一種枯草芽孢桿菌泡騰制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于畜禽、水產(chǎn)動(dòng)物、毛皮動(dòng)物、寵物養(yǎng)殖領(lǐng)域，涉及一種用于家畜、家禽、水產(chǎn)動(dòng)物、毛皮動(dòng)物、寵物用枯草芽孢桿菌泡騰制劑的制備方法。所制備的枯草芽孢桿菌泡騰粉、顆粒、片具有耐9種抗菌藥物，耐pH值2.0酸，耐0.03%膽鹽，耐85℃高溫，溶化或崩解速度快，穩(wěn)定等特點(diǎn)。本發(fā)明生產(chǎn)的泡騰粉、泡騰顆粒、泡騰片，均包括以下重量份數(shù)的原料：枯草芽孢桿菌菌粉（1.0×1011cfu/g）2～20份、酸源1～20份、堿源0.9～26份、微晶纖維素0.5～5份、水溶潤滑劑0.5～5份、填充劑24～95.1份。使用上述泡騰制劑飼喂養(yǎng)殖動(dòng)物，肉雞日增重提高5%以上，料肉比降低2%以上，每只肉雞經(jīng)濟(jì)效益增加0.8元以上；蛋雞產(chǎn)蛋率提高2%以上，料蛋比降低2%以上；仔豬日增重提高5%以上，料肉比降低4%以上。
【專利說明】
一種枯草芽孢桿菌泡騰制劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于畜禽、水產(chǎn)動(dòng)物、毛皮動(dòng)物、寵物養(yǎng)殖領(lǐng)域，涉及一種用于家畜、家禽、水產(chǎn)動(dòng)物、毛皮動(dòng)物、寵物用枯草芽孢桿菌泡騰制劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]抗生素和合成抗菌藥(以下簡稱抗菌藥物)作為飼料添加劑，因殘留和畜禽產(chǎn)品安全問題，其使用已受到了嚴(yán)格的限制，飼用微生態(tài)制劑如枯草芽孢桿菌等的一個(gè)重要性質(zhì)是對病原菌有不同程度的抑菌活力，且無毒副、殘留作用，可以避免抗菌藥物應(yīng)用的一些弊端，因而飼用微生態(tài)制劑可以部分代替抗菌藥物。
[0003]從抗菌藥物和飼用微生態(tài)制劑的作用機(jī)理及應(yīng)用技術(shù)上看，飼用微生態(tài)制劑在很長一段時(shí)間內(nèi)很難完全取代抗菌藥物，當(dāng)抗菌藥物的使用范圍限制到一定程度時(shí)，必將有一個(gè)抗菌藥物與飼用微生態(tài)制劑配合使用的時(shí)期，因此了解飼用微生態(tài)制劑對各類常用抗菌藥物的敏感性、篩選耐藥菌株至關(guān)重要。
[0004]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是農(nóng)業(yè)部公告第2045號(hào)允許使用的飼料添加劑，是一種可形成芽孢的好氧型革蘭氏陽性菌，具有生產(chǎn)條件要求相對簡單、耐溫度變化、快速復(fù)活、快速生長、較強(qiáng)分泌酶等特點(diǎn)。廣泛應(yīng)用于家畜、家禽、水產(chǎn)動(dòng)物、毛皮動(dòng)物、寵物養(yǎng)殖中。
[0005]目前大多數(shù)枯草芽孢桿菌菌株對常見的抗菌藥物敏感，與抗菌藥物聯(lián)用時(shí)必須間隔一定的時(shí)間，篩選耐藥菌株十分必要。
[0006]從發(fā)酵技術(shù)來講，枯草芽孢桿菌有固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵2種常用技術(shù)，其中固態(tài)發(fā)酵技術(shù)操作簡便但不夠精細(xì)、易受雜菌污染、菌體含量不易控制、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定;而液態(tài)發(fā)酵是采用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，對整個(gè)發(fā)酵過程都可以進(jìn)行精細(xì)的過程控制，具有便于無菌操作，容易控制菌體含量，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的特點(diǎn)，但技術(shù)水平要求較高，相對固態(tài)發(fā)酵投資要高，但更適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明優(yōu)化了枯草芽孢桿菌耐藥菌株的液態(tài)發(fā)酵工藝。
