豌豆蛋白的新型分離方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了分離豌豆蛋白的方法。所述方法開始于豌豆蛋白的水性提取物或溶液，使其通過至少一種膨脹床吸附(EBA)過程。所述EBA過程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液與至少一種吸附樹脂接觸，所述吸附樹脂包含具有特定化學結(jié)構(gòu)的至少一種配體(L1或L2)。目標蛋白通過將其從所述吸附樹脂洗脫而分離。本發(fā)明還提供了經(jīng)由本發(fā)明的方法可獲得的各種蛋白組合物。
【專利說明】豌豆蛋白的新型分離方法發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及豌豆蛋白的分離方法以及由所述方法獲得的純化的豌豆蛋白。
[0002]發(fā)明背景
[0003]豌豆(來自(Pisum Sativum)植物的種子)是人類和動物的未加工形式和加工形式的蛋白的重要來源。
[0004]WO 2011/122937、W0 1998/033388和WO 2011/050471 全部涉及分離、純化和使用豌豆蛋白的各個方面。另外，Croy等，B1chem J.1980,191,509-516討論了來自豌豆的伴豌豆球蛋白(convicilin)的純化和特性。
[0005]分離豌豆蛋白級分的先前方法通常涉及給定級分的沉淀。在鹽的分級中，豆球蛋白在鹽中沉淀，豌豆球蛋白保持可溶的。然而，當分離富含豌豆球蛋白的級分時，伴豌豆球蛋白已被證明是污染物，并且難以避免。豆球蛋白級分通常被伴豌豆球蛋白污染。伴豌豆球蛋白污染在大規(guī)模的分離過程中是典型的(參見，例如Geuguen等，J.Sc1.FoodAgric.1984,35,1024-1033；Larre&Gueguen,J.Chromatogr.1986,361,169-178)。
[0006]發(fā)明目標
[0007]盡管至今已取得進步，但仍需要從豌豆蛋白的水性提取物或溶液中純化和分離蛋白的替代和改善的方法。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些配體對豌豆蛋白中的各種蛋白顯示出選擇性親和力。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及分離豌豆蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0010]1.提供豌豆蛋白的水性提取物或豌豆蛋白的溶液，所述豌豆蛋白的提取物或溶液包含至少兩種類型的豌豆蛋白；
[0011]i1.使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液通過至少一種膨脹床吸附過程，其中所述膨脹床吸附過程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液與至少一種吸附樹脂接觸以提供未結(jié)合的蛋白級分和結(jié)合的蛋白級分，所述吸附樹脂選擇性地吸附至少第一類型的豌豆蛋白，所述吸附樹脂包含:
[0012]至少一種配體(LI)，所述至少一種配體(LI)包含芳族或雜芳族環(huán)系和一種或多種酸性基團，或者
[0013]至少一種配體(L2)，所述至少一種配體(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在配體(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被選自以下的一個或多個基團取代的胺:
[0014]a.芳基、芐基或雜芳基；
[0015]b.具有4-16個碳原子的烷基，所述烷基可以為直鏈、支鏈或環(huán)狀的；
[0016]或者它們的組合；
[0017]ii1.通過洗脫所述未結(jié)合的蛋白級分或所述結(jié)合的蛋白級分從所述吸附樹脂中分離所述第一類型的豌豆蛋白；以及
[0018]iv.從所述吸附樹脂中分離第二類型的豌豆蛋白以提供第二豌豆蛋白組合物，所述第二豌豆蛋白組合物在所述第一類型的豌豆蛋白中被消耗。
[0019]方法以及配體LI和L2的進一步詳細內(nèi)容在本發(fā)明的下述詳述以及所附權(quán)利要求中給出。
[0020]本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法獲得的豌豆蛋白組合物。
【附圖說明】
[0021]圖1-11示出本發(fā)明實例的SDS-PAGE凝膠。
[0022]圖12-16b示出，與商用豌豆蛋白來源相比，根據(jù)本發(fā)明分離的豌豆蛋白的性質(zhì)。
[0023]發(fā)明詳述
[0024]如上所述，本發(fā)明提供了分離豌豆蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0025]1.提供豌豆蛋白的水性提取物或豌豆蛋白的溶液，所述豌豆蛋白的提取物或溶液包含至少兩種類型的豌豆蛋白；
[0026]i1.使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液通過至少一種膨脹床吸附過程，其中所述膨脹床吸附過程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液與至少一種吸附樹脂接觸以提供未結(jié)合的蛋白級分和結(jié)合的蛋白級分，所述吸附樹脂選擇性地吸附至少第一類型的豌豆蛋白，所述吸附樹脂包含:
[0027]至少一種配體(LI)，所述至少一種配體(LI)包含芳族或雜芳族環(huán)系和一種或多種酸性基團，或者
[0028]至少一種配體(L2)，所述至少一種配體(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在配體(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被選自以下的一個或多個基團取代的胺:
[0029]a.芳基、芐基或雜芳基；
[0030]b.具有4-16個碳原子的烷基，所述烷基可以為直鏈、支鏈或環(huán)狀的；
[0031]或者它們的組合；
[0032]ii1.通過洗脫所述未結(jié)合的蛋白級分或所述結(jié)合的蛋白級分從所述吸附樹脂中分離所述第一類型的豌豆蛋白；以及
[0033]iv.從所述吸附樹脂中分離第二類型的豌豆蛋白以提供第二豌豆蛋白組合物，所述第二豌豆蛋白組合物在所述第一類型的豌豆蛋白中被消耗。
[0034]適當?shù)?，方法的步驟依序進行，而無介入步驟。
[0035]豌豆和豌豆蛋白
[0036]豌豆為豌豆植物的種子，是生長于世界許多地區(qū)的豆科作物。豌豆作為食品和食品成分的來源具有重大的經(jīng)濟重要性。
[0037]婉?蛋白是婉?中存在的蛋白的通用術(shù)語。婉?含有約25%的蛋白。
[0038]豌豆中大的蛋白級分為:
[0039]1.凝集素
[0040]2.豆球蛋白(類似于大豆球蛋白)，60kDa并且可以被分成40kDa和20kDa的亞基。[0041 ] 3.豌豆球蛋白，50kDa并且可以被分成331^^、301^^、191^^、171^^和12.51^3的亞基。
[0042]4.伴碗豆球蛋白，70kDa
[0043]已經(jīng)開發(fā)了復(fù)雜的實驗室程序以將蛋白彼此分級。此類技術(shù)不能實際地應(yīng)用于商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。這些技術(shù)中的一些也難以再現(xiàn)，因為程序中小的變化顯著地改變產(chǎn)物的最終組成。
[0044]方法
[0045]根據(jù)本發(fā)明的方法開始于豌豆蛋白的粗制水性提取物或豌豆蛋白的溶液。通常，豌豆蛋白的水性提取物通過用水或者稀酸或稀堿提取豌豆或豌豆產(chǎn)物(例如壓碎的豌豆或豌豆粉)獲得。提取優(yōu)選在I至60°C的溫度下進行0.1至20小時。水可以具有近中性的pH(pH
6.5-7.5),或者可以為堿性的，例如pH 8.Ο-pH 12。在一些情況下，在提取期間，提取混合物的pH通過添加水性堿而在優(yōu)選范圍內(nèi)保持恒定。
[0046]在一些情況下，豌豆蛋白為來源于通過進一步加工如沉淀、離心和過濾(包括膜過濾，如超濾、鈉濾和微濾)的粗提物的豌豆蛋白的溶液。在優(yōu)選實施方案中，豌豆蛋白溶液由蛋白沉淀物制備，所述蛋白沉淀物通過酸化近中性或堿性豌豆蛋白提取物獲得。
[0047]豌豆蛋白可以來自于豌豆中所有豌豆蛋白的“全部”提取物。豌豆蛋白也可以來自于豌豆乳清，在低PH(?pH 4.5)時，大部分蛋白已經(jīng)從所述豌豆乳清中沉淀，而在提取物中留下低PH的可溶性蛋白。
[0048]為了與分離過程的pH相匹配，豌豆蛋白的水性提取物或溶液可以在步驟(ii)之前進行PH調(diào)節(jié)，優(yōu)選將pH調(diào)節(jié)至2.0-9.0。調(diào)節(jié)pH可以導致水性提取物中的蛋白質(zhì)沉淀，因此可以傾析、離心或過濾PH-調(diào)節(jié)的豌豆蛋白提取物以在步驟(ii)之前移除不溶性材料。
[0049]豌豆蛋白的水性提取物或溶液包含至少兩種類型的豌豆蛋白-第一類型的豌豆蛋白和第二類型的豌豆蛋白。
[0050]使豌豆蛋白的水性提取物或溶液通過至少一種分離過程，所述分離過程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物與至少一種吸附樹脂接觸。
[0051]吸附樹脂選擇性地吸附至少第一類型的豌豆蛋白，并且可能吸附其它豌豆蛋白。因此，獲得了未結(jié)合的蛋白級分和結(jié)合的蛋白級分。
[0052]分離過程為固相吸附過程:膨脹床吸附(EBA)。
[0053]膨脹床吸附(EBA)
[0054]在近些年開發(fā)的各種工業(yè)色譜分離技術(shù)中，膨脹床吸附(EBA)已經(jīng)成功地引入生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的某些領(lǐng)域中。EBA為一類流化床吸附，其中返混水平保持最小。與其它色譜分離技術(shù)相比，EBA提供顯著的優(yōu)勢，因為它可以直接使用非澄清進料。
[0055]在EBA期間，當應(yīng)用液體流時，允許吸附樹脂的床在色譜柱內(nèi)膨脹。床的膨脹通常在柱或一些其它穿孔裝置中實現(xiàn)，所述柱具有在其各個末端提供的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所述網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)覆蓋柱的橫截面積，所述穿孔裝置在流動中不產(chǎn)生湍流。參見，例如W0-A-9218237(Amersham Pharmacia B1tech AB, Sweden)。相同效果也在利用攬動的輸入流WO-A-9200799的系統(tǒng)(UpFront Chromatography A/S)中觀察到。
[0056]在膨脹床狀態(tài)中，樹脂的吸附劑顆粒之間的距離致使進料流中的微粒雜質(zhì)自由通過。相比之下，傳統(tǒng)的填充床充當可以阻塞的深層過濾器，從而產(chǎn)生增加的反壓，除非進料完全澄清。由于在EBA柱中未積累顯著的壓力，所以可能應(yīng)用EBA而無通常與填充床柱相關(guān)的大小和流速的限制。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，吸附過程未涉及填充床。
