用于乳凝膠流變特性的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及乳品技術(shù)領(lǐng)域，特別地，其涉及用于評估酸化乳凝膠(乳凝膠)的流變特性的方法，包括確定剪切應力、凝膠硬度和持水量。該方法可用于快速可靠地確定酸化乳例如酸乳酪和新鮮乳酪的流變特性。本發(fā)明還涉及篩選產(chǎn)生具有期望流變特性的發(fā)酵乳之微生物培養(yǎng)物的方法。通過使用在每個吸移管的排氣筒內(nèi)裝配有壓力傳感器的自動化微量滴定板吸移平臺，可以在吸取和分配乳凝膠時實時監(jiān)測壓力變化，然后將所得壓力相對于時間數(shù)據(jù)與乳凝膠流變特性例如剪切應力、凝膠硬度和持水量相關(guān)聯(lián)。
【專利說明】
用于乳凝膠流變特性的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及乳品技術(shù)領(lǐng)域，特別地，其涉及用于評估酸化乳凝膠(乳凝膠）的流變 特性的方法，包括確定剪切應力、凝膠硬度和持水量。
[0002] 該方法可用于快速可靠地確定酸化乳例如酸乳酪和新鮮乳酪的流變特性。本發(fā)明 還涉及篩選產(chǎn)生具有期望流變特性的發(fā)酵乳之微生物培養(yǎng)物的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 乳凝膠是一種軟固體。其網(wǎng)絡(luò)為易于發(fā)生結(jié)構(gòu)重排的相對動態(tài)的體系。乳凝膠的 物理特性可采用酪蛋白相互作用模型來描述，所述酪蛋白相互作用包括吸引力與排斥力之 間的平衡。吸引力可以是例如疏水相互作用、來源于磷酸鈣納米團簇的酪蛋白交聯(lián)和酪蛋 白與變性乳清蛋白之間的共價二硫化交聯(lián)。排斥力可以是例如靜電排斥或電荷排斥，在發(fā) 酵開始時大多數(shù)為負。
[0004] 乳凝膠例如酸乳酪通過用由嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus)和德氏 乳酸桿菌亞種保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii subsp·bulgaricus)的混合 物組成的細菌培養(yǎng)物使乳發(fā)酵來制備。細菌發(fā)酵將乳糖及其他糖轉(zhuǎn)化為乳酸，這降低乳的 pH。在乳的酸化期間，pH從約6.7降至<4.6,導致乳凝膠形成。該酸化過程導致形成由酪蛋 白簇和鏈組成的三維網(wǎng)絡(luò)。主要有兩種類型:凝固型酸乳酪(set yogurt)和攪拌型酸乳酪。 凝固型酸乳酪形成在零售罐(retail pot)中，因為乳酸菌將乳糖及其他糖發(fā)酵成乳酸，在 消費者容器中呈現(xiàn)連續(xù)凝膠結(jié)構(gòu)。對于攪拌型酸乳酪，通過攪拌來攪亂(disrupt)在大型發(fā) 酵器中孵育期間形成的酸化乳凝膠，經(jīng)攪拌產(chǎn)物通常經(jīng)栗和管轉(zhuǎn)移至緩沖器和冷卻器。
[0005] 食品流變學研究食材的變形和流動。酸乳酪可歸類為假塑性物質(zhì)（含流動起始所 必需超出的屈服應力），其可為粘彈性流體(攪拌型酸乳酪或飲用型酸乳酪)或粘彈性固體 (凝固型酸乳酪）。粘彈性表示該物質(zhì)具有理想固體的一些彈性特性和理想(粘性)液體的一 些流動特性(Lee和Lucey，2010)。通常使用流變儀和/或質(zhì)構(gòu)分析儀來評估酸乳酪的流變特 性，例如復數(shù)模量和剪切應力。大變形流變特性是重要的，這是因為大多數(shù)產(chǎn)品為攪拌型， 其中初始凝膠被剪切和攪拌。一種類型的大變形測試為應力過沖實驗或恒定剪切速率測 試。感官質(zhì)構(gòu)屬性常常與大變形儀器測試的結(jié)果相關(guān)聯(lián)，例如剪切應力與粘度相關(guān)，復數(shù)模 量與凝膠硬度相關(guān)。收集關(guān)于酸化乳的流變特性之數(shù)據(jù)的能力為乳品生產(chǎn)商提供重要的 "產(chǎn)品維度"。關(guān)于流變性質(zhì)（物質(zhì)流動）的知識對于預測可栗性和可傾倒性、在浸漬 (dipping)或涂覆操作中的性能或其可處理、加工或使用的容易度有價值。
[0006] 酸乳酪的物理屬性，包括缺乏可視乳清分離和感知粘度，是酸乳酪的質(zhì)量和消費 者總體感官接受度的重要方面。由于這些原因，對剪切應力、凝膠硬度和乳清分離的測量通 常是生產(chǎn)/加工及遞送發(fā)酵乳品用于進一步用途的幾乎所用領(lǐng)域中所采用質(zhì)量控制的整體 部分。
[0007] 質(zhì)構(gòu)是發(fā)酵乳品例如酸乳酪的重要質(zhì)量因素，而消費者接受度常常與質(zhì)構(gòu)特性非 常緊密地相關(guān)。酸乳酪質(zhì)構(gòu)隨加工參數(shù)而變化，并且尤其受對細菌培養(yǎng)物的選擇影響。質(zhì)構(gòu) 可通過感官分析（由接受過培訓人員小組進行)或通過提供關(guān)于產(chǎn)品的流動行為和粘性/彈 性之信息的流變學方法來描述。在用乳酸菌(LAB)進行的乳發(fā)酵中，乳糖及其他糖被轉(zhuǎn)化為 乳酸，導致pH降低，隨后酪蛋白膠束及其他乳蛋白質(zhì)聚集。將乳的pH降低至pH4.6導致酪蛋 白顆粒中和(損失電荷），這隨后導致酪蛋白顆粒聚集，最終導致增加的粘度和凝膠形成。凝 膠可通過例如復數(shù)模量（與感官描述詞凝膠硬度相關(guān)）和剪切應力（與感官描述詞口稠度 (mouth thickness)相關(guān))來表征。由于由LAB酸化導致的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化及LAB導致的 胞外多糖(EPS)的產(chǎn)生，不同發(fā)酵乳品的質(zhì)構(gòu)顯著不同。
[0008] 對質(zhì)構(gòu)的感官評價通常作為完整感官譜分析的一部分實施，所述全部感官分析在 一項分析中提供關(guān)于酸乳酪的氣味(odor)、風味(flavor)、味道(taste)和質(zhì)構(gòu)的信息。酸 乳酪的重要質(zhì)構(gòu)特性為凝膠硬度、口稠度和粘稠度(ropiness)。
[0009] 凝膠硬度:通過將一匙酸乳酪緩慢置于未觸動過的酸乳酪表面并評價其在流出前 保持結(jié)構(gòu)多長時間來進行視覺評價一一時間越長，凝膠硬度越高。
[0010] 口稠度:在以"正常高"食用速率食用酸乳酪時評價一一吞下酸乳酪所花費的時間 越長，口稠度越高。
[0011] 粘稠度:通過將一匙酸乳酪拉起并評價多長的線(繩狀物(rope))掛在匙上來進行 視覺評價一一繩狀物越長，粘稠度越高。
[0012] 對于凝固型酸乳酪，凝膠硬度和口稠度是最重要的參數(shù)，而對于攪拌型酸乳酪，口 稠度和粘稠度是關(guān)鍵參數(shù)。一般而言，粘稠酸乳酪更為乳脂狀、更滑(顆粒較少）、更稠且硬 度較低。乳脂狀常常與高粘稠度相關(guān)。感官質(zhì)構(gòu)屬性常常與大變形儀器測試結(jié)果相關(guān)聯(lián)，例 如，剪切應力與粘度相關(guān)，復數(shù)模量與凝膠硬度相關(guān)。乳凝膠的持水量是凝固型酸乳酪和新 鮮乳酪的重要質(zhì)量參數(shù)。
[0013] 用于描述發(fā)酵乳流變性質(zhì)的常用流變技術(shù)是粘度測定法，其中測量抗剪切力。該 測量在流變儀上實施，可在廣泛范圍的剪切速率下得到流動特性，提供完整的粘度測定表 征。剪切應力（由平行于物體表面作用的力而產(chǎn)生的變形)作為剪切速率(應變改變速率)的 函數(shù)測量，得到流動曲線。更多信息可獲自通過增加剪切應力并隨后將其降低得到的雙流 動曲線(參照Mezger，2006中的圖1)。向上流動曲線與向下流動曲線之間的環(huán)形區(qū)域稱為滯 后，描述酸乳酪在變形后恢復結(jié)構(gòu)的能力。表觀粘度可計算為剪切應力除以剪切速率。對于 牛頓流體，例如水，剪切應力和剪切速率簡單地成比例，因此，粘度恒定。然而，許多食物產(chǎn) 品例如酸乳酪剪切變稀，意味著提高剪切速率導致剪切應力小于比例增加。因此，這些產(chǎn)品 的粘度必須表示為指定剪切速率下的多個表觀粘度。
