一種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素及其制備方法
【專利摘要】本申請公開了一種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，包括以下步驟：制備基于川明參的發(fā)酵醪液；使用糖化酶和酵母菌對發(fā)酵醪液進行同步糖化發(fā)酵；使用乳酸菌發(fā)酵菌劑對糖化發(fā)酵后的發(fā)酵醪液進行發(fā)酵，制備得到川明參酵素。本申請還公開了一種上述制備方法制備得到的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素，該方法制得的酵素原料產(chǎn)品含有大量益生菌，具有一定的生物活性保健功能性。
【專利說明】
一種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本申請屬于食品發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵 素及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 川明參為傘形科植物川明參（Chuanminshen violaceum Shen et Shan)的干燥 根。川明參又稱明參、明沙參、土明參、沙參，主要產(chǎn)于四川（青北江、金堂、簡陽、蒼溪、威遠、 北川、平武、巴中、南川、間中）、湖北（宜昌、當陽）等地，其中以金堂、青北江、巴中和閬中一 帶所產(chǎn)之川明參藥材質(zhì)量最佳。川明參具有潤肺化痰，養(yǎng)陰和胃，平肝解毒等作用，常用量 為10-15g，在民間主要是作為食用，主要用于燉湯或者燉肉。
[0003] 科學發(fā)明表明，川明參中粗蛋白含量高達5%以上，其水解氨基酸總含量超過3%， 各類氨基酸達13種以上，尤其是人體必需的7種氨基酸，占總氨基酸含量的40 %以上，可廣 泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健食品領(lǐng)域，市場前景廣闊。除此之外，川明參還含有阿魏酸、香豆素、槲 皮素、留體、三萜酸等生物活性物質(zhì)。現(xiàn)代醫(yī)學試驗也表明川明參具有明顯的鎮(zhèn)咳祛痰的作 用，川明參多糖具有增強小鼠特異性及非特異性體液免疫的作用和一定的抗突變作用。這 些都為川明參的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。
[0004] 酵素，也稱為"酶"，是酵母分泌的"代謝產(chǎn)物"，是一種生物催化劑，大多數(shù)酵素由 蛋白質(zhì)構(gòu)成。酵素幾乎可以參與所有的身體活動，在酵素的參與下人體能維持正常的機體 免疫、新陳代謝、修復(fù)組織等生理功能。目前，國內(nèi)對利用川明參生產(chǎn)酵素的報道和認知還 幾乎沒有。川明參當中大量的蛋白質(zhì)、多糖等成分結(jié)果發(fā)酵后，可能含有豐富的超氧化物歧 化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、礦物質(zhì)以及酚類、維生素、黃酮類等次生代謝產(chǎn)物，具有體內(nèi) 環(huán)境、分解、抗炎、抗菌、凈化血液等作用。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中并沒有川明參酵素產(chǎn)品的報道，酵素產(chǎn)品大多由果蔬或谷物原料發(fā)酵 制得;現(xiàn)有的通過果蔬或谷物原料發(fā)酵制得的酵素存在菌活性低、色澤差的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本申請上述問題，提供了一種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制 備方法，該方法制得的飲料含有大量益生菌，具有一定的生物活性保健功能性。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本申請公開了一種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的 制備方法，包括以下步驟：
[0008] 1)制備基于川明參的發(fā)酵醪液；
[0009] 2)使用糖化酶和酵母菌對發(fā)酵醪液進行同步糖化發(fā)酵；
[0010] 3)使用乳酸菌發(fā)酵菌劑對糖化發(fā)酵后的發(fā)酵醪液進行發(fā)酵，制備得到川明參酵 素。
[0011] 進一步地，步驟1)中的制備基于川明參的發(fā)酵醪液具體為：
[0012] 1.1)制備川明參泥:川明參原料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水預(yù)煮，破 碎成泥，即得到川明參泥；
[0013] 1.2)將川明參泥與大豆粉或大豆蛋白粉按照質(zhì)量比（g/g)為1:0.05-1:0.2混合， 按照固液比（g/ml)l:0.2-l添加水，在發(fā)酵罐當中預(yù)煮5-10min保持溫度90-95Γ;隨后降溫 至75-85 °C按照40KNU/kg川明參泥添加液化酶，液化至碘反應(yīng)為紅棕色；115 °C滅菌15min同 時使液化酶失活，制備得到基于川明參的發(fā)酵醪液。
[0014] 進一步地，大豆粉或大豆蛋白粉的目數(shù)為40目以上。
[0015] 進一步地，步驟2)中使用酵母菌對發(fā)酵醪液進行同步糖化發(fā)酵具體為:將預(yù)處理 好的發(fā)酵醪液按照質(zhì)量比(g/g)為1:50-1:25添加預(yù)活化好的酵母種子液;同時按0.4AUG/g 添加糖化酶;在30-32Γ發(fā)酵10_14h，期間不斷攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為120-200r/min，保持發(fā)酵罐 攪拌槳轉(zhuǎn)速。
[0016] 進一步地，酵母種子液的活菌數(shù)大于107CFU/ml。
[0017] 進一步地，預(yù)活化好的酵母種子液通過以下方法制備得到：