[0057]EBA過程的特征在于:柱內(nèi)部液體的返混非常有限，這與熟知的湍流流化床相反。床中的返混通常被測量為軸向分散(“容器分散準數(shù)”)，SMLevenspiel，"ChemicalReact1n Engineering〃2nd Edit1n,John Wiley&Sons(1972)。
[0058]可以通過將豌豆蛋白的水性提取物以至少3cm/min，諸如至少5cm/min、例如至少8cm/min、諸如至少10cm/min、例如20cm/min的線性流速應(yīng)用至吸附柱而有效地進行純化。通常地，流速在5-50cm/min的范圍內(nèi)進行選擇，諸如范圍為5_15cm/min、例如范圍為10-30cm/min、諸如范圍為25_50cm/min。
[0059 ] 豌豆蛋白溶液/提取物的溫度優(yōu)選在1°C -90 °C的范圍內(nèi)，諸如范圍為5 °C -18 °C、諸如范圍為7°C_15°C、諸如范圍為19°C_80°C、諸如范圍為19°C_70°C、諸如范圍為25°C_65°C、諸如范圍為45°C_60°C。
[0060]當將豌豆蛋白的水性提取物或溶液添加至吸附柱時，柱中存在的吸附顆粒與材料懸浮液之間的比率可以進行優(yōu)化以便保留吸附柱的高容量以及獲得高純度的待純化的蛋白產(chǎn)物。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在柱中存在的吸附劑相對于待上樣至柱的豌豆蛋白的水性提取物以至少1:0.5、諸如至少1: 1、例如至少1:3、諸如至少1:5、例如至少1:8、諸如至少1:10、例如至少1:12、諸如至少1:15、例如至少1:20、諸如至少1:25、例如1:30、諸如1:30的比率提供，所述比率基于體積/體積測量的。
[0061]第一類型的豌豆蛋白通過洗脫未結(jié)合的蛋白級分或結(jié)合的蛋白級分從所述吸附樹脂中分咼。
[0062]分離過程可以以許多方式起作用，現(xiàn)將對所述方式進行描述。
[0063]通常，第一類型的豌豆蛋白級分以結(jié)合的蛋白級分保持吸附在樹脂上，而第二類型的豌豆蛋白(為未結(jié)合的蛋白級分)在第一洗脫(洗滌)步驟中洗脫。隨后進行第二洗脫步驟，其釋放第一類型的豌豆蛋白(為結(jié)合的蛋白級分)。
[0064]可選地，第二類型的豌豆蛋白保持吸附在樹脂上，而第一類型的豌豆蛋白在第一洗脫(洗滌)步驟期間從所述吸附樹脂上洗脫。在一個或多個后續(xù)的洗脫步驟中，第二類型的豌豆蛋白然后被釋放，并且基本上分離而不含第一類型的豌豆蛋白。
[0065]在一個方面，基本上全部豌豆蛋白(包括第一類型的豌豆蛋白)最初吸附至所述吸附樹脂上，然后在含有部分第一類型的豌豆蛋白或者不含第一類型的豌豆蛋白的情況下，將第一類型的豌豆蛋白在第二洗脫步驟(在第一洗脫(洗滌)步驟以去除其它未結(jié)合的物質(zhì)之后)中從所述吸附樹脂洗脫，然后將剩余的第二類型的豌豆蛋白在第三或進一步后續(xù)洗脫步驟中洗脫。
[0066]為了獲得純化的第一類型的豌豆蛋白，洗脫可以通過現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)描述和已知的任何方法進行。吸附的蛋白產(chǎn)物的洗脫可以用通常選自以下的溶液進行:稀堿、稀酸、稀的緩沖液、稀鹽溶液和水或者它們的組合。在優(yōu)選的實施方案中，洗脫和/或洗滌步驟用稀溶液進行以使得在洗脫產(chǎn)物中存在的鹽和其它不需要的物質(zhì)的量最小化。
[0067]優(yōu)選地，用于洗脫第一類型的豌豆蛋白級分和/或第二類型的豌豆蛋白產(chǎn)物的稀溶液的鹽、緩沖液、酸或堿的濃度小于200mM、優(yōu)選地小于lOOmM、優(yōu)選地小于50mM、優(yōu)選地小于30mM、甚至更優(yōu)選地小于20mM。鹽、緩沖液、酸或堿濃度的測定直接在含有待分離的一種蛋白或多種蛋白的洗出液級分中進行，而無需另外稀釋洗出液級分。通常，低成本且無毒的鹽、緩沖液、酸和堿為適用的。特別優(yōu)選的鹽為氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化銨。特別優(yōu)選的緩沖液為檸檬酸鹽緩沖液、乳酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、甲酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液。特別優(yōu)選的酸為檸檬酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸、鹽酸。特別優(yōu)選的堿為氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)、氫氧化Ii(Ca(OH)2)、氫氧化錢(NH4OH)。所有這些可以進行組合以實現(xiàn)優(yōu)化的洗脫程序。
[0068]在本發(fā)明的實施方案中，可以使用包含小于5%(v/v)的有機溶劑、諸如小于3%(v/v)的有機溶劑、例如小于I % (v/v)的有機溶劑、諸如O % (v/v)的有機溶劑的洗脫液進行洗脫。
[0069]吸附樹脂
[0070]在本發(fā)明的實施方案中，吸附樹脂包含至少一種配體(LI)。配體(LI)包含芳族或雜芳族環(huán)系和一種或多種酸性基團。
[0071]優(yōu)選地，包含芳族或雜芳族環(huán)系和/或一種或多種酸性基團的配體(LI)具有至多2000道爾頓、諸如至多1000道爾頓、諸如至多500道爾頓的分子量。
[0072]芳族環(huán)系適當?shù)匕交蜉粱?br>[0073]在本發(fā)明的實施方案中，雜芳族部分可以選自:單環(huán)雜芳族基，其選自噻吩基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、異噻唑基、異噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基和噠嗪基；以及雙環(huán)雜芳族基，其選自吲哚基、嘌呤基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基和苯并噁唑基。
[0074]在本發(fā)明的進一步實施方案中，酸性基團選自羧酸基團(-C00H)、磺酸基團(_SO2OH)、亞磺酸基團(-S(O)OH)、次膦酸基團(-PH(O) (OH))、膦酸單酯基團(_P(0) (OH) (OR))和膦酸基團(-P(O) (0H) 2)，優(yōu)選羧酸基團(-COOH)。
[0075]優(yōu)選地，配體(LI)可以來源于選自以下的化合物:亞甲基-苯甲酸、羥基-苯甲酸、氨基-苯甲酸、巰基-苯甲酸、巰基-煙酸、巰基-四唑乙酸，諸如2-氨基-苯甲酸、3-氨基-苯甲酸、4-氨基-苯甲酸、2-巰基-苯甲酸、3-巰基.苯甲酸、4-巰基-苯甲酸、5-巰基-1 -四唑乙酸、4-氨基鄰苯二甲酸和5-氨基間苯二甲酸。
[0076]適當?shù)?，在配體(LI)中，所述一種或多種芳族或雜芳族環(huán)系被所述一種或多種酸性基團取代。配體LI可以包含多于一種酸性基團以及其它取代基，諸如堿性取代基和酸性取代基。
[0077]在本發(fā)明的替代實施方案中，吸附樹脂包含至少一種配體(L2)。配體(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺。配體(L2)中的烷基胺或烷基芳基胺部分包含被選自以下的一個或多個基團取代的胺:
[0078]1.芳基、芐基或雜芳基；
[0079]i1.具有4-16個碳原子的烷基，所述烷基可以為直鏈、支鏈或環(huán)狀的;諸如例如，丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、i^一烷基、十二烷基、環(huán)戊基、環(huán)己基或十氫萘基；
[0080]或者它們的組合。
[0081]配體(L2)可以選自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N，N_二甲基-1，3_二氨基丙燒、1,3-二氨基丙燒、1,6-二氨基己燒、1,6-二氨基己燒、1,8-氨基辛燒、1,9-二氨基壬烷、I，12-氨基十二烷、2-氨基芐胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑、2，4-二氨基-6-羥基嘧啶、節(jié)胺或苯(撐)二甲(基二)胺。
[0082]具體優(yōu)選的配體(L2)的C/N比(定義為化學式中碳原子/氮原子的數(shù)目)為至少4，諸如至少5、諸如至少6。
[0083]在本發(fā)明的實施方案中，配體(LI或L2)的濃度在10-990ymol/g吸附樹脂的干物質(zhì)的范圍內(nèi)。
[0084]在本發(fā)明的實施方案中，配體(LI或L2)的濃度在l-145ymol/ml水合的、沉降的吸附樹脂的范圍內(nèi)。
[0085]在本發(fā)明的進一步實施方案中，配體(LI或L2)的濃度在l-130ymol/g濕的但抽吸-瀝干的吸附樹脂的范圍內(nèi)。
[0086]優(yōu)選地，配體(LI或L2)的濃度在I O-1 ΟΟμπιο I /g濕的但抽吸-瀝干的吸附樹脂的范圍內(nèi)，諸如在15-80ymol/g濕的但抽吸-瀝干的吸附樹脂的范圍內(nèi)，諸如在20_60ymol/g濕的但抽吸-瀝干的吸附樹脂的范圍內(nèi)。
[0087]除配體(LI或L2)之外，吸附樹脂包含聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)，其構(gòu)成大部分的吸附樹脂，并且支撐在其上的配體(LI或L2)。
[0088]聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)可以在通常選自以下的某些類型的天然或合成的有機聚合物中尋找:i)天然和合成的多糖以及基于其它碳水化合物的聚合物，包括瓊脂、海藻酸鹽、角叉菜膠、瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠、蓋提膠(gum ghatti)、黃蓍膠、刺梧桐樹膠、槐樹豆膠、黃原膠、瓊脂糖、纖維素、果膠、粘蛋白、葡聚糖、淀粉、肝素、殼聚糖、羥基淀粉、羥丙基淀粉、羧甲基淀粉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和羧甲基纖維素；ii)合成的有機聚合物與單體產(chǎn)生聚合物，包括丙烯酸聚合物、聚酰胺、聚酰亞胺、聚酯、聚醚、聚合的乙烯基化合物、聚烯烴和它們的取代衍生物以及包含功能上多于一種此類聚合物的共聚物和它們的取代衍生物；以及i i i)它們的混合物。聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)的優(yōu)選組為多糖，諸如瓊脂糖。
[0089]在本發(fā)明的實施方案中，吸附樹脂呈顆粒形式。吸附樹脂顆?？梢灾辽俨糠值赝高^待分離的蛋白以便確保與不可透過的顆粒相比顯示出顯著的結(jié)合能力，所述不可透過的顆粒僅可以在其表面結(jié)合靶蛋白，從而產(chǎn)生相對低的結(jié)合能力。吸附樹脂顆?？梢詾橐幌盗胁煌慕Y(jié)構(gòu)、組成和形狀。
[0090]吸附劑可以進一步呈多孔纖維或多孔膜的形式。
