專利名稱：轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法，具體而言，涉及將變性狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶重折疊成具有酶活性、與天然狀態(tài)的酶基本上具有同等活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法。通過該方法可以將變性的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶重折疊成具有酶活性的天然狀態(tài)的酶，可以將用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的無活性酶蛋白質(zhì)變換成大量且廉價的高活性的酶，能廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可應(yīng)用于果凍等膠狀食品、酸奶、奶酪、或膠狀化妝品等的制備和肉食的改造等，還可廣泛應(yīng)用于除此之外的領(lǐng)域，是工業(yè)上極其有用的酶。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(EC 2.3.2.13；TGase)是催化蛋白質(zhì)或多肽鏈的谷氨酰胺殘基的γ-羧基酰胺基與一級胺基間的乙酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，其中，將從微生物(茂原鏈輪絲菌(Streptoverticilliummobraense)的變種)培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶稱之為微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)。
MTG是由331個氨基酸構(gòu)成的分子量為38000的單聚體蛋白質(zhì)(生物化學(xué)雜志，268，11565-11572，1993)。為了大量生產(chǎn)該酶，就力求使上述微生物的培養(yǎng)條件最適化(Agricaltural BiologicalChemistry，53，2613-，1989)，但該微生物不能廣泛應(yīng)用于以往蛋白質(zhì)的工業(yè)生產(chǎn)，生產(chǎn)量和生產(chǎn)耗費等方面也存在許多問題。另外，該酶雖可在菌體外以活性狀態(tài)分泌，但由于它分子內(nèi)具有4處通過脫酰胺反應(yīng)而容易進(jìn)行化學(xué)修飾的序列，在進(jìn)行分泌生產(chǎn)的過程中培養(yǎng)液中進(jìn)行了化學(xué)修飾，回收的培養(yǎng)上清中蓄積了活性很低的酶。為了解決這些問題，對應(yīng)用大腸桿菌等微生物的基因重組MTG的生產(chǎn)法進(jìn)行了各種探索(Bioscience and Bioindustry，52，554-561，1994)。
若讓該酶的序列在大腸桿菌的菌體表達(dá)，其表達(dá)量甚微，但通過與可高表達(dá)的T7基因10來源的序列片段融合可成功地高表達(dá)融合蛋白質(zhì)。但是，將該融合蛋白限制性分解而得到的具有原本序列的酶的活性，是天然狀態(tài)下轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的1/5，這提示了用該方法得到的酶的高級結(jié)構(gòu)的不完全性(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)。此外，從融合蛋白中僅切出該酶的序列，就有必要通過消化酶或化學(xué)手段進(jìn)行限制性分解，問題是不僅制備方法復(fù)雜，而且生產(chǎn)耗費高。
要解決以上問題，就有必要獲得用微生物直接高表達(dá)該酶序列的技術(shù)，獲得將回收的變性狀態(tài)的酶完全再形成高級結(jié)構(gòu)、恢復(fù)酶活性的技術(shù)(再折疊技術(shù))。先前，本申請人在大腸桿菌菌體內(nèi)表達(dá)MTG時，將使用的密碼子變成宿主大腸桿菌用的，通過大幅度增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)而成功地實現(xiàn)目前為止尚不可能的在菌體內(nèi)高表達(dá)該酶序列，并將該內(nèi)容申請了專利(特愿平10-181951號，平成10年6月29日申請，特開平11-075876號(平成11年3月23日公開)，以下將該發(fā)明稱為“以前的發(fā)明”)。
在這種狀況下，努力開發(fā)優(yōu)良的重折疊方法。
發(fā)明的課題、目的可是，對于蛋白質(zhì)的重折疊技術(shù)來講，預(yù)測檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)的適宜條件是不可能的，有必要用實際的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行各自操作條件的試驗性探索(Advances in Protein Chemistry，50，1-59，1997)。根據(jù)以前的發(fā)明(上述本申請人申請的專利)，可從大量變性狀態(tài)的該酶入手，在這里初次探討該酶重折疊技術(shù)。
本發(fā)明的目的是為了建立該酶的廉價的工業(yè)制備方法，開發(fā)由基因重組微生物生產(chǎn)的變性狀態(tài)下獲得的該酶的重折疊方法，提供基本上與天然狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有同等酶活性(即轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法。發(fā)明的公開以解決上述課題為本發(fā)明的目的，本發(fā)明者們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)變性狀態(tài)下的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶至少要經(jīng)過包含下述工序(a)和(b)的工序才能有效的制備出具有酶活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(a)將該變性狀態(tài)的酶形成中間結(jié)構(gòu)的工序，所述的中間結(jié)構(gòu)是形成在水性溶劑中、酸性條件下具有酶活性的結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)；以及(b)將已經(jīng)形成上述結(jié)構(gòu)形成的中間結(jié)構(gòu)的酶形成高級結(jié)構(gòu)的工序，所述的高級結(jié)構(gòu)是在水性溶劑中、pH值中性范圍內(nèi)具有酶活性的高級結(jié)構(gòu)。
也就是說，本發(fā)明為至少包括上述步驟(a)和(b)，特別是包括重折疊步驟的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法。
(a)中得到的具有中間結(jié)構(gòu)的酶，象(a)中處理過程那樣得到的酶雖具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，但與天然存在的酶相比其活性基本上很低，例如酶活性不到20U/ml。
再者，本發(fā)明包括下述內(nèi)容。
1.上述工序(a)的方法中，當(dāng)該酶分子內(nèi)的半胱氨酸殘基的巰基為游離形式，形成在水性溶劑中、酸性條件下有酶活性的結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)時，在酸性條件下將該酶稀釋。
2個半胱氨酸殘基部分結(jié)合形成二聚體時，優(yōu)選還原的的巰基為游離形式的。
2.上述方法，其中工序(b)中，水性溶劑包括形成具有酶活性的高級結(jié)構(gòu)的促進(jìn)劑。
工序(b)中包含調(diào)整到中性范圍的階段，此時可使用促進(jìn)高級結(jié)構(gòu)的目的物形成的促進(jìn)劑，特別優(yōu)選在升高pH值之前添加使用。此時，作為促進(jìn)劑，優(yōu)選低分子量化合物，例如氯化鉀、氯化鍶等無機(jī)鹽，醋酸鈉、丙酸鈉等有機(jī)鹽，氨基酸鹽，聚乙二醇等，DMSO、DMF等有機(jī)溶劑。
3.上述方法，其中在工序(b)之后，包含工序(c)-即會合該酶中無活性的酶，分離該凝積物的工序。
4.上述方法，其中在工序(a)中該酶溶解在水性溶劑中，工序(b)中該中性范圍是將工序(a)中獲得的酶溶液的pH值升高到中性范圍。
5.上述方法，其中在工序(a)中，將該變性狀態(tài)的酶的酸性溶液在酸性條件下稀釋時，在低溫下進(jìn)行，優(yōu)選在15℃以下進(jìn)行稀釋，稀釋的蛋白質(zhì)濃度不到10mg/ml。
稀釋倍數(shù)為5倍以上，優(yōu)選10倍以上，更優(yōu)選50～400倍，可分幾個階段進(jìn)行稀釋。當(dāng)使用下述變性劑進(jìn)行稀釋時，稀釋前和稀釋后以尿素代表變性劑的濃度時，稀釋成4～10M，優(yōu)選稀釋成0.01～0.5M。