[0018] a)制備酵母活化培養(yǎng)基(g/L):稱量葡萄糖5.0,酵母粉5.0,蛋白胨5.0，（NH4)2S〇4 1.5，KH2P〇4 1.5，MgS〇4.7H20 0.65，CaCl2 2·8，ρΗ 6.0,于 115°C條件下高壓蒸汽滅菌 15min， 制備得到酵母活化培養(yǎng)基；
[0019] b)菌種活化:取質(zhì)量體積百分比為1%的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于30°C 溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
[0020] 進一步地，步驟3)使用乳酸菌發(fā)酵菌劑對糖化發(fā)酵后的發(fā)酵醪液進行發(fā)酵，制備 得到川明參酵素具體為:將乳酸菌發(fā)酵菌劑培養(yǎng)好的發(fā)酵醪液加溫至37°C，接入預(yù)活化好 的乳酸菌發(fā)酵菌劑，在35-3%~繼續(xù)發(fā)酵發(fā)酵12-16h，制備得到川明參酵素;其中，乳酸菌發(fā) 酵菌劑是由腸系膜明串珠菌、胚牙乳桿菌、短乳桿菌和乳酸片球菌按照菌落總數(shù)1:1:1:1混 合而成。
[0021] 進一步地，預(yù)活化好的乳酸菌發(fā)酵菌劑的活菌數(shù)大于107CFU/ml。
[0022] 進一步地，預(yù)活化好的乳酸菌具體通過以下方法制備得到：
[0023] al)制備乳酸發(fā)酵菌劑活化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母 粉4· 0、檸檬酸銨2 · 0、KH2P〇42、乙酸鈉 5、MgS(k7H200 · 2、MnS〇4〇 · 05、吐溫80 lml、pH6 · 4，按照 常規(guī)工藝制備得到乳酸發(fā)酵菌劑活化培養(yǎng)基；
[0024] bl)菌種活化:取質(zhì)量體積百分比為1%的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于37 °C溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
[0025] 本申請還公開了一種由上述的制備方法制備得到的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明 參酵素。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請可以獲得包括以下技術(shù)效果：
[0027] 1)本發(fā)明利用川明參為主要原料，將川明參通過清洗、預(yù)煮、簡單破碎得到川明參 泥;添加液化酶分解川明參淀粉，然后滅菌消除液化酶酶活;添加糖化酶和接種酵母菌同步 糖化發(fā)酵;接入乳酸菌劑二次發(fā)酵控溫發(fā)酵，得到一種以川明參功能性成分和微生物活性 成分為特征的功能性保健酵素產(chǎn)品。通過對制得的酵素產(chǎn)品進行抗氧化活性檢測(ABTS自 由基清除能力、超氧化物自由基清除能力和DPPH自由基清除能力）和理化指標檢測（粗多 黨、總糖、還原性糖、總活菌數(shù)），證明該方法制得的飲料含有大量益生菌，具有一定的生物 活性保健功能性。
[0028] 當然，實施本申請的任一產(chǎn)品必不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。
【附圖說明】
[0029] 此處所說明的附圖用來提供對本申請的進一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，本申 請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當限定。在附圖中：
[0030] 圖1是本申請酵母發(fā)酵過程中各主要參數(shù)變化情況；
[0031]圖2是本申請發(fā)酵過程中基于ABTS自由基清除能力、超氧化物自由基清除能力和 DPPH自由基清除能力變化圖。
【具體實施方式】
[0032] 以下將配合附圖及實施例來詳細說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應(yīng)用 技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。
[0033] 本發(fā)明提供一種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，包括以下步驟： [0034] 1)制備基于川明參的發(fā)酵醪液：
[0035] 1.1)制備川明參泥:川明參原料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水預(yù)煮，破 碎成泥，即得到川明參泥，其中，川明參原料與水的固液比(g/ml)為2:1-5:1;
[0036] 1.2)將川明參泥與大豆粉或大豆蛋白粉按照質(zhì)量比（g/g)為1:0.05-0.2混合(40 目以上），按照固液比（g/ml)l :0.2-1:1添加水，在發(fā)酵罐當中預(yù)煮5-10min保持溫度90-95 °C;隨后降溫至75-85Γ按照40KNU/kg川明參泥添加液化酶(諾維信α-淀粉酶耐溫SC型），液 化至碘反應(yīng)為紅棕色；115°C滅菌15min同時使液化酶失活，制備得到基于川明參的發(fā)酵醪 液；
[0037] 2)使用糖化酶和酵母菌對發(fā)酵醪液進行同步糖化發(fā)酵：
[0038] 將預(yù)處理好的發(fā)酵醪液按照質(zhì)量比（g/g)為1:50-1: 25添加預(yù)活化好的酵母種子 液(酵母種子液活菌數(shù)應(yīng)大于l〇7CFU/ml);同時按0.4AUG/g添加糖化酶（諾維信Amylase AG300L);在30-32°C發(fā)酵10_14h(接種量與發(fā)酵時間呈反比），期間不斷攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為 120-200r/min，保持發(fā)酵罐攪拌槳轉(zhuǎn)速；