[0091]配體LI或L2可以通過本身已知可適用于該目的的任何類型的共價鍵與聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)連接，所述連接可以通過配體與固相材料之間直接的化學反應(yīng)進行或者通過用本身已知可能將基質(zhì)和配體連接的適當?shù)脑噭┗罨笆龅木酆衔锘A(chǔ)基質(zhì)或配體進行。
[0092]此類適當?shù)幕罨噭┑膶嵗秊楸砺却?、表溴醇、烯丙基縮水甘油醚；雙環(huán)氧化合物，諸如丁二醇二縮水甘油醚;鹵素取代的脂肪族化合物，諸如二氯丙醇、二乙烯砜;羰基二咪唑;醛類，諸如戊二醛;醌類;溴化氰;高碘酸鹽，諸如偏過碘酸鈉;碳二亞胺;氯-三嗪，諸如氰尿酰氯;磺酰氯，諸如甲苯磺酰氯和tresyl chlorides;N-輕基琥?白酰亞胺;2_氟_1_甲基吡啶甲苯-4-磺酸鹽;噁唑酮；馬來酰亞胺;吡啶基二硫化物;和酰肼。在這些中，優(yōu)選留下不同于單鍵的間隔基團SPl的活化試劑，例如表氯醇、表溴醇、烯丙基縮水甘油醚;雙環(huán)氧化合物；鹵素取代的脂肪族化合物;二乙烯砜;醛類;醌類;溴化氰;氯-三嗪;噁唑酮;馬來酰亞胺;吡啶基二硫化物;和酰肼。
[0093]特別令人關(guān)注的活化試劑被認為是環(huán)氧-化合物，諸如表氯醇、烯丙基縮水甘油醚和丁二醇二縮水甘油醚。在某些情況下，活化試劑甚至可以構(gòu)成促成免疫球蛋白與聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)結(jié)合的官能團的一部分，例如在二乙烯砜被用作活化試劑的情況下。在其它情況下，活化試劑在官能團與基質(zhì)反應(yīng)期間從基質(zhì)釋放。當使用羰基二咪挫(carbodi imidazoles)和碳二亞胺時，則將是上述情況。
[0094]上文提及的可能性使得與定義存在連接聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)和配體LI或L2的任選間隔基團SPl相關(guān)。在本發(fā)明的上下文中，間隔基團SPl被認為是活化試劑的一部分，所述間隔基團SPl在基質(zhì)與配體之間形成連接。因此，間隔基團SPl對應(yīng)于涉及的活化試劑和偶聯(lián)反應(yīng)。在一些情況下，例如當使用碳二亞胺時，活化試劑形成基質(zhì)或配體試劑的活化形式。在偶聯(lián)之后，在配體與基質(zhì)間質(zhì)之間未留下活化試劑部分，因此，SPl僅為單鍵。
[0095]在其它情況下，間隔基團SPl為實現(xiàn)結(jié)合特性(即配體)的官能團的組成部分，并且如果間隔基團SPl包含官能活性位點或取代基，諸如硫醇、胺類、酸性基團、砜基、硝基、羥基、腈基或能夠通過氫鍵、靜電鍵合或排斥、電荷轉(zhuǎn)移等發(fā)生相互作用的其它基團，則這為特別重要的。
[0096]在其它情況下，間隔基團SPl可以包含芳族或雜芳族環(huán)，其在固相基質(zhì)的結(jié)合特性中起重要作用。例如，如果醌類或氯三嗪被用作聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)或配體LI或L2的活化劑，則將是上述情況。
[0097]優(yōu)選地，間隔基團SPl為來源于活化試劑的單鍵或雙基團，所述活化試劑選自表氯醇、烯丙基縮水甘油醚、雙環(huán)氧化合物諸如丁二醇二縮水甘油醚、鹵素取代的脂肪族化合物諸如I，3_二氯丙-2-醇、醛類諸如戊二醛、二乙烯砜、醌類、溴化氰、氯-三嗪諸如氰尿酰氯、2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸鹽、馬來酰亞胺、噁唑酮和酰肼。優(yōu)選地，間隔基團SPl選自，例如式-ch2-ch(oh)-ch2-(來源于表氯醇)、-(ch2)3-o-ch2-ch(oh)-ch2-(來源于烯丙基縮水甘油醚)或-CH2-CH(0H)-CH2-0-(CH2)4-0-CH2-CH(0H)-CH2-(來源于丁二醇二縮水甘油醚)的短鏈脂肪族雙基團;或單鍵。
[0098]因此，吸附樹脂顆?？梢杂稍S多化學上衍生的多孔材料構(gòu)成，所述多孔材料具有在給定流速下操作的必要密度和結(jié)合能力。
[0099]吸附樹脂顆粒的密度可以為至少1.3g/mL、更優(yōu)選為至少1.5g/mL、更優(yōu)選為至少1.8g/mL、甚至更優(yōu)選為至少2.0g/mL、更優(yōu)選為至少2.3g/mL、甚至更優(yōu)選為至少2.5g/mL、最優(yōu)選為至少2.8g/mL以便使方法的高生產(chǎn)率成為可能。
[0100]在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，吸附樹脂顆粒的平均粒徑為至多500μπι、具體為至多450μηι、更具體為至多400μηι、甚至更具體為至多350μηι、甚至更具體為至多300μηι、甚至更具體為至多250μπι諸如至多200μπι。
[0101]吸附樹脂顆?？梢栽诰酆衔锘A(chǔ)基質(zhì)內(nèi)包含一個或多個無孔芯。聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)充當覆蓋多個(或單個)芯材料和保持多個(或單個)芯材料在一起的裝置。吸附樹脂顆?？梢詾槿鏦O 92/00799中所述的凝聚成團型，每個被多孔材料包圍的顆粒具有至少兩個無孔芯。在凝聚成團型吸附樹脂顆粒中的無孔芯適當?shù)貫椴煌愋秃统叽纾缬蓛蓚€或更多個高密度顆粒組成的芯顆粒通過周圍的瓊脂糖(聚合物基礎(chǔ)基質(zhì))保持在一起。
[0102]吸附樹脂顆粒也可以為薄膜型，每個顆粒具有單個無孔芯，所述顆粒被多孔材料例如被瓊脂糖包被的高密度不銹鋼珠或固體玻璃珠包圍。
[0103]無孔芯通常構(gòu)成吸附樹脂顆粒的總體積的至多50%，諸如至多40%，優(yōu)選至多30 % ο無孔芯可以隨機分布在聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)內(nèi)并且不一定位于吸附樹脂顆粒的中心。
[0104]適當?shù)臒o孔芯材料的實例為無機化合物、金屬、重金屬、基本的非金屬(elementary non-metals)、金屬氧化物、非金屬氧化物、金屬鹽和金屬合金等。此類芯材料的實例為金屬硅酸鹽、金屬硼硅酸鹽;陶瓷，包括二硼化鈦、碳化鈦、二硼化鋯、碳化鋯、碳化媽、碳化娃、氮化招、氮化娃、氮化鈦、氧化乾、金屬娃粉和二娃化鉬(mo lybdenumdisiIide);金屬氧化物和硫化物，包括鎂、鋁、鈦、銀、絡(luò)、錯、給、猛、鐵、鈷、鎳、銅和銀的氧化物;非金屬氧化物;金屬鹽，包括硫酸鋇;金屬元素，包括鎢、鋯、鈦、鉿、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銦、銅、銀、金、鈀、鉑、釕、鋨、銠和銥，以及金屬元素的合金，諸如所述金屬元素之間形成的合金，例如不銹鋼;碳的結(jié)晶形式和非晶形形式，包括石墨、碳黑和炭。優(yōu)選的無孔芯材料為碳化媽、媽、鋼和欽珠諸如不鎊鋼珠。
[0105]蛋白組合物及其制備
[0106]本發(fā)明提供了豌豆蛋白組合物和組合的豌豆蛋白產(chǎn)物的途徑。
[0107]在第一類型的豌豆蛋白中被消耗的第二豌豆蛋白組合物通過從吸附樹脂中分離第二類型的豌豆蛋白來提供。在本發(fā)明的上下文中，第二豌豆蛋白在所述第一類型的豌豆蛋白中“被消耗”，意指在第二豌豆蛋白中的第一豌豆蛋白的量借助于方法而減少。然而，在一個方面，第一類型的豌豆蛋白可以從第二豌豆蛋白中完全去除。
[0108]優(yōu)選地，分離第一類型的豌豆蛋白和第二類型的豌豆蛋白以使得在分離過程之前和之后，基于蛋白的重量/重量測量時，第一類型的豌豆蛋白含有的第二類型的蛋白的初始量小于30%、諸如小于25%、諸如小于20%、諸如小于15%、諸如小于10%、諸如小于5%。
[0109]還優(yōu)選的是分離第一類型的豌豆蛋白和第二類型的豌豆蛋白以使得在分離過程之前和之后，基于蛋白的重量/重量測量時，第二類型的豌豆蛋白含有的第一類型的蛋白的初始量小于30%、諸如小于25%、諸如小于20%、諸如小于15%、諸如小于10%、諸如小于
[0110]在一些情況下，優(yōu)選分離第一類型的豌豆蛋白和第二類型的豌豆蛋白以實現(xiàn)兩種類型的蛋白的上文提及的優(yōu)選分離水平。
[0111]在第一類型的豌豆蛋白中被消耗的第二豌豆蛋白組合物可以變性以提供變性的第二豌豆蛋白組合物?？梢垣@得變性過程的選擇性。變性第二豌豆蛋白組合物通過加熱至溫度為 50°c-100°c，諸如 50°c-90°c、諸如 50°c-80°c、諸如 55°c-80°c、諸如 60°c-80°c 而適當?shù)匕l(fā)生?？蛇x地-或者與加熱處理組合-可以應(yīng)用酶的蛋白質(zhì)水解以使任何不需要的蛋白失活，諸如脂氧合酶、凝集素和過敏性抗原。
[0112]因此，本發(fā)明涉及通過本文所述的方法獲得的第二豌豆蛋白組合物。
[0113]保健飲品
[0114]根據(jù)本發(fā)明的方法分離豌豆蛋白級分允許制備有用的食品，所述食品可以提供有益效果。一種此類有用的食品為包含豌豆蛋白級分的保健飲品。適當?shù)?，此類健康飲品的PH小于7，并且可以為例如果汁或蘇打。
[0115]本發(fā)明的實施方案。
[0116]1.實施方案1.分離豌豆蛋白的方法，所述方法包括以下步驟:
[0117]1.提供豌豆蛋白的水性提取物或豌豆蛋白的溶液，所述豌豆蛋白的提取物或溶液包含至少兩種類型的豌豆蛋白；
[0118]i1.使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液通過至少一種膨脹床吸附過程，其中所述膨脹床吸附過程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液與至少一種吸附樹脂接觸以提供未結(jié)合的蛋白級分和結(jié)合的蛋白級分，所述吸附樹脂選擇性地吸附至少第一類型的豌豆蛋白，所述吸附樹脂包含:
[0119]至少一種配體(LI)，所述至少一種配體(LI)包含芳族或雜芳族環(huán)系和一種或多種酸性基團，或者
[0120]至少一種配體(L2)，所述至少一種配體(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在配體(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被選自以下的一個或多個基團取代的胺:
[0121]c.芳基、芐基或雜芳基；
[0122]d.具有4-16個碳原子的烷基，所述烷基可以為直鏈、支鏈或環(huán)狀的；
[0123]或者它們的組合；
[0124]ii1.通過洗脫所述未結(jié)合的蛋白級分或所述結(jié)合的蛋白級分從所述吸附樹脂中分離所述第一類型的豌豆蛋白；以及
[0125]iv.從所述吸附樹脂中分離第二類型的豌豆蛋白以提供第二豌豆蛋白組合物，所述第二豌豆蛋白組合物在所述第一類型的豌豆蛋白中被消耗。
[0126]實施方案2.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述第二類型的豌豆蛋白保持吸附在所述樹脂上，而所述第一類型的豌豆蛋白從所述吸附樹脂洗脫。
[0127]實施方案3.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中第一和第二類型的豌豆蛋白最初均被吸附在所述吸附樹脂上，然后將所述第一類型的豌豆蛋白從所述吸附樹脂洗脫。
