含有對(duì)映體牛尿酚的組合物和產(chǎn)物及其用圖
【專利說明】
[0001] 本申請(qǐng)是中國發(fā)明申請(qǐng)（發(fā)明名稱：含有對(duì)映體牛尿酚的組合物和產(chǎn)物及其用 途；【申請(qǐng)?zhí)枴?01010156015. 9 ;申請(qǐng)日：2003. 07. 24)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及對(duì)映體牛尿酚（equol)化合物，即S-牛尿酚和R-牛尿酚的制備和分 離，以及含有對(duì)映體牛尿酚化合物的食物和藥物，所述食物和藥物用于治療哺乳動(dòng)物和人 類的疾病和病情。
【背景技術(shù)】
[0003] 大豆和由純化大豆蛋白制備的食物的營養(yǎng)價(jià)值是眾所周知的，而再次對(duì)大豆食物 產(chǎn)生興趣主要是對(duì)異黃酮的潛在健康益處的證明研宄的結(jié)果，其中異黃酮是大豆中富含的 一類植物雌激素。盡管最近FDA許可大豆食物制造商可聲稱每份含至少6. 25g大豆蛋白的 大豆食物有利心臟健康（FDA，1999)，這還是沒有認(rèn)識(shí)到大豆中異黃酮組分的價(jià)值，現(xiàn)在的 研宄表明植物雌激素具有降低膽固醇的作用，同時(shí)還具有有助于降低心血管危險(xiǎn)因子的重 要非類固醇性質(zhì)。經(jīng)常食用大豆的亞洲國家的激素依賴性疾病的低發(fā)病率據(jù)稱部分是由于 大豆異黃酮的作用。
[0004] 植物雌激素，尤其是來自大豆，三葉草和野葛（kudzu)的異黃酮，例如染料木素 (genistein)、葛根黃豆苷元（daidzein)、黃豆黃素（glycitein)、peurarin及其糖苷衍生 物、雞豆黃素（biochanin)A和芒柄花黃素（formononetin)，及其糖苷衍生物，在一些哺乳 動(dòng)物和人組織中顯示雌激素的性質(zhì)，并在其它組織中通過在雌激素受體位點(diǎn)競爭性抑制雌 激素結(jié)合而顯示抗-雌激素的性質(zhì)。和雌激素不同，這些異黃酮植物雌激素似乎與乳腺癌 和子宮癌的危險(xiǎn)增高無關(guān)，并實(shí)際上可抑制乳腺癌和前列腺癌的發(fā)病。
[0005] 心血管疾病是發(fā)病率和死亡率的主要病因，特別在美國和西歐國家更是如此。數(shù) 種致病因子參與心血管疾病的發(fā)病，包括對(duì)該疾病的遺傳素因、性別、生活方式因子例如吸 煙和飲食、年齡、高血壓、高脂血癥，包括高膽固醇血癥。數(shù)種這些因子，尤其是高脂血癥和 高膽固醇血癥，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的發(fā)病，而動(dòng)脈硬化是血管和心臟疾病的主要病因。
[0006] 高血膽固醇濃度是人類血管疾病和冠心病的關(guān)鍵危險(xiǎn)因子之一。升高的 低密度脂蛋白膽固醇（下文稱"LDL-膽固醇〃）和總膽固醇與冠心病危險(xiǎn)增高直接 相 關(guān)(CholesterolandMortality:30YearsofFollow-UpfromtheFramingham Study,Anderson,Castelli，&Levy，JAMA，Vol. 257,pp. 2176-80 (1987))，而低水平的高密度 脂蛋白膽固醇（下文稱"HDL-膽固醇〃）也是誘病因子。數(shù)個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)支持HDL-膽固醇 對(duì)動(dòng)脈硬化的保護(hù)作用。研宄還顯示，婦女的血HDL-膽固醇每增加1-mg/dL，冠狀血管疾 病的危險(xiǎn)性就降低 3% (High-densityLipoproteinCholesterolandCardiovascular Disease:FourProspectiveAmericanStudies,Gordon,Probstfield,andGarrisonet.al .,Circulation,Vol. 79,pp. 8-15(1989))〇