[0014]在振蕩測量中，使取自發(fā)酵乳產(chǎn)品的樣品經(jīng)歷振蕩運動(正弦應力）。該方法是非 破壞性的，并且以非常小的變形實施。因此，得到了操作(例如在口中）之前的酸乳酪起始硬 度的信息。被測量的參數(shù)是儲能模量G'（表示彈性性能）和損耗模量G"（表示粘性特性）。由 此可計算出復數(shù)模量G*，其為總凝膠硬度的量度。
[0015]乳中脂肪和蛋白質(zhì)減少通常與發(fā)酵乳品的許多質(zhì)構(gòu)和功能缺陷相關(guān)。一些產(chǎn)品例 如酸乳酪和乳酪可示出自發(fā)脫水收縮作用，其中在發(fā)酵期間在產(chǎn)品表面上形成乳清層。該 乳清層可在冷卻期間被吸收。一些產(chǎn)EPS或其他聚合物的微生物培養(yǎng)物能夠通過結(jié)合水/乳 清從而增加水含量來增加乳凝膠的持水量。這是一個重要功能，因為脂肪和蛋白質(zhì)減少導 致脫脂物質(zhì)中較少的水分。乳清分離(脫乳清)被定義為從網(wǎng)絡(luò)中除去乳清，其隨后變得作 為表面乳清可見。脫乳清不利地影響酸乳酪的消費者認知，因而酸乳酪生產(chǎn)商使用穩(wěn)定劑 (例如，果膠、明膠、淀粉)或增加乳的總固體含量，尤其是蛋白質(zhì)含量來防止脫乳清。自發(fā)脫 水收縮作用是未施加任何外力(例如，離心）的凝膠收縮，其為乳清分離的常見原因。自發(fā)乳 清分離與不穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)相關(guān)，其可以是由于凝膠基質(zhì)重排的增加或者其可以由對弱凝膠網(wǎng) 絡(luò)的破壞(例如，通過振動或切割）引起。從發(fā)酵乳產(chǎn)品去除乳清或脫水縮合作用通過采用 離心、經(jīng)篩或網(wǎng)眼對乳清去水或者利用虹吸法來測量。離心法測量作為高的外力之結(jié)果的 持水量，即，凝膠對壓縮的抵抗。
[0016] 標準流變測量要求較大的待測發(fā)酵乳樣品。雖然這些測量方法精確且可重復，但 是它們對每個樣品所需時間、技術(shù)技能和精確度有高要求。用于測量粘度的現(xiàn)有設(shè)備對于 每個樣品花費約20分鐘，并且對于所有這樣的設(shè)備，無論是自動機械實施該過程還是半自 動地或手動地，常見的是一次可測試僅一個樣品。這些測量非常耗時，這是由于各個樣品間 的清洗和更換步驟使其難以用于高通量篩選。
[0017] 在許多吸移應用中，為了各種目的在自動吸移過程期間進行壓力監(jiān)測，例如為了 丟棄不規(guī)律吸移過程(102002073215 ;他11^1切118〇11&(11^46)，或者為了提供對吸移過程的 完全自動控制（EP1614468;Hamilton Bonaduz AG)〇
[0018] W02011107472(Novozymes)中描述了通過測量兩個或更多個樣品的粘度隨時間的 變化得到的液體中的酶活性。
[0019] 需要用于確定在一種或更多種菌株的存在下制備的乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度 和/或持水量和用于篩選能夠有助于剪切應力、凝膠硬度和/或持水量的菌株的改進方法。 本發(fā)明利用乳凝膠的吸移壓力曲線測量，使得能夠進行小樣品體積乳凝膠流變特性的快速 確定，從而給出菌株改進乳凝膠質(zhì)構(gòu)的潛能的提示。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 在食品工業(yè)，如所提及的，乳凝膠的流變性質(zhì)是重要的質(zhì)量參數(shù)。在乳的發(fā)酵中， 常常向乳中添加乳酸菌或其他細菌以提供具有期望口味及質(zhì)構(gòu)的產(chǎn)品，以延長乳的保質(zhì) 期。篩選提供具有特定和期望質(zhì)構(gòu)的產(chǎn)品的微生物因現(xiàn)有粘度測量方法的缺點而耗時且耗 力。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法對確定乳凝膠的流變性質(zhì)特別有用。特別地，該方法還可用于 確定乳凝膠的一些流變性質(zhì)，包括剪切應力、凝膠硬度和持水量。
[0021] 在一個方面，本發(fā)明提供了用于確定乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度和持水量中至 少之一的方法，所述方法包括：
[0022] (i)提供一個或更多個樣品，每一個均包含樣品容器和樣品，其中至少一個樣品是 所述乳凝膠；
[0023] (ii)在步驟（i)所述樣品的吸取和/或分配期間測量頂部空間壓力以得到壓力相 對于時間數(shù)據(jù);和
[0024] (iii)由步驟（ii)的壓力相對于時間數(shù)據(jù)確定所述乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度 和持水量中至少之一；
[0025]其中在步驟(iii)中通過將所述壓力相對于時間數(shù)據(jù)與剪切應力相關(guān)聯(lián)來確定所 述剪切應力；在步驟（iii)中通過將由非混合樣品或離心樣品得到的吸取曲線上的最小壓 力與復數(shù)模量相關(guān)聯(lián)來確定所述凝膠硬度；以及在步驟（iii)中通過將由非混合樣品或離 心樣品得到的吸取曲線上的拐彎時間點(bend-time-point)與持水量相關(guān)聯(lián)來確定所述持 水量。
[0026]本發(fā)明使得可以在使用96孔微型容器例如微量滴定板時，通過高通量篩選在發(fā)酵 乳中選擇具有期望質(zhì)構(gòu)特性的最佳菌株，例如在少于60秒內(nèi)同時測量96個不同樣品，所述 質(zhì)構(gòu)特性包括剪切應力、凝膠硬度和持水量。通過使用在每個吸移管的排氣筒（air displacement barrel)內(nèi)裝配有壓力傳感器的自動化微量滴定板吸移平臺（pipetting station)(來自Hamilton Robotics TADM系統(tǒng)，描述于EP2009449和US6938504中），可以監(jiān) 測吸取和分配乳凝膠時壓力的實時變化，然后將所得壓力相對于時間數(shù)據(jù)與乳凝膠流變特 性例如剪切應力、凝膠硬度和持水量相關(guān)聯(lián)。壓力監(jiān)測通過TADM(總吸取和分配監(jiān)測）工具 進行，其為上述液體處理自動機械中的任選裝置。
[0027] 最近指出化?2009449;他11^1切118〇1^(11^46)，液體的表面張力和粘度越大，則液 體開始流入吸移管尖端時吸移管尖端內(nèi)的壓力越低，并且活塞移動而尚未發(fā)生任何液體流 動時壓力的時間性質(zhì)斜率的絕對值越大。作為另一一般規(guī)則，指出液體的粘度越大，活塞移 動已停止但液體流動仍繼續(xù)時壓力的時間性質(zhì)斜率一般越小。然而，結(jié)論是所有這些一般 規(guī)則更為定性，因此，盡管他們似乎相當直觀，但在準備使用吸移裝置給出具有不同物理性 質(zhì)的液體時，卻難以對它們進行定量評估以計算待用工藝變量的差異。
[0028]用于確定乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度和持水量中至少之一的方法可以不同的操 作模式實現(xiàn)。在一個實施方案中，本發(fā)明方法用于確定剪切應力。在另一實施方案中，該方 法用于確定凝膠硬度。在另一實施方案中，本發(fā)明方法用于確定剪切應力和凝膠硬度二者。 在另一實施方案中，本發(fā)明方法用于確定持水量。
[0029]因此，根據(jù)具體樣品及期望定量的粘性，相應地進行樣品操作和計算。
[0030]使用液體處理自動機械使得能夠?qū)悠愤M行統(tǒng)一處理，還使得可以對低體積樣品 快速起效。本發(fā)明方法使得可以自動處理許多樣品，適用于針對若干流變特性一一剪切應 力、凝膠硬度和持水量(脫乳清)一一;決速、可靠且可重復地對乳凝膠進行高通量篩選。