[0128]實施方案4.如實施方案3所述的方法，其中從所述吸附樹脂洗脫所述第一類型的豌豆蛋白經(jīng)由增加洗脫液的pH發(fā)生。
[0129]實施方案5.如前述實施方案中任一項所述的方法，還包括變性所述第二豌豆蛋白組合物以提供變性的第二豌豆蛋白組合物的步驟。
[0130]實施方案6.如實施方案5所述的方法，其中變性所述第二豌豆蛋白組合物通過加熱至50°C-100°C的溫度發(fā)生。
[0131]實施方案7.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中包含芳族或雜芳族環(huán)系和/或一種或多種酸性基團的所述配體(LI)具有至多2000道爾頓、諸如至多1000道爾頓、諸如至多500道爾頓的分子量。
[0132]實施方案8.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述配體(LI)包含芳族環(huán)系，優(yōu)選為苯基或萘基。
[0133]實施方案9.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述配體(LI)包含雜芳族環(huán)系，所述雜芳族環(huán)系可以選自單環(huán)雜芳族基，其選自噻吩基、呋喃基、吡喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、異噻唑基、異噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基和噠嗪基；以及雙環(huán)雜芳族基，其選自吲哚基、嘌呤基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基和苯并噁唑基。
[0134]實施方案10.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述配體(LI)包含酸性基團，其選自羧酸基團(-C00H)、磺酸基團(-SO2OH)、亞磺酸基團(-S(O)OH)、次膦酸基團(-PH(O) (OH))、膦酸單酯基團(-P(O) (OH) (OR))和膦酸基團(-P(O) (OH)2)，優(yōu)選羧酸基團(_C00H)ο
[0135]實施方案11.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述配體(LI)選自亞甲基-苯甲酸、羥基-苯甲酸、氨基-苯甲酸、巰基-苯甲酸、巰基-煙酸、巰基-四唑乙酸諸如2-氨基-苯甲酸、3-氨基-苯甲酸、4-氨基-苯甲酸、2-巰基-苯甲酸、3-巰基.苯甲酸、4-巰基-苯甲酸、5-巰基-1-四唑乙酸、4-氨基鄰苯二甲酸和5-氨基間苯二甲酸。
[0136]實施方案12.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中-在配體(LI)中-所述一個或多個芳族或雜芳族環(huán)系被所述的一個或多個酸性基團取代。
[0137]實施方案13.如實施方案1-12中任一項所述的方法，其中配體(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被選自以下的一個或多個基團取代的胺:具有4-16個碳原子的烷基，所述烷基可以為直鏈、支鏈或環(huán)狀的，諸如例如丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、環(huán)戊基、環(huán)己基或十氫萘基；
[0138]實施方案14.如實施方案13所述的方法，其中所述配體(L2)選自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N,N-二甲基-1,3-二氨基丙燒、1,3-二氨基丙燒、1,6-二氨基己燒、I,
6-二氨基己燒、1,8-氨基辛燒、1,9-二氨基壬燒、1,12-氨基十二燒、2-氨基節(jié)胺、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑、2，4-二氨基-6-羥基嘧啶或芐胺。
[0139]實施方案15.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述吸附樹脂包含聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)，在其上支撐有所述配體(LI或L2)。
[0140]實施方案16.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述聚合物基礎(chǔ)基質(zhì)為天然或合成的有機聚合物，選自i)天然和合成的多糖以及基于其它碳水化合物的聚合物，包括瓊脂、海藻酸鹽、角叉菜膠、瓜爾豆膠、阿拉伯樹膠、蓋提膠、黃蓍膠、刺梧桐樹膠、槐樹豆膠、黃原膠、瓊脂糖、纖維素、果膠、粘蛋白、葡聚糖、淀粉、肝素、殼聚糖、羥基淀粉、羥丙基淀粉、羧甲基淀粉、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素和羧甲基纖維素;ii)合成的有機聚合物與單體產(chǎn)生的聚合物，包括丙烯酸聚合物、聚酰胺、聚酰亞胺、聚酯、聚醚、聚合的乙烯基化合物、聚烯烴和它們的取代衍生物以及包含功能上多于一種此類聚合物的共聚物和它們的取代衍生物；以及iii)它們的混合物。
[0141]實施方案17.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述吸附樹脂呈顆粒形式。
[0142]實施方案18.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述豌豆蛋白的水性提取物通過在pH 6.5-7.5時用水提取豌豆或豌豆產(chǎn)物獲得。
[0143]實施方案19.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中所述豌豆蛋白的水性提取物通過在約pH 9.0時用水提取豌豆或豌豆產(chǎn)物獲得。
[0144]實施方案20.如前述實施方案中任一項所述的方法，其中在步驟(ii)之前，將所述豌豆蛋白的水性提取物進行PH調(diào)節(jié)，優(yōu)選將pH調(diào)節(jié)至2.0-9.0。
[0145]實施方案21.如實施方案20所述的方法，其中在步驟(ii)之前，將pH調(diào)節(jié)的豌豆蛋白提取物進行離心或過濾以去除不溶性材料。
[0146]實施方案22.第二豌豆蛋白組合物，其在所述第一類型的豌豆蛋白中被消耗，通過實施方案I所述的方法獲得。
[0147]實施方案23.變性的第二豌豆蛋白組合物，其通過實施方案5的方法獲得。
實施例
[0148]實施例1
[0149]1A)瓊脂糖珠的活化:
[Ο?δΟ] 將珠尺寸為20-350μηι的多種高密度瓊脂糖珠的樣品(由Upfront ChromatographyA/S生產(chǎn)，瓊脂糖濃度為3-8%并且含有10%的碳化鎢作為高密度填充物)進行交聯(lián)并且用表氯醇(Aldrich目錄號:E1055)活化。測定產(chǎn)生的環(huán)氧基的濃度以在20-100mmol/L珠的范圍內(nèi)變化。
[0151]1B)配體與活化珠的偶聯(lián):
[0152]下述一般程序用于將配體與實施例1A中所述的活化珠偶聯(lián)。
[0153]I)將50ml環(huán)氧-活化珠在吸濾器上用200ml去離子水洗滌并且瀝干。將瀝干的吸附劑轉(zhuǎn)移至250ml塑料瓶中。
[0154]2)將配體(2.5g)溶解或懸浮在50ml去離子水中，并且用2M NaOH將pH調(diào)節(jié)至10.5-12.5以獲得完全溶解的配體溶液。
[0155]3)在室溫下，將配體溶液與瀝干的吸附劑在輥混合機上溫育18小時。
[0156]4)將吸附劑用5升去離子水洗滌。
[0157]對于在水中溶解性差的配體而言，將配體溶解或懸浮在50%的乙醇中，并且用2MNaOH將pH調(diào)節(jié)至10.5-12.5。在將配體溶液與抽吸-瀝干的吸附劑溫育之后，將吸附劑用I升50 %的乙醇洗滌，隨后用4升去離子水洗滌。
[0158]通過偶聯(lián)配體上特有官能團的酸堿滴定來測定配體濃度。
[0159]將下述化合物與表氯醇-活化的瓊脂糖珠如上文一般程序中所述進行偶聯(lián):
[0160]4-氨基苯甲酸、4-巰基苯甲酸、4-氨基水楊酸、丁胺、己胺、辛胺、芐胺、二氨基丙烷、1.6-二氨基己烷(4和6%的瓊脂糖)、二氨基辛烷、I，9_ 二氨基壬烷、二氨基十二烷、2-氨基節(jié)胺、新戊胺、二丁胺、戊胺、N, N-二甲基-二氨基丙燒、2-氨基苯并咪卩坐、2,4-二氨基-6-羥基嘧啶、2-氨基苯并咪唑、2-氨基咪唑。
[0161]1C)配體氯甲基苯甲酸與實施例1A中所述的活化珠的偶聯(lián)
[0162]I)將200ml環(huán)氧-活化珠在吸濾器上用800ml去離子水洗滌并且瀝干。將瀝干的吸附劑轉(zhuǎn)移至500ml塑料燒杯中。
[0163]2)添加224ml去離子水。將溶液用機械混合器混合。
[0164]3)添加32.5%的氫氧化鈉以達到pH 13.5(最初為25ml)。
[0165]4)添加6.7g氯甲基苯甲酸。
[0166]5)每隔15min檢查pH并且添加32.5%的NaOH以將pH保持在13.5。
[0167]6)每小時添加6.7g氯甲基苯甲酸。
[0168]7)在混合8小時之后，將吸附劑用5升去離子水洗滌。
[0169]通過偶聯(lián)配體上特有官能團的酸堿滴定來測定配體濃度。
[0170]ID)配體2-二乙氨基-氯乙烷(DEAE)與實施例1A中所述的活化珠的偶聯(lián)
[0171]I)將200ml環(huán)氧-活化珠在吸濾器上用800ml去離子水洗滌并且瀝干。然后，將其用600ml 85%的N-甲基吡咯烷酮溶液洗滌。將瀝干的吸附劑轉(zhuǎn)移至1000ml塑料燒杯中。
[0172]2)添加200ml 85%的N-甲基吡咯烷酮溶液。將溶液與機械混合器混合。
[0173]3)將12g DEAE添加至溶液中。
[0174]4)將50.8g NaOH添加至溶液中。
[0175]5)在2小時之后，將吸附劑用5升去離子水洗滌。
[0176]通過偶聯(lián)配體上特有官能團的酸堿滴定來測定配體濃度。
[0177]IE)配體亞硫酸鈉和丁磺酸內(nèi)酯(SP)與實施例1A所述的活化珠的偶聯(lián)
[0178]I)將200ml環(huán)氧-活化珠在吸濾器上用800ml去離子水洗滌并且瀝干。將瀝干的吸附劑轉(zhuǎn)移至100ml塑料瓶中。
[0179]2)添加200ml 1.2M亞硫酸鈉溶液。將溶液用機械混合器混合。
[0180]3)在室溫下，將配體溶液與瀝干的吸附劑在輥混合機上溫育18小時。
[0181]4)將吸附劑用5升去離子水洗滌并且瀝干。將瀝干的吸附劑轉(zhuǎn)移至100ml塑料燒杯中。
[0182]3)將10ml 35%的NaOH添加至燒杯中。將含有吸附劑和NaOH的燒杯置于水浴中并且加熱至63 °C。
[0183]4)將4g SDS添加至溶液中。
[0184]6)每隔30分鐘，將8ml 丁磺酸內(nèi)酯添加至溶液中。
[0185]5)在5小時之后，將吸附劑用5升去離子水洗滌。
[0186]通過偶聯(lián)配體上特有官能團的酸堿滴定來測定配體濃度。
[0187]實施例2
[0188]本實施例描述了用于下述實施例的豌豆提取物的制備。
[0189]將干燥的黃色豌豆(目錄號:3032，來自Unifood Import A/S,Denmark)研磨以產(chǎn)生豌豆粉。
