一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽及其制法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 尿酸是人體嘌呤代謝的產(chǎn)物。正常狀態(tài)下，人體血尿酸含量為200~410 y mol/ L，女性普遍低于男性。人體尿酸水平的升高通常與人體嘌呤代謝異?；蚰I臟排泄異常息息 相關，國際上將男性血尿酸濃度超過420 y mol/L、女性超過357 y mol/L時定義為高尿酸血 癥。而高尿酸血癥往往會引起通風。痛風在公元前2640年即被埃及人定義，并于公元前 400年被記錄到希波克拉底的醫(yī)學著作中。如今，由于飲食結構和生活方式的改變，高尿酸 血癥及痛風患者也隨之增加，已成為現(xiàn)代社會常見的一種風濕性疾病。
[0003] 人們一般很少關注自已的血尿酸水平，往往是等到出現(xiàn)了痛風的癥狀才采取治 療。目前以消炎、鎮(zhèn)痛治療為主，如秋水仙堿及非留體抗炎藥物，持續(xù)用藥1到2周后能明顯 改善痛風癥狀。吲哚美辛也能夠治療急性痛風，而注射促腎上腺皮質激素具有更好的、更快 速的療效。別嘌呤醇是目前市面上唯一一款通過抑制黃嘌呤氧化酶活性而減少尿酸生成、 降低血尿酸濃度的藥物，其作用靶點明確，但起效慢，且在使用初期會加劇痛風癥狀。但無 論是消炎、鎮(zhèn)痛藥物，還是作用機理明確的別嘌呤醇藥物，在治療時往往會出現(xiàn)一定的毒副 作用，因此對于已患有痛風石的患者多采取手術剔除痛風石、矯正關節(jié)來進行治療。而在無 癥狀高尿酸血癥的治療中，醫(yī)生建議通過調整飲食結構或口服一些食源性的藥物來進行治 療，達到緩慢降低血尿酸水平的目的。
[0004] 蛋白質是我們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚臓I養(yǎng)元素，且在蛋白質中蘊含著很多的生物 活性物質一一生物活性肽，其中可能具有降血壓、降膽固醇、抗血栓、抗癌、抗氧化等生物活 性。但這些生物活性肽隱藏在蛋白質內(nèi)部或僅是蛋白質的某個基因片段，當人們攝食這些 蛋白質食物時，蛋白質進入人體胃和腸道中，這些生物活性肽也不能被胃和腸道中酶系作 用而完全釋放出來?，F(xiàn)代生物酶解技術是一種可高效釋放蛋白質內(nèi)部生物活性肽的方法， 該法主要是模仿人體內(nèi)消化系統(tǒng)的蛋白水解過程，且由于是在體外作用，其水解條件和蛋 白酶的種類和濃度均可調整，所以可高效獲取目標生物活性的生物活性肽。
[0005] 另外，美拉德反應是食品加工或儲存過程中常發(fā)生于還原糖與氨基酸、多肽、蛋白 質或任何含氮化合物之間的非酶褐變反應，其反應歷程較快，內(nèi)部的成分變化復雜，甚至會 生成某些具有較強生物活性的物質，如目前報道較多的是美拉德反應可以顯著增強蛋白肽 的抗氧化活性，因此，美拉德反應也是一種提升蛋白肽生物活性的有效的處理手段之一。
[0006] 秋刀魚屬于海洋中上層魚類，其肉含有豐富的蛋白質，但附加值較低，主要作為食 用或飼料，價格低廉。目前已有通過生物酶解制備抗氧化肽的研宄，仍未見利用秋刀魚來制 備降尿酸組分的研宄。如果以秋刀魚為原料制備出具有明顯降低尿酸的蛋白肽產(chǎn)品，不僅 可拓展秋刀魚的應用領域和提高其經(jīng)濟價值，更重要的可改善人們的生活質量，具有極大 的社會意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法， 該方法的創(chuàng)新點在于實現(xiàn)酶解與美拉德反應的連續(xù)作用，以及外加單體氨基酸作為酶解體 系的底物抑制劑來達到調節(jié)酶解進程的目的。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供由上述方法制得的具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德 肽。
[0009] 本發(fā)明的再一目的在于提供上述的秋刀魚美拉德肽的用途。
[0010] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：
[0011] 一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法，包括以下步驟：
