酶組合物在反芻動(dòng)物飼料中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及：一種酶組合物，所述酶組合物包括經(jīng)曲霉亞屬尼格里菌Aspergillus section Nigri的菌株發(fā)酵的主底物，所述主底物選自由小麥、麥麩、菜籽餅以及它們的混合物，所述酶組合物呈現(xiàn)出：(i)每克組合物的木聚糖酶活性大于或等于500AXC，(ii)每克組合物的β?葡聚糖酶活性大于或等于500BGU，以及(iii)每克組合物的纖維素酶活性大于或等于50CMC；以及該酶組合物在反芻動(dòng)物的飼料中的應(yīng)用。
【專利說明】
酶組合物在反芻動(dòng)物飼料中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及通過在飼料中加入非藥用食品添加劑來改善反芻動(dòng)物的畜牧學(xué)性能。
【背景技術(shù)】
[0002] 反芻動(dòng)物的遺傳進(jìn)展帶來了獲得家畜動(dòng)物極高的畜牧學(xué)性能的可能性。這表現(xiàn)為 極高水平的產(chǎn)奶量（高于40kg/奶牛/天），以及育肥牛的極高的體重增加（高于l，500g/動(dòng) 物/天）。這些性能需要?jiǎng)游飻z入更多的飼料原料，并且需要非常豐富的飼料來滿足它們的 生存和生產(chǎn)需要。
[0003] 攝入水平的增加以及反芻動(dòng)物日糧中濃縮物部份的增加具有降低動(dòng)物的代謝效 率的影響。由于轉(zhuǎn)運(yùn)加速并且因此效率較低，所以動(dòng)物利用少得多的營養(yǎng)素。因此，非常需 要找到一種能夠改善日糧(草料或濃縮物)至產(chǎn)品（奶或肉）的轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的營養(yǎng)方案。
[0004]已知的是，限制反芻動(dòng)物的日糧整體消化率的是纖維、纖維素和半纖維素的消化 率，同時(shí)現(xiàn)有技術(shù)(Beauchemin et al · (2003) J. Anim. Sci ·E· Suppl · 2 :E37_E47)中描述了 酶在反芻動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。此外，已經(jīng)提出使用細(xì)菌淀粉酶(US 2009/0324571)或真菌淀 粉酶(W0 03/068256)來增加反芻動(dòng)物中淀粉的消化率。然而，作者認(rèn)識到動(dòng)物對酶補(bǔ)充物 的反應(yīng)存在顯著差異，因此，一方面需要找到針對反芻動(dòng)物的特定添加物，另一方面需要找 到用于改善反芻動(dòng)物飼料中的多數(shù)多糖一纖維素和半纖維素一的消化率的添加劑。因此， 提出了將包括纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和半乳糖苷酶添加 劑的純化的酶復(fù)合物加入到反芻動(dòng)物的飼料中，以增加攝入的草料(fourrages)的消化率 (W0 2009/0006362)。然而，這些添加劑僅和草料一起使用，而不能與濃縮的食料(谷物、副 產(chǎn)品、濾餅)一起使用，而加入濃縮的食料是改善反芻動(dòng)物的畜牧學(xué)性能的主要方式。
[0005] 因此，非常需要一種對于反芻動(dòng)物飼料的新的添加劑，從而使該反芻動(dòng)物飼料能 改善動(dòng)物的畜牧學(xué)性能，甚至能夠與最佳化的飼料(例如包括濃縮食料的飼料)一起喂養(yǎng)。
[0006] 已經(jīng)提出使用不同類型的產(chǎn)生酶的微生物，來改善反芻動(dòng)物的畜牧學(xué)性能 (Beauchemin et al. (2004)Can. J.Anim Sci . 84:23-36) 〇一旦完成了用于生產(chǎn)這些酶的發(fā) 酵，通常就立即使酶與發(fā)酵殘余物以及生產(chǎn)微生物分離。然而，所生產(chǎn)出的酶的類型和活性 隨著所使用的微生物的類型、所使用的底物以及所使用的培養(yǎng)條件而變化很大，這導(dǎo)致在 動(dòng)物中觀察到的效果非常不均一，因此限制了農(nóng)夫的收益。具體地，難以確定酶活性的有效 組合的應(yīng)用，尤其對于經(jīng)基因改造的生物在液態(tài)發(fā)酵中生產(chǎn)的酶。由于液體形式的酶被快 速濾出并且在瘤胃中失活，因此在使用液體形式的酶時(shí)，施用該酶的方式也是個(gè)問題。
[0007] 本發(fā)明是由本發(fā)明人的出乎意料的發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的，即使用曲霉亞屬尼格里菌 (Aspergillus section Nigri)的發(fā)酵真菌，更具體地使用塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis)類型的發(fā)酵真菌，對谷類和/或谷類副產(chǎn)物和/或含油種子副產(chǎn)物進(jìn)行固態(tài)發(fā) 酵，能夠可重復(fù)地得到呈現(xiàn)出給定水平的纖維素酶活性、木聚糖酶活性和β-葡聚糖酶活性 的多酶組合物，并且該酶組合物無論以何種形式提供至反芻動(dòng)物的飼料日糧中時(shí)，均能夠 改善反芻動(dòng)物的畜牧學(xué)性能，尤其是改善奶產(chǎn)量、食物效率、消耗指數(shù)（indice de consommation)、體重增加，增加反芻活動(dòng)，提高攝入草料的能力，提高草料和/或濃縮物的 消化率，并且降低甲烷的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 因此，本發(fā)明涉及一種酶組合物，所述酶組合物包括經(jīng)曲霉亞屬尼格里菌 (Aspergillus section Nigri)的菌株，更具體經(jīng)塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的 菌株發(fā)酵的主底物，所述主底物選自由小麥，麥麩，菜籽餅，小麥和麥麩的混合物，小麥和菜 籽餅的混合物，麥麩和菜籽餅的混合物以及小麥、麥麩和菜籽餅的混合物所組成的組，所述 酶組合物呈現(xiàn)出：
[0009] (i)每克組合物的木聚糖酶活性大于或等于500AXC，
[0010] (ii)每克組合物的β-葡聚糖酶活性大于或等于500BGU，以及
[0011] (iii)每克組合物的纖維素酶活性大于或等于50CMC。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及該酶組合物的制造方法，所述制造方法包括以下步驟:使用塔 賓曲霉（A.tubingensis)子進(jìn)化枝的菌株、更具體地使用塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis)或新型黑曲霉（Aspergillus neoniger)的菌株，更優(yōu)選使用塔賓曲霉 (Aspergi 1 lus tubingensis)的菌株，對自由小麥，麥麩，菜籽餅，小麥和麥麩的混合物，小 麥和菜籽餅的混合物，麥麩和菜籽餅的混合物以及小麥、麥麩和菜籽餅的混合物所組成的 組中的主底物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，直至發(fā)酵產(chǎn)物至少呈現(xiàn)出以下酶活性的最小值：
[0013] (i)每克組合物的木聚糖酶活性大于或等于500AXC，
[0014] (ii)每克組合物的β-葡聚糖酶活性大于或等于500BGU，以及
[0015] (iii)每克組合物的纖維素酶活性大于或等于50CMC，該發(fā)酵優(yōu)選在培養(yǎng)基中出現(xiàn) 第一孢子時(shí)停止。
[0016] 本發(fā)明還涉及一種反芻動(dòng)物飼料的添加劑，所述添加劑包括上述酶組合物。
[0017] 本發(fā)明的目的還在于上述添加劑在喂養(yǎng)反芻動(dòng)物的飼料組合物或預(yù)混合物作為 配料，尤其是作為非醫(yī)用配料中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還涉及一種用于喂養(yǎng)反芻動(dòng)物的預(yù)混合物，所述預(yù)混合物包括上述添加 劑；以及本發(fā)明涉及一種反芻動(dòng)物的補(bǔ)充飼料組合物，所述補(bǔ)充飼料組合物包括:有效量的 上述添加劑或上述預(yù)混合物，以及適用于反芻動(dòng)物的飼料原料。
[0019] 本發(fā)明的另一目的涉及一種制造反芻動(dòng)物的補(bǔ)充飼料組合物的方法，該方法包 括:使得如上所限定的添加劑或如上所限定的預(yù)混合物與適用于反芻動(dòng)物的飼料原料混 合。
[0020] 本發(fā)明還涉及如上所限定的酶組合物、如上所限定的添加劑、如上所限定的預(yù)混 合物或如上所限定的飼料組合物在改善反芻動(dòng)物的畜牧學(xué)性能中的應(yīng)用。
[0021] 最后，本發(fā)明涉及一種用于改善反芻動(dòng)物的畜牧學(xué)性能的方法，其中，使所述反芻 動(dòng)物攝入有效量的如上所限定的酶組合物、如上所限定的添加劑、如上所限定的預(yù)混合物 或如上所限定的飼料組合物。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 反芻動(dòng)物
[0023] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"反芻動(dòng)物"是指任何多胃的食草性哺乳動(dòng)物，對于反 芻動(dòng)物，其在飼料攝入后通過再咀嚼過程完全或部分進(jìn)行消化。
[0024] 反芻動(dòng)物的消化道由4個(gè)隔室組成:瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃。在這4個(gè)隔室中，因?yàn)?大多數(shù)營養(yǎng)物在瘤胃中進(jìn)行消化，所以瘤胃是最重要的。瘤胃中的消化對應(yīng)于涉及多種重 要菌群的發(fā)酵過程，該多種重要菌群用于溶纖作用、半纖溶解作用(hgmicellulolyse)、蛋 白水解、酸的產(chǎn)生、甲烷的產(chǎn)生、維生素的合成等。由于瘤胃菌群的重要作用，因此反芻動(dòng)物 的消化生理學(xué)顯著不同于單胃動(dòng)物(其中菌群起次要作用）的消化生理學(xué)。
[0025] 這樣的動(dòng)物是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如包括牛科動(dòng)物、綿羊類動(dòng)物、山羊類 動(dòng)物、鹿科動(dòng)物和駱駝科動(dòng)物。優(yōu)選地，在本發(fā)明的背景中，反芻動(dòng)物為?？苿?dòng)物。
[0026] 在本文中，"?？?或"?？苿?dòng)物"是指?？?bovides)的一個(gè)亞科，包括幾種重要的 家畜。牛科動(dòng)物具體包括牛，特別是奶牛，哺乳母牛（vache allaitante)，小母牛（g6 nisse)，牛犢(veau)，斷乳小牛(broutard)，小公牛（taurillon)，飼養(yǎng)的肉牛(boeuf)，用于 育肥的肉牛(boeuf δ l'engrais)，公牛（taureau)，水牛，牦牛，白肢野牛(gayal)和白臀野 牛(banteng)。優(yōu)選地，當(dāng)在本發(fā)明的范圍內(nèi)所使用的反芻動(dòng)物為?？苿?dòng)物時(shí)，該反芻動(dòng)物 選自牛，尤其是奶牛、牛犢、斷乳小牛，喂奶的牛犢，飼養(yǎng)的肉牛和用于育肥的肉牛。
[0027] 在本文中，"綿羊類"是指羊(Ovis)屬的反芻草食動(dòng)物。綿羊類動(dòng)物具體包括野生 綿羊、綿羊、母羊、年幼的母羊(vacive)和蓋羊。
[0028] 在本文中，"山羊類動(dòng)物"是指著山羊?qū)俚姆雌c草食動(dòng)物。山羊類動(dòng)物具體包括山 羊、雄山羊、小山羊和野山羊。
[0029]在本文中，"鹿科"是指具有鹿角的鹿科(Cervidae)的反芻動(dòng)物。鹿科動(dòng)物具體包 括牡鹿（cerf,)、幼鹿（hgre)、年幼的牡鹿（daguet)、雌鹿（biche)、幼鹿（faon)、雄猜 (〇116￥代11；[1)、雄鹿((3116￥代1^6)、雌鹿(131'0031(1)、馴鹿(代11116)、扁角鹿((13；[111)、雌鹿(雌性 扁角鹿)和麋鹿。
[0030] 在本文中，"駱駝科"是指駱駝科(Camelidae)的偶蹄目哺乳動(dòng)物。駱駝科具體包括 單峰駱駝、駱駝、雌性駱駝、美洲駝(lama)和羊駝。
[0031] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，反芻動(dòng)物為家畜動(dòng)物。
[0032] 酶組合物
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的酶組合物包括經(jīng)曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri) 的菌株，優(yōu)選塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的菌株發(fā)酵的主底物，或基本由或由經(jīng) 曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri)的菌株，優(yōu)選塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的菌株發(fā)酵的主底物組成，所述主底物選自由小麥，麥麩，菜籽餅，小麥和麥 麩的混合物，小麥和菜籽餅的混合物，麥麩和菜籽餅的混合物以及小麥、麥麩和菜籽餅的混 合物所組成的組，所述酶組合物呈現(xiàn)出：
