,Ithaca,NY!Agricultural Experiment Station Chemical Laboratories，University of Missouri，Columbia，M0;表9)。所述五個飲食處 理組為對照組(飲食組I )、以及包含25 %DGM(飲食組2和3)或者11.7 %FD(飲食組4和5)的飲 食組，分別不含(-)或者含有(+ )蛋白酶酶補(bǔ)充劑(表10)?；谝延械男畔⑺酗嬍撑渲?成等熱量和等氮，以滿足NRC(1994)關(guān)于蛋雞的建議。然而，為了避免高基線水平飲食蛋白 質(zhì)和氨基酸對藻類添加潛在的負(fù)面效應(yīng)產(chǎn)生可能的屏蔽作用，特地用14%的粗蛋白（"CP"） 配制實驗飲食以確保母雞所需要的所有可用的飲食蛋白。蛋白酶添加的速率是生產(chǎn)商建議 水平的3倍(飲食組3和5，15，000PR0T/kg)。以PROT單位測定酶活性，其中1個單位定義成在 pH 9.0和37°C條件下每分鐘從ΙμΜ底物(Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-對硝基苯胺)釋放Ιμπιο?對 硝基苯胺的酶的量。每種飲食飼喂給5個重復(fù)組，每個重復(fù)組由6只單獨(dú)籠養(yǎng)的雞構(gòu)成。
[0156]表9.實驗中使用的兩種藻類產(chǎn)品的近似分析和氨基酸譜*
[0159] *以原樣為基礎(chǔ)。
[0160]表10.實驗飲食的組成和營養(yǎng)價值
[0161]
[0163] 1預(yù)混合物提供以下水平（以每千克飲食計算）的維生素和礦物質(zhì)：維生素 A，6， 500IU;維生素 D，3，500IU;維生素 E，25IU，亞硫酸氫鈉甲萘醌，5mg;核黃素，25mg; d-鈣泛酸， 25mg;煙酸，150mg;維生素 B12(以0 · 1 %溶于甘露醇中），IImg;生物素，Img;葉酸，2 · 5mg;硫胺 素 -HCl，7mg;吡哆醇-HCl，25mg; CuSO4· 5H2〇，31 · 4mg;KI，46yg;MnSO4 · H2O，61 · 5mg;Na2SeO3， 0 · 13mg; ZnO，43 · 5mg; Na2Mo〇4 · H2O，I · 3mg。
[0164] "RONOZYM以 ProAct L(DSM，Bagavaerd，丹麥）；75,000PR0T/g。以3倍于200mg/ kg飼料的建議加入量加入。
[0165] 蛋雞的體重每兩周記錄一次。每天收集雞蛋并且在母雞日產(chǎn)蛋量的基礎(chǔ)上計算蛋 產(chǎn)量。按重復(fù)組(by replicates)每兩周記錄一次采食量。對在第2、第4、第6、第8、第10、第 12和第14周的最后3天收集的雞蛋進(jìn)行單獨(dú)稱重。隨后將同樣的這些雞蛋打破，分離并稱重 蛋黃和蛋清，并將蛋殼在蒸餾水中漂洗、在空氣中干燥、并且稱重。在第8和第14周的結(jié)束， 在每個重復(fù)組(n = 5/處理組）中隨機(jī)選擇一只雞來通過右翼靜脈進(jìn)行血液取樣并且通過 CO2室息施以安樂死來分別收集末梢8厘米的十二指腸、空腸和回腸，分別位于十二指腸、空 腸和回腸內(nèi)的消化物，以及肝臟。還在第14周時收集了排泄物。
[0166] 總氨基酸消化率
[0167] 在第14周進(jìn)行安樂死的前五天，用加有0.3%氧化鉻（不可消化的標(biāo)記物）的相同 的實驗飲食飼喂前述相同的母雞，用于確定回腸和排泄物的總氨基酸消化率(Ravindran et al.，"A Comparison of Ileal Digesta and Excreta Analysis for the Determination of Amino Acid Digestibility in Food Ingredients for Poultry，'， British Poultty Science 40(2):266_274(1999);Kim et al·，"Interactive Effects of Age，Sex，and Strain on Apparent Ileal Amino Acid Digestibility of Soybean Meal and an Animal By-Product Blend in Broilers，"Poult.Sci.4:908_917(2012)，其 全部內(nèi)容在此通過引用并入）D按照Phthaldialdehyde Reagent Complete Solution (Sigma-Aldrich Co.LLC，St.Louis，M0)描述的方法分別確定排泄物、回腸消化物和飼料中 的總氨基酸。
[0168] 血漿生化