[0007] 雌激素在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和保持血管健康方面起重要作用，正如絕經(jīng)后血漿膽固醇 增加，以及在美國和大多數(shù)西方國家中死于心血管疾病的婦女多于男子這一事實(shí)可證明。 為此，一直相信HRT能通過預(yù)防CVD來使絕經(jīng)后婦女受益。最近對(duì)16, 608名以上絕經(jīng)后 堅(jiān)持HRT8年以上的婦女進(jìn)行的婦女健康初步研宄（Women'sHealthInitiativeStudy) 沒有顯示這種益處，并且實(shí)際上發(fā)現(xiàn)由于血栓栓塞和心臟疾病導(dǎo)致的死亡危險(xiǎn)增加，尤其 是在聯(lián)用雌激素和孕激素的第一年中，同時(shí)乳腺癌的危險(xiǎn)性顯著增加。由于這些報(bào)道的結(jié) 果，HRT使用急劇減少，而且現(xiàn)在婦女不斷地尋找雌激素的替代形式來改善絕經(jīng)后雌激素缺 乏。植物雌激素如異黃酮通過與雌激素受體的構(gòu)象結(jié)合而起到天然選擇性雌激素受體調(diào)節(jié) 物的作用，是潛在有吸引力的替代物，并且雖然公開了很多大豆或三葉草異黃酮的用途，但 是關(guān)于重要的代謝物質(zhì)牛尿酚的潛在價(jià)值只有很少的數(shù)據(jù)。
[0008] 最近研宄表明，大豆異黃酮對(duì)于降低動(dòng)物內(nèi)血總膽固醇和LDL-膽固醇濃度有重 要作用，從而抑制動(dòng)脈硬化發(fā)病。異黃酮對(duì)人血膽固醇水平的作用更加有爭議，但數(shù)項(xiàng)研宄 現(xiàn)在表明需要大豆中存在異黃酮來觀察到膽固醇-降低作用。Crouse等人的重要研宄顯 示，血清總膽固醇和LDL-膽固醇和大豆蛋白中的異黃酮量之間的劑量依賴關(guān)系。與異黃酮 可具有膽固醇自身平衡的作用無關(guān)，有證據(jù)顯示異黃酮對(duì)血管具有重要影響。研宄已顯示 脂質(zhì)過氧化減少，動(dòng)脈活性、血流和血壓的改善，以及血小板聚集的降低。我們最近發(fā)現(xiàn)，包 含異黃酮的每日飲食可降低C-反應(yīng)性蛋白的水平，所述蛋白是炎癥的重要標(biāo)志物，并被認(rèn) 為是心血管疾病的加速因子之一。所有上述內(nèi)容都是重要的心血管疾病危險(xiǎn)性降低因子。
[0009] 異黃酮顯示對(duì)減少骨質(zhì)損失的作用（bone-sparingeffect)。目前的17項(xiàng)體外培 養(yǎng)骨細(xì)胞研宄，24項(xiàng)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的體內(nèi)研宄，以及17項(xiàng)飲食干預(yù)研宄顯示， 異黃酮具有減少骨質(zhì)損失的作用。在所有這些研宄中都檢驗(yàn)大豆異黃酮或三葉草異黃酮。 我們首次表明，牛尿酚是重要的骨質(zhì)營養(yǎng)因子，與雌激素不同，它對(duì)絕經(jīng)后婦女不僅具有降 低骨再吸收細(xì)胞的活性的能力，實(shí)際上還具有增加骨鹽密度的作用。
