一種具有高存活率的耐胃酸型地衣芽孢桿菌微膠囊的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及益生菌微膠囊制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞桿菌微膠囊的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)是一種芽孢桿菌科細(xì)菌，為革蘭氏陽性桿菌。地衣芽孢桿菌能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物菌群之間、微生物菌群與宿主之間的微生態(tài)平衡。腸道微生態(tài)功能紊亂所導(dǎo)致的疾病，如細(xì)菌或病毒性腹瀉、急慢性腸炎，可以通過服用地衣芽孢桿菌制劑來調(diào)整腸道菌群失調(diào)，達(dá)到治療并恢復(fù)腸道功能的目的；同時，地衣芽孢桿菌可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，以殺滅致病菌。此外，地衣芽孢桿菌在機(jī)體內(nèi)能產(chǎn)生抗活性物質(zhì)，具有獨(dú)特的生物奪氧作用機(jī)制，能抑制致病菌的生長繁殖。故地衣芽胞桿菌在臨床醫(yī)學(xué)上屬于安全性的有益微生物，在保健食品中屬于益生菌。
[0003]益生菌是指定植于人體生殖系統(tǒng)和腸道內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效以改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性微生物的總稱。益生菌能夠產(chǎn)生多種健康功效，如可以改善產(chǎn)品風(fēng)味、降低膽固醇濃度、調(diào)節(jié)并維持腸道微生態(tài)平衡、抗癌抗腫瘤效應(yīng)、提高乳糖利用率，因而益生菌在保健和醫(yī)療等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用開發(fā)潛力。然而，益生菌制劑在生產(chǎn)、保藏及給藥過程中，會受到一系列因素的影響，外界因素如溫度、濕度等，體內(nèi)因素如胃酸、消化酶類等，導(dǎo)致到達(dá)腸道部位的活菌數(shù)量大大減少，限制了益生菌功效的發(fā)揮。因此，將益生菌包埋在合適的載體中，如微膠囊內(nèi)，可以降低不良因素的影響，從而提高益生菌腸道定植的存活率。
[0004]自然界中的天然多糖類高分子及其衍生物，具有良好的生物學(xué)性能如無毒、親水溶脹性、生物相容性、生物可降解性；同時，具有聚電解質(zhì)特性，即溶于水后能產(chǎn)生聚陽離子或聚陰離子基團(tuán)，因而是制備聚合電解質(zhì)微膠囊的優(yōu)選材料。天然多糖類高分子，如氯化殼聚糖，其具備殼聚糖的優(yōu)良特性，且能夠直接溶于水(中性PH環(huán)境中)；同時，作為聚陽離子電解質(zhì)，氯化殼聚糖能夠與聚陰離子電解質(zhì)反應(yīng)形成聚合電解質(zhì)復(fù)合物薄膜。常用的聚陰離子電解質(zhì)，如海藻酸鈉、纖維素硫酸鈉，皆具有可成膜性、生物相容性、生物可降解性等優(yōu)良性能。通過帶有相反電荷的多糖類聚電解質(zhì)之間、或聚電解質(zhì)與小分子交聯(lián)劑之間的相互反應(yīng)，形成聚合電解質(zhì)膜用以設(shè)計益生菌微載體，如殼聚糖-海藻酸微膠囊、海藻酸鈣凝膠微球等，已有較多的研宄報道，但依然存在很多不足，如:耐胃酸性能差、存活率低?？朔祟悊栴}的主要途徑:一是提高益生菌菌株的抗逆性；二是選擇合適的載體材料以提高載菌微膠囊的環(huán)境耐受性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開一種具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞桿菌微膠囊的制備方法，旨在提高地衣芽胞桿菌的抗逆性、環(huán)境耐受性，大幅提高活菌通過胃部后的存活率，在載體保護(hù)下使大量活菌在腸道部位釋放并定植，達(dá)到益生保健功效。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。
[0007]本發(fā)明具有高存活率的耐胃酸型地衣芽孢桿菌微膠囊的制備方法，其特點(diǎn)在于，包括以下步驟:
[0008](I)菌株活化:將地衣芽孢桿菌菌液接種于pH = 6.4-7.5的液體培養(yǎng)基中，在35-400C、160-280rpm條件下培養(yǎng)10_18h，進(jìn)行菌種活化，得到活化種子液；
[0009](2)擴(kuò)大培養(yǎng):將所述活化種子液按2-7 %的接種量接種于裝有pH = 6.4-7.5的新鮮液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在35-40°C、160-280rpm條件下培養(yǎng)2_6h，得到地衣芽孢桿菌培養(yǎng)物；
[0010](3)菌懸液制備:將所述地衣芽孢桿菌培養(yǎng)物于4°c、3000-8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10-40min，去除上清液，獲得沉淀菌體；