[0034] (i)每克組合物的木聚糖酶活性大于或等于500AXC，
[0035] (ii)每克組合物的β_葡聚糖酶活性大于或等于500BGU，以及 [0036] (iii)每克組合物的纖維素酶活性大于或等于50CMC。
[0037]上述酶活性以每克干組合物來表示。
[0038]在本文中，"木聚糖酶"是指生物化學(xué)與分子生物學(xué)國際聯(lián)盟（IUBMB)的酶命名法 中的EC3.2.1.8類的酶，該酶使線性多糖β-l，4-木聚糖降解成木糖，從而使半纖維素降解。
[0039] 用于測量木聚糖酶活性的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常情況下，為了證 實(shí)該活性，可以使酶溶液作用于與發(fā)色團(tuán)雷馬(R0mazol)亮藍(lán)R結(jié)合的可溶性燕麥木聚糖的 溶液，并且測量通過酶溶液的作用而釋放出的低聚物。在用乙醇進(jìn)行沉淀后，該低聚物存在 于可溶部分中。在該方法中使用的反應(yīng)介質(zhì)優(yōu)選由130yL的10g/L的燕麥偶氮木聚糖溶液 (MEGAZYME)、50yL的稀釋在醋酸鹽緩沖液中的0.4M pH 4.70的酶溶液組成。該反應(yīng)優(yōu)選在 31°C下進(jìn)行20分鐘。該反應(yīng)通常通過加入500yL的96%的乙醇來停止。讀取離心(在20 °C下， 以3，OOOrpm離心10分鐘）后得到的上清液在590nm處的光密度。木聚糖酶活性單位(AXC)可 被限定為以下的酶量:稀釋至1單位/mL的該酶在pH 4.70以及30<€下，從貼11^2〇1亮藍(lán)1?木聚 糖溶液中釋放出不會(huì)在乙醇中沉淀的低聚物，以便上清液在590nm處的光密度為0.93。
[0040] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物呈現(xiàn)出：每克組合物的木聚糖酶活性大于500AXC， 更優(yōu)選每克組合物的木聚糖酶活性大于750AXC，更優(yōu)選每克組合物的木聚糖酶活性大于 1000AXC，在所有中優(yōu)選每克組合物的木聚糖酶活性大于或等于2000AXC。
[0041] 在本文中，"β-葡聚糖酶"是指由生物化學(xué)與分子生物學(xué)國際聯(lián)盟（IUBMB)的酶命 名法中的EC3.2.1.6類的酶，該酶使葡聚糖裂解。β葡聚糖酶尤其包括:使β-l，3-葡聚糖，諸 如胼胝質(zhì)或凝膠多糖裂解的β-l，3-葡聚糖酶;使β-l，6-葡聚糖裂解的β-l，6-葡聚糖酶;纖 維素酶;對木葡聚糖具有特異性的內(nèi)切β_1，4-葡聚糖酶;或?qū)δ酒暇厶蔷哂刑禺愋缘耐馇?β-1，4-葡聚糖酶。
[0042] 用于測量β-葡聚糖酶活性的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常情況下，為了 證實(shí)該活性，可以使酶溶液作用于與發(fā)色團(tuán)、R6mazo 1亮藍(lán)R結(jié)合的大麥β-葡聚糖的溶液。該 底物在ρΗ4.8下通過β-葡聚糖酶活性發(fā)生水解，釋放出與發(fā)色團(tuán)結(jié)合的且不會(huì)在乙醇中沉 淀的低聚物，通過測量在590nm處的吸光度來估計(jì)該低聚物的濃度。在該方法中使用的反應(yīng) 介質(zhì)優(yōu)選由130此的在0.1M乙酸鹽磷酸鹽稀釋緩沖液中稀釋至4/5&且調(diào)節(jié)至pH4.75的大麥 偶氮葡聚糖溶液(MEGAZYME)、50yL的稀釋在0.1M乙酸鹽磷酸鹽緩沖液中pH 4.70的酶溶液 組成。優(yōu)選地，該反應(yīng)在31°C下進(jìn)行20分鐘。該反應(yīng)通常通過加入620yL的沉淀溶液(在1L的 96%乙醇中的30g乙酸鈉三水合物和3g乙酸鋅)來停止。讀取離心(在20°C下，以3,000rpm離 心10分鐘）后得到的上清液在590nm處的光密度。β-葡聚糖酶活性單位(BGU)可被限定為以 下的酶量:稀釋至濃度為1單位/mL時(shí)，該酶在檢測條件(30°C，pH 4.8)下釋放出不會(huì)在乙醇 中沉淀的與Rgmazol亮藍(lán)R結(jié)合的大麥葡聚糖的低聚物，以便上清液在590nm處的吸光度為 0 · 9 〇
[0043] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物呈現(xiàn)出：每克組合物的β-葡聚糖酶活性大于 500BGU，更優(yōu)選每克組合物的β-葡聚糖酶活性大于600Β⑶，更優(yōu)選每克組合物的β-葡聚糖 酶活性大于1000BGU，在所有中優(yōu)選每克組合物的β-葡聚糖酶活性大于或等于1500BGU。
[0044] 在本文中，"纖維素酶"是指由生物化學(xué)與分子生物學(xué)國際聯(lián)盟（IUBMB)的酶命名 法中的EC3.2.1.4類的酶，該酶使纖維素、地衣多糖及谷物的β葡聚糖，以β-1-4鍵合的葡萄 糖聚合物裂解。"纖維素酶"尤其包括內(nèi)切-1，4-i3-D-葡聚糖酶、β-l，4_葡聚糖酶、β-1，4_內(nèi) 切葡聚糖水解酶、纖維素酶A、纖維素 (ce 1 lulosine)ΑΡ、內(nèi)切葡聚糖酶D、堿性纖維素酶、纖 維素酶43、纖維糊精酶(061111(1611：1'；[1^86)、9.5纖維素酶、結(jié)晶纖維素酶(3￥；^61386)、胰酶 (pancellase)SS和 1，4_(1，3,1，4)-β-?-匍聚糖_4_ 匍聚糖水解酶。
[0045] 用于測量纖維素酶活性的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常情況下，為了證 實(shí)該活性，可以使酶溶液作用于部分解聚且與發(fā)色團(tuán)Rgmazol亮藍(lán)R結(jié)合的羧甲基纖維素的 溶液。通過纖維素活性，該底物在PH4.5下水解，釋放出與發(fā)色團(tuán)結(jié)合的且不會(huì)在乙醇中沉 淀的低聚物，測量在590nm處的吸光度來計(jì)算該低聚物的濃度。在該方法中使用的反應(yīng)介質(zhì) 優(yōu)選由10(^1的2(^/1且?!14.5的偶氮羧甲基纖維素溶液(168 &271116 90504&)，10(^1^的稀釋 在0.1M乙酸鹽緩沖液中pH 4.60的酶溶液組成。該反應(yīng)優(yōu)選在41°C下進(jìn)行10分鐘。該反應(yīng)通 常通過加入500yL的沉淀溶液（1L的96%乙醇中的40g乙酸鈉三水合物和4g乙酸鋅)來停止。 讀取離心(在20°C下，以3,000rpm離心10分鐘）后得到的上清液在590nm處的光密度。羧甲基 纖維素酶活性單位(CMC)可被限定為以下的酶量:在檢測條件(41°C，pH 4.5)下，稀釋至濃 度為1單位/mL的該酶釋放出部分解聚合且且與Rgmazol亮藍(lán)R結(jié)合的不會(huì)因沉淀溶液而發(fā) 生沉淀的羧甲基纖維素的低聚物，以便上清液在590nm處的吸光度為1.0。
[0046] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物呈現(xiàn)出：每克組合物的纖維素酶活性大于50CMC， 更優(yōu)選每克組合物的纖維素酶活性大于75CMC，更優(yōu)選每克組合物的纖維素酶活性大于 120CMC，在所有中優(yōu)選每克組合物的纖維素酶活性大于或等于180CMC。
[0047] 在尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物呈現(xiàn)出：每克組合物的木聚糖 酶活性大于或等于2000AXC，每克組合物的β-葡聚糖酶活性大于或等于1500BGU，以及每克 組合物的纖維素酶活性大于或等于180CMC。
[0048]根據(jù)本發(fā)明的酶組合物可進(jìn)一步包括除上述木聚糖酶、β_葡聚糖酶和纖維素酶活 性之外的其它酶活性，但該其它酶活性水平非常低。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物不具有 任何果膠酶、甘露聚糖酶、淀粉酶和/或半乳糖苷酶活性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物 不具有任何阿魏酸酯酶活性。
[0049] 在本文中，"不具有任何酶活性X的組合物"是指通過檢測酶活性的常規(guī)技術(shù)在其 中檢測不到酶活性X的組合物。換言之，不具有任何酶活性X的組合物不包括具有酶活性X的 任何蛋白，或包括如下蛋白：該蛋白具有很低濃度(例如，通過蛋白質(zhì)組技術(shù)確定）的酶活性 X，以致于通過檢測酶活性的常規(guī)技術(shù)測量不到相應(yīng)的酶活性X。
[0050] 上述木聚糖酶活性、β_葡聚糖酶活性和纖維素酶活性源自于使用曲霉亞屬尼格里 菌（Aspergillus section Nigri)的菌株，更尤其是塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis) 的菌株對根據(jù)本發(fā)明的酶組合物所含的底物，尤其是主底物進(jìn)行的發(fā)酵。
[0051 ]在本文中，"主底物"是指如下底物，該底物代表在使用曲霉亞屬尼格里菌 (Aspergillus section Nigri)的菌株，更尤其是塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的 菌株進(jìn)行發(fā)酵期間所使用的底物的至少70%、優(yōu)選至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少 95%或 100%。
[0052]該底物，特別是主底物選自由小麥，麥麩，菜籽餅，小麥和麥麩的混合物，小麥和菜 籽餅的混合物，麥麩和菜籽餅的混合物，以及小麥、麥麩和菜籽餅的混合物所組成的組。優(yōu) 選地，底物選自由麥麩、菜籽餅以及它們的混合物所組成的組。在所有中優(yōu)選地，該底物，特 別是主底物為麥麩和菜籽餅的混合物。在混合物中，麥麩和菜籽餅的質(zhì)量比的范圍為10/90 (換言之，10%的麥麩和90%的菜籽餅)至90/10(換言之，90%的麥麩和10%的菜籽餅），優(yōu) 選15/85(換言之，15%的麥麩和85%的菜籽餅)至80/20(換言之，80%的麥麩和20%的菜籽 餅），優(yōu)選20/80(換言之，20%的麥麩和80%的菜籽餅)至70/30(換言之，70%的麥麩和30% 的菜籽餅），優(yōu)選25/75(換言之，25%的麥麩和75%的菜籽餅)至60/40(換言之，60%的麥麩 和40%的菜籽餅），進(jìn)一步更優(yōu)選20/80(換言之，20%的麥麩和80%的菜籽餅)至50/50(換 言之，50%的麥麩和50%的菜籽餅），進(jìn)一步更優(yōu)選30/70(換言之，30%的麥麩和70%的菜 籽餅)至50/50(換言之，50 %的麥麩和50 %的菜籽餅）。
[0053]在使用曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri)的菌株，更尤其是塔賓 曲霉(Aspergillus tubingensis)的菌株發(fā)酵期間所使用的底物可進(jìn)一步包括額外的底 物：
[0054]-油籽餅，諸如豆餅、玉米胚芽餅、向日葵籽餅、棕櫚仁(palmiste)餅、亞麻餅、花生 餅、可可餅、椰子餅、棉籽餅、葡萄籽餅、橄欖果渣、亞麻油餅、麻風(fēng)樹籽餅或芝麻餅；
[0055]-除麥麩之外的其它谷物副產(chǎn)品，諸如小麥粉，粗面粉（remoulage)，次粉 (remoulage bis)，糠，麩質(zhì)飼料，谷骯粉(gluten meal)，來自于釀酒廠/乙醇廠的干酒糟， 來自于釀酒廠/乙醇廠的干的可溶性酒糟，啤酒糟，玉米穗，燕麥、小麥、大麥、黑小麥、稻、黑 麥或玉米的細(xì)根、胚芽或粗磨粉；
[0050]-有機(jī)氮源，諸如氨基酸、大豆蛋白的濃縮物、馬鈴薯蛋白的濃縮物、小麥面筋或玉 米面筋；
[0057]-無機(jī)氮源，諸如尿素、氨、銨鹽或釜餾物；
[0058]-鈉、鉀、氯、鈣或磷礦物鹽;和/或
[0059]-微量元素，諸如鐵、銅、鋅、猛、鈷、碘或硒。
[0000] 優(yōu)選地，在使用曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri)的菌株，更尤其 是塔賓曲霉(Aspergi 1 lus tubingensis)的菌株進(jìn)行發(fā)酵期間所使用的底物可進(jìn)一步包括 油籽餅，尤其是玉米胚芽餅作為額外的底物。
[0061] 如上所限定的底物經(jīng)曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri)的菌株， 優(yōu)選經(jīng)曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri)進(jìn)化枝黑曲霉(A.niger)的菌株， 更優(yōu)選經(jīng)塔賓曲霉(Aspergi 1 lus tubingensis)或新型黑曲霉(Aspergi 1 lus neoniger)的 菌株，更優(yōu)選經(jīng)塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的菌株發(fā)酵，以得到如上所限定的木 聚糖酶活性、葡聚糖酶活性和纖維素酶活性。在一替代實(shí)施方式中，如上所限定的底物是 經(jīng)曲霉亞屬尼格里菌（Aspergillus section Nigri)中不是塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis)的菌株發(fā)酵的。上述發(fā)酵可為浸漬發(fā)酵(或液態(tài)發(fā)酵）、固態(tài)發(fā)酵或固/液態(tài)發(fā) 酵。優(yōu)選地，上述發(fā)酵為固態(tài)發(fā)酵。