[0010] 盡管大量科學(xué)文獻(xiàn)關(guān)注大豆或三葉草中的天然異黃酮，很少有報(bào)道關(guān)于它們的腸 來源代謝物的作用和效果，并仍需要進(jìn)一步發(fā)展能在哺乳動(dòng)物和人中安全提供治療或預(yù)防 作用的化合物和方法。
[0011] 1932年，非類固醇雌激素牛尿酚（7-羥基_3_(4' -羥基苯基）-苯并二氫呋喃 (chroman))首次從懷孕的母牛尿液中分離并鑒定，并隨后在食用大豆食物的人的尿中鑒 定。牛尿酚的結(jié)構(gòu)類似于類固醇雌激素雌二醇（estradiol)。牛尿酚在異黃酮類物質(zhì)中是 獨(dú)特的，這是因?yàn)樗哂惺中灾行?，并因此以兩種不同的對(duì)映體形式即R-和S-對(duì)映體形式 而存在。以前對(duì)牛尿酚的所有研宄似乎都利用牛尿酚的外消旋形式進(jìn)行的。通常對(duì)兩種形 式的牛尿酚的存在缺乏認(rèn)識(shí)，并且就我們的知識(shí)而言，對(duì)于單個(gè)對(duì)映體的具體作用或活性 尚未有過報(bào)道。當(dāng)牛尿酚最初在母牛的尿中鑒定時(shí)，據(jù)報(bào)道其是光學(xué)活性的，以R-對(duì)映體 而存在。隨后，發(fā)現(xiàn)這是錯(cuò)誤的，并有證據(jù)表明從馬尿中分離的牛尿酚形式實(shí)際上是S-對(duì) 映體。我們第一次證明了人腸中產(chǎn)生的牛尿酚形式只是S-對(duì)映體，且我們合成并分離了獨(dú) 立的對(duì)映體，并顯示了它們對(duì)雌激素受體（ER)即ERa和ER0的親合力有明顯差異。
[0012] 雖然最初發(fā)現(xiàn)將大劑量的牛尿酚注射到卵巢切除后的小鼠時(shí)，牛尿酚沒有顯示雌 激素作用，后來的發(fā)現(xiàn)顯示它是造成綿羊的不育綜合癥的原因。
[0013] 最初也報(bào)道過（-)牛尿酚在卵巢切除后的小鼠中不具有雌激素活性，但隨后證實(shí) 牛尿酚的外消旋混合物作為弱雌激素起作用，而其前體，葛根黃豆苷元和芒柄花黃素沒有 或具有可忽略的雌激素活性。
[0014] 牛尿酚不通常存在于大多數(shù)健康成人的尿中，除非他們吃了大豆。牛尿酚在體內(nèi) 的形成僅依賴于腸道微生物區(qū)系，這可從以下的發(fā)現(xiàn)證實(shí)：無細(xì)菌的動(dòng)物不分泌牛尿酚，以 及在從出生起就僅喂給大豆食物的新生嬰兒的血漿和尿中沒有發(fā)現(xiàn)牛尿酚。
[0015] 牛尿酚完全是一種不天然存在于任何基于植物的產(chǎn)物中的非類固醇雌激素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明涉及用于制備商業(yè)產(chǎn)品的組合物，其包含S-牛尿酚。
[0017] 優(yōu)選地，所述組合物通過從S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物中分離S-牛尿 酚制備。
[0018] 優(yōu)選地，所述組合物主要由S-牛尿酚組成，并且對(duì)映體純度為90%最小對(duì)映體過 量（EE)，更優(yōu)選為96 %最小EE，甚至更優(yōu)選為98 %最小EE。
[0019] 本發(fā)明還涉及用于制備商業(yè)產(chǎn)品的組合物，其包含R-牛尿酚。
[0020] 優(yōu)選地，其中所述組合物主要由R-牛尿酚組成，并且對(duì)映體純度為90%最小對(duì)映 體過量（EE)，更優(yōu)選為96 %最小EE，甚至更優(yōu)選為98 %最小EE。
[0021] 本發(fā)明還涉及商業(yè)制品，其包含S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