[0169] 除非另有說明，否則所有化學(xué)品均購自Sigma-Aldrich Co.，LLC(St.Louis，M0)D 血液樣品以l，〇〇〇x g離心15min。分離血漿部分并凍于-20°C。使用高效液相色譜法測定胰 島素 （Sarmento et al ·，"Development and Validation of a Rapid Reversed-Phase HPLC Method for the Determination of Insulin from Nanoparticulate Systems，'， Biomed .Chromatogr .20:898-903(2006)，其全部內(nèi)容在此通過引用并入）、3-甲基組氨酸 (3-MH)(Henrikson et al·，"Amino Acid Analysis by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography：Precolumn Derivatization with Phenylthiocyanate，" Anal .Biochem · 136:65-74(1984)，其全部內(nèi)容在此通過引用并入）、 皮質(zhì)酉同(Fowler et al.，"The Determination of Plasma Corticosterone of Chickens by High Pressure Liquid Chromatography，"Poult.Sci.62:1075_1079(1983)，其全部內(nèi) 容在此通過引用并入）和谷氨酰胺（Georgi et al·，"High-Performance Liquid Chromatographic Determination of Amino Acids in Protein Hydrosylates and in Plasma Using Automated Pre-Column Derivatization with O-PhthaIdialdehyde/2-Mercaptoethanol，" J .Chromatogr .613:35-42(1993)，其全部內(nèi)容在此通過引用并入）的血 楽濃度使用尿酸液體穩(wěn)定試劑盒（Infinity TM，F(xiàn)isher Diagnostics ,Middletown，NY)確 定血楽尿酸的濃度（Miles et al. "Uric Acid Excretion by the Chick as an Indicator of Dietary Protein Quality/iPoult.Sci.55：98-102(1976)；Vit et al.? "Hepatic Purine Enzymes and Uric Acid Excretion as Indicators of Protein Quality in Chicks Fed Graded L-Lysine Diets，"J·Sci·Food Agric·62:369-374 (1993)，其全部內(nèi)容在此通過引用并入）D根據(jù)Bowers等的方法（"Measurement of Total Alkaline Phosphatase Activity in Human Serum，"Gun.Chem.21:1988(1975)，其全部內(nèi) 容在此通過引用并入）測定堿性磷酸酶（AKP)的血漿活性。根據(jù)Lau等的方法 (Characterization and Assay of Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Activity in Serum：Potential Use to Assess Bone ResorptionZiClin.Chem.33:458-462(1987)? 其全部內(nèi)容在此通過引用并入），并且將pH變更為5.8,來確定抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP) 的血漿活性。
[0170]腸道消化物和刷狀緣的蛋白酶活性以及氨基酸消化率
[0171] 在十二指腸、空腸和回腸處分別用冰冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖掉小腸內(nèi)容物， 并且將所述內(nèi)容物置于無菌小瓶中，快速在液氮中冷凍，并儲存在_80°C。在要分析時，于冰 上解凍腸道消化物，勻漿60秒，并在4°C18,000x g離心20分鐘。倒出上清液用于蛋白酶活性 的測定。從所述三個小腸部分收集粘膜片段，并儲存在_80°C。在要分析時，將所述粘膜樣品 勻漿60秒并以3,00(^8離心15分鐘。將得到的上清液以27,00(^8離心30分鐘，并且重懸剩 余的沉淀物用于確定蛋白酶活性。使用偶氮酪蛋白測定法確定總蛋白酶活性(Tomarelli et a I. ?uThe Use of Azoalbumin as a Substrate in the Colorimetric Determination of Peptic and Tryptic Activity，"J·Lab·Cl in.Med·34:428-433 (1949)，其全部內(nèi)容在此通過引用并入）D
[0172] Q-PCR 分析和 Western 印跡