[0039] 其中，預(yù)活化好的酵母種子液通過以下方法制備得到：制備酵母活化培養(yǎng)基（g/ L):稱量葡萄糖5.0,酵母粉5.0,蛋白胨5.0，（NH4)2S〇4 1·5，ΚΗ2Ρ〇4 1.5，MgS〇4.7H20 0.65， CaCl2 2.8，pH 6.0，于115°C條件下高壓蒸汽滅菌15min，制備得到酵母活化培養(yǎng)基;取質(zhì)量 體積百分比為1%的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于30°C溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖 床轉(zhuǎn)速150r/min 〇
[0040] 3)使用乳酸菌發(fā)酵菌劑對糖化發(fā)酵后的發(fā)酵醪液進行發(fā)酵:將培養(yǎng)發(fā)酵醪液加溫 至37°C，接入預(yù)活化好的乳酸菌發(fā)酵菌劑(活菌數(shù)應(yīng)大于107CFU/ml)，在35-3%~繼續(xù)發(fā)酵 發(fā)酵12-16h，制備得到川明參酵素；其中，乳酸菌發(fā)酵菌劑是由腸系膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides XF03)、胚牙乳桿菌（Lactobacillus plantarum XF02)、短 乳桿菌(Lactobacillus brevis XF04)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici XF02) 按照菌落總數(shù)1:1:1:1混合而成。
[0041] 其中，預(yù)活化好的乳酸菌具體通過以下方法制備得到：制備乳酸發(fā)酵菌劑活化培 養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、檸檬酸銨2.0、KH 2P〇4 2.0、乙酸 鈉5.0、MgS〇4.7H20 0·2、Μη S040.05、吐溫80 lml、pH6.4,按照常規(guī)工藝制備得到乳酸發(fā)酵 菌劑活化培養(yǎng)基;取質(zhì)量體積百分比為1%的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于37°C溫度 條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
[0042] 實施例1
[0043] -種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，包括以下步驟:將川明參原 料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水預(yù)煮，破碎成泥，即得到川明參泥，其中，川明參 原料與水的質(zhì)量比（g/g)為1:1;按照質(zhì)量比（g/g)為1:0.05混合，（40目以上），按照固液比 (g/ml) 1:0.5添加水，在發(fā)酵罐當中預(yù)煮8min保持溫度92°C ;隨后降溫至80°C按照40KNU/kg 川明參泥添加液化酶（諾維信淀粉酶耐溫SC型），液化至碘反應(yīng)為紅棕色；115°C滅菌 15min同時使液化酶失活，制備得到基于川明參的發(fā)酵醪液;將預(yù)處理好的發(fā)酵醪液按照質(zhì) 量比(g/g)為1:40添加預(yù)活化好的酵母種子液(酵母種子液活菌數(shù)應(yīng)大于10 7CFU/ml);同時 按0.4AUG/g添加糖化酶(諾維信Amylase AG300L);在30°C發(fā)酵12h(接種量與發(fā)酵時間呈反 比），期間不斷攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為160r/min，保持發(fā)酵罐攪拌槳轉(zhuǎn)速;將培養(yǎng)發(fā)酵醪液加溫至 37°C，接入預(yù)活化好的乳酸菌發(fā)酵菌劑(活菌數(shù)應(yīng)大于10 7CFU/ml)，在37°C繼續(xù)發(fā)酵發(fā)酵 14h，制備得到川明參酵素；其中，乳酸菌發(fā)酵菌劑是由腸系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides XF03)、胚牙乳桿菌（Lactobacillus plantarum XF02)、短乳桿菌 (Lactobacillus brevis XF04)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici XF02)按照菌 落總數(shù)1:1:1:1混合而成。
[0044]其中，預(yù)活化好的酵母種子液通過以下方法制備得到：制備酵母活化培養(yǎng)基（g/ L):稱量葡萄糖5.0,酵母粉5.0,蛋白胨5.0，（NH4)2S〇4 1·5，ΚΗ2Ρ〇4 1.5，MgS〇4.7H20 0.65， CaCl2 2.8，pH 6.0，于115°C條件下高壓蒸汽滅菌15min，制備得到酵母活化培養(yǎng)基;取質(zhì)量 體積百分比為1%的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于30°C溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖 床轉(zhuǎn)速150r/min。預(yù)活化好的乳酸菌具體通過以下方法制備得到：制備乳酸發(fā)酵菌劑活化 培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、檸檬酸銨2.0、KH 2P〇4 2.0、乙 酸鈉 5.0、MgS〇4.7H20 0.2、Mn S040.05、吐溫80 lml、pH6.4,按照常規(guī)工藝制備得到乳酸發(fā) 酵菌劑活化培養(yǎng)基;取質(zhì)量體積百分比為1 %的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于37°C溫 度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