[0190]以1+7的粉/水比使用六種提取方法:
[0191]1.在近中性pH提取
[0192]2.在pH 8.0提取
[0193]3.在pH 10.0 提取
[0194]4.在pH 8.0用0.1M NaCl提取
[0195]5.在pH 8.0.5Μ NaCl提取
[0196]6.在pH 8.0用I.0Μ NaCl提取
[0197]在近中性pH提取
[0198]將250g豌豆粉與1750ml去離子水混合。將懸浮液混合I小時，之后通過在ΙΟΟμπι尼龍濾網(wǎng)上篩分提取物來去除不溶性級分。所得的提取物為渾濁的乳狀液體，其中PH為6.3，并且電導率為2.4mS/cm。
[0199]在PH8.0提取
[0200]將250g豌豆粉與1750ml去離子水混合。將懸浮液混合I小時，同時在混合期間，通過添加IM NaOH將pH連續(xù)調(diào)節(jié)至pH 8.0。在整個提取期間，將pH以此方式保持在pH 8.0。在提取之后，通過在ΙΟΟμπι尼龍濾網(wǎng)上篩分提取物來去除不溶性級分。所得的提取物為渾濁的乳狀液體，其中pH為8.0，并且電導率為2.6mS/cm。
[0201]在PH 10.0 提取
[0202]將250g豌豆粉與1750ml去離子水混合。將懸浮液混合I小時，同時在混合期間，通過添加IM NaOH將pH連續(xù)調(diào)節(jié)至pH 10.0。在整個提取期間，將pH以此方式保持在pH 10.0。在提取之后，通過在ΙΟΟμπι尼龍濾網(wǎng)上篩分提取物來去除不溶性級分。所得的提取物為渾濁的乳狀液體，其中pH為10.0并且電導率為3.9mS/cm。
[0203]在PH8.0用0.IM NaCl提取
[0204]將250g豌豆粉與1750ml 0.1M NaCl溶液混合。將懸浮液混合I小時，同時在混合期間，通過添加IM NaOH將pH連續(xù)調(diào)節(jié)至pH8.0。在整個提取期間，將pH以此方式保持在pH8.0。在提取之后，通過在ΙΟΟμπι尼龍濾網(wǎng)上篩分提取物來去除不溶性級分。
[0205]在pH8.0用0.51 NaCl提取
[0206]將250g豌豆粉與1750ml 0.5M NaCl溶液混合。將懸浮液混合I小時，同時在混合期間，通過添加IM NaOH將pH連續(xù)調(diào)節(jié)至pH8.0。在整個提取期間，將pH以此方式保持在pH
8.0。在提取之后，通過在ΙΟΟμπι尼龍濾網(wǎng)上篩分提取物來去除不溶性級分。
[0207]在ΡΗ8.0用I.0Μ NaCl提取
[0208]將250g豌豆粉與1750ml 1.0M NaCl溶液混合。將懸浮液混合I小時，同時在混合期間，通過添加IM NaOH將pH連續(xù)調(diào)節(jié)至pH8.0。在整個提取期間，將pH以此方式保持在pH
8.0。在提取之后，通過在ΙΟΟμπι尼龍濾網(wǎng)上篩分提取物來去除不溶性級分。
[0209 ]對于以填充床色譜進行的實驗而言，將提取物在1，OOOrpm離心以去除沉淀的和不溶的材料。
[0210]實施例3
[0211]SDS PAGE和干物質(zhì)分析程序。
[0212]在下述實施例中描述的各個測試吸附劑的性能根據(jù)下述一般程序通過SDS-PAGE凝膠電泳測定。
[0213]將25yL豌豆蛋白樣品(在10.000RPM離心以去除不溶性物質(zhì)的顆粒)與25yL tris-甘氨酸樣品緩沖液(LC2676,Novex by Life Technologies，USA)混合。將所得的溶液在非還原條件下于水中煮沸5。將20yL煮沸的樣品上樣至預(yù)制的SDS-PAGE凝膠盒中(4-20%的tris-甘氨酸梯度凝膠(lmm) ,EC6025 ,Novex by Life Technologies ,USA)。將凝膠在200V，400mA下運行I小時。將凝膠用考馬斯亮藍染色劑(SimplyBlue? SafeStain,LC6060)染色過夜。
[0214]圖1顯示在pH 10.0,pH 8.0和pH 6.3時豌豆提取物的SDS-PAGE凝膠。已添加來自Invitrogen(Novex未染色蛋白標準物，LC5801)的標準分子標記以便鑒定不同的蛋白。存在箭頭以指示鑒定的蛋白條帶。
[0215]在下述實例中，基于顯示標準標記的SDS-PAGE凝膠，與凝膠上出現(xiàn)的特異性蛋白條帶相比，可以推斷出例如豌豆凝集素、豌豆豆球蛋白或其它特異性蛋白是否結(jié)合/不結(jié)合特異性吸附劑。
[0216]圖1，實施例3
[0217]泳道1=標準標記(kDa)
[0218]泳道2 =豌豆提取物，pH 6.3
[0219]圖2顯示在pH 10.0、pH 8.0和pH 6.3時提取的，pH逐步調(diào)節(jié)至pH 3.0的豌豆提取物的SDS-PAGE凝膠。
[0220]圖2，實施例3
[0221]泳道I =豌豆提取物，pH 10.0
[0222]泳道2= pH 10.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 9的豌豆提取物，
[0223]泳道3= pH 10.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 8的豌豆提取物
[0224]泳道4= pH 10.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 7的豌豆提取物
[0225]泳道5= pH 10.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 6的豌豆提取物
[0226]泳道6= pH 10.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 5的豌豆提取物
[0227]泳道7= PH 10.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 4的豌豆提取物
[0228]泳道8 = pH 10.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 3的豌豆提取物
[0229]泳道9 = pH 8.0時提取的豌豆
[0230]泳道10 = pH 8.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 7的豌豆
[0231]泳道n =PH 8.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 6的豌豆
[0232]泳道12 = pH 8.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 5的豌豆
[0233]泳道13 = pH 8.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 4的豌豆
[0234]泳道14 = pH 8.0時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 3的豌豆
[0235]泳道15 = pH 6.3時提取的豌豆
[0236]泳道16 = pH 6.3時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 5的豌豆
[0237]泳道17 = PH 6.3時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 4的豌豆
[0238]泳道18 = pH 6.3時提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 3的豌豆
[0239]圖3顯示在pH 8.0時用0.1、0.5和1.0M NaCl提取的豌豆提取物的SDS-PAGE凝膠。
[0240]泳道I =在pH 8.0時用0.1M NaCl提取的豌豆
[0241]泳道2 =在pH 8.0時用0.1M NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 7的豌豆
[0242]泳道3 =在pH 8.0時用0.1M NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 6的豌豆
[0243]泳道4 =在pH 8.0時用0.1M NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 5的豌豆
[0244]泳道5 =在pH 8.0時用0.1M NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 4的豌豆
[0245]泳道6 =在pH 8.0時用0.1M NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 3的豌豆
[0246]泳道7 =在pH 8.0時用0.51 NaCl提取的豌豆
[0247]泳道8 =在pH 8.0時用0.511 NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 7的豌豆
[0248]泳道9 =在pH 8.0時用0.511 NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 6的豌豆
[0249]泳道10 =在pH 8.0時用0.51 NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 5的豌豆
[0250]泳道11=在pH 8.0時用0.5M NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 4的豌豆
[0251]泳道12 =在pH 8.0時用0.51 NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 3的豌豆
[0252]泳道13 =在pH 8.0時用I.0Μ NaCl提取的豌豆，
[0253]泳道14 =在pH 8.0時用I.0Μ NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 7的豌豆
[0254]泳道15 =在pH 8.0時用I.0Μ NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 6的豌豆
[0255]泳道16 =在pH 8.0時用I.0Μ NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 5的豌豆
[0256]泳道17 =在pH 8.0時用I.0Μ NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 4的豌豆
[0257]泳道18 =在pH 8.0時用I.0Μ NaCl提取的，然后調(diào)節(jié)至pH 3的豌豆
[0258]干物質(zhì)測定
[0259]根據(jù)下述一般程序測定選定實例的蛋白洗出液中回收的不可透析的干物質(zhì)的量:
[0260]將固定量的洗出液(7.5ml)用水透析18小時以從蛋白樣品中消除諸如鹽和緩沖物質(zhì)的小分子(透析膜:Spectra/Por mo I ecu larporous membrane tubing，截留6_8kD,Spectrum Laboratories ,USA)。在透析之后，將透析的蛋白溶液轉(zhuǎn)移至箔燒杯中并在100°C干燥過夜(24小時)。將干物質(zhì)(蛋白)的量計算為干燥之后燒杯的重量減去燒杯的重量。定量的氨基酸分析通常證實了大于90%的干物質(zhì)確實為蛋白相關(guān)的。