工序(a)優(yōu)選在低溫下進(jìn)行，特別是稀釋時優(yōu)選在低溫下進(jìn)行。例如，在15℃以下，優(yōu)選在3-10℃的溫度下進(jìn)行。
6.上述方法，其中在工序(a)中的水性溶劑包含蛋白質(zhì)變性劑。
優(yōu)選初始物質(zhì)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在水性溶劑中有良好的溶解性，可使用蛋白質(zhì)變性劑作為溶解輔助劑。這種情況下的蛋白質(zhì)變性劑包括尿素，鹽酸胍，硫氰酸鹽等。使用的濃度就是普通蛋白質(zhì)變性時使用的濃度，也可根據(jù)變性劑的種類選用，如使用尿素作為變性劑時，使用濃度為4-10M。
7.轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法，它是通過將變性狀態(tài)下的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在酸性條件下溶解到水性溶劑中，其后，將該酶溶液調(diào)整到中性范圍時，生產(chǎn)出具有酶活性狀態(tài)的酶。此時，優(yōu)選的處理條件等可利用前面記載的。
8.上述方法，其中在工序(a)中得到的形成所述結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)，在近紫外區(qū)的CD譜與天然狀態(tài)的相比有30-70％的分子橢圓率。
9.將變性狀態(tài)下的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酸性條件下溶解到水性溶劑中，可得到具有以下性質(zhì)(d)-(g)的蛋白質(zhì)。
(d)用異羥肟酸法進(jìn)行轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性測定，具有15-25U/mg的比活性；(e)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，分子量為36000-40000；(f)近紫外區(qū)的CD譜與天然狀態(tài)的相比有30-70％的分子橢圓率；(g)用His-Mes pH6.1的緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，與天然狀態(tài)的相比遷移率慢。
上述SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，優(yōu)選具有與天然狀態(tài)同等的大約38000的分子量。
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性測定中所應(yīng)用的異羥肟酸法，可按眾知的方法(例如，參照文獻(xiàn)Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，61，830-835，1997)進(jìn)行。
下面是本發(fā)明的適宜例子。
下面工序包含工序A和B，由變性狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)，通過重折疊方法，制備具有酶活性的天然狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(A)將含有活性殘基半胱氨酸殘基(Cys)的巰基游離(free)，來自變性、可溶化了的微生物的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液的pH值調(diào)整到酸性范圍，優(yōu)選用含有少量變性劑的酸性緩沖液，優(yōu)選稀釋50-400倍，得到具有形成天然狀態(tài)結(jié)構(gòu)的過程中形成的中間結(jié)構(gòu)(狀態(tài))的酶；(B)向含有上述具有中間結(jié)構(gòu)(狀態(tài))的酶溶液中直接添加堿性溶液，或者在添加促進(jìn)結(jié)構(gòu)形成的低分子量化合物后添加堿性溶液，使其pH值上升到中性范圍，6-7左右，促進(jìn)該酶高級結(jié)構(gòu)的形成，或者在形成高級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，必要時會合未形成該結(jié)構(gòu)的無活性級分，作為凝集物進(jìn)行分離的過程。
實施方案下面對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)說明。尤其是從含有培養(yǎng)重組大腸桿菌而得到的變性狀態(tài)的酶的培養(yǎng)物開始，作為適宜例，具體地以進(jìn)行重折疊的情況為中心進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于此。
本發(fā)明使用的初始物質(zhì)-被處理物是變性狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，優(yōu)選象來自微生物的變性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(MTG)那樣沒有高級結(jié)構(gòu)、基本上不顯示酶活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，再者具有最終能發(fā)揮轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性序列的酶也包含在本發(fā)明的初始物質(zhì)之內(nèi)。
更詳細(xì)地講，天然狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的序列是從N端的天門冬酰胺殘基(序號1)開始到C端的脯氨酸殘基(序號331)為止的331個氨基酸構(gòu)成的，不用說這樣的蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明的初始物質(zhì)之內(nèi)。另外，其它具有從第2個到第331個氨基酸殘基，由330個氨基酸(缺失第1個門冬酰胺殘基)構(gòu)成的蛋白質(zhì)，或者N端和/或C端側(cè)結(jié)合了一個或多個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，基本上不顯示轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，但通過高級結(jié)構(gòu)的形成后具有了活性或有這種可能的蛋白質(zhì)也包含在內(nèi)。這種蛋白質(zhì)的氨基酸序列內(nèi)缺失、置換和/或添加或插入了一個或多個氨基酸，通過本發(fā)明的方法，可具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性或有這種可能性，具有這種序列的蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明的初始物質(zhì)之內(nèi)。
本發(fā)明使用的初始物質(zhì)的代表性例子包括，培養(yǎng)插入了微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的微生物，例如重組的大腸桿菌，而得到的含變性酶的培養(yǎng)物(以前的發(fā)明上述本申請人的在先申請作為后面實施例中的參考制造例)。這里，改變微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基因的一部分，使其表達(dá)的氨基酸序列的一部分中，有一處或多處發(fā)生缺失/或置換(一個或多個氨基酸殘基)，和/或添加、插入一個或多個氨基酸，使之最終發(fā)揮轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，若具有這樣序列的可作為本發(fā)明的初始物質(zhì)使用。
應(yīng)用大腸桿菌作為生產(chǎn)宿主時，微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶起初在菌體中以不溶性顆粒蓄積，所以該顆?？勺鳛楸景l(fā)明的初始物質(zhì)。這種情況下，優(yōu)選在水性溶劑中使按常規(guī)方法回收的微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的不溶性顆粒可溶化。此時，將之懸浮到1mM乙二胺四乙酸(EDTA)后，可應(yīng)用尿素、鹽酸胍等蛋白質(zhì)變性劑溶化它。其它的用于可溶化的變性劑包括硫氰酸鹽等。
尿素濃度和鹽酸胍濃度按一般蛋白質(zhì)變性所必要的濃度使用，分別為7-10M、4-7M左右。微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的濃度無特別限制，但優(yōu)選盡可能的高濃度，例如10-100mg/ml左右。
該水溶液中，在見到如二聚體這樣的二硫鍵結(jié)合進(jìn)行還原時，優(yōu)選添加還原劑。此時可向水溶液中添加還原劑，如20mM的二硫蘇糖醇(DTT)，將pH值調(diào)整到7.5以后，37℃攪拌大約2小時，使其溶化。