[0045] 實施例2
[0046] -種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，包括以下步驟:將川明參原 料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水預(yù)煮，破碎成泥，即得到川明參泥，其中，川明參 原料與水的質(zhì)量比（g/g)為1:0.5;將川明參泥與大豆粉或大豆蛋白粉按照質(zhì)量比（g/g)為 1:0.2(40目以上），按照固液比&/ 1111)1:1添加水，在發(fā)酵罐當中預(yù)煮51^11保持溫度95°(：;隨 后降溫至75°C按照40KNU/kg川明參泥添加液化酶(諾維信α-淀粉酶耐溫SC型），液化至碘反 應(yīng)為紅棕色；115°C滅菌15min同時使液化酶失活，制備得到基于川明參的發(fā)酵醪液;將預(yù)處 理好的發(fā)酵醪液按照質(zhì)量比（g/g)為1:50添加預(yù)活化好的酵母種子液(酵母種子液活菌數(shù) 應(yīng)大于l〇 7CFU/ml);同時按0.4AUG/g添加糖化酶(諾維信Amylase AG300L);在32°C發(fā)酵10h (接種量與發(fā)酵時間呈反比），期間不斷攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，保持發(fā)酵罐攪拌槳轉(zhuǎn) 速;將培養(yǎng)發(fā)酵醪液加溫至37°C，接入預(yù)活化好的乳酸菌發(fā)酵菌劑(活菌數(shù)應(yīng)大于10 7CFU/ ml)，在35°C繼續(xù)發(fā)酵發(fā)酵16h，制備得到川明參酵素;其中，乳酸菌發(fā)酵菌劑是由腸系膜明 串珠菌（Leuconostoc mesenteroides XF03)、胚牙乳桿菌（Lactobacillus plantarum XF02)、短乳桿菌（Lactobacillus brevis XF04)和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici XF02)按照菌落總數(shù)1:1:1:1混合而成。
[0047] 其中，預(yù)活化好的酵母種子液通過以下方法制備得到：制備酵母活化培養(yǎng)基（g/ L):稱量葡萄糖5.0,酵母粉5.0,蛋白胨5.0，（NH4) 2S〇4 1·5，ΚΗ2Ρ〇4 1.5，MgS〇4.7H20 0.65， CaCl2 2.8，pH 6.0，于115°C條件下高壓蒸汽滅菌15min，制備得到酵母活化培養(yǎng)基;取質(zhì)量 體積百分比為1%的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于30°C溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖 床轉(zhuǎn)速150r/min。預(yù)活化好的乳酸菌具體通過以下方法制備得到：制備乳酸發(fā)酵菌劑活化 培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、檸檬酸銨2.0、KH 2P〇4 2.0、乙 酸鈉 5.0、MgS〇4.7H20 0.2、Mn S040.05、吐溫80 lml、pH6.4,按照常規(guī)工藝制備得到乳酸發(fā) 酵菌劑活化培養(yǎng)基;取質(zhì)量體積百分比為1 %的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于37°C溫 度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
[0048] 實施例3
[0049] -種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，包括以下步驟:將川明參原 料清洗去除表面泥土后，按照一定比例加水預(yù)煮，破碎成泥，即得到川明參泥，其中，川明參 原料與水的質(zhì)量比（g/g)為1:2;將川明參泥與大豆粉或大豆蛋白粉按照質(zhì)量比（g/g)為1: 0.01混合(40目以上），按照固液比（g/ml)l:0.2添加水，在發(fā)酵罐當中預(yù)煮10min保持溫度 90°C;隨后降溫至85°C按照40KNU/kg川明參泥添加液化酶(諾維信α-淀粉酶耐溫SC型），液 化至碘反應(yīng)為紅棕色；115°C滅菌15min同時使液化酶失活，制備得到基于川明參的發(fā)酵醪 液;將預(yù)處理好的發(fā)酵醪液按照質(zhì)量比(g/g)為1:25添加預(yù)活化好的酵母種子液(酵母種子 液活菌數(shù)應(yīng)大于l〇 7CFU/ml);同時按0.4AUG/g添加糖化酶(諾維信Amylase AG300L);在30 °C發(fā)酵14h(接種量與發(fā)酵時間呈反比），期間不斷攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為120r/min，保持發(fā)酵罐 攪拌槳轉(zhuǎn)速;將培養(yǎng)發(fā)酵醪液加溫至37°C，接入預(yù)活化好的乳酸菌發(fā)酵菌劑(活菌數(shù)應(yīng)大于 10 7CFU/ml)，在39°C繼續(xù)發(fā)酵發(fā)酵12h，制備得到川明參酵素;其中，乳酸菌發(fā)酵菌劑是由腸 系膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides XF03)、胚牙乳桿菌（Lactobacillus plantarum XF02)、短乳桿菌（Lactobacillus brevis XF04)和乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici XF02)按照菌落總數(shù)1:1:1:1混合而成。