[0031] 質(zhì)構(gòu)極其重要，尤其是對于低脂和低蛋白質(zhì)產(chǎn)品，其可通過使用產(chǎn)EPS培養(yǎng)物改 進，以補償脂肪和蛋白質(zhì)損失。在產(chǎn)生產(chǎn)高EPS培養(yǎng)物的開發(fā)過程中，所見粘度增加是遞增 的，這突出了對精確測量的需要以區(qū)分和確定最佳候選物。本發(fā)明方法可區(qū)分粘度相近的 乳凝膠例如酸乳酪，還可在乳酪制備期間使用，如W02008153387中所述（Nizo Food Research B.V.)〇
[0032] 本發(fā)明在確定、預測或選擇對于產(chǎn)生具有期望質(zhì)量的發(fā)酵乳產(chǎn)品（例如酸乳酪或 乳酪)最佳的微生物例如細菌或這樣的微生物的混合物非常有用。特別地，基于本發(fā)明方法 可鑒定出產(chǎn)生具有非期望特性(例如極稠、非均勻粘度等)的發(fā)酵乳的微生物(例如細菌)及 其混合物。
[0033] 因此，在第二方面，本發(fā)明提供了根據(jù)微生物有助于在所述微生物存在下制備的 乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度和/或持水量的能力對所述微生物進行分級的方法：
[0034] (i)提供在至少一種微生物的存在下制備的乳凝膠的兩個或更多個樣品，每一個 均包含樣品容器和樣品；
[0035] (ii)在步驟（i)所述兩個或更多個樣品的吸取和/或分配期間測量頂部空間壓力 以得到壓力相對于時間數(shù)據(jù);和
[0036] (iii)根據(jù)在所述至少一種微生物的存在下制備的乳凝膠的相對壓力相對于時間 數(shù)據(jù)對所述微生物進行分級；
[0037] 其中
[0038]剪切應力a)與吸取曲線上的壓力相對于時間數(shù)據(jù)成反比，并且b)與分配曲線上的 壓力相對于時間成正比；
[0039] 凝膠硬度與由非混合樣品或離心樣品得到的吸取曲線上的最小壓力成反比；和
[0040] 持水量與由非混合樣品或離心樣品得到的吸取曲線上的拐彎時間點成反比。
[0041] 在第三方面，本發(fā)明提供了用于確定乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度和持水量中至 少之一的設(shè)備，所述設(shè)備包含在吸移管頂部空間裝配有壓力傳感器的自動化吸移系統(tǒng)和在 所述方法的步驟(ii)期間調(diào)度樣品操作和記錄壓力相對于時間測量結(jié)果的軟件控制系統(tǒng)。
[0042] 本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點將由以下描述及權(quán)利要求而顯而易見。
【附圖說明】
[0043] 圖1:具有不同粘度的5種商業(yè)酸乳酪培養(yǎng)物隨時間[ms]推移測量的分配壓力。
[0044] 圖2:具有不同粘度的5種商業(yè)酸乳酪培養(yǎng)物隨時間[ms]推移測量的吸取壓力。
[0045] 圖3:相對于通過吸移于6秒監(jiān)測的分配壓力繪出的用流變儀測量的300^1時剪切 應力。
[0046]圖4:相對于通過吸移于13秒監(jiān)測的吸取壓力繪出的用流變儀測量的300(1時剪切 應力。
[0047] 圖5:剪切應力不同的單株乳酸桿菌的兩個重兩個重復樣品品的吸取曲線。
[0048] 圖6:剪切應力不同的6種低脂酸乳酪的兩個重兩個重復樣品品的吸取曲線。
[0049]圖7:剪切應力不同的6種低脂酸乳酪的兩個重兩個重復樣品品在吸取期間的壓力 變化速率。
[0050] 圖8:剪切應力不同的6種低脂酸乳酪的兩個重復樣品的分配曲線。
[0051] 圖9:剪切應力不同的6種低脂酸乳酪的兩個重復樣品在分配期間的壓力變化速 率。
[0052] 圖10:用回歸模型得到的剪切應力預測值(橫軸)相對于觀察值(縱軸）。
[0053] 圖11:用回歸模型得到的復數(shù)模量預測值(橫軸)相對于觀察值(縱軸）。
[0054]圖12:通過在微量滴定板(每孔lm)中直接發(fā)酵乳制備用于篩選目的的乳凝膠樣品 的吸取壓力與大規(guī)模(奶瓶，200ml)用于乳發(fā)酵的相同微生物培養(yǎng)物的剪切應力值之間的 相關(guān)性。A.通過用14種不同乳球菌(Lactococcus)菌株直接在微量滴定板（lml)中于30°C發(fā) 酵乳20小時制備的并然后于4°C儲存1天的乳凝膠樣品的TADM吸取曲線。吸取500μ1的體積。 Β.(Α)的14個樣品于1秒的吸取壓力值與使用由相同培養(yǎng)物以200ml規(guī)模制備的乳凝膠樣品 于流變計上測量的300JT 1時剪切應力之間的相關(guān)性，其中接種樣品然后孵育12至15小時直 至其達到pH 4.55。
[0055]圖13:使用TADM在96孔板中篩選乳球菌菌株。A.通過兩個重復示出的微量滴定板 中96個樣品的TADM吸取和分配曲線。通過用多至96個乳球菌(Lactococcus)菌株直接在微 量滴定板（lml)中于30°C發(fā)酵乳20小時制備乳凝膠樣品，然后于4°C儲存1天。吸取500μ1的 體積。Β.將來自兩個重復的每種樣品于1秒和1.2秒的吸取壓力值求平均值，根據(jù)壓力值分 級(從最低到最高)并繪圖。來自（A)的菌株1(在板上作為高剪切應力對照出現(xiàn)兩次)和菌株 2出現(xiàn)在(B)的標度下段，而乳樣品和未酸化乳的菌株出現(xiàn)在較高壓力標度(僅示出一個代 表性樣品）。在現(xiàn)有測量條件下，已酸化乳但未導致高粘度乳凝膠的大多數(shù)菌株位于約-2000至-2500Pa。
[0056]圖14:使用TADM分析乳凝膠的持水量。A.方法構(gòu)思?；跍y量用三種不同嗜熱鏈球 菌(Streptococcus thermophilus)菌株發(fā)酵的乳中乳清相長度和TADM曲線拐彎的時間點 來計算相關(guān)系數(shù)R，每個菌株作16個重復。B.通過用三種不同菌株發(fā)酵乳得到的乳凝膠的 TADM曲線，使用未發(fā)酵乳作為對照。吸取700μ1的體積。
[0057]圖15:Α.通過用單株嗜熱鏈球菌于96孔微量滴定板發(fā)酵乳得到的乳凝膠TADM曲 線。B.導致具有高至中度復數(shù)模量(G*)值(與凝膠硬度相關(guān))之乳凝膠的來自（A)的所選樣 品。吸取500μ1的體積。TADM曲線標記有相應樣品的G*值。
【具體實施方式】
[0058] 在第一方面，本發(fā)明提供了用于確定乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度和持水量中至 少之一的方法，所述方法包括：
[0059] (i)提供一個或更多個樣品，每一個均包含樣品容器和樣品，其中至少一個樣品是 所述乳凝膠；
[0060] (ii)在步驟（i)所述樣品的吸取和/或分配期間測量頂部空間壓力以得到壓力相 對于時間數(shù)據(jù);和
[0061] (iii)由步驟（ii)的壓力相對于所選時間數(shù)據(jù)確定所述乳凝膠的剪切應力、凝膠 硬度和持水量中至少之一；
[0062] 其中在步驟(iii)中通過將所述壓力相對于時間數(shù)據(jù)與剪切應力相關(guān)聯(lián)來確定所 述剪切應力；在步驟（iii)中通過將由非混合樣品或離心樣品得到的吸取曲線上的最小壓 力與復數(shù)模量相關(guān)聯(lián)來確定所述凝膠硬度；以及在步驟（iii)中通過將由非混合樣品或離 心樣品得到的吸取曲線上的拐彎時間點與持水量相關(guān)聯(lián)來確定乳凝膠的所述持水量。
[0063] 術(shù)語"乳"意在指可根據(jù)本發(fā)明方法進行發(fā)酵的任何原料乳和/或經(jīng)加工乳物質(zhì)。 因此，可用乳基質(zhì)包括但不限于任何乳或乳樣產(chǎn)品的溶液/混懸液，例如全脂乳或低脂乳、 脫脂乳、酪乳、復原乳粉、煉乳、奶粉、乳清、乳清滲透物、乳糖、乳清蛋白濃縮物或奶油。乳基 質(zhì)可來源于任何哺乳動物(例如牛、羊或豬)或復原乳粉。乳還包括來自可用乳酸菌發(fā)酵以 提供乳凝膠的具有相似外觀的植物物質(zhì)。在另一實施方案中，原料選自低至高脂乳和低至 高蛋白質(zhì)乳。在另一實施方案中，原料是由雌性哺乳動物的乳腺分泌的乳。
[0064] 本文所用術(shù)語"乳凝膠"意在指任何具有高或低質(zhì)構(gòu)的酸化乳凝膠及其混合物，其 用酸化劑例如微生物酸化，具有在乳例如乳產(chǎn)品例如發(fā)酵乳產(chǎn)品（例如，酸乳酪、酪乳或酸 奶油）、乳酪(例如，新鮮乳酪）中進行發(fā)酵的至少一種微生物(例如細菌、酵母或霉菌）。