[0007]目前飼用枯草芽孢桿菌制劑以普通粉劑或液體為主，市場競爭激烈。泡騰型枯草芽孢桿菌制劑具有極高的商業(yè)價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及一種用于家畜、家禽、水產(chǎn)動(dòng)物、毛皮動(dòng)物、寵物用枯草芽孢桿菌泡騰制劑的制備方法。所制備的枯草芽孢桿菌泡騰粉、顆粒、片具有耐9種抗菌藥物，耐pH值2.0酸，耐0.03%膽鹽，耐85°C高溫，溶化或崩解速度快，穩(wěn)定等特點(diǎn)。具體包括以下步驟:
51、菌株篩選:篩選出耐9種抗菌藥物的枯草芽孢桿菌菌株待用；
52、對SI所得枯草芽孢桿菌菌株活化、發(fā)酵、離心，得菌粉待用；
53、篩選酸源、堿源、酸堿比例、填充劑，與菌粉等混合制成泡騰制劑。
[0009]菌株篩選的具體步驟為:采用肉湯稀釋法分析枯草芽孢桿菌對阿莫西林、硫酸粘菌素、硫酸新霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、鹽酸林可霉素、酒石酸泰樂菌素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、乳酸環(huán)丙沙星9種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果枯草芽孢桿菌對硫酸粘菌素、磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥，對阿莫西林、硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸林可霉素敏感性較低，對酒石酸泰樂菌素、鹽酸多西環(huán)素、乳酸環(huán)丙沙星敏感性較高。根據(jù)9種抗菌藥物對枯草芽孢桿菌的MIC，選擇稀釋倍數(shù)最小的抗菌藥物磺胺間甲氧嘧啶鈉，取第I孔內(nèi)液體加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌懸液。于滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別加入不同稀釋倍數(shù)的阿莫西林、酒石酸泰樂菌素、硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、鹽酸林可霉素、乳酸環(huán)丙沙星并作倍比稀釋，然后每管加入培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌懸液，置37°C培養(yǎng)24h，再將含有藥物的培養(yǎng)物連轉(zhuǎn)3次;把一定濃度的該抗菌藥物加入到營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基中，用接種環(huán)從第3次的培養(yǎng)物中挑取菌液進(jìn)行劃線，置37°C培養(yǎng)24h。然后提高抗菌藥物濃度重復(fù)上面步驟逐步篩選出耐9種抗菌藥物枯草芽孢桿菌高耐菌株。所篩選的枯草芽孢桿菌菌株最高可耐受阿莫西林72yg/mL、硫酸粘菌素85.7yg/mL、硫酸新霉素115.5yg/mL、磺胺間甲氧啼啶鈉259μ區(qū)/1111^、鹽酸林可霉素18(^8/1111^、酒石酸泰樂菌素153.7548/1111^、氟苯尼考5(^8/1111^、鹽酸多西環(huán)素175.Syg/mL、乳酸環(huán)丙沙星53.2yg/mL，耐pH值2.0酸、耐0.03%膽鹽，耐85 °C高溫。