接著，向這樣得到的微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可溶化液中添加適量的鹽酸等酸，將其pH值調(diào)整到2-7，優(yōu)選3-5，更優(yōu)選3.5-4.5，用包含相同濃度變性劑和還原劑的同一緩沖液或相同pH值的緩沖液稀釋，將濃度調(diào)整為10-100mg/ml，優(yōu)選20-80mg/ml。處理溫度優(yōu)選低溫0-15℃，優(yōu)選在3-10℃左右進(jìn)行處理。
將上面得到的溶液稀釋到預(yù)先冷卻到3-10℃的5-50mM的醋酸鈉緩沖液中，優(yōu)選15-25mM，pH3-5，優(yōu)選pH3.5-4.5，將蛋白質(zhì)濃度調(diào)整為0.2-4mg/ml，尿素濃度為0.01-0.5M，這樣能引導(dǎo)變性酶轉(zhuǎn)向形成所述結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)(狀態(tài))。調(diào)整溶劑環(huán)境，在酸性條件下稀釋，起初以速度效果觀察的中間狀態(tài)，不是平衡容易地從天然狀態(tài)引導(dǎo)出的狀態(tài)(參照后述的實施例11-16)。
變性酶的稀釋可分階段進(jìn)行，總體的稀釋倍數(shù)優(yōu)選50-400倍左右，使用變性劑時，變性劑的濃度用尿素代表時，將濃度為4-10M左右的酶稀釋到0.01-0.5M左右。
在上述酸性條件下進(jìn)行稀釋時，適于重折疊的獲得上述結(jié)構(gòu)形成的中間結(jié)構(gòu)(中間狀態(tài))時間長，例如保持在0.5小時以上，優(yōu)選1小時以上，更優(yōu)選保持1.5小時以上。
如此形成的中間結(jié)構(gòu)(中間狀態(tài))與后面實施例11-16中所示的天然結(jié)構(gòu)(狀態(tài))的不同，通過選擇本發(fā)明優(yōu)選的稀釋條件，可有效獲得“天然狀態(tài)”的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
中間狀態(tài)的形成可用逆相高效液相(HPLC)和高效凝膠過濾色譜進(jìn)行檢測，如分別用Vydac 214TP54(4.6φ×250mm，SEPARATIONSGROUP)和Superdex-75 HR 10/30(10φ×300mm，ァマシャム·ファルマシァ·バィオラク)進(jìn)行檢測，通過比較微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的峰面積可進(jìn)行確認(rèn)。用文獻(xiàn)(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)記載的方法測定出的中間狀態(tài)的酶活性低，如比活性為10-20U/mg左右，比天然狀態(tài)的酶活性(約300U/mg)大大下降。具有這樣酶活性的組分或級分包含在本發(fā)明(a)工序中得到的具有“形成所述結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)”的酶中。因此，在具有這樣低酶活性的MTG生產(chǎn)階段(不包含其采集過程)，結(jié)束本發(fā)明的(a)工序。
應(yīng)用凝膠過濾色譜和透析可取代上述稀釋法，形成中間(狀態(tài))，但與稀釋法相比，酶蛋白質(zhì)的回收率和酶活性(比活性)降低，所以，不優(yōu)選這些方法。若得到上述低酶活性產(chǎn)物，可進(jìn)行(b)工序，尤其沒必要分離本發(fā)明(a)工序中的酶。
接著，在(b)工序中，將如上得到的含有形成中間狀態(tài)的酶溶液的pH值處理成中性范圍。此時，將酶溶液維持在低溫下，例如維持在15℃以下，優(yōu)選維持在3-10℃，升高其pH值到中性范圍。調(diào)整成中性范圍的方法優(yōu)選向其中添加堿性溶液，將pH值升高到5.8-8.5，優(yōu)選6-7，離心除去產(chǎn)生的沉淀，回收含結(jié)構(gòu)形成結(jié)束了的微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的上清。因此，會合該方法完成上述結(jié)構(gòu)形成中得到的無活性酶，作為凝集物可容易地分離，所以極為有利。在獲得具有上述目標(biāo)酶活性的結(jié)構(gòu)形成階段(不包含其采集過程)，結(jié)束本發(fā)明的(b)工序。
上清的酶活性為30U/mg，與天然狀態(tài)的同等高，各種HPLC的洗脫峰形圖，分光學(xué)性質(zhì)，及熱穩(wěn)定性與天然狀態(tài)的微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶完全或基本一致。由以上可知，從變性蛋白質(zhì)完成向天然狀態(tài)酶的重折疊。此外，酶的分離、純化方法，可利用已知的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶之外其它酶的分離、純化方法，容易地進(jìn)行。
在升高中間狀態(tài)的pH值時，預(yù)先向其中添加低分子量化合物作為促進(jìn)劑，由此可促進(jìn)從中間狀態(tài)向天然狀態(tài)的結(jié)構(gòu)形成。比如，0.01-10mM氯化鈣(CaCl2)等2價金屬鹽，形成結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移的核心促進(jìn)局部結(jié)構(gòu)形成，促進(jìn)中間狀態(tài)向天然狀態(tài)轉(zhuǎn)移。除氯化鈣以外，可應(yīng)用氯化鍶等無機(jī)鹽。0.1-2M的醋酸鈉和丙酸鈉等有機(jī)鹽，0.1-2M的精氨酸鹽酸鹽等氨基酸鹽，10-40％的二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑，1-10％的聚乙二醇等多元醇和1-50mM的CHAPS等表面活性劑，可通過改變緩沖液的性質(zhì)而抑制向天然狀態(tài)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移的過程中產(chǎn)生的酶會合聚集，提高該酶蛋白質(zhì)的回收率。
如此得到的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶純度極高，將之分離純化無特殊困難，應(yīng)用慣用的或已知的方法進(jìn)行酶(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)的分離純化很容易進(jìn)行。
本發(fā)明中如此得到的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與天然狀態(tài)的基本上具有同等活性，且純度極高，所以沒必要再進(jìn)行純化，可直接在食品等各種領(lǐng)域與天然狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶同樣使用。
附圖簡述

圖1示MTG表達(dá)質(zhì)粒pTRPMTG-01的構(gòu)建圖。
圖2示MTG表達(dá)質(zhì)粒pTRPMTG-02的構(gòu)建圖。
圖3表示MTG表達(dá)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的展開圖。
1.MTG(4μg)2.pUC19/JM109的菌體破碎總級分(陰性對照)3.pUCTRPMTG-02/JM109的菌體破碎總級分4.第3泳道的離心上清部分5.第3泳道的離心沉淀部分圖4示質(zhì)粒pUCN216D的構(gòu)建圖。
圖5示MTG表達(dá)質(zhì)粒pTRPMTG(+)D2的構(gòu)建圖。
圖6表示缺失相當(dāng)于精氨酸殘基GAT的圖。
圖7表示N末端的氨基酸為絲氨酸的圖。
圖8表示天然狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(天然型)與從基因重組MTG獲得的酶(基因重組型)的逆相HPLC圖。
1.基因重組型；2.天然型天然型、基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶分別以8μg以下的條件進(jìn)行逆相HPLC。柱Vydac 214TP5410洗脫液A 0.1％TFA(三氟醋酸)B 0.1％TFA，80％乙腈洗脫程序1ml/min時間(分)A(％)B(％)0 703020 505025 0 10028 0 100圖9表示天然狀態(tài)的(天然型)與從基因重組MTG獲得的(基因重組型)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的CD譜。
用AVIV型號62ADS(HART SCIENTIFIC)和1mm電池，20℃測定實施例1中4個待檢樣品的CD譜。圖中待檢樣品的序號1-4如下。待檢樣品序號轉(zhuǎn)答氨酰胺酶緩沖液pH值轉(zhuǎn)答氨酰胺酶1 天然型4.0 3.22mg/ml2 然型 5.8 3.203 基因高組型 0 1.814 基因高組型5.8 1.69圖10表示實施例12中得到的基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的天然型及其結(jié)構(gòu)形成過程中中間結(jié)構(gòu)(狀態(tài))的CD(圓二色性)譜。