[0065] 本文所用術(shù)語"酸化劑"意在指固體、流體或液體形式的任何試劑，其在施用于(微 量)容器后能夠降低容器中的pH(與添加酸化劑前容器中的pH相比），所述酸化劑例如微生 物或酸。在另一實施方案中，所述酸化劑選自微生物，所述微生物選自細菌，例如乳酸菌。
[0066] 在一個實施方案中，本發(fā)明方法用于確定剪切應力、凝膠硬度和持水量。
[0067] 在另一實施方案中，樣品中至少有一些被吸取和/或分配多于一個吸取和/或分配 循環(huán)。
[0068] 在另一實施方案中，所述乳凝膠包含多于一個相，例如液相和軟固相。
[0069] 在另一實施方案中，在第一吸取和/或分配循環(huán)后第二吸取和/或分配循環(huán)前混合 樣品，例如通過反復吸取和/或分配，或者通過引入樣品容器的混合裝置。
[0070] 在另一實施方案中，對于至少一種樣品，基本上全部樣品體積在步驟（ii)中被吸 取和/或分配。
[0071 ] 在另一實施方案中，每個所述樣品的體積小于lml、小于0.75ml、約0.5ml或約 0.35ml〇
[0072] 在另一實施方案中，樣品中至少有一些被吸取和分配多于一個吸取和/或分配循 環(huán)。
[0073] 在另一實施方案中，乳凝膠是發(fā)酵乳品。在另一實施方案中，乳凝膠是酸乳酪、酪 乳、酸奶油或新鮮乳酪。在另一實施方案中，乳凝膠是酸乳酪。
[0074]如實施例1和4所示，乳凝膠的剪切應力與吸取曲線上所選時間點的頂部空間壓力 成反比，并且與分配曲線上所選時間的頂部空間壓力成正比。因此，可通過選擇吸取或分配 曲線(取決于吸取/分配速度和體積)上的時間點和使用通過流變計測量結(jié)果編制的模型將 該時間點的頂部空間壓力與剪切應力相關(guān)聯(lián)來確定剪切應力。
[0075]因此，在另一實施方案中，在步驟(iii)中通過將所選時間點測量的頂部空間壓力 與剪切應力相關(guān)聯(lián)來確定乳凝膠的所述剪切應力。
[0076]如所示，在實施例3中，剪切應力與TADM壓力曲線特征之間的線性回歸模型具有非 常高的預測能力。
[0077]在又一實施方案中，通過吸取獲得壓力相對于時間數(shù)據(jù)。
[0078]在另一實施方案中，通過分配獲得壓力相對于時間數(shù)據(jù)。
[0079] 在又一實施方案中，通過吸取和分配二者獲得壓力相對于時間數(shù)據(jù)。
[0080] 在又一實施方案中，用于步驟(ii)的裝置是在每個吸移管的排氣筒內(nèi)裝配有壓力 傳感器的自動化吸移平臺。通常而言，該裝置是Hamilton Robotics MicroLab Star。
[0081] 在另一實施方案中，所確定的流變特性選自復數(shù)模量和剪切應力中的一種或更多 種。通常而言，所確定的流變特性選自復數(shù)模量和剪切應力。
[0082] 對于乳凝膠質(zhì)構(gòu)特性的高通量測量，通常直接在微量容器中發(fā)酵乳，并于恒定溫 度例如4°C下于4°C儲存1至30天，所述微量容器通常是96孔微量滴定板或384孔微量滴定 板。約1個月的長時間儲存會導致一些樣品的自發(fā)乳清分離，其可利用本發(fā)明方法測量為乳 凝膠的持水量。其他樣品在乳發(fā)酵期間將顯示已出現(xiàn)的乳清分離。或者，為了避免在能夠分 析持水量之前的長時間儲存，對微量滴定板中的樣品施加外力例如離心以加速乳清分離。 輕柔離心（例如，500xg，5至10分鐘)通常將引起乳清分離，但離心條件可能不同，這取決于 乳凝膠特性和乳內(nèi)容物。例如，由具較低量脂肪和蛋白質(zhì)的乳制成的乳凝膠網(wǎng)絡(luò)會比由具 較高量脂肪和蛋白質(zhì)的乳制成的乳凝膠弱。添加到乳中的穩(wěn)定劑例如果膠將穩(wěn)定乳凝膠網(wǎng) 絡(luò)，并且其因而需要更猛烈的離心(更快的加速度，更長的時間）以增加脫乳清。過于猛烈的 離心會對凝膠網(wǎng)絡(luò)造成如此大的損失以至于所有乳凝膠樣品將得到類似的乳清相長度，無 論用于發(fā)酵乳的菌株為何。
[0083]在另一實施方案中，所述樣品容器是多孔板中的一個孔。
[0084] 在一個實施方案中，步驟(ii)中樣品的吸取和/或分配來自吸移管。
[0085] 在另一實施方案中，所述吸移管尖端在剛好低于樣品的表面處吸取樣品，使得吸 取速率匹配吸移管尖端垂直移動入樣品內(nèi)的速度。
[0086] 在另一實施方案中，在步驟（ii)的至少一個吸取和/或分配循環(huán)期間的所述測量 之前對樣品中的至少一些進行離心。
[0087] 在又一實施方案中，使所述樣品在尚未離心的情況下進行步驟(ii)中的第一吸取 和/或分配循環(huán)，離心所述樣品，然后對其進行步驟(ii)中的進一步的吸取和/或分配循環(huán)。
[0088] 在另一實施方案中，至少一種樣品是標準品。
[0089] 在另一實施方案中，在60秒內(nèi)、30秒內(nèi)或5秒內(nèi)對每個樣品完成步驟(i i)的一次或 更多次吸取和/或分配循環(huán)而不進行任何離心。
[0090] 如果在自發(fā)乳清分離發(fā)生前確定尚未于4°C儲存多于一天的樣品的持水量，該方 法由以下步驟組成：（i)對含發(fā)酵乳的微量滴定板離心。由于離心，形成了兩個相:水樣的 (乳清)和粘性的/固體；（ii)具有傳導吸移管尖端的96孔自動機械頭部進入管(96個樣品同 時)并采用液面檢測尋找樣品表面。如果使用非傳導性吸移管尖端，則有必要限定距離管底 部的距離，在此處96孔頭部將開始吸取樣品；（iii)一旦所述尖端感受到樣品表面，其開始 吸取樣品同時緩慢向下移動入管，首先進入乳清相然后進入粘性/固相。同時記錄TADM; (iv)記錄TADM曲線拐彎的時間點，其表示從乳清相到固相的轉(zhuǎn)變，然后將該時間點與乳清 相長度相關(guān)聯(lián)。較短的時間表示較小的乳清相長度及因而較高的持水量(圖15)。
[0091] 為了確定乳凝膠樣品（通常在a)于4°C儲存或b)離心后于96孔微量滴定板中）的持 水量、剪切應力和凝膠硬度，對該板進行一個或若干個后續(xù)吸取和/或分配步驟，同時記錄 TADM。在第一吸取循環(huán)期間，TADM壓力曲線以繪圖表示，其中縱軸上為壓力(Pa)，橫軸上為 時間（毫秒）。具V樣曲線的樣品通常具有高凝膠硬度（圖15)。將對具有V形樣曲線的每個樣 品所觀察到的最低壓力與具中至高凝膠硬度的乳凝膠之凝膠硬度相關(guān)聯(lián)。對于具有低凝膠 硬度但較高剪切應力的樣品而言，該關(guān)聯(lián)不顯著，因為這些壓力曲線使V形松散，這使得難 以進行凝膠硬度測量。然而，因為可以利用該方法分辨出具高凝膠硬度至中度凝膠硬度的 樣品，所以其為篩選具有高凝膠硬度的菌株的良好工具。
[0092] 在通過將吸移管尖端緩慢移動進樣品同時吸取的第一輪吸取期間一一此時存在 兩個相(水相和固相），于非混合樣品中確定持水量，并記錄TADM壓力曲線拐彎時的時間點， 該時間點表示固相的開始(參見圖14)。
[0093] 所述發(fā)酵乳凝膠可含有一種微生物，或若干種不同的微生物。
[0094] 所述發(fā)酵乳凝膠可以是兩種或更多種乳凝膠的混合物，或者可以將其他添加劑與 乳混合，所述添加劑例如穩(wěn)定劑、凝膠形成劑、蛋白質(zhì)例如脫脂乳粉、淀粉、碳水化合物。
[0095] 在另一些實施方案中，當從乳凝膠吸取和/或分配樣品時，其通常在短時間區(qū)間內(nèi) 完成，例如用96通道吸移頭，96個樣品可以在幾秒內(nèi)檢測。標準流變測量要求每個樣品20分 鐘，因此，96個樣品需要32小時。
[0096] 因此，當采用本發(fā)明方法確定流變性質(zhì)時，可分析顯著增加數(shù)目的樣品，因而可對 用于產(chǎn)生乳凝膠的相當高數(shù)量的乳組合物和微生物進行分析、歸類和選擇。
[0097] 在又一些實施方案中，當從乳凝膠吸取和/或分配樣品時，這樣的樣品通常選自 100微升(μL)至10毫升(ml)的體積。通常而言，當乳凝膠是酸乳酪時，吸取和/或分配的樣品 選自100μΙ至lml的體積。
[0098]從乳凝膠吸取和/或分配樣品在一定溫度區(qū)間內(nèi)且在一定壓力下完成，所述溫度 區(qū)間和壓力可根據(jù)待測試乳凝膠而不同。乳凝膠通常儲存在低溫下，例如4°C至13°C，但通 過TADM進行的壓力測量通常在室溫下進行，例如20°C。
