專(zhuān)利名稱(chēng)：一株微生物菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株微生物菌株及其應(yīng)用，具體涉及ー種煙草煙堿降解菌一微桿菌GYC29 (Microbacterium sp. GYC29) CCTCC NO M2010311 及其在煙草中的應(yīng)用，屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙堿又名尼古丁(Nicotine)，是煙草生物堿中的主要成分。烤煙中煙堿的含量一般在I. 5% 3. 5%,以2. 5%左右為宜。煙堿含量過(guò)低，勁頭太小，煙堿含量過(guò)高，勁頭太大，會(huì)引起刺嗆辛辣感。降低煙草中的煙堿含量，目前主要有三條途徑(I)從農(nóng)業(yè)種植的角度進(jìn)行調(diào)控主要從遺傳、生態(tài)和栽培等方面來(lái)進(jìn)行控制。(2)從化學(xué)的角度煙葉中的生物堿可通過(guò)用熱水漂洗、有機(jī)溶劑萃取、氣體抽提和蒸汽蒸餾等處理煙葉的方法將煙葉中的煙堿脫棹。(3)從微生物和酶的角度從煙葉、煙籽和土壌中分離能夠降解煙堿的微生 物，培養(yǎng)后直接或者分離出酶系后作用于煙葉，降低煙葉中的煙堿含量，從而提高煙葉的可用性。對(duì)于已經(jīng)成熟采收了的煙葉，就只能采用第2和3種方法。其中，使用溶劑抽提等化學(xué)方法雖然可以去除一部分煙堿，但同時(shí)會(huì)引起煙草中的一些致香成分的損失和外觀色澤的顯著變化，從而在一定程度上降低了處理煙葉的可用性。而通過(guò)微生物或酶來(lái)處理煙葉，由于酶具有專(zhuān)ー性，因此可以較好地避免這些問(wèn)題。在微生物降解煙堿方面，C. Enders等早在1947年就對(duì)酵母降解煙堿進(jìn)行了研究，以后逐漸成為人們關(guān)注的課題。國(guó)外一些大的煙草企業(yè)如菲利普莫瑞斯煙草公司、英美煙草公司等很早就利用微生物對(duì)煙草中的煙堿進(jìn)行降解，以此來(lái)滿(mǎn)足一部分消費(fèi)群體對(duì)低尼古丁香煙的需求。目前已報(bào)道的能夠降解煙堿的微生物主要包括2大類(lèi)酵母和細(xì)菌。國(guó)夕卜報(bào)追如 Deharyomyces nicotianae,Micrococus nicotianae,Pseudomonas, Alcaligenesparadox us, Arthrobacterglobif ormils, Enterobacter cloacae, Cunninghamellaechinulata, Nicotianae plumbaginif olia, Artnrobacter oxidans 等。國(guó)內(nèi)孫君社等(2002)從煙葉倉(cāng)庫(kù)或露天煙垛周?chē)耐翂粗蟹蛛x出降解煙草煙堿的煙草假單胞菌(Pseudomonas nicotianae)。利用微生物來(lái)處理煙葉,不僅降解了煙葉中的煙堿，改善煙葉的品質(zhì)，還減少對(duì)環(huán)境的污染，提高煙葉資源的利用率，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。因此，篩選能夠高效降解煙堿的微生物，用于處理煙草煙葉中的煙堿，具有廣泛的應(yīng)用前景。在已報(bào)道的煙堿降解菌中，尚未有利用微桿菌降解煙堿的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種能夠高效降解煙堿的微生物菌株即微桿菌GYC29 (Microbacterium sp. GYC29)，保藏號(hào)為 CCTCC NO :M2010311，及其相應(yīng)的培養(yǎng)條件并公開(kāi)ー種利用微生物降解煙草中的煙堿提高煙葉可用性的方法。本發(fā)明通過(guò)如下方案實(shí)現(xiàn)ー種微生物菌株,其特征在于它為微桿菌Microbacterium sp. GYC29,保藏號(hào)為CCTCC NO M2010311 ;菌落黃色，表面光滑不透明邊緣整齊；革蘭氏陽(yáng)性，最適生長(zhǎng)溫度為25-30 °C。所述菌株通過(guò)如下途徑獲得將植煙土壤分別取IOg加入到含有200mL無(wú)菌水的三角瓶中，于30°C，200rpm的搖床搖30min，過(guò)濾，取ImL細(xì)菌懸液轉(zhuǎn)接至另ー個(gè)含200mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，富集培養(yǎng)3d，然后取ImL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至另ー個(gè)含200mL煙堿濃度為O. 2%的煙堿培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)3d。將培養(yǎng)物稀釋涂布到煙堿選擇培養(yǎng)基上，經(jīng)分離純化和耐受煙堿能力試驗(yàn)，獲得在O. 8%煙堿濃度培養(yǎng)液中可以旺盛生長(zhǎng)的降解煙堿菌株，即微桿菌Microbacteriumsp.GYC29。所述富集培養(yǎng)基為蛋白胨10g，酵母提取物5. 0g，NaCl 10g，Ig K2HPO4,水1000ml, ρΗ7· O。所述煙堿培養(yǎng)基為0.2w/v % 煙堿，13. 3g K2HPO4 · 3H20，4g KH2PO4,0. 2g MgSO4 · 7Η20，0· 05ml 微量元素，水 1000ml, ρΗ7· O。所述微量元素為0.04g CaCl2,0. 07g CuSO4,0. 008g MnSO4 · H2O, O. 004gFeSO4 · 7Η20，0· Ig Na2MoO4 · 2H20，加 0. Imol ·じ1 的 HCl 溶解定容 IOOmL0所述煙堿選擇培養(yǎng)基為煙堿培養(yǎng)基+1. 5W/v%瓊脂粉。所述菌株的培養(yǎng)步驟為A、斜面培養(yǎng)蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7. 0，
將冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)2天；B、搖瓶培養(yǎng)煙堿2g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，K2HPO4 ·3Η20 13. 3g，KH2PO44g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調(diào)pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌；搖瓶裝液量為10 30v/v%，接種量為2 10v/v%，培養(yǎng)溫度為20 40°C，搖床轉(zhuǎn)速為100 200rpm，搖瓶培養(yǎng)I 3天，煙堿降解率達(dá)到85 100%。所述微量元素為-.CaCl20. 04g, CuSO4 0. 07g, MnSO4 · H2O 0. 008g, FeSO4 · 7H200. 004g, Na2MoO4 · 2H20 0. lg,加 0. Imol ·じ1 的 HCl 溶解定容 100ml。所述微桿菌Microbacterium sp. GYC29用于降解煙草中的煙堿；所說(shuō)的用于降解煙草中的煙堿,通過(guò)如下步驟獲得A、將權(quán)利要求I所述的微桿菌Microbacterium sp. GYC29進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),獲得發(fā)酵液及菌體；B、將步驟a所得的發(fā)酵液或菌體用水、生理鹽水或者緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯缶簼舛冗_(dá)到IO6 IO12個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的I 5%，加入到含水量為10 50%的煙草中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為10 50°C，發(fā)酵時(shí)間不低于4小吋。其中步驟B中所說(shuō)的緩沖液為巴比妥緩沖液、鄰苯ニ甲酸鹽緩沖液、氨-氯化銨緩沖液、硼砂-氯化鈣緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液、醋酸-醋酸銨緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的任意ー種。培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)稀釋后菌液濃度達(dá)到IO9個(gè)/ml，將菌液按照煙葉重量的I 5%，加入到含水量為10 50%的煙草中，發(fā)酵6 72小時(shí)，可使煙葉煙堿含量降低，刺激性明顯減少，煙氣醇和，煙葉可用性明顯提高。所述微桿菌Microbacterium sp. GYC29,已于2010年11月24日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡(jiǎn)稱(chēng)為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2010311。保藏地址湖北省武漢市武昌珞珈山，郵政編碼430072。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為采用本發(fā)明來(lái)改善煙葉原料尤其是上部煙葉的品質(zhì)，エ藝過(guò)程簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和；經(jīng)過(guò)處理后，煙葉煙堿含量降低 ，刺激性明顯減少，煙氣醇和，煙葉可用性明顯提高。該方法具有簡(jiǎn)單實(shí)用，成本低廉等特點(diǎn)，可望在エ業(yè)上推廣應(yīng)用。說(shuō)明書(shū)附圖
為便于理解本發(fā)明微桿菌GYC29的分子生物學(xué)特征，特結(jié)合附圖做進(jìn)ー步說(shuō)明。圖I為微桿菌GYC29的16S rDNA序列圖。
具體實(shí)施例方式下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的闡述，其目的是為更好理解本發(fā)明的內(nèi)容。因此，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I斜面培養(yǎng)蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7. 0，將
冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)2天。搖瓶培養(yǎng)煙堿lg，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，K2HPO4 · 3H20 13. 3g，KH2PO44g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調(diào)pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌。250ml搖瓶裝液量為30ml，接種量為3v/v%，培養(yǎng)溫度為20°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，搖瓶培養(yǎng)24小時(shí)，煙堿降解率達(dá)到100% ο微量元素=CaCl2 O. 04g, CuSO4 O. 07g, MnSO4 · H2OO. 008g, FeSO4 · 7H20 0. 004g, Na2MoO4 · 2H20 0. lg，加 0. Imol ·じ1 的 HCl 溶解定容 100ml。實(shí)施例2斜面培養(yǎng)與實(shí)施例I相同。在250ml搖瓶裝入30ml培養(yǎng)基，其組成如下煙堿4g，玉米漿 15g,酵母膏 5g，氯化鈉 5g，K2HPO4 · 3H20 13. 3g，KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調(diào)pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌。250ml搖瓶裝液量為30ml，接種量為2v/v%，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，搖瓶培養(yǎng)48小時(shí)，煙堿降解率達(dá)到85%。實(shí)施例3斜面培養(yǎng)與實(shí)施例I相同。在250ml搖瓶裝入30ml培養(yǎng)基，其組成如下煙堿8g，玉米漿 15g,酵母膏 5g，氯化鈉 5g，K2HPO4 · 3H20 13. 3g，KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調(diào)pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌。250ml搖瓶裝液量為30ml，接種量為2v/v%，培養(yǎng)溫度為40°C，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，搖瓶培養(yǎng)72小時(shí)，煙堿降解率達(dá)到62%。實(shí)施例4取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的I %，噴施到含水量為16%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在35で、相対濕度65%的條件下發(fā)酵24小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降8. 6 %，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。實(shí)施例5
取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的I %，噴施到含水量為16%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在35で、相対濕度65%的條件下發(fā)酵36小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降12.9%，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。實(shí)施例6取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的I %，噴施到含水量為16%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在35で、相対濕度65%的條件下發(fā)酵48小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降20%，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。
實(shí)施例7取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的2%，噴施到含水量為16%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在35で、相対濕度75%的條件下發(fā)酵60小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降26.2%，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。實(shí)施例8取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的2%，噴施到含水量為16%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在35で、相対濕度65%的條件下發(fā)酵72小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降32. 8%，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。實(shí)施例9取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的I %，噴施到含水量為10%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在50°C、相対濕度65%的條件下發(fā)酵24小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降8. 6 %，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。實(shí)施例10取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的I %，噴施到含水量為25%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在35で、相対濕度65%的條件下發(fā)酵36小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降12.9%，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。實(shí)施例11取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的I %，噴施到含水量為30%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在35で、相対濕度65%的條件下發(fā)酵48小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降20%，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。實(shí)施例12取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的2%，噴施到含水量為40%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在35で、相対濕度75%的條件下發(fā)酵60小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降26.2%，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。