[0050] 其中，預(yù)活化好的酵母種子液通過以下方法制備得到：制備酵母活化培養(yǎng)基（g/ L):稱量葡萄糖5.0,酵母粉5.0,蛋白胨5.0，（NH4)2S〇4 1·5，ΚΗ2Ρ〇4 1.5，MgS〇4.7H20 0.65， CaCl2 2.8，pH 6.0，于115°C條件下高壓蒸汽滅菌15min，制備得到酵母活化培養(yǎng)基;取質(zhì)量 體積百分比為1%的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于30°C溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖 床轉(zhuǎn)速150r/min。預(yù)活化好的乳酸菌具體通過以下方法制備得到：制備乳酸發(fā)酵菌劑活化 培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉4.0、檸檬酸銨2.0、KH 2P〇4 2.0、乙 酸鈉5.0、MgS〇4.7H20 0.2、Mn S040.05、吐溫80 lml、pH6.4,按照常規(guī)工藝制備得到乳酸發(fā) 酵菌劑活化培養(yǎng)基;取質(zhì)量體積百分比為1 %的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于37°C溫 度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
[0051] 對比例1
[0052]株式會社LINKS市售的酵素。
[0053] 對比例2
[0054] 市售臺灣德麗斯康酵素。
[0055] 下面結(jié)合具體的實驗過程和結(jié)果來說明本發(fā)明的技術(shù)效果：
[0056] 1材料與方法
[0057] 1.1材料與儀器 [0058] 1.1.1實驗材料
[0059] 發(fā)酵主料及輔料：川明參(成熟川明參清洗后直接烘干，無硫磺熏蒸，含水量低于 15%);輔料:乳酸發(fā)酵菌劑(泡樂美-I號，市售）、安琪果酒酵母(安琪葡萄酒果酒專用酵母 RW)、焦亞硫酸鈉、檸檬酸(均為食品級）。
[0060] 待測樣品分離：在2mL EP管取少量發(fā)酵醪液在2400Xg冷凍離心機（4°C)中離心 lmin，再以孔徑為〇. 45μπι的微孔濾膜過濾發(fā)酵液，-20°c保存?zhèn)溆谩?br>[0061] 1.1.2主要儀器
[0062] YJ-875型醫(yī)用超凈工作臺、恒溫搖床培養(yǎng)箱、臺式干燥箱重慶醫(yī)療設(shè)備廠;751GW 紫外、可見分光光度計惠普上海分析儀器有限公司；JA2003電子天平上海天平儀器廠； LD5-2A離心機北京醫(yī)用離心機廠;酶標儀美國Bio-Rad公司；氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)日本島津公 司GC20，配GC-Solution 7 · 0數(shù)據(jù)分析工作站。
[0063] 1.2實驗方法
[0064] 1.2.1主要培養(yǎng)基的制作
[0065] 安琪果酒酵母活化培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，（冊4)2S〇4 1.5，KH2P04 1.5，MgS〇4.7H20 0.65，CaCl2 2·8，ρΗ 6.0，115°C條件下高壓蒸汽滅菌 15min。
[0066] 乳酸發(fā)酵菌劑活化培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基，g/L):葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、 酵母粉4.0、檸檬酸銨2.0、KH2P042、乙酸鈉5、MgS04.7H200.2、MnS040.05、吐溫80 lml、 ρΗ6·4〇
[0067] 菌種活化:取質(zhì)量體積百分比為l%(w/v)菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，搖床 培養(yǎng)16h(酵母菌30°C，乳酸菌37°C)，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。
[0068] 1.2.2工藝流程 [0069] 見實施例1
[0070] 1.2.3發(fā)酵過程中還原糖、乙醇、生物量的測定
[0071] 還原糖測定以無水葡萄糖為對照，采用略作改進的3,5_二硝基水楊酸(DNS)比色 法。具體為:吸取〇. 25~1.5mL 0.2%標準葡萄糖溶液，置于25mL容量瓶中，再加入3，5-二硝 基水楊酸溶液3mL，用蒸餾水補足至總體積5mL沸水浴中顯色5min，然后以流動水迅速冷卻， 蒸餾水定容至刻度，搖勻。以蒸餾水2mL與3，5-二硝基水楊酸溶液3mL試劑同樣操作為空白 調(diào)零，在波長540nm處比色，得到吸光度值，參照葡萄糖標準曲線，求出還原糖的量。
[0072]乙醇測定采用氣相色譜法，以正丙醇為內(nèi)標，氫火焰離子化檢測器，Agilent DB-WAX型柱(30m X 0.32mm X 0.25μπι)。具體為:進樣口溫度220°C，檢測器220 °C，柱流速1.6mL/ min;載氣為40mL/min氫氣，空氣流速400mL/min;采用分流進樣，分流比30:1，進樣量lyL;程 序升溫條件:初始溫度50 °C，保持2min，以10 °C /min升至100 °C，再以20 °C/min升至160 °C，保 持lmin;單個樣檢測時間為lOmin。
[0073] 生物量的測定:酵母發(fā)酵液經(jīng)過過濾后，稀釋20倍，利用分光度計分別測定0D600。 [0074] 1 · 2 · 4抗氧化活性能力測定
[0075]為考察川明參發(fā)酵菌液的抗氧化能力，本發(fā)明分別考察了其ABTS自由基清除能 力、超氧化物自由基清除能力和DPPH自由基清除能力的變化情況。ABTS測定，采用試劑盒法 (方法見http: //www. senbei jia. com/n jsb jsw-Products-4874682/〇貝勾自南京森貝伽生物 科技有限公司，貨號SBJ-0186) JPPH法根據(jù)文獻方法略作改進測定，具體為：取lmL用甲醇 稀釋至一定濃度的樣品，加入2mL的DPPH溶液(0.5mol/mL)，搖勾至暗處反應(yīng)20min后，于波 長517nm處測定吸光值，以清水作為對照，DPPH自由基清除率（％ ) = (Ac^toi-Asa^id/Ac^troi X 100。超氧自由基采用試劑盒方法(購自碧云天生物科技公司，產(chǎn)品標號S0116,方法見 http://www.beyotime.com/reactive-oxygen/s0116.html)〇 [0076] 2結(jié)果與分析
