGGGCCACTGCATATAGTCTGTGCCATAGACATGACAATGGATAATAATATTTCAGACAGAGAGCAGGAGTTAGGTAGCTGTGCTCCTTTCCCTTTAATTGAGTGTGCCCATTTTTTTATTCATGTATGTGTATACATGTGTGTGCACACATGCCATAGGTTGATACTGAACACCGTCTTCAATCGTTCCCCACCCCACCTTATTTTTTGAGGCAGGGTCTCTTCCCTGATCCTGGGGCTCATTGGTTTATCTAGGCTGCTGGCCAGTGAGCTCTGGAGTTCTGCTTTTCTCTACCTCCCTAGCCCTGGGACTGCAGGGGCATGTGCTGGGCCAGGCTTTTATGTCGCGTTGGGGATCTGAACTTAGGTCCCTAGGCCTGAGCACCGTAAAGACTCTGCCACATCCCCAGCCTGTTTGAGCAAGTGAACCATTCCCCAGAATTCCCCCAGTGGGGCTTTCCTACCCTTTTATTGGCTAGGCATTCATGAGTGGTCACCTCGCCAGAGGAATGAGTGGCCACGACTGGCTCAGGGTCAGCAGCCTAGAGATACTGGGTTAAGTCTTCCTGCCGCTCGCTCCCTGCAGCCGCAGACAGAAAGTAGGACTGAATGAGAGCTGGCTAGTGGTCAGACAGGACAGAAGGCTGAGAGGGTCACAGGGCAGATGTCAGCAGAGCAGACAGGTTCTCCCTCTGTGGGGGAGGGGTGGCCCACTGCAGGTGTAATTGGCCTTCTTTGTGCTCCATAGAGGCTTCCTGGGTACACAGCAGCTTCCCTGTCCTGGTGATTCCCAAAGAGAACTCCCTACCACTGGACTTACAGAAGTTCTATTGACTGGTGTAACGGTTCAACAGCTTTGGCTCTTGGTGGACGGTGCATACTGCTGTATCAGCTCAAGAGCTCATTCACGAATGAACACACACACACACACACACACACACACACACACAAGCTAATTTTGATATGCCTTAACTAGCTCAGTGACTGGGCATTTCTGAACATCCCTGAAGTTAGCACACATTTCCCTCTGGTGTTCCTGGCTTAACACCTTCTAAATCTATATTTTATCTTTGCTGCCCTGTTACCTTCTGAGAAGCCCCTAGGGCCACTTCCCTTCGCACCTACATTGCTGGA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ID No.18人Beer基因組序列(該基因有2個外顯子，位于第161-427位和第3186-5219位)tagaggagaa gtctttgggg agggtttgct ctgagcacac ccctttccct ccctccgggg 60ctgagggaaa catgggacca gccctgcccc agcctgtcct cattggctgg catgaagcag 120agaggggctt taaaaaggcg accgtgtctc ggctggagac cagagcctgt gctactggaa 180ggtggcgtgc cctcctctgg ctggtaccat gcagctccca ctggccctgt gtctcgtctg 240cctgctggta cacacagcct tccgtgtagt ggagggccag gggtggcagg cgttcaagaa 300tgatgccacg gaaatcatcc ccgagctcgg agagtacccc gagcctccac cggagctgga 360gaacaacaag accatgaacc gggcggagaa cggagggcgg cctccccacc acccctttga 420gaccaaaggt atggggtgga ggagagaatt cttagtaaaa gatcctgggg aggttttaga 480aacttctctt tgggaggctt ggaagactgg ggtagaccca gtgaagattg ctggcctctg 540ccagcactgg tcgaggaaca gtcttgcctg gaggtggggg aagaatggct cgctggtgca 600gccttcaaat tcaggtgcag aggcatgagg caacagacgc tggtgagagc ccagggcagg 660gaggacgctg gggtggtgag ggtatggcat cagggcatca gaacaggctc aggggctcag 720aaaagaaaag gtttcaaaga atctcctcct gggaatatag gagccacgtc cagctgctgg 780taccactggg aagggaacaa ggtaagggag cctcccatcc 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6780ggttggtgtt tgaatctgag gagactgaag caccaagggg ttaaatgttt tgcccacagc 6840catacttggg ctcagttcct tgccctaccc ctcacttgag ctgcttagaa cctggtgggc 6900acatgggcaa taaccaggtc acactgtttt gtaccaagtg ttatgggaat ccaagatagg 6960agtaatttgc tctgtggagg ggatgaggga tagtggttag ggaaagcttc acaaagtggg 7020tgttgcttag agattttcca ggtggagaag ggggcttcta ggcagaaggc atagcccaag 7080caaagactgc aagtgcatgg ctgctcatgg gtagaagaga atccaccatt cctcaacatg 7140taccgagtcc ttgccatgtg caaggcaaca tgggggtacc aggaattcca agcaatgtcc 7200aaacctaggg tctgctttct gggacctgaa gatacaggat ggatcagccc aggctgcaat 7260cccattacca cgagggggaa aaaaacctga aggctaaatt