[0261]實施例4:
[0262]測試了根據(jù)實施例1制備的吸附劑在pH4.5,6.3和8.0時結(jié)合豌豆蛋白的能力。測試了下述配體:
[0263]pH 4.5時的4-巰基苯甲酸、pH 6.3時的芐胺、pH 6.3時的己胺和pH 8.0時的Q-reagenso
[0264]程序
[0265]將Iml吸附劑轉(zhuǎn)移并且裝入小的頂部開口塑料柱(Poly-Prep ChromatographyColumn,目錄號:731-1550，B1rad，USA)中以形成大約20mm床高的填充床。對于所有測試，應(yīng)用通過填充床的流速為大約0.5ml/min。在裝填之后，根據(jù)提取物的pH，用1ml 1mM檸檬酸鈉，pH 4.5或10mM K2HPO4,pH 6.0或者10mM K2HP04，pH8.0平衡吸附劑。將豌豆提取物(根據(jù)實施例2在近中性pH制備，但比率為1+2)的pH用IM HCl調(diào)節(jié)至pH 6.0和4.5，用IMNaOH將pH調(diào)節(jié)至pH 8.0。將所有提取物在6，000RPM離心以去除沉淀的和不溶的材料。將1ml離心的提取物上樣至柱。將流經(jīng)(未結(jié)合的蛋白)收集成兩個級分。然后，根據(jù)提取物的pH，用5ml 1mM檸檬酸鈉，pH 4.5或10mM Κ2ΗΡ04ρΗ 6.0或10mM K2HPO4^pH 8.0洗滌柱。將流經(jīng)(未結(jié)合的和松散結(jié)合的蛋白)收集成一個5ml級分。通過應(yīng)用適合于陰離子交換劑的1ml 50mM NaOH或IM NaCl，將結(jié)合的蛋白隨后從柱中釋放(洗脫的)。將流經(jīng)(洗脫的蛋白，洗出液)收集成一個1ml級分。通過SDS-PAGE測定吸附劑的性能(如實施例3中所述)。參見圖4。
[0266]結(jié)果表明測試的芳族酸配體結(jié)合與其它測試配體不同的蛋白。4-巰基苯甲酸配體(參見泳道5，代表含有結(jié)合蛋白的洗出液級分)結(jié)合大約10kDa處的脂氧合酶和大約20-25kDa處的白蛋白。豌豆球蛋白的顯著條帶在流經(jīng)中保留(參見泳道2和3)。對于芐胺、己胺和Q-reagnes，結(jié)合模式是相似的(參見泳道10、15和20)。它們都結(jié)合顯著量的伴豌豆球蛋白(70kDa)和豆球蛋白(60kDa)，但豌豆球蛋白在50和33kDa處的較大亞基在流經(jīng)中保留(參見泳道7、8、11、12、16 和 17)。
[0267]圖4，實施例4
[0268]泳道I =PH 4.5時的豌豆提取物
[0269]泳道2=來自負載有配體4-巰基苯甲酸的吸附劑的流經(jīng)級分1(未結(jié)合的蛋白)
[0270]泳道3=來自負載有配體4-巰基苯甲酸的吸附劑的流經(jīng)級分2(未結(jié)合的蛋白)
[0271]泳道4=來自負載有配體4-巰基苯甲酸的吸附劑的洗滌級分(未結(jié)合的蛋白)
[0272]泳道5=來自具有配體4-巰基苯甲酸的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)
[0273]泳道6 = pH 6.3時的豌豆提取物
[0274]泳道7=來自負載有配體芐胺的吸附劑的流經(jīng)級分1(未結(jié)合的蛋白)
[0275]泳道8=來自負載有配體芐胺的吸附劑的流經(jīng)級分2(未結(jié)合的蛋白)
[0276]泳道9=來自負載有配體芐胺的吸附劑的洗滌級分(未結(jié)合的蛋白)
[0277]泳道10=來自具有配體芐胺的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)
[0278]泳道11=來自負載有配體己胺的吸附劑的流經(jīng)級分1(未結(jié)合的蛋白)
[0279]泳道12=來自負載有配體己胺的吸附劑的的流經(jīng)級分2(未結(jié)合的蛋白)
[0280]泳道13 = pH 6.3時的豌豆提取物
[0281]泳道14=來自負載有配體己胺的吸附劑的洗滌級分(未結(jié)合的蛋白)
[0282]泳道15=來自具有配體己胺的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)
[0283]泳道16=來自負載有配體Q-reagens的吸附劑的流經(jīng)級分1(未結(jié)合的蛋白)
[0284]泳道17=來自負載有配體Q-reagens的吸附劑的流經(jīng)級分2(未結(jié)合的蛋白)
[0285]泳道18 = pH 8.0時的豌豆提取物
[0286]泳道19=來自負載有配體Q-reagens的吸附劑的洗滌級分(未結(jié)合的蛋白)
[0287 ]泳道20 =來自具有配體Q-reagens的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)
[0288]實施例5:
[0289]測試了根據(jù)實施例1制備的吸附劑在pH6.3時結(jié)合豌豆蛋白的能力。測試了下述配體:
[0290]4-巰基苯甲酸和芐胺.[0291 ] 程序
[0292]柱制備和流速依據(jù)實施例4。在裝填之后，將吸附劑用1ml1mM梓檬酸鈉，pH 6.0平衡。根據(jù)實施例4，在近中性pH時制備豌豆提取物。將提取物在18，000RPM離心以去除不溶的和沉淀的材料。將2ml離心的提取物上樣至柱。將流經(jīng)(未結(jié)合的蛋白)收集成兩個Iml級分。將吸附劑用5ml 1mM檸檬酸鈉，pH 6.0洗滌。將流經(jīng)(未結(jié)合的和松散結(jié)合的蛋白)收集成一個5ml級分。通過應(yīng)用1ml50mM NaOH，將結(jié)合的蛋白隨后從柱中釋放(洗脫的)。將流經(jīng)(洗脫的蛋白，洗出液)收集成一個1ml級分并且通過添加IM HCl，將洗出液級分的pH立即調(diào)節(jié)至pH 7.0。
[0293]通過SDS-PAGE測定吸附劑的性能(如實施例3中所述)。參見圖5。
[0294]結(jié)果表明芐胺配體(參見泳道5，代表含有結(jié)合蛋白的洗出液級分)基本上結(jié)合應(yīng)用至柱的所有蛋白，除了10kDa處的脂氧合酶和20-25kDa處的白蛋白，其在流經(jīng)和洗滌級分中保留，參見泳道2、3和4。對于4-巰基苯甲酸，結(jié)合模式是相似的(參見泳道10)，但不結(jié)合大條帶的豆球蛋白(60kDa)。這意味著不結(jié)合60kDa處的豆球蛋白和20-25kDa處的白蛋白。此處也不存在10kDa處的脂氧合酶。
[0295]圖5，實施例5
[0296]泳道I =PH 6.3時的豌豆提取物
[0297]泳道2=來自負載有配體芐胺的吸附劑的流經(jīng)級分1(未結(jié)合的蛋白)
[0298]泳道3=來自負載有配體芐胺的吸附劑的流經(jīng)級分2(未結(jié)合的蛋白)
[0299]泳道4=具有配體芐胺的吸附劑的洗滌液(未結(jié)合的和松散結(jié)合的蛋白)
[0300]泳道5=來自具有配體芐胺的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)
[0301]泳道6 =空白
[0302]泳道7=來自負載有配體4-巰基苯甲酸的吸附劑的流經(jīng)級分1(未結(jié)合的蛋白)
[0303]泳道8=來自負載有配體4-巰基苯甲酸的吸附劑的流經(jīng)級分2(未結(jié)合的蛋白)
[0304]泳道9=具有配體4-巰基苯甲酸的吸附劑的洗滌液(未結(jié)合的和松散結(jié)合的蛋白)
[0305]泳道10=來自具有配體4-巰基苯甲酸的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)
[0306]實施例6:
[0307]測試了根據(jù)實施例1制備的吸附劑在pH8.0時結(jié)合豌豆蛋白的能力。測試了下述配體:
[0308]DEAE 和辛胺。
[0309]程序
[0310]柱制備和流速依據(jù)實施例4。在裝填之后，將吸附劑用1ml 1mM K2HPO4,pH 8.0平衡。根據(jù)實施例2，在pH 8.0時制備豌豆提取物。將提取物在6，000RPM離心以去除不溶的和沉淀的材料。將5ml離心的提取物上樣至柱中。將流經(jīng)(未結(jié)合的蛋白)收集成兩個級分。將吸附劑用5ml去離子水洗滌。將流經(jīng)(未結(jié)合的和松散結(jié)合的蛋白)收集成一個5ml級分。通過應(yīng)用1ml IM NaCl(針對DEAEWPlOml 10mM磷酸，pH 2.3(針對辛胺)，將結(jié)合的蛋白隨后從柱中釋放(洗脫的)。將流經(jīng)(洗脫的蛋白，洗出液)收集成一個1ml級分，并且將洗出液級分的pH立即調(diào)節(jié)至pH 7.0。
[0311]通過SDS-PAGE測定吸附劑的性能(如實施例3中所述)。參見圖6。
[0312]結(jié)果表明，雖然配體DEAE結(jié)合的比配體辛胺多，但兩種配體具有相似的結(jié)合模式(參見泳道5和9，代表含有結(jié)合蛋白的洗出液級分)。它們基本上結(jié)合應(yīng)用至柱的所有蛋白，但除了 10kDa處的脂氧合酶和20-25kDa處的白蛋白，其在流經(jīng)和洗滌級分中保留，參見泳道2、3、4、6、7和8。
[0313]圖6，實施例6
[0314]泳道I =PH 8.0時的豌豆提取物
[0315]泳道2=來自負載有配體DEAE的吸附劑的流經(jīng)級分1(未結(jié)合的蛋白)
[0316]泳道3=來自負載有配體DEAE的吸附劑的流經(jīng)級分2(未結(jié)合的蛋白)
[0317]泳道4=具有配體DEAE的吸附劑的洗滌液(未結(jié)合的和松散結(jié)合的蛋白)
[0318]泳道5=來自具有配體DEAE的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)
[0319]泳道6=來自負載有配體辛胺的吸附劑的流經(jīng)級分1(未結(jié)合的蛋白)
[0320]泳道7=來自負載有配體辛胺的吸附劑的流經(jīng)級分2(未結(jié)合的蛋白)
[0321]泳道8=具有配體辛胺的吸附劑的洗滌液(未結(jié)合的和松散結(jié)合的蛋白)
[0322]泳道9=來自具有配體辛胺的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)
[0323]實施例7:
[0324]本實施例顯示如何從豌豆提取物中捕獲特異性豌豆蛋白，其中主要部分的豌豆蛋白已經(jīng)通過pH 4.5時的沉淀和傾析去除。與配體SP偶聯(lián)的吸附劑(如實施例1所述制備的)(用滴定至129mmol/L的吸附劑測定配體濃度)已在pH 4.5時被用于結(jié)合蛋白。
[0325]用膨脹床吸附(EBA)色譜進行實驗。
[0326]用于實驗的EBA柱:具有150cm玻璃管的直徑為Icm的實驗室EBA柱(目錄號:7010-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0327]程序