[0099] 如果所述乳凝膠是酸乳酪，則在4 °C至30°C的溫度區(qū)間內(nèi)從液體中吸取和/或分配 樣品，優(yōu)選地在4°C至18°C的溫度區(qū)間內(nèi)，以約latm的環(huán)境大氣壓力。
[0100]因為乳凝膠的剪切應力與吸取曲線上的壓力相對于時間數(shù)據(jù)成反比，與分配曲線 上的壓力相對于時間數(shù)據(jù)成正比（乳凝膠的剪切應力與吸取曲線上所選時間點（取決于吸 取速度和體積）的頂部空間壓力成反比，與分配曲線上所選時間點（取決于分配速度和體 積)的頂部空間壓力成正比），所以乳凝膠的凝膠硬度與獲自非混合樣品或離心樣品的吸取 曲線上的最小壓力成反比，乳凝膠的持水量與獲自非混合樣品或離心樣品的吸取曲線上的 拐彎時間點成反比(參見本文中的實施例），乳凝膠樣品的剪切應力、凝膠硬度和/或持水量 可容易地通過比較乳凝膠樣品的相對壓力相對于時間數(shù)據(jù)來進行比較。
[0101] 在第二方面，本發(fā)明提供了用于根據(jù)微生物有助于在所述微生物存在下制備的乳 凝膠的剪切應力、凝膠硬度和/或持水量的能力對所述微生物進行分級的方法：
[0102] (i)提供在至少一種微生物的存在下制備的乳凝膠的兩個或更多個樣品，每一個 均包含樣品容器和樣品；
[0103] (ii)在步驟（i)所述兩個或更多個樣品的吸取和/或分配期間測量頂部空間壓力 以得到壓力相對于時間數(shù)據(jù);和
[0104] (iii)根據(jù)在所述至少一種微生物的存在下制備的乳凝膠的相對壓力相對于時間 數(shù)據(jù)對所述微生物進行分級，
[0105] 其中剪切應力a)與吸取曲線上的壓力相對于時間數(shù)據(jù)成反比，并且b)與分配曲線 上的壓力相對于時間數(shù)據(jù)成正比;凝膠硬度與由非混合樣品或離心樣品得到的吸取曲線上 的最小壓力成反比；以及持水量與由非混合樣品或離心樣品得到的吸取曲線上的拐彎時間 點成反比。
[0106] 當本發(fā)明方法用于確定或預測哪些微生物例如細菌或者所述微生物的混合物適 于產(chǎn)生發(fā)酵乳(例如酸乳酪)時，它是非常有用的，所述微生物或這樣的微生物的混合物帶 來期望的剪切應力、凝膠硬度和持水量，從而為發(fā)酵乳產(chǎn)品帶來期望的質(zhì)量。特別地，可鑒 定出導致具有非期望特性的乳凝膠的微生物(例如細菌)及其混合物，所述非期望特性例如 較低或較高的粘度、較低或較高的凝膠硬度或者較低或較高的持水量。
[0107] 在另一實施方案中，用于根據(jù)微生物有助于在所述微生物存在下制備的乳凝膠的 剪切應力、凝膠硬度或持水量的能力對所述微生物進行分級的方法還包括步驟（iv):如果 所述至少一種微生物有助于在所述至少一種微生物的存在下制備的乳凝膠之相對高剪切 應力、相對高凝膠硬度和/或相對高持水量，則選擇所述至少一種微生物。
[0108] 在另一實施方案中，用于根據(jù)微生物有助于在所述微生物存在下制備的乳凝膠的 剪切應力、凝膠硬度或持水量的能力對所述微生物進行分級的方法還包括步驟（iv):如果 所述至少一種微生物有助于在所述至少一種微生物的存在下制備的乳凝膠之相對低剪切 應力、相對低凝膠硬度和/或相對低持水量，則選擇所述至少一種微生物。
[0109] 在另一實施方案中，所述樣品中至少有一些被吸取和/或分配多于一個吸取和/或 分配循環(huán)。
[0110] 在另一實施方案中，所述乳凝膠包含多于一個相，例如液相和軟固相。
[0111] 在另一實施方案中，在第一吸取和/或分配循環(huán)后第二吸取和/或分配循環(huán)前混合 樣品，例如通過反復吸取和/或分配，或者通過引入樣品容器的混合裝置。
[0112] 在另一實施方案中，對于至少一個樣品，基本上全部樣品體積在步驟（ii)中被吸 取和/或分配。
[0113] 在另一實施方案中，每個所述樣品的體積小于lml、小于0.75ml、約0.5ml或約 0.35ml〇
[0114] 在另一實施方案中，樣品中至少有一些被吸取和/或分配多于一個吸取和/或分配 循環(huán)。
[0115] 在另一實施方案中，乳凝膠是發(fā)酵乳品。在另一實施方案中，乳凝膠是酸乳酪、酪 乳、酸奶油或新鮮乳酪。在另一實施方案中，乳凝膠是酸乳酪。
[0116] 在又一實施方案中，通過吸取獲得所述壓力相對于時間數(shù)據(jù)。
[0117] 在另一實施方案中，通過分配獲得所述壓力相對于時間數(shù)據(jù)。
[0118] 在又一實施方案中，通過吸取和分配二者獲得所述壓力相對于時間數(shù)據(jù)。
[0119] 在另一實施方案中，用于步驟(ii)的裝置是在每個吸移管的排氣筒內(nèi)裝配有壓力 傳感器的自動化吸移平臺。通常而言，該裝置是Hamilton Robotics MicroLab Star。
[0120] 在另一實施方案中，所述樣品容器是多孔板中的一個孔。
[0121] 在一個實施方案中，步驟(ii)中樣品的吸取和/或分配來自吸移管。
[0122] 在另一實施方案中，所述吸移管的尖端在剛好低于樣品的表面處吸取樣品，使得 吸取速率匹配吸移管尖端垂直移動入樣品內(nèi)的速度。
[0123] 在另一實施方案中，在步驟（ii)的至少一個吸取和/或分配循環(huán)期間的所述測量 之前離心樣品中的至少一些。
[0124] 在又一實施方案中，使所述樣品在尚未離心的情況下進行步驟(ii)中的第一吸取 和/或分配循環(huán)，離心所述樣品，然后對其進行步驟(ii)中的進一步的吸取和/或分配循環(huán)。
[0125] 在另一實施方案中，至少一個樣品是標準品。
[0126] 在另一實施方案中，在60秒、30秒或5秒內(nèi)對每個樣品完成步驟(ii)的一個或更多 個吸取和/或分配循環(huán)而不進行任何離心。
[0127] 所述發(fā)酵乳凝膠可含有一種微生物，或若干種不同的微生物。
[0128] 所述發(fā)酵乳凝膠可以是兩種或更多種乳凝膠的混合物，或者可以將其他添加劑與 乳混合，例如穩(wěn)定劑、凝膠形成劑、蛋白質(zhì)例如脫脂乳粉、淀粉、碳水化合物。
[0129] 在另一些實施方案中，當從乳凝膠吸取和/或分配樣品時，其通常在短時間區(qū)間內(nèi) 完成，例如用96通道吸移頭，96個樣品可以在幾秒內(nèi)檢測。標準流變測量要求每個樣品20分 鐘，因此，96個樣品需要32小時。
[0130] 在又一些實施方案中，當從乳凝膠吸取和/或分配樣品時，這樣的樣品通常選自 100微升(μL)至10毫升(ml)的體積。通常而言，當乳凝膠是酸乳酪時，吸取和/或分配的樣品 選自100μΙ至lml的體積。
[0131] 當從乳凝膠吸取和/或分配樣品時，其在一定溫度區(qū)間內(nèi)且在一定壓力下進行，所 述溫度區(qū)間和壓力可根據(jù)待測試乳凝膠而不同。乳凝膠通常儲存在低溫下，例如4°C至13 °C，但通過TADM進行的壓力測量通常在室溫下進行，例如20°C。
[0132] 如果所述乳凝膠是酸乳酪，則在4 °C至30°C的溫度區(qū)間內(nèi)從液體中吸取和/或分配 樣品，優(yōu)選地在4°C至18°C的溫度區(qū)間，以約latm的環(huán)境大氣壓力。
[0133] 此外，本發(fā)明對篩選適于用于獲得乳凝膠的特定流變特性的微生物(例如細菌)或 這樣的微生物的混合物非常有用。
[0134] 因此，該確定剪切應力的方法還可視為通過如本文所述確定剪切應力來確定乳凝 膠的質(zhì)量的方法。
[0135] 乳凝膠可以在裝有各乳凝膠樣品的具有1、2或多至384個容器的樣品容器中進行 測量，且單位面積可能有甚至更高的孔密度。在另一實施方案中，高通量篩選在微量容器中 進行，例如在具有至少1個、8個例如至少24個、例如至少48個、例如至少96個、例如至少384 個孔的微量滴定板中進行。通常而言，高通量篩選在具有96個孔的微量滴定板中進行。
[0136] 在上述監(jiān)測方法中使用的微生物通常選自乳酸菌、酵母、霉菌，所述乳酸菌例如乳 球菌（Lactococcus)、乳桿菌（Lactobacillus)、鏈球菌（Streptococcus)、明串珠菌 (Leuconostoc)、片球菌（Pediococcus)、雙歧桿菌（Bifidobacterium )、芽抱桿菌 (Bacillus)、酒球菌（Oenococcus);所述酵母例如酵母菌（Saccharomyces)、畢赤酵母 (卩；[(311丨&)、克魯維酵母(1(1115^61'01115^68)、假絲酵母(0&11(1丨(1&)和地絲菌(6601：1'；[。1111111);所述 霉菌例如曲霉(Aspergillus)和青霉(PeniciIlium) 0