[0062]在本發(fā)明的上下文中，"固態(tài)發(fā)酵"被限定為在可用作碳源和能量源的濕潤的固體 底物、惰性底物或不溶性底物上培養(yǎng)微生物。在底物顆粒之間的空間內(nèi)沒有或近似沒有游 離水的情況下發(fā)生發(fā)酵過程。與此相反，本文中，"浸漬發(fā)酵"是指營養(yǎng)物和微生物均浸漬在 水性介質(zhì)中來進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。
[0063] 優(yōu)選地，使用塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)通過固態(tài)發(fā)酵對如上所限定 的底物進(jìn)行發(fā)酵。
[0064]在本文中，"曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri)"是指先前被指定 為黑曲霉（A.niger)種群的曲霉(Aspergillus)屬的亞屬，其通常包括如\^作3 6七&1· (2011)Studies in Mycology 69:1-17所述的被分在5個(gè)主要進(jìn)化枝中的26種：黑曲霉 (A.niger)進(jìn)化枝，包括A· neoniger、A. costaricaensis、A. vadensis、A · eucalypticola、 A. piperis、A acidus、A. tubingensis、A. awamori、A.niger和 A. bras i liens is種；煙曲霉 (A. carbonarius)進(jìn)化枝，包括A. ibericus、A. sclerotiicarbonarius、A carbonarius和 A. sclerotioniger種；A.heteromorphus進(jìn)化枝，包括A. ellipticus和A.heteromorphus種； A.homomorphus進(jìn)化枝，包括A.homomorphus種；以及A.aculeatus進(jìn)化枝，包括 A.fijiensis、A.aculeatus、A.aculeatinus、A.uvarum、A.indologenus、A.japonicus和 A.優(yōu)選地，在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用的曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri)的菌株為黑曲霉(A.niger)進(jìn)化枝上的菌株。在一具體的實(shí)施方式中，在本 發(fā)明的范圍內(nèi)使用的曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri)的菌株為黑曲霉 (A.niger)進(jìn)化枝上的不是塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株的菌株。
[0065] 如上所述，黑曲霉(A.niger)進(jìn)化枝包括被分在3個(gè)子進(jìn)化枝上的10種:塔賓曲霉 (A.tubingensis)子進(jìn)化枝，包括A ?neoniger，A.costaricaensis，A.vadensis， A. eucalypticola，A.piperis，A acidus和A. tubingensis種；黑曲霉（A.niger)子進(jìn)化枝， 包括泡盛曲霉(六.3￥311101'；〇和黑曲霉(六.111861')種；以及巴西曲霉(六.13從8；!_11611818)子進(jìn)化 枝，包括巴西曲霉(八.13從8；!_11611818)種。優(yōu)選地，在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用的曲霉亞屬尼格里 菌(Aspergillus section Nigri)的菌株為塔賓曲霉(A.tubingensis)子進(jìn)化枝上的菌株。 在一具體的實(shí)施方式中，在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用的曲霉亞屬尼格里菌（Aspergillus section Nigri)的菌株為塔賓曲霉（A.tubingensis)子進(jìn)化枝上不是塔賓曲霉 (A. tubingensis)菌株的菌株。更優(yōu)選地，在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用的曲霉亞屬尼格里菌 (Aspergillus section Nigri)的菌株為塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis)或新型黑 曲霉（Aspergillus neoniger)的菌株，甚至更優(yōu)選地為塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis)的菌株。
[0066] 在本文中，"塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis)"是指曲霉亞屬尼格里菌 (Aspergillus section Nigri)的成員，其特征菌株為La Cellule(1934)43:245_247中所 述的塔賓莫瑟里曲霉(Aspergillus tubingensis Mosseray)菌株。它是一種產(chǎn)生黑色分生 孢子的絲狀真菌，在地面上普遍存在，腐生的且能夠在許多復(fù)雜的天然基質(zhì)上生長。塔賓曲 霉(Aspergillus tubingensis)沒有出現(xiàn)在保護(hù)工人避免工作中出現(xiàn)生物制劑相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的 指令(Directive)2000/54/EC的附件III的致病物質(zhì)的列表中。
[0067] 塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的， 并且包括Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC MYA-81、Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC MYA-83、Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC MYA_84、Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC MYA_4879、Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC MYA-77、Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC MYA-78>Aspergi1lus tubingensis Mosseray ATCC MYA_79、Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC MYA_82、Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC MYA_80、Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC 10550、 Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC 76608和Aspergillus tubingensis Mosseray ATCC 201255〇
[0068]在本文中，"新型黑曲霉（Aspergillus neoniger)"是指曲霉亞屬尼格里菌 (Aspergillus section Nigri)的成員，其特征菌株為Varga et al.(2011)Studies in Mycology 69:1-17中所述的Aspergillus neoniger Varga菌株。
[0069]新型黑曲霉(Aspergillus neoniger)菌株的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并 且包括Aspergillus neoniger CBS 115656或Aspergillus neoniger NRRL 62634,以及 Aspergillus neoniger CBS 115657。
[0070]優(yōu)選地，在發(fā)酵前，對如上所限定的底物進(jìn)行預(yù)處理以進(jìn)行巴氏殺菌或消毒。熱處 理可為在例如高壓滅菌器中進(jìn)行加熱。因此，底物可在介于90°c和125°C之間的溫度下，優(yōu) 選介于95和115°C之間的溫度下，更優(yōu)選在105°C的溫度下，高壓滅菌15分鐘至45分鐘，優(yōu)選 20分鐘至40分鐘，更優(yōu)選35分鐘。
[0071]更優(yōu)選地，對如上所限定的底物進(jìn)行預(yù)加濕，以獲得40%至100%的干物質(zhì)，優(yōu)選 45 %至90 %的干物質(zhì)，優(yōu)選50%至80%的干物質(zhì)，優(yōu)選為55%至70%的干物質(zhì)，優(yōu)選為60% 的干物質(zhì)。
[0072] 有利地，在加濕過程中，可以將pH調(diào)節(jié)至4.8至6.2，優(yōu)選5.0至6.0，優(yōu)選5.2至5.8， 在所有中優(yōu)選5.6,以有助于熱處理的巴氏殺菌效果以及所期望的發(fā)酵的啟動(dòng)。
[0073]可利用任何合適的接種物來進(jìn)行如上所限定的底物的接種。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉 用于從選定的塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)菌株制備合適的接種物的多種方式。 接種劑量有利地為每克底物的初始干物質(zhì)有至少1 X 1〇7孢子。
[0074]在發(fā)酵開始時(shí)，優(yōu)選地，將底物的水含量調(diào)整為底物和水的總重量的40%至50%、 優(yōu)選45%，并且優(yōu)選地，例如通過周期性繼續(xù)加入水以補(bǔ)充介質(zhì)中的水損失，以在發(fā)酵期間 使得底物的水含量基本上維持在該區(qū)間。表述"基本上維持"是指，在濕度水平的兩次連續(xù) 調(diào)整之間的相對短的時(shí)段中，或在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，可以容許濕度含量的值偏離40%至50%區(qū) 間5單位％。發(fā)酵期間，由于在真菌生長導(dǎo)致溫度升高的影響下而出現(xiàn)蒸發(fā)，底物的濕度水 平實(shí)際上趨于降低。
[0075]發(fā)酵可在任何合適的反應(yīng)器中進(jìn)行?？墒褂玫姆磻?yīng)器的實(shí)例為A.Durand等人發(fā)表 在Agro-Food-Industry Hi_Tech(Mai-Juin 1997，pages 39-42)的文章中所述的那些反應(yīng) 器。
[0076] 發(fā)酵可進(jìn)行1天至3天，優(yōu)選30小時(shí)至60小時(shí)，更優(yōu)選48小時(shí)的時(shí)段。優(yōu)選地，在培 養(yǎng)基中出現(xiàn)第一孢子時(shí)停止發(fā)酵，因?yàn)殒咦拥拇嬖跁?huì)由于它們的揮發(fā)性而在攝入時(shí)使動(dòng)物 不安。
[0077] 優(yōu)選地，使介質(zhì)的溫度保持在28°C和38°C之間，優(yōu)選在30°C和36°C之間，更優(yōu)選33 Γ。
[0078]優(yōu)選地，上述發(fā)酵在有氧條件下，并優(yōu)選在黑暗中進(jìn)行。
[0079]由此得到的發(fā)酵產(chǎn)物為潮濕的固體產(chǎn)物。優(yōu)選在中等溫度下，例如小于45°C，對該 發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行干燥或脫水，以便不影響酶活性。該干燥或脫水可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟 知的任何合適的技術(shù)，例如使用流化床、冷凍干燥、蒸烘、真空蒸烘或沸石吸附器（ζ ? odratation)來進(jìn)行。
[0080]上述發(fā)酵產(chǎn)物也可在低溫，例如-20°c下，優(yōu)選在濕潤狀態(tài)下被冷凍。
[0081 ]也可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的技術(shù)，提取水中的發(fā)酵產(chǎn)物，且以液 體的形式進(jìn)行回收。發(fā)酵產(chǎn)物的提取可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)來進(jìn)行，尤其 通過在水溶液中的提取、在醇溶液中的提取、利用溶劑的提取、高壓均質(zhì)化、超臨界萃取、利 用流化床的提取、研磨(broyage)、低溫研磨(broyage cryoggnique)、降壓、空腔作用、起泡 法、超聲波提取、吸附在樹脂或沸石上來進(jìn)行。然后，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何技 術(shù)，尤其通過離心、過濾、超濾、層析，使用膜或沉淀來純化液體形式的酶。
[0082]根據(jù)本發(fā)明的酶組合物可以任何合適的形式用于添加劑中。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明 的酶組合物為不經(jīng)提取的粗制形式。