[0077] 2.1不同接種量對酵母發(fā)酵的影響情況
[0078] 由于酵母發(fā)酵階段采用的是同步糖化發(fā)酵(SSF)，接種量將決定于酵母的生長繁 殖速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵體系中微生物繁殖達到高峰的時間，使產(chǎn)物的形 成速度加快，并可減少雜菌的生長機會。但接種量過大過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合 成。同時，過大的接種量也有可能造成發(fā)酵高峰過早到來，與糖化步驟不相協(xié)調(diào)。而過小會 延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，因此有必要確定其最佳的接種量。
[0079] 本發(fā)明考察了初始總糖濃度260g/kg，發(fā)酵20h條件下，0.5%、1%、2%、4%、8%、 12% (w/w)預(yù)活化好的酵母種子液接種量對川明參醪液發(fā)酵過程的影響，結(jié)果如表1所示。 從表1可以看出，接種量的大小對發(fā)酵結(jié)果影響較大。當接種量為2%-8%時，各發(fā)酵參數(shù)相 差不大，而與12%和0.5%接種量的發(fā)酵參數(shù)則差異明顯。由于二次乳酸菌劑發(fā)酵需要留下 一定數(shù)量的糖，如果酵母發(fā)酵階段過強則會影響后續(xù)的乳酸發(fā)酵，對酵素生產(chǎn)造成不利影 響。
[0080] 川明參酵素產(chǎn)品的酵母發(fā)酵階段，其目的不僅是要獲得較多的優(yōu)質(zhì)酵母益生菌及 其單細胞蛋白，同時也要獲取足夠多的酵母代謝途徑中的一些關(guān)鍵酶。釀酒酵母 (S.cerevissae)在對數(shù)生長期時的葡萄糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸甘油酸激酶、稀醇 酶、丙酮酸激酶等酶都顯示了較高的表達量，而這些酶類都是包括糖酵解途徑、磷酸戊糖途 徑、三羧酸循環(huán)途徑的關(guān)鍵限制性酶類，因此選擇酵母菌對數(shù)生長期就逐漸停止其作為主 體發(fā)酵的地位，有利于酵素產(chǎn)品的生產(chǎn)。
[0081] 從發(fā)酵調(diào)控角度來看，影響后續(xù)乳酸菌劑發(fā)酵的環(huán)境因素主要是較低的pH值，高 酒精濃度和殘?zhí)菨舛燃敖M成，12.5%vol的酒精濃度就會造成乳酸菌的大量死亡，8-10% vol的乙醇濃度就會影響乳酸菌的生長。pH至低于3.2時，乳酸菌很難生長。綜合以上因素并 符合集約化生產(chǎn)原則，選擇2%的接種量不僅使酵母菌處于對數(shù)生長階段中期，殘總糖、殘 還原糖濃度和發(fā)酵pH為45.91g/kg、33.49g/kg和3.47也不至于抑制后續(xù)乳酸發(fā)酵的快速啟 動和正常進行。
[0082]表1不同接種量對發(fā)酵的影響
[0084] 2.2川明參酵素酵母發(fā)酵階段隨時間變化的情況
[0085]圖1考察了初始總糖濃度260g/kg，接種量2%情況下，18h內(nèi)不同發(fā)酵時間點川明 參醪液發(fā)酵的變化過程。從圖1中可以看出，川明參泥發(fā)酵狀況較好，發(fā)酵12h之后殘總糖、 殘還原糖、乙醇含量和生物量變化逐漸趨于緩慢。在12h內(nèi)，殘總糖和殘還原糖從發(fā)酵初期 的260g/kg和123.8g/kg快速下降至67.4g/kg和57.7g/kg，而乙醇濃度和生物量則增加到 92.1g/kg和0.86(0D600)。
[0086] 發(fā)酵液中的殘還原糖濃度存在先升高后降低的情況，發(fā)酵第4h的糖濃度達到峰值 的190. lg/kg，究其原因，是由于酵母增殖和代謝速度利用還原糖的速度低于SSF過程當中 糖化酶新釋放還原糖的速度。眾所周知，酵素的生產(chǎn)是為了獲得一定量的有益微生物及其 代謝產(chǎn)物，殘留的糖也將進一步豐富酵素的營養(yǎng)組成。因此，我們認為發(fā)酵12h不僅有利于 提高生產(chǎn)效益也保障了酵素成分的營養(yǎng)組成更加合理。隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵液中酵 母菌個數(shù)不斷增加，在18h之后增長緩慢，此時S0D活性為250.04U/g，因此將最佳發(fā)酵時間 設(shè)定為18~24h。
[0087] 本發(fā)明的酵母發(fā)酵階段采用SSF發(fā)酵工藝，即是糖化和發(fā)酵同時在同一容器中進 行，該發(fā)酵策略具有工藝簡單、設(shè)備利用效率高、能耗低、發(fā)酵迅速、底物利用度高等眾多優(yōu) 點。但是同步糖化發(fā)酵法存在糖化和發(fā)酵溫度不協(xié)調(diào)等缺點，一般來說，糖化的最適溫度高 于50°C，而酵母發(fā)酵的理想溫度約在30°C左右。在川明參酵素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，還存在二次 乳酸菌劑發(fā)酵過程，在實際生產(chǎn)過程中，可在發(fā)酵12h之后，就接種已活化完成的乳酸菌劑， 然后逐漸升高發(fā)酵液溫度，抑制乙醇發(fā)酵過程，為乳酸菌劑發(fā)酵創(chuàng)造條件。
