一種復合乳酸菌瘤胃調(diào)控劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術領域，特別涉及一種復合乳酸菌瘤胃調(diào)控劑及其制備 方法。
【背景技術】
[0002] 養(yǎng)好反芻動物的關鍵在于養(yǎng)好瘤胃中的微生物，研宄證實，奶牛瘤胃內(nèi)微生物，與 奶牛的生長存在密切關系：奶牛采食后，飼料降解成小分子，經(jīng)血液吸收，送到各組織、器官 利用。奶牛瘤胃類似于一個龐大的發(fā)酵罐，瘤胃內(nèi)有數(shù)以億計的厭氧微生物_細菌和原蟲， 所以只有具備良好瘤胃功能的奶牛，才能最大限度地發(fā)揮其生產(chǎn)性能。通過向瘤胃內(nèi)提供 活性物質，從而激活瘤胃微生物的生長與代謝，可達到調(diào)控瘤胃功能的目的。
[0003] 微生態(tài)制劑，是指在微生態(tài)學理論的指導下，調(diào)整微生態(tài)平衡失調(diào)，保持微生態(tài)平 衡，提高宿主健康水平的正常菌群及其代謝產(chǎn)物和選擇性促進宿主正常菌群生長的物質制 劑總稱。主要包括乳酸菌類制劑、酵母菌類制劑及其復合微生態(tài)制劑。這些微生態(tài)制劑可 以調(diào)節(jié)動物腸道微生態(tài)平衡，提高動物生長率，提高飼料利用率，促進動物對鈣、鎂、鐵的 吸收；抑制腸道有害微生物的繁殖，提高動物健康水平，增強動物免疫力；無毒副作用，無 耐藥性，無病原性，被視為綠色飼料添加劑之一。
[0004] 乳酸菌（lacticacidbacteria，LAB)由一組形態(tài)、代謝和生理特性相同的細菌 組成，大多為革蘭氏陽性、無芽孢的球菌或桿菌，并且這群菌能在可利用的碳水化合物發(fā)酵 過程中產(chǎn)生大量的乳酸菌多為厭氧菌，以無氧呼吸為主，部分菌種可進行有氧呼吸，常用于 食品和飼料發(fā)酵劑的乳酸菌主要集中于乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、腸球菌屬里的幾十 種。
[0005] 乳酸菌代謝物是乳酸菌在繁殖過程中產(chǎn)生一些胞外代謝產(chǎn)物，主要是乳酸、乙酸、 丙酸、乳酸菌肽、乳酸菌素、多種維生素和促生長因子，其中乳酸、乙酸、丙酸具有較強的抑 菌活性和較寬的抑菌范圍，可抑制酵母菌、真菌、細菌及其它一些有害微生物的生長和發(fā) 育，調(diào)整腸道菌群，增強機體抗病能力。乳酸菌代謝產(chǎn)物具有良好的熱穩(wěn)定性及較好的抗蛋 白酶活性和抗過氧化氫酶活性，并且PH值越低，其抑菌能力越強。
[0006] 復合乳酸菌代謝物制備工藝：本發(fā)明主要利用不同種屬乳酸菌產(chǎn)生的代謝物對 有害菌的抑制功能，以實驗室篩選得到的產(chǎn)酸能力較強的植物乳桿菌、產(chǎn)乳酸菌素能力較 強的乳酸乳球菌和產(chǎn)肽聚糖能力較強的糞腸球菌為發(fā)酵菌株，采用高密度工業(yè)發(fā)酵技術， 得到高密度的乳酸菌發(fā)酵液，通過調(diào)整發(fā)酵條件使其能夠更大程度上發(fā)揮其產(chǎn)酸的能力、 產(chǎn)乳酸菌素能力和產(chǎn)肽聚糖的能力，提高產(chǎn)品有效組分的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為解決上述現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種微生態(tài)飼料添加劑 及其制備方法。
[0008] 為達到上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案是：一種復合乳酸菌瘤胃調(diào)控劑，由植 物乳桿菌代謝物及滅活的植物乳桿菌、乳酸乳球菌代謝物及滅活的乳酸菌、糞腸球菌代謝 物及滅活的糞腸球菌組成，所述的植物乳桿菌代謝物及其滅活的植物乳桿菌、乳酸乳球菌 代謝物及其滅活的乳酸乳球菌和糞腸球菌代謝物及其滅活的糞腸球菌的質量比為1:1: 1、 1:2:1 或 1:1:2〇
[0009] 所述的植物乳桿菌代謝物、乳酸乳球菌代謝物或糞腸球菌代謝物優(yōu)選采用如下方 法進行前處理：將植物乳桿菌代謝物、乳酸乳球菌代謝物或糞腸球菌代謝物進行噴霧干燥 處理。