1.稀釋后0-10分；2.稀釋后10-60分；3.稀釋后60-160分；4.稀釋后170-270分；5.純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
圖11表示實施例12中得到的基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的天然型及其結(jié)構(gòu)形成過程中中間狀態(tài)的CD譜。
1.純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；2.將純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶調(diào)整到pH4.2，0.16M的尿素中；3.由變性狀態(tài)稀釋后，經(jīng)過26小時。
圖12表示對實施例13中得到的基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的天然型及其結(jié)構(gòu)形成過程中中間結(jié)構(gòu)(狀態(tài))進(jìn)行凝膠過濾分析的色譜圖。
圖13表示對實施例16中得到的基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的天然型及其結(jié)構(gòu)形成過程中中間狀態(tài)進(jìn)行非變性PAGE的結(jié)果圖。
1.純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；2.由變性狀態(tài)稀釋后，經(jīng)過26小時；3.將純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶調(diào)整到pH4.2，0.16M的尿素中；4.與3相同。
最佳實施狀態(tài)以下通過制備例和實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體說明。
(初始物質(zhì)的制備)將編碼微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的DNA導(dǎo)入大腸桿菌中，用2×YT培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，微生物來源的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以不溶性顆粒蓄積在細(xì)菌體內(nèi)，將之作為初始物質(zhì)使用均如下制備。其詳細(xì)內(nèi)容記載于本申請者以前的發(fā)明特愿平10-181951號、平成10年6月29日申請，特開平11-075876號公報(平成11年3月23日)(說明書等)中，本說明書中引入其說明書中的內(nèi)容作為參考。
因為MTG在菌體內(nèi)以不溶性顆粒的形式蓄積，所以包含在如下菌體破碎液的離心沉淀部分中，在以后的實施例中，將該離心沉淀部分作為顆粒應(yīng)用。該顆粒不顯示轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。大腸桿菌中MTG的大量表達(dá)<1>MTG表達(dá)質(zhì)粒pTRPMTG-01的構(gòu)建考慮到大腸桿菌和酵母密碼子的使用頻度，已經(jīng)全部合成了MTG基因(參照特開平5-199883號公報)。但是，該基因序列沒有在大腸桿菌中表達(dá)最適宜的元件。也就是說，存在的30個精氨酸殘基的密碼子均是單一的密碼子AGA。于是，首先，再合成最適于在大腸桿菌中表達(dá)的從MTG N末端開始的200個堿基。
轉(zhuǎn)錄MTG基因的啟動子應(yīng)用trp啟動子，它在培養(yǎng)基中缺乏色氨酸時容易誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。高表達(dá)マグィ轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG)基因的質(zhì)粒pTTG2-22(參照特開平6-225775號公報)使用trp啟動子，マグィTG基因上游的序列按異種蛋白在大腸桿菌中高表達(dá)的要求設(shè)計。
質(zhì)粒質(zhì)粒pTRPMTG-01的構(gòu)建是如圖1所示的那樣在マグィTG表達(dá)質(zhì)粒pTTG2-22(參照特開平6-225775號公報)的trp啟動子下游，從ClaI/HpaI部位到BgIII部分置換成合成DNA基因的ClaI/HpaI片段和pGEM15BTG(參照特開平6-30771)的HpaI/BamHI片段(小)。
合成DNA基因的ClaI/HpaI片段，是從pTTG2-22的trp啟動子下游ClaI部位開始到翻譯起始密碼子結(jié)束的序列和具有MTG基因從N末端開始的216個堿基的基因序列。關(guān)于MTG結(jié)構(gòu)基因部分，要參考大腸桿菌的密碼子使用頻度，使之最適于在大腸桿菌中表達(dá)，這樣來確定堿基序列。但為了去除mRNA形成高級結(jié)構(gòu)的能力，所以將編碼N末端部分區(qū)域中的縮合密碼子的3個字母變換成富含腺嘌呤、尿嘧啶，盡可能不要聯(lián)用相同的堿基。
合成DNA基因的ClaI/HpaI片段，設(shè)計成N末端有EcoRI、HindIII位點。設(shè)計的基因其+鏈和-鏈間相互重疊的大約40-50個堿基，合成12條相當(dāng)于各個序列的DNA(序列表中序號2-13)。將該合成的DNA的5’端磷酸化，與配對的合成的DNA退火后，連接。然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，切出大的目的DNA，重組到pUC19的EcoRI/HindIII部位。驗證堿基序列，將正確的命名為pUCN216。從該pUCN216中切出ClaI/HpaI片段(小)，用于構(gòu)建pTRPMTG-01。
(2>MTG表達(dá)質(zhì)粒pTRPMTG-02的構(gòu)建由于保持有pTRPMTG-01的大腸桿菌JM109不能高表達(dá)MTG，所以將MTG基因N末端改變了的部分以外的部分(777個堿基)也改變用于大腸桿菌。由于一次合成777個堿基較難，所以參考大腸桿菌的密碼子使用頻度確定堿基序列后，每次200個堿基分4批(B1，2，3，4)合成。設(shè)計每批的末端保持EcoRI、HindIII。設(shè)計的基因，其+鏈和-鏈間相互重疊的大約40-50個堿基，每批合成10條相當(dāng)于各序列的DNA，共合成40條(序列表中序號14-53)。將該合成的DNA的5’端磷酸化，與配對的合成的DNA退火后，連接。然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，切出大的目的DNA，重組到pUC19的EcoRI/HindIII部位。驗證堿基序列，將正確的分別命名為pUCB1，B2，B3，B4。然后如圖2那樣連接B1和B2，B3和B4，制作pUCB3-4。再由pTRPMTG-01、pUCN216、pUCB1-2、pUCB3-4構(gòu)建pTRPMTG-02。存在于pTRPMTG-02上包含高表達(dá)MTG基因的堿基序列示于序列表序列號1中。
<3>MTG表達(dá)質(zhì)粒pTRPMTG-02(+)、(-)的構(gòu)建由于保持有pTRPMTG-02的大腸桿菌JM109不能高表達(dá)MTG，所以將質(zhì)粒多拷貝化。將包含pTRPMTG-02 trp啟動子的Eco0109I片段(小)平端化后，重組到多拷貝質(zhì)粒pUC19的HincII部位，構(gòu)建與lacZ的啟動子和trp啟動子的同一體(pUCTRPMTG-02(+))逆向的質(zhì)粒(pUCTRPMTG-02(-))。
<4>MTG的表達(dá)用含有150μg/ml氨芐西林的3ml 2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)pUCTRPMTG-02(+)、pUC19轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，37℃振蕩培養(yǎng)10小時(預(yù)培養(yǎng))。向該培養(yǎng)液0.5ml中添加50ml含有150μg/ml氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)20小時。
從培養(yǎng)液中收集菌體，超聲波破碎。該菌體破碎液的總組分、離心上清部分、離心沉淀部分在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中的展開結(jié)果如圖3所示?？梢源_證，pUCTRPMTG-02(+)/JM109的菌體破碎液的總組分、離心沉淀部分中與MTG的分子量相同的蛋白質(zhì)高表達(dá)。另外，通過Wester blotting可以驗證，該蛋白質(zhì)與小鼠抗MTG抗體反應(yīng)。該蛋白質(zhì)的表達(dá)量為500-600mg/L。生產(chǎn)培養(yǎng)基中即便不加入3-β-吲哚丙烯酸也能看到顯著高表達(dá)。