[0010]對上述篩選的枯草芽孢桿菌菌株進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化，以營養(yǎng)肉湯為發(fā)酵培養(yǎng)基，通過測定枯草芽孢桿菌的生長曲線，認(rèn)為枯草芽孢桿菌在24h發(fā)酵液菌體濃度最高，發(fā)酵時(shí)間確定為24h。對不同碳源(葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖、淀粉、糊精、甘露醇、麩皮)、不同氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、花生餅粉、豆餅粉、硫酸銨、硝酸銨、尿素)、不同無機(jī)鹽(NaCl、FeS04、ZnS04、CuS04、MnS04.H2O^MgSO4.7H20)對枯草芽孢桿菌發(fā)酵的影響進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，確定了以玉米粉作為碳源，花生餅粉作為氮源，MnSO4.H20、FeS04作為無機(jī)鹽。選擇玉米粉濃度、花生餅粉濃度、MnSO4.H2O濃度、初始pH值、接種量設(shè)計(jì)五個(gè)因素四水平的LI 6(45)正交試驗(yàn)，最終確定枯草芽孢桿菌菌株的最佳培養(yǎng)條件為:玉米粉1%、花生餅粉2%、MnSO4.H2O0.07%、初始pH值7.0，接種量為2%。之后研究了裝液量對發(fā)酵的影響，通過優(yōu)化確定枯草芽孢桿菌菌株最佳發(fā)酵條件為:玉米粉1%、花生餅粉2%、MnS04.H2O0.07%、Fe SO40.0 2% ^ NaH2PO4.2H20 0.2% ^ Na2HPO4.2H20 0.4%，初始 pH 值 7.0，裝液量 20%，接種量2%，發(fā)酵溫度37 °C，發(fā)酵24h。
[0011 ]將發(fā)酵液離心得1.0 X 10ncfu/g枯草芽孢桿菌菌粉。
[0012]選擇檸檬酸、酒石酸、硼酸、蘋果酸、富馬酸、乙二酸、乳酸8種酸，選擇碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鈣5種堿對枯草芽孢桿菌泡騰粉、顆粒、片進(jìn)行驗(yàn)證，通過檢測PH值、活菌數(shù)、發(fā)泡量、崩解時(shí)限或溶化性。篩選出檸檬酸、酒石酸、硼酸、蘋果酸、富馬酸中的一種或幾種作為最佳酸源，碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀中的一種或幾種作為最佳堿源。單因素方差分析5個(gè)酸堿比例對枯草芽孢桿菌泡騰粉、顆粒、片的pH值、發(fā)泡量、崩解時(shí)限或溶化性的差異性，確定1: 0.9?1: 1.3為最佳酸堿比例。選擇乳糖、蔗糖、葡萄糖、水溶淀粉做填充劑，通過檢測發(fā)泡量、崩解時(shí)限或溶化性、顆粒和片表面光滑程度，確定乳糖、蔗糖或水溶淀粉為填充劑。生產(chǎn)枯草芽孢桿菌泡騰粉、顆粒、片各3批，結(jié)果活菌數(shù)、pH值穩(wěn)定，發(fā)泡量高，崩解時(shí)限或溶化性在3min以內(nèi)。經(jīng)過18個(gè)月的穩(wěn)定性考察，枯草芽孢桿菌泡騰粉、顆粒、片水分略有增加，PH值、發(fā)泡量、活菌數(shù)略有降低，崩解時(shí)限或溶化性略有延長，但均在標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)；其他指標(biāo)不變，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。保質(zhì)期定為18個(gè)月。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0014]菌株篩選的具體步驟為:采用肉湯稀釋法分析枯草芽孢桿菌對阿莫西林、硫酸粘菌素、硫酸新霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、鹽酸林可霉素、酒石酸泰樂菌素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、乳酸環(huán)丙沙星9種抗菌藥物的敏感性。結(jié)果9種抗菌藥物對枯草芽孢桿菌的MIC分別為:阿莫西林9yg/mL、硫酸粘菌素>85.7yg/mL、硫酸新霉素7.219yg/mL、磺胺間甲氧啼啶鈉>259yg/mL、鹽酸林可霉素22.5yg/mL、酒石酸泰樂菌素2.402yg/mL、氟苯尼考3.125yg/mL、鹽酸多西環(huán)素0.343^^/!!^、乳酸環(huán)丙沙星0.SOSlIgAiLt3根據(jù)9種抗菌藥物對枯草芽孢桿菌的MIC，選擇稀釋倍數(shù)最小的抗菌藥物磺胺間甲氧嘧啶鈉，取第I孔內(nèi)液體加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)枯草芽孢桿菌懸液。于滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中分別加入國家標(biāo)準(zhǔn)最高推薦用量稀釋8倍的阿莫西林、稀釋256倍的酒石酸泰樂菌素、稀釋16倍的硫酸新霉素、稀釋64倍的氟苯尼考、稀釋1024倍的鹽酸多西環(huán)素、稀釋8倍的鹽酸林可霉素、稀釋512倍的乳酸環(huán)丙沙星并作倍比稀釋，然后每管加入培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌懸液，置37°C培養(yǎng)24h，再將含有藥物的培養(yǎng)物連轉(zhuǎn)3次;把一定濃度的該抗菌藥物加入到營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基中，用接種環(huán)從第3次的培養(yǎng)物中挑取菌液進(jìn)行劃線，置37°C培養(yǎng)24h。然后提高抗菌藥物濃度重復(fù)上面步驟逐步篩選出耐9種抗菌藥物枯草芽孢桿菌高耐菌株。所篩選的枯草芽孢桿菌菌株最高可耐受阿莫西林72yg/mL、硫酸粘菌素85.7yg/mL、硫酸新霉素115.5yg/mL、磺胺間甲氧啼啶鈉259yg/11^、鹽酸林可霉素180卩8/1111^、酒石酸泰樂菌素153.75卩8/1111^、氟苯尼考50卩8/1]11^、鹽酸多西環(huán)素175.Syg/mL、乳酸環(huán)丙沙星53.2yg/mL，耐pH值2.0酸、耐0.03%膽鹽，耐85 °C高溫。
[0015]選擇玉米粉1%、花生餅粉2%、MnS04.H2O0.07%^FeS040.02%^ΝβΗ2Ρ04.2Η20 0.2%、Na2HPO4.2Η20 0.4%，初始pH值7.0，裝液量20%，接種量2%，發(fā)酵溫度37 °C，發(fā)酵24h生產(chǎn)3批枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，將發(fā)酵液5000r/min離心1min得到菌粉，3批菌粉活菌數(shù)分別為1.26X10ncfu/mL、I.18 X10ncfu/mL、I.22X10ncfu/mL。
[0016]實(shí)施例1:選擇檸檬酸做酸源，選擇碳酸氫鈉做堿源，酸堿比例1:1.1，選擇乳糖做填充劑。將枯草芽孢桿菌菌粉10份與微晶纖維素I份、乳糖29份、檸檬酸10份混合，過24目篩備用或制成酸顆粒;將枯草芽孢桿菌菌粉10份與微晶纖維素I份、乳糖28份、碳酸氫鈉11份混合，過24目篩備用或制成堿顆粒，將酸粉末與堿粉末按1:1比例混合得泡騰粉，將酸顆粒與堿顆粒按1:1比例混勻得泡騰顆?；蚣铀軡櫥瑒┚垡叶?000 0.5份，按常規(guī)方法壓片得泡騰片。按上述工藝生產(chǎn)枯草芽孢桿菌泡騰粉、顆粒、片各3批，結(jié)果活菌數(shù)、pH值穩(wěn)定，發(fā)泡量高，崩解時(shí)限或溶化性在3min以內(nèi)。
[0017]實(shí)施例2:選擇檸檬酸、酒石酸做酸源，選擇碳酸鈉做堿源，酸堿比例1:1.3，選擇蔗糖和乳糖I: I做填充劑。將枯草芽孢桿菌菌粉I份與微晶纖維素0.5份、乳糖20.25份、蔗糖20.25份、檸檬酸5份、酒石酸3份混合，過24目篩備用或制成酸顆粒;將枯草芽孢桿菌菌粉I份與微晶纖維素0.5份、乳糖19.05份、蔗糖19.05份、碳酸鈉10.4份混合，過24目篩備用或制成堿顆粒，將酸粉末與堿粉末按1:1比例混合得泡騰粉，將酸顆粒與堿顆粒按1:1比例混勻得泡騰顆?；蚣铀軡櫥瑒┚垡叶?000 I份，按常規(guī)方法壓片得泡騰片。按上述工藝生產(chǎn)枯草芽孢桿菌泡騰粉、顆粒、片各3批，結(jié)果活菌數(shù)、pH值穩(wěn)定，發(fā)泡量高，崩解時(shí)限或溶化性在3min以內(nèi)。
[0018]實(shí)施例3:選擇硼酸、酒石酸做酸源，選擇碳酸氫鈉、碳酸鉀做堿源，酸堿比例I:
0.9，選擇蔗糖和水溶淀粉4:1做填充劑。將枯草芽孢桿菌菌粉5份與微晶纖維素2.5份、蔗糖26份、水溶淀粉6.5份、硼酸5份、酒石酸5份混合，過24目篩備用或制成酸顆粒;將枯草芽孢桿菌菌粉5份與微晶纖維素2.5份、水溶淀粉6.7份、蔗糖26.8份、碳酸鉀4份、碳酸氫鈉5份混合，過24目篩備用或制成堿顆粒，將酸粉末與堿粉末按1:1比例混合得泡騰粉，將酸顆粒與堿顆粒按1:1比例混勻得泡騰顆粒或加水溶潤滑劑聚乙二醇4000 0.5份1￥?-1(30 1.5粉，按常規(guī)方法壓片得泡騰片。按上述工藝生產(chǎn)枯草芽孢桿菌泡騰粉、顆粒、片各3批，結(jié)果活菌數(shù)、PH值穩(wěn)定，發(fā)泡量高，崩解時(shí)限或溶化性在3min以內(nèi)。
