枯草芽孢桿菌生物保鮮劑及在大黃魚保鮮中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)品防腐保鮮技術(shù)，具體涉及枯草芽孢桿菌作為生物保鮮劑在大黃魚防腐保鮮中的應(yīng)用以及保鮮防腐的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水產(chǎn)品是人們食品的重要組成部分，冰鮮保藏是水產(chǎn)在市場(chǎng)流通的主要方式之一。由于水產(chǎn)品含有豐富的蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，容易引起腐敗細(xì)菌快速生長(zhǎng)繁殖，腐敗物質(zhì)大量積累，因而極易變質(zhì)，影響到水產(chǎn)品的質(zhì)量，甚至威脅人的身體健康。因此，水產(chǎn)品的保鮮方法成為目前的研究熱點(diǎn)。目前，應(yīng)用于水產(chǎn)品的保鮮技術(shù)主要有低溫保鮮、化學(xué)保鮮、氣體保鮮、輻射保鮮和生物保鮮等。生物保鮮以其安全性高、能耗低的優(yōu)勢(shì)成為開發(fā)新熱點(diǎn)。植物源保鮮劑主要起抗氧化作用;動(dòng)物源抑菌劑如魚精蛋白；水產(chǎn)品中常用的微生物源抑菌劑主要有乳酸菌產(chǎn)生的乳酸菌素、納它霉素等。動(dòng)/植物來(lái)源的保鮮劑受原料限制，價(jià)格較高;而目前產(chǎn)業(yè)化的微生物源保鮮劑均為微生物代謝物，日益受到重視。
[0003]枯草芽孢桿菌菌株具有抑制病原菌和微藻的活性，被允許使用在果蔬、魚飼料中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種枯草芽孢桿菌作為生物保鮮劑在水產(chǎn)品保鮮防腐中的應(yīng)用，為水產(chǎn)品特別是冰鮮大黃魚的保鮮提供新的途徑。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
本應(yīng)用中所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(BaciIIus subtulis)BSh0851，保藏日期為2009年12月13日，保藏單位是中國(guó)微生物菌株保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCCN0.3502。
[0006]所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為革蘭氏陽(yáng)性菌，芽孢橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，常形成皺醭;需氧菌，可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，V-P陽(yáng)性。
[0007]采用優(yōu)化培養(yǎng)后的培養(yǎng)條件，通過(guò)液體發(fā)酵制得含有高活性物質(zhì)的發(fā)酵液，并采用酸沉淀的方法得到脂肽類活性物質(zhì)粗提物。粗提物產(chǎn)量為0.45g/L，對(duì)105cfu/mL嗜冷桿菌、105cfu/mL假單胞菌和105cfu/mL希瓦氏菌3菌混合液的抑菌率為33%。
[0008]將0.3mg/mL粗提物與0.3mg/mL尼薩普林和20mg/mL殼聚糖鹽酸鹽配伍，制成混合保鮮劑。使用本發(fā)明的保鮮劑對(duì)大黃魚進(jìn)行保鮮，儲(chǔ)藏5天后，揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)和微生物以及感官指標(biāo)均符合我國(guó)鮮大黃魚等相關(guān)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 3101-2010)中一級(jí)鮮度，防腐保鮮效果顯著，延長(zhǎng)了大黃魚的貨架期。結(jié)果表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵液粗提物能夠有效地抑制大黃魚表面細(xì)菌的生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)大黃魚魚肉的脂肪酸氧化和新鮮度也有一定的改善效果。
[0009]大黃魚保鮮方法是用碎冰將鮮活大黃魚失活，將枯草芽孢桿菌粗提物、尼薩普林、殼聚糖鹽酸鹽溶液混合噴灑在魚體，于4°C冰箱內(nèi)冰上貯藏。
[0010]具體包括以下步驟:(I)種子液制備:從營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上挑取一接種環(huán)已活化的枯草芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中，37°C，200r/min，培養(yǎng)24h ；種子培養(yǎng)基為牛肉霄3g、氯化鈉5g、蛋白胨10g、蒸餾水1000mL、pH7.0-7.2;
(2)發(fā)酵液培養(yǎng)基制備:酵母浸膏14g，無(wú)水葡萄糖14g，MgS0dg，蒸餾水100mL，pH7.0;
(3)枯草芽孢桿菌無(wú)菌體發(fā)酵液的制備:在步驟(2)制得的發(fā)酵液中接入步驟(I)制得的種子液，接種量為7%;調(diào)節(jié)初始pH值8;培養(yǎng)溫度38°C，轉(zhuǎn)速10r.min—1，裝液量150mL/250mL搖瓶;在此條件下培養(yǎng)24h ；
(4)無(wú)菌發(fā)酵液的制備:將步驟(3)所述枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液在10000r/min離心15min后，用0.22μπι濾膜過(guò)濾，即為無(wú)菌體的發(fā)酵濾液；
(5)發(fā)酵液粗提物制備:將步驟(4)所述無(wú)菌發(fā)酵液用2mol/L的HCl調(diào)至ρΗ2.0，于4°C放置3d，再次10000r/min離心1min，收集沉淀物，溶解于無(wú)菌水中，并用NaCl調(diào)節(jié)pH至7;
(6)步驟(5)所得發(fā)酵液經(jīng)酸沉得到抑菌活性物質(zhì)即抑菌脂肽類物質(zhì)的產(chǎn)量為0.45g/L，對(duì)105cfu/mL嗜冷桿菌、105cfu/mL假單胞菌和105cfu/mL希瓦氏菌3菌混合液的抑菌率為33%；
(7)將步驟(5)的粗提物稀釋為活性物質(zhì)量為0.3mg/mL，與0.3mg/mL尼薩普林和20mg/mL殼聚糖鹽酸鹽制成混合保鮮劑；
(8)于在冰鮮大黃魚全表面，每隔12h噴灑步驟(7)制得的混合保鮮劑，每尾大黃魚每次噴灑的用量約為5mL。
[0011 ]本發(fā)明的有益效果如下:1、枯草芽孢桿菌作為一種飼料用益生菌，其代謝產(chǎn)物添加對(duì)人體安全無(wú)害。2、該枯草芽孢桿菌粗提物的抑菌譜較廣，能夠有效的抑制革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的生長(zhǎng)，且在4°C條件下保藏具有顯著的作用，從而對(duì)大黃魚的防腐保鮮起到很好的效果。3、該枯草芽孢桿菌來(lái)源復(fù)合保鮮劑在對(duì)大黃魚等水產(chǎn)品保鮮的過(guò)程中能夠有效保持水產(chǎn)品的新鮮度、感官性狀等。
【具體實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明以揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)，硫代巴比妥酸(TBA)，菌落總數(shù)等指標(biāo)評(píng)價(jià)枯草芽孢桿菌來(lái)源復(fù)合保鮮劑對(duì)養(yǎng)殖冰鮮大黃魚保鮮效果。
[0013]參考水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)(SC/T3032-2007)規(guī)定的測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮的方法。稱10g(精確到0.0lg)于均質(zhì)杯中，再加入90mL高氯酸溶液，均質(zhì)2min，用濾紙過(guò)濾或離心分離，濾液于2°C_6°C的環(huán)境條件下貯存，可保存2d。將1mL 2%的硼酸倒入50mL錐形瓶，加1-2滴混合指示劑，將硼酸置于冷凝管下端，并使冷凝管下端浸入液面，精確吸取上述樣品濾液2mL于蒸饋器反應(yīng)內(nèi)，加1%氧化鎂混懸液5mL，迅速蓋塞、加水，通入蒸汽。待蒸汽充滿蒸餾器內(nèi)部，由冷凝管出現(xiàn)第一滴冷凝水開始計(jì)算，蒸餾5min即停止，吸收液用約0.0lmol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。終點(diǎn)呈紅色，同時(shí)作試劑空白試驗(yàn)。TVB-N值單位為mgN/100g。揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)是判斷魚類鮮度的主要化學(xué)指標(biāo)之一，魚一級(jí)鮮度的TVBN值在5-10mg/100g，一般鮮度的魚TVBN值在 15-25mg/100g，當(dāng)TVBN值達(dá)到30-40mg/100g則魚已腐敗。
[0014]菌落總數(shù)測(cè)定方法:參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)-食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中的菌落總數(shù)測(cè)定操作(GB4789.2-2010)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBT18108-2008對(duì)鮮海水魚細(xì)菌菌落數(shù)做出規(guī)定:魚肉中細(xì)菌總數(shù)< 14CfVg為一級(jí)鮮度(A級(jí))標(biāo)準(zhǔn)，< 105cfu/g標(biāo)準(zhǔn)為腐敗終點(diǎn)(C級(jí))標(biāo)準(zhǔn)。
[0015]將新鮮大黃魚分4組，分別采用殼聚糖鹽酸鹽、枯草芽孢桿菌粗提物-殼聚糖鹽酸鹽和枯草芽孢桿菌粗提物-尼薩普林-殼聚糖鹽酸鹽復(fù)合保鮮劑進(jìn)行保鮮;并作I組對(duì)照，為了保證實(shí)驗(yàn)影響因素的一致性，對(duì)照組噴灑無(wú)菌水。
[0016](I)種子液制備:從營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上挑取一接種環(huán)已活化的枯草芽孢桿菌接種到種子培養(yǎng)基中，37°C，200r/min，培養(yǎng)24h;種子培養(yǎng)基為牛肉膏3g、氯化鈉5g、蛋白胨10g、蒸餾水 1000mL、pH7.0-7.2；
(2)發(fā)酵液培養(yǎng)基制備:酵母浸