[0022] 優(yōu)選地，其中所述非外消旋混合物包含比例為約1:99到約49:51的S-牛尿酚與 R-牛尿酚，或約51:49到約99:1的S-牛尿酚與R-牛尿酚。
[0023] 優(yōu)選地，其中所述商業(yè)制品包括食品。
[0024] 優(yōu)選地，其中所述牛尿酚的非外消旋混合物是通過將選自S-牛尿酚和R-牛尿酚 的第一牛尿酚組分和由S-牛尿酚和R-牛尿酚的外消旋混合物組成的第二牛尿酚組分混合 制成的。
[0025] 本發(fā)明還涉及食品組合物，其包含添加劑組分，所述添加劑組分選自S-牛尿酚， R-牛尿酚，以及S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
[0026] 優(yōu)選地，其中所述食品每份包括至少約lmg，至多約300mg的S-牛尿酷，更優(yōu)選至 少約10mg，至多約200mg的S-牛尿酷，并甚至更優(yōu)選至少約30mg，至多約50mg的S-牛尿 酚。
[0027] 本發(fā)明還涉及局部用于皮膚的組合物，其包含添加劑組分，所述添加劑組分選自 S-牛尿酷，R-牛尿酷，以及S-牛尿酚和R-牛尿酚的非外消旋混合物。
[0028] 優(yōu)選地，所述局部用于皮膚的組合物，優(yōu)選為油膏、液體或乳液的形式，所述組合 物包含S-牛尿酚和賦形劑，其中S-牛尿酚為所述組合物重量的至少0. 1 %，至多10 %。
[0029] 優(yōu)選地，其中所述S-牛尿酚在C-4'或C-7位置偶聯(lián)以形成選自下組的偶聯(lián)物：葡 糖苷酸、硫酸酯、乙酸酯、丙酸酯、葡糖苷、乙酰-葡糖苷、丙二酰-葡糖苷及其混合物。
[0030] 本發(fā)明還涉及將牛尿酚的外消旋混合物分離成第一和第二對(duì)映體的方法，包括以 下步驟：（1)提供包含牛尿酚的外消旋混合物的組合物；（2)提供包含手性相的HPLC柱； (3)使用流動(dòng)相，使一定量的所述組合物通過所述HPLC柱的入口，所述流動(dòng)相包含C3-C7烷 烴（alkyl)和C2-C4醇；(4)自通過步驟起第一段時(shí)間后，從HPLC柱出口收集包含第一對(duì) 映體的第一流出物；并（5)自通過步驟起第二段時(shí)間后，從柱出口收集包含第二對(duì)映體的 第二流出物。
[0031] 具體地，本發(fā)明涉及將牛尿酚的外消旋混合物分離成第一和第二對(duì)映體的方法， 包括以下步驟：
[0032] (1)提供包含牛尿酚的外消旋混合物的組合物；
[0033] (2)提供包含手性相硅石基質(zhì)的HPLC柱，優(yōu)選其中所述硅石基質(zhì)包含纖維素三 (3, 5-二甲基苯基氨基甲酸酯）和纖維素三（4-甲基苯甲酸酯）；
[0034] (3)使用流動(dòng)相，使一定量的所述組合物通過所述HPLC柱的入口，所述流動(dòng)相 包含C3-C7烷烴和C2-C4醇，優(yōu)選其中所述流動(dòng)相包含比例為95:5-5:95,甚至更優(yōu)選為 50:50-90:10的己烷：丙醇；
[0035] (4)自通過步驟起第一段時(shí)間后，從HPLC柱出口收集包含第一對(duì)映體的第一流出 物；以及
[0036] (5)自通過步驟起第二段時(shí)間后，從HPLC柱出口收集包含第二對(duì)映體的第二流出 物。
[0037] 本發(fā)明還涉及進(jìn)行研宄的方法，其中將異黃酮給藥人類受試者，并測定該受試者 的至少一種生理數(shù)據(jù)，其包含以下步驟：1)將一定劑量的異黃酮給藥至少選定受試組中一 個(gè)人類受試者2)檢測所述受試者的尿中牛尿酚的水平，和3)鑒定所述受試者為牛尿酚產(chǎn) 生者還是非-牛尿酚產(chǎn)生者。
[0038] 具體地，本發(fā)明涉及進(jìn)行研宄的方法，其中將異黃酮給藥人類受試者，并測定至少 一種生理數(shù)據(jù)，