酶復合物在養(yǎng)殖型動物的飼料中的用圖
【專利說明】酶復合物在養(yǎng)殖型動物的飼料中的用途
[0001] 本發(fā)明的技術領域屬于動物營養(yǎng)領域。
[0002] 已知弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae)菌株可以產(chǎn)生至少五種類型的稱為 Ia、Ib、II、III、IV的蛋白酶和兩種肽酶（專利GB 1133579)。
[0003] 在其專利申請WO 87/07905中，申請人描述了用于獲得專一地由II、III和IV型 蛋白酶（其中Π 型蛋白酶占優(yōu)勢）組成的蛋白水解復合物的方法。該復合物是從WAKSMN 3535類型的弗氏鏈霉菌菌株開始通過下述過程而獲得的：發(fā)酵，通過過濾來提取復合物， 然后在具有相應于2, 000至12, 000的分子量的截止閾值的膜上進行超濾，和最后粉化。如 此獲得的以粉末形式的復合物具有至少2, 000安森單位（Anson unit)/mg蛋白質的滴度。
[0004] 在該申請中，II型蛋白酶以接近18kDa的分子量和接近9. 0的等電點為特征。
[0005] 在動物飼料中所使用的該復合物允許動物有效地同化富含粗蛋白質的食物并因 此刺激其生長。此外，在妊娠母豬中所使用的該復合物使得能夠獲得在出生時豬崽體重的 增加，伴隨有飼料消耗的減少和健康狀況的改善。
[0006] 然而，該方法并不能使得能夠有效地去除污染性的副產(chǎn)物。
[0007] 在專利申請WO 97/37681中，提供了改進，其使得能夠將滴度為至少4, 000安森單 位/mg蛋白質的產(chǎn)品用于治療性應用。因此，占優(yōu)勢的蛋白酶具有大于100, 000安森單位 /mg蛋白質的比活性，具有30至36kDa的分子量和接近7. 0的等電點。
[0008] 后來進行的分析顯示，所述蛋白酶的分子量為18_20kDa。
[0009] 所描述的治療性應用主要在于：減少對于某些疾病來說特征性的粘液分泌過多的 正面作用；腸吸收和血液循環(huán)的改善；還有針對感染性疾病的對抗。此外，所述組合物被描 述為有利于腸粘膜的經(jīng)萎縮的或被破壞的絨毛的再生。
[0010] 鑒于從弗氏鏈霉菌的培養(yǎng)物中提取的酶復合物的重大的治療特性，重要的是使用 更加完全地擺脫了可能影響其活性的生物學雜質的酶復合物。
[0011] 因此，本發(fā)明旨在提供上面所描述的酶復合物的改善，以尤其是有利于在工業(yè)養(yǎng) 殖背景下的良好的養(yǎng)殖條件和動物健康。
[0012] 因此，本發(fā)明的目標在于通過培養(yǎng)弗氏鏈霉菌菌株而獲得的包含蛋白酶混合物的 酶復合物用于對養(yǎng)殖型動物的飼料進行補充的用途，其特征在于，在所述混合物的這些蛋 白酶之中，一種蛋白酶具有7. 0左右的等電點，和另一種蛋白酶具有8. 0左右的等電點。
[0013] 所述復合物占非常多數(shù)地包含這兩種類型的蛋白酶，即這兩種蛋白酶的比例超過 所述混合物的活性的80%。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一個特征，等電點為7.0左右的蛋白酶具有大約150, 000安森單位 /mg蛋白質的比活性。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個特征，等電點為8. 0左右的蛋白酶具有大約38, 000安森單位/ mg蛋白質的比活性。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，將所述酶復合物作為飼料補充物用于改善工業(yè)養(yǎng)殖型 動物的總體狀況，所述飼料補充物以粉末、液體或任何其他適合于與飼料組合物相混合的 形式存在。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一個特征，在旋轉式滾筒中將以粉末形式的酶復合物與飼料組合物 進行干法混合直至均勻。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，在流化床中將以液體形式的酶復合物噴霧在飼料組合 物上，然后?；?。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一個特征，在家禽的飼料中使用所述酶復合物。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，在豬的飼料中使用所述酶復合物。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一個特征，在魚的飼料中使用所述酶復合物。
[0022] 本發(fā)明的目標還在于用于養(yǎng)殖型動物的飼料組合物，其包含本發(fā)明的酶復合物， 和任選地，具有營養(yǎng)目的的賦形劑或載體，或其他添加劑。
[0023] 最后，本發(fā)明的目標在于用于制備根據(jù)本發(fā)明的酶復合物的方法，其特征在于，培 養(yǎng)弗氏鏈霉菌菌株，過濾發(fā)酵液，然后著手進行通過超濾和離子交換色譜法以及隨后的等 電聚焦來提取酶復合物，和最后將所獲得的復合物凍干。