[0083]本文中，"粗制形式"是指含有如上所限定的酶活性、發(fā)酵的底物以及如上所限定 的曲霉亞屬尼格里菌(Aspergillus section Nigri)真菌，尤其是塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)真菌的發(fā)酵介質(zhì)。在底物經(jīng)曲霉亞屬尼格里菌（Aspergillus section Nigri)的菌株，更具體塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的菌株發(fā)酵后，在直接用于根 據(jù)本發(fā)明的酶組合物之前，可尤其對發(fā)酵介質(zhì)進(jìn)行脫水或研磨。該研磨可通過本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的任何合適的技術(shù)，諸如微粉化、剪切研磨、沖擊研磨、低溫球磨或粉碎。
[0084] 根據(jù)本發(fā)明的酶組合物可以進(jìn)一步被標(biāo)準(zhǔn)化。這種標(biāo)準(zhǔn)化可有利地確保組合物的 良好的均勻性，并且促進(jìn)其在制造飼料原料步驟中的應(yīng)用。
[0085] 用于喂養(yǎng)反芻動(dòng)物的添加劑
[0086] 本發(fā)明涉及一種用于如上述"反芻動(dòng)物"部分中所限定的反芻動(dòng)物的飼料的添加 劑、優(yōu)選非藥用添加劑，所述添加劑包括如上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物，基本 由如上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物組成，或由如上述"酶組合物"部分中所限定 的酶組合物組成。
[0087] 在本文中，"添加劑"是指可被動(dòng)物攝入，或可被加入到動(dòng)物的飼料原料、飼料日糧 或飼料中的組分或組分的混合物。
[0088] 根據(jù)本發(fā)明的添加劑可進(jìn)一步包括:額外的配料，諸如生理上可接受的載劑、穩(wěn)定 劑、抗氧化劑或防腐劑，以及額外的酶，如蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、半乳糖苷 酶、阿魏酸酯酶和/或果膠酶。
[0089] 根據(jù)本發(fā)明的添加劑可為適用于其后續(xù)使用的任何形式，尤其是液體形式、粉末 形式或顆粒形式。
[0090] 根據(jù)本發(fā)明的添加劑可在喂養(yǎng)如上述"反芻動(dòng)物"部分中所限定的反芻動(dòng)物的飼 料組合物或預(yù)混合物中用作配料，尤其是用作非藥用配料。
[0091] 預(yù)混合物
[0092] 在本文中，"預(yù)混合物"是指酶和可選的微量元素、維生素和礦物質(zhì)的濃縮物，其以 低百分比混入用于制成反芻動(dòng)物的全價(jià)飼料的不同原料中。
[0093] 該預(yù)混合物優(yōu)選地由如上"添加劑"部分所限定的添加劑的稀釋液或在該添加劑 的載劑上的沉淀物來制成，以對酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化且促進(jìn)其在目標(biāo)動(dòng)物中的應(yīng)用。
[0094] 因此，本發(fā)明涉及一種用于喂養(yǎng)如上"反芻動(dòng)物"部分中所限定的反芻動(dòng)物的預(yù)混 合物，該預(yù)混合物包括如上"添加劑"部分中所限定的添加劑。
[0095] 根據(jù)本發(fā)明的預(yù)混合物可包括在動(dòng)物，尤其是反芻動(dòng)物的飼料中常規(guī)使用的其它 添加劑。
[0096] 這樣的添加劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且包括:工藝添加劑，諸如防腐劑、 抗氧化劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、膠凝劑、粘合劑、用于控制放射性核素污染的物質(zhì)、防凝 劑、酸度校正劑、青貯飼料的添加劑、變性劑;感官添加劑，諸如著色劑(摻雜或修飾動(dòng)物飼 料的顏色，包含在動(dòng)物飼料中、賦予為這些動(dòng)物所生產(chǎn)的食料以顏色的物質(zhì)）、芳香物質(zhì)；營 養(yǎng)添加劑，諸如維生素、維生素原、ω-3脂肪酸以及"具有相似效果的化學(xué)上明確限定的物 質(zhì)"、微量元素的化合物、氨基酸、尿素;脂肪酸和畜牧添加劑，諸如消化改善劑，如酶、腸道 菌群的穩(wěn)定劑，或"對環(huán)境具有積極影響"的物質(zhì)。
[0097] 作為實(shí)例，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)混合物可具有以下組成：
[0098] 根據(jù)本發(fā)明的酶組合物 0.3%~3% 維生素的混合物（A、B、D、E、煙酸等） 0.1%~1% 礦物鹽（CaHPCV CaC〇" NaCI、CuO、MnO. FeS〇4、ZnO 等） （)％~99.6% 來自谷物的物質(zhì)（糠、面粉，草料粉，玉米芯，大麥細(xì)根等） 0%~99,6%
[0099] 根據(jù)本發(fā)明的預(yù)混合物可為適用于其后續(xù)使用的任何形式，尤其是液體形式、粉 末形式或顆粒形式。
[0100] 飼料組合物
[0101] 本發(fā)明還涉及一種用于如上"反芻動(dòng)物"部分中所限定的反芻動(dòng)物的補(bǔ)充飼料組 合物，該補(bǔ)充飼料組合物包括有效量的如上"添加劑"部分中所限定的添加劑或如上"預(yù)混 合物"部分中所限定的預(yù)混合物，以及適用于如上"反芻動(dòng)物"部分中所限定的反芻動(dòng)物的 飼料原料。
[0102] 適用于反芻動(dòng)物的飼料原料是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，并且例如包括:任何類 型以及處于其所有形式(綠色物、脫水的、青貯飼料、聚結(jié)物等）的草料，如牧草和其它飼料 草、飼料谷物（大麥、玉米、燕麥、小麥、高粱、大豆、黑麥），豆類(豌豆、蠶豆、扁豆、大豆、苜 蓿、紅豆草、車軸草），根，塊莖和其副產(chǎn)品（甜菜、甜菜漿、馬鈴薯、馬鈴薯漿等），卷心菜，油 菜，向日葵，蔬菜廢料(葉莖(fanes )、秸桿、稻殼麥片、麩皮、去皮的玉米芯、甘蔗渣)和淀粉， 農(nóng)業(yè)食品工業(yè)(淀粉制造、淀粉生產(chǎn)、乙醇廠、啤酒廠、面粉廠等）的副產(chǎn)品，以及菜籽餅，糖 漿和含氮的食料材料(諸如尿素)及其衍生物(縮二脲、酰脲)和氨鹽。
[0103] 優(yōu)選地，適用于本發(fā)明范圍內(nèi)的反芻動(dòng)物的飼料原料包括通常為攝入的（優(yōu)選每 天攝入的）干物質(zhì)的10 %至50 %的草料、優(yōu)選玉米青貯飼料，優(yōu)選還包括其它草料，諸如干 草、稻草或牧草或谷類青貯飼料，并且優(yōu)選補(bǔ)充有濃縮的飼料原料，諸如谷物、菜籽餅或復(fù) 合飼料原料。
[0104] 反芻動(dòng)物的飼料日糧可尤其包括如上"酶組合物"部分中所限定的酶組合物，以 及：
[0105]比例為0%至100%、優(yōu)選40%至70%的濕草料、干燥的草料或干草料。
[0106]比例為0 %至100 %、優(yōu)選30 %至60 %的濃縮的飼料原料(濃縮的原料或復(fù)合飼料 原料)。
[0107] 優(yōu)選地，存在于飼料組合物中的如上"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、如上 "添加劑"部分中所限定的添加劑或如上"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物的量，使得為 動(dòng)物提供如下"有效日劑量"部分中限定的有效日劑量。
[0108] 根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物可為適用于喂養(yǎng)反芻動(dòng)物、尤其是家畜反芻動(dòng)物的任何 形式。具體地，根據(jù)本發(fā)明的飼料組合物可為片狀形式、顆粒形式、碎肩形式或粉末形式。
[0109] 本發(fā)明還涉及一種用于制造反芻動(dòng)物的補(bǔ)充飼料組合物的方法，該方法包括以下 步驟:將如上述"添加劑"部分中所限定的添加劑或如上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混 合物與適用于如上所述反芻動(dòng)物，尤其是家畜反芻動(dòng)物的飼料原料相混合。
[oho]該使添加劑或預(yù)混合物與飼料原料相混合的步驟可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 的任何技術(shù)來進(jìn)行。
[0111]根據(jù)本發(fā)明的制造飼料組合物的方法可進(jìn)一步包括:配制飼料組合物的步驟，以 及調(diào)制（condi tionnement)步驟。這些步驟可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何常規(guī)技術(shù)來 進(jìn)行。因此，當(dāng)上述添加劑或上述預(yù)混合物為粉末形式時(shí)，則可以在配制(或混合)步驟中將 其加入到飼料原料中；或者，當(dāng)上述添加劑或上述預(yù)混合物為液體形式時(shí)，則可在飼料造粒 之后將其噴涂到飼料原料上。
[0112]有效日劑量
[0113]配制在上述"添加劑"部分中所限定的添加劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù) 混合物或上述"飼料組合物"部分中所限定的飼料組合物，以將有效量的酶活性提供給目標(biāo) 動(dòng)物?？衫帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何技術(shù)，諸如尤其是混合、稀釋、沉積在載劑上、噴涂 或粉末化在顆粒上或直接分配給動(dòng)物，來配制上述添加劑、上述預(yù)混物或上述飼料組合物。 [0114]所采用的配制方法取決于目標(biāo)動(dòng)物，并且優(yōu)選受到β_葡聚糖酶活性的水平的制 約。
[0115] 有效日劑量通常為：
[0116] 奶牛：2250BGU/動(dòng)物/天至9000BGU/動(dòng)物/天，優(yōu)選4500BGU/動(dòng)物/天；
[0117] 用于育肥的牛科動(dòng)物：2250BGU/動(dòng)物/天至9000BGU/動(dòng)物/天，優(yōu)選2250BGU/動(dòng)物/ 天直至活體體重達(dá)500公斤，并且活體體重超過500公斤時(shí)，優(yōu)選為3，375BGU/動(dòng)物/天。
[0118] 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，諸如尤其是依據(jù)活體體重、依據(jù)代謝活體體重 (PV^75)、依據(jù)瘤胃體積、依據(jù)每天攝入的干物質(zhì)的總量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過與奶?；?用于育肥的?？苿?dòng)物進(jìn)行比較來計(jì)算對于其它類型的反芻動(dòng)物的有效日劑量，其中，特別 是在活體體重小于l〇〇kg的動(dòng)物中，最小量優(yōu)選為1，125BGU/動(dòng)物/天。
[0119]提高畜牧學(xué)性能的應(yīng)用
[0120] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在奶?；蛴糜谟实呐？苿?dòng)物的飼料日糧中補(bǔ)充根據(jù)本發(fā)明的酶 組合物能夠提高它們的畜牧學(xué)性能，尤其是提高奶產(chǎn)量(包括所產(chǎn)奶的乳脂水平和蛋白水 平）、提高體重增加、增加反芻活動(dòng)、改善食物效率和消耗指數(shù)、提高草料的攝入能力、增加 草料和/或濃縮物的消化率以及降低甲烷的產(chǎn)量。
[0121] 因此，本發(fā)明的目的還涉及上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、上述"添加 劑"部分中所限定的添加劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上述"飼料組合 物"部分中所限定的飼料組合物在增加上述"反芻動(dòng)物"中所限定的反芻動(dòng)物的畜牧學(xué)性能 中的應(yīng)用。
[0122] 在本文中，"畜牧學(xué)性能"是指能夠評價(jià)動(dòng)物質(zhì)量的標(biāo)識，尤其是它對各種功能(生 長、工作、繁殖……）的生物學(xué)能力的標(biāo)識。畜牧學(xué)性能尤其包括動(dòng)物的體重增加(尤其是日 平均體重增加），它的消耗指數(shù)或食物效率，典型年齡(age-type)的體重，屠體產(chǎn)率，屠體重 量，屠體形態(tài)，食物攝取，攝入草料的能力，草料和/或濃縮物的消化率，奶產(chǎn)量，奶的蛋白水 平，奶的脂肪水平，反芻活動(dòng)，甲烷產(chǎn)量，產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)毛量。優(yōu)選地，上述"酶組合物"部分中 所限定的酶組合物、上述"添加劑"部分中所限定的添加劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定 的預(yù)混合物或上述"飼料組合物"部分中所限定的飼料組合物在上述"反芻動(dòng)物"部分中所 限定的反芻動(dòng)物中能夠促進(jìn)體重增加，和/或改善消耗指數(shù)，和/或促進(jìn)食物攝入，和/或改 善屠體產(chǎn)率、屠體重量、屠體形態(tài)、奶產(chǎn)量、奶的蛋白水平、奶的脂肪水平、產(chǎn)仔數(shù)和/或產(chǎn)毛 量，和/或增加反芻活動(dòng)，和/或提高攝入草料的能力，和/或提高草料和/或濃縮物的消化 率，和/或降低甲烷產(chǎn)量。更優(yōu)選地，上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、上述"添加 劑"部分中所限定的添加劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上述"飼料組合 物"部分中所限定的飼料組合物在上述"反芻動(dòng)物"部分中所限定的反芻動(dòng)物中能夠提高奶 產(chǎn)量，和/或改善消耗指數(shù)，和/或促進(jìn)體重增加，和/或增加反芻活動(dòng)，和/或提高攝入草料 的能力，和/或提高草料和/或濃縮物的消化率，和/或降低甲烷的產(chǎn)量。在所有中優(yōu)選地，上 述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、上述"添加劑"部分中所限定的添加劑、上述"預(yù)混 合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上述"飼料組合物"部分中所限定的飼料組合物在上述 "反芻動(dòng)物"部分中所限定的反芻動(dòng)物中能夠提高奶產(chǎn)量，和/或改善消耗指數(shù)，和/或促進(jìn) 體重增加，和/或增加反芻活動(dòng)。