[0328]柱裝填有高度為50cm的澄清床，等同于40ml吸附劑。在負載提取物期間的流速:15cm/min= 12ml/min。在平衡、洗滌和洗脫期間的流速:15cm/min= 12ml/min。在裝填之后，將吸附劑用200ml 1mM檸檬酸鈉，pH 4.5平衡。用IM HCl將豌豆提取物(根據(jù)實施例2在近中性pH制備的)的pH調(diào)節(jié)至pH 4.5，攪拌I小時，并傾析上清液。將上清液直接上樣至柱而無需離心。將1200ml上清液上樣至柱。將流經(jīng)(未結(jié)合的蛋白)收集成四個300ml級分。將吸附劑用360ml去離子水洗滌。將流經(jīng)(未結(jié)合的和松散結(jié)合的蛋白)收集成一個330ml級分。通過應(yīng)用275ml 30mM NaOH，將結(jié)合的蛋白隨后從柱中釋放(洗脫的)。將洗出液收集成一個195ml級分。
[0329]通過SDS-PAGE測定吸附劑的性能(如實施例3中所述)。參見圖7AP配體(參見泳道8，代表含有結(jié)合蛋白的洗出液級分)結(jié)合大約10kDa處的脂氧合酶和大約20-25kDa的白蛋白。流經(jīng)級分幾乎從蛋白中被耗盡(參見泳道2、3、4、5和6)。
[0330]對洗出液進行干物質(zhì)測定(如實施例3中所述)。洗出液中的蛋白濃度為1.9mg/ml，每ml上樣至柱的豌豆提取物(上清液)產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)量為1.8mg。這致使每ml吸附劑的總吸附劑結(jié)合能力為54mg蛋白。
[0331]圖7，實施例7
[0332]泳道I=PH 4.5時的豌豆提取物(上清液)
[0333]泳道2=來自負載有配體SP的吸附劑在pH 4.5時的流經(jīng)級分I (未結(jié)合的蛋白)。
[0334]泳道3=來自負載有配體SP的吸附劑在pH 4.5時的流經(jīng)級分2 (未結(jié)合的蛋白)。
[0335]泳道4=來自負載有配體SP的吸附劑在pH 4.5時的流經(jīng)級分3(未結(jié)合的蛋白)。
[0336]泳道5=來自負載有配體SP的吸附劑在pH 4.5時的流經(jīng)級分4(未結(jié)合的蛋白)。
[0337]泳道6=來自負載有配體SP的吸附劑在pH 4.5時的級分I至4的流經(jīng)匯集物(未結(jié)合的蛋白)
[0338]泳道7=具有配體SP的吸附劑的洗滌液(未結(jié)合的和松散結(jié)合的蛋白)。
[0339]泳道8=來自具有配體SP的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)。
[0340]實施例8:
[0341]本實施例顯示如何從豌豆提取物中捕獲特異性豌豆蛋白。通過將12.5kg干豌豆在87.5L去離子水中混合60分鐘來制備豌豆提取物。此后，將提取物靜置沉積20分鐘，然后將上清液傾析并被用作對柱進行上樣。使用PH 6.3時的芐胺吸附劑結(jié)合豌豆蛋白。
[0342]用膨脹床吸附(EBA)色譜進行實驗。
[0343]用于實驗的EBA柱:具有150cm玻璃管的直徑為30cm的EBA柱(目錄號:7300-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0344]程序
[0345]柱裝填有高度為50cm的澄清床，等同于35.3L吸附劑。在負載提取物期間的流速:20cm/min = 14.lL/min。在平衡、洗滌和洗脫期間的流速:20cm/min= 14.lL/min。在裝填之后，將吸附劑用150L 1mM磷酸鉀，pH 6.3平衡。將豌豆提取物(在近中性pH時制備的)攪拌I小時，并將上清液傾析。將上清液直接上樣至柱而無需離心。將70.6L提取液上樣至柱。將流經(jīng)(未結(jié)合的蛋白)收集成一個級分，但每17.5L取樣樣品。將吸附劑用250L去離子水洗滌。通過應(yīng)用70L30mM NaOH，將結(jié)合的蛋白隨后從柱中釋放(洗脫的)。將洗出液收集成一個70L級分，在收集期間，將所述級分的PH連續(xù)調(diào)節(jié)至pH7-9。在收集之后，總洗出液的pH為7.5，并且電導率為1975yS/cm。
[0346]通過SDS-PAGE測定吸附劑的性能(如實施例3中所述)。參見圖8。芐胺配體(參見泳道6，代表含有結(jié)合蛋白的洗出液級分)結(jié)合大約I OOkDa處的脂氧合酶，70kDa處的伴豌豆球蛋白和大約45kDA處的豌豆球蛋白以及20-25kDa處的白蛋白。流經(jīng)級分含有60kDa處的豆球蛋白和婉?球蛋白(參見泳道2、3、4和5)。
[0347]對洗出液進行干物質(zhì)測定(如實施例3中所述)。洗出液中的蛋白濃度為13.5mg/ml，每ml上樣至柱的豌豆提取物(上清液)產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)量為13.5mg。這致使每ml吸附劑的總吸附劑結(jié)合能力為26.8mg蛋白。
[0348]圖8，實施例8
[0349]泳道I=近中性pH時的豌豆提取物(上清液)
[0350]泳道2=來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 6.3時的流經(jīng)樣品1(未結(jié)合的蛋白)。
[0351]泳道3=來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 6.3時的流經(jīng)樣品2(未結(jié)合的蛋白)。
[0352]泳道4=來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 6.3時的流經(jīng)樣品3 (未結(jié)合的蛋白)。
[0353]泳道5=來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 6.3時的流經(jīng)樣品4(未結(jié)合的蛋白)。
[0354]泳道6=來自具有配體芐胺的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)。
[0355]實施例9:
[0356]本實施例顯示如何從豌豆提取物中捕獲特異性豌豆蛋白。通過將12.5kg干豌豆在87.5L去離子水中混合60分鐘來制備豌豆提取物。此后，將提取物調(diào)節(jié)至pH 8.0并靜置沉積20分鐘。然后將上清液傾析并被用作對柱進行上樣。使用pH 8.0的芐胺吸附劑結(jié)合豌豆蛋白。
[0357]用膨脹床吸附(EBA)色譜進行實驗。
[0358]用于實驗的EBA柱:具有150cm玻璃管的直徑為30cm的EBA柱(目錄號:7300-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0359]程序
[0360]柱裝填有高度為50cm的澄清床，等同于35.3L吸附劑。在負載提取物期間的流速:20cm/min = 14.lL/min。在平衡、洗滌和洗脫期間的流速:20cm/min= 14.lL/min。在裝填之后，將吸附劑用300L 1mM磷酸鉀，pH 8.0平衡。將來自豌豆提取物的上清液直接上樣至柱而無需離心。將60L上清液上樣至柱。將流經(jīng)(未結(jié)合的蛋白)收集成一個級分，但每20L取樣樣品。將吸附劑用250L去離子水洗滌。通過應(yīng)用80L 30mM NaOH將結(jié)合的蛋白隨后從柱中釋放(洗脫的)。將洗出液收集成一個70L級分，在收集期間，將所述級分的pH連續(xù)調(diào)節(jié)至pH 7-
9。在收集之后，總洗出液的pH為7.3，并且電導率為2.38mS/cm。
[0361 ] 通過SDS-PAGE測定吸附劑的性能(如實施例3中所述)。參見圖9。芐胺配體(參見泳道5，代表含有結(jié)合蛋白的洗出液級分)結(jié)合大約I OOkDa處的脂氧合酶，70kDa處的伴豌豆球蛋白和大約45kDA的豌豆球蛋白以及20kDa處的一些白蛋白。流經(jīng)級分含有60kDa處的豆球蛋白和豌豆球蛋白(參見泳道2、3和4)。
[0362]對洗出液進行干物質(zhì)測定(如實施例3中所述)。洗出液中的蛋白濃度為4.8mg/ml，每ml上樣至柱的豌豆提取物(上清液)產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)量為5.6mg。這致使每ml吸附劑的總吸附劑結(jié)合能力為9.6mg蛋白。
[0363]圖9，實施例9
[0364]泳道I=PH 8.0時的豌豆提取物(上清液)
[0365]泳道2=來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 8.0時的流經(jīng)樣品1(未結(jié)合的蛋白)。
[0366]泳道3=來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 8.0時的流經(jīng)樣品2(未結(jié)合的蛋白)。
[0367]泳道4=來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 8.0時的流經(jīng)樣品3(未結(jié)合的蛋白)。
[0368]泳道5=來自具有配體芐胺的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)。
[0369]實施例10:
[0370]本實施例顯示如何從豌豆提取物中捕獲特異性豌豆蛋白。如實施例9所述制備豌豆提取物，除了在提取期間，將0.5mg/ml亞硫酸鈉添加至混合物中。因此，將12.5kg干豌豆和50g亞硫酸鈉在87.5L去離子水中混合60分鐘。此后，將提取物調(diào)節(jié)至pH 8.0并靜置沉積20分鐘。然后將上清液傾析并被用作對柱進行上樣。使用pH 8.0的芐胺吸附劑結(jié)合豌豆蛋白。
[0371]用膨脹床吸附(EBA)色譜進行實驗。
[0372]用于實驗的EBA柱:具有150cm玻璃管的直徑為30cm的EBA柱(目錄號:7300-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0373]程序
[0374]柱裝填有高度為50cm的澄清床，等同于35.3L吸附劑。在負載提取物期間的流速:20cm/min = 14.lL/min。在平衡、洗滌和洗脫期間的流速:20cm/min= 14.lL/min。在裝填之后，將吸附劑用300L 1mM磷酸鉀，pH 8.0平衡。將來自豌豆提取物的上清液直接上樣至柱而無需離心。將60L上清液上樣至柱。將流經(jīng)(未結(jié)合的蛋白)收集成一個級分，但每20L取樣樣品。將吸附劑用300L去離子水洗滌。通過應(yīng)用80L 30mM NaOH，將結(jié)合的蛋白隨后從柱中釋放(洗脫的)。將洗出液收集成一個60L級分，在收集期間，將所述級分的pH連續(xù)調(diào)節(jié)至pH
7-9。在收集之后，總洗出液的pH為7.0，并且電導率為1.96mS/cm。
[0375]通過SDS-PAGE測定吸附劑的性能(如實施例3中所述)。參見圖10。芐胺配體(參見泳道7，代表含有結(jié)合蛋白的洗出液級分)結(jié)合大約10kDa處的脂氧合酶，7OkDa處的伴豌豆球蛋白和大約45kDA的豌豆球蛋白以及20kDa處的白蛋白。流經(jīng)級分含有60kDa處的豆球蛋白和豌豆球蛋白(參見泳道2、3和4)。
[0376]對洗出液進行干物質(zhì)測定(如實施例3中所述)。洗出液中的蛋白濃度為5.5mg/ml，每ml上樣至柱的豌豆提取物(上清液)產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)量為5.5mg。這致使每ml吸附劑的總吸附劑結(jié)合能力為9.3mg蛋白。