[0024] 該發(fā)明使得能夠提供其特征受到嚴格限定的飼料補充物。
[0025] 本發(fā)明首先使得能夠精確地調整待施用到飼料組合物中的劑量，以便獲得所希望 的治療效果。
[0026] 本發(fā)明還具有在工業(yè)養(yǎng)殖中改善動物的健康狀況的優(yōu)點。
[0027] 此外，本發(fā)明還提供了在工業(yè)養(yǎng)殖中動物的總體狀況的改善，這提高了經(jīng)營的贏 利性。
[0028] 本發(fā)明還允許動物生長的增加，同時引起飼料消耗的下降。
[0029] 通過與圖解說明了腸絨毛的圖片相關聯(lián)地閱讀下面的對于作為實例而給出的實 施方案進行的補充描述，將會更好地理解本發(fā)明的其他特征、細節(jié)和優(yōu)點。
[0030] 已知以名稱 Panstimase# (PANcreatic STIMulating diastASE)進行銷售的 酶混合物是來自弗氏鏈霉菌發(fā)酵的酶復合物。該復合物被描述為占多數(shù)地包含三種蛋白 酶，其中的一些特異地作用于硬化蛋白（膠原、彈性蛋白、角蛋白），但也作用于由霍亂弧菌 或某些大腸桿菌（Escherichia coli)致病菌株所釋放的蛋白質性質的某些毒素。
[0031] 在畜牧學領域中，重要的是擁有在技術上明確的、十分恒定的且其特性因此清楚 地確定的產(chǎn)品。
[0032] 為了獲得根據(jù)本發(fā)明的酶復合物，培養(yǎng)弗氏鏈霉菌菌株并過濾發(fā)酵液。然后，著手 進行通過超濾、離子交換色譜法和等電聚焦來提取和表征酶復合物。最后，著手進行將所獲 得的復合物凍干。
[0033] 對于弗氏鏈霉菌菌株的培養(yǎng)，使用例如WAKSMAN 3535類型的菌株，并且所述菌株 可以是在遺傳上經(jīng)改進的，以便尤其是獲得蛋白水解活性的增加或任何抗生素分泌的取 消。
[0034] 在工業(yè)生產(chǎn)型發(fā)酵罐中在合適的培養(yǎng)基中進行所述培養(yǎng)。該培養(yǎng)基可以例如基 于：15g/l大豆磨粉；30g/l葡萄糖；lg/Ι磷酸氫二鉀；10g/l碳酸鈣。
[0035] 所述反應在7. 0至7. 5的pH下，在大約28°C的發(fā)酵溫度下，以0. 3體積的無菌空 氣/培養(yǎng)基體積/分鐘的通氣來進行。
[0036] -旦培養(yǎng)結束，就通過在澄清劑存在下過濾發(fā)酵液來去除菌絲體。
[0037] 酶復合物的提取需要使用幾項技術，包括超濾、離子交換色譜法和等電聚焦。
[0038] 軺濾
[0039] 濾液的超濾借助于具有50kDa的截止閾值的膜來進行。
[0040] 在3小時的過濾后，所收集的濾液（起始體積的71 % )具有通過明膠薄膜測試而 揭示的蛋白水解活性。該測試在于用銀進行染色且放置在固體支持物上的明膠薄膜的降 解。
[0041] 離子奪換色譜法
[0042] 采用使用具有合適尺寸的Cellufine C-500羧甲基凝膠柱（Amicon)來進行的陽 離子交換色譜法。
[0043] 色譜法緩沖液為pH 5. 5的IOmM檸檬酸鹽緩沖液，并且洗脫通過0至1.0 M的NaCl 梯度來進行。洗脫流速根據(jù)柱的大小來調整，例如對于直徑為2. 5cm且高度為27cm的柱子， 它為10至15ml/分鐘。
[0044] 等電聚隹
[0045] 在Phast-system上，對于從3至9的pH，用Pharmacia公司的即用型凝膠來進行 分析型等電聚焦。用考馬斯藍來進行揭示。
[0046] 在固體介質中的制備型等電聚焦的情況下，將酶溶液逆蒸餾水（95ml)進行透析， 并且與5ml的具有4. 7g Ultrodex凝膠和0. 5g甘氨酸的3-9的兩性電解質相混合。將凝 膠在40°C下干燥6小時。在3W的恒定功率下，在整夜或等價的時間段期間進行迀移。用考 馬斯藍來進行揭示。
[0047] 取出各種不同的凝膠條帶，用3ml水進行漂洗，過濾，然后用3ml Tris-HCl緩沖液 進行漂洗。
[0048] 然后，就其蛋白水解活性容量和其蛋白質含量來對如此獲得的級分進行分析。然 后，將樣品逆0.3M Tris-HCKpH 8.0)緩沖液進行透析。
[0049] 在液體介質中的制備型等電聚焦的情況下，將逆蒸餾水進行透析的酶溶液與兩性 電解質（3.5ml)相混合。迀移在8W的恒定功率下進行4小時。
[0050] 對所取得的級分進行分析，然后將其逆0. 3M Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液進行透析。
[0051] 上面所指出的實驗條件將可根據(jù)希望獲得的產(chǎn)品的量和在工業(yè)條件下的使用來 進行調整。
[0052] 因此，在所述混合物中獲得：占多數(shù)的具有7.0左右的等電點（pi)的蛋白酶，和以 較少比例，具有8.0左右的pi的蛋白酶。
[0053] 在9ml的體積中獲得占多數(shù)的pi為大約7. 0的蛋白酶，其中具有0. 49mg/ml的蛋 白質濃度。由于該蛋白酶在其等電點處沉淀，因而關于純化的特別預防措施可能是必需的。 所獲得的溶液具有75, 000A. U. /ml左右的滴度。
[0054] 在均質化后，以4mg的規(guī)模