[0123] 在本文中，"體重增加"或"日均增重"是指動(dòng)物的重量增長的變化，以g/天來表示。
[0124] 在本文中，"消耗指數(shù)"是指食物轉(zhuǎn)化的效率。在用于育肥的反芻動(dòng)物的情況下，通 過消耗的飼料原料量和活體體重增加之間的比例來確定該指數(shù);在產(chǎn)奶的反芻動(dòng)物的情況 下，通過消耗的飼料原料量和產(chǎn)奶量之間的比例來確定該指數(shù)。
[0125] 在本文中，"食物效率"是指反芻動(dòng)物的飼料日糧轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的測量值。該食物效 率為如上所限定的消耗指數(shù)的反比例。
[0126] 在本文中，"典型年齡的體重"是指便于比較的處于參比年齡(例如，1年或18個(gè)月） 的動(dòng)物的體重。
[0127] 在本文中，"屠體產(chǎn)率"是指動(dòng)物的屠體重量和活體體重之間的比例，這能夠評估 "純產(chǎn)率"。
[0128] 在本文中，"屠體重量"是指屠體在經(jīng)冷卻處理(chilling)之后的重量。
[0129] "食物攝入"是指動(dòng)物攝入的飼料原料的量。
[0130] "攝入草料的能力"是指動(dòng)物自發(fā)攝入的草料的量。
[0131] "飼料和/或濃縮物的消化率"是指被動(dòng)物有效保留和/或消化的草料和/或濃縮物 的份額。
[0132] "產(chǎn)奶量"或"奶產(chǎn)量"是指每天生產(chǎn)的奶量，以體積單位或重量單位來表示。在本 發(fā)明的上下文中，在奶產(chǎn)量的提高不僅可以通過產(chǎn)奶量的增加來表示，還可通過奶的乳脂 水平(taux butyreux)和/或蛋白水平的提高來表示。
[0133] "奶的蛋白水平"是指奶中所含的蛋白質(zhì)的量。
[0134] 在本文中，"奶的脂肪水平"是指奶中所含的脂肪的量。
[0135] 在本文中，"產(chǎn)仔數(shù)"是指幼崽或后代出生時(shí)的數(shù)量和重量。
[0136] 在本文中，"反芻活動(dòng)"是指每天專用于咀嚼食物團(tuán)的分鐘數(shù)。
[0137] "產(chǎn)毛量"是指產(chǎn)毛的哺乳動(dòng)物(例如絨山羊)生產(chǎn)的毛量。
[0138] 優(yōu)選地，上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、上述"添加劑"部分中所限定 的添加劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上述"飼料組合物"部分中所限定的 飼料組合物在上述"反芻動(dòng)物"部分中所限定的反芻動(dòng)物中能夠以顯著性的方式提高奶產(chǎn) 量(尤其提高奶的乳脂水平和/蛋白水平），和/或提高消耗指數(shù)和/或食物效率，和/或促進(jìn) 體重增加，和/或增加反芻活動(dòng)，和/或增加攝入草料的能力，和/或增加草料和/或濃縮物的 消化率，和/或降低甲烷產(chǎn)量。
[0139]具體地，在優(yōu)選使用包括玉米青貯飼料的飼料，優(yōu)選包括粗草料，諸如草或干草、 菜籽餅、甜菜漿以及含氮和能量的濃縮物，以及在上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合 物(該酶組合物優(yōu)選存在于該飼料中以提供4500BGU/動(dòng)物/天）的飼料喂養(yǎng)的反芻動(dòng)物，尤 其是?？苿?dòng)物、優(yōu)選奶牛中，上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、上述"添加劑"部分 中所限定的添加劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上述"飼料組合物"部分中 所限定的飼料組合物，能夠使奶產(chǎn)量提高1 %至5%、優(yōu)選3%，和/或使奶的蛋白水平提高 0.5% 至 1.5%、優(yōu)選 1%。
[0140]具體地，在優(yōu)選使用包括玉米青飼料的飼料原料，優(yōu)選包括玉米青飼料以及 含氮和能量的濃縮物以及在上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物(該酶組合物優(yōu)選存 在于該飼料中以提供2250BGU/動(dòng)物/天直至活體體重達(dá)到500kg，并且在活體體重超過 500kg時(shí)提供3,375BGU/動(dòng)物/天）的飼料原料喂養(yǎng)的反芻動(dòng)物，尤其是?？苿?dòng)物、優(yōu)選用于 育肥的?？苿?dòng)物中，上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、上述"添加劑"部分中所限 定的添加劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上述"飼料組合物"部分中所限定 的飼料組合物能夠使體重增加提高1 %至15%、優(yōu)選10%。
[0141 ]具體地，在優(yōu)選使用包括玉米青飼料的飼料原料，優(yōu)選包括玉米青飼料以及 含氮和能量的濃縮物以及在上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物(該酶組合物優(yōu)選存 在于該飼料中以提供4500BGU/動(dòng)物/天)的飼料原料喂養(yǎng)的反芻動(dòng)物，尤其是牛科動(dòng)物、優(yōu) 選奶牛中，上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、上述"添加劑"部分中所限定的添加 劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上述"飼料組合物"部分中所限定的飼料組 合物能夠使反芻活動(dòng)增加5%至15%、優(yōu)選8%至11 %。
[0142] 具體地，在優(yōu)選使用包括干牧草、玉米青貯飼料和/或牧草青貯飼料的飼料原料， 優(yōu)選包括干牧草以及在上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物(該酶組合物優(yōu)選存在于 該飼料中以提供3375BGU/動(dòng)物/天）的飼料原料喂養(yǎng)的反芻動(dòng)物，尤其是牛科動(dòng)物、優(yōu)選屠 宰的牛中，上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、上述"添加劑"部分中所限定的添加 劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上述"飼料組合物"部分中所限定的飼料組 合物能夠使甲烷產(chǎn)量降低〇. 5%至9%，優(yōu)選2.5%至8%。
[0143] 上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物、上述"添加劑"部分中所限定的添加 劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上述"飼料組合物"部分中所限定的飼料組 合物進(jìn)一步能夠使被施用它們的反芻動(dòng)物或反芻動(dòng)物的畜群維持整體良好狀況，特別是使 畜群維持農(nóng)夫可接受的生育力、發(fā)病率和/或死亡率，或甚至促進(jìn)該生育率，和/或降低該發(fā) 病率和/或該死亡率。
[0144] 本發(fā)明還涉及一種用于提高反芻動(dòng)物的畜牧學(xué)性能的方法，其特征在于，使反芻 動(dòng)物攝入，優(yōu)選以飼料日糧的方式攝入，有效量的上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合 物、上述"添加劑"部分中所限定的添加劑、上述"預(yù)混合物"部分中所限定的預(yù)混合物或上 述"飼料組合物"部分中所限定的飼料組合物。
[0145] 在本文中，"有效量"是指能夠增加如上所限定的畜牧學(xué)性能的酶組合物的量，該 酶組合物可選地存在于添加劑、預(yù)混合物或飼料組合物中。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而 易見的是，該量將取決于所涉及的反芻動(dòng)物、它的年齡、它的性別、它的遺傳類型、它的生理 階段、它的體重、預(yù)期的性能水平以及它的飼料日糧。
[0146] 典型地，在?？苿?dòng)物的情況下，對于奶牛，有效攝入量使得所攝入的β-葡聚糖酶活 性介于2，250Β⑶/天與9000BGU/天之間，優(yōu)選4500BGU/天；以及對于用于育肥的牛科動(dòng)物， 有效攝入量使得所攝入的葡聚糖酶活性介于2,250BGU/天與9000BGU/天之間，優(yōu)選對于 活體體重在500kg以下的用于育肥的?？苿?dòng)物，所攝入的β-葡聚糖酶活性為2250BGU/天，對 于體重超過500kg的用于育肥的?？苿?dòng)物，所攝入的β-葡聚糖酶活性為3375BGU/天。
[0147] 通常來講，將如上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物適時(shí)，例如按照每日一 次、兩周一次、一周一次或兩個(gè)月一次的頻率，以分散且連續(xù)的攝入的形式提供給反芻動(dòng) 物。優(yōu)選地，使反芻動(dòng)物依據(jù)日劑量攝入有效量的如上述"酶組合物"部分中所限定的酶組 合物。
[0148] 對于僅通過放牧喂養(yǎng)的反芻動(dòng)物，上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物優(yōu)選 以獨(dú)立于它們的主飼料的方式提供。
[0149] 對于喂養(yǎng)新鮮草料或儲(chǔ)存草料(例如，干草)或工業(yè)飼料原料(包括飼料濃縮物）的 反芻動(dòng)物，上述"酶組合物"部分中所限定的酶組合物可以以與這些飼料原料混合的方式提 供，或獨(dú)立于這些飼料原料的方式提供。
[0150]通過以下實(shí)施例，將對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的闡述。
[0151] 實(shí)施例
[0152] 實(shí)施例1:通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的酶組合物
[0153] 在本實(shí)施例中，描述了在塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的菌株的存在下， 通過對菜籽餅和麥麩的混合物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵來獲得根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的方法。
[0154] 營養(yǎng)介質(zhì)由重量比為7/3的菜籽餅(作為粉狀物)和麥麩的混合物制成。然后，將混 合物預(yù)加濕至60 %的干物質(zhì)，且在105 °C下高壓滅菌35分鐘。冷卻后，在介質(zhì)中接種塔賓曲 霉(Aspergillus tubingensis)的孢子的溶液，以獲得1 X 107孢子/每克干物質(zhì)的濃度和 45%的初始濕度。通過加入硫酸，將pH調(diào)節(jié)至4.9。將由此所得的培養(yǎng)基以10g干物質(zhì)/瓶的 量分配在錐形瓶中。隨后，將錐形瓶在33°C、有氧條件下，在黑暗中孵育48小時(shí)，同時(shí)不進(jìn)行 任何攪拌。當(dāng)培養(yǎng)基中出現(xiàn)第一孢子時(shí)，停止培養(yǎng)(因?yàn)殒咦拥膿]發(fā)性而在攝入期間使動(dòng)物 不安，所以發(fā)酵產(chǎn)品被設(shè)計(jì)成含有最小可能量的孢子）。
[0155] 對發(fā)酵結(jié)束時(shí)獲得的混合物進(jìn)行干燥并且就這樣來喂養(yǎng)動(dòng)物，或者將該獲得的混 合物提取到水中，從而以液體形式加入。
[0156] 實(shí)施例2:測量根據(jù)本發(fā)明的酶組合物對奶牛的生產(chǎn)性能的影響
[0157] 在本實(shí)施例中，描述了根據(jù)本發(fā)明的酶組合物對高產(chǎn)奶牛的畜群的生產(chǎn)性能的影 響。
[0158] 材料和方法