[0137] 本文所用術(shù)語"TADM"意在指總吸取和分配監(jiān)測，即樣品吸取和分配期間對壓力的 測量。
[0138] 本文所用術(shù)語"添加劑"意在指用于影響乳凝膠的流變性和持水量的待測試的任 何合適的添加劑。這樣的添加劑可以是待與乳混合的一種添加劑或者兩種或更多種添加劑 的混合物，例如但不限于穩(wěn)定劑、凝膠形成劑、蛋白質(zhì)例如脫脂乳粉、淀粉、碳水化合物和水 膠體。
[0139] 與確定乳凝膠的流變特性例如剪切應力、凝膠硬度和持水量的方法相關(guān)的上述所 有實施方案也適用于該監(jiān)測乳凝膠剪切應力變化的方法。
[0140] 本文所引用的所有參考文獻包括出版物、專利申請和專利均以引用方式并入本 文，其程度就如同每篇參考文獻個別地且明確地指明以引用方式并入并且在本文中以其整 體給出一樣。
[0141] 本文所用所有標題和小標題僅為了方便起見并且不應解釋為以任何方式限制本 發(fā)明。
[0142] 除非在本文中另有指明或者與上下文明顯矛盾，否則上述要素所有可能變化形式 的任何組合均由本發(fā)明涵蓋。
[0143] 除非本文中另有指明，否則本文述及的范圍值僅旨在作為單獨提及落入該范圍內(nèi) 的每個單獨的值的簡捷方法，并且每個單獨的值均并入說明書中，如同其在本文中單獨引 用一樣。除非另有說明，否則本文中提供的所有確切值代表相應的近似值(例如，針對特定 因素或測量結(jié)果提供的所有示例性確切值均可視為還提供相應的近似測量結(jié)果，在適當時 用術(shù)語"約"修飾）。
[0144] 本文所述的所有方法均可以任何合適的順序進行，在本文中另有指明或者與上下 文明顯矛盾除外。
[0145] 在描述本發(fā)明的上下文中使用的"a/an"和"所述"及類似指稱均應理解為涵蓋單 數(shù)和復數(shù)，本文中另有指明或者上下文明顯矛盾除外。因此，"a/an"和"所述"可以指至少一 或者一或更多。
[0146] 本文提供的任意和全部實施例或示例性語言(例如，"例如"）的使用僅旨在更好地 闡明本發(fā)明而不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制，另有指明除外。說明中的語言均不應理解為表 示任一要素對實踐本發(fā)明必不可少，除非同樣明確地陳述。
[0147] 本文中專利文獻的引用和并入僅為了方便起見，并不反映該專利文獻的任何有效 性、可取得專利性、和/或可實施性。
[0148] 本文中在提及一個或更多個要素時使用術(shù)語例如"包含"、"具有"、"包括"或"含 有"對本發(fā)明的任意方面或?qū)嵤┓桨高M行的描述旨在為"由該特定的一個或更多個要素組 成"、"基本上由該特定的一個或更多個要素組成"或"主要包含該特定的一個或更多個要 素"的本發(fā)明類似方面或?qū)嵤┓桨柑峁┲С郑舷挛闹辛碛兄该骰蛎黠@矛盾除外（例如，本 文所述包含特定要素的組合物應理解為還描述由該要素組成的組合物，上下文另有指明或 者明顯矛盾除外）。
[0149] 本發(fā)明在適用的法律所允許的最大程度上包括在本文所示各個方面或權(quán)利要求 中引用的主題的所有修改和等同形式。
[0150]以上描述中公開的特征可單獨地及以其任意組合為用于以其多種形式實現(xiàn)本發(fā) 明的材料。
[0151] 實施例
[0152] 本文描述和要求保護的本發(fā)明不限于本文所公開的特定方面的范圍，因為這些方 面旨在作為本發(fā)明若干方面的說明。任何等同方面旨在落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實上，對于 本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，除本文示出和描述的那些之外的本發(fā)明多種修改將通過以上描述而 顯而易見。這些修改也旨在落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在存在矛盾的情況下，以本公開內(nèi) 容(包括定義)為準。
[0153] 用于吸移的設(shè)備
[0154] 在以下實驗中使用裝配有TADM工具的液體處理平臺Hamilton Robotics MicroLab Star〇
[0155] 所述Hamilton Robotics MicroLab Star具有4、8、12或16個吸移通道及96孔頭， 其基于排氣技術(shù)構(gòu)建，與手持電子吸移管相似。每個通道可吸取多至lml的體積，并且對于 一些吸移通道而言，多至5ml。為了在不同體積范圍內(nèi)吸移，96孔頭可適應體積為10、50、300 至lOOOyl的一系列尖立而。
[0156] 該液體處理器具有位于每個吸移通道的頂部空間的壓力傳感器。通過在計算機上 運行的合適的軟件收集來自每個傳感器的壓力數(shù)據(jù)，例如，通過Hamilton Robotics MicroLab Star液體處理器(Hamilton Robotics)的"總吸取分配監(jiān)測"（TADM)軟件。
[0157] 實施例1 一商業(yè)酸乳酪培養(yǎng)物
[0158] 乳的發(fā)酵
[0159] 使用酸乳酪培養(yǎng)物的冷凍濃縮物接種添加有2%脫脂乳粉的脫脂乳。將該乳于90 °C加熱20分鐘，然后用0.02 %冷凍濃縮物接種。孵育在43 °C發(fā)生直至pH達到4.55，此時發(fā)生 乳的凝固。隨后，利用后處理單元(PTU)向酸乳酪施加2巴的后處理。然后將發(fā)酵乳冷卻至5 Γ。
[0160] 發(fā)酵乳的流變學測量
[0161] 流變學:孵育次日，使發(fā)酵乳達到13°C，并用裝配有穿孔盤的棍狀物輕柔攪拌直至 樣品均勾。在流變計上評估樣品的流變特性(Anton Paar Physica Rheometer with ASC, Automatic Sample Changer，Anton'Paar5CGmbH,Austria) 〇設(shè)置如下：
[0162] 等待時間（為了重建至幾分原始結(jié)構(gòu)）
[0163] 5分鐘，不進行振蕩或旋轉(zhuǎn)
[0164] 振蕩（為了測量G'和G"以計算G*)
[0165] =0.3%，頻率(f) = [0.5 …8]Hz [0166] 經(jīng)60秒6個測量點(每10秒一個）
[0167] 旋轉(zhuǎn)(為了測量300 Ι/s時的剪切應力）
[0168] =[0·3-300]Ι/s和=[275-0·3]1/s
[0169] 經(jīng)210秒21個測量點(每10秒一個），升至300 1/s。
[0170] 和
[0171] 經(jīng)210秒21個測量點(每10秒一個），降至0.3 1/s。
[0172]選擇300 Ι/s時的剪切應力進行進一步分析。
[0173]樣品還由經(jīng)培訓感官評審小組評價，其中按照前述通過將一匙酸乳酪緩慢置于未 觸動過的酸乳酪表面上并評價在流出前保持其結(jié)構(gòu)多久一一時間越長，凝膠硬度越高一一 來視覺評價凝膠硬度、口稠度和粘稠度。
[0174]吸移:均勻攪拌用質(zhì)構(gòu)特性不同的培養(yǎng)物制備的發(fā)酵乳以在將樣品轉(zhuǎn)移至測試管 前獲得均勻性。每管只進行一次吸取和分配，因為酸乳酪的結(jié)構(gòu)將在尖端進入時發(fā)生變化。 以20μ 1 /秒的速率吸取500μ 1的體積并以50μ 1 /秒分配，實時記錄壓力變化。
[0175] 結(jié)果和結(jié)論
[0176] 用目前在乳品業(yè)使用且具有不同剪切應力的酸乳酪培養(yǎng)物濃縮物孵育的發(fā)酵乳 可通過常規(guī)流變計測試和通過吸移下監(jiān)測的吸取和/或分配壓力二者來明顯區(qū)分(參見圖1 和2)。此外，在流變計上測量的300JT 1時的剪切應力(Pa)與分配壓力(Pa)之間的關(guān)聯(lián)示出相 關(guān)系數(shù)為〇 · 92(參見圖3)。在流變計上測量的300(1時的剪切應力(Pa)與13秒時的吸取壓力 之間的關(guān)聯(lián)示出相關(guān)系數(shù)為0.95(參見圖4)。