[0173] 為了掲示微藻生物質(zhì)作為飼料蛋白質(zhì)新來源的營養(yǎng)和代謝效應(yīng)的分子機(jī)制，確定 了十二指腸和肝臟中幾個因子的mRNA和蛋白應(yīng)答。選擇和理由如下:幾個最重要的氨基酸/ 肽轉(zhuǎn)運(yùn)子包括陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(CAT)家族、寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白I(PEPTl)、以及NA2+非依賴性 支鏈和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（LAT)(Gilbert et al·，"Developmental Regulation of Nutrient Transporter and Enzyme mRNA Abundance in the Small Intestine of Broilers，'， Poult.Sci.86：1739-1753(2007)；Gilbert et al.?uDietary Protein Quality and Feed Restriction Influence Abundance Nutrient Transporter mRNA in the Small Intestine of Broiler Chicks J. Nutr. 138 ： 262-271 (2008) ； Speier et al.?uGene Expression of Nutrient Transporters and Digestive Enzymes in the Yolk Sac Membrane and Small Intestine of the Developing Embryonic Chick，'，Poult·Sci.91: 1941-1949(2012);其全部內(nèi)容在此通過引用并入）。此外，氨肽酶(APN)可以針對腸道蛋白 質(zhì)組合物的變化做出應(yīng)答(Gilbert et al·，"Dietary Protein Composition Influences Abundance of Peptide and Amino Acid Transporter Messenger Ribonucleic Acid in the Small Intestine of2Lines ofBroiler Chicks，"Poult.Sci.89:1663-1676(2010)， 其全部內(nèi)容在此通過引用并入）。由于飲食性蛋白質(zhì)的最重要功能之一是提供氨基酸用于 蛋白質(zhì)的合成，因此藻類蛋白質(zhì)如何影響組織蛋白的合成仍有待確定。雖然有很復(fù)雜的系 統(tǒng)控制和執(zhí)行該合成，S6核糖體蛋白（S6)及其上游的調(diào)節(jié)物包括P70S6激酶1(P70)和哺乳 動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR)的磷酸化，連同真核起始因子4E(elF4E)在起始蛋白質(zhì)合成中 發(fā)揮重要作用并且對飲食蛋白質(zhì)的改變有應(yīng)答（Gilbert et al.，"Developmental Regulation of Nutrient Transporter and Enzyme mRNA Abundance in the Small Intestine of BroilersZiPoult.Sci.86：1739-1753(2007)；Gilbert et al.?uDietary Protein Quality and Feed Restriction Influence Abundance Nutrient Transporter mRNA in the Small Intestine of Broiler Chicks J.Nutr. 138 ： 262-271 (2008)； Speier et al·，"Gene Expression of Nutrient Transporters and Digestive Enzymes in the Yolk Sac Membrane and Small Intestine of the Developing Embryonic Chick，"Poult · Sci · 91:1941-1949(2012);其全部內(nèi)容在此通過引用并入）。
[0174] 勻漿十二指腸的組織樣品并且使用TRI zol試劑分離和純化總RNA( Life Technologies，Carlsbad，CA)。在Bio-tek分光光度計上于260nm光密度處以及在Agi lent Bioanalyzer2100(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)上確定RNA的濃度和質(zhì)量。按 照制造商的說明（Life Technologies，Carlsbad，CA)，使用Superscript和隨機(jī)引物/寡T混 合物生成cDNA文庫。為了研究飼喂藻類和蛋白酶對腸道蛋白質(zhì)代謝可能產(chǎn)生的影響，通過 RT-qPCR使用SYBR Green在ABI7700上（Life Technologies，Carlsbad，CA)確定以下關(guān)鍵因 子的相對基因表達(dá)：PepTl (匪_204365.1，其全部內(nèi)容在此通過引用并入）、LAT-1(NM_ 001030579.1，其全部內(nèi)容在此通過引用并入）、CAT-1 (NMJ)01145490.1，其全部內(nèi)容在此通 過引用并入)和APN(NM_204861.1，其全部內(nèi)容在此通過引用并入）。用于每個單獨(dú)基因的引 物列于表11中。用對照基因 β-肌動蛋白（NM_205518.1，其全部內(nèi)容在此通過引用并入)的表 達(dá)，使用AACt方程（Livak et al ·，"Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2[_delta delta C(T)]Method，"Methods 25:402-408(2001)，其全部內(nèi)容在此通過引用并入)校對每個樣品的相對基因表達(dá)并且相 對于對照的母雞進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0175] 表11.雞mRNA的引物序列