[0159] 將38頭純荷斯坦品種(Prim'Holstein)的高產(chǎn)奶牛分成2組并且配對在一起。它們 的分批處理(mise en lot)基于以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行:奶產(chǎn)量、奶的蛋白水平、奶的脂肪水平、泌乳 等級、活體體重。
[0160]使動(dòng)物接受由以下物質(zhì)組成的混合日糧：9.5kg的玉米青貯飼料的DM(干材料）、 2. lkg的纖維性飼料原料(猜桿+具有長纖維的苜蓿）的011、4.91^含氮校正劑(〇〇1^6(^6111·) (表1中示出了其組成）的DM、8.0kg的生產(chǎn)飼料原料(表1中示出了其組成）。
[0161]將通過實(shí)施例1中所述的方法得到的酶組合物標(biāo)準(zhǔn)化為預(yù)混合物，用于確保該組 合物的良好均勻性，并促進(jìn)其在制造飼料原料的步驟中的應(yīng)用。將由此標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)混物以 0.25%的量摻入到生產(chǎn)飼料原料中，以提供4500BGU/動(dòng)物/天。由此標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)混合物的特 征是：130AXC/g、290BGU/g以及35CMC/g。測試的持續(xù)時(shí)間為8周。
[0162]供應(yīng)lkg/天的含丙二醇的飼料原料(Sandi+，能量源)在奶牛上實(shí)現(xiàn)了少于30天的 泌乳期。
[0163] 日糧的平均特征（％/干物質(zhì)）：總含氮物質(zhì)：17.7% ;不溶于中性洗劑的纖維 (NDF) :35.8% ;以及淀粉：17.6%。
[0164] 表1:奶牛的食料的組成
[0165]
[0166] 表2中示出了動(dòng)物批次的特征。
[0167] 經(jīng)分批處理的奶牛批次的特征(在兩周預(yù)實(shí)驗(yàn)之后）
[0168]
[0169] 結(jié)果
[0170] 表3中示出了兩組的產(chǎn)量結(jié)果。
[0171] 批次的產(chǎn)量結(jié)果和統(tǒng)計(jì)學(xué)
[0172]
[0173] NS:非顯著性；*:ρ<0·10;**:ρ<0·05 ;***:ρ<0·001
[0174] 本發(fā)明人注意到，提供酶組合物對于許多標(biāo)準(zhǔn)具有非常明顯的效果：
[0175] 奶產(chǎn)量顯著提高；
[0176]蛋白水平(+0.3g/kg)以及產(chǎn)生的蛋白物質(zhì)顯著增加；
[0177] MP 7%顯著增加(通過水平校正的奶產(chǎn)量=MP*(BL+PL)/70):+0.7kg。
[0178] 這些效果并不需要增加攝入的干物質(zhì)，從而呈現(xiàn)出更好的食物效率(產(chǎn)奶量/攝入 的干物質(zhì)）。
[0179]該實(shí)施例表明：提供根據(jù)本發(fā)明的酶組合物，能夠改善高產(chǎn)奶牛的奶產(chǎn)量的畜牧 學(xué)性能，并且更好地穩(wěn)定飼料日糧的價(jià)格。
[0180] 實(shí)施例3:測量根據(jù)本發(fā)明的酶組合物對用于育肥的牛科動(dòng)物的生長性能的影響
[0181] 在本實(shí)施例中，描述了根據(jù)本發(fā)明的酶組合物對用于育肥的?？苿?dòng)物的生長性能 的影響。
[0182] 材料和方法
[0183] 將40頭夏洛萊(Charolais)品種的用于育肥的?？苿?dòng)物分為2組。基于活體體重標(biāo) 準(zhǔn)進(jìn)行分批處理。
[0184] 使動(dòng)物接受混合的完全日糧，其中在表4中詳細(xì)示出了該混合的完全日糧的組成。
[0185] 將通過實(shí)施例1中所述的方法得到的酶組合物標(biāo)準(zhǔn)化為預(yù)混合物，以確保該組合 物的良好均勻性，并促進(jìn)其在向動(dòng)物分配的步驟中的應(yīng)用。將由此標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)混合物摻入 到該混合的完全日糧中，以提供9000BGU/動(dòng)物/天。由此標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)混合物的特征是： 80AXC/g、150BGU/g 以及 17CMC/g。
[0186] 該測試持續(xù)10個(gè)月。
[0187] 用于育肥的?？苿?dòng)物的混合的完全日糧的組成
[0188]
[0189] 莖里
[0190] 表5中詳細(xì)示出了兩組的產(chǎn)量結(jié)果。
[0191] 批次的生長結(jié)果
[0192]
[0193] 本發(fā)明人注意到:通過在用于育肥的幼年?？苿?dòng)物的飼料中加入酶組合物，能夠 使日平均體重增加 (DAWG)提高10 %。它是以屠殺時(shí)的屠體重量來表示，其在補(bǔ)充有根據(jù)本 發(fā)明的酶組合物的動(dòng)物批次中提高了2%。
[0194] 該實(shí)施例表明：提供根據(jù)本發(fā)明的酶組合物能夠改善用于育肥的?？苿?dòng)物的生長 畜牧學(xué)性能。
[0195] 實(shí)施例4:測量根據(jù)本發(fā)明的酶組合物對奶牛的產(chǎn)量性能和反芻活動(dòng)的影響
[0196] 在本實(shí)施例中，描述了根據(jù)本發(fā)明的酶組合物對高產(chǎn)奶牛畜群的產(chǎn)量性能以及動(dòng) 物的反芻活動(dòng)的影響。
[0197] 材料和方法
[0198] 將36頭純荷斯坦品種的高產(chǎn)奶牛分成2組?；谝韵聵?biāo)準(zhǔn)對動(dòng)物進(jìn)行分批處理:奶 產(chǎn)量、體重、泌乳等級和以天數(shù)表示的泌乳期。該測試持續(xù)85天。
[0199] 動(dòng)物接受混合的完全日糧，該混合的完全日糧主要由玉米青貯飼料、苜蓿干草、黑 麥干、玉米黃漿飼料、生產(chǎn)濃縮物和水。其詳細(xì)的組成示出在表6中。
[0200] 將通過實(shí)施例1中所述的生產(chǎn)方法得到的酶組合物標(biāo)準(zhǔn)化為預(yù)混合物，用于確保 該組合物的良好均勻性，并促進(jìn)其在向動(dòng)物分配的步驟中的應(yīng)用（利用"頂部喂養(yǎng)（top feeding)"進(jìn)行分配）。將所得到的預(yù)混合物混合在全日糧中以提供4500BGU/動(dòng)物/天。由此 標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)合物的特征是:400AXC/g、270BGU/g以及69CMC/g。
[0201 ] 利用聲波探測器(RuminAct，Milkline,意大利），每天記錄36頭牛的反會(huì)活動(dòng)。
[0202] 奶牛的混合的完全日糧的組成
[0203]
[0204] S大豆餅44% :41.2% ;棉籽餅:33%，向日葵餅:7.21% ;玉米麩粉:7.21% ;CaC03: 2.68% ;^!1〇)3:2.68%;]\%0:1.00%;〇&冊04 :0.67%;恥(：1:0.67%;211504 :0.10%;預(yù)混合 物:0.54%〇
[0205]對混合的完全日糧的營養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行分析:干物質(zhì)48.69 %，粗蛋白15.75 %/干物質(zhì) (干）；脂肪：2.70%/干物質(zhì)；粗纖維素：18.45%/干;NDF:37.86%/干;ADF:21.15%/干，以 及淀粉:25.57%/干。
[0206] 在該測試中，兩個(gè)批次之間沒有攝入的差異。
[0207] 題
[0208] 表7中詳細(xì)示出了兩組的奶產(chǎn)量結(jié)果。
[0209] 批次的奶產(chǎn)量(kg/動(dòng)物/天)的結(jié)果和統(tǒng)計(jì)學(xué)
[0210]
[0211]在測試期間，奶產(chǎn)量在泌乳階段降低。在測試期間，與對照組相比，接受根據(jù)本發(fā) 明的酶組合物的批次呈現(xiàn)出+1.5kg奶/動(dòng)物/天的提高。
[0212] 表8中詳細(xì)示出了奶組合物(脂肪和蛋白）的結(jié)果。
[0213] 塾:批次的奶的組成和統(tǒng)計(jì)學(xué)
[0214]
[0216] 在測試期間，對照組中乳脂水平保持穩(wěn)定，而在處理組(補(bǔ)充有根據(jù)本發(fā)明的酶組 合物）中乳脂水平增加。經(jīng)處理的牛的批次中的乳脂水平總是高于對照牛的批次中的乳脂 水平。在85天的測試之后，處理組的牛的乳脂水平比對照組的牛的乳脂水平高0.12點(diǎn)。
[0217] 在該測試過程中，與對照組相比，測試組中奶的蛋白水平增加較快。據(jù)統(tǒng)計(jì)，本發(fā) 明人注意到，在D53和D69，蛋白水平分別顯著地增加 +0.21點(diǎn)和+0.17點(diǎn)。這還表示為蛋白的 較大輸出（在測試結(jié)束時(shí)，+〇. 〇8kg/天）。
[0218] 反芻活動(dòng)對奶牛的代謝活性非常重要，并且可以是監(jiān)測動(dòng)物健康的有用手段。反 芻刺激唾液的產(chǎn)生，因此確保了瘤胃中對于纖維素分解活性的最佳條件。
[0219] 表9中示出了平均每日反芻活動(dòng)的數(shù)據(jù)。反芻活動(dòng)以每天每只動(dòng)物的反芻分鐘數(shù) 來表示。
[0220] 表9:動(dòng)物的反芻活動(dòng)(反芻的分鐘/動(dòng)物/天)
[0221]
[0222] 兩組在測試開始時(shí)沒有呈現(xiàn)出任何統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(對照組和處理組分別為500.6分 鐘/天/動(dòng)物比511.6分鐘/天/動(dòng)物）。然而，在測試16天后，在處理批次中，反會(huì)活動(dòng)數(shù)值增 加。在測試的后期(D69至D85)，相互作用（處理X時(shí)段)是顯著的（P = 0.0132)，處理組的反 芻活動(dòng)大于對照組的反芻活動(dòng)(+52.2分鐘/天/動(dòng)物）。對D21至D85時(shí)段的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明： 在處理組的牛中，具有反芻活動(dòng)+39分鐘/天/動(dòng)物的相同的相互作用。
[0223] 該實(shí)施例證實(shí)了：提供根據(jù)本發(fā)明的酶組合物能夠改善高產(chǎn)奶牛的奶產(chǎn)量(每日 產(chǎn)奶量、乳蛋白的產(chǎn)量和乳脂的產(chǎn)量）的畜牧學(xué)性能，更好地穩(wěn)定飼料日糧的價(jià)格，以及改 進(jìn)反芻活動(dòng)。
[0224] 實(shí)施例5:測量根據(jù)本發(fā)明的酶組合物在體外對瘤胃發(fā)酵的影響(氣體釋放）
[0225] 在本實(shí)施例中，描述了根據(jù)本發(fā)明的酶組合物在體外對瘤胃發(fā)酵，尤其是對氣體 釋放、特別是甲烷產(chǎn)生的影響。
[0226] 材料和方法
[0227] 動(dòng)物
[0228] 使用具有瘤胃插管的挑選的兩頭牛。在體外實(shí)驗(yàn)的整個(gè)持續(xù)過程中，用半干飼草 (4kg )、玉米青貯飼料(5kg/天）、切碎的稻草(1 kg)和濃縮物（1 kg)的混合物喂養(yǎng)動(dòng)物。
[0229] 配料
[0230] 對四種飼料原料進(jìn)行體外研究：干牧草、牧草青貯飼料、玉米青貯飼料和大豆餅。 表10中示出了實(shí)驗(yàn)配料的化學(xué)組成。
[0231] 表10:所使用配料的化學(xué)組成
[0232]
[0233] Ματ:總含氮材料
[0234] 2Ν/Α:不適用
[0235] 對不同的配料進(jìn)行冷凍干燥，并利用實(shí)驗(yàn)室粉碎機(jī)研磨至1_。
[0236] 將使用新型黑曲霉(Aspergillus neoniger)的菌株，根據(jù)實(shí)施例1中所述的生產(chǎn) 方法得到的酶組合物標(biāo)準(zhǔn)化為預(yù)混合物，用于確保該組合物的良好均勻性，并促進(jìn)其在"頂 部喂養(yǎng)"中向動(dòng)物分配的步驟中的應(yīng)用。將所得到的預(yù)混合物混合在全日糧中以提供 3375BGU/動(dòng)物/天。由此標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)混合物的特征是:70AXC/g、213BGU/g&&28CMC/g。
[0237]根據(jù)Menke和Steingass(1988)描述的方法來進(jìn)行體外發(fā)酵。接種物由1/3的在2頭 挑選出的牛中收集的瘤胃流體，以及2/3的Menke和Steingass緩沖液（Menke K H， Steingass Η.(1988)Estimation of the energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid.Animal Research Development. 28,7-55)組成。在接種物的存在下，將200mg的底物并入到100ml的 玻璃注射器中。定期進(jìn)行氣體體積的讀取。
[0238] 在進(jìn)行正常飼料喂食的動(dòng)物中采樣瘤胃流體(對照），并且隨后在同一動(dòng)物適應(yīng)于 以lg/kg食料（~15g/天/動(dòng)物）的量補(bǔ)充有根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的喂食3周后，采樣瘤胃 流體(測試）。