[0019]使用上述泡騰制劑飼喂養(yǎng)殖動(dòng)物，肉雞日增重提高5%以上，料肉比降低2%以上，每只肉雞經(jīng)濟(jì)效益增加0.8元以上；蛋雞產(chǎn)蛋率提高2%以上，料蛋比降低2%以上;仔豬日增重提高5%以上，料肉比降低4%以上。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種枯草芽孢桿菌泡騰制劑的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟: 51、菌株篩選:篩選出耐9種抗菌藥物的枯草芽孢桿菌菌株待用； 52、對SI所得枯草芽孢桿菌菌株活化、發(fā)酵、離心，得菌粉待用； 53、篩選酸源、堿源、酸堿比例、填充劑，與菌粉等混合制成泡騰制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌泡騰制劑，其特征在于，所篩選的枯草芽孢桿菌菌株最高可耐受阿莫西林72yg/mL、硫酸粘菌素85.7yg/mL、硫酸新霉素115.5yg/mL、磺胺間甲氧啼啶鈉259yg/mL、鹽酸林可霉素180yg/mL、酒石酸泰樂菌素153.75yg/mL、氟苯尼考50μg/mL、鹽酸多西環(huán)素175.5yg/mL、乳酸環(huán)丙沙星53.2yg/mL，耐pH值2.0酸、耐0.03%膽鹽，耐85°C高溫。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌泡騰制劑，其特征在于，以玉米粉1%、花生餅粉2%、MnS04.H200.07%、FeS040.02%、NaH2P04.2H20 0.2%^Na2HPO4.2H20 0.4%為培養(yǎng)基，初始pH值7.0，裝液量20%，接種量2%，發(fā)酵溫度37 °C，發(fā)酵24h的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，離心得1.0X 10nCfu/g枯草芽孢桿菌菌粉。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌泡騰制劑，其特征在于，泡騰制劑包括:泡騰粉、泡騰顆粒、泡騰片，均包括以下重量份數(shù)的原料:枯草芽孢桿菌菌粉(1.0 X 10ncfU/g)2?20份、酸源I?20份、堿源0.9?26份、微晶纖維素0.5?5份、水溶潤滑劑0.5?5份、填充劑24?95.1份。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌泡騰制劑，其特征在于，酸源為檸檬酸、酒石酸、硼酸、蘋果酸、富馬酸中的一種或幾種，堿源為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀中的一種或幾種，水溶潤滑劑為聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鎂、PVP-K30中的一種或幾種，填充劑為蔗糖、乳糖、葡萄糖、水溶淀粉中的一種或幾種。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌泡騰制劑，其特征在于，將枯草芽孢桿菌菌粉與適量的微晶纖維素、填充劑、酸源混合，過24目篩備用或制成酸顆粒;將枯草芽孢桿菌菌粉與適量的微晶纖維素、填充劑、堿源混合，過24目篩備用或制成堿顆粒，酸堿比例為1:0.9?I: 1.3，將酸粉末與堿粉末混合得泡騰粉，將酸顆粒與堿顆粒按比例混勻得泡騰顆粒或加水溶潤滑劑，按常規(guī)方法壓片得泡騰片。
【文檔編號(hào)】A23K10/18GK105941834SQ201610418643
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】張曉云, 劉學(xué)彬, 周同茂, 王釗, 高國權(quán), 馮英珍, 馮欣璞, 許燦, 李玉佳, 段寶軒
【申請人】麥?zhǔn)希ㄊ仪f）飼料科技有限公司