專利名稱：：用于產(chǎn)生胚中具有母體基因組的全二倍體組的種子的核酸和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因的等位基因和擬南芥(Arabidopsis)、Boechera、水稻及其它植物的基因產(chǎn)物用于操縱配子發(fā)生和種子發(fā)育，以產(chǎn)生在胚中具有母體基因組的全二倍體組的種子的用途。本發(fā)明還涉及改變的基因用于產(chǎn)生未減數(shù)雌配子體而基本上不影響花粉發(fā)育的用途。
背景技術(shù)：
：植物生活周期在二倍體孢子體世代和單倍體的配子體世代之間交替。減數(shù)分裂代表植物生活周期二倍體孢子體和單倍體配子體階段之間的轉(zhuǎn)變。減數(shù)分裂導(dǎo)致單倍體孢子形成。在植物中(與動(dòng)物不同)，減數(shù)分裂產(chǎn)物經(jīng)歷另外的分裂以形成多細(xì)胞單倍體配子體。配子的分化在減數(shù)分裂產(chǎn)物分裂后，在配子體發(fā)育的較后階段發(fā)生。受精之前的有性過(guò)程因而包括兩個(gè)截然不同的階段包括減數(shù)分裂和單倍體孢子形成的孢子發(fā)生；以及涉及孢子發(fā)育成配子體的配子發(fā)生，包括受精和支持胚生長(zhǎng)所需的配子和相關(guān)細(xì)胞。大多數(shù)植物種經(jīng)歷有性生殖；然而一些植物種能夠進(jìn)行無(wú)性生殖。術(shù)語(yǔ)無(wú)融合生殖通常公認(rèn)為是某些形式的無(wú)性生殖的任意一種對(duì)有性生殖的取代(KoltunowA.和GrossniklaussU.Armu.Rev.PlantBiol.Vol.54:547-74，2003)。無(wú)融合生殖是一種遺傳控制的植物生殖方法，涉及其中胚形成而無(wú)卵細(xì)胞和精子結(jié)合的種子形成。存在三種基本類型的無(wú)融合生殖l)無(wú)孢子生殖，其中胚由源自珠心的胚嚢中的染色體未減數(shù)卵孤雌生殖發(fā)育而成，2)二倍體孢子生殖，其中胚由源自大孢子母細(xì)胞的胚嚢中的未減數(shù)卵孤雌生殖發(fā)育而成，以及3)不定胚生殖，其中胚直接由體細(xì)胞發(fā)育而成。前兩種類型的無(wú)融合生殖都?xì)w為配子體無(wú)融合生殖，因?yàn)樵谶@兩種情形中胚都是由雌配子體或胚嚢發(fā)育而成，而在不定胚生殖中胚直接由體細(xì)胞發(fā)育而成而沒(méi)有中間的雌配子體階段。配子體無(wú)融合生殖因而包括兩個(gè)部分i)未減數(shù)孢子生殖，或保留了親本基因型的未減數(shù)雌配子體(胚嚢)的產(chǎn)生，以及ii)胚的孤雌發(fā)育，有或沒(méi)有發(fā)育成胚乳的中央細(xì)胞的受精。無(wú)融合生殖因而是不經(jīng)過(guò)雌性減數(shù)分裂和配子配合而產(chǎn)生遺傳上與母本相同的胚的生殖過(guò)程。該三種類型的無(wú)融合生殖具有經(jīng)濟(jì)潛力，因?yàn)樗鼈兛梢源偈谷魏位蛐?不管多么雜合)純育。利用無(wú)融合生殖，尤其是適應(yīng)性基因型(adaptivegenotype)或雜交基因型的后代將在重復(fù)的生活周期中維持它們的基因型。除了固定雜種優(yōu)勢(shì)，無(wú)融知或未研發(fā)出的作物的商業(yè)化雜種的產(chǎn)生成為可能。因而，無(wú)融合生殖可以使雜種研發(fā)更有效。無(wú)融合生殖還簡(jiǎn)化了雜種產(chǎn)生并增加了具有良好的雄性不育系的植物種中的遺傳多樣性。將控制專性或高水平有性;無(wú)融合基;型雜交:產(chǎn)生純種fi雜種是高i期望的:無(wú)融合生殖轉(zhuǎn)移至重要作物的將使得有可能開(kāi)發(fā)出純種雜種和商業(yè)化生產(chǎn)雜種而無(wú)需細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核雄性不育以及高花費(fèi)、勞動(dòng)密集型的生產(chǎn)過(guò)程。專性無(wú)融合生殖的Fl雜種將通過(guò)種子來(lái)無(wú)限地純育并且可以考慮來(lái)通過(guò)種子來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)生殖方法或無(wú)性系生殖方法。研發(fā)無(wú)融合生殖培育的作物還可以為發(fā)展中國(guó)家的糧食安全提供重要作用(SpillaneC，SteimerA，和GrossniklausU,Sex.PlantReprod.14:179-187，2001)。事實(shí)上，大多數(shù)已知的控制無(wú)融合生殖的基因已在與培育物種親緣關(guān)系遠(yuǎn)的野生種中找到。雖然種間雜交在培養(yǎng)的物種和野生種之間是可能的，但基因組之間的染色體配對(duì)通常較低或不存在，導(dǎo)致這種方法失敗。附圖簡(jiǎn)述圖l示出了^7ad突變體植林的減少的結(jié)實(shí)率。，最常見(jiàn)的范圍是每林植物1-10粒種子。圖2示出了利用Alexander染色顯示的^rad突變體植林正?；ǚ鄣幕盍?。(圖2A)為野生型。(圖2B)為辦M^突變體。圖3示出了野生型和^7^突變體中的雄性減數(shù)分裂和雌性減數(shù)分裂。(圖3A-C)為野生型。(圖3D-F)為^rW突變體。(圖3A，D)為減數(shù)分裂1末(末期)的雄性性母細(xì)胞。(圖3B，E)為四分體階段的雄性性母細(xì)胞。(圖3C，F(xiàn))為分裂后期1階段的雌性性母細(xì)胞。《Md經(jīng)歷了均等雌性減數(shù)分裂。圖4示出了二倍體f/7S^突變體植林的代表性后代的染色體倍性。(圖4A)為顯示有15條染色體的三倍體后代植林的體細(xì)胞。(圖4B)為攜帶顯示以9:6分離的15條染色體的三倍體后代植林中的雄性減數(shù)分裂1。(圖4C)為顯示有10條染色體的二倍體后代植林的體細(xì)胞。圖5示出了BoecheraholboelliiM"同系物對(duì)d/a^/突變體的補(bǔ)充(complementoition):(圖5A)為顯示了未伸長(zhǎng)的長(zhǎng)角果的力w^突變體。(圖5B)為用Bh"M"基因轉(zhuǎn)化的d/ad突變體，表現(xiàn)為含有種子的伸長(zhǎng)的長(zhǎng)角果。(圖5C)為c(^d突變體植林(1)、補(bǔ)足了的植抹(2)和野生型植林(3)的長(zhǎng)角果的比較。(圖5D)為補(bǔ)足了的植林的裂開(kāi)的長(zhǎng)角果，顯示了完全的結(jié)實(shí)率。(圖5E)為野生型植林的分裂的長(zhǎng)角果。圖6是示出了用于構(gòu)建條件性補(bǔ)充品系的pBI101.3::Dyad::(A)GR盒的示意圖。圖7是顯示CAPS多態(tài)性用以將ZW"的內(nèi)源性基因座如實(shí)施例6中描述的進(jìn)行基因分型的聚丙烯酰胺凝膠。圖7A:解析的KNEF/KNER引物擴(kuò)增產(chǎn)物的HinFl消化片段。圖7B:解析的KKF/KKR引物擴(kuò)增產(chǎn)物的HinFl消化片段。圖8示出了實(shí)施例6中的力wd表型的條件性補(bǔ)充。圖8A:在地塞米松處理之前和之后顯示了未伸長(zhǎng)的長(zhǎng)角果(^rad表型)的花序。箭頭表示在開(kāi)始處理時(shí)最新開(kāi)放的花朵的位置。在處理開(kāi)始5-7天后長(zhǎng)角果表現(xiàn)出伸長(zhǎng)(野生型表型)。圖8B:在地塞米松處理之前表現(xiàn)為不育(d>ad)表型的分離的長(zhǎng)角果。圖8C:顯示了通過(guò)地塞米松處理的條件性補(bǔ)充后恢復(fù)的野生型表型。圖8D:在地塞米松處理后表現(xiàn)為完全的結(jié)實(shí)率的開(kāi)裂的長(zhǎng)角果。圖9顯示了實(shí)施例6中c^ad表型的條件性補(bǔ)充后胚珠的形態(tài)學(xué)。圖9A:在地塞米松處理前成熟胚珠階段的顯示^Fad表型并且沒(méi)有胚嚢的純胚珠。圖9B:在地塞米松處理后恢復(fù)的胚嚢。圖IO示出了由心wd突變體產(chǎn)生的種子的大小變化以及從二倍體擬南芥林和四倍體擬南芥林之間的回交獲得的種子的大小差異。圖10A:來(lái)自自交的野生型二倍體Col-0植株的種子是均一正常的。圖10B:來(lái)自四倍體植林的種子。圖10C:來(lái)自自交的dj^i/植林的種子的大小在大(L)、正常(N)和皺縮(S)之間變化。圖10D:來(lái)自與二倍體雄林雜交的四倍體雌林的母本過(guò)量-種子是皺縮的。圖10E:在與來(lái)自母本過(guò)量雜交的種子比較時(shí)，來(lái)自二倍體雌林與四倍體雄林雜交的父本過(guò)量-種子的大小較大。圖11示出了用如http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw中的ClustalW(為默認(rèn)參數(shù))進(jìn)行的來(lái)自擬南芥(SEQIDNO:5)、Boechera(SEQIDNO:18)、水稻(SEQIDNO:51)和來(lái)自楊樹(shù)(毛果楊(Populustrichocarpa))(SEQIDNO:26)的"Z4"蛋白的蛋白質(zhì)序列的比對(duì)。圖12示出利用ClustalW(1.82)進(jìn)行的水稻"M"多肽序列(SEQIDNO:51)與推定的玉米Pf力"多肽序列(SEQIDNO:55和54)的比對(duì)。圖12A:水稻"M"氨基酸1-147的比對(duì)。圖12B:7JC稻"W"氨基酸317-803的比對(duì)。圖13示出了將來(lái)自水稻的"W"多肽序列作圖于確定含有"7J仄編碼序列的兩個(gè)玉米重疊群之上。
發(fā)明內(nèi)容存在兩個(gè)可以考慮用于將無(wú)融合生殖引入培養(yǎng)作物的一般策略。第一個(gè)策略是通過(guò)從野生近緣種基因滲入進(jìn)培育種中。第二個(gè)通過(guò)從有性種鑒定能夠賦予無(wú)融合生殖特征的基因，然后累進(jìn)這些基因以產(chǎn)生無(wú)融合生殖的全部成分。然后用轉(zhuǎn)基因方法將這些基因?qū)肱嘤魑镏?。因而例如，一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)可用于設(shè)計(jì)未減數(shù)孢子生殖，并且這些基因可以與另一組基因或其它處理組合來(lái)誘導(dǎo)單性胚的發(fā)育。用于在植物中誘導(dǎo)孤雌生殖的方法是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利No.5，840，567)。一種用于誘導(dǎo)用于本發(fā)明的孤雌發(fā)育的優(yōu)選方法是用已經(jīng)受輻射的花粉給植物授粉，由此使它的受精作用失活。(PandeyK丄和PhungM.，Theoret.Appl.Genet.，Vol.62:295-300，1982;LoftiM.等，PlantCel1Reprod.，Vol.21:1121-1128，2003)。這種方法是優(yōu)選的，因?yàn)樗呀?jīng)用于許多植物種并且顯示是普遍適用的，最易于用于具有不完全花的植物(雌雄同林的和雌雄異林植物)。然而，該方法可應(yīng)用于這樣的具有完全花的雌雄同林植物所或分離。用于絕育花粉的輻射的具體量將不同，這取決于種的具體情況。一般而言，大約10至2000戈瑞(Gray)的量是足夠的。優(yōu)選地，所述量為約100-500戈瑞，更優(yōu)選200-250戈瑞。孤雌生殖的成功誘導(dǎo)可以通過(guò)篩選種子的胚的存在檢測(cè)，例如在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后通過(guò)解剖種子或在看片燈上觀察種子，如LoftiM.等，PlantCellReprod.，Vol，21:1121-1128，2003所描述。已經(jīng)嘗試了將單性生殖性狀引入正常有性生殖的作物中。據(jù)AskerS.(Hereditas，Vol.91:231-241，1979)報(bào)道，該嘗試在小麥、甜菜和玉米中沒(méi)有成功。PCT公開(kāi)號(hào)W089/00810(Maxon等，1989)公開(kāi)了用來(lái)自非馴養(yǎng)的不育苜蓿植物的提取物來(lái)在培育植物中誘導(dǎo)單性生殖形式的生殖。當(dāng)在高梁、向日葵、珍珠粟和蕃茄中評(píng)估雄性不育的誘導(dǎo)時(shí)，據(jù)報(bào)道在高梁、珍珠粟和向日葵中存在減少的結(jié)實(shí)率并且在馬鈴薯中存在減少的坐果率。雖然無(wú)融合生殖有效地用于了柑桔屬(Citrus)來(lái)產(chǎn)生均一的且無(wú)疾病和無(wú)病毒的根狀莖(ParlevlietJ.E.等，inCitrus.Proc.Am.Soc.Hort.Sci.，Vol.74:252-260，1959)并且用于綠毛蒺藜草(Bashaw,CropScience,Vol.20:112，1980)和Poa(Pepin等，CropScience,Vol.11:445-448，1971)來(lái)產(chǎn)生改良的栽培品種，但其尚不能成功地轉(zhuǎn)移至栽培作物中。設(shè)計(jì)無(wú)融合生殖的第二個(gè)方法涉及鑒定和操縱來(lái)自有性生殖種的無(wú)融合生殖相關(guān)基因。有關(guān)無(wú)融合生殖的一個(gè)發(fā)展的觀點(diǎn)認(rèn)為，無(wú)融合生殖與有性生殖相關(guān)并涉及在有性途徑中也起作用的基因的作用(TuckerM.R.等，PlantCell,Vol,15(7):1524-1537，2003)。在有性生殖中，通常由接近發(fā)育中的胚珠頂端的下皮層產(chǎn)生的大孢子母細(xì)胞擴(kuò)大并且經(jīng)歷減數(shù)分裂和兩次細(xì)胞分裂來(lái)形成大孢子的直列四分孢子，每個(gè)直列四分孢子具有單倍染色體數(shù)。在不同的植物種之間最常見(jiàn)的是，三個(gè)最頂端的孢子退化，同時(shí)功能性合點(diǎn)孢子經(jīng)歷三輪伴隨細(xì)胞擴(kuò)大的核分裂來(lái)形成具有一個(gè)卵細(xì)胞、兩個(gè)助細(xì)胞和三個(gè)反極細(xì)胞的胚嚢。無(wú)融合生殖是需要多個(gè)步驟和控制無(wú)融合生殖的整個(gè)途徑的過(guò)程，因?yàn)橐呀?jīng)顯示，在某些種中需要多個(gè)基因的作用(vanDijk等，Heredity,Vol.83:715-721，1999;MatzkF.等，PlantCel1，17(l):13-24，2005)。已經(jīng)認(rèn)為，由途徑中的一個(gè)基因或一亞組基因控制的各個(gè)組成步驟分開(kāi)操作將對(duì)生殖力具有負(fù)面影響(Spillane，C，SteimerA.和GrossniklausU.，Sex.PlantReprod.Vol.14:179-87，2001)，并認(rèn)為只有包括整個(gè)途徑的整組基因協(xié)同作用才能有效地促進(jìn)無(wú)融合生殖。對(duì)擬南芥突變體的遺傳分析和分子分析已經(jīng)導(dǎo)致鑒定了許多在孢子發(fā)生階段和配子發(fā)生階段起作用的基因(YangW.C.和SundaresanV.，Curr.Opin.PlantBiol.Vol.3(1):53-57，2000)。擬南芥的^Ffl^突變體經(jīng)鑒定為導(dǎo)致雌性不育(SiddiqiI.等，Development,Vol.127(1):197-207，2000)并且對(duì)它的分析顯示cT7a^突變體植林在雌性減數(shù)分裂中是有缺陷的。在該《M^突變體中大多數(shù)雌性性母細(xì)胞經(jīng)歷了單次減數(shù)分裂而產(chǎn)生兩個(gè)細(xì)胞而不是四個(gè)細(xì)胞，之后停留在進(jìn)一步的發(fā)育階段(包括配子發(fā)生)。該《rad突變體中的雄性減數(shù)分裂、花粉發(fā)育和雄性能育性發(fā)現(xiàn)是正常的(SiddiqiI.等，Development,Vol.127(1):197-207，2000;ReddyT.V.等，Development,Vol.130(24):5975-5987，2003)。對(duì)雌性減數(shù)分裂過(guò)程中減數(shù)分裂的染色體的分析表明，同源染色體沒(méi)有經(jīng)歷聯(lián)會(huì)并且減數(shù)分裂1的減數(shù)分裂由均等分裂取代(AgasheB.，PrasadC.K.，和SiddiqiL，Development,Vol.129(16)，3935-3943，2002)。一項(xiàng)獨(dú)立的研究已導(dǎo)致鑒定了與"MZ—致的SWI1基因(MotamayorJ.C，等，Sex.PlantReprod.Vol.12:209-218,2000;MercierR.等，GenesandDev.Vol.15:1859—1871,2001)。由這些研究鑒定的基因在下文中稱為"J^基因。來(lái)自擬南芥的野生型iMZ基因編碼639個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQIDNO:5)。