[0239] 實(shí)驗(yàn)方案如下:4種底物X 2種處理(對照或測試）X 3個(gè)注射器+3個(gè)空白=27個(gè)注 射器/系列。進(jìn)行兩個(gè)系列(54個(gè)注射器），以確定甲烷(CH4)的產(chǎn)量和氨態(tài)氮(N-NH 3)的產(chǎn)量。 [0240]用于產(chǎn)生CH4和N-NH3的系列的發(fā)酵進(jìn)行24h。在24h結(jié)束時(shí)，對發(fā)酵瓶的氣相樣品進(jìn) 行取樣以通過氣相色譜法確定CH 4的產(chǎn)量，并且對液相樣品進(jìn)行取樣以確定N-NH3的產(chǎn)量。在 開始發(fā)酵時(shí)，對接種物的3個(gè)樣品進(jìn)行離心，并分析它們的N-NH3含量。
[0241] CH4產(chǎn)量與用于發(fā)酵的底物的DM的克數(shù)相關(guān)，并且數(shù)值根據(jù)接種物和空白進(jìn)行校 正。
[0242] 莖里
[0243]如表11所示，從發(fā)酵24h后產(chǎn)生的甲烷量的角度來看，似乎呈現(xiàn)出，對于草料配料 (干草、干草料和玉米青貯飼料），使用根據(jù)本發(fā)明的酶組合物產(chǎn)生較少甲烷的趨勢，并且氨 被瘤胃原住菌利用的較高(較低的NH3含量）。
[0244] 表11:在存在或不存在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的情況下，利用瘤胃流體使飼料配 料在體外發(fā)酵24h后的甲燒和氨的產(chǎn)量(N=6)
[0245]
[0246] 通過24小時(shí)后進(jìn)行的測量（甲烷和NH3)，本發(fā)明人能夠觀察所有的纖維飼料原料 (草料:干草、玉米青貯飼料和干牧草)具有一致的趨勢：甲烷產(chǎn)量降低，并且發(fā)酵緩沖液中 的氨得到了瘤胃微生物的更好的利用。這意味著，在發(fā)酵的第一時(shí)間，在根據(jù)本發(fā)明的酶組 合物的存在下進(jìn)行孵育的草料可更好地促進(jìn)細(xì)菌生長，從而確保為牛更好地供應(yīng)微生物來 源的蛋白和氨基酸。
[0247] 該實(shí)施例表明：提供根據(jù)本發(fā)明的酶組合物能夠降低反芻動(dòng)物瘤胃中所包含的微 生物的甲烷的產(chǎn)量。
[0248] 實(shí)施例6:測量根據(jù)本發(fā)明的酶組合物在尼龍袋中對反芻動(dòng)物的飼料原料的消化 率的影響
[0249] 在本實(shí)施例中，描述了根據(jù)本發(fā)明的酶組合物在尼龍袋中對反芻動(dòng)物飼料的多種 常規(guī)原料的消化率的影響。
[0250] 材料和方法 [0251 ] 動(dòng)物
[0252] 使用具有瘤胃插管的挑選的兩頭牛。在尼龍袋實(shí)驗(yàn)的整個(gè)持續(xù)過程中，用半干飼 草(4kg )、玉米青貯飼料(5kg/天）、切碎的稻草(1 kg)和濃縮物(1 kg)的混合物喂養(yǎng)動(dòng)物。
[0253] 配料
[0254] 在尼龍袋中對四種飼料原料進(jìn)行研究:干牧草、干草青貯飼料、玉米青貯飼料和大 豆餅。表12中示出了實(shí)驗(yàn)配料的化學(xué)組成。
[0255] 表12:所使用配料的化學(xué)組成
[0256
[0257] ^ΑΤ:總含氮材料
[0258] 2Ν/Α:不適用
[0259] 對不同的配料進(jìn)行冷凍干燥，并利用實(shí)驗(yàn)室粉碎機(jī)研磨至1_。
[0260]將使用新型黑曲霉(Aspergillus neoniger)的菌株，根據(jù)實(shí)施例1中所述的生產(chǎn) 方法得到的酶組合物標(biāo)準(zhǔn)化為預(yù)混合物，用于確保該組合物的良好均勻性，并促進(jìn)其在"頂 部喂養(yǎng)"中向動(dòng)物分配的步驟中的應(yīng)用。將所得到的預(yù)混合物混合在全日糧中以提供 3375BGU/動(dòng)物/天。由此標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)混合物的特征是:70AXC/g、213BGU/g&&28CMC/g。
[0261] 為了研究根據(jù)本發(fā)明的酶組合物在動(dòng)物的瘤胃代謝中引起的變化，通過使用尼龍 袋技術(shù)（0J*sk；ov?E.R.，Hovell，D and Mould，F(xiàn).L. (1980) .The use of the nylon bag technique for the evaluation of feedstuffs.Tropical Animal Production 5:195- 213)，使用2頭插管的干奶牛進(jìn)行尼龍袋實(shí)驗(yàn)。在尼龍袋中，對四種測試的飼料原料進(jìn)行兩 個(gè)系列的消化率:動(dòng)物喂食上述飼料食物(對照）的系列；隨后，在同一動(dòng)物適應(yīng)于具有約 lg/kg食料(~15g/天/動(dòng)物)的量的根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的補(bǔ)充食物(測試)3周后進(jìn)行的 系列。實(shí)驗(yàn)方案如下:4種配料X 2種處理(對照或測試）X 4個(gè)袋X 7個(gè)測量時(shí)間（0、3、6、9、 12、24、481〇=224袋。分析(0、6、12、24、4811)袋中發(fā)酵的飼料原料的粗蛋白含量、冊？、能量 和淀粉含量(淀粉專用于玉米青貯飼料）。
[0262] 通過參考方法（method 967 · 03 ;method 981 · 10 ; "Official methods of analysis"，A0AC, 1990，Ed .Kenneth Heir ich)，確定配料在水解前和水解后的干物質(zhì)和粗 蛋白的含量。通過酶和比色法(Megazyme Ltd,愛爾蘭)來確定玉米青飼料的淀粉含量。根 據(jù)Van Soest等人（Van Soest P.J.，Robertson J.B.，Lewis B.A.(1991):Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition.J.Dairy Sci. ,74,3583-3597)的方法，通過ANKOM系統(tǒng)， 利用熱穩(wěn)定淀粉酶測定NDF (中性洗滌纖維)含量。
[0263]在尼龍袋中消化結(jié)束時(shí)，計(jì)算干物質(zhì)、淀粉、能量、NDF和淀粉的消化率，并且根據(jù) 相關(guān)的配料以及是否具有補(bǔ)充劑（N= 8)，對值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，并且利用Orskov和 McDonald模型（Orskov，E.R.and McDonald，Y.1979.Protein degradability in the rumen was estimated from determining the digestibility of feeds in the rumen. (Daynal Agricultural Science,Cambridge 92:499-503)來模擬降解動(dòng)力學(xué)。牛被認(rèn)為是 隨機(jī)因素。
[0264] 題
[0265] 向牛分配根據(jù)本發(fā)明的酶組合物，沒有顯著改變在插管的牛的瘤胃中孵育的、容 納在尼龍袋中的配料的干物質(zhì)的最終降解度(表13)。然而，實(shí)際上草料、特別是與干牧草相 關(guān)的降解動(dòng)力學(xué)受到了影響，因?yàn)樵诟鶕?jù)本發(fā)明的酶組合物的存在下，降解度在24h后達(dá)到 0.820，而在沒有本發(fā)明的酶組合物的存在下，降解度在24h后達(dá)到0.645(P<0.05)。
[0266] 這種趨勢得到了中性洗滌纖維(NDF)中的不溶性纖維部分發(fā)生更快降解的證實(shí) (表14)。事實(shí)上，對于干牧草，根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的加入使得NDF的降解度在24h之后從 0.370達(dá)到0·685(Ρ<0· 05)，并且，在玉米和干草中觀察到了相同的趨勢，而對氮(表15)而 言沒有非顯著性差異(Ρ>〇. 05)。
[0267] 與未補(bǔ)充的牛相比，當(dāng)牛補(bǔ)充有根據(jù)本發(fā)明的酶組合物時(shí)，大豆中包含的粗能量 的降解度在6小時(shí)和12小時(shí)后是更好的(0.600和0.540比0.420和0.490)(表16)。
[0268] ^13 :在0、3、6、9、12、24和48h之后，在存在或不存在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的情 況下，干材料在尼龍袋中的消化率(N=4) (g/g飼料原料）
[0269]
[0270] 加粗:顯著性差異(ρ<0·05)
[0271] 表14:在0、6、12和48h之后，在存在或不存在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的情況下，NDF 在尼龍袋中的消化率(N=2)(g/g飼料原料）
[0272]
[0273] *:尼龍袋中沒有足夠的樣品進(jìn)行該檢驗(yàn)
[0274] 加粗:顯著性差異(Ρ<0·05)
[0275] 表15:在0、6、12和48h之后，在存在或不存在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的情況下，氮 在尼龍袋中的消化率(N=2)(g/g飼料原料）
[0276]
[0277] *:尼龍袋中沒有足夠的樣品進(jìn)行該檢驗(yàn)
[0278] 加粗:顯著性差異(Ρ<0·05)
[0279] 表16:在0、6、12和48h之后，在存在或不存在根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的情況下，粗 能量在尼龍袋中的消化率(N=2)(g/g飼料原料）
[0280]
[0281] *:尼龍袋中沒有足夠的樣品進(jìn)行該檢驗(yàn)
[0282] 加粗：顯著性差異(Ρ<0·05)
[0283] 通過這些尼龍袋降解度的測量，證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明的酶組合物對纖維飼料原料具 有顯著性影響的假說。根據(jù)本發(fā)明的酶組合物加速了 3種纖維飼料原料的降解過程，并且顯 著性地加速了干牧草并且尤其是其纖維部分(NDF)的發(fā)酵。在奶牛中的效果可以是降低瘤 胃的膨松性，并且增加攝入草料的能力。這種效果對于通過消耗草料難以滿足其對食物需 求，而必須以顯著的方式補(bǔ)充比草料源昂貴的產(chǎn)品濃縮物的泌乳動(dòng)物來說具有非常重要的 意義。
[0284] 本實(shí)施例證實(shí)了：提供根據(jù)本發(fā)明的酶組合物能夠更好地穩(wěn)定動(dòng)物的草料源的價(jià) 格，并且因此得到更好的食物效率。
[0285] 實(shí)施例7:在溢流式厭氧反應(yīng)器(0AR)和培養(yǎng)管下，測量根據(jù)本發(fā)明的酶組合物對 瘤胃的微生物代謝的影響
[0286] 本實(shí)施例的目標(biāo)是：
[0287] 1)量化根據(jù)本發(fā)明的酶組合物對牛科動(dòng)物瘤胃的微生物代謝的影響，其中?？苿?dòng) 物瘤胃的微生物在6個(gè)溢流式厭氧反應(yīng)器(0AR)中的?？粕蟮?種特征日糧上進(jìn)行培養(yǎng)。 0AR為具有雙排出的連續(xù)發(fā)酵罐。
[0288] 2)通過在培養(yǎng)管中孵育24h后，測量粗酶組合物、它的可溶部分和不溶部分以及經(jīng) 高壓滅活的酶組合物對揮發(fā)性脂肪酸(VFA)產(chǎn)量和氣體的影響，詳細(xì)說明根據(jù)本發(fā)明的酶 組合物對瘤胃發(fā)酵的作用模式。
[0289] 材料和方法
[0290] 溢流式厭氧反應(yīng)器(0AR)中的測試
[0291] 使用工作體積為1升的六個(gè)發(fā)酵罐，將其固相和液相的更新速率分別調(diào)節(jié)至 0.031Γ1和0.061Γ 1。將經(jīng)1mm網(wǎng)狀物過濾的奶牛瘤胃的內(nèi)容物接種在這些發(fā)酵罐中。通過連 續(xù)輸入緩沖溶液(碳酸鹽和磷酸鹽），使發(fā)酵罐的pH值保持在6.0以上。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)供給 底物(飼料原料）：在llh和23h時(shí)。在測量和采樣階段前的第一個(gè)5天期間，進(jìn)行發(fā)酵罐的平 衡階段。
[0292]以10g/kg DM日糧的水平引入根據(jù)本發(fā)明的酶組合物。日供應(yīng)量為0.25g/發(fā)酵罐。 一方面利用塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的菌株（1號），另一方面利用新型黑曲霉 (Aspergillus neoniger)的菌株(2號），通過實(shí)施例1中所述的生產(chǎn)方法來制備兩個(gè)批次的 酶組合物。由此獲得的酶組合物具有以下特征:對于1號樣本，l，037AXC/g、l，063BGU/g和 262CMC/g;對于2號樣本，3，399AXC/g、3，623BGU/g和846CMC/g。將所得到的兩種組合物標(biāo)準(zhǔn) 化為兩種預(yù)混合物，以有助于將其加入到發(fā)酵罐中。由此標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)混合物的特征是:對于 1 號樣本，171 AXC/g、225B ⑶/g 和 67CMC/g;對于 2 號樣本，122AXC/g、280B ⑶/g 和 75CMC/g。 [0293]日糧包含小麥和大豆餅，從而配制等氮且等能量的食物。
[0294]各種測試因素為：
[0295] 1)產(chǎn)品，3種水平的因素:無 /1號酶組合物/2號酶組合物。
[0296] 2)日糧，3種水平的因素:基于玉米青貯飼料/牧草青貯飼料/果樹草(de foin de dactyle)