再者，用小鼠抗MTG抗體進(jìn)行Wester blotting時，在離心上清部分中一點也沒看到MTG表達(dá)，由此可以明白表達(dá)的MTG幾乎全部形成不溶性蛋白質(zhì)包含體。
<5>表達(dá)MTG的N末端氨基酸分析對表達(dá)MTG的蛋白質(zhì)包含體N末端氨基酸殘基進(jìn)行分析，N末端序列約60％為甲硫氨酸殘基，40％為甲酰甲硫氨酸殘基。要除去相當(dāng)于起始密碼子的(甲酰)甲硫氨酸殘基，需進(jìn)行以下操作。
<6>MTG的N末端門冬酰胺殘基的缺失以含有MTG N末端216個堿基的pUCN216為模板進(jìn)行PCR，使相當(dāng)于門冬酰胺殘基的堿基序列缺失掉。pUCN216是包含MTG N末端ClaI-HpaI片段的大約216個bp克隆到pUC19的EcoRI/HindIII部位的質(zhì)粒。pF01(序列表序列號54)、pR01(序列表序列號55)是持有載體中序列的引物，pDELD(序列表序列號56)是缺失了相當(dāng)于Asp殘基的堿基序列，pHd01(序列表序列號57)是將C變成G，產(chǎn)生HindIII位點。pF01、pDELD是正義引物，pR01、pHd01是反義引物。
首先，pF01和pHd01，pDELD和pR01組對，分別對pUCN216進(jìn)行PCR，94℃30秒、55℃1分、72℃2分的條件下進(jìn)行35個循環(huán)。用酚/氯仿抽提各PCR產(chǎn)物，然后用乙醇沉淀，溶解到100μl水中。
從各PCR產(chǎn)物中取1μl混合，94℃熱變性10分鐘，然后以pF01和pHd01引物對進(jìn)行PCR，94℃30秒、55℃1分、72℃2分的條件下進(jìn)行35個循環(huán)。
用酚/氯仿抽提第二次PCR產(chǎn)物，乙醇沉淀后，用HindIII、EcoRI處理，獲得pUC19的亞克隆pUCN216D(圖4)。驗證所得pUCN216D的序列，是目的產(chǎn)物。
<7>門冬酰胺殘基缺失質(zhì)粒的構(gòu)建將pUCN216D的EcoRI/PpaI片段(小)與pUCB1-2(MTG基因的HpaI/BglII片段亞克隆到pUC19的Ec0RI/HindIII部位的質(zhì)?！车腅co0109I/HpaI片段(大)結(jié)合，構(gòu)成pUCNB1-2D。再將pUCNB1-2D的ClaI/BglII片段(小)與MTG高表達(dá)質(zhì)粒pUCTRPMTG-02(+)DClaI/BglII片段(大)結(jié)合，形成門冬酰胺殘基缺失的MTG表達(dá)質(zhì)粒pUCTRPMTG(+)D2(圖5)。結(jié)果如圖6所示，得到包含缺失相當(dāng)于門冬酰胺殘基GAT的MTG基因的質(zhì)粒。
<8>缺失門冬酰胺殘基的MTG的表達(dá)用含有150μg/ml氨芐西林的3ml 2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)pUCTRPMTG(+)D2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109，37℃振蕩培養(yǎng)10小時(預(yù)培養(yǎng))。向該培養(yǎng)液0.5ml中添加50ml含有150μg/ml氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)20小時。將菌體超聲波破碎后，取其破碎液的上清部分和沉淀部分，從SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后考馬斯亮蘭染色和用小鼠抗MTG抗體進(jìn)行Western blotting的結(jié)果來看，在超聲波破碎后的沉淀部分，即不溶性部分中可檢測到缺失門冬酰胺殘基的MTG蛋白質(zhì)。這提示缺失門冬酰胺殘基的MTG蛋白質(zhì)以蛋白質(zhì)包含體的形式蓄積在菌體內(nèi)。
對該蛋白質(zhì)包含體的N末端氨基酸序列進(jìn)行分析，如圖7所示，N末端的序列大約90％為絲氨酸。
比較<5>和<8>中得到的表達(dá)MTG的N末端氨基酸序列結(jié)果，由表1可以看出，通過使MTG的N末端缺失門冬酰胺殘基，可有效除去表達(dá)MTG的N末端附加的起始密碼子甲硫氨酸。
表1

N.D.未檢測(實施例1)用象前面所講初始物質(zhì)制備例中那樣制備的顆粒(上述離心沉淀部分)來制備顆粒懸浮液(1mMEDTA)，添加終濃度為8M的尿素，再添加20mM DTT之后，用20mM磷酸緩沖液調(diào)整pH值到7.5，37℃攪拌2小時，進(jìn)行抽提，作為變性酶液。用前述的逆相HPLC測定該變性酶液的含量后，分成小分，-80℃凍存，直到以后實驗中應(yīng)用。
向該變性酶溶液(酶濃度約50mg/ml)中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預(yù)先5℃冷卻的稀釋用緩沖液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。此時，反應(yīng)條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M。按文獻(xiàn)(Bioscience，Biotechnology，andBiochemistry，61，830-835，1997)中記載的方法求出反應(yīng)溶液中的酶活性(比活性)為19.4U/mg。5℃繼續(xù)攪拌30分鐘，然后滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心，得到上清。所得酶活性上升到pH值上升前的1.5倍，達(dá)到29.0U/mg，幾乎與微生物來源的天然狀態(tài)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶一致。從變性酶開始的蛋白質(zhì)回收率為53.6％。
維持以上的重折疊反應(yīng)條件，將實驗的規(guī)模提高10倍，用500緩沖液稀釋，pH值上升到6.0以后，離心，得到上清。該酶的比活性為33.7U/mg，從變性酶液開始的蛋白質(zhì)回收率為41.9％。將所得酶液通過陽離子交換色譜，應(yīng)用(1)逆相HPLC(參照圖8)，(2)CD譜(參照圖9)，和(3)示差掃描熱量計(DSC)，比較所得純化酶的性狀與微生物來源的天然狀態(tài)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的性狀，可以看到二者基本上沒差異。
(實施例2)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為0.2mg/ml。將6ml該變性酶溶液過用含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0緩沖液平衡過的Sephadex-G25M柱(1.6φ×15cm，Pharmacia)，用相同的緩沖液展開。以280nm波長的UV吸收為指標(biāo)回收級分。層析在室溫進(jìn)行。將回收級分于5℃冷卻30分鐘以上，向其中滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心，得到上清。該酶的比活性為23.4U/mg，從變性酶液開始的蛋白質(zhì)回收率為39.8％，酶的比活性、蛋白質(zhì)回收率比實施例1中得到的有所降低。
(實施例3)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為0.2mg/ml。將1ml該變性酶溶液裝入透析袋(Spectra/Por membrance，Nol；Spectrum MedicalInduatries，Inc.)，在1000ml緩沖液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中5℃透析過夜。向所得透析內(nèi)液中滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心，得到上清。該酶的比活性為31.1U/mg，從變性酶液開始的蛋白質(zhì)回收率為42.6％，比實施例1中得到的有所降低。
(實施例4)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為6.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH6.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預(yù)先5℃冷卻的稀釋用緩沖液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH6.0)中，攪拌使之均勻。此時，反應(yīng)條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M。5℃繼續(xù)攪拌30分鐘，離心得到上清。上清中一點也沒檢測到蛋白質(zhì)，會合聚集用于重折疊的變性酶。