[0088] 本發(fā)明所提供的制備方法中，整體工藝適合工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，節(jié)約生產(chǎn)設(shè)備;功能 性有效成分大部分得以保留；DPPH、ABTs自由基清除能力和超氧自由基清除能力分別為 38.39%、52· 66 %和90.14%，相比二段發(fā)酵開始階段分別上升了57.42 %、28.51 %和 11.76%。相比市售果蔬酵素和谷物酵素產(chǎn)品，本品在色澤、滋味和總活菌數(shù)上具有明顯優(yōu) 勢。在色澤方面呈白色偏黃，發(fā)酵菌液噴霧干燥后呈乳白色，市售產(chǎn)品多為黑褐色、綠色或 灰色。香氣方面呈現(xiàn)川明參特有的風味?？偦罹鷶?shù)方面本品總活菌數(shù)可達1.6X10 9CFU/ml。
[0089] 在22-30h的發(fā)酵周期內(nèi)，總糖和還原糖從發(fā)酵初期的260g/kg和123.8g/kg快速下 降至37.4g/kg和17.7g/kg，較低的糖濃度也有利于長期保存本產(chǎn)品。
[0090] 從圖2可以看出，在發(fā)酵52h內(nèi)，DPPH自由基清除能力逐漸下降，能力從12h的 28.95%下降至32h后的12.33%，在隨后的16h又逐步上升至14.5%左右。超氧自由基清除 能力的變化則較為顯著，從發(fā)酵24h的最高值90.14，降至了發(fā)酵44h的最低值34.17 %。DPPH 自由基是一個以氮為中心的脂溶性的自由基，相對于其他方法，被廣泛的運用于評價短時 間內(nèi)的抗氧化活性。DPPH自由基比羥基自由基和超氧自由基更穩(wěn)定，這使得它更有利于運 用于抗氧化性的評價。ABTs自由基清除能力則呈現(xiàn)隨發(fā)酵時間延長穩(wěn)定向上的趨勢，從乳 酸菌劑發(fā)酵初期的47.12%，上升至發(fā)酵52h的55.36%，但總體變化范圍不及DPPH自由基清 除能力和超氧自由基清除能力的變化劇烈。
[0091] ABTS法與DPPH法相似，均是基于分光光度測定反應(yīng)體系的顏色改變來確定待測液 的抗氧化活性。ABTS法和DPPH法測定柑橘、梓檬、白柚和橘子果汁的抗氧化能力變化結(jié)果基 本一致。但是，從圖2中可以看出，ABTS與DPPH法測定的抗氧化能力存在明顯相反的變化。究 其原因，ABTS法本質(zhì)是一種間接方法，是反應(yīng)發(fā)酵液清除ABTS+自由基的能力，與真實的氧 化分解過程沒有關(guān)系，ABTS+的氧化還原電勢為0.68V，也就是說只要某化合物的氧化還原 電勢低于〇. 68V就能將ABTS+還原，出現(xiàn)顏色變化，進而出現(xiàn)ABTS自由基清除能力。川明參酵 素發(fā)酵醪液是一個復(fù)雜體系，其中有大量物質(zhì)的氧化還原電勢均低于0.68V，均可將ABTS+ 還原，因此存在測量結(jié)果不穩(wěn)定的情況。
[0092]在發(fā)明川明參酵素天然發(fā)酵過程中抗氧化能力變化的過程中DPPH自由基清除能 力、超氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力呈逐漸增加趨勢，發(fā)酵前后分別提高了 3.6%，5.7 %和16.5%。在冬棗酵素發(fā)酵過程中隨著生物量的增加，還原力、羥自由基清除 率和S0D酶活力均不斷升高。結(jié)合圖2發(fā)明結(jié)果表明，應(yīng)當適當控制發(fā)酵時間，乳酸菌劑發(fā)酵 階段的時間控制在12h即可，此時的DPPH、ABTs自由基清除能力和超氧自由基清除能力分別 為38.39%、52.66%和90.14%，相比二段發(fā)酵開始階段分別下降57.42%和上升28.51%、 11.76%〇
[0093] 2.4川明參酵素發(fā)酵結(jié)果驗證與感官評定分析
[0094] 經(jīng)過前期實驗優(yōu)化，川明參經(jīng)過清洗、蒸煮、液化酶解、滅菌、同步糖化酵母發(fā)酵 (12h)、乳酸菌劑發(fā)酵12h后，活菌數(shù)可達10 8-109CFU/ml，殘還原糖濃度低于20g/kg，殘總糖 濃度大于35g/kg，不僅保留了一定的川明參多糖和微生物胞外多糖營養(yǎng)成分，也降低了微 生物污染的風險。
[0095] 由于酵素產(chǎn)品目前國內(nèi)沒有感官評定的相關(guān)標準可供執(zhí)行，本發(fā)明依據(jù)"GB/T 29605感官分析食品感官質(zhì)量控制導(dǎo)則"和"GB/T 29604-2013感官分析建立感官特性參比 樣的一般導(dǎo)則"，參考"GB/T 15038葡萄酒、果酒通用分析方法"、"GB/T 10789飲料通則"和 "GB/T 29602固體飲料"統(tǒng)計了30人的感官評定結(jié)果。表2是本發(fā)酵產(chǎn)品經(jīng)過噴霧干燥后與 市售臺灣某果蔬酵素產(chǎn)品A和日本谷物酵素產(chǎn)品B的感官分析與關(guān)鍵指標比較。
[0096]結(jié)果表明：本產(chǎn)品在色澤、滋味和總活菌數(shù)上具有明顯優(yōu)勢。在色澤方面，由于川 明參本身顏色呈白色偏黃，發(fā)酵菌液噴霧干燥后呈乳白色，而產(chǎn)品A呈現(xiàn)淡綠色，產(chǎn)品B呈灰 色。但是香氣方面不及產(chǎn)品A和B，本品呈現(xiàn)一定的中藥味?？偦罹鷶?shù)方面本品總活菌數(shù)可達 1.6 X 109CFU/ml，相對于產(chǎn)品A和B具有明顯優(yōu)勢。
[0097]表2發(fā)酵成品酵素的分析結(jié)果
[0099] 3結(jié)論
[0100] 本發(fā)明通過對川明參的兩段發(fā)酵生產(chǎn)川明參酵素產(chǎn)品，得到優(yōu)化有的發(fā)酵工藝 為:總發(fā)酵時間為24h，其中初段酵母發(fā)酵時間為12h，酵母接種量的2%，此時的殘總糖濃度 為67 · 4g/kg，乙醇濃度為92 · 1 g/kg，殘還原糖濃度為57 · 7g/kg，生物量0D600為0 · 86;之后接 種乳酸發(fā)酵菌劑，繼續(xù)發(fā)酵10-14小時即可，發(fā)酵24h的DPPH、ABTs自由基清除能力和超氧自 由基清除能力分別為18.39 %、52.66 %和90.14%，相比二段發(fā)酵開始階段分別下降 57.42%和上升 28.51 % 11.76%。