gtaggtcggg ttagaggtta 7320tttatggaaa gttatattct acctacatgg ggtctataag cctggcgcca atcagaaaag 7380gaacaaacaa cagacctagc tgggaggggc agcattttgt tgtagggggc ggggcacatg 7440ttctgggggt acagccagac tcagggcttg tattaatagt ctgagagtaa gacagacaga 7500gggatagaag gaaataggtc cctttctctc tctctctctc tctctctctc actctctctc 7560tctctcacac acacacacag acacacacac acgctctgta ggggtctact tatgctccaa 7620gtacaaatca 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9301從前面的描述，應(yīng)該理解，盡管為了說明的目的本文描述了本發(fā)明的具體實施方案，但可以進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范疇。因此，本發(fā)明僅受附及權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其選自(a)含有SEQ ID Nos.1、5、9、11、13或15，或它們的互補序列的分離核酸分子；(b)與(a)的核酸分子在高嚴(yán)緊條件下特異雜交的分離核酸分子；和(c)根據(jù)(a)或(b)的編碼TGF-β結(jié)合蛋白的分離核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離核酸分子，其中所述核酸分子編碼含有SEQ ID NO.2之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的分離核酸分子，其中所述核酸分子編碼含有SEQ ID NO.6之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的分離核酸分子，其中所述核酸分子編碼含有SEQ ID NO.10之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的分離核酸分子，其中所述核酸分子編碼含有SEQ ID NO.12之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的分離核酸分子，其中所述核酸分子編碼含有SEQ ID NO.14之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的分離核酸分子，其中所述核酸分子編碼含有SEQ ID NO.16之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
8.含有可操作地與根據(jù)權(quán)利要求1-7之任意一項的核酸分子相連接的啟動子的表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其中所述啟動子選自CMV I-E啟動子、SV40早期啟動子和MuLV LTR。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其中所述啟動子是組織特異性啟動子。
11.制備TGF-β結(jié)合蛋白的方法，包括在足以產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的時間和條件下，培養(yǎng)含有根據(jù)權(quán)利要求8的載體的細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，進(jìn)一步包括純化所述蛋白質(zhì)的步驟。
13.能夠指導(dǎo)根據(jù)權(quán)利要求1-7之任意一項的核酸分子表達(dá)的病毒載體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的病毒載體，其中所述載體選自單純皰疹病毒載體、腺病毒載體、腺病毒伴隨病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
15.帶有根據(jù)權(quán)利要求8-14之任意一項的載體的宿主細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自人細(xì)胞、狗細(xì)胞、猴細(xì)胞、大鼠細(xì)胞和小鼠細(xì)胞。
17.分離的蛋白質(zhì)，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-7之任意一項的核酸分子所編碼的TGF-β結(jié)合蛋白。
18.與根據(jù)權(quán)利要求17的蛋白質(zhì)特異結(jié)合的抗體。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的抗體，其中所述單克隆抗體是鼠抗體或人抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的抗體，其中所述抗體選自F(ab’)2、F(ab)2、Fab’、Fab和Fv。
22.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求19的抗體的雜交瘤。
23.融合蛋白質(zhì)，其包含第一多肽片段和第二多肽片段，其中第一多肽片段含有根據(jù)權(quán)利要求1-7之任意一項的核酸分子所編碼的TGF-β結(jié)合蛋白，或其至少10個氨基酸長的部分，第二多肽片段含有非TGF-β結(jié)合蛋白。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的融合蛋白質(zhì)，其中所述第一多肽片段長至少20個氨基酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的融合蛋白質(zhì)，其中所述第一多肽片段長至少50個氨基酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求23的融合蛋白質(zhì)，其中所述第二多肽片段含有多個陰離子氨基酸殘基。