[0377]圖10，實施例10
[0378]泳道I =如實施例3中所述的標準標記。
[0379]泳道2 = pH 8.0時，含有亞硫酸鹽的豌豆提取物(上清液)
[0380]泳道3=來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 8.0時的流經(jīng)樣品1(未結(jié)合的蛋白)。[0381 ]泳道4 =來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 8.0時的流經(jīng)樣品2(未結(jié)合的蛋白)。
[0382]泳道5=來自負載有配體芐胺的吸附劑在pH 8.0時的流經(jīng)樣品3 (未結(jié)合的蛋白)。
[0383]泳道6 =空白
[0384]泳道7=來自具有配體芐胺的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)。
[0385]實施例11:
[0386]本實施例顯示如何從豌豆提取物中捕獲特異性豌豆蛋白，其中使用與配體SP偶聯(lián)的吸附劑(如實施例1所述制備的)，主要部分的豌豆蛋白已經(jīng)在PH 4.5沉淀并且傾析(用滴定至129mmol/L的吸附劑測定配體濃度)，其中，pH 4.5時，蛋白已結(jié)合。
[0387]用膨脹床吸附(EBA)色譜進行實驗。
[0388]用于實驗的EBA柱:具有150cm玻璃管的直徑為30cm的實驗室EBA柱(目錄號:7300-1500,Upfront Chromatography A/S,Denmark)
[0389]程序
[0390]柱裝填有高度為44cm的澄清床，等同于31.1L吸附劑。在負載提取物期間的流速:15cm/min = 10.6L/min。在平衡、洗滌和洗脫期間的流速:15cm/min= 10.6L/min。在裝填之后，將吸附劑用200L 1mM檸檬酸鈉，pH 4.5平衡。將豌豆提取物(根據(jù)實施例2在近中性pH時產(chǎn)生的)的PH用IM HCl調(diào)節(jié)至pH 4.5，攪拌I小時，并將上清液傾析。將上清液直接上樣至柱而無需離心。將62L提取物上樣至柱。將流經(jīng)(未結(jié)合的蛋白)收集成一個級分，但每301^取樣樣品。將吸附劑用300L去離子水洗滌。通過應(yīng)用70L 30mM NaOH，將結(jié)合的蛋白隨后從柱中釋放(洗脫的)。將洗出液收集成一個52.3L級分，在收集期間，將所述級分的pH連續(xù)調(diào)節(jié)至pH 7-9。在收集之后，總洗出液的pH為7.2，并且電導率為1.54mS/cm。
[0391]通過SDS-PAGE測定吸附劑的性能(如實施例3中所述)。參見圖11。SP配體(參見泳道5，代表含有結(jié)合蛋白的洗出液級分)結(jié)合上清液中可得的所有蛋白。流經(jīng)級分幾乎從蛋白中被耗盡(參見泳道3和4)。
[0392]對洗出液進行干物質(zhì)測定(如實施例3中所述)。洗出液中的蛋白濃度為12.8mg/ml，每ml上樣至柱的豌豆提取物(上清液)產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)量為10.8mg。這致使每ml吸附劑的總吸附劑結(jié)合能力為21.5mg蛋白。
[0393]圖11，實施例11
[0394]泳道I=在pH調(diào)節(jié)之前的豌豆提取物(上清液)
[0395]泳道2= pH 4.5時的豌豆提取物(上清液)
[0396]泳道3=來自負載有配體SP的吸附劑在pH 4.5時的流經(jīng)級分I (未結(jié)合的蛋白)。
[0397]泳道4=來自負載有配體SP的吸附劑在pH 4.5時的流經(jīng)級分2(未結(jié)合的蛋白)。
[0398]泳道5=來自具有配體SP的吸附劑的洗出液(結(jié)合并隨后釋放的蛋白)。
[0399]實施例12
[0400]本實施例示出如實施例8、9、1和11所述制備的不同的豌豆蛋白級分的選擇的功能性質(zhì)。
[0401]對于選擇的功能性質(zhì)，測試了四種豌豆蛋白級分和商用豌豆蛋白:
[0402]豌豆蛋白級分
[0403]I.商用豌豆蛋白:豌豆蛋白MEGA(目錄號:480，來自Natur Drogeriet A/S ,Denmark)
[0404]2.豌豆蛋白級分1，？??1(實施例8中所述)
[0405]3.豌豆蛋白級分2，PPF2(實施例9中所述)
[0406]4.豌豆蛋白級分3，PPF3(實施例10中所述)
[0407]5.豌豆蛋白級分4，PPF4(實施例11中所述)
[(MO8]測試的選擇的功能性質(zhì)
[0409]1.顏色(使用CIE實驗室顏色測量)
[0410]2.豌豆蛋白級分的pH
[0411]3.發(fā)泡能力和穩(wěn)定性
[0412]4.膠凝強度和溫度
[0413]5.乳化能力和穩(wěn)定性
[0414]顏色
[0415]使用CIE實驗室顏色測量方法測量了豌豆蛋白級分的顏色。圖12顯示來自針對各個豌豆蛋白級分測量的結(jié)果。所有測試的豌豆蛋白為白色至淺黃色，然而，與商用豌豆蛋白(MEGA)相比，豌豆蛋白級分I至4的黃色較淺，這通過圖12中較低的b*值觀察到。
[0416]豌豆蛋白級分的pH
[0417]圖13顯示豌豆蛋白級分的3%溶液的測量的pH值。所有測試的豌豆蛋白的起始pH為中性pH。與商用豌豆蛋白MEGA相比，豌豆蛋白級分2具有略高的pH值。
[0418]發(fā)泡能力和穩(wěn)定性
[0419]豌豆蛋白級分(PPF1-PPF4和MEGA)的發(fā)泡能力和穩(wěn)定性通過以下測量:將3 %的豌豆蛋白溶解在去離子水中，將pH調(diào)節(jié)至7.0，并使用Ul tra Turrex，將豌豆蛋白溶液在20.0OOrpm混合5min。將發(fā)泡能力測量為體積增加的百分比，將發(fā)泡穩(wěn)定性測量為泡沫降至自身發(fā)泡能力的50%的時間。圖14a-14f顯示出測量的值。從圖14b、14c和14d中，可以觀察至IJ，隨著時間的推移，豌豆蛋白級分1(ρΗ 4時)、級分2和級分3具有的發(fā)泡能力等于或高于商用豌豆蛋白(圖14a)。在圖14f中，豌豆蛋白級分2在pH 4和尤其是pH 7時顯示出很好的泡沫穩(wěn)定性。
[0420]圖14a-e:實施例12，發(fā)泡能力(Y-軸:體積增加％，X_軸:時間(分鐘)
[0421 ]圖14f:實施例12，發(fā)泡穩(wěn)定性(Y-軸:體積增加% )
[0422]膠凝強度和溫度
[0423]豌豆蛋白級分的膠凝強度已通過將12.5%的豌豆蛋白溶解于去離子水中進行測量。將豌豆蛋白溶液以2 °C/分鐘從25 0C加熱至90 °C，同時使用來自Anton Paar的rheometerphysica MCR301測量凝膠的彈性和粘度。此后，將凝膠在流變儀中冷卻至25°C并在IHz測量膠凝強度。圖15a顯示測量的膠凝強度，圖15b顯示膠凝強度相對于40°C至95°C的溫度的測量值。圖15a表明所有豌豆蛋白級分的膠凝強度等于或高于商用豌豆蛋白，MEGA。在圖15b中，可以觀察到尤其是PH7時的豌豆蛋白級分I和4在高溫下具有優(yōu)異的膠凝強度。
[0424]圖15b，實施例12(Y-軸:膠凝強度(G ’)(Pa)，X-軸:溫度(°C))
[0425]乳化能力和穩(wěn)定性
[0426]豌豆蛋白級分的乳化能力和穩(wěn)定性已通過將1%的豌豆蛋白溶解于去離子水中測量。然后，將豌豆蛋白溶液與菜籽油以1:1的比率混合。然后，使用U11 r a T h u r r a X以
20.0OOrpm攪拌混合物直至觀察到乳狀液。此后，將乳狀液(全部樣品)在1500xg離心5分鐘。然后，將乳化能力計算為乳狀液體積/樣品的總體積的百分比。計算的值顯示在圖16a中。
[0427]然后，乳化穩(wěn)定性通過加熱樣品(乳化)至80°C保持30分鐘并在室溫冷卻靜置15分鐘來獲得。此后，將樣品在1500xg離心5分鐘。然后，將乳化穩(wěn)定性計算為乳狀液體積/樣品總體積的百分比。計算的值顯示在圖16b中。
[0428]圖16a和16b顯示與商用豌豆蛋白，MEGA相比，測試的豌豆蛋白級分I至4全部具有相等或較高的乳化能力和穩(wěn)定性。
【主權(quán)項】
1.分離豌豆蛋白的方法，所述方法包括以下步驟: 1.提供豌豆蛋白的水性提取物或豌豆蛋白的溶液，所述豌豆蛋白的提取物或溶液包含至少兩種類型的豌豆蛋白； i 1.使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液通過至少一種膨脹床吸附過程，其中所述膨脹床吸附過程包括使所述豌豆蛋白的水性提取物或溶液與至少一種吸附樹脂接觸以提供未結(jié)合的蛋白級分和結(jié)合的蛋白級分，所述吸附樹脂選擇性地吸附至少第一類型的豌豆蛋白，所述吸附樹脂包含: 至少一種配體(LI)，所述至少一種配體(LI)包含芳族或雜芳族環(huán)系和一種或多種酸性基團，或者 至少一種配體(L2)，所述至少一種配體(L2)包含烷基胺或烷基芳基胺，其中在配體(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被選自以下的一個或多個基團取代的胺: a.芳基、芐基或雜芳基； b.具有4-16個碳原子的烷基，所述烷基可以為直鏈、支鏈或環(huán)狀的； 或者它們的組合； ii1.通過洗脫所述未結(jié)合的蛋白級分或所述結(jié)合的蛋白級分從所述吸附樹脂中分離所述第一類型的豌豆蛋白；以及 iv.從所述吸附樹脂中分離第二類型的豌豆蛋白以提供第二豌豆蛋白組合物，所述第二豌豆蛋白組合物在所述第一類型的豌豆蛋白中被消耗。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括變性所述第二豌豆蛋白組合物以提供變性的第二豌豆蛋白組合物的步驟。3.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述配體(LI)包含芳族環(huán)系，優(yōu)選苯基或萘基。4.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中配體(L2)中的所述烷基胺或烷基芳基胺部分包含被選自以下的一個或多個基團取代的胺:具有4-16個碳原子的烷基，所述烷基可以為直鏈、支鏈或環(huán)狀的；諸如例如丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、環(huán)戊基、環(huán)己基或十氫萘基。5.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述配體(L2)選自丁胺、己胺、辛胺二丁胺、戊胺、正戊胺、N,N-二甲基-1,3-二氨基丙燒、1,3-二氨基丙燒、1,6-二氨基己燒、1,6-二氨基己燒、1,8-氨基辛燒、1,9-二氨基壬燒、1, 12-氨基十二燒、2-氨基節(jié)胺、2-氨基苯并咪卩坐、2-氨基咪唑、2，4-二氨基-6-羥基嘧啶或芐胺。6.第二豌豆蛋白組合物，其在所述第一類型的豌豆蛋白中被消耗，通過權(quán)利要求1和3-5中任一項所述的方法獲得。7.變性的第二豌豆蛋白組合物，其通過權(quán)利要求2所述的方法獲得。
【文檔編號】A23J1/14GK105939618SQ201580006290
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2015年1月29日
【發(fā)明人】阿蘭·奧托·利默, 瑪麗·本迪克斯·漢森, 馬丁·龐陶普丹
【申請人】預(yù)層析股份有限公司