[0178] Αρη，氨肽酶N;Catl，陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-I ;Latl，L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體I ;Peptl，肽 轉(zhuǎn)運(yùn)體-1;和PAact，β_肌動蛋白。
[0179] 本研究中使用的一抗的信息列于表12中。山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物來 自 Bio-Rad Laboratories公司（Hercules，CA)。信號的檢測使用 了來自 Thermo Fisher Scientif ic公司（Rockford，IL)的化學(xué)發(fā)光底物。使用經(jīng)液氮冷卻的研缽和件通過冷凍粉 碎法提取母雞肝臟樣品（6-10mg)。將提取物溶解在蛋白裂解緩沖液（150mM氯化鈉；IOmM三 氨基甲烷；ImM EDTA; ImM乙二醇-雙-N，N，YM -四乙酸；1 %氚核；0.5 % NP-40; IOOmM氟化 鈉；10 ;mM磷酸鈉;和2mM正釩酸鈉）中。將勻漿物置于冰上45分鐘，然后在4°C以I，OOOg離心 30分鐘。將上清液以10，OOOg再次離心45分鐘并以150，OOOg最后離心45分鐘。用二辛可寧酸 (BCA)測定法(Thermo Fisher Scientif ic，Rockford，IL)確定所得上清液中的蛋白質(zhì)含 量。
[0180]表12.Western分析用兩種類型微藻喂養(yǎng)的蛋雞肝臟中蛋白合成相關(guān)因子所用的 一抗的名稱、類型和稀釋度*
[0182] *所有的抗體均購自Cell Signaling Technology(Beverly，MA)。
[0183] **eIF4E，真核起始因子4E; mTOR，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；p70，p70S6激酶；S6， S6核糖體蛋白；和PS6，磷酸化-S6-核糖體蛋白。
[0184]將肝勻漿物(25yg蛋白）溶解在SDS還原性樣品緩沖液中并在加載至12% (對于檢 測具有大分子量的mTOR采用7.5%)的SDS-PAGE還原微型凝膠(Bio-Rad Laboratories公 司，Hercules，CA)之前煮沸5分鐘。在穩(wěn)定的30mA跑膠。使用BioRad微型反式印跡盒在100伏 將凝膠中的蛋白質(zhì)向硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移60min(mTOR轉(zhuǎn)移75分鐘）。在滾動的平臺上，在含 5 %牛奶的Tr is緩沖鹽溶液(TBST)(含0.1 %吐溫20)中室溫(RT)封閉膜1小時。在用TBST洗 滌三次(每次5分鐘）后，在恒速溫和攪拌下將膜與兔的一抗(Ce 11 Signaling Technology 公司，Danvers，MA)4°C過夜培育。對于p70S6激酶、S6、磷酸化S6和eIF4E，在3%BSA TWEEN?20(TBST)中以1:1000稀釋抗體，對于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR)，在3%牛 奶TBST中以1: 1000稀釋抗體。在RT下與山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶結(jié)合物（Bio-Rad Laboratories公司，Hercul es，CA)(所述結(jié)合物以1:3000稀釋于3 %牛奶TBST中）培育1小時 之前，在TBST中將膜洗滌三次。在TBST中洗滌三次并且在蒸餾水中漂洗五次之后，在暴露于 Kodak BioMax XAR 膠卷（Care stream，Ro Chester，NY)之前，在 RT 下將膜在Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce，Rockford，IL)中培育5分鐘。如先前所述確定目標(biāo)蛋白條 帶的相對定量值(Yan et al·，"Dietary Selenium Deficiency Partially Rescues Type 2Diabetes_Like Phenotypes of Glutathione Peroxidase-I-Overexpressing Male Mice，"J.Nutr. 142:1975-1982(2012)，其全部內(nèi)容在此通過引用并入）。
[0185] 統(tǒng)計分析
[0186] 使用隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計法，每個處理組有5個重復(fù)并且每個重復(fù)有6只雞。使用 JMP8.0(SAS Institute，Cary，NC)執(zhí)行了五個正交對比來確定基于藻類的飲食組和對照飲 食組之間、藻類飲食組之間、以及酶處理組之間的差異。