27.在高嚴(yán)緊條件下與根據(jù)SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13或15，或它們的互補序列的核酸分子雜交的分離寡核苷酸。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的分離寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長至少20個核苷酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的分離寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長至少30個核苷酸。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的分離寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長至少50個核苷酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的分離寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的長度在50-100個核苷酸之間。
32.特異擴(kuò)增根據(jù)權(quán)利要求1-7之任意一項的核酸分子的全部或部分的引物對。
33.切割編碼根據(jù)權(quán)利要求17之蛋白質(zhì)的RNA的核酶。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的核酶，其中所述蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO.2的蛋白質(zhì)。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的核酶，其中所述蛋白質(zhì)含有SEQ ID NO.6的蛋白質(zhì)。
36.根據(jù)權(quán)利要求33的核酶，其中所述RNA編碼含有SEQ ID NO.10之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
37.根據(jù)權(quán)利要求33的核酶，其中所述RNA編碼含有SEQ ID NO.12之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
38.根據(jù)權(quán)利要求33的核酶，其中所述RNA編碼含有SEQ ID NO.14之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
39.根據(jù)權(quán)利要求33的核酶，其中所述RNA編碼含有SEQ ID NO.16之蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
40.根據(jù)權(quán)利要求33的核酶，其中所述核酶由核糖核酸組成。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的核酶，其中所述核糖核酸的一或多個是2’-O-甲基核糖核酸。
42.根據(jù)權(quán)利要求33的核酶，其中所述核酶由脫氧核糖核酸和核糖核酸的混合物構(gòu)成。
43.根據(jù)權(quán)利要求33的核酶，其中所述核酶由具有硫代磷酸酯鍵的核酸構(gòu)成。
44.含有編碼根據(jù)權(quán)利要求33之核酶的核酸序列的核酸分子。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的核酸分子，其中該核酸是DNA或cDNA。
46.根據(jù)權(quán)利要求44的核酸分子，其處于轉(zhuǎn)錄該核酸分子的啟動子的控制之下。
47.含有根據(jù)權(quán)利要求33的核酶的宿主細(xì)胞。
48.含有根據(jù)權(quán)利要求44的核酸分子的載體。
49.根據(jù)權(quán)利要求54的載體，其中該載體是質(zhì)粒、病毒、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子或粘粒。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的載體，其中所述病毒選自逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。
51.含有根據(jù)權(quán)利要求48-50之任意一項的載體的宿主細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞被所述載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
53.根據(jù)權(quán)利要求51的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是人細(xì)胞。
54.制備核酶的方法，包括提供處于啟動子轉(zhuǎn)錄控制之下的編碼根據(jù)權(quán)利要求33之核酶的DNA，以及轉(zhuǎn)錄該DNA以產(chǎn)生該核酶。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中該核酶是體外產(chǎn)生的。
56.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，進(jìn)一步包括純化該核酶。
57.增加骨礦化的方法，包括向恒溫動物導(dǎo)入有效量的根據(jù)權(quán)利要求33-43之任意一項的核酶。
58.增加骨礦化的方法，包括在利于根據(jù)權(quán)利要求44之核酸分子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生核酶的條件下，向患者導(dǎo)入有效量的該核酸分子。
59.含有根據(jù)權(quán)利要求33-43之任意一項的核酶和可藥用載體或稀釋劑的藥物組合物。
60.能夠特異擴(kuò)增根據(jù)權(quán)利要求1-7之任意一項的核酸分子的全部或部分的引物對。
61.檢測編碼TGF-β結(jié)合蛋白的核酸分子的方法，包括在高嚴(yán)緊條件下孵育根據(jù)權(quán)利要求27-31之任意一項的寡核苷酸，并檢測所述寡核苷酸的雜交。