再向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到9.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH9.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預(yù)先5℃冷卻的稀釋用緩沖液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH9.0)中，攪拌使之均勻。此時，蛋白質(zhì)回收率為18.9％，檢測不到酶活性。繼續(xù)滴入濃鹽酸，將pH降到6.0，離心得到上清。上清中一點也沒檢測到蛋白質(zhì)，會合聚集用于重折疊的變性酶。
以上結(jié)果與實施例1的有效性均提示進(jìn)行稀釋操作時pH值必需保持酸性條件。
(實施例5)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預(yù)先5℃冷卻的稀釋用緩沖液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃繼續(xù)攪拌30分鐘，再注入0.25ml pH4.0的變性酶溶液(40mg/ml)，稀釋之。這樣的操作重復(fù)2次，共分4次稀釋，結(jié)果最終的反應(yīng)條件為變性酶濃度0.78mg/ml，尿素濃度0.16M。5℃繼續(xù)攪拌30分鐘，滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心得到上清。所得酶的比活性為32.8U/mg，從變性酶液開始的蛋白質(zhì)回收率為59.0％。稀釋操作不分次進(jìn)行，將1ml變性酶溶液(pH4.0，40mg/ml)一次進(jìn)行稀釋時，所得上清的比活性相同(32.8U/mg)，但蛋白質(zhì)回收率比分4次稀釋時降低3％，得到56％。
(實施例6)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預(yù)先5℃冷卻的稀釋用緩沖液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃繼續(xù)攪拌30分鐘，向其中添加1mM CaCl2，再5℃攪拌30分鐘。此時，反應(yīng)條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M，CaCl21mM。然后，滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心得到上清。所得酶的比活性為30.0U/mg，從變性酶液開始的蛋白質(zhì)回收率為60.1％。以不添加CaCl2時同時進(jìn)行的重折疊作為對照，所得酶的比活性為31.7U/mg，從變性酶液開始的蛋白質(zhì)回收率為51.3％，相差大約9％，由此確證在pH值增加到6.0以前添加CaCl2的效果。另一方面，預(yù)先向稀釋用緩沖液中添加1mM CaCl2時，比活性為25.3U/mg，蛋白質(zhì)回收率為53.2％，與pH值上升前添加相比有些降低。
(實施例7)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml.將0.25ml注入到50ml預(yù)先5℃冷卻的稀釋用緩沖液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃繼續(xù)攪拌30分鐘，向其中添加0.1mM StCl2，再5℃攪拌30分鐘。此時，反應(yīng)條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M，StCl20.1mM。然后，滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心得到上清。所得酶的比活性為27.3U/mg，從變性酶液開始的蛋白質(zhì)回收率為84.5％。比實施例1的蛋白回收率(53.6％)有大幅度上升。
(實施例8)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將0.25ml注入到50ml預(yù)先5℃冷卻的稀釋用緩沖液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃繼續(xù)攪拌30分鐘，向其中添加10mM表面活性劑CHAPS(3-[(3-膽胺異丙基)二甲基-氨基]-2-羥基-1-丙磺酸)，再5℃攪拌30分鐘。此時，反應(yīng)條件為變性酶濃度0.2mg/ml，尿素濃度0.04M，CHAPS 10mM。然后，滴入4M氫氧化鈉使pH值增加到6.0，離心得到上清。所得酶的比活性為29.3U/mg，從變性酶液開始的蛋白質(zhì)回收率為93.0％。比實施例1的蛋白回收率(53.6％)有大幅度上升。
(實施例9)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將0.2ml注入到10ml預(yù)先5℃冷卻的稀釋用緩沖液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。5℃邊攪拌邊在30秒、5分、及0.5、1.0、1.5、2.0、3.0及17小時后分別取樣，滴入4M氫氧化鈉使pH值轉(zhuǎn)換到6.0，離心取上清。所得上清中酶的比活性及從變性酶溶液開始到獲得上清的蛋白質(zhì)回收率與取樣時間間的關(guān)系如表2所示。結(jié)果，稀釋后直接轉(zhuǎn)換pH值的比活性低，隨著取樣時間的延長，pH值轉(zhuǎn)換后上清中的比活性增高，1.5小時以上時可達(dá)30U/mg。由于經(jīng)pH4.0的稀釋所形成的中間結(jié)構(gòu)(狀態(tài))獲得適于重折疊的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，所以更優(yōu)選1.5小時以上的時間。
表2

(實施例10)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將0.2ml注入到10ml預(yù)先5℃冷卻的各種pH值的稀釋用緩沖液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH3.5、3.8、4.0、4.2、4.5、5.0、5.5)中，攪拌使之均勻。5℃繼續(xù)攪拌2小時，然后滴入4M氫氧化鈉使pH值轉(zhuǎn)換到6.0，離心取上清。所得上清中酶的比活性及從變性酶溶液開始到獲得上清的蛋白質(zhì)回收率與稀釋時的pH間的關(guān)系如表3所示。結(jié)果，pH4.0和4.2時比活性和蛋白質(zhì)回收率最高。
表3

(實施例11)向與實施例1同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM醋酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將147ml注入到7350ml預(yù)先5℃冷卻的稀釋用緩沖液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.1)中，攪拌使之均勻。5℃繼續(xù)攪拌2小時，然后滴入4M氫氧化鈉使pH值轉(zhuǎn)換到6.0，傾析并離心取上清。所得上清中酶的比活性為30.7U/mg，從變性酶溶液開始到獲得上清的蛋白質(zhì)回收率為66.5％。通過超濾(截斷分子量10kDa)將該上清濃縮為750ml，用平衡陽離子交換色譜的緩沖液(20mM醋酸鈉，pH5.8)稀釋10倍。然后，過經(jīng)同一緩沖液充分平衡過的陽離子交換柱(CM SepharoseFF，11.3φ×10cm，ァマシャム·ファルマシァ·バィオテク社制)。用同一緩沖液再平衡后，以280nm波長的UV吸收為指標(biāo)，用0-0.3M的NaCl線性濃度梯度進(jìn)行洗脫，回收蛋白質(zhì)級分(500ml)。層析在室溫進(jìn)行。通過該操作可除去菌體來源的非目標(biāo)性雜質(zhì)物。
將回收級分的半量(250ml)過凝膠過濾柱(SepharoseG-25M，14φ×15cm，ァマシャム·ファルマシァ·バィオテク社制)，該柱用含2mM DTT的20mM醋酸鈉緩沖液，pH6.0平衡過，用同一緩沖液展開。以280nm波長的UV吸收為指標(biāo)，回收蛋白質(zhì)級分(380ml)。層析在室溫進(jìn)行。所得蛋白質(zhì)級分的比活性為29.4U/mg(約0.75g)。將該級分調(diào)整為1.2mg/ml，分成小份，-80℃凍存。以后，將該保存的樣品稱為“純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶”。
另一方面，將上述陽離子交換色譜中殘余的另一半回收級分(250ml)過上述用含2mM DTT的10mM醋酸鈉緩沖液，pH6.0平衡過的凝膠過濾柱，用同一緩沖液展開。以280nm波長的UV吸收為指標(biāo)，回收蛋白質(zhì)級分(380ml)。層析在室溫進(jìn)行。用前述的超濾將所得蛋白質(zhì)級分的總量濃縮到122ml。將醋酸銨的濃度調(diào)整為50mM，-80℃冷凍，進(jìn)行冷凍干燥，得到大約0.75g干粉。以后，將該干粉稱為“純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶干粉”。