[0101 ]對比例1和對比例2中的產(chǎn)品呈黑紫色，滋味酸澀微甜，總活菌數(shù)在108CFU/ml，相 比對比例1和對比例2中的產(chǎn)品，本品在色澤、滋味和總活菌數(shù)上具有明顯優(yōu)勢，可達1.6X 109CFU/ml，呈現(xiàn)一定的中藥味，本發(fā)明為進一步開發(fā)川明參精深加工產(chǎn)品提供了一條可行 途徑。
[0102]上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當理解發(fā)明并非 局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改 和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行 改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán) 利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 制備基于川明參的發(fā)酵醪液； 2) 使用糖化酶和酵母菌對發(fā)酵醪液進行同步糖化發(fā)酵； 3) 使用乳酸菌發(fā)酵菌劑對糖化發(fā)酵后的發(fā)酵醪液進行發(fā)酵，制備得到川明參酵素。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，其特征在于， 所述步驟1)中的制備基于川明參的發(fā)酵醪液具體為： 1.1) 制備川明參泥:川明參原料清洗去除表面泥土后，按照固液比（g/ml)2:1-5:1加水 預(yù)煮，破碎成泥，即得到川明參泥； 1.2) 將川明參泥與大豆粉或大豆蛋白粉按照質(zhì)量比（g/g)為1:0.05-1:0.2混合，按照 固液比（g/ml)l:0.2-l添加水，在發(fā)酵罐當中預(yù)煮5-10min保持溫度90-95Γ;隨后降溫至 75-85 °C按照40KNU/kg j I丨明參泥添加液化酶，液化至碘反應(yīng)為紅棕色；115 °C滅菌15min同時 使液化酶失活，制備得到基于川明參的發(fā)酵醪液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，其特征在于， 所述大豆粉或大豆蛋白粉的目數(shù)為40目以上。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，其特征在于， 所述步驟2)中使用酵母菌對發(fā)酵醪液進行同步糖化發(fā)酵具體為:將預(yù)處理好的發(fā)酵醪液按 照質(zhì)量比（g/g)為1: 50-1: 25添加預(yù)活化好的酵母種子液；同時按0.4AUG/g添加糖化酶;在 30-32°C發(fā)酵10_14h，期間不斷攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速為120-200r/min，保持發(fā)酵罐攪拌槳轉(zhuǎn)速。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，其特征在于， 所述酵母種子液的活菌數(shù)大于l〇7CFU/ml。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，其特征在于， 所述預(yù)活化好的酵母種子液通過以下方法制備得到： a) 制備酵母活化培養(yǎng)基(g/L):稱量葡萄糖5.0，酵母粉5.0，蛋白胨5.0，（NH4)2S〇4 1.5， KH2PO4 1.5，MgS〇4.7H20 0.65，CaCl2 2·8，ρΗ 6.0,于 115°C條件下高壓蒸汽滅菌 15min，制備 得到酵母活化培養(yǎng)基； b) 菌種活化:取質(zhì)量體積百分比為1%的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于30°C溫度 條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，其特征在于， 所述步驟3)使用乳酸菌發(fā)酵菌劑對糖化發(fā)酵后的發(fā)酵醪液進行發(fā)酵，制備得到川明參酵素 具體為:將乳酸菌發(fā)酵菌劑培養(yǎng)好的發(fā)酵醪液加溫至37°C，接入預(yù)活化好的乳酸菌發(fā)酵菌 劑，在35-3%~繼續(xù)發(fā)酵發(fā)酵12-16h，制備得到川明參酵素;其中，乳酸菌發(fā)酵菌劑是由腸系 膜明串珠菌、胚牙乳桿菌、短乳桿菌和乳酸片球菌按照菌落總數(shù)1:1:1:1混合而成。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，其特征在于， 所述預(yù)活化好的乳酸菌發(fā)酵菌劑的活菌數(shù)大于l〇 7CFU/ml。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于復(fù)合菌分段發(fā)酵的川明參酵素的制備方法，其特征在于， 所述預(yù)活化好的乳酸菌具體通過以下方法制備得到： al)制備乳酸發(fā)酵菌劑活化培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖20.0、蛋白胨10、牛肉膏5.0、酵母粉 4.0、檸檬酸銨2·0、ΚΗ2Ρ〇4 2.0、乙酸鈉5.0、MgS〇4.7H20 0.2、Mn S040.05、吐溫80 lml、 pH6.4，按照常規(guī)工藝制備得到乳酸發(fā)酵菌劑活化培養(yǎng)基； bl)菌種活化:取質(zhì)量體積百分比為1 %的菌粉至預(yù)先配制的活化培養(yǎng)基中，于37°C溫 度條件下?lián)u床培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min。10. -種由權(quán)利要求1至9中任一權(quán)利要求所述的制備方法制備得到的基于復(fù)合菌分段 發(fā)酵的川明參酵素。
【文檔編號】A23L2/38GK105831737SQ201610184302
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】張良, 趙紅宇, 徐煒楨, 李玉鋒, 賴朋
【申請人】西華大學