[0297] 選定的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃是在對應(yīng)于7天3個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)段的3個(gè)平衡不完全區(qū)組(表17)中的計(jì) 劃，每個(gè)計(jì)劃包括5天的平衡階段和2天的測量和采樣階段。
[0298] 表17:在0AR中使用兩種酶組合物和各種飼料原料進(jìn)行測試的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。
[0299]
[0300] EH:牧草青貯飼料;EM:玉米青貯飼料;F:草原干草 [0301 ]在測試過程中，進(jìn)行測量和采樣：
[0302] -pH，氧化還原電位；
[0303]-發(fā)酵罐內(nèi)容物，用于對原生動(dòng)物進(jìn)行計(jì)數(shù)并且確定發(fā)酵相(VFA，氨態(tài)氮）；
[0304] -氣體(收集2天），用于測量所產(chǎn)生的體積及其組成；
[0305] -收集2天流出物，用于日糧的降解結(jié)果以及微生物蛋白質(zhì)的發(fā)酵和合成；
[0306] -對新鮮的流出物進(jìn)行兩次離心得到的微生物沉淀塊。
[0307] 在樣品進(jìn)行以下分析：
[0308] -青貯飼料、流出物和發(fā)酵內(nèi)容物中的VFA(色譜法）；
[0309] -氨態(tài)氮(特異性探針）；
[0310] -氣體(色譜法）；
[0311] -飼料原料和冷凍干燥的流出物中的DM、有機(jī)材料；
[0312] -飼料原料和冷凍干燥的流出物中的淀粉；
[0313]-根據(jù)范氏法(Van Soest)(NDF、ADF、ADL)，對飼料原料和冷凍干燥的流出物中的 壁的分離；
[0314] -在飼料原料、冷凍干燥的流出物以及微生物沉淀塊中的氮(杜馬斯(Dumas)法）；
[0315] -在冷凍干燥的流出物和微生物沉淀塊中的核酸堿基(色譜法）。
[0316] 利用如下的方差分析模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:YijkpPi+Rj+Pi+Rj+Bk+eijki，其中，P、 R、B和e分別為產(chǎn)品因素、食物因素、區(qū)組和實(shí)驗(yàn)誤差。
[0317] 培養(yǎng)管中的測試
[0318] 在按照標(biāo)準(zhǔn)程序孵育24h并且在最后供應(yīng)日糧后的12h，對發(fā)酵罐的內(nèi)容物進(jìn)行采 樣，將樣品接種到60個(gè)裝配有丁基聚四氟乙烯塞子的72mL的培養(yǎng)管中。所研究的因素是：
[0319] 1)產(chǎn)品，5種水平的P因素:無/2號組合物/2號組合物的不溶部分/2號組合物的液 體部分(無發(fā)酵底物)/經(jīng)高壓滅活的酶組合物。2號組合物的液體部分對應(yīng)于從2號組合物 的其余部分提取在水相中的酶。
[0320] 2)接種物，3種水平的R因素：合應(yīng)于基于玉米青貯飼料/牧草青貯飼料/果園草 (foin de dactyle)的日糧并且在培養(yǎng)管中接收相同的日糧。
[0321] 以10g/kg DM日糧的水平，引入根據(jù)本發(fā)明的2號酶組合物。
[0322] 對于每一接種物，在連續(xù)兩天在兩個(gè)時(shí)段中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。在平衡期后，從沒有接 收酶組合物的0AR上采集接種物(在0AR中的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃中，產(chǎn)品因素為0水平）。在孵育的每一 天和每次處理(產(chǎn)品X接種的組合)都引入兩個(gè)培養(yǎng)管。
[0323] 在測試期間，進(jìn)行測量和采樣：
[0324] -接種物，以確定其VFA組成；
[0325] -在管中孵育24h后的培養(yǎng)基，用于確定VFA組成；
[0326] -氣體，用于測量在孵育24h后的產(chǎn)生量以及確定其組成。
[0327] 對樣品進(jìn)行以下分析：
[0328] -青貯飼料、流出物和發(fā)酵內(nèi)容物中的VFA(色譜法）；
[0329] -氣體(色譜法）。
[0330]利用方差分析模型來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
[0331]該分析表明：與發(fā)酵底物的分離的酶對瘤胃微生物代謝的效果相比，根據(jù)本發(fā)明 的酶組合物對瘤胃的微生物代謝具有有益的效果。
[0332]實(shí)施例8:通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的酶組合物
[0333] 在本實(shí)施例中，描述了在塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的菌株的存在下， 通過由菜籽餅和麥麩(主底物）的混合物和玉米胚芽餅(附加底物)組成的底物進(jìn)行固態(tài)發(fā) 酵，來獲得根據(jù)本發(fā)明的酶組合物的方法。
[0334] 營養(yǎng)介質(zhì)由菜籽餅(作為粉狀物)和麥麩的混合物以及玉米胚芽餅以如下重量比 例的制成:36 %的菜籽餅、36 %的麥麩、28 %的玉米胚芽餅。然后，將混合物預(yù)加濕至60 %的 干物質(zhì)，且在105°C下高壓滅菌35分鐘。冷卻后，將塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的 孢子的溶液接種到該介質(zhì)中，以獲得1 X 1〇7孢子/克干物質(zhì)的濃度和45%的初始濕度。通過 加入硫酸，將pH調(diào)節(jié)至4.9。將由此所得的培養(yǎng)基以10g干物質(zhì)/瓶的量分配在錐形瓶中。隨 后，將錐形瓶在33°C、有氧條件下，在黑暗中孵育72小時(shí)，同時(shí)不進(jìn)行任何攪拌。當(dāng)培養(yǎng)基中 出現(xiàn)第一孢子時(shí)，停止培養(yǎng)(因?yàn)殒咦拥膿]發(fā)性而在攝入期間使動(dòng)物不安，所以發(fā)酵產(chǎn)品被 設(shè)計(jì)成含有最小可能量的孢子）。
[0335] 對發(fā)酵結(jié)束時(shí)獲得的混合物進(jìn)行干燥并且就這樣來喂養(yǎng)動(dòng)物，或者將該獲得的混 合物提取在水中，從而以液體形式加入。
[0336] 由此獲得的組合物在發(fā)酵72小時(shí)后的特征是：2,65(^乂(：/^、4,808861]/^和1， 050CMC/g〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種酶組合物，所述酶組合物包括經(jīng)曲霉亞屬尼格里菌Aspergi llus section Nigri的菌株發(fā)酵的主底物，所述主底物選自由小麥，麥麩，菜籽餅，小麥和麥麩的混合物， 小麥和菜籽餅的混合物，麥麩和菜籽餅的混合物以及小麥、麥麩和菜籽餅的混合物所組成 的組，所述酶組合物呈現(xiàn)出： (i) 每克組合物的木聚糖酶活性大于或等于500AXC， (ii) 每克組合物的β-葡聚糖酶活性大于或等于500BGU，以及 (iii) 每克組合物的纖維素酶活性大于或等于50CMC。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中，所述曲霉亞屬尼格里菌Aspergi 1 lus section Nigri的菌株為黑曲霉Aspergillus niger進(jìn)化枝的菌株。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的酶組合物，其中，所述曲霉亞屬尼格里菌Aspergillus section Nigri的菌株為塔賓曲霉Aspergillus tubingensis子進(jìn)化枝的菌株。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中，所述曲霉亞屬尼格里菌 Aspergillus section Nigri的菌株為塔賓曲霉Aspergillus tubingensis或新型黑曲霉 Aspergillus neoniger的菌株。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中，所述曲霉亞屬尼格里菌 Aspergillus section Nigri的菌株為塔賓曲霉Aspergillus tubingensis的菌株。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中，所述底物是經(jīng)所述曲霉亞屬尼 格里菌Aspergillus section Nigri的菌株通過固態(tài)發(fā)酵而被發(fā)酵的。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的酶組合物，其中，所述底物由麥麩和菜籽餅的混 合物組成。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的酶組合物，其中，所述麥麩和所述菜籽餅的質(zhì)量比為20/80至 50/50。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的酶組合物，所述酶組合物呈現(xiàn)出： (i) 每克組合物的木聚糖酶活性大于或等于1000AXC， (ii) 每克組合物的β-葡聚糖酶活性大于或等于800BGU，以及 (iii) 每克組合物的纖維素酶活性大于或等于120CMC。10. -種權(quán)利要求3中所限定的酶組合物的制造方法，所述制造方法包括以下步驟:使 用塔賓曲霉A. tubingensis子進(jìn)化枝的菌株，對選自由小麥，麥麩，菜籽餅，小麥和麥麩的混 合物，小麥和菜籽餅的混合物，麥麩和菜籽餅的混合物以及小麥、麥麩和菜籽餅的混合物所 組成的組中的主底物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，直至發(fā)酵產(chǎn)物至少呈現(xiàn)出以下酶活性的最小值： (i) 每克組合物的木聚糖酶活性大于或等于500AXC， (ii) 每克組合物的β-葡聚糖酶活性大于或等于500BGU，以及 (iii) 每克組合物的纖維素酶活性大于或等于50CMC。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的制造方法，其中，所述塔賓曲霉Aspergillus tubingensis 子進(jìn)化枝的菌株為塔賓曲霉Aspergi 1 lus tub ingens is或新型黑曲霉Aspergi 1 lus neoniger的菌株。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的制造方法，其中，所述塔賓曲霉Aspergi llus tubingensis 子進(jìn)化枝的菌株為塔賓曲霉Aspergi 1 lus tub ingens i s的菌株。13. -種反芻動(dòng)物飼料的添加劑，所述添加劑包括根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的 酶組合物。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的添加劑在喂養(yǎng)反芻動(dòng)物的飼料組合物或預(yù)混合物中用作配 料的應(yīng)用。15. -種用于喂養(yǎng)反芻動(dòng)物的預(yù)混合物，所述預(yù)混合物包括根據(jù)權(quán)利要求13所述的添 加劑。16. -種反芻動(dòng)物的補(bǔ)充飼料組合物，所述補(bǔ)充飼料組合物包括:有效量的根據(jù)權(quán)利要 求13所述的添加劑或根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)混合物，以及適用于反芻動(dòng)物的飼料原料。17. -種制造反芻動(dòng)物的補(bǔ)充飼料組合物的方法，所述方法包括:使根據(jù)權(quán)利要求13所 述的添加劑或根據(jù)權(quán)利要求15所述的預(yù)混合物，與適用于反芻動(dòng)物的飼料原料混合。18. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的酶組合物、根據(jù)權(quán)利要求13所述的添加劑、根據(jù) 權(quán)利要求15所述的預(yù)混合物或根據(jù)權(quán)利要求16所述的飼料組合物在提高反芻動(dòng)物的畜牧 學(xué)性能中的應(yīng)用。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，用于提高奶產(chǎn)量，和/或改善消耗指數(shù)和/或食物效 率，和/或促進(jìn)體重增加，和/或增加反芻活動(dòng)，和/或提高草料和濃縮物的消化率，和/或降 低甲烷的產(chǎn)量。20. -種用于改善反芻動(dòng)物的畜牧學(xué)性能的方法，其中，使所述反芻動(dòng)物攝入有效量的 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的酶組合物、根據(jù)權(quán)利要求13所述的添加劑、根據(jù)權(quán)利要 求15所述的預(yù)混合物或根據(jù)權(quán)利要求16所述的飼料組合物。
【文檔編號】A23K10/30GK105939613SQ201580006124
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2015年1月27日
【發(fā)明人】伯努瓦·德洛德, 馬修·圖爾納特
【申請人】J·舒福萊企業(yè)公司