(實施例12)應(yīng)用實施例11中得到的純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶干粉，研究結(jié)構(gòu)形成的中間結(jié)構(gòu)(狀態(tài))的物理化學(xué)性質(zhì)。將該干粉溶解到1mMEDTA水溶液中，添加尿素、DTT和磷酸鈉，使其終濃度分別為8M、20mM和20mM，調(diào)pH為7.5。將之37℃孵育2小時，向其中滴入濃鹽酸，調(diào)pH為4.0。用含8M尿素和20mM DTT的20mM磷酸鈉，pH4.0稀釋之，將變性酶濃度調(diào)整為40mg/ml。分成小份，-80℃凍存，備用。將該變性酶液融解后，向0.2ml中注入10ml稀釋用緩沖液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0〕，攪拌均勻。其后，隨時間變化測定其近UV光譜。測定時使用JascoJ-715spetropolarimeter，比色杯在近UV區(qū)選用1cm通道，在遠(yuǎn)UV區(qū)選用0.1cm的通道。測定在室溫進(jìn)行，波長掃描率為10nm/min。所得數(shù)據(jù)變換成每1摩爾氨基酸的CD(圓二色性)。圖10是近UV的CD(圓二色性)譜。0-10min是1次掃描的數(shù)據(jù)，10-60min是5次掃描的平均數(shù)據(jù)，60-160min和170-270min是10次掃描的平均數(shù)據(jù)。由該結(jié)果可以看出，直接稀釋后幾乎沒有高級結(jié)構(gòu)形成，其后緩慢進(jìn)行結(jié)構(gòu)形成。60-160min和170-270min幾乎顯示同一波譜，這表明在近UV-CD觀察到的高級結(jié)構(gòu)形成延續(xù)到160min才結(jié)束。稀釋后即使經(jīng)過26小時(h)，在60-160min所形成的結(jié)構(gòu)一點也沒變化。
同時向?qū)嵤├?1中得到的純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中添加尿素和磷酸鈉，最終調(diào)整為含0.16M尿素和2mM DTT的20mM醋酸鈉、pH4.2，靜置24小時，使之在同一緩沖液中形成充分穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)后，同樣測定CD譜，與天然狀態(tài)的比較。結(jié)果如圖11所示。即便在0.16M尿素，pH4.2中，該酶也沒失去天然結(jié)構(gòu)(狀態(tài))。另一方面，從變性狀態(tài)通過稀釋而形成的結(jié)構(gòu)狀態(tài)(稀釋后26小時)與同一緩沖液中該酶的結(jié)構(gòu)狀態(tài)(天然狀態(tài))有明顯差異，這表明變性→稀釋操作(重折疊)中形成的結(jié)構(gòu)狀態(tài)是與天然狀態(tài)不同的“中間狀態(tài)”，但稀釋后狀態(tài)慢慢產(chǎn)生變化。
由以上可以看出，近紫外區(qū)尤其是260-290nm的CD譜中，中間狀態(tài)相對于天然狀態(tài)的分子橢圓率為30-70％。
(實施例13)向與實施例12同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM磷酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將該溶液0.2ml注入到10ml稀釋用緩沖液(含2mMDTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。為了研究稀釋后結(jié)構(gòu)狀態(tài)的變化過程，用Superdex 75 HR10/30進(jìn)行凝膠過濾分析。緩沖液用包含0.02％Tween 20的0.1M硫酸鈉，pH4.0，流速0.8ml/min。隨時間變化(2、10、30、60、100、160、260分及1日)分析稀釋后的樣品100μg。直接稀釋后(2分)，檢測到比天然結(jié)構(gòu)(狀態(tài))下該酶的峰洗脫時間早4分鐘出現(xiàn)的峰，與稀釋后的時間經(jīng)過一起，洗脫時間發(fā)生變化，這表明結(jié)構(gòu)狀態(tài)(大分子狀態(tài))在稀釋后繼續(xù)變化。
另一方面，將在實施例11中獲得的純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在含0.16M尿素和2mM DTT的20mM醋酸鈉、pH4.0中透析24小時，在稀釋用緩沖液中形成充分穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)后進(jìn)行同樣地分析(參照圖12)。峰的洗脫時間與天然狀態(tài)的無變化，該酶在0.16M尿素pH4.0的條件下沒有喪失天然狀態(tài)。通過稀釋形成的結(jié)構(gòu)在經(jīng)過足夠的時間后，其峰的洗脫時間與天然狀態(tài)的一致，但峰形依然有明顯的差異。這表明通過稀釋形成的中間狀態(tài)隨時間的變化其構(gòu)造狀態(tài)也發(fā)生變化，最終沒達(dá)到與天然狀態(tài)同樣的結(jié)構(gòu)，保留在結(jié)構(gòu)形成中的中間狀態(tài)。
(實施例14)向與實施例12同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM磷酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為15mg/ml。將該溶液0.2ml注入到10ml稀釋用緩沖液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻。測定該溶液在280nm處激發(fā)的Trp熒光的λmax隨時間的變化(30秒及0.5、1、1.5和2小時)。從剛稀釋后(30秒)開始，觀察λmax轉(zhuǎn)藍(lán)(351.5→344nm)隨時間的變化，顯示結(jié)構(gòu)慢慢緊湊化(結(jié)構(gòu)形成進(jìn)行)的過程。稀釋后即便經(jīng)過足夠的時間，λmax與天然狀態(tài)的(340.0nm)也不一致，這表明通過稀釋而形成的結(jié)構(gòu)狀態(tài)與天然狀態(tài)有明顯的差異。
另一方面，將在實施例11中獲得的純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在含0.16M尿素和2mMDTT的20mM醋酸鈉、pH4.0中透析24小時，在稀釋用緩沖液中形成充分穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)后，同樣進(jìn)行Trp熒光的λmax測定時，λmax與天然狀態(tài)的沒有變化，這表明該酶在0.16M尿素pH4.0的條件下能夠維持天然結(jié)構(gòu)(狀態(tài))(參照表4)。這些結(jié)果表明，通過稀釋形成的中間狀態(tài)隨時間的變化其構(gòu)造狀態(tài)也發(fā)生變化，最終沒達(dá)到與天然狀態(tài)同樣的結(jié)構(gòu)，保留在結(jié)構(gòu)形成中的中間狀態(tài)。
表4

(實施例15)向與實施例12同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM磷酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為15mg/ml。將該溶液0.2ml和ANS(8-苯胺萘-1-磺酸，終濃度20μM)注入到10ml稀釋用緩沖液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.2)中，攪拌使之均勻。其后，在激發(fā)波長400nm、熒光波長470nm處測定ANS熒光強(qiáng)度隨時間的變化(1分，0.5、1、1.5、2小時)，結(jié)果如表5所示。結(jié)果是，從剛稀釋后(1分)開始到2小時，可觀察到隨時間的變化，熒光強(qiáng)度降低(1387→974)，這顯示了蛋白質(zhì)表面露出的疏水性區(qū)域慢慢消失的過程。但是稀釋后即便經(jīng)過足夠的時間，ANS熒光強(qiáng)度也降不到天然狀態(tài)的熒光強(qiáng)度，這表明通過稀釋而形成的結(jié)構(gòu)狀態(tài)與天然狀態(tài)有明顯的差異。
另一方面，將在實施例11中獲得的純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在含0.16M尿素和2mM DTT的20mM醋酸鈉、pH4.0中透析24小時，在稀釋用緩沖液中形成充分穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)后，同樣進(jìn)行ANS熒光強(qiáng)度測定時，與天然狀態(tài)比較熒光強(qiáng)度有若干上升，其變化不大(56→162)，這表明該酶在0.16M尿素pH4.0的條件下能夠維持天然狀態(tài)。這些結(jié)果表明，通過稀釋形成的中間狀態(tài)隨時間的變化其構(gòu)造狀態(tài)也發(fā)生變化，最終沒達(dá)到與天然狀態(tài)同樣的結(jié)構(gòu)，保留在結(jié)構(gòu)形成中的中間狀態(tài)。