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述寡核苷酸是標(biāo)記的。
63.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述寡核苷酸結(jié)合在固相支持物上。
64.檢測TGF-β結(jié)合蛋白的方法，包括在足以允許根據(jù) 18-21之任意一項的抗體與TGF-β結(jié)合蛋白結(jié)合的條件和時間下，孵育該抗體，并檢測所述結(jié)合。
65.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所述抗體結(jié)合在固相支持物上。
66.根據(jù)權(quán)利要求64的方法，其中所述抗體是標(biāo)記的。
67.根據(jù)權(quán)利要求66的方法，其中所述抗體是用選自酶、熒光蛋白和放射性同位素的標(biāo)記物標(biāo)記的。
68.轉(zhuǎn)基因動物，其生殖細(xì)胞和體細(xì)胞含有根據(jù)權(quán)利要求1的編碼TGF-β結(jié)合蛋白的核酸分子，并且該核酸分子可操作地與可有效表達(dá)所述基因的啟動子相連接，其中所述基因在胚胎階段被導(dǎo)入所述動物或所述動物的祖先，條件是所述動物并非人類。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的轉(zhuǎn)基因動物，其中TGF-β結(jié)合蛋白由根據(jù)權(quán)利要求8-10之任意一項的載體表達(dá)。
70.轉(zhuǎn)基因敲除動物，包含其生殖細(xì)胞和體細(xì)胞中與根據(jù) 1之核酸分子雜交的內(nèi)源性核酸分子的至少一個等位基因遭到破壞的動物，其中與不具有所述破壞的動物相比，所述破壞阻止了所述等位基因轉(zhuǎn)錄成信使RNA，條件是所述動物并非人類。
71.根據(jù)權(quán)利要求70的轉(zhuǎn)基因動物，其中所述破壞是核酸的缺失、替代或插入。
72.根據(jù)權(quán)利要求68或70的轉(zhuǎn)基因動物，其中該動物選自小鼠、大鼠和狗。
73.確定候選分子是否能夠增加骨礦質(zhì)含量的方法，包括(a)將一或多個候選分子與根據(jù)權(quán)利要求1-7之任意一項的核酸分子所編碼的TGF-β結(jié)合蛋白和TGF-β蛋白質(zhì)家族的選定成員混合；(b)確定該候選分子是否改變了該TGF-β家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、或改變了TGF-β結(jié)合蛋白與該TGF-β家族成員的結(jié)合。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中該所述TGF-β蛋白質(zhì)家族成員是BMP6。
75.確定候選分子是否能夠增加骨礦質(zhì)含量的方法，包括確定候選分子是否抑制TGF-β結(jié)合蛋白與骨或其類似物的結(jié)合。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述骨類似物是羥基磷灰石。
77.用于檢測TGF-β結(jié)合蛋白基因表達(dá)的試劑盒，其包含含有核酸分子的容器，其中所述核酸分子選自(a)含有SEQ ID NO1、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列的核酸分子；(b)含有(a)的核苷酸序列的互補序列的核酸分子；(c)是(a)或(b)的至少長20個核苷酸的片段的核酸分子。
78.檢測TGF-β結(jié)合蛋白的試劑盒，包含含有根據(jù)權(quán)利要求18-21之任意一項的抗體的容器。
79.反義寡核苷酸，其含有與根據(jù)SEQ ID NOs.1、3、5、7、9、11、13或15，或它們的互補序列的核酸分子雜交的核酸分子，而且其中所述寡核苷酸抑制根據(jù)權(quán)利要求17的TGF-β結(jié)合蛋白的表達(dá)。
80.根據(jù)權(quán)利要求79的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長15個核苷酸。
81.根據(jù)權(quán)利要求79的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長20個核苷酸。
82.根據(jù)權(quán)利要求79的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長50個核苷酸。
83.根據(jù)權(quán)利要求79的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有一或多種核酸類似物。
84.根據(jù)權(quán)利要求79的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有一或多種核糖核酸。
85.根據(jù)權(quán)利要求79的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有一或多種脫氧核糖核酸。
86.根據(jù)權(quán)利要求79的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸序列含有一個或多個修飾的共價鍵。
87.根據(jù)權(quán)利要求86的寡核苷酸，其中所述修飾的共價鍵選自硫代磷酸酯鍵、磷酸三酯鍵、磷酸甲酯鍵、亞甲基(甲基亞胺基)鍵、嗎啉代鍵、酰胺鍵、聚酰胺鍵、短鏈烷基糖間鏈、環(huán)烷基糖間鏈、短鏈雜原子糖間鏈、和雜環(huán)糖間鏈。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的TGF－β結(jié)合蛋白類型或家族。還公開了用于篩選增加骨礦化的分子的試驗方法和利用這些分子的方法。
文檔編號C12N15/12GK1333828SQ99815505
公開日2002年1月30日 申請日期1999年11月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月27日
發(fā)明者M·E·布倫科, D·J·格拉斯, B·科瓦斯維克, J·T·默利甘, B·W·佩珀, J·范尼斯, D·G·溫克勒 申請人:達(dá)爾文發(fā)現(xiàn)有限公司