[0177] 實施例2-單株乳酸桿菌
[0178] 乳的發(fā)酵
[0179] 將剪切應力不同的兩株乳酸桿菌在MRS肉湯中于37°C培養(yǎng)過夜。在干物質(zhì)含量為 9.5%且在分批工藝中以15分鐘熱處理至99°C的復原乳中按照1%v/v接種該菌株，一式兩 份。在37°C進行孵育直至pH達到4.55,此時乳發(fā)生凝固。輕柔攪拌發(fā)酵乳至均勻，冷卻至5 °C，次日轉(zhuǎn)移至燒杯。
[0180] 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的確定
[0181] 吸移:均勻攪拌用質(zhì)構(gòu)特性不同的培養(yǎng)物制備的發(fā)酵乳以在將樣品轉(zhuǎn)移至測試管 前獲得均勻性。每管只進行一次吸取和分配，以20μ1/秒的速度吸取500μ1的體積并以50μ1/ 秒分配，實時記錄壓力變化。
[0182] 結(jié)果和結(jié)論
[0183] 用具有不同流變特性的單株乳酸桿菌孵育的發(fā)酵乳可通過在吸移期間監(jiān)測到的 吸取壓力明顯地區(qū)分(參見圖5)。
[0184] 實施例3-低脂酸乳酪質(zhì)構(gòu)的分析
[0185] 低脂酸乳酪
[0186] 使用酸乳酪培養(yǎng)物的冷凍濃縮物接種添加有2%脫脂乳粉的脫脂乳(0.1%脂肪）。 將該乳于90°C加熱20分鐘，然后用0.02 %冷凍濃縮物接種。孵育在43°C發(fā)生直至pH達到 4.55,此時發(fā)生乳的凝固。隨后，利用后處理單元(PTU)向酸乳酪施加2巴的后處理。然后，將 發(fā)酵乳冷卻至5 °C。
[0187] 低脂酸乳酪的流變學測量
[0188] 流變學:孵育次日，使酸乳酪達到13°C，并用裝配有穿孔盤的棍狀物輕柔攪拌直至 樣品均勾。在流變計上評估樣品的流變特性(Anton Paar Physica Rheometer with ASC, Automatic Sample Changer,AntonPaar?GmbH,Austria)。設(shè)置如下：
[0189] 等待時間（為了重建至幾分原始結(jié)構(gòu)）
[0190] 5分鐘，不進行振蕩或旋轉(zhuǎn)
[0191] 振蕩（為了測量G'和G"以計算G*)
[0192] =0.3%，頻率(f) = [0.5 …8]Hz [0193] 經(jīng)60秒6個測量點(每10秒一個）
[0194] 旋轉(zhuǎn)(為了測量300 Ι/s時的剪切應力）
[0195] = [0 · 3-300] Ι/s和=[275-0 · 3] 1/s
[0196] 經(jīng)210秒21個測量點(每10秒一個），升至3001/s。
[0197] 和
[0198] 經(jīng)210秒21個測量點(每10秒一個），降至0 · 31 /s。
[0199]選擇3001/s時的剪切應力進行進一步分析。
[0200] 吸移:將按照上述制備的低脂酸乳酪轉(zhuǎn)移至測試管。每管只進行一次吸取和分配， 因為酸乳酪的結(jié)構(gòu)將在尖端進入時發(fā)生變化。吸取500μ1的體積（25μ1/秒)并分配(65μ1/ 秒），實時記錄壓力變化。
[0201] 壓力曲線特征提?。?br>[0202] 獲自6種不同低脂酸乳酪(一式兩份)的吸取和分配曲線可見于圖6和圖8。
[0203]選擇壓力曲線特征的不同方法代替固定的任意時間點。根據(jù)壓力曲線（圖6)計算 壓力變化速率(圖7和9)。然后，如下所述評估最大速率及獲得該速率的時間：
[0204]
[0205] 最大吸取速率=最大(吸取速率）
[0206] 吸出tmax = t(最大吸出速率）
[0207]
[0208] 最大分配速率=最大(分配速率）
[0209] 分配tmax = t (最大分配速率）
[0210] 這些描述詞(特征）用于偏最小二乘法分析(參見下述和圖10至12)。尤其對于分配 曲線，在分配結(jié)束時發(fā)生時間偏移。這被稱為下降(drop-off)，并且將其用作變量（以毫秒 計）（參見圖1和圖8)。
[0211]結(jié)果和討論
[0212]用目前乳品業(yè)中使用的酸乳酪培養(yǎng)物濃縮物孵育的并且具有不同流變特性的低 脂攪拌型酸乳酪可以通過常規(guī)流變計測試和通過在吸移下監(jiān)測吸取和/或分配壓力二者明 顯區(qū)分(參見圖6和8)。
[0213]此外，使用從這些曲線提取的特征構(gòu)建偏最小二乘（PLS) (Wold, Svante ;Ruhe， Axel ;Wold,Herman;Dunn，W.J. (1984) .SIAM J.Sci.Stat.Comp.5(3) :735-743)模型。這些 模型檢查這些特征與300 1/s時的剪切應力和1Hz時的復數(shù)模量之流變計結(jié)果的線性回歸 關(guān)系。
[0214]通過 Umetrics 用 SB1CA 13.0 構(gòu)建模型。
[0215]使用來自壓力曲線的計算特征作為X變量(潛在的），使用流變計參數(shù)作為Y(參考） 變量。
[0216]然后建立X變量與Y變量之間的線性回歸模型，并針對每個X變量計算線性回歸系 數(shù)。
[0217]在下表中針對所得模型描述(R2)和預測(Q2)的能力對所得模型進行了描述：
[0218]
[0219] RMSEE(估值的均方根誤差)表示觀察結(jié)果至模型的擬合。RMSEcv是類似量度，但采 用交叉驗證(排除樣品）步驟評估并反映預測誤差。它們示出模型的精確度。"剪切應力"的 模型誤差在合理范圍內(nèi)（<10% )，而"復數(shù)模量"（G*)的預測不那么精確（11.5%)。該不精 確是由于參考方法(流變計)>20 %的偏差，尤其在低水平G* (〈50)時。
[0220]此外，通過利用吸移壓力特征在流變計上測量的300 l/s(Pa)時的剪切應力的預 測能力示出相關(guān)系數(shù)為0.97(參見圖10)。通過吸移特征得到的復數(shù)模量的相應預測模型示 出相關(guān)系數(shù)為0.924(參見圖11)。
[0221 ]實施例4 一針對質(zhì)構(gòu)化LAB菌株的高通量篩選 [0222]乳的發(fā)酵
[0223]用不同的乳球菌菌株接種含具有1 %乳糖和1 %葡萄糖之M17肉湯的96孔微量滴定 板并在Galaxy R C02孵育器(RS Biotech)中于30°C孵育過夜。用不同的嗜熱鏈球菌菌株接 種含具有2%乳糖之M17肉湯的另一96孔微量滴定板并在Galaxy R C02孵育器中于37°C孵 育過夜。利用Hami 1 ton自動機械使用來自含添加劑之M17肉湯的1 %過夜培養(yǎng)物接種含乳和 pH指示劑的96孔微量滴定板，并于30°C孵育乳球菌菌株20小時及于43°C孵育鏈球菌菌株18 小時。利用pH指示劑進行的pH確定確定大多數(shù)樣品的pH低于5.0。所述板作兩次重復。將含 酸化乳的板在4°C儲存1天。
[0224]使用所選乳球菌和鏈球菌菌株接種200mL體積的乳，用于通過流變計進行流變分 析。在干物質(zhì)含量為9.5%且在分批工藝中以15分鐘熱處理至99°C的復原乳中按照1%v/v 接種該菌株，一式兩份。對于乳球菌孵育發(fā)生在30°C，對于鏈球菌孵育發(fā)生在43°C直至pH達 到4.55,此時乳發(fā)生凝固。輕柔攪拌發(fā)酵乳樣品至均勻，冷卻至4°C，5日后于4°C轉(zhuǎn)移至燒 杯。
[0225] 發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的分析
[0226] 乳酸化并在4 °C儲存1天后，利用Hamilton自動機械對微量滴定板進行TADM壓力分 析（圖12A，13A)。使用大口徑尖端吸取500μ1的體積(350yl/s)。對來自兩個重復的每種樣品 1秒及1.2秒時的吸取壓力值求均值、根據(jù)壓力值分類(最低至最高)并繪圖（圖13Β)。
[0227] 利用流變計（具有自動樣品更換器ASC的Anton Paar Physica Rheometer,Anton Paaif GmbH，Austria)來評估樣品的流變特性，采用實施例1中的設(shè)置。選擇剪切速率300s 4時的剪切應力分析來將獲自流變計與TADM分析的流變性質(zhì)相關(guān)聯(lián)(圖12B)。