[0187] 1 ·對照組對比 DGM-+FD-(1 對比 2+4)
[0188] 2.DGM-對比 FD-(2 對比 4)
[0189] 3.DGM+對比 DG-(2 對比 3)
[0190] 4.FD+對比 FD-(4 對比 5)
[0191] 5.DGM++FD+對比 DGM-+FD-(2+4 對比 3+5)
[0192] 將顯著性定義成P<0.05。
[0193] 結(jié)果
[0194] 蛋的產(chǎn)量和質(zhì)量
[0195] 飲食處理不影響體重(BW)、日均采食量(ADFI )、母雞日產(chǎn)蛋量和殼的重量(表13)。 在最初的2周中飼喂所述兩種類型的藻類生物質(zhì)降低了（P<0.05)采食量。相較于硅藻，飼 喂綠色微藻降低了（P<〇.05)蛋和蛋清的平均重量。在含有蛋白酶，特別是綠藻的飲食組 中，平均蛋黃重量也更高(表13)。
[0196] 表13.在補(bǔ)充和不補(bǔ)充蛋白酶的條件下加入飲食藻類對蛋雞的蛋產(chǎn)量和質(zhì)量的效 應(yīng)1
[0198] 1數(shù)值表示成整個時期內(nèi)兩周一次數(shù)據(jù)的平均值(每個處理組n = 5)。
[0199] 血漿生化指標(biāo)
[0200] 在第8或第14周時，胰島素、谷氨酰胺、尿酸和AKP的血漿濃度在5個治療組間無顯 著差異(表14)。在統(tǒng)計學(xué)上，在第14周時，用對照飲食喂養(yǎng)的母雞相較于用藻類飲食喂養(yǎng)的 母雞具有更高的血漿3-MH濃度。發(fā)現(xiàn)在第14周時，相較于用不含蛋白酶的硅藻喂養(yǎng)的母雞， 用含蛋白酶的硅藻飲食喂養(yǎng)的母雞中皮質(zhì)酮的濃度更低。在第8周時的綠藻喂養(yǎng)組的血漿 TRAP活性和在第14周時的所有藻類喂養(yǎng)組的血漿TRAP活性均低于(P<0.05)對照組的活 性。
[0201 ]表14.在第8和第14周時，在補(bǔ)充或不補(bǔ)充蛋白酶的條件下加入飲食藻類對蛋雞血 漿生化的效應(yīng)u [0202]
[0203] 1數(shù)值表示成平均值(每個處理組n = 5)。
[0204] 23-MH，3-甲基組氨酸;TRAP，抗酒石酸抗性酸性磷酸酶;和AKP，堿性磷酸酶。
[0205] 消化物和刷狀緣的蛋白酶活性以及氨基酸消化率
[0206] 確定了蛋雞的十二指腸、空腸或者回腸消化物中的蛋白酶活性沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性 差異(表15)。在第14周時，用綠藻和硅藻喂養(yǎng)的母雞的空腸刷狀緣的蛋白酶活性比對照組 更高(P<0.05)(表15)。在第14周時，蛋白酶的加入提升了十二指腸處的刷狀緣蛋白酶活 性。未確定刷狀緣活性有其他的變化。
[0207]表15.在第8和第14周時，在補(bǔ)充或不補(bǔ)充蛋白酶的條件下加入飲食藻類對不同小 腸段消化物及刷狀緣膜的蛋白酶活性以及回腸和排泄物的表觀氨基酸消化率的效應(yīng)1
[0209] 1數(shù)值表示成平均值(每個處理組n = 5)。
[0210] 2在第14周時使用Cr2O3作為不可消化的標(biāo)記物測得。
[0211] 蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)
[0212] 觀察到對LATl具有顯著的主效應(yīng)。和對照組相比，在第14周時，用含有蛋白酶的綠 藻和硅藻喂養(yǎng)的母雞在十二指腸分別具有較低(P<〇. 05)的LATlmRNA水平(表16)。正交對 比還揭示，含藻類的飲食比對照飲食具有更低水平的LATl。未確定對CATl、PepTl、或者APN 有其他的主效應(yīng)。然而，APN的正交對比結(jié)果表明含藻類的飲食組具有較低的APN水平(P = 0.056)〇
[0213]表16.在第14周時，在補(bǔ)充或不補(bǔ)充蛋白酶的條件下加入飲食藻類對十二指腸中 氨基酸和肽轉(zhuǎn)運(yùn)體的相對mRNA水平的效應(yīng)1
[0215] 1數(shù)據(jù)表示成相對于對照的相對變化平均值(n = 3-4)。
[0216] 2Apn，氨肽酶N; Cat 1，陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體I; Lat I，L型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1;和Pept 1， 肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1。沒有相同上標(biāo)字母的數(shù)值有差異，P<〇. 05。
[0217]與對照組相比，用藻類喂養(yǎng)的4組中肝磷-S6(PS6)的量和PS6/S6的比率上升了4-9 倍(P<0.05)(圖3)，而肝S6蛋白的量不受飲食處理的影響。與對照組相比，用綠藻加蛋白酶 喂養(yǎng)的母雞具有更高(P<〇.〇5)水平的肝elF4E和P70。用硅藻喂養(yǎng)的兩組母雞具有比對照 組更低(P<〇. 05)的肝mTOR水平和更高的肝P70水平。
[0218] 討論
[0219] 本研究顯示，用25%的脫脂綠色微藻或者11.7%的全脂硅藻微藻飼喂母雞14周不 會降低總產(chǎn)蛋量、采食量或者體重。同時，在