[0011]按體積比1:4-8向所述沉淀菌體中加入無菌水、振蕩混均，再于4 °C、3000-8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10_40min，去除上清液，反復(fù)洗滌2_3次，最后用無菌水懸浮菌體，得到活菌數(shù)多109cfu/mL的地衣芽孢桿菌菌懸液；
[0012](4)內(nèi)水相菌體懸浮液制備:將所述地衣芽孢桿菌菌懸液加入到經(jīng)無菌處理的聚陰離子電解質(zhì)溶液中，無菌條件下振蕩混均，得到內(nèi)水相菌體懸浮液，在所述內(nèi)水相菌體懸浮液中聚陰離子電解質(zhì)濃度為0.01-0.04g/mL ；
[0013](5)外水相A液、外水相B液制備:配制經(jīng)無菌處理的濃度為0.04-0.lg/mL的小分子溶液作為外水相A液備用；配制經(jīng)無菌處理的濃度為0.005-0.03g/mL的聚陽離子電解質(zhì)溶液作為外水相B液備用；
[0014](6)地衣芽孢桿菌濕微膠囊的制備:將l_5mL的內(nèi)水相菌體懸浮液以450-850 μ L.rnirT1的流速注入到15_60mL外水相A液中，在200_500rpm轉(zhuǎn)速下保持外水相的低速流動，經(jīng)室溫固化反應(yīng)5-35min后，收集載菌微膠囊，用無菌水洗滌后緩慢加入到15-60mL外水相B液中，在200_500rpm轉(zhuǎn)速下保持外水相的低速流動，室溫包衣反應(yīng)
5-35min后，收集產(chǎn)物并用無菌水均勻洗滌，得到耐胃酸型地衣芽孢桿菌濕微膠囊；
[0015](7)干燥保藏:將所述耐胃酸型地衣芽孢桿菌濕微膠囊低溫真空干燥后，在無菌條件下進(jìn)行真空包裝，即得到干燥的耐胃酸型地衣芽孢桿菌微膠囊。
[0016]本發(fā)明所述地衣芽胞桿菌微膠囊的制備方法，其特點(diǎn)也在于:
[0017]步驟(7)中所述的低溫真空干燥為45°C以下的任何一種干燥方式。
[0018]步驟(I)中所述的地衣芽孢桿菌菌株為野生型地衣芽胞桿菌、基因工程型地衣芽胞桿菌中的一種或兩種。
[0019]步驟(I)和步驟⑵中所述的液體培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基或大豆豆柏上清液體培養(yǎng)基。其中大豆豆柏上清液體培養(yǎng)基是按如下步驟配制:將大豆豆柏過80目篩，在pH = 8.5的堿性條件下以0.lg/mL的濃度溶解在水中，6000rpm離心15min，取上清液，調(diào)PH至6.4-7.5，即得大豆豆柏上清培養(yǎng)基。
[0020]步驟(4)和步驟(5)中所述的無菌處理方法為過濾除菌或高溫滅菌。
[0021]步驟⑷中所述的聚陰離子電解質(zhì)溶液為海藻酸鈉溶液；步驟(5)中所述的聚陽離子電解質(zhì)溶液為氯化殼聚糖溶液。
[0022]步驟(5)中所述的小分子溶液為氯化鈣溶液、氯化鋇溶液或氯化鐵溶液；
[0023]步驟(3)和步驟(6)中所述的無菌水為蒸餾水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液。
[0024]本發(fā)明中微膠囊的雙重耐胃酸性原理是:作為聚陰離子的高分子聚電解質(zhì)如海藻酸鈉，其溶于水后質(zhì)子化使分子鏈上形成大量的-COO_基團(tuán)，經(jīng)小分子交聯(lián)劑如Ca 2+交聯(lián)固化后形成海藻酸鈣凝膠微球，在酸性條件下，微球中的海藻酸形成難溶性凝膠骨架，從而形成“內(nèi)核”耐酸性屏障，對負(fù)載益生菌起到第一重保護(hù)功效；而作為聚陽離子的高分子聚電解質(zhì)如氯化殼聚糖，其溶于水后質(zhì)子化使分子鏈上形成大量的-NH3+基團(tuán)，當(dāng)載有益生菌的海藻酸鈣凝膠微球進(jìn)入氯化殼聚糖溶液中以后，微球表面海藻酸分子的-COO—基團(tuán)立刻與氯化殼聚糖分子的-NH3+基團(tuán)發(fā)生離子反應(yīng)，通過靜電相互作用形成聚合電解質(zhì)復(fù)合物薄膜，該薄膜在酸性條件下難溶于水，從而形成“外殼”耐酸性屏障，對負(fù)載益生菌起到第二重保護(hù)功效。因此，在“內(nèi)核”與“外殼”雙重屏障的保護(hù)下，被負(fù)載益生菌能夠免受胃液破壞，在腸道部位堿性環(huán)境中溶解，實現(xiàn)益生菌的釋放與定植。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:在地衣芽孢桿菌菌株擴(kuò)大培養(yǎng)時采用優(yōu)化的培養(yǎng)條件，包括溫度、PH、時間和培養(yǎng)基，特別是培養(yǎng)基的優(yōu)化，使地衣芽孢桿菌細(xì)胞能夠大量繁殖；制備的微膠囊內(nèi)部呈蜂窩狀結(jié)構(gòu)、地衣芽孢桿菌細(xì)胞被鑲嵌其內(nèi)，外部呈殼狀結(jié)構(gòu)，起到進(jìn)一步的包覆與隔離作用；結(jié)合真空包裝，能夠使地衣芽孢桿菌細(xì)胞處于良好的休眠環(huán)境中。通過提高地衣芽孢桿菌的抗逆性、環(huán)境耐受性，大幅降低活菌通過胃部后的死亡率，在載體保護(hù)下使大量活菌在腸道部位釋放并定植，起到益生保健功效。本發(fā)明的菌株為地衣