[0010] 所述的復合乳酸菌瘤胃調(diào)控劑的制備方法，包括如下步驟：
[0011] 步驟一、植物乳桿菌代謝物的制備：（1)將植物乳桿菌菌種接種到MRS斜面培養(yǎng)基 中，35~37°C靜止培養(yǎng)24小時得到復活的植物乳桿菌菌種；（2)將復活的植物乳桿菌接種 至液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得一級種子液；（3)將一級種子液以2~8%的量接種至優(yōu)化后 的培養(yǎng)基中，33~37°C發(fā)酵12~24h，得到二級種子液；(4)液體厭氧發(fā)酵：將二級種子液 以5~10%的接種量接種至液體厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，30~33°C厭氧發(fā)酵16~24h，得厭氧 發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)噴霧干燥處理，得到植物乳桿菌代謝物；
[0012] 步驟二、乳酸乳球菌代謝物的制備：（1)將乳酸乳球菌接種到MRS斜面培養(yǎng)基中， 37°C靜止培養(yǎng)24小時，得到復活的乳酸乳球菌菌種；（2)將復活的乳酸乳球菌接種至液體 MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得一級種子液；(3)將一級種子液以2~4%的量接種至優(yōu)化后的培養(yǎng) 基進行發(fā)酵，得到發(fā)酵后的菌體；(4)將發(fā)酵后的菌體以5~10%接種至乳酸乳球菌液體厭 氧培養(yǎng)基中，28~30°C厭氧發(fā)酵24~36h，得厭氧發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)噴霧干燥處理，得到乳酸乳 球菌代謝物；
[0013] 步驟三、糞腸球菌代謝物的制備：（1)將糞腸球菌接種到MRS斜面培養(yǎng)基中，37°C 靜止培養(yǎng)24小時，得到復活的糞腸球菌菌種；（2)將復活的糞腸球菌接種至液體MRS培養(yǎng) 基中，得一級種子液；（3)將一級種子液以1~3%的量接種至優(yōu)化后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到 二級種子液；(4)將二級種子液以6~8%的接種量接種至液體厭氧培養(yǎng)基中，35~37°C厭 氧發(fā)酵16~36h，得厭氧發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)噴霧干燥處理，得到糞腸球菌代謝物；
[0014] 步驟四、復合乳酸菌瘤胃調(diào)控劑的制備：將步驟一的植物乳桿菌代謝物及其滅活 的植物乳桿菌、步驟二的乳酸乳球菌代謝物及其滅活的乳酸乳球菌和步驟三的糞腸球菌代 謝物及其滅活的糞腸球菌按質量比I:I:I、1:2:1或1:1:2混合均勻，得到復合乳酸菌瘤胃 調(diào)控劑。
[0015] 步驟一中：
[0016] 所述的液體厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基由如下按質量分數(shù)計的成分組成：甜菜糖蜜5~ 10%、玉米漿5~10%、磷酸二氫鈉0? 05~0? 15%、無水乙酸鈉0? 5~1 %、硫酸鎂0? 01~ 0. 15%、硫酸錳0.01~0. 15%、吐溫800. 2~0.5%、余量為水，并調(diào)節(jié)pH為5.0~6.0。
[0017] 所述的優(yōu)化后的培養(yǎng)基由如下成分組成：蛋白胨30g、酵母粉10g、葡糖糖30g、無 水乙酸鈉 15g、檸檬酸氫二銨 5g、吐溫 804g、K2HP042g、MgSO4 ? 7H200. 2g、MnSO4.H2O0? 07g、 蒸餾水1L。
[0018] 步驟二中：
[0019] 所述的乳酸乳球菌液體厭氧培養(yǎng)基由如下按質量分數(shù)計的成分組成：甘蔗糖 蜜2 %~5 %、玉米漿5~10 %、氯化鈉0? 1 %~0? 2 %、硫酸鎂0? 01 %~0? 05 %、硫酸錳 0? 0025~0? 005%、吐溫800.I%~0? 3%、余量為水，并調(diào)節(jié)pH為6. 5~7. 0。