[0012] (1)秋刀魚預處理：秋刀魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過絞肉機絞碎，加入秋刀魚碎 肉質量3~5倍的水，在40~50°C下加熱攪拌1~2小時，調節(jié)體系pH值至4. 2,繼續(xù)攪 拌加熱1~1. 5小時，離心分離，棄除上清液和上層油脂，取沉淀物；
[0013] (2)酶解-美拉德連續(xù)發(fā)應：往秋刀魚沉淀物中加入其質量1~1. 5倍的水，然后 加入蛋白酶和單體氨基酸，調節(jié)體系pH值至7. 0,在50~55°C下保溫水解6~9小時后， 加入還原糖，在100~121°C下加熱1. 0~2. 0小時，離心，取上清液，得到秋刀魚美拉德肽 液；將美拉德肽液真空濃縮、噴霧干燥，得到秋刀魚美拉德肽干粉；
[0014] 以秋刀魚沉淀物的質量為計算基準，蛋白酶的加入量占1. 5~3. 0%，單體氨基酸 的加入量占〇. 1~〇. 3%，還原糖的加入量占0. 5~2. 5% ;
[0015] 所述的調節(jié)體系pH值是用0. 5mol/L的NaOH溶液或HC1溶液調節(jié)；
[0016] 所述的離心是5000r/min離心15~20min ;
[0017] 步驟⑵所述的蛋白酶是商業(yè)用的堿性蛋白酶和風味蛋白酶，優(yōu)選諾維信公司的 喊性蛋白酶（Alcalase 2.4L)和風味蛋白酶（Flavourzyme 500MG);
[0018] 步驟（2)所述的單體氨基酸為酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸，優(yōu)選色氨酸；
[0019] 步驟（2)所述的還原糖為葡萄糖、木糖或核糖。
[0020] 由上述方法制得的秋刀魚美拉德肽可用于制備降尿酸藥物或保健品；使用時，所 述的秋刀魚美拉德肽可以與具有降尿酸作用的中草藥復配。
[0021] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：
[0022] (1)本發(fā)明結合生物酶解和美拉德反應技術來制備具有降尿酸作用的美拉德肽， 首先通過在酶解前期添加單體氨基酸，一方面可直接增加最終酶解產(chǎn)物中某些氨基酸的含 量，另一方面通過對酶解體系進行底物抑制，反向調控酶解進程，促成或抑制某些氨基酸的 生成，改變酶解產(chǎn)物的氨基酸組成，提高酶解產(chǎn)物的降尿酸活性或美拉德反應活性；然后在 酶解結束后直接添加還原糖實現(xiàn)酶解與美拉德反應的連續(xù)作用制備出美拉德肽，既簡化了 生產(chǎn)工藝流程，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，又使制得的目標美拉德肽的降尿酸作用顯著 增強，經(jīng)大鼠動物實驗表明采用本發(fā)明方法制備的降尿酸美拉德肽可顯著降低大鼠的血尿 酸水平，并對大鼠的腎臟功能具有一定程度的保護作用。
[0023] (2)本發(fā)明工藝操作簡單、生產(chǎn)成本低、沒有任何污染、所得美拉德肽的降尿酸活 性強。
【附圖說明】
[0024] 圖1是實施例2和對比例產(chǎn)品的尿酸峰色譜圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0026] 以下各實施例中，采用反相高效液相色譜法測定尿酸值的方法如下：
[0027] (1)溶液的配置
[0028] 0?2mol/L (pH 7. 5)磷酸緩沖液（PBS):準確稱取 30. 0838g Na2HP04 ? 12H20 和 2. 4962g NaH2P04 ? 2H20,用去離子水溶解，定容至500ml。
[0029] 黃嘌呤溶液：準確稱取6. 4mg黃嘌呤，先用1ml1M NaOH將其溶解，再加入100ml PBS，以1M HC1調節(jié)pH值至7. 5。
[0030] 黃嘌呤氧化酶：取120 y 1酶液，以PBS稀釋至8ml。
[0031] 尿酸標曲：準確稱取10mg尿酸，加入10ml水，再稀釋至0? 1~0? 9mg/ml。
[0032] 醋酸胺-冰醋酸：準確稱取醋酸胺3. 85g定容至1000ml，然后加入4ml冰醋酸。
[0033] (2)樣品預處理：