[0228] 結(jié)果與結(jié)論
[0229] 通過在微量滴定板中使用不同的單一菌株進行乳酸化并通過TADM分析所得乳凝 膠的質(zhì)構(gòu)化特性，可以選擇導致高粘度乳凝膠（圖13)的菌株和具有高凝膠硬度的乳凝膠 (圖 15)。
[0230]在圖13上，高剪切應力候選菌株--來自圖13A的菌株1 (在板上作為高剪切應力 對照出現(xiàn)兩次)和菌株2-一二者出現(xiàn)在圖13B的標度下段，而乳樣品和未酸化乳的菌株出 現(xiàn)在較高壓力標度(僅示出一個代表性樣品）。使乳酸化但未導致高粘度乳凝膠的大多數(shù)菌 株在現(xiàn)有測量條件下位于約_2000Pa至-2500Pa。
[0231] 因而，TADM壓力分析是用于篩選能夠?qū)е戮哂衅谕髯兲匦灾槟z的微生物的 合適工具。
[0232] 實施例5-乳凝膠持水量的確定
[0233] 乳凝膠例如凝固型酸乳酪和/或新鮮乳酪的持水量是期望的特征。
[0234] 為了在96孔微量滴定板中確定乳凝膠樣品的持水量，對經(jīng)離心以誘導脫乳清或經(jīng) 冷存延長時間（例如，30天)的樣品進行TADM壓力測量。
[0235] 乳的發(fā)酵
[0236] 用3種不同的嗜熱鏈球菌菌株接種含具有2%乳糖之M17肉湯的96孔微量滴定板， 每種菌株作若干重復以評估變化水平，并在Galaxy R C02孵育器(RS Biotech)中于37°C孵 育過夜。利用Hamilton自動機械使用來自含2 %乳糖的M17肉湯的1 %過夜培養(yǎng)物接種含乳 和pH指示劑的96孔微量滴定板，并于43 °C孵育18小時。
[0237] 發(fā)酵乳持水量的確定
[0238] 將含乳凝膠樣品和作為對照之乳的板以500xg于4°C離心10分鐘。在通過將吸移管 尖端緩慢移動進樣品同時吸取的第一輪吸取期間一一此時存在兩個相（乳清和凝膠/固 體），確定非混合樣品的持水量，并記錄TADM壓力曲線顯著變化時的時間點，該時間點表示 固相的開始（圖14)。使用傳導吸移管尖端吸取700μ1的體積(60yl/s)以感知樣品的開始(并 由此感知吸取的開始）。
[0239] 結(jié)果和結(jié)論
[0240]發(fā)現(xiàn)了用尺測量的乳清長度與TADM壓力曲線顯著變化時的時間點（拐彎時間點） 之間的關(guān)聯(lián)(R2 = 〇.79)(圖14A和C)，所述乳清長度表示脫水收縮作用(脫乳清或持水量）。 [0241]使用不同菌株在微量滴定板中進行乳酸化是用于為例如凝固型酸乳酪和新鮮乳 酪選擇菌株的合適工具，其中期望導致具有高持水量的乳凝膠的菌株?？梢砸宰詣臃绞綇?例如Excel文件進行數(shù)據(jù)的抽取，并且基于所述結(jié)果，可以找到具有期望特性的乳凝膠樣品 和相應的培養(yǎng)物、添加劑和培養(yǎng)條件。
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[0249] US6938504
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【主權(quán)項】
1. 用于確定乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度和持水量中至少之一的方法，所述方法包括： (i) 提供一個或更多個樣品，每一個均包含樣品容器和樣品，其中至少一個樣品是所述 乳凝膠； (ii) 在步驟（i)的所述樣品的吸取和/或分配期間測量頂部空間壓力以得到壓力相對 于時間的數(shù)據(jù)；以及 (iii) 由步驟（ii)的壓力相對于時間的數(shù)據(jù)確定所述乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度和 持水量中至少一個； 其中 在步驟(iii)中通過將所述壓力相對于時間的數(shù)據(jù)與剪切應力相關(guān)聯(lián)來確定所述剪切 應力； 在步驟(iii)中通過將由非混合樣品或離心樣品得到的吸取曲線上的最小壓力與復數(shù) 模量相關(guān)聯(lián)來確定所述凝膠硬度； 以及 在步驟(iii)中通過由非混合樣品或離心樣品得到的吸取曲線上的拐彎時間點與持水 量相關(guān)聯(lián)來確定所述持水量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中剪切應力是確定的。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中凝膠硬度是確定的。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中剪切應力和凝膠硬度二者是確定的。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中持水量是確定的。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中對所述樣品中的至少一些吸取和/或 分配多于一個吸取和/或分配循環(huán)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述乳凝膠包含多于一個相，例如液 相和軟固相。8. 根據(jù)權(quán)利要求6至7中任一項所述的方法，其中在第一吸取和/或分配循環(huán)之后以及 在第二吸取和/或分配循環(huán)之前混合所述樣品，例如通過反復吸取和/或分配，或者通過引 入所述樣品容器的混合裝置。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述乳凝膠是發(fā)酵乳產(chǎn)品。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述乳凝膠是酸乳酪、酪乳、酸奶油 或新鮮乳酪。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項所述的方法，其中在步驟（ii)的至少一個吸取和/或 分配循環(huán)的所述測量之前對至少一些所述樣品進行離心。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中使所述樣品在尚未離心的情況下進行步驟（ii) 的第一吸取-分配循環(huán)，離心所述樣品，然后對其進行步驟（ii)中的進一步的吸取-分配循 環(huán)。13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項所述的方法，其中用于步驟（ii)的設(shè)備為Hamilton Robotics MicroLab Star〇14. 用于根據(jù)微生物有助于在其存在下制備的乳凝膠的剪切應力、凝膠硬度和/或持水 量的能力對所述微生物進行分級的方法，所述方法包括： (i)提供在至少一種微生物的存在下制備的乳凝膠的兩個或更多個樣品，每一個均包 含樣品容器和樣品； (ii) 在步驟（i)所述兩個或更多個樣品的吸取和/或分配期間測量頂部空間壓力以得 到壓力相對于時間的數(shù)據(jù)；以及 (iii) 根據(jù)在所述至少一種微生物的存在下制備的乳凝膠的相對壓力相對于時間的數(shù) 據(jù)對所述微生物進行分級， 其中 剪切應力a)與吸取曲線上的壓力相對于時間的數(shù)據(jù)成反比，并且b)與分配曲線上的壓 力相對于時間的數(shù)據(jù)成正比； 凝膠硬度與由非混合樣品或離心樣品得到的所述吸取曲線上的最小壓力成反比；以及 持水量與由非混合樣品或離心樣品得到的所述吸取曲線上的拐彎時間點成反比。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，進一步包括步驟(iv):如果所述至少一種微生物有助 于在其存在下制備的乳凝膠具有相對高的剪切應力、相對高的凝膠硬度和/或相對高的持 水量，則選擇所述至少一種微生物。
【文檔編號】G01N35/10GK105939611SQ201480074400
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年12月9日
【發(fā)明人】梅泰·康托, 薇拉·波爾森, 貢納爾·歐爾戈德, 喬治奧斯·特哈斯, 桑德拉·溫德, 帕特里克·德克斯
【申請人】科.漢森有限公司