[0020] 所述的優(yōu)化后的培養(yǎng)基由如下成分組成：葡糖糖l〇g、甘蔗糖蜜50g、豆柏49. 16g、 Na2HP044g、（NH4)2S043. 77g、無水乙酸鈉lg、檸檬酸氫二銨 0? 5g、MgS04.7H20 0? 4g、MnS04.H20 0. 025g、吐溫801g、蒸餾水1L。
[0021] 步驟三中：
[0022] 所述的液體厭氧培養(yǎng)基由如下按質量分數(shù)計的成分組成：甘蔗糖蜜5~10%、玉 米漿2~4%、磷酸二氫鈉0? 1~0? 2%、無水乙酸鈉0? 2~0? 5%、硫酸錳0? 01~0? 02%、 硫酸鎂〇. 02~0. 04%、吐溫800. 05~0. 1 %、余量為水，并調(diào)節(jié)pH為6. 0~7. 0。
[0023] 所述的優(yōu)化后的培養(yǎng)基由如下成分組成：葡糖糖20g、玉米漿60g、無水乙酸鈉5g、 檸檬酸氫二銨 6g、NaH2P043g、吐溫 801g、MgSO4 ? 7H20 0? 2g、MnSO4 ?H2O0? 05g、蒸餾水 1L。
[0024] 步驟一中的液體厭氧發(fā)酵過程中采用適合植物乳桿菌代謝的應激條件，但要同時 確保植物乳桿菌的活性，使其在應激條件下產(chǎn)生特定的抗應激代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)基的PH控制 在5. 0~6. 0,溫度控制在30~33°C，接種量控制在5~10%，培養(yǎng)時間控制在20~36h。
[0025] 步驟二中的乳酸乳球菌厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基的pH控制在6. 5~7. 0,溫度控制在28~ 30°C，接種量為5~10%。
[0026] 步驟三中的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基的pH控制在6.0~7. 0,溫度控制在35~37 °C，接種 量為6~8 %。
[0027] 相對于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的有益效果為：
[0028] (1)國內(nèi)目前尚無復合的乳酸菌應用于反芻動物瘤胃調(diào)控的瘤胃調(diào)控劑，本發(fā)明 以三株產(chǎn)主要產(chǎn)物不同菌株的代謝物進行復合，可以改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，是安全、無毒副作 用、無污染的瘤胃調(diào)控劑。
[0029] (2)本發(fā)明采用單一菌種工業(yè)發(fā)酵技術通過不同的條件刺激產(chǎn)生特定的抗應激代 謝物，便于實現(xiàn)工藝穩(wěn)定、產(chǎn)品穩(wěn)定，而且有效解決了活菌制劑和酶制劑容易失活及抗生素 類物質帶來的負面影響；采用多個單菌種發(fā)酵代謝物組復配技術，進一步拓寬產(chǎn)品的功能 性，解決了單一菌株功能的局限性問題。
[0030] (3)本發(fā)明的復合乳酸菌瘤胃調(diào)控劑品質優(yōu)良，穩(wěn)定性好，經(jīng)瘤胃體外批次培養(yǎng)證 明其功效性強，作為營養(yǎng)均衡的復合乳酸菌瘤胃調(diào)控劑，可提高瘤胃中揮發(fā)性脂肪酸的含 量、菌體蛋白含量。復合乳酸菌瘤胃調(diào)控劑不是活菌制劑，而是經(jīng)厭氧發(fā)酵后由活菌產(chǎn)生的 抗特定性應激的代謝產(chǎn)物，易儲存不會隨保存時間的延長活性降低，確保了產(chǎn)品有效成分 的含量。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明：
[0032] 實施例1
[0033] -種復合乳酸菌瘤胃調(diào)控劑的制備方法，包括如下步驟：
[0034] 步驟一、植物乳桿菌代謝物的制備：（1)將植物乳桿菌菌種接種到MRS斜面培養(yǎng) 基中，35°C靜止培養(yǎng)24小時得到復活的植物乳桿菌菌種；（2)將復活的植物乳桿菌接種至 液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得一級種子液；(3)將一級種子液以2%的量接種至優(yōu)化后的培