實(shí)施例13取實(shí)施例I中的發(fā)酵液10ml，用無(wú)菌蒸餾水稀釋至IO9個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的2%，噴施到含水量為50%的2008年邵陽(yáng)上部煙葉B2F中，在35で、相対濕度65%的條件下發(fā)酵4小時(shí)，可使煙葉煙堿含量下降32. 8%，煙葉刺激 性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，煙葉品質(zhì)得到改善。
權(quán)利要求
1.ー種微生物菌株,其特征在于它為微桿菌Microbacterium sp. GYC29,保藏號(hào)為CCTCC NO M2010311 ;菌落黃色，表面光滑不透明邊緣整齊；革蘭氏陽(yáng)性，最適生長(zhǎng)溫度為25-30 °C。
2.如權(quán)利要求I所述的微生物菌株，其特征在于所述菌株通過(guò)如下途徑獲得 首先從土壤或者煙葉中分離出降解煙草煙堿的微生物菌株；然后將獲得的微生物菌株用煙堿選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，經(jīng)分離純化和耐受煙堿能力試驗(yàn)，獲得可以高效降解煙堿的菌株，即微桿菌 Microbacterium sp. GYC29。
3.如權(quán)利要求I或2所述的微生物菌株，其特征在于所述菌株的培養(yǎng)步驟為 A、斜面培養(yǎng)蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水IOOOml，ρΗ7·0，將冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)2天； B、搖瓶培養(yǎng)煙堿2g，蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，K2HPO4·3Η20 13. 3g,KH2PO4 4g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調(diào)pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌；搖瓶裝液量為10 30v/v%，接種量為2 10v/v%，培養(yǎng)溫度為20 40°C，搖床轉(zhuǎn)速為100 200rpm，搖瓶培養(yǎng)I 3天，煙堿降解率達(dá)到85 100%。
4.如權(quán)利要求3所述的微生物菌株，其特征在于所述微量元素為=CaCl2O. 04g, CuSO4O.07g, MnSO4 · H2O O. 008g, FeSO4 · 7H20 0. 004g, Na2MoO4 · 2H20 0. lg,加 0. Imol ·じ1 的 HCl溶解定容100ml。
5.權(quán)利要求I所述的ー株微生物菌株的應(yīng)用，其特征在于，所說(shuō)微桿菌Microbacterium sp. GYC29用于降解煙草中的煙堿；所說(shuō)的用于降解煙草中的煙堿,通過(guò)如下步驟獲得 A、將權(quán)利要求I所述的微桿菌Microbacteriumsp. GYC29進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),獲得發(fā)酵液及菌體； B、將步驟A所得的發(fā)酵液或菌體用水、生理鹽水或者緩沖液進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯缶簼舛冗_(dá)到IO6 IO12個(gè)菌/ml，將菌液按照煙葉重量的I 5%，加入到含水量為10 50%的煙草中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為10 50°C，發(fā)酵時(shí)間不低于4小吋。
6.如權(quán)利要求5所述的微生物菌株的應(yīng)用，其特征在于，其中步驟A中所說(shuō)的緩沖液為巴比妥緩沖液、鄰苯ニ甲酸鹽緩沖液、氨-氯化銨緩沖液、硼砂-氯化鈣緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液、醋酸-醋酸銨緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液或磷酸鹽緩沖液中的任意ー種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株微生物菌株及其應(yīng)用，具體涉及一種煙草煙堿降解菌微桿菌GYC29(Microbacterium sp.GYC29)CCTCC NOM2010311及其在煙草中的應(yīng)用。本發(fā)明所公開(kāi)的菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中可以分解利用煙堿。將該菌株的發(fā)酵液或菌體按照煙葉重量的1～5％，加入到含水量為10～50％的煙草中，發(fā)酵6～72小時(shí)可以使煙葉的煙堿含量降低2～33％，煙葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣變醇和，感官質(zhì)量明顯改善。本發(fā)明通過(guò)使用微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)降解煙草煙堿，可以適當(dāng)調(diào)整煙葉原料的煙堿含量大小，提高煙葉的可用性。
文檔編號(hào)A24B15/20GK102719369SQ20111015897
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者張紀(jì)利, 白森, 胡亞杰, 蔡聯(lián)合, 鄒克興, 金亞波, 韋建玉, 黃泰松, 龍章德 申請(qǐng)人:廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司