表5

(實施例16)向與實施例12同樣制備的變性酶溶液中滴入濃鹽酸，調(diào)整pH為4.0。用含8M尿素和20mM二硫蘇糖醇(DTT)的20mM磷酸鈉，pH4.0將之稀釋，將變性酶溶液的濃度調(diào)整為40mg/ml。將該溶液0.2ml注入到10ml稀釋用緩沖液(含2mM DTT的20mM醋酸鈉，pH4.0)中，攪拌使之均勻，進(jìn)行非變性PAGE。用市售的NuPAGE Tris-Acetate 7％膠(Novex)，His-Mes pH6.1緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖13所示。稀釋后該酶的遷移率與天然狀態(tài)的有明顯差異，這表明通過稀釋而形成的結(jié)構(gòu)狀態(tài)與天然狀態(tài)有差異。
同時，將在實施例11中獲得的純化基因重組型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中添加尿素和醋酸鈉溶液，最終調(diào)整為含0.16M尿素和2mMDTT的20mM醋酸鈉、pH4.0，同樣進(jìn)行非變性PAGE。溶劑變化前后遷移率沒有變化，這表明該酶在0.16M尿素pH4.0的條件下能夠維持天然狀態(tài)。
實施例11-16所示的結(jié)果顯示(1)水性溶劑中，酸性條件下，用變性劑稀釋而形成的結(jié)構(gòu)狀態(tài)是復(fù)雜的化合物；(2)其狀態(tài)是隨時間變化的；(3)最終保留到與天然結(jié)構(gòu)不同的“中間狀態(tài)”。再者，實施例9和10(4)優(yōu)選適當(dāng)設(shè)定稀釋條件，通過誘導(dǎo)中間狀態(tài)，可提高向天然狀態(tài)的回收率。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明中使用的上述重折疊方法，可工業(yè)化將由基因重組微生物生產(chǎn)的變性狀態(tài)的酶與天然狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基本上具有同等酶活性，即具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的高純度的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。且無需特殊純化，可直接與天然狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶同樣廣泛使用于食品等各種領(lǐng)域。
尤其是，通過在酸性溶液中稀釋，優(yōu)選將pH保持在一定狀態(tài)下進(jìn)行稀釋處理后調(diào)整到中性范圍，制備出具有有效促進(jìn)從變性狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，經(jīng)過上述結(jié)構(gòu)形成的中間結(jié)構(gòu)，到目的高級結(jié)構(gòu)形成這樣酶活性的酶。
還提供具有形成上述結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)的中間體。
權(quán)利要求
1.具有酶活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于將變性狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶付諸至少包含下述工序(a)和(b)的工序(a)將該變性狀態(tài)的酶形成中間結(jié)構(gòu)的工序，所述的中間結(jié)構(gòu)是形成在水性溶劑中、酸性條件下具有酶活性的結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)；以及(b)將已經(jīng)形成可形成上述結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)的酶形成高級結(jié)構(gòu)的工序，所述的高級結(jié)構(gòu)是在水性溶劑中、pH值中性范圍內(nèi)具有酶活性的高級結(jié)構(gòu)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中工序(a)中在該酶分子內(nèi)半胱氨酸殘基的巰基是游離的，在形成在水性溶劑中，酸性條件下具有酶活性的結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)時，在溶解狀態(tài)下將該酶在酸性條件下稀釋。
3.權(quán)利要求1的方法，其中工序(b)中的水性溶劑包含形成具有酶活性的高級結(jié)構(gòu)的促進(jìn)劑。
4.權(quán)利要求1的方法，在工序(b)之后包含工序(c)，即會合該酶中無活性的酶，作為凝集物進(jìn)行分離的工序。
5.權(quán)利要求1的方法，其中工序(a)中，將該酶溶解到水性溶劑中，其中工序(b)中的中性范圍是指將工序(a)中得到的酶溶液的pH值上升到中性范圍。
6.權(quán)利要求2的方法，其中工序(a)中將變性狀態(tài)的酶的酸性溶液稀釋成酸性時，在15℃以下的低溫下進(jìn)行稀釋，所稀釋的蛋白質(zhì)濃度不到10mg/ml。
7.權(quán)利要求1的方法，其中工序(a)中的水性溶劑包含蛋白質(zhì)變性劑。
8.權(quán)利要求1的方法，其中形成所述結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)在近紫外區(qū)域的CD譜相對于天然狀態(tài)的有30-70％的分子橢圓率。
9.具有酶活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的制備方法，其特征在于，將變性狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在水性溶劑中酸性條件下溶解，其后將該酶溶液調(diào)整到中性范圍，生成具有酶活性的酶。
10.通過將變性狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶置于水性溶劑中酸性條件下，可得到具有以下(d)-(g)所示特征的蛋白質(zhì)(d)用異羥肟酸方法對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行活性測定，它具有15-25U/mg的比活性；(e)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法中，分子為36000-40000；(f)近紫外區(qū)域的CD譜相對于天然狀態(tài)的有30-70％的分子橢圓率；以及(g)用His-Mes、pH6.1的緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行非不變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時，其遷移比天然狀態(tài)的慢。
全文摘要
通過包括至少下述工序(a)和(b)的工序?qū)⒆冃誀顟B(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶制備為具有酶活性的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶:(a)將該變性狀態(tài)的酶形成中間結(jié)構(gòu)的工序,所述的中間結(jié)構(gòu)是形成在水性溶劑中、酸性條件下具有酶活性的結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu);以及(b)將已經(jīng)形成上述結(jié)構(gòu)形成的中間結(jié)構(gòu)的酶形成高級結(jié)構(gòu)的工序,所述的高級結(jié)構(gòu)是在水性溶劑中、pH值中性范圍內(nèi)具有酶活性的高級結(jié)構(gòu)。因此能有效地對基因重組微生物生產(chǎn)的變性狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行重折疊,使之與天然狀態(tài)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶基本上具有同等酶活性,即能夠工業(yè)性制備具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性的高純度的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。還提供形成上述結(jié)構(gòu)的中間結(jié)構(gòu)的中間體。
文檔編號C12N9/10GK1334867SQ99816257
公開日2002年2月6日 申請日期1999年12月24日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月28日
發(fā)明者橫山敬一, 小野邦夫, 江島大輔 申請人:味之素株式會社 被以下專利引用 (1),