擬南芥中的"r^7基因的三個(gè)等位基因已經(jīng)有所描述。這些等位基因是在氨基酸508處截?cái)?；所得的蛋白質(zhì)因而缺失了野生型蛋白質(zhì)中存在的C-端130個(gè)氨基酸；ii)swil.l，其導(dǎo)致產(chǎn)生了減少量的野生型蛋白質(zhì)，導(dǎo)致一些雌性性母細(xì)胞經(jīng)歷減數(shù)分裂1的均等分裂而其它性母細(xì)胞則經(jīng)歷減數(shù)分裂；以及iii)swi1.2，其在位置394處產(chǎn)生終止密碼子并導(dǎo)致類似于的雌性表型，但是還另外導(dǎo)致在雄性減數(shù)分裂中有缺陷，導(dǎo)致雄性不育。Boechera中對(duì)應(yīng)于d7ad等位基因的位置應(yīng)該是一個(gè)突變，導(dǎo)致在氨基酸序列的位置508移碼并導(dǎo)致終止密碼子在10個(gè)另外的密碼子之后(即位置518)的。大米中的相應(yīng)位置分別在563和572處。不受本發(fā)明的任何理論的約束，本發(fā)明人認(rèn)為具有多肽羧基端至位置394(在擬南芥中，并且在其它物種的相應(yīng)位置)的部分的ZMZ蛋白的量的減少，產(chǎn)生了其中雌性性母細(xì)胞經(jīng)歷減數(shù)分裂l的均等分裂，導(dǎo)致在雌配子中保留了母本基因型(并因而保留了雜合性)的表型。正常(或近似)量的具有從位置394至位置508(在擬南芥中，在其它物種的相應(yīng)位置中)的結(jié)構(gòu)域的"Z4"蛋白的保持提供了正常的花粉發(fā)育，而植物中該結(jié)構(gòu)域的缺失產(chǎn)生了雄性不育的表型。在產(chǎn)生本發(fā)明之前，尚未報(bào)導(dǎo)^a^或swil.2等位基因純合的植物顯示出結(jié)實(shí)。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)攜帶有swil.1等位基因的植物在純合時(shí)顯示出減少的結(jié)實(shí)率，但已經(jīng)分析了所產(chǎn)生的種子的染色體結(jié)構(gòu)并發(fā)現(xiàn)它們是二倍體，因而表明該種子是由正常的大孢子發(fā)生和大形配子發(fā)生產(chǎn)生(MotamayorJ.C等，Sex.PlantReprod.Vol.12:209-218，2000)。如先前描述的，由于f/"fZ、swil.1和swil.2中均等分裂、還未知道任何這些是否具有發(fā)育成雌配子的潛能。在產(chǎn)生本發(fā)明以前也不知道是否染色體在均等的單次分裂的雌性減數(shù)分裂過(guò)程中經(jīng)歷了重組并因而該分裂產(chǎn)物喪失親本的雜合性。伴隨均等分裂發(fā)生的重組的似真性得到了在酵母中的研究的支持，該研究證明二倍體細(xì)胞可以進(jìn)入減數(shù)分裂，經(jīng)歷減數(shù)分裂重組，然后在轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)培養(yǎng)基時(shí)停止減數(shù)分裂并進(jìn)行有絲分裂。如果重組在基因和著絲點(diǎn)之間發(fā)生，則這種有絲分裂可導(dǎo)致遺傳標(biāo)記的雜合性喪失(EspositoR.E.和EspositoM.S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.71(8):3172-31761974)。本發(fā)明涉及這樣的發(fā)現(xiàn)在不同的^W純合的突變體植林中所觀察到的減數(shù)分裂1均等分裂的產(chǎn)物能夠產(chǎn)生功能性的未減數(shù)胚嚢，所述胚嚢具有未減數(shù)孢子生殖的特性(無(wú)融合生殖的一種重要組分)。本發(fā)明涉及使用擬南芥、Boechera、水稻、楊屬(Populus)和其它植物的"r^基因，尤其是其突變體等位基因，以及它們的基因產(chǎn)物來(lái)操縱配子發(fā)生和種子發(fā)育，以產(chǎn)生其胚基因型包含母體基因組的全二倍體組的種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，在擬南芥和其它植物類型中產(chǎn)生了三倍體種子。本發(fā)明還提供了用基因的突變體等位基因和基因產(chǎn)物產(chǎn)生雜種優(yōu)勢(shì)植物的方法。在一些實(shí)施方案中，植物和種子包含母體基因組的全二倍體組，并且沒(méi)有父體基因組的貢獻(xiàn)，因而表現(xiàn)為理想的無(wú)融合生殖體。在這些實(shí)施方案的一些實(shí)例中，貢獻(xiàn)母體基因組的植林是擁有具有理想表型的等位基因的分配的雜種，并且本發(fā)明的方法使得能固定并且容易繁殖這樣的等位基因的組合。本發(fā)明涉及導(dǎo)致含有母體基因組的全二倍體組的種子形成的基因及其基因產(chǎn)物的使用。本發(fā)明可用于產(chǎn)生可用以產(chǎn)生無(wú)籽果、構(gòu)建三體品系用于基因定位研究，以及保持親本植株的雜合性和無(wú)融合生殖的三倍體植林。用于本發(fā)明的"r^的等位基因?qū)е挛礈p數(shù)的(二倍體的)胚嚢形成。本發(fā)明還涉及"M"基因用于引起未減數(shù)胚嚢的形成而基本上不影響花粉發(fā)育的用途。本發(fā)明還涉及"w"基因用于通過(guò)三倍體自交來(lái)產(chǎn)生更高級(jí)別的多倍體的用途，所述多倍體將可用于產(chǎn)生具有增加的生物量的植物。應(yīng)該理解，本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案將顯示本發(fā)明的不同方面，并且可以提供本發(fā)明的不同優(yōu)點(diǎn)。并不是每個(gè)實(shí)施方案都將享有本發(fā)明的所有優(yōu)點(diǎn)。定義短語(yǔ)"核酸序列"指從5'末端至3'末端讀取的脫氧核糖核酸或核糖核酸堿基的聚合物的結(jié)構(gòu)。在雙鏈核酸的情況中，"核酸序列，，包括其在另一條鏈上的互補(bǔ)鏈。"核酸"或"多核苷酸"指單鏈或雙鏈的DNA或RNA聚合物(或者在一些情況中為脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的類似物，例如硫代磷酸酯或PNA類似物，或具有核苷酸堿基的衍生物的核苷酸)并包括染色體DNA、自我復(fù)制的質(zhì)粒、DNA或RNA(或類似物)的感染性聚合物和起一級(jí)結(jié)構(gòu)作用的DNA或RNA(或類似物)。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸序列"常?？膳c"多核苷酸"互換，但有時(shí)可以指分子的序列信息，而不是指分子本身。"啟動(dòng)子"定義為引導(dǎo)有效連接的核酸轉(zhuǎn)錄的一組核酸控制序列。如本文所用的，"植物啟動(dòng)子"是在植物中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶n型啟動(dòng)子的情形中，為T(mén)ATA元件。啟動(dòng)子還任選包括遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或抑制元件(repressorelement)，其可位于離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)千個(gè)堿基對(duì)之多處。"組成型"啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子。"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)"有效連接的"指核酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子，或一組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))和另一核酸序列之間的功能性連接，其中所述表達(dá)控制序列引導(dǎo)對(duì)應(yīng)所述的另一序列的核酸的轉(zhuǎn)錄。"表達(dá)盒"包括三個(gè)主要元件i)啟動(dòng)子；ii)另一多核苷酸，其可以稱作"編碼多核苷酸"或"編碼序列"，所述多核苷酸有效連接至所述啟動(dòng)子并且在表達(dá)盒導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)它的轉(zhuǎn)錄由所述啟動(dòng)子引導(dǎo)；以及iii)終止子多核苷酸，其引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄停止并直接位于所述另一多核苷酸的下游。術(shù)語(yǔ)"植林"包括整個(gè)植物、植物器官(例如葉、莖、花、根等)、種子和植物細(xì)胞及它們的后代?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物類型通常是可接受轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物類型范圍，包括被子植物(單子葉植物和雙子葉植物)以及棵子植物。它包括多種多倍性程度的植物，包括多倍體、二倍體和單倍體。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，優(yōu)選所述植物是雌雄同株植物。如果多核苷酸具有不同的序列并源自外來(lái)種，或者如果來(lái)自相同種則是從它原始形式修飾產(chǎn)生的，則所述多核苷酸是與有機(jī)體或另一多核苷酸"異源的"。例如，有效連接至啟動(dòng)子的異源編碼序列指來(lái)自與該啟動(dòng)子源自的種不同的種的編碼序列，或者如果來(lái)自相同種，則指與任何天然存在的等位基因變體不同的編碼序列。對(duì)單獨(dú)抹"外源性的"多核苷酸是通過(guò)除有性雜交外的任何手段導(dǎo)入所述植物體中的多核苷酸。通過(guò)其可以實(shí)現(xiàn)外源性多核苷酸導(dǎo)入的方法的實(shí)例在下面描述，并且包括農(nóng)桿菌(Agrobacterium)-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍方法、電穿孔等。這種含有外源性核酸的植物在這里稱作Rl代轉(zhuǎn)基因植物。由有性雜交或通過(guò)自交產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物是這種植物的后代。用于本發(fā)明的""r^核酸"或"""Z多核苷酸序列"是核酸的子序列或該核酸的全長(zhǎng)多核苷酸序列，所述核酸編碼參與控制減數(shù)分裂的多肽并且其在突變時(shí)使得能發(fā)生關(guān)于未減數(shù)雌配子體形成的無(wú)融合生殖。""J^"基因"包含ZM/核酸以及一起的供"w"基因產(chǎn)物在宿主細(xì)胞(優(yōu)選植物)中表達(dá)的啟動(dòng)子以及其它轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列?；蚴且活惍a(chǎn)生包含蛋白質(zhì)編碼部分的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的植物基因并且已經(jīng)在水稻(GenbankID:62733414)和其它植物中鑒定，所述的蛋白質(zhì)編碼部分編碼的多肽與擬南芥"^"基因(SEQIDN0:1)編碼的多肽具有基本的序列同一性。"M"基因也已經(jīng)在毛果楊和玉米中鑒定(實(shí)施例9)。"^"基因在野生型擬南芥中以單拷貝存在。而且，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的豐度非常低，因?yàn)樗辉阪吣讣?xì)胞中表達(dá)，所述孢母細(xì)胞在生殖組織中構(gòu)成非常小的細(xì)胞群。以前已顯示擬南芥"r^基因在減數(shù)分裂的染色體組建中起關(guān)鍵作用(AgasheB.，PrasadC.K.，andSiddiqiI.，DevelopmentVol.129(16):3935-39432002)。因此，它的這種作用極可能在其它植物種中觀察到，正如在水稻中存在密切相關(guān)的基因所表明的。本申請(qǐng)中的數(shù)據(jù)確定Boechera也具有在序列上與所述擬南芥ZMZ基因密切相關(guān)的"M"基因。在轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和內(nèi)源基因的抑制(例如，通過(guò)RNA干擾、反義或有義抑制)這兩種情形中，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，使用的多核苷酸序列不需要與其源自的基因序列或待抑制的多核苷酸序列一致，而是可以僅"基本上一致，，。如下文中說(shuō)明的，這些基本上一致的變體特別是由術(shù)語(yǔ)"7J"核酸所涵蓋。在其中多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生功能性多肽的情形中，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，由于密碼子簡(jiǎn)并性許多多核苷酸序列將編碼相同的多肽。這些變體特別是由術(shù)語(yǔ)""r^核酸"所涵蓋。另外，該術(shù)語(yǔ)特別是包括與本文公開(kāi)的多核苷酸序列基本一致(根據(jù)下面描述測(cè)定)的那些序列以及編碼是野生型多肽的突變體或保持了所述"M"多肽的功能的多肽(例如，保守置換"M"多肽中的氨基酸而產(chǎn)生)的那些序列。而且，變體可以是編碼如下描述的顯性負(fù)性突變體以及導(dǎo)致過(guò)早轉(zhuǎn)錄終止的無(wú)義突變體或移碼突變體的那些序列。如果兩個(gè)核酸或多肽分子中的核苷酸序列或氨基酸殘基序列分別在如下描述進(jìn)行比對(duì)獲取最大對(duì)應(yīng)性時(shí)是相同的，則這兩種核酸或多肽稱為是"一致的"。在兩個(gè)或多個(gè)核酸或多肽序列的情況下，術(shù)語(yǔ)"一致的"或"百分比一致性"指在比較窗口比較和比對(duì)獲取最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，為相同的或具有指定百分比的氨基酸殘基或相同核苷酸的兩個(gè)或多個(gè)序列或子序列，所述的最大對(duì)應(yīng)性是用一種下列的序列比較算法或者通過(guò)手動(dòng)比對(duì)和目測(cè)來(lái)測(cè)量。當(dāng)序列一致性百分比用于指蛋白質(zhì)或肽時(shí)，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，不一致的殘基位置通常因?yàn)楸Ｊ匦园被嶂脫Q而不同，其中氨基酸殘基置換成了具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基并因而沒(méi)有改變?cè)摲肿拥墓δ苄再|(zhì)。如果序列因保守置換而不同，則可以上調(diào)百分比序列一致性來(lái)校正取代的保守性性質(zhì)。用于進(jìn)行這種調(diào)整的方法是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的。通常，，這涉及將保守置換打分為部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配，從而增加了百分比序列一致性。因此，例如，如果一致的氨基酸的打分為l，而非保守置換的打分為0,則保守置換的打分在0和l之間。保守置換的打分可4艮據(jù)(例如)Meyers&Miller的算法(ComputerApplic.Biol.Sci.4:11-17(1988)),例如才艮據(jù)在程序PC/GENE(Intelligenetics，MountainView,Calif.，USA)中實(shí)現(xiàn)的該算法來(lái)計(jì)算。在兩個(gè)核酸或多肽的情形中，短語(yǔ)"基本一致的，，指利用其中一種下列的序列比較算法或者通過(guò)手動(dòng)比對(duì)和目測(cè)測(cè)量，在比較窗口比對(duì)獲取最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，具有至少60°/。，優(yōu)選80%,最優(yōu)選90-95%的核苷酸或氨基酸殘基一致性的序列或子序列。該定義也指測(cè)試序列的互補(bǔ)序列，所述的互補(bǔ)序列在所述測(cè)試序列與參考序列具有基本一致性時(shí)具有基本的序列互補(bǔ)性或子序列互補(bǔ)性。對(duì)于序列比較，通常將一個(gè)序列用作測(cè)試序列與其比較的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試序列和參考序列輸入電腦中，指定子序列坐標(biāo)，并且如果需要，指定序列算法程序參數(shù)。通常使用程序參數(shù)的默認(rèn)值，但可以指定參數(shù)的備選值。然后基于程序參數(shù)，序列比較算法計(jì)算出測(cè)試序列相對(duì)參考序列的百分比序列一致性。如本文使用的，"比較窗口"包括對(duì)連續(xù)位置的片段，通常為20-600，通常約50至約200，更常見(jiàn)約100至約150個(gè)連續(xù)位置的指代，在所述的連續(xù)位置中在兩個(gè)序列經(jīng)最佳比對(duì)后，一個(gè)序列可以與相同數(shù)量的連續(xù)位置的參考序列進(jìn)行比較。用于比較的序列的比對(duì)方法是本領(lǐng)域所熟知的。用于比較的序列的最佳比對(duì)可以例如通過(guò)以下方法進(jìn)4亍Smith&Waterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981))的局部同源性算法、Needleman&Wunsch(J.Mol.Biol.48:443(1970))的同源性比對(duì)算法、Pearson&Lipman(Pro"Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988))的相似性搜索方法、這些算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(GAP、BESTFIT、FASTA以及WisconsinGenetics軟件包中的TFASTA(GeneticsComputerGroup、575ScienceDr.,Madison,Wis.))或手動(dòng)比對(duì)和目測(cè)?？捎玫乃惴ǖ囊粋€(gè)實(shí)例是PILEUP。PILEUP用漸進(jìn)成對(duì)比對(duì)(progressivepairwisealignment)來(lái)產(chǎn)生相關(guān)序歹'J組的多序歹寸比對(duì)，以便顯示關(guān)系和百分比序列一致性。它還繪制了顯示聚類關(guān)系的關(guān)系樹(shù)或樹(shù)狀圖，用于產(chǎn)生比對(duì)。PILEUP釆用了對(duì)FengD.F.，&Doolittle，R.F.，J.Mol.Evol.Vol.35:351-360(1987)的漸進(jìn)比對(duì)法的簡(jiǎn)化。使用的方法類似于Higgins&Sharp,CABIOS5:151-153(1989)描述的方法。該程序可以比對(duì)最多300個(gè)序列，每個(gè)序列的最大長(zhǎng)度為5，000個(gè)核苷酸或氨基酸。多序列比對(duì)方法起始于兩個(gè)最相似序列的成對(duì)序列比對(duì)，產(chǎn)生了兩個(gè)比對(duì)序列的簇。然后將該簇與下一個(gè)最相關(guān)的序列或比對(duì)序列簇進(jìn)行比對(duì)。兩個(gè)序列簇通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立序列的成對(duì)序列比對(duì)的簡(jiǎn)單延伸來(lái)進(jìn)行比對(duì)。最終的比對(duì)通過(guò)一系列的漸進(jìn)成對(duì)比對(duì)完成。該程序通過(guò)指定具體序列及它們序列比較區(qū)域的氨基酸或核苷酸坐標(biāo)以及通過(guò)指定程序參數(shù)來(lái)運(yùn)行。例如，可以使用以下參數(shù)默認(rèn)的空位權(quán)重(gapweight)(3.00)、默認(rèn)的空位長(zhǎng)度權(quán)重(gaplengthweight)(0.10)和加權(quán)的末端空位(weightedendgap)，將參考序列與其它測(cè)試序列比較以便測(cè)定百分比序列一致性關(guān)系。適用于測(cè)定百分比序列一致性和序列相似性的算法的另一個(gè)實(shí)例是BLAST算法，其在AltschulS.F.等，J.Mol.Biol.Vol.215:403-410(1990)中有所描述。用于實(shí)施BLAST分析的軟件是可通過(guò)NationalCenterforBiotechnologyInformation(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)/〉開(kāi)獲得的。該算法涉及首先通過(guò)確定查詢序列中的長(zhǎng)度為W的短字串(word)來(lái)確定高得分序列對(duì)(HSP,highscoringsequencepair)，所述查詢序歹'J的長(zhǎng)度W的短字串在與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字串比對(duì)時(shí)匹配或滿足一些為正值的得分閾值T。T稱為鄰近字串(neighborhoodword)得分閥值(AltschulS.F.等，LMol,Biol.Vol.215:403-410(1990))。將這些初始的命中鄰近字串(neighborhoodwordhit)作為種子用于起始搜索以找到含有它們的更長(zhǎng)HSP。將命中字串(wordhit)沿著每個(gè)序列的兩個(gè)方向延伸直到累積的比對(duì)打分不可以增加。在下列情況下停止命中字串在每個(gè)方向上的延伸累積的比對(duì)打分從它的最大獲得值下降了數(shù)量X;累積打分由于一次或多次負(fù)得分殘基比對(duì)的累積而成為0或低于0;或者到達(dá)了任一序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X決定了比對(duì)的敏感性和速度。所述BLAST程序以默認(rèn)設(shè)置使用字串長(zhǎng)度(W)為11、BLOSUM62打分矩陣(參見(jiàn)Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))比對(duì)(B)為50、期望值(E)為10、M=5,N--4以及兩條鏈都比較。BLAST算法也進(jìn)行兩個(gè)序列之間的相似性的統(tǒng)計(jì)分析(參見(jiàn)，例如Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一種相似性測(cè)量是最小加和概率(smallestsumprobability)(P(N))，其提供了有關(guān)兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間的匹配將偶然發(fā)生的可能性的指示。例如，如果在測(cè)試核酸與參考核酸的比較中最小加和概率小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，并且最優(yōu)選小于約0.001，則認(rèn)為該核酸與參考序列相似。"經(jīng)保守修飾的變體"適用于氨基酸和核酸序列兩者。對(duì)于特殊的核酸序列，經(jīng)保守修飾的變體指編碼相同的或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者如果核酸不編碼氨基酸序列，則指基本上一致的序列。由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，大量的功能相同的核酸編碼任意給定的蛋白質(zhì)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每個(gè)丙氨酸由一個(gè)密碼子確定的位置處，可將該密碼子改變成任意描述的相應(yīng)密碼子而不會(huì)改變編碼的多肽。這種核酸變異是"沉默變異"，其為經(jīng)保守修飾的變異的一種。這里的編碼多肽的每種核酸序列也描述了該核酸的每種可能的沉默變異。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以修飾核酸中的每個(gè)密碼子(除了AUG，其通常為甲硫氨酸的唯一密碼子)來(lái)產(chǎn)生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每種沉默變異在每種描述的序列中是隱含的。"基本一致的序列"，是指其中序列的改變沒(méi)有影響分子的期望功能的序列。對(duì)于氨基酸序列，技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，對(duì)核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列的單獨(dú)的取代、刪減或添加(其改變、添加或刪減了編碼序列中的單個(gè)氨基酸或小比例的氨基酸)在該改變導(dǎo)致氨基酸由化學(xué)相似的氨基酸置換時(shí)是"經(jīng)保守修飾的變異"。提供功能相似的氨基酸的保守置換表是本領(lǐng)域所熟知的。下面的6組每組包含為相互保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。(參見(jiàn)，例如Creighton，Proteins(1984))。兩個(gè)核酸序列或多肽基本上一致的指示是由第一核酸編碼的多肽可與產(chǎn)生對(duì)抗由第二核酸編碼的多肽的抗體發(fā)生免疫雜交反應(yīng)。因而，例如，如果兩個(gè)肽僅因保守置換而不同，則所述的一個(gè)多肽通常與另一個(gè)多肽基本一致。兩個(gè)核酸序列基本一致的另一指示是兩個(gè)分子或它們的互補(bǔ)序列在如下描述的嚴(yán)格條件下互相雜交。短語(yǔ)"選擇性(或特異性)雜交"指當(dāng)核苷酸序列存在于復(fù)雜混合物(例如，整個(gè)細(xì)胞或文庫(kù)DNA或RNA)中時(shí)，在嚴(yán)格雜交條件下分子僅與特定的核苷酸序列結(jié)合、形成雙鏈體或雜交。短語(yǔ)"嚴(yán)格雜交條件"指這樣一種條件在該條件下探針將與其靶子序列雜交，通常是與核酸的復(fù)雜混合物中的靶序列雜交，但是不與其它序列雜交。嚴(yán)格條件是序列-依賴性的，并且在不同的環(huán)境下將會(huì)不同。更長(zhǎng)的序列在更高的溫度下特異性雜交。對(duì)核酸雜交的廣泛指導(dǎo)在Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—-HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"Elsevier(1993)中找到。通常，在確定的離子強(qiáng)度pH下，選擇嚴(yán)格條件為比特定序列的熱解鏈溫度(Tra)約低5-10匸。低嚴(yán)格條件通常選擇為低于TL約15-30X:。L指這樣的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)在該溫度下，平衡時(shí)，50%的與靶標(biāo)互補(bǔ)的探針與靶序列雜交(在靶序列過(guò)量存在時(shí)，在L下，平衡時(shí)50%的探針被占據(jù))。嚴(yán)格條件是其中鹽濃度低于約1.0M鈉離子，通常約0.01-1.OM鈉離子濃度(或其它鹽)，pH為7.0-8.3，并且對(duì)于短的探針(例如10-50個(gè)核苷酸)溫度至少約30X:，而對(duì)于長(zhǎng)的探針(例如大于50個(gè)核苷酸)溫度至少約60x:的那些條件。嚴(yán)格條件也可以通過(guò)加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)是背景的至少2倍，優(yōu)選是背景雜交的10倍。如果它們編碼的多肽是基本一致的，則在嚴(yán)格條件下不互相雜交的核酸仍然是基本一致的。例如，當(dāng)核酸的一個(gè)拷貝用遺傳密碼允許的最大密碼子簡(jiǎn)并產(chǎn)生時(shí)出現(xiàn)這種情況。在這種情形中，核酸通常在中度嚴(yán)格雜交條件下雜交。在本發(fā)明中，包含用于本發(fā)明的"M"核酸的基因組DNA或cDNA可以在嚴(yán)格條件下，用在這里公開(kāi)的核酸序列在標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡中確定。為了本公開(kāi)內(nèi)容的目的，用于該雜交的合適的嚴(yán)格條件是包括下列情況的那些條件或等效的條件在37C下于40%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS的緩沖液中雜交，以及在至少約50匸，優(yōu)選約高達(dá)約60。C的溫度下，在0.1x至1xSSC，優(yōu)選0.5xSSC，更優(yōu)選0.2xSSC中至少洗滌一次，洗滌20分鐘。陽(yáng)性雜交是背景的至少2倍。一般技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，可以利用備選的雜交和洗滌條件來(lái)提供類似的嚴(yán)格性。兩個(gè)多聚核苷酸基本一致的另一個(gè)指示是，由一對(duì)寡核苷酸引物對(duì)擴(kuò)增的參考序列是否隨后可在嚴(yán)格雜交條件下用作探針來(lái)從cDM或基因組文庫(kù)中分離出測(cè)試序列，或在例如RM印跡或DNA印跡中確定測(cè)試序列。"植物雜種"定義為通過(guò)使相同植物種的兩個(gè)品種雜交而獲得的植物。"種間雜種"定義為通過(guò)雜交不同種的兩種植物獲得的植物。生殖事件中的"母本"定義為具有種子的植林。本發(fā)明提供了基因及其產(chǎn)物以及涉及應(yīng)用分子遺傳方法來(lái)控制種子發(fā)育和無(wú)融合生殖的方法。本發(fā)明還涉及"^"基因的突變體等位基因，所述突變體等位基因表達(dá)缺失了天然蛋白質(zhì)C-端部分的截短形式的"Mi7多肽，并導(dǎo)致未減數(shù)雌配子體的發(fā)育而同時(shí)保持了花粉發(fā)育基本不變，這可通過(guò)花粉活力檢測(cè)和雄性減數(shù)分裂中的染色體分離的顯微鏡檢查確定。本發(fā)明也涉及"W"基因的雌性特異性突變體等位基因的核苷酸序列，所述雌性特異性突變體等位基因編碼缺失天然/MZ多肽C-端部分的"M"多肽，并使得植物中該突變多肽的表達(dá)特異性地導(dǎo)致未減數(shù)雌配子體的發(fā)育但基本不影響花粉發(fā)育。這種突變體等位基因?qū)⒈磉_(dá)這樣的"r^多肽，例如在擬南芥的突變體等位基因的情形中，該多肽缺失了全部或部分的在SEQIDNO:5中的氨基酸509和氨基酸639之間的天然多肽序列部分，但確實(shí)含有編碼最多至氨基酸394的多肽序列的所有區(qū)域。此外，本發(fā)明還提供了這樣的核苷酸序列其在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO:4中給出的序列雜交并編碼天然"F^多肽的C-端缺失型衍生物，其中所述缺失部分對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:5中氨基酸509和639之間的區(qū)域，這通過(guò)利用比較窗口與SEQIDN0:5比較測(cè)定。Boechera、水稻和楊樹(shù)的"W"蛋白的對(duì)應(yīng)部分可以結(jié)合圖11確定。本發(fā)明的組合物還包括天然"M/7多肽序列的C-端缺失型衍生物，以及由上述/W"多肽序列和蛋白質(zhì)序列(例如糖皮質(zhì)激素受體蛋白)形成的融合蛋白和編碼它們的核酸，所述蛋白質(zhì)序列條件性地運(yùn)送該融合蛋白至植物細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。本發(fā)明的方法包括在植物中表達(dá)多核苷酸序列以產(chǎn)生保留了母體基因型的未減數(shù)雌配子。這種未減數(shù)雌配子的產(chǎn)生可用于設(shè)計(jì)無(wú)融合生殖和固定雜種優(yōu)勢(shì)，以及用于產(chǎn)生三倍體植物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，"M"多肽序列可以通過(guò)任意幾種熟知的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入植物的基因組中，其中所述"M/多肽序列在所述植物中表達(dá)為反義RNA或雙鏈RNA，從而導(dǎo)致對(duì)內(nèi)源"r^7基因的抑制并導(dǎo)致未減數(shù)雌配子的產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將C-端缺失的"W"多核體的形成，而同時(shí)保持花粉的發(fā)育基本不受影響。導(dǎo)致未減數(shù)雌配子體形成的多核苷酸序列在植物中的表達(dá)可隨后用于通過(guò)卵細(xì)胞孤雌發(fā)育成胚來(lái)產(chǎn)生無(wú)融合種子。這種"^"多核苷酸序列在植物雜種中的表達(dá)導(dǎo)致未減數(shù)雌配子的形成，該未減數(shù)雌配子保留了母體的基因型從而導(dǎo)致在下一世代中固定了雜種優(yōu)勢(shì)。雜種優(yōu)勢(shì)的固定是非常有用的，因?yàn)樗鼘⑹沟媚芡ㄟ^(guò)自交而不必借助于不同基因型的兩種親本品種之間的雜交來(lái)進(jìn)行雜種種子的繁殖。本發(fā)明還有另一個(gè)實(shí)施方案是導(dǎo)致未減數(shù)雌配子形成的多核苷酸序列在植物種的種間雜種中的表達(dá)，其可用于產(chǎn)生無(wú)融合種子。這種無(wú)融合種子的產(chǎn)生可用于將一種植物種的農(nóng)藝學(xué)上有用的基因滲入進(jìn)另一物種中。然而，本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案涉及"M"多核苷酸序列或"W"多肽序列的條件性表達(dá)或可控表達(dá)和/或其活性。這種條件性表達(dá)可用于促進(jìn)未減數(shù)雌配子的產(chǎn)生并從而促進(jìn)無(wú)融合種子的產(chǎn)生(僅在需要時(shí))。用于影響多核苷酸序列和多肽序列在植物中的條件性表達(dá)或活性的方法是本領(lǐng)域中熟知的，并且包括(但不限于)乙醇可誘導(dǎo)的基因表達(dá)(Devaux等，PlantJ.,Vol.36(6):918-930,2003)、類固醇激素可誘導(dǎo)的活性控制(SchenaM.，LloydA.M.和DavisR.W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.88(23):10421-10425，1991)以及四環(huán)素介導(dǎo)的表達(dá)控制(BohnerS.等,PlantJ.Vol.9(1):87-95，1999)。下面的實(shí)施例6描述了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，其中可以開(kāi)發(fā)出顯示d7ad突變表型的純系的植物群體。所述植物群體可以通過(guò)采用條件性RNAi或反義來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述RMi或反義構(gòu)建體在條件性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)表現(xiàn)形式是這樣一種形式其中將"""基因的互補(bǔ)拷貝在d7ad突變體等位基因是純合的遺傳背景中，在條件性啟動(dòng)子的控制下在植物中表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)表現(xiàn)形式將采用第一種植物與表達(dá)反式激活因子的第二種植物雜交，所述第一種植物攜帶有在啟動(dòng)子的控制下表達(dá)的RNAi或反義構(gòu)建體，所述啟動(dòng)子在所述反式激活因子的控制下表達(dá)，并且其中所述第一種植物缺少所述反式激活因子。如本文描述制備的分離的序列可用于許多技術(shù)中，例如用于抑制或改變內(nèi)源性"M"基因的表達(dá)。植物中/M"基因表達(dá)或Z7M/活性的調(diào)節(jié)是特別有用的，例如作為產(chǎn)生無(wú)融合種子的系統(tǒng)的部分。/7/^/核酸的分離一般而言，在下面描述的重組DNA技術(shù)中的術(shù)語(yǔ)和實(shí)驗(yàn)室方法是本領(lǐng)域所熟知且通常采用的那些。將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于克隆、DM和RNA分離、擴(kuò)增和純化。通常，涉及DNA連接酶、DM聚合酶、限制性內(nèi)切酶等的酶促反應(yīng)按照產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。這些技術(shù)和多種其它技術(shù)通常根據(jù)Sambrook等的MolecularCloning—ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.，(1989)進(jìn)行。ZMZ核酸的分離可以通過(guò)許多技術(shù)完成。例如，可將基于在此公開(kāi)的序列的寡核苷酸探針用于在cDNA或基因組DM文庫(kù)中鑒定所需基因。為了構(gòu)建基因組文庫(kù)，基因組DNA的大片段通過(guò)隨機(jī)產(chǎn)生斷裂而產(chǎn)生，例如用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生，并將所述片段與載體DM連接以形成可以包裝成合適載體的連環(huán)體。為了制備cDNA文庫(kù)，將mRNA從理想的器官(例如胚珠)分離，并用所述mRNA制備含有"W"基因轉(zhuǎn)錄物的cDNA文庫(kù)。備選地，cDNA可以由從"M"基因或同系物在其中表達(dá)的其它組織提取的mRNA制備。然后可以用基于在這里公開(kāi)的克隆基因的序列的探針篩選該cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)。探針可用于與基因組DNA或cDNA序列雜交以分離出相同或不同植物種中的同源基因。備選地，可以將產(chǎn)生對(duì)抗/7^多肽的抗體用于篩選mRNA表達(dá)文庫(kù)。備選地，可以用擴(kuò)增技術(shù)從核酸樣本擴(kuò)增所關(guān)注的核酸。例如，可將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)用于直接從基因組DM、cDM、基因組文庫(kù)或cDNA文庫(kù)擴(kuò)增"r^7基因的序列。PCR和其它體外擴(kuò)增方法也可用于(例如)克隆編碼待表達(dá)蛋白質(zhì)的核酸序列、用于制備核酸以用作探針用于檢測(cè)樣品中所需mRNA的存在、用于核酸測(cè)序或用于其它目的。對(duì)于PCR的綜述，參見(jiàn)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications.(Innis，M，Gelfand，D.，Sninsky，J.和White,T.,eds.)，AcademicPress,SanDiego(1990)。用于鑒定植物組織的序列的合適引物和探針通過(guò)將在這里提供的序列與其它相關(guān)基因或它們編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較而產(chǎn)生。例如，可以將Boecheraholboelli"W"與來(lái)自水稻的密切相關(guān)的基因(GenbankIDNo.50917243)進(jìn)行比較。利用這些技術(shù)，技術(shù)人員可以確定在這里公開(kāi)的基因或多肽中的保守區(qū)域以便制備合適的引物和探針序列。與"M"相關(guān)基因的保守區(qū)域特異性雜交的引物可用于擴(kuò)增來(lái)自差異大的植物種的序列。然后可將使用上面所公開(kāi)的條件的標(biāo)準(zhǔn)核酸雜交技術(shù)用于確定全長(zhǎng)的cDM或基因克隆。"W"活性或基因表達(dá)的控制由于基因涉及控制減數(shù)分裂和雌配子體的倍性，抑制內(nèi)源zr^活性或基因表達(dá)可用于許多方面。例如，通過(guò)利用攜帶有如上描述的C-端缺失的等位基因抑制表達(dá)或修飾"M/活性可用于產(chǎn)生沒(méi)有種子或具有小的/退化了的種子的果實(shí)(這里稱作"無(wú)籽果")。在多數(shù)植物種中，三倍體的產(chǎn)生導(dǎo)致生殖細(xì)胞的形成有缺陷(歸因于減數(shù)分裂中染色體的不平衡分離)并導(dǎo)致沒(méi)有種子或形成小的/退化了的種子。對(duì)內(nèi)源"""表達(dá)或活性的抑制可使得能控制倍性。因而，在其中zr^活性受到抑制或修飾的本發(fā)明植物的實(shí)施方案中，種子缺乏或退化而產(chǎn)生了無(wú)籽果。本發(fā)明的核酸的另一個(gè)用途是用于開(kāi)發(fā)無(wú)融合生殖的植物系(即，其中無(wú)性生殖過(guò)程在胚珠中發(fā)生的植物，對(duì)于無(wú)融合生殖的論述，參見(jiàn)Koltu應(yīng)A.，PlantCell,Vol.5:1425-1437(1993))。無(wú)融合生殖提供了一種選擇和固定不容易通過(guò)傳統(tǒng)育種來(lái)保持的復(fù)雜的雜合基因型的新手段。因而，例如，可以獲得并容易保持具有理想形狀(例如雜種優(yōu)勢(shì))的新的雜交系。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到許多方法可用于調(diào)節(jié)"M"活性或基因表達(dá)。可以在植物細(xì)胞中在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平或翻譯后水平上調(diào)節(jié)"M"活性。用于在每種這些水平上調(diào)節(jié)"M/活性的技術(shù)通常是技術(shù)人員所熟知的并且一些技術(shù)在下面筒要論迷。用于將遺傳突變導(dǎo)入植物基因中的方法是熟知的。例如，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用誘變化學(xué)物質(zhì)處理種子或其它植物材料。這樣的化學(xué)物質(zhì)包括(但不限于)下列物質(zhì)硫酸二乙酯、氮丙啶、甲基磺酸乙酯和N-亞硝基-N-乙脲。備選地，可以使用來(lái)自放射源例如X射線、Y射線或快中子的電離輻射。攜帶"W"序列突變的植物可以通過(guò)用PCR引物擴(kuò)增"W"核苷酸序列，之后分析PCR產(chǎn)物以鑒定具有ZK4i多核苷酸序列遺傳突變的植物來(lái)分子篩選經(jīng)誘變處理的收集的植物種群而鑒定。用于篩選和鑒定攜帶特異性基因序列突變的植物的方法已有所描述(HenikoffS.，BradleyT.J.和ComaiL，PlantPhysiol.Vol.135(2):630-636，2004)。備選地，同源重組可用于通過(guò)特異性刪減或改變/rj"基因來(lái)在體內(nèi)誘導(dǎo)靶基因分裂(通常，參見(jiàn)Grewal和Klar,Genetics146:1221-1238(1997)以及Xu等，GenesDev.10:2411-2422(1996))。同源重組已經(jīng)在植物中得到證實(shí)(Puchta等，Experientia50:277-284(1994)、Swoboda等，EMBOJ.13:484-489(1994)、Offringa等，Pro"Natl.Acad.Sci.USA90:7346-7350(1993)以及Kempin等，Nature389:802-803(1997))。在將同源重組技術(shù)應(yīng)用于本發(fā)明的基因中，"M"基因序列選擇部分(包括5'上游區(qū)、3'下游區(qū)和基因內(nèi)區(qū)段)中的突變(例如在這里公開(kāi)的那些突變)可在體外進(jìn)行并然后利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入所需植物中。由于已經(jīng)知道同源重組技術(shù)的效率取決于使用的載體，如Mountford等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:4303-4307(1994)，以及Vaulont等，TransgenicRes.4:247-255(1995)描述的雙順?lè)醋踊虬邢蜉d體的使用可便利地用于增加選擇改變的基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的效率。突變基因?qū)⒁赃@樣的方式與靶標(biāo)野生型基因相互作用，該方式使得將在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中發(fā)生野生型基因的同源重組和靶向置換，導(dǎo)致抑制ZWZ活性。備選地，可以4吏用由在末端具有雙發(fā)夾帽(doublehairpincap)的雙鏈體構(gòu)象的一段連續(xù)的RNA和DNA殘基組成的寡核苷酸。將變化。染色體外的T-DNA質(zhì)粒上的嵌合寡核苷酸的導(dǎo)入導(dǎo)致少量轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中由嵌合分子引導(dǎo)的有效且特異性的"W"基因轉(zhuǎn)換。這種方法在Cole—Strauss等，Science273:1386—1389(1996)和Yoon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:2071—2076(1996)中描述?；虮磉_(dá)可用重組DNA技術(shù)，通過(guò)用含有轉(zhuǎn)座子或T-DNA序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞來(lái)失活。通過(guò)這些方法制備的突變體可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定。例如，突變體可以通過(guò)PCR檢測(cè)或者通過(guò)(例如)RM印跡或反轉(zhuǎn)錄，之后通過(guò)PCR(RT-PCR)檢測(cè)mRNA的存在或缺失而得以檢測(cè)。也可以通過(guò)篩選生殖力、雌性減數(shù)分裂和大孢子發(fā)育的改變來(lái)選擇突變體。如本文描述制備的分離的核酸序列還可以用于許多技術(shù)中以在多種水平上控制內(nèi)源"K4"基因的表達(dá)。來(lái)自在此公開(kāi)的序列的子序列可用于控制轉(zhuǎn)錄、RNA積聚、翻譯等。許多方法可用于抑制植物中的基因表達(dá)。例如，可以便利地使用RNA干擾(RNAi)技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，將來(lái)自所需基因的核酸片段克隆為反向重復(fù)序列，其中兩個(gè)拷貝由通常為5至2000個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選為30至500個(gè)核苷酸并且更優(yōu)選為50至200個(gè)核苷酸的間隔序列隔開(kāi)。將所述反向重復(fù)序列有效地連接至啟動(dòng)子，之后有效連接至終止子，使得這兩個(gè)拷貝都將被轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生沿其長(zhǎng)度的全部或部分自我互補(bǔ)的RNA類型。然后將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)植物中并產(chǎn)生雙鏈RNA。作為另一個(gè)實(shí)例，反義技術(shù)可便利地用于抑制"M"基因的表達(dá)。為實(shí)現(xiàn)該目的，將來(lái)自所需基因的核酸片段克隆并有效地連接至啟動(dòng)子，使得將會(huì)轉(zhuǎn)錄RNA反義鏈。然后將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進(jìn)植物中并產(chǎn)生RNA反義鏈。在植物細(xì)胞中，據(jù)認(rèn)為反義抑制可以在所有水平的基因調(diào)節(jié)上起作用(包括RNA翻譯的抑制)(參見(jiàn)BourquePlantSci.(Limerick)105:125-149(1995)、PantopoulosInProgressinNucleicAcidResearchandMolecularBiology,Vol.48.Cohn,W.E.和K.Moldave(Ed.).AcademicPress,Inc.:SanDiego，Calif"USA、London,England,UK.p.181-238;Heiser等，PlantSci.(Shannon)127:61-69(1997))并且通過(guò)防止編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的mRNA積聚而發(fā)揮作用(參見(jiàn)，BaulcombePlantMol.Bio.32:79-88(1996);Prins和GoldbachArch.Virol.141:2259-2276(1996);Metzlaff等，Cell88:845-854(1997)，Sheehy等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:8805-8809(1988)以及Hiatt等，美國(guó)專利No.4，801，340)。待導(dǎo)入的核酸片段通常將與內(nèi)源"r^基因或待抑制的基因的至少一部分基本一致。然而，該序列不需要完全一致來(lái)抑制表達(dá)?？梢栽O(shè)計(jì)本發(fā)明的載體，使得抑制效果適用于顯示與靶基因同源或基本同源的基因家族中的其它基因。對(duì)于反義抑制，相對(duì)于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mRNA，所述的導(dǎo)入序列也不需要是全長(zhǎng)的。通常，較高同源性可用于補(bǔ)償較短序列的使用。此外，所述的導(dǎo)入序列不需要具有相同的內(nèi)含子或外顯子模式，并且非編碼片段的同源性可以同樣有效。通常，應(yīng)使用約30或40個(gè)核苷酸至約全長(zhǎng)的核苷酸之間的序列，但是優(yōu)選為至少約100個(gè)核苷酸的序列，更優(yōu)選為至少約200個(gè)核苷酸的序列，并且尤其優(yōu)選為約500至約1700個(gè)核苷酸的序列?？砂邢蛟S多基因區(qū)用以抑制"7J"基因的表達(dá)。乾標(biāo)可包括(例如)編碼區(qū)、內(nèi)含子、來(lái)自外顯子/內(nèi)含子接合處的序列、5'或3'非翻譯區(qū)等。在一些實(shí)施方案中，可以設(shè)計(jì)該構(gòu)建體以消除調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合至"M"基因序列的能力，所述的調(diào)節(jié)蛋白是"K4"基因序列的細(xì)胞特異性和/或組織特異性表達(dá)所需要的。這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列可以位于基因的5'-、3'-或編碼區(qū)內(nèi)并且可以促進(jìn)(正調(diào)節(jié)元件)或抑制(負(fù)調(diào)節(jié)元件)基因轉(zhuǎn)錄。這些序列可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)的缺失分析來(lái)確定。一旦該序列確定，將靶向這些序列的反義構(gòu)建體導(dǎo)入植物中以控制特定組織(例如發(fā)育中的胚珠和/或種子)中的基因轉(zhuǎn)錄。基于寡核苷酸的三螺旋形成可用于破壞"W"基因的表達(dá)。三鏈DNA可以抑制DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，產(chǎn)生位點(diǎn)特異性突變、分裂DNA并誘導(dǎo)同源重組(參見(jiàn)，例如Havre和GlazerJ.Virology67:7324-7331(1993);Scanlon等，F(xiàn)ASEBJ.9:1288-1296(1995);Giovannangeli等，Biochemistry35:10539-10548(1996);Chan和GlazerJ.Mol,Medicine(Berlin)75:267-282(1997))。三螺旋DNA可用于乾向確定用于反義調(diào)節(jié)的相同序列。催化性RNA分子或核酶也可以用于抑制"/^7基因的表達(dá)。有可能設(shè)計(jì)實(shí)際上與任何靶標(biāo)RNA特異性配對(duì)并在特定位置處切割磷酸二酯主鏈，從而在功能上使粑標(biāo)RNA失活的核酶。在實(shí)施這種切割時(shí)，所述核酶自身不受改變，并因而能夠回收利用并切割其它分子，使其成為真正的酶。在反義RNA中包含核酶序列在其上賦予了RNA切割活性，從而增加了該構(gòu)建體的活性。因而，核酶可用于靶向確定用于反義調(diào)節(jié)的相同序列。已經(jīng)鑒定了許多類型的核酶。一種類型的核酶源自植物中的許多能夠自我切割和復(fù)制的小環(huán)狀RM。所述RNA可單獨(dú)復(fù)制(類病毒RNA)或者與輔助病毒一起復(fù)制(衛(wèi)星RNA)。實(shí)例包括來(lái)自鱷梨日斑類病毒的RM、來(lái)自煙草環(huán)斑病毒、紫花苜蓿短暫條紋病毒、絨毛煙草斑駁病毒、茄屬植物斑駁病毒和地下三葉草斑駁病毒的衛(wèi)星RNA。靶標(biāo)RNA-特異性核酶的設(shè)計(jì)和使用在Zhao和Pick,Nature365:448-451(1993);Eastham和AhleringJ.Urology156:1186-1188(1996)、Sokol和Murray,TransgenicRes.5:363-371(1996)、Sun等，Mol.Biotechnology7:241-251(1997)和Haseloff等，Nature,334:585-591(1988)中有所描述。另一種抑制方法是正義共抑制(sensecosuppression)。以有義取向構(gòu)造的核酸的導(dǎo)入已顯示為一種通過(guò)其阻斷靶基因轉(zhuǎn)錄有效的手段。對(duì)于使用該方法來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)的實(shí)例，參見(jiàn)Assaad等，PlantMol.Bio.22:1067-1085(1993)、FlavellProc.Natl.Acad.Sci.USA91:3490-3496(1994)、Stam等，AnnalsBot.79:3-12(1997)、Napoli等，ThePlantCell2:279-289(1990)以及美國(guó)專利No.5,034,323、No.5，231，020、和No.5，283，184。如果導(dǎo)入序列本身不含有編碼序列，而僅含有內(nèi)含子或與內(nèi)源序列的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中存在的序列同源的非翻譯序列，則可能會(huì)發(fā)生抑制作用。導(dǎo)入序列通常將與想要抑制的內(nèi)源序列基本一致。這種最低限度的一致性通常將大于約65%,但更高的一致性可能起到更有效抑制內(nèi)源序列表達(dá)的作用。大于約80%的充分更高的一致性是優(yōu)選的，但是約95%至完全一致將是最優(yōu)選的。如同反義調(diào)節(jié)的情況一樣，這種作用應(yīng)該適用于顯示同源或基本同源的相似基因家族中的任何其它蛋白質(zhì)。對(duì)于正義抑制，相對(duì)于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或完全加工的mRM，所述的導(dǎo)入序列(要求低于絕對(duì)一致)也不需要是全長(zhǎng)的。這對(duì)于避免一些植物(過(guò)表達(dá)者)的同時(shí)產(chǎn)生來(lái)說(shuō)是優(yōu)選的。比全長(zhǎng)序列短的序列的較高一致性抵償了較長(zhǎng)的、較低一致性的序列。此外，導(dǎo)入序列不需要具有相同的內(nèi)含子或外顯子類型，并且非編碼片段的一致性將同樣有效。通常，使用上面提及的用于反義調(diào)節(jié)的尺寸范圍的序列。另外，可利用共抑制技術(shù)靶向關(guān)于反義調(diào)節(jié)而提及的相同的基因區(qū)域。備選地，消除DYAD細(xì)胞特異性基因表達(dá)所需的蛋白質(zhì)可調(diào)節(jié)DYAD活性。因而，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或控制DYAD基因表達(dá)的序列的表達(dá)可用這里描述的方法調(diào)節(jié)。另一種方法是使用設(shè)計(jì)的DYADmRNA翻譯的tRNA抑制。該方法涉及將抑制型tRNA用于反式激活含有提前終止密碼子的靶基因(參見(jiàn)Betzner等，PlantJ.11:587-595(1997)，以及Choisne等，PlantJ.11:597-604(1997))。首選產(chǎn)生含有組成型表達(dá)的DYAD基因的植物系，所述DYAD基因包琥珀終止密碼子。還產(chǎn)生了多個(gè)植物系，每個(gè)植物系含有在細(xì)胞型特異性啟動(dòng)子引導(dǎo)下的tRNA抑制基因構(gòu)建體。然后將該tRM基因構(gòu)建體雜交進(jìn)該系中以便以靶向的方式激活DYAD活性。這些tRNA抑制系也可以用于靼向相同細(xì)胞或組織類型的任何類型的基因的表達(dá)。顯性陰性形式的DYAD多肽的產(chǎn)生是抑制內(nèi)源DYAD活性的一種便利手段，所述DYAD多肽在它們結(jié)合至其它蛋白質(zhì)的能力方面是有缺陷的。該方法涉及用編碼突變體DYAD多肽的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植林，所述突變體DYAD多肽與內(nèi)源性蛋白質(zhì)形成缺陷型復(fù)合物并從而阻止該復(fù)合體正常形成。該突變體多肽通過(guò)氨基酸置換、添加、缺失等而在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平上與天然存在的序列不同。這些修飾可以以許多種組合使用以產(chǎn)生最終的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)鏈。將顯性陰性突變體用于使靶基因失活在Mizukami等，PlantCell8:831-845(1996)中有所描述。影響蛋白與自身或其它蛋白質(zhì)相互作用的能力的另一個(gè)策略涉及DYAD特異性抗體的使用。在這種方法中，將DYAD特異性抗體的細(xì)胞特異性表達(dá)用于通過(guò)抗體抗原識(shí)別來(lái)使功能性結(jié)構(gòu)域失活(參見(jiàn)，Hupp等，Cell83:237-245(1995))。本發(fā)明的核酸用于增強(qiáng)DYAD基因表達(dá)的用途如本文描述制備的分離的序列也可用于引入特定DYAD核酸的表達(dá)以增強(qiáng)或增加內(nèi)源性基因的表達(dá)。增強(qiáng)表達(dá)也可用于(例如)通過(guò)防止植物結(jié)籽來(lái)增加營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。如果基因過(guò)表達(dá)是期望的，則可以將來(lái)自不同種的所需基因用于減小潛在的正義抑制作用。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，由本發(fā)明基因編碼的多肽，與其它蛋白質(zhì)一樣，具有行使不同功能的不同結(jié)構(gòu)域。因而，所迷基因序列不需要是全長(zhǎng)的，只要能表達(dá)所述蛋白質(zhì)的所需功能性結(jié)構(gòu)域。經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)鏈也容易用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的和在下面詳細(xì)描述的多種重組DNA技術(shù)設(shè)計(jì)。例如，所述鏈可以通過(guò)氨基酸置換、添加、缺失等而在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平上與天然存在的序列不同。這些修飾可以以許多種組合使用以產(chǎn)生最終的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)鏈。重組載體的制備為了在上述技術(shù)中使用分離的序列，制備了適用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重組DNA載體。用于轉(zhuǎn)化各種種類的高等植物種的技術(shù)是熟知的并且在科技文獻(xiàn)中有描述。參見(jiàn)，例如Weising等，Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)。編碼所需多肽的DNA序列(例如編碼全長(zhǎng)蛋白質(zhì)或iM"與細(xì)胞內(nèi)定位序列的融合蛋白或截短的"M/蛋白的cMA序列)將優(yōu)選與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)節(jié)序列組合，所述調(diào)節(jié)序列將在轉(zhuǎn)化植物的期望組織中引導(dǎo)序列從基因轉(zhuǎn)錄。例如，對(duì)于過(guò)表達(dá)，可以采用將引導(dǎo)基因在再生植林的所有組織中表達(dá)的植物啟動(dòng)子片段。這種啟動(dòng)子在本文中稱為"組成型"啟動(dòng)子并且在大多數(shù)環(huán)境條件下和發(fā)育階段或細(xì)胞分化階段是有活性的。組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。l'-或2'-啟動(dòng)子源于根癌農(nóng)桿菌的T-DNA，并且來(lái)自多種植物基因的其它轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域是技術(shù)人員已知的。這樣的基因包括(例如)來(lái)自擬南芥的ACTll(Huang等，PlantMol.Biol.33:125-139(1996))、來(lái)自擬南芥的Cat3(GenBankNo，U43147,Zhong等，Mol.Gen.Genet.251:196-203(1996))、來(lái)自甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)的編碼硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶的基因(GenbankNo.X74782,Solo函be等，PlantPhysiol.104:1167-1176(1994))、來(lái)自玉米的GPcl(GenBankNo.X15596,Martinez等，J.Mol.Biol208:551—565(1989)),以及來(lái)自玉米的Gpc2(GenBankNo.U45855,Manjunath等,PlantMol.Biol.33:97-112(1997))。備選地，所述植物啟動(dòng)子可引導(dǎo)ZK^核酸在特定組織中的表達(dá)或者可能另外處于在更精確的環(huán)境或發(fā)育調(diào)控?？赏ㄟ^(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括缺氧條件、溫度升高或存在光照。這樣的啟動(dòng)子在這里稱作"誘導(dǎo)型"啟動(dòng)子或"組織特異性"啟動(dòng)子。術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，組織特異性啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)有效連接的序列在除靼組織之外的組織中表達(dá)。因而，如本文使用的，組織特異性啟動(dòng)子是這樣一種啟動(dòng)子，其優(yōu)先在靶組織中驅(qū)動(dòng)表達(dá)，但是也可以導(dǎo)致在其它組織中的一些表達(dá)。條件性表達(dá)、組織特異性表達(dá)或兩者的組合也可以通過(guò)用反式激活基因?qū)崿F(xiàn)，其中可以將"W"核酸置于合成啟動(dòng)子的控制之下，該啟動(dòng)子通過(guò)異源的或合成的反式激活因子驅(qū)動(dòng)。反式酸的相應(yīng)表達(dá)。已經(jīng)在植物中使用的可反式激活的系統(tǒng)和可誘導(dǎo)的系統(tǒng)的實(shí)例包括mGal4:VP16/UAS、p0p/LhG4、GVE/VGE、GVG、p0p6/LhGR和XVE(在Moore等，ThePlantJournal45:651-683(2006)中綜述)。發(fā)育調(diào)控的啟動(dòng)子的實(shí)例包括只在(或者主要只在)某些組織，例如果實(shí)、種子或花中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。引導(dǎo)核酸在胚珠、花或種子中表達(dá)的啟動(dòng)子在本發(fā)明中是特別有用的。如本文使用的，種子特異性啟動(dòng)子是引導(dǎo)在種子組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以是(例如)胚珠特異性的(其包括引導(dǎo)在母體組織或雌配子體，例如卵細(xì)胞或中央細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子)、胚特異性的、胚乳特異性的、珠被特異性的或一些它們的組合。實(shí)例包括在Reiser等，Cell83:735-742(1995)中描述的來(lái)自胚珠特異性BEL1基因(GenBankNo.U39944)的啟動(dòng)子，以及來(lái)自雄性性母細(xì)胞特異性DUET基因的啟動(dòng)子(ReddyT.V.等，Development,Vol.130(24):5975-5987，2003)。其它合適的種子特異性啟動(dòng)子源自下列基因來(lái)自玉米的MAC1(Sheridan等，Genetics142:1009—1020(1996))、來(lái)自玉米的Cat3(GenBankNo.L05934,Abler等，PlantMol.Biol.22:10131-1038(1993))、來(lái)自玉米的編碼油質(zhì)蛋白18kD的基因(GenBankNo.J05212，Lee等，PlantMol.Biol.26:1981-1987(1994))、來(lái)自擬南芥的vpl基因(GenbankNo.U93215)、來(lái)自擬南芥的編碼油質(zhì)蛋白的基因(GenbankNo.Z17657)、來(lái)自擬南芥的Atmycl(Urao等，PlantMol.Biol.32:571-576(1996))、來(lái)自擬南芥的2S種子儲(chǔ)藏蛋白基因家族(Conceicao等，PlantJ.5:493-505(1994))、來(lái)自甘藍(lán)型油菜的編碼油質(zhì)蛋白20kD的基因(GenBankNo.M63985)、來(lái)自甘藍(lán)型油菜的napA(GenBankNo.J02798,Josefsson等，JBL26:12196-1301(1987)、來(lái)自甘藍(lán)型油菜的napin基因家族(Sjodahl等，Planta197:264-271(1995)、來(lái)自甘藍(lán)型油菜的編碼2S儲(chǔ)藏蛋白的基因(Dasgupta等，Gene133:301-302(1993))、來(lái)自大豆的編碼油質(zhì)蛋白A的基因(GenbankNo.U09118)和油質(zhì)蛋白B的基因(GenbankNo.,119)以及來(lái)自大豆的編碼低分子量富硫蛋白的基因(Choi等，Mol.Gen.，Genet.246:266-268(1995))。另外，在此公開(kāi)的/K4Z基因的啟動(dòng)子序列可用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的ZM"多核苷酸或異源序列的表達(dá)。如果期望正常的多肽表達(dá)，則應(yīng)包含位于編碼區(qū)的3'末端的多腺苷酸化區(qū)域。該多腺苷酸化區(qū)域可源自天然的基因、多種其它植物基因或T-DNA。包含來(lái)自本發(fā)明基因的序列(例如啟動(dòng)子或編碼區(qū)域)的栽體將通常包含賦予植物細(xì)胞可選擇的表型的標(biāo)記基因。例如，該標(biāo)記可編碼殺蟲(chóng)劑抗性(特別是抗生素抗性，例如卡那霉素抗性、G418、博來(lái)霉素抗性、潮霉素抗性)或者除草劑抗性，例如氯磺隆(chlorosulfuron)抗性或Basta抗性。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可通過(guò)多種常規(guī)技術(shù)導(dǎo)入所需植物宿主的基因組中。例如，DNA構(gòu)建體可以用諸如植物細(xì)胞原生質(zhì)的電穿孔和顯微注射之類的技術(shù)直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組DNA中，或者DNA構(gòu)建體可以用轟擊法例如DM粒子轟擊來(lái)直接導(dǎo)入進(jìn)植物組織中。顯微注射技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中有很好的描述。利用聚乙二醇沉淀導(dǎo)入DNA構(gòu)建體在Paszkowski等，EmboJ.3:2717-2722(1984)中描述。電穿孔技術(shù)在Fromm等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:5824(1985)中描述。轟擊轉(zhuǎn)化技術(shù)在Klein等，Nature327:70-73(1987)中描述。備選地，可以將DNA構(gòu)建體與合適的T-DNA旁側(cè)區(qū)結(jié)合并導(dǎo)入常規(guī)的根癌農(nóng)桿菌宿主載體中。在細(xì)胞受該細(xì)菌感染時(shí)，根癌農(nóng)桿菌宿主的致病功能將引導(dǎo)所述構(gòu)建體和鄰接的標(biāo)記插入該植物細(xì)胞的DNA中。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)(包括解毒和雙元載體的使用)在科學(xué)文獻(xiàn)中有很好的描述。參見(jiàn)，例如Horsch等，Science233:496-498(1984),以及Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci,USA80:4803(1983)?？膳囵B(yǎng)通過(guò)任意上述的轉(zhuǎn)化技術(shù)驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞以再生出完整的植林，所述植林具有轉(zhuǎn)化的基因型并因而具有理想的表型例如種子量增加。這種再生技術(shù)依賴于組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中的某些植物激素的使用，通常依賴于與所需核苷酸序列一起導(dǎo)入的殺蟲(chóng)劑和/或除草劑標(biāo)記。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體開(kāi)始的植物再生在Evans等，ProtoplastsIsolationandCulture,HandbookofPlantCellCulture,pp.124-176，MacMillilanPublishingCompany,NewYork,1983,以及Binding，RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,pp.21—73CRCPress,BocaRaton，1985中描述。也可以從植物愈傷組織、外植體、器官或其部分獲得再生。這樣的再生技術(shù)在Klee等，Ann.Rev.ofPlantPhys.38:467-486(1987)中有一般性描述。本發(fā)明的核酸可用于賦予基本上任何植物所需的性狀。因而，本發(fā)明使用了廣范圍的植物，包括來(lái)自下列屬的種檟如樹(shù)屬(Anacardium)、花生屬(Arachis)、天門(mén)冬屬(Asparagus)、顛癡屬(Atropa)、燕麥屬(Avena)、齊屬(Brassica)、柑桔屬(Citrus)、西瓜屬(Citrullus)、辣椒屬(Capsicum)、紅花屬(Carthamus)、椰子屬(Cocos)、咖啡屬(Coffea)、黃瓜屬(Cucumis)、南瓜屬(C畫(huà)rbita)、胡蘿卜屬(Daucus)、油棕屬(Elaeis)、草莓屬(Fragaria)、大豆屬(Glycine)、棉屬(Gossypium)、向曰葵屬(Helianthus)、Heterocal1is、大麥屬(Hordeum)、萊菪屬(Hyoscyamus)、萵苣屬(Uctuca)、亞麻屬(Lin認(rèn))、黑麥草屬(Lolium)、羽扇豆屬(Lupinus)、番癡屬(Lycopersicon)、蘋(píng)果屬(Malus)、木薯屬(Manihot)、Majorana、苜蓿屬(Medicago)、煙草屬(Nicotiana)、洋橄欖屬(Olea)、稻屬(Oryza)、黍?qū)?Panieum)、Pannesetum、鱘梨屬(Persea)、菜豆屬(Phaseolus)、黃連木屬(Pistachia)、豌豆屬(Pisum)、犁屬(Pyrus)、李屬(Prunus)、蘿卜屬(Raphanus)、蓖麻屬(Ricinus)、黑麥屬(Secale)、千里光屬(Senecio)、白芥屬(Sinapis)、癡屬(Solanum)、高粱屬(Sorghum)、Theobromus、胡蘆巴屬(Trigonella)、小麥屬(Triticum)、蠶豆屬(Vicia)、葡萄屬(Vitis)、缸豆屬(Vigna)和玉米屬(Zea)。技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在表達(dá)盒穩(wěn)定地整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物中并確認(rèn)為有效后，所述表達(dá)盒可以通過(guò)有性雜交來(lái)導(dǎo)入其它植物中?？梢允褂萌我獾脑S多標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)，這取決于待雜交的物種?？梢愿鶕?jù)熟知的方法分析從本發(fā)明植物獲得的種子以鑒定具有所需性狀的植林。如果將反義技術(shù)或其它技術(shù)用于控制"W"基因的表達(dá)，則可以將PT-PCR或RM印跡分析用于篩選所需植林。此外，可以檢測(cè)不依賴于受精的生殖發(fā)育的存在?？梢?例如)根據(jù)形成無(wú)胚種子、形成在受精后敗育的種子或在無(wú)受精的情況下坐果的能力來(lái)篩選植林。這些步驟將部分取決于所使用的具體植物種，但將根據(jù)技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。下面的實(shí)施例是以說(shuō)明本發(fā)明的方式給出，并且不應(yīng)該理解為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1:^^d突變體顯示了有缺陷的雌性能育力和減少的結(jié)實(shí)在對(duì)EMS誘變的M2植物種群中的擬南芥不育突變體的篩選中分離出dyad突變體(SiddiqiI等,DevelopmentVol.127(1):197-207(2000))。通過(guò)回交分析能育性表明，該突變體是雌性不育的，但是雄性能育的。對(duì)雌孢子發(fā)生和胚珠發(fā)育的分析表明，dj^f經(jīng)歷了有缺陷的雌性減數(shù)分裂，由于減數(shù)分裂細(xì)胞周期的有缺陷的發(fā)展而導(dǎo)致單次減數(shù)分裂，之后該減數(shù)分裂停止并無(wú)法在多數(shù)胚珠中發(fā)育雌配子。通過(guò)觀察性母細(xì)胞的染色體分散而分析雌性減數(shù)分裂表明，雌性減數(shù)分裂在cT7acT突變體中是不正常的染色體不能聯(lián)會(huì)并且經(jīng)歷了均等分裂而不是減數(shù)分裂，這通常是在減數(shù)分裂1階段發(fā)生的(AgasheB.，PrasadC.K.，和SiddiqiI.，DevelopmentVol.129(16):3935-3943(2002))。如圖1中顯示，^^d突變體的結(jié)實(shí)率在與野生型比較時(shí)極度減小，并且觀察到了不同^ra^突變體植林之間的結(jié)實(shí)率程度的變化。結(jié)實(shí)率是散發(fā)性的和隨機(jī)的，使得在群體的植林間沒(méi)有觀察到數(shù)量的一致性。結(jié)實(shí)率的模式是每林植株1-10粒，但是可達(dá)到最多約275粒，這是極少觀察到(500林植林中有l(wèi)林)。實(shí)施例2:雄性減數(shù)分裂和能育性在^f^/突變體中是正常的用Alexander染色檢測(cè)花粉的活力并發(fā)現(xiàn)花粉是完全有活力的并且與野生型相當(dāng)(圖2)。通過(guò)分析性母細(xì)胞的染色體分散來(lái)檢查雄性減數(shù)分裂表明，雄性減數(shù)分裂是正常的并且導(dǎo)致產(chǎn)生了單倍體孢子四分體(圖3)。因而，雄性減數(shù)分裂、雄性能育性和花粉發(fā)育及功能在d"cr突變體中是正常的。另一方面，雌性減數(shù)分裂在^Kflff中是異常的。在^^cT中沒(méi)有觀察到同源染色體的聯(lián)會(huì)發(fā)生并且野生型雌性減數(shù)分裂的減數(shù)分裂l的減數(shù)分裂(圖3C)由均等減數(shù)分裂(圖3E)取代。實(shí)施例3:從c^ad突變體收獲的種子萌發(fā)產(chǎn)生三倍體植株有可能的是，^^d突變體中產(chǎn)生的種子是由少量雌性性母細(xì)胞中的正常減數(shù)分裂產(chǎn)生，所述雌性性母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育產(chǎn)生正常功能的胚嚢，其隨后由單倍體花粉受精而發(fā)育成種子。如果是這種情況，這些種子將表現(xiàn)為避免了d7^/突變體中發(fā)生的異常雌性減數(shù)分裂。為了檢驗(yàn)這種可能性，將來(lái)自々ad植抹的種子(n=169)萌芽并發(fā)現(xiàn)其具有高的萌發(fā)率(>90%)并產(chǎn)生形態(tài)學(xué)上正常的幼苗，除了一些種子產(chǎn)生異常幼苗(10%)外。在萌發(fā)的幼苗中沒(méi)有觀察到形狀、對(duì)稱性和子葉數(shù)目的變異情況。這與源自其它減數(shù)分裂突變體(例如AtSpoll-l和AtDmcl)的幼苗相反，所述的其它減數(shù)分裂突變體經(jīng)歷了減數(shù)分裂1中的染色體隨機(jī)分離，導(dǎo)致了更高比例的在幼苗階段顯示出一系列發(fā)育異常的非整倍體后代(GrelonM.等，TheEMBOJ.，Vol20:589-600，2001，CouteauF.等，PlantCell,Vol.11(9):1623-1634，1999)。幼苗在轉(zhuǎn)移至土壤時(shí)隨后的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)也是正常的，并且產(chǎn)生了其中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與野生型及親本c^acT突變體植株相似的植林。觀察到的主要區(qū)別在于植林開(kāi)始抽苔時(shí)花的大小。在大部分植林(n-41/52)中，觀察到花的大小相對(duì)于野生型來(lái)說(shuō)相對(duì)增大?；ǖ拇笮≡黾佑锌赡軞w因于活力增加或有利的環(huán)境影響。由于所述植林是在控制環(huán)境中生長(zhǎng)，我們排除了后者的可能性?；ㄆ鞔笮〉脑黾拥钠渌赡茉蚩赡苁潜缎栽黾印１缎栽黾颖憩F(xiàn)為營(yíng)養(yǎng)體和花結(jié)構(gòu)(尤其是花粉粒)的大小增加(AltmannT.，等，PlantCellReports.Vol.13:652-656，1994)。色體來(lái)檢測(cè)它們的倍性水平。通過(guò)檢測(cè)減數(shù)分裂的染色體分散發(fā)現(xiàn)，17/19的植林是三倍體并且發(fā)現(xiàn)剩余的2個(gè)是二倍體(圖4)。由于花粉發(fā)育和雄性減數(shù)分裂在^rad突變體中是正常的而減數(shù)的雌性減數(shù)分裂由均等分裂取代，這些結(jié)果表明，多數(shù)種子是由于未減數(shù)(二倍體)的卵細(xì)胞通過(guò)正常的單倍體精子受精而產(chǎn)生而不是由少數(shù)胚珠中的正常雌性減數(shù)分裂產(chǎn)生，即大多數(shù)種子沒(méi)有表現(xiàn)出避開(kāi)了異常減數(shù)分裂。實(shí)施例4:源自^rfld的三倍體植林顯示保留了所有雜合標(biāo)記"/acT突變體中形成的三倍體種子可能是未減數(shù)胚囊通過(guò)正常單倍體花粉受精的產(chǎn)物，這符合^Fad中發(fā)生的均等雌性減數(shù)分裂。如果這種未減數(shù)胚嚢是由未減數(shù)大孢子形成，那么該未減數(shù)胚嚢的基因型將與二倍體親本植林的基因型一致，所述未減數(shù)大孢子是由其中染色體保持為單價(jià)體并未能經(jīng)歷重組的大孢子母細(xì)胞的均等分裂產(chǎn)物產(chǎn)生。因而，如果親本植林對(duì)分子標(biāo)記是雜合的，那么所迷三倍體后代將對(duì)該標(biāo)記來(lái)說(shuō)也是雜合的。如果未連接至著絲點(diǎn)的標(biāo)記認(rèn)為是在雜合的條件下，那么在完全不存在重組的情況下，親本雜合性的100%傳遞將在產(chǎn)生的雌配子和所述三倍體后代中實(shí)現(xiàn)。如果重組和交換發(fā)生，那么100%雜合性將不能在產(chǎn)生的三倍體后代中維持。對(duì)于未連接至著絲點(diǎn)的標(biāo)記，預(yù)期的未減數(shù)胚嚢中的純合性頻率為33%，并且三倍體后代中的純合性的頻率為16.7%,而在完全不存在重組的情況下將不會(huì)存在純合子。未喪失雜合性的未減數(shù)胚嚢的形成對(duì)于設(shè)計(jì)無(wú)融合生殖和固定雜種優(yōu)勢(shì)來(lái)說(shuō)是非常期望的。我們使用微衛(wèi)星來(lái)測(cè)量^sd突變體植林的三倍體后代之間的雜合性喪失。在野生型Nossen(No-0)和dj^cT突變體Columbia(Col)生態(tài)型之間的分離的F2代雜種中鑒定^rfltf突變體植株。從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(www.arabidopsis.org)獲得分布在5條擬南芥染色體的每條的整條上并且未連接至著絲點(diǎn)的候選標(biāo)記(>35cM)。檢驗(yàn)用于產(chǎn)生所述F2代群體的親本植株以確定多態(tài)性并且基于結(jié)果我們選出了50林基因型F2代fl^ad突變體植林的4條染色體上的5個(gè)不同的標(biāo)記(表1)并確定對(duì)于每林植林來(lái)說(shuō)都是雜合的那些標(biāo)記。單獨(dú)從所述50林F2代植林收集自交種子并且讓其生長(zhǎng)為50個(gè)不同的家族，每個(gè)家族由可變數(shù)量的同胞組成。這總共產(chǎn)生了分布涵蓋50個(gè)家族的196林植林。對(duì)每個(gè)家族的所有成員進(jìn)行基因型分析，分析對(duì)于親本植林來(lái)說(shuō)是雜合的那些標(biāo)記，所以對(duì)于每個(gè)標(biāo)記分析了分布涵蓋所有50個(gè)F2代家族的74-119株植林。表1:對(duì)d7ad植林后代進(jìn)行標(biāo)記分析以測(cè)量雜合性喪失和重組。a在第6列括號(hào)中的數(shù)字表示用于分析那些標(biāo)記的全部植林的純合子百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在篩選的196林植林中，我們獲得了35林對(duì)至少一種對(duì)親本植林來(lái)說(shuō)是雜合的標(biāo)記是純合的植林。通過(guò)進(jìn)行減數(shù)分裂的染色體分散測(cè)定了這35林植林中的22抹植抹的倍性。發(fā)現(xiàn)有21林植林是二倍體而另一林是具有13條染色體的超二倍體。因此根據(jù)該分析，雜合性喪失幾乎只發(fā)現(xiàn)于二倍體中。在未顯示雜合性喪失的植林中，從單獨(dú)的F2家族隨機(jī)選擇15林植林并檢驗(yàn)它們的倍性。發(fā)現(xiàn)這15林都是三倍體。因而，結(jié)果表明在三倍體中不存在雜合性喪失，所述三倍體構(gòu)成了二倍體^Fad突變體植株后代的主要類型。在三倍體中未能發(fā)現(xiàn)雜合性喪失也排除了關(guān)于它們的形成的一個(gè)備選的可能機(jī)制，也就是多精受精，即單倍體雌配子由兩個(gè)單獨(dú)的雄配子受精，該機(jī)制也將預(yù)示雜合性喪失。我們的發(fā)現(xiàn)表明，^^d突變體植林的三倍體后代是由保留了親本基因型的未減數(shù)胚囊受精產(chǎn)生。未減數(shù)的胚囊的形成是無(wú)融合生殖的一個(gè)關(guān)鍵方面。實(shí)施例5:Boecheraholboelli的"M"同系物的分離和功能鑒定用Bho5Bam(SEQIDNO:39)和Bho3Bam(SEQIDNO:40)引物從兼性無(wú)融合生殖的Boecheraholboellii品系(accession)二倍體Greenland和三倍體Colorado(NaumovaT.N.等，Sex.PlantReprod.Vol.14:195-200,2001)克隆"W"同系物的3kB基因組編碼區(qū)。將Bh"rJ/7基因克隆(SEQIDNO:16)有效連接至擬南芥"MZ啟動(dòng)子并用于轉(zhuǎn)化《Mff突變體植林以檢測(cè)補(bǔ)充性。還擴(kuò)增了BhPMZ7cDNA并進(jìn)行測(cè)序(SEQIDNO:17)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物原位真空滲入轉(zhuǎn)化將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)移進(jìn)^rfld雜合的Fl代植林中。我們獲得了42株轉(zhuǎn)化林，其中9林轉(zhuǎn)化林是^^d突變體等位基因純合的，這通過(guò)d"if等位基因座旁側(cè)的CAPS和微衛(wèi)星標(biāo)記測(cè)定(AgasheB，PrasadC.K.，和SiddiqiI.，DevelopmentVol.129(16):3935-3943(2002))。在所述的9林轉(zhuǎn)化林中，有4林轉(zhuǎn)化抹顯示了對(duì)^^d突變表型的補(bǔ)充，這可以通過(guò)充分伸長(zhǎng)的長(zhǎng)角果(圖5)來(lái)判定，發(fā)現(xiàn)具有完全的結(jié)實(shí)率。剩余的5林植林可能由于共抑制而不育。擬南芥植林的生長(zhǎng)具有^rai/突變的擬南芥林是如早先描述的(SiddiqiI.等，Development.Vol.127(1):197-207(2000))。用于孩炎衛(wèi)星標(biāo)記分析的F2代是源自如所描述的No-0林(Nossen生態(tài)型)和Col-0生態(tài)型背景中的d/a(/突變體之間的雜交(SiddiqiI.等，Development.Vol.127(1):197-207(2000))。讓植林在如所描述的控制環(huán)境下生長(zhǎng)(SiddiqiI.等，Development.Vol.127(1):197-207(2000))。對(duì)于陪替氏平皿中的種子萌發(fā)，將種子用乙醇表面滅菌IO分鐘，之后用0.025%的氯化汞處理它們5分鐘。另外，將該種子用無(wú)菌水洗滌3次以除去任何氯化汞痕跡。將種子再懸浮于微溫的0.5%頂層瓊脂中并均勻散布在補(bǔ)充有2%蔗糖的MS瓊脂平板(0.7%)上。讓該平板在層流通風(fēng)櫥中干燥1小時(shí)，將平板用石蠟?zāi)っ芊獠⒈３衷?t:的冷庫(kù)中層化3天。之后，將平板轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室中。在其后的兩周后，計(jì)算萌發(fā)率。對(duì)于盆中的種子生長(zhǎng)，通過(guò)混合等比例的Soilrite:珍珠巖蛭石制備用于植物生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基(KeltechEnergiesLtd.，Karnataka574108，India)。將盆栽用混合物均勻施加在底部有孔(允許毛細(xì)上升)的盆中并將該盆浸入1XMS溶液中，所述溶液含有每升加入有1ml(1000X)次要鹽(H3BO3(70mM)、MnC12(14mM)、CuS04(0.5mM)、ZnS04(lmM)、腿o04(0.2mM)、NaCl(l謹(jǐn))、CoC12(0.OlmM))的主鹽CaC12(4mM)、MgSo4(1.5mM)、KN03(18.8mM)、NH4N03(20,6mM)、KH2Po4(1.25mMpH5.6)、Fe-EDTA(20mM)。將種子均勻散布在盆的表面上，蓋上Saran包裝膜，并保持在4-8X:下3天以便層化，然后轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室中。在移栽的時(shí)，在幼苗轉(zhuǎn)移至土壤培養(yǎng)基后將盆蓋上Saran包裝膜并直接置于生長(zhǎng)室中。一旦植林在盆栽混合物中固定即移除Saran包裝膜。用蒸餾水以有規(guī)律的間隔進(jìn)行澆灌。結(jié)實(shí)率分析將具有Col-0生態(tài)型背景的^ra^突變的F2代分離群體用于對(duì)《^^純合的植林的結(jié)實(shí)率進(jìn)行打分，讓^rad突變體植林生長(zhǎng)直至它們的末期(這時(shí)植物停止開(kāi)花)。在這一階段后，停止?jié)补嘁员闶归L(zhǎng)角果達(dá)到采收成熟度。期間，變黃且將落果的最低處的長(zhǎng)角杲分別裂開(kāi)并且按單抹收獲種子(若有的話)。同樣需要以有規(guī)律的間隔時(shí)間收獲種子以避免可能的種子丟失。最后，將收集的種子按單抹合并以計(jì)算每林植株的種子總數(shù)。花粉活力花藥中的小孢子母細(xì)胞的活性染色如已描述的進(jìn)行(AlexanderM.P.，StainTechnol.Vol.44(3):117—122，1971)。減數(shù)分裂分散對(duì)雄性減數(shù)分裂和雌性減數(shù)分裂分散的分析是如所描迷的(AgasheB，PrasadC.K.和SiddiqiI.，DevelopmentVol.129(16):3935-3943(2002))。植抹DNA分離用于微衛(wèi)星標(biāo)記分析的基因組DNA根據(jù)DellaportaS.L.等，PlantMol.Bio.Rep.，Vol.1:19-21(1983)描述的方法(具有小的修改)分離。從單獨(dú)的植林收集大約500mg的葉組織于1.5ml埃彭道夫管中并將其在液氮中速凍。然后，用微研杵將該組織碾磨成細(xì)小粉末。將200jj1新鮮制備的提取緩沖液(100mMTris(pH8)、50mMEDTA、500mMNaCl、1.4%SDS和10mMP-巰基乙醇)加入至該粉末中并用微研桿將其細(xì)微均化。然后，加入等體積的2xctab并輕微渦旋該混合物。隨后，將該混合物在65匸下于振蕩水浴中孵育5分鐘。之后，讓該樣品冷卻并加入等體積的24:1的氯仿異戊醇，將其輕微混合并在13000rpm下離心10分鐘。將含有DNA的水相轉(zhuǎn)移至新的埃彭道夫管中并加入2/3體積的水冷的異丙醇以使DNA沉淀。將DNA通過(guò)在4"C下以13000rpm離心20分鐘來(lái)獲得沉淀顆粒。將該DNA沉淀顆粒用70%乙醇洗滌并將該顆粒風(fēng)干30分鐘并懸浮于含有無(wú)DNA酶的RNA酶(20ug/ml)的50|i1無(wú)菌水或TE緩沖液(pH8.0)中。標(biāo)記分析基于對(duì)Col-0和No-0生態(tài)型的親本調(diào)查，從4條不同染色體選擇了合理地未連接至著絲點(diǎn)的5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記。將這些標(biāo)記用于F2代(No-0xCol-0(^^^))分離群體以選擇對(duì)所給標(biāo)記來(lái)說(shuō)是雜合的^Ffl^植株。收集這些^^d植林的種子并將其在單獨(dú)的陪替氏平亞中萌發(fā)，使得每個(gè)后代構(gòu)成了具體母本^^d植株的同胞。同樣，將來(lái)自對(duì)所給標(biāo)記來(lái)說(shuō)是雜合的多林植抹的同胞的數(shù)據(jù)一同考慮用于標(biāo)記分析。微衛(wèi)星標(biāo)記和它們的位置的列表是如表1中所描述的。用于擴(kuò)增孩i衛(wèi)星的引物序列來(lái)自TAIR網(wǎng)站(www.arabidopsis.org):nga162ngal62FSEQIDNO:6ngal62RSE(JIDNO:7nga225nga225FSEQIDNO:8nga225RSEQIDNO:9ngal68ngal68FSEQIDNO:10ngal68RSEQIDNO:11ngal107ngall07FSEQIDNO:12ngall07RSEQIDNO:13nga6nga6FSEQIDNO:14nga6RSEQIDNO:15PCR在55"C的退火溫度下(在72。C下延伸)于IXPCR緩沖液(PerkinElmer)中進(jìn)行20秒鐘，該P(yáng)CR緩沖液含有2mMMgCl、0.2mM的每種dNTP、1單位的TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer/Cetus)以及5pmol正向側(cè)翼引物和反向側(cè)翼引物。將PCR產(chǎn)物在150V的8%的聚丙烯酰胺凝膠中解析3小時(shí)，用溴化乙錠染色并用Syngene凝膠成像系統(tǒng)(Sy卿tics公司，UK)捕獲。植物材料Boecheraholboellii的兼性無(wú)融合生殖的二倍體Greenland和三倍體Colorado品系是由KimBoutilier贈(zèng)送(NaumovaT.N.等，Sex.PlantReprod.Vol.14:195-200，2001)。植林在含有如描述用于擬南芥的培養(yǎng)基的器皿中生長(zhǎng)并且在與用于擬南芥的條件相同的條件下生長(zhǎng)。/W"啟動(dòng)子的克隆用引物pg2r4(SEQIDNO:48)和PDYBAM(SEQIDN0:47)從Col-0生態(tài)型擴(kuò)增1.8kb的/f^啟動(dòng)子區(qū)并且按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)將該產(chǎn)物克隆進(jìn)pGEMT栽體(Promega)中。從Boecheraholboellii克隆"MZ同系物用在5'末端具有BamHl位點(diǎn)的引物Bho5BAM(SEQIDNO:39)和Bho3BAM.(SEQIDNO:40)從Boecheraholboellii擴(kuò)增擬南芥則"同系物(Bh"M幼的基因編碼區(qū)。將所得的3kb片段克隆進(jìn)pGEMT中。在擬南芥"K^啟動(dòng)子下驅(qū)動(dòng)Bh/7J"的雙元載體pCAMBIA1300的構(gòu)建將Bh"M/從pGEMT中作為3kbBamHI片段釋放并克隆進(jìn)攜帶有植物可選標(biāo)記潮霉素的pCAMBIA1300載體中。用引物BDY3(SEQIDNO:36)和0CSR(SEQIDNO:38)檢驗(yàn)取向。將1.6kb"r^啟動(dòng)子區(qū)(SEQIDNO:22)作為Sacl片段從pGEMT載體釋放并插入pCAMBIA1300載體中的Bh/7M"上游。該啟動(dòng)子相對(duì)于BhZ7W"基因組序列的取向用引物ismr4(SEQIDNO:37)和bdyl(SEQIDNO:35)確定。三親本雜交將上面構(gòu)建的雙元載體pCAMBIA轉(zhuǎn)移進(jìn)農(nóng)桿菌(AGL1)中是如所描述的通過(guò)三親本雜交進(jìn)行(AgasheB，PrasadC.K.和SiddiqiI，Development,Vol.129(16):3935-3943(2002))。擬南芥植抹的轉(zhuǎn)化對(duì)于Bh"rj"的補(bǔ)充分析，將Col-0x^"^/的Fl代植林用攜帶有由擬南芥"W"啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Bh/W"的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物原位真空滲入轉(zhuǎn)化根據(jù)BechtoldN.和PelletierG.，MethodsMol.Biol.，Vol.82:259-66(1998)進(jìn)行。轉(zhuǎn)化株的選擇將來(lái)自經(jīng)真空滲入的F1代植林的TO粒種子置于含有0.8%細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂粉、lmMKN03和1%蔗糖(含20jug/ml潮霉素)的陪替氏平亞中。在低溫層化3天后，將平板轉(zhuǎn)移至生長(zhǎng)室中?？钩泵顾氐霓D(zhuǎn)化林最早可在轉(zhuǎn)移5天后根據(jù)充分伸長(zhǎng)的胚根、直立的胚軸和充分伸展的子葉確定。將選擇的轉(zhuǎn)化林另外轉(zhuǎn)移至含有潮霉素的MS平板中并且在建立抗性后將它們最終轉(zhuǎn)移至土壤介質(zhì)中。此外，如先前描述的用bdy3和0CSR引物檢驗(yàn)植林中插入序列的存在。^FacT基因座處的接合性(zygosity)的基因分型將分離的d/aifF2代種群的三種基因型通過(guò)共顯性的CAPS標(biāo)記(KoniecznyA.和AusubelF.M.，PlantJ.，Vol.4(2):403-410，1993)和可變的微衛(wèi)星鑒定。cfyad突變體等位基因的旁側(cè)序列源自Landsbergerecta生態(tài)型并且來(lái)自野生型等位基因的那些旁側(cè)序列具有Colombia生態(tài)型序列。因此，將這些旁側(cè)序列中的SNP用于產(chǎn)生緊連接dyacT基因座(KNEF(SEQIDN0:31)和KNER(SEQIDNO:32)、KKF(SEQIDNO:33)和KKR(SEQIDNO:34))任一側(cè)并位于其旁側(cè)的CAP標(biāo)記以及緊連接至"W"的微衛(wèi)星標(biāo)記引物(KMF(SEQIDNO:29和KMR(SEQIDNO:30))(AgasheB，PrasadC.K.和SiddiqiI.，DevelopmentVol.129(16):3935-3943(2002))。利用上述標(biāo)記在^rsd基因座處進(jìn)行基因分型是如所描述的(AgasheB，PrasadC.K.和SiddiqiI.,DevelopmentVol.129(16):3935-3943(2002))。RNA分離和cDNA合成將來(lái)自二倍體Greenland植林的發(fā)育良好的單芽用于根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)通過(guò)TriZol制劑(Invitrogen)進(jìn)行總RNA的分離。使用用于cDNA合成的SuperscriptChoicesystem(GIBC0BRL),將4Mg總RNA用于進(jìn)行第一鏈cDM合成。通過(guò)使用引物5RF3(SEQIDN0:41)和Bho3BAM(SEQIDNO:40)對(duì)該cDNA另外的擴(kuò)增用于克隆。將所得的1.9KB片段克隆進(jìn)pGEMT中并測(cè)序。結(jié)果作為SEQIDNO:17在序列列表中示出。相應(yīng)的"K4"蛋白的氨基酸序列在SEQIDNO:18中示出。實(shí)施例6:條件性"M"等位基因的構(gòu)建和表現(xiàn)i^a^突變體表型的純系轉(zhuǎn)基因植物群的發(fā)展用于構(gòu)建條件性"^"基因的等位基因的策略是基于將大鼠糖皮質(zhì)激素受體(GR)的激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SEQIDN0:27)與/M"的C-端融合并將該融合構(gòu)建體整合進(jìn)^ra^突變體等位基因純合的(dy/dy)植林的基因組中。所述/W/HJR融合蛋白其本身不能補(bǔ)足d"d突變體，因?yàn)樗鯣R結(jié)構(gòu)域在不存在類固醇激素時(shí)賦予了胞質(zhì)定位，而的作用位點(diǎn)是位于細(xì)胞核內(nèi)。然而在存在類固醇激素時(shí)，該融合蛋白從胞質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)釋放并變得能夠轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，在那里其可以補(bǔ)足《Mi/突變體。所述構(gòu)建步驟如下將植物雙元載體pBI101.3用BamHI和Sacl消化以除去GUS報(bào)告基因并將其用包含GR結(jié)構(gòu)域的BamHl-Sacl片段代替(A.M.Lloyd等，Science266，436-439(1994))。將所得質(zhì)粒命名為pBIlOl.3::GR。接下來(lái)，將引物DyCF(SEQIDNO:43)和DyPB(SEQIDNO:42)(其含有用以修飾終止密碼子和引入BamHI和Pstl限制性位點(diǎn)的序列)用于PCR擴(kuò)增"W"基因的304bp的C-端區(qū)。將該經(jīng)修飾的序列作為216bp的Pstl片段克隆進(jìn)攜帶有5.8kb基因克隆(SEQIDNO:28)的pBS(KS)::Dyad質(zhì)粒中以產(chǎn)生pBS(KS)::Dyad'，所述基因克隆含有對(duì)應(yīng)PI克隆MFG13(AccNo.AB025621)的坐標(biāo)9684-3878的整個(gè)"a"基因。所得的質(zhì)粒含有這樣的"WZ基因它的終止密碼子TGA已由GGG替換并且其還攜帶有與替換密碼子一起的BamHI位點(diǎn)。將含有MFG13的核苷酸9684-9416的來(lái)自pBSII(KS)::Dyad'的269bpSall-BamHI片段克隆進(jìn)pBIlOl.3::GR中，之后用Sail加BamHI消化。然后，將9417-5335的剩余P〃/部分作為來(lái)自pBS(KS)::Dyad'的BamHI-BamHI片段克隆進(jìn)前一步驟的產(chǎn)物中，導(dǎo)致GR結(jié)構(gòu)域與的C-端框內(nèi)融合。命名為pBIlOl.3::DyadAGR的質(zhì)粒終產(chǎn)物在圖6中示出。將該構(gòu)建體通過(guò)用輔體大腸桿菌菌林HB101[pRK2013]進(jìn)行三親本雜交來(lái)導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌林AGL1中。通過(guò)植物原位轉(zhuǎn)化(BechtoldN.和PelletierG.，MethodsMol.Biol.，Vol.82:259-66，1998)將T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)化進(jìn)^W突變體等位基因雜合的(+/dy)擬南齊植林(TO)中。通過(guò)將種子鋪于含卡那霉素(50mg/升)的MS瓊脂平板上來(lái)選擇卡那霉素抗性Tl幼苗并將其轉(zhuǎn)移至MS+卡那霉素平板來(lái)確認(rèn)抗性表型。轉(zhuǎn)化林通過(guò)用DyCF(SEQIDNO:43)和GRrev(SEQIDN0:44)引物進(jìn)行PCR來(lái)進(jìn)一步鑒定。將確定的卡那霉素抗性幼苗轉(zhuǎn)移至土壤中并生長(zhǎng)至成熟體階段。在最初的8-10粒長(zhǎng)角果抽苜和發(fā)育后，除了每天用10|iM地塞米+>+0.015%SUwetL-77噴灌植林外，還每三天一次用lOjiM地塞米松澆灌植林。注意到在地塞米松處理之前顯示為不育的幾株植林在地塞米松處理開(kāi)始5-7天后發(fā)育了能育的長(zhǎng)角果。將部分植物材料用于DNA印記分析以測(cè)定插入序列的拷貝數(shù)，并且還用;進(jìn)行基因分型。^7fld^變體最初在L、er背景下分離并隨后基因;入進(jìn)Col林中。因而，CAPS標(biāo)記的Ler等位基因判定句M^突變體而Col等位基因指示野生型(圖7)。在具有至少一個(gè)拷貝的^ra^突變體等位基因的植林中鑒定單拷貝插入序列并且將這些植林的種子鋪在MS+卡那霉素平板上。將卡那霉素抗性幼苗轉(zhuǎn)移至土壤中并關(guān)于^^/基因座進(jìn)行基因分型。鑒定^ad突變體等位基因純合的植林并將其栽培至成年期。在抽莒后，所有植林在最初階段直至最初的8-10朵花開(kāi)花期間都用水栽培，之后用如上描述的含地塞米松的溶液澆灌。通過(guò)篩選不同的單拷貝插入序列鑒定表現(xiàn)條件性不育的品系。例如，圖8中顯示的一種品系No.33產(chǎn)生了這樣的^rac突變體植林(dy/dy)，所有這些突變體植林在生殖生長(zhǎng)的最初階段都表現(xiàn)為不育并且它們?cè)诘厝姿商幚砗笞兂蔀槟苡牧?。在地塞米松處理前分離的芽的胚珠顯示為^rad突變表型，而在地塞米松處理后分離的那些顯示為野生型表型(圖9)。從純合的i^ad突變體植林收獲種子以產(chǎn)生T3家族并且通過(guò)篩選全部產(chǎn)生了卡那霉素抗性幼苗的家族來(lái)鑒定"r^HJR插入序列純合的T3家族。這些結(jié)果舉例說(shuō)明了條件性"M"等位基因的構(gòu)建及它引入進(jìn)植林從而產(chǎn)生了在一組條件(不存在地塞米松)下顯示出^acf突變表型并且在供給(或噴灌)地塞米松時(shí)顯示為野生型表型的植林。這些結(jié)果還使得能開(kāi)發(fā)全部顯示出^rad突變表型的純系植物種群。用于該研究的糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)構(gòu)域序列(914bp)(SEQIDNO:27)GGATCCTGAAGCTCGAAAAACAAAGAAAAAAATCAAAGGGATTCAGCAAGCCACTGCAGGAGTCTCACAAGACACTTCGGAAAATCCTAACAAAACAATAGTTCCTGCAGCATTACCACAGCTCACCCCTACCTTGGTGTCACTGCTGGAGGTGATTGAACCCGAGGTGTTGTATGCAGGATATGATAGCTCTGTTCCAGATTCAGCATGGAGAATTATGACCACACTCAACATGTTAGGTGGGCGTCAAGTGATTGCAGCAGTGAAATGGGCAAAGGCGATACCAGGCTTCAGAAACTTACACCTGGATGACCAAATGACCCTGCTACAGTACTCATGGATGTTTCTCATGGCATTTGCCCTGGGTTGGAGATCATACAGACAATCAAGTGGAAACCTGCTCTGCTTrGCTCCTGATCTGATTATTAATGAGCAGAGAATGTCTCTACCCTGCATGTATGACCAATGTAAACACATGCTGTTTGTCTCCTCTGAATTACAAAGATTGCAGGTATCCTATGAAGAGTATCTCTGTATGAAAACCTTACTGCTTCTCTCCTCAGTTCCTAAGGAAGGTCTGAAGAGCCAAGAGTTATTTGATGAGATTCGAATGACTTATATCAAAGAGCTAGGAAAAGCCATCGTCAAAAGGGAAGGGAACTCCAGTCAGAACTGGCAACGGTTTTACCAACTGACAAAGCTTCTGGACTCCATGCATGAGGTGGTTGAGAATCTCCTTACCTACTGCTTCCAGACATTTTTGGATAAGACCATGAGTATTGAATTCCCAGAGATGTTAGCTGAAATCATCACTAATCAGATACCAAAATATTCAAATGGAAATATCAAAAAGCTTCTGTTTCATCAAAAATGACTGACCTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC用于在pBS(KS)::Dyad中作為Sail片段克隆的d/ac/基因組序列(5807bp)(SEQIDNO:28)GTCGACTTTTTGTTTGACCAGTGTATTTGGTTTGACTTCAGATTTGGCAAGTACGAAGCTTATGCGCTTTTGCAATCGAAACAAGGGAAAAATCTGTACTTTGTTAGCTGCGTGACTTGAGCTCTTTGGTCCGGAGACGGTAGAAGACGACAAAGCACTGACCTTTCATCTCTCGGCGATCGAAAAAATCACTCTCTTTCCTCATCAGACCCGACCCGTTATGAAGGTATCCAGACCCGTTTATTTTGATCCATCTCATAGTCGGATCCCCAAAAAAATTCAGCTTAGATTGGCCCATTTAGGCCCGTTTACAGTTTTTTACTTTTTTCTTAATTATCTnTTAACATCTTACATTATACATATTTGACTCAACAAAAAAATATAACTTAAATGTATTGTTGACTGTTTTTGATAATTAAGAAAAAAATATmTAAATTATTAAAAATATTGTTGACTCAACAAAAAAATATAACTTAAATGTATTGGGCAAATAATCATGGTCATAAGTCCTCAAGCTTATTAnTGTTTTGATTGGTTTAAATACTTTATAAAAAAAATATCAATTATATCATGTTATTACGTAAATTAAGCTnTTGATnTAAAAAAGCTTCAGCTCAATAAAGAAAAACAGATTCAGTTATCATTGGAGTATAAAATTGGTCGATACATTAGAGACATTAATCCTTACATCATAAACAATTTAATGTGAATAAAACATCATAAATCACATATCATTATCCGAAAATAATCATATGTAAGAATAATCACTGTGACAAAAAAAAAAAACAATTCCTCACGTGTGTAGTCGGTCCCCACTCTAGTAGCAGTAGCTTAATGATGCCTTCTCCGCACGTGTAACACGAAATTTATTCGCTACGGCCAATTACATTAACCTTCAGGTCTTATCACCGTTAAATTTrCAAAATGACACACGTGQCATCAATCCGTAATATCACTACGTCTGCTTTCAATCTTTCATTGTAGATGATTTCGTACACCAATTTCCGCGAACGTTTACAGTTTAGATACAGTTTGAGGGCAAATCTGTCAATATACGCCAACTTGCTGCGAAAGCAATATAGTCACGTGCCGTGCACACGCATATAAGACTCACACACTCACACCACTCTCTCTCTCTCTCTAACCTCATATATAAAGCCACCTCCCAGATTCATTAAATGCGACATTTCAAAACTTTTCTTTTTGCTGTCTTCCCCATAAGCTCTCTGCTGATTAAAAAGATTTTCTGGTATAAAACAAAATTCTTCAAATATTTCTGGGTTTATGTTTTCTCTCTATTTCTCAGAAATGCTTTAATrTCTCCATCCGCGTCCATGTTTTTTTTTCTCCGTTGCTGATTTTGATTTTTTTAATCCAGTGAAAAGGAGGAACGAAGATTATCGAGAGCAAAAATCATGAGTGTAAGATCTCTCTCGCTCTCAGATTTTATTTTTTTTCGCTGTGATATAAATGGCTCAGTCACTATCAGTCTCATGATGAGAAAAATAAAACTCATCACCGCTTGATTCTGTTTCCTTAGTGTCTCCCACGCGCGTACCAGAAAGCGCGTGTGTGTTTCTTGTTATACTCGCAGAGTCAGGTTTTTTCAAATATATTCTCTCCAGGCAGCAGCAACAACAACAAACCGATTTnTCATTATTCCTTATAACAATTTTTGATTCTCCAGAAAAAAAATATCTCTCTTAGTTTTTCTCTTGTTCTACAGAGTACGATGTTCGTGAAACGGAATCCGATTAGAGAAACCACCGCCGGGAAAATCTCTTCGCCGTCGTCACCGACTTTCAATGGTAAACTACTGAAGCTATAGTTTCTTCGTmTGTTGATTTTCTCGCTTCTCTTCTAATTTCTGAATTnTGGTTTGGGTTTGTTCTTACAGTTGCAGTCGCGCATATAAGAGCTGGATCTTATTACGAAATCGATGCTTCGATTCTTCCTCAGAGATCGCCGGAAAATCTTAAATCGATTAGAGTCGTCATGGTATTCACTCGATTCTCTGCTnTTTCACCTnTATTATAGACAGATCTCGTTTTTTGTTGTTCGTCTGGGTTTTCGAGTGATTTTTTAAGGTTTATTGATGCAGGTGAGCAAAATCACGGCGAGTGACGTGTCTCTCCGGTACCCAAGCATGTTTTCACTCCGATCGCATTTCGATTACAGTAGGATGAACCGGAATAAACCGATGAAGAAGAGGAGTGGTGGTGGTCTTCTTCCTGTTTTCGACGAGAGTCATGTGATGGCTTCGGAGCTAGCTGGAGACTTGCTTTACAGAAGAATCGCACCTCATGAACTTTCTATGAATAGAAATTCCTGGGGTTTCTGGGTTTCTAGTTCTTCTCGCAGGAACAAATTTCCAAGAAGGGAGGTGGTTTCTCAACCGGCGTACAATACTCGTCTCTGTCGCGCTGCTTCACCGGAGGGAAAGTGCTCGTCTGAGCTGAAATCGGGAGGGATGATCAAGTGGGGAAGGAGATTGCGTGTGCAGTATCAGAGTCGGCATATTGATACTAGGAAGAATAAGGAAGGTGAGGAGAGTTCTAGAGTGAAGGATGAAGTTTACAAAGAAGAAGAGATGGAGAAAGAAGAGGATGATGATGATGGGAATGAAATAGGAGGCACTAAACAAGAGGCAAAGGAGATAACTAATGGAAATCGTAAGAGAAAGCTGATTGAATCAAGTACTGAGAGACTCGCTCAGAAAGCTAAGGTTTATGATCAGAAGAAGGAAACTCAAATTGTGGTTTATAAGAGGAAATCAGAGAGGAAGTTCATTGATAGATGGTCTGTTGAGAGGTAAAATGCATAAAAATTAACGAATTTTATGATCTCTGAATTTGGATTTTCCTTGGTTCTATTGATTGATTGTGGTTAATTTTGAAGGTACAAACTAGCTGAGAGGAACATGTTAAAAGTGATGAAGGAGAAGAATGCAGTGTTTGGCAACTCCATACTCAGGCCAGAGTTGAGGTCAGAAGCAAGGAAGCTGATTGGTGACACAGGTCTATTGGATCATCTGCITAAGCACATGGCTGGTAAGGTGGCTCCTGGAGGTCAAGATAGGTTTATGAGAAAGCACAATGCAGATGGGGCAATGGAGTATTGGTTGGAGAGTTCTGATTTGATTCACATAAGGAAAGAAGCAGGAGTTAAAGATCCTTACTGGACTCCTCCACCTGGTTGGAAGCTTGGTGACAACCCTTCTCAAGATCCTGTCTGCGCTGGAGAAATCCGTGACATCAGAGAAGAATTAGCTAGCCTGAAAAGGTAGAAAAGTTATTGAATTGGTTATACGATCATCTCCCTTTAGTTGTCTTATTGCAATTTTAACTCATGTCTGTCTTGGTCTTGAGAAGAGAATTGAAGAAACTTGCGTCAAAGAAGGAAGAGGAGGAGCTTGTTATCATGACTACGCCTAATTCTTGTGTTACTAGTCAGAATGATAATCTGATGACTCCAGCAAAGGTAAGAGCTCGAAACAATAGCTGAGGCCTCTCTCTTGTGAAAATGTTTTATGCTACTTTGTGAACATCTCTGCTGCTTTTTCTTAGGAAATCTACGCTGATCTGCTGAAAAAGAAATACAAAATTGAGGACCAGCTAGTGATTATTGGAGAAACCTTGCGTAAAATGGAGGTATGTATATCCCTAGATTGAGTTTCCAAGTAGACACAAACCCTTACTTAAAATGTAAAATCTTGATTTAGTAACTATCACAAGTAGTCATAGGAAACTCCCTTGGAGGATAACAGTGAACCATGTAAAATGGGCCCATTTAGCGTATGTGATAAATGATTTCCTCTGTCTCTATGAGAGACCACTTTGCTGATAGTCGAATAATGATGAAACATTTGTGTTACTATAAATGCAAATATTGCAGGAAGACATGGGATGGCTTAAGAAAACAGTGGACGAGAACTATCCTAAAAAGCCAGACTCAACAGAGACACCTTTGCTACTAGAGGATTCACCACCAATACAGACACTAGAAGGAGAAGTGAAGGTGGTGAACAAGGGTAACCAAATCACAGAGