維持了雌馬酚產生能力的雌 馬酚產生微生物的發(fā)酵制品，因此在世界范圍內首次實現(xiàn)提供以活菌的狀態(tài)含有雌馬酚產 生微生物的飲料和食品。另外，即使在需要大量生產的工業(yè)規(guī)模中實施，本發(fā)明的制備方法 也維持了雌馬酚產生微生物的雌馬酚產生能力并進行發(fā)酵，因此在商業(yè)上的實用性很高、 極為有用。
[0050] 如果能夠提供以活菌的狀態(tài)含有維持了雌馬酚產生能力的雌馬酚產生微生物的 飲料和食品，則能夠使不能產生雌馬酚的人(雌馬酚非產生者)獲得雌馬酚產生能力，因此 根據(jù)本發(fā)明能夠使雌馬酚非生產者享受基于雌馬酚的有效生理活性。
[0051] 另外，根據(jù)本發(fā)明的含有雌馬酚產生微生物的組合物，可以長期穩(wěn)定地維持雌馬 酚產生微生物的雌馬酚產生能力，具備可以充分耐受流通?銷售的保存穩(wěn)定性。特別是，本 發(fā)明的含有雌馬酚產生微生物的組合物為發(fā)酵大豆飲料或發(fā)酵豆?jié){的形態(tài)時，由于含有以 黃豆苷原類為代表的來自大豆的有用成分，同時還含有活菌狀態(tài)的雌馬酚產生微生物，因 此也存在雌馬酚產生微生物容易在腸內生成雌馬酚的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0052][圖1]為在實施例4中測定的各飲料中所含的格氏乳球菌的活菌數(shù)的結果。
[0053][圖2]為在實施例4中測定的各飲料中所含的格氏乳球菌的雌馬酚產生能力的結 果。
【具體實施方式】
[0054]本發(fā)明中，所謂雌馬酚產生微生物，是指具有同化選自黃豆苷原糖苷、黃豆苷原及 二氫黃豆苷原中的至少1種黃豆苷原類產生雌馬酚的能力(代謝活性)的微生物。此處，作為 黃豆苷原糖苷，具體地可以舉出黃豆苷、丙二酰黃豆苷、乙酰黃豆苷等。作為本發(fā)明中使用 的雌馬酚產生微生物，只要作為食品允許食用并具有雌馬酚產生能力即可，沒有特別限定。 例如，已知在下述微生物中存在具有上述能力的微生物：格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)等屬于乳球菌屬的微生物;中間鏈球菌(Streptococcus intermedius)、星座鏈 球菌（Streptococcus constellatus )等屬于鏈球菌屬的微生物；粘膜乳桿菌 (Lactobacillus mucosae)等屬于乳桿菌屬的微生物;卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus) 等屬于擬桿菌屬的微生物;屎腸球菌(Enteroccus faecium)等屬于腸球菌屬的微生物;大 芬戈爾德菌（Finegoldia magna)等屬于芬戈爾德菌屬的微生物；屬于韋榮氏球菌 (VeilloneIla)屬的微生物；Adlercreutzia equolifaciens等屬于Adlercreutzia屬的微 生物；粘液真桿菌(Eubacterium Iimosum)等屬于真桿菌屬的微生物;Eggerthel Ia hongkongenis等屬于埃格特菌（Eggerthe Ila )屬的微生物；青春雙歧桿菌 (Bifidobacterium adolescentis)、短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve)等屬于雙歧桿 菌屬的微生物；屬于史雷克氏菌（Slackia)屬的微生物；屬于不動桿菌屬(Acinetobacter) 屬的微生物等。在雌馬酚產生微生物中，優(yōu)選為乳球菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬及雙歧桿菌 屬等乳酸菌，更優(yōu)選屬于乳球菌屬的乳酸菌，可以特別優(yōu)選舉出格氏乳球菌。雌馬酚產生微 生物，例如可以以有無雌馬酚的產生能力作為指標，從人類腸內中分離。對于上述雌馬酚產 生微生物，已經保藏了由本發(fā)明人等從人類腸內分離鑒定的菌，即乳球菌20 - 92(FERM BP -10036號）、鏈球菌E - 23 - 17(FERM BP-6436號）、鏈球菌A6G225(FERM BP-6437號）及 擬桿菌屬E - 23 - 15(FERM BP-6435號），本發(fā)明中可以使用上述保藏菌。另外，作為雌馬酚 產生微生物，也可以使用Eubacterium limnosus(ATCC 8486)、埃格特菌屬(KCC10490)、 Adlercreutzia equolifaciens(JCMl4793)、EggertheIla hongkongenis HKUlO (JCM14552)、青春雙歧桿菌TM - 1(FERM P - 20325號）、短雙歧桿菌(JCM1273)、史雷克氏菌 TM30(FERMAP - 20729號）、革蘭氏陽性菌do03(AHU-1763)(FERMAP-20905號）等。在上述 的保藏菌中，本發(fā)明中優(yōu)選使用乳球菌20 - 92。
[0055] 以下，詳細說明本發(fā)明的發(fā)酵物的制備方法(第1法和第2法）、發(fā)酵制品、及含有雌 馬酚產生微生物的組合物。第1法為以大豆粉末及/或豆?jié){作為原料制備發(fā)酵物的方法，第2 法為以乳作為原料制備發(fā)酵物的方法。
[0056] 在本說明書中，所謂母發(fā)酵劑是指由儲用培養(yǎng)物制備的發(fā)酵劑(種菌），所謂生產 用發(fā)酵劑是指使用母發(fā)酵劑制備的發(fā)酵劑(種菌），在利用主發(fā)酵大量生產發(fā)酵物時作為發(fā) 酵劑使用。
[0057] 1.發(fā)酵物的制備方法(第1法)
[0058] 該第1法的發(fā)酵物的制備方法包括下述步驟：制備母發(fā)酵劑（以下也記作"母發(fā)酵 劑一 Γ)的步驟(1);使用母發(fā)酵劑一 1制備生產用發(fā)酵劑（以下也記作"生產用發(fā)酵劑一 Γ) 的步驟(2);及使用生產用發(fā)酵劑一 1，以大豆粉末或豆?jié){作為原料制備發(fā)酵物的步驟(3)。 以下，詳細說明該第1法的發(fā)酵物的制備方法的每個步驟。
[0059] 步驟(1)
[0060] 本發(fā)明中，首先，在含有黃豆苷原類的培養(yǎng)基（以下也記作"母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 Γ) 中，在維持pH5.0以上的狀態(tài)下，對雌馬酚產生微生物進行厭氧發(fā)酵，由此制備母發(fā)酵劑（以 下也記作"母發(fā)酵劑一 Γ )(步驟(1))。
[0061] 母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1以雌馬酚產生微生物可以生長且允許作為食品成分為限，母 發(fā)酵劑沒有特別限定，可以根據(jù)最終制備的發(fā)酵物的種類適當設定其組成。
[0062] 母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1中使用的黃豆苷原類包括黃豆苷原糖苷、黃豆苷原及二氫黃 豆苷原中的1種或2種以上的黃豆苷原類。作為黃豆苷原糖苷，具體地可以舉出黃豆苷、丙二 酰黃豆苷、乙酰黃豆苷等。本發(fā)明中，作為上述黃豆苷原類，可以使用黃豆苷原類的純品、黃 豆苷原類的粗精制品及含有黃豆苷原類的物質中的任一種。作為含有黃豆苷原類的物質， 可以舉出大豆、豆?jié){、大豆胚軸、葛、葛根、紅地球葡萄(red globe grape)、苜蓿及它們的提 取物(水、含水酒精等極性溶劑提取物)等。從穩(wěn)定地維持雌馬酚產生微生物的雌馬酚產生 能力的觀點考慮，作為本發(fā)明中使用的黃豆苷原類，優(yōu)選大豆、豆?jié){、大豆胚軸或其提取物， 特別優(yōu)選大豆。
[0063]此處，使用大豆作為黃豆苷原類時，優(yōu)選舉出粉末化后的大豆，更優(yōu)選舉出蒸煮或 煮沸并且粉末化后的大豆，特別優(yōu)選舉出在65~105°C下蒸煮或煮沸30秒~30分鐘并粉末 化后的大豆。另外，對于粉末化后的大豆的平均粒徑沒有特別限定，但一般而言，從使制備 的發(fā)酵物具備良好的口感的觀點考慮，優(yōu)選中值粒徑約為50μπι左右以下。另外，優(yōu)選粒徑 150μπι以上的粒子為10%以下。需要說明的是，上述粒徑使用激光衍射/散射式粒度分布測 定裝置進行測定。
[0064] 作為母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1中的黃豆苷原類含有物的配合比例，例如，可以舉出黃豆 苷原類的總量為0.002~0.04重量％，優(yōu)選為0.004~0.02重量％，更優(yōu)選為0.008~0.012 重量％的比例。更具體而言，使用大豆粉末作為黃豆苷原類時，可以舉出母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1中大豆粉末換算成干燥重量時為3~28重量％，優(yōu)選為5~28重量％，更優(yōu)選為7~17重 量％的比例。另外，使用大豆胚軸提取物作為黃豆苷原類時，可以舉出母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1 中大豆胚軸提取物換算為干燥重量時為0.005~0.1重量％，優(yōu)選為0.01~0.05重量％，更 優(yōu)選為0.02~0.03重量％的比例。通過以上述的配合比例含有黃豆苷原類，可以在不破壞 雌馬酚產生能力的情況下使雌馬酚產生微生物增殖，得到母發(fā)酵劑一 1。
[0065] 另外，為了促進雌馬酚產生微生物的生長，母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1中可以含有精氨酸 等氨基酸、抗壞血酸等維生素類、焦磷酸鐵等微量金屬。母發(fā)酵劑為了使雌馬酚產生微生物 的生長良好，優(yōu)選在母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1中添加精氨酸，作為母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1中的精氨 酸的配合比例，例如可以舉出為0.01~1重量％，優(yōu)選為0.05~0.3重量％。
[0066] 進而，根據(jù)需要，除上述成分之外，還可以在母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1中添加氮源、碳源 等營養(yǎng)素。
[0067] 母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1有時影響發(fā)酵物的味道，因此可以優(yōu)選舉出對發(fā)酵物味道沒 有不良影響的培養(yǎng)基。
[0068] 母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1通過混合規(guī)定量的添加成分、根據(jù)需要使其乳化、然后進行殺 菌處理而制備。
[0069] 本步驟（1)中，雌馬酚產生微生物的厭氧發(fā)酵可以通過使用氣體容器(gas packs) 和厭氧罐的現(xiàn)有的公知方法實施。
[0070] 另外，本步驟（1)中，維持pH為5.0以上、優(yōu)選為5.5~8.0、更優(yōu)選為6.0~8.0進行 厭氧發(fā)酵。通過如上所述維持PH，可以在不破壞雌馬酚產生能力的情況下使雌馬酚產生微 生物增殖，制備母發(fā)酵劑一 1，通過該第1法的制備方法最終得到的發(fā)酵物中，可以穩(wěn)定地維 持該微生物的雌馬酚產生能力。上述厭氧發(fā)酵中的PH的控制可以利用公知的方法實施。例 如，在使用的培養(yǎng)基中，設定被雌馬酚產生微生物同化的糖類(例如葡萄糖等）的配合比例 為〇. 5重量％以下、優(yōu)選為0.4重量％以下、更優(yōu)選為0.3重量％以下時，即使發(fā)酵進行，pH也 不降低，因此可以維持厭氧發(fā)酵中的PH在上述范圍內。另外，厭氧發(fā)酵中的pH的控制也可以 通過適當添加 pH調節(jié)劑進行。
[0071 ]本步驟（I)中的厭氧發(fā)酵如下實施:將雌馬酚產生微生物的種菌接種在母發(fā)酵劑 培養(yǎng)基一 1上，在該微生物可生長的溫度區(qū)域、優(yōu)選在該微生物的最佳溫度區(qū)域下，使其厭 氧發(fā)酵20~96小時，優(yōu)選72~96小時。更具體而言，使用乳酸菌作為雌馬酸產生微生物時， 例如可以在35~39°C下進行厭氧發(fā)酵72~96小時。
[0072] 如上所述得到的母發(fā)酵劑一 1含有雌馬酚產生微生物，所述雌馬酚產生微生物增 殖且為維持了雌馬酚產生能力的狀態(tài)。
[0073] 如上所述得到的母發(fā)酵劑可以直接供給至接下來的步驟(2)，同時也可以根據(jù)需 要，使用該母發(fā)酵劑作為種菌，在與上述條件相同的條件下進一步制備母發(fā)酵劑，在接下來 的生產中使用。使用制備的母發(fā)酵劑、在與上述條件相同的條件下再次制備母發(fā)酵劑的步 驟可以重復1次或數(shù)次，例如1~10次左右。即使如上所述重復實施發(fā)酵，只要滿足上述條 件，則在母發(fā)酵劑一 1中就可以以維持了雌馬酚產生能力的狀態(tài)含有雌馬酚產生微生物。
[0074] 步驟(2)
[0075]接著，使用上述步驟（1)中得到的母發(fā)酵劑一 1，在含有上述黃豆苷原類的培養(yǎng)基 中（以下也記作"生產用發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 Γ )，在維持pH5.0以上的狀態(tài)下進行發(fā)酵，由此制 備生產用發(fā)酵劑一 1 (以下也記作"生產用發(fā)酵劑一 Γ )(步驟(2))。
[0076] 生產用發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1為含有上述黃豆苷原類的培養(yǎng)基，以雌馬酚產生微生物 可以生長且允許作為食品成分為限，沒有特別限定，可以根據(jù)發(fā)酵物的種類適當設定。
[0077] 生產用發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1通過含有黃豆苷原類，可以在維持雌馬酚產生微生物的 雌馬酚產生能力的狀態(tài)下使其增殖。關于生產用發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1中配合的上述黃豆苷原 類的種類及配合比例，與下述的主發(fā)酵用培養(yǎng)基一 1相同。
[0078] 另外，生產用發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1中，除上述黃豆苷原類之外，可配合的添加成分的 種類及配合比例與上述母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1相同。另外，生產用發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1有時影響 發(fā)酵物的味道，因此可以優(yōu)選舉出對發(fā)酵物的味道沒有不良影響的培養(yǎng)基，進而優(yōu)選舉出 與上述母發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1的組成相同的培養(yǎng)基。
[0079] 生產用發(fā)酵劑培養(yǎng)基一 1可以通過混合規(guī)定量的配合成分、根據(jù)需要使其乳化、然 后進行殺菌處理而制備。
[0080] 該步驟(2)中，厭氧發(fā)酵通過維持pH為5.0以上，優(yōu)選為5.5~8.0，更優(yōu)選為