[0034] 將樣品稀釋至40mg/ml，在96孔酶標板中依次加入50 y 1樣品與50 y 1黃嘌呤，每 個樣品做3個平行，37°C保溫lOmin后加入150 y 1黃嘌呤氧化酶，37°C繼續(xù)保溫20min后 加入80 y 1 1M HC1終止反應，過0. 25 y m水性膜，待測。
[0035]色譜柱：ZorbaxEclipseXDB-C18 柱（5ym，4. 6 X 250mm,安捷倫），
[0036] 液相條件：洗脫液為10%甲醇+90%醋酸胺-冰醋酸溶液，進樣體積為20 y L，流 速lml/min，檢測波長為290nm，運行時間10min〇
[0037] (3)計算公式
[0038]
【主權項】
1. 一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 秋刀魚預處理：秋刀魚去頭、去內(nèi)臟，清洗干凈，過絞肉機絞碎，加入秋刀魚碎肉質 量3~5倍的水，在40~50°C下加熱攪拌1~2小時，調節(jié)體系pH值至4. 2,繼續(xù)攪拌加 熱1~1. 5小時，離心分離，棄除上清液和上層油脂，取沉淀物； (2) 酶解-美拉德連續(xù)發(fā)應：往秋刀魚沉淀物中加入其質量1~1. 5倍的水，然后加入 蛋白酶和單體氨基酸，調節(jié)體系pH值至7. 0,在50~55°C下保溫水解6~9小時后，加入 還原糖，在100~121°C下加熱I. 0~2. 0小時，離心，取上清液，得到秋刀魚美拉德肽液； 將肽液真空濃縮、噴霧干燥，得到秋刀魚美拉德肽干粉； 以秋刀魚沉淀物的質量為計算基準，蛋白酶的加入量占1. 5~3. 0%，單體氨基酸的加 入量占0. 1~0. 3%，還原糖的加入量占0. 5~2. 5% ; 步驟（2)所述的單體氨基酸為酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸； 步驟（2)所述的還原糖為葡萄糖、木糖或核糖。
2. 根據(jù)權利要求1所述的具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法，其特征在 于：步驟（2)所述的蛋白酶為堿性蛋白酶和風味蛋白酶。
3. 根據(jù)權利要求2所述的具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽的制備方法，其特征在 于：堿性蛋白酶為諾維信公司的Alcalase 2. 4L，風味蛋白酶為諾維信公司的Flavourzyme 500MG。
4. 一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽，其特征在于：是由權利要求1-3任一項所 述的方法制備得到。
5. 權利要求4所述的秋刀魚美拉德肽在制備降尿酸藥物或保健品中的應用。
6. 根據(jù)權利要求5所述的秋刀魚美拉德肽在制備降尿酸藥物或保健品中的應用，其特 征在于：所述的秋刀魚美拉德肽與具有降尿酸作用的中草藥復配。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有降尿酸活性的秋刀魚美拉德肽及其制備方法和應用，其制備方法包括以下步驟：將秋刀魚絞碎，加水加熱攪拌，調節(jié)pH值至4.2，離心分離，取沉淀；往沉淀物中加水、蛋白酶和單體氨基酸，調節(jié)pH值至7.0，水解后再加入還原糖反應，離心，取上清液即為秋刀魚美拉德肽液；將肽液噴霧干燥得到秋刀魚美拉德肽干粉。本發(fā)明方法實現(xiàn)了酶解與美拉德反應的連續(xù)作用制備出美拉德肽，簡化生產(chǎn)工藝流程，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，且制得的目標美拉德肽的降尿酸作用顯著，經(jīng)大鼠動物實驗表明采用本發(fā)明方法制備的降尿酸美拉德肽可顯著降低大鼠的血尿酸水平，并對大鼠的腎臟功能具有一定程度的保護作用。
【IPC分類】A61P19-06, A23J1-04, A61K38-02
【公開號】CN104664039
【申請?zhí)枴緾N201510094674
【發(fā)明人】趙謀明, 劉洋, 蘇國萬, 趙容鐘, 趙強忠, 林戀竹
【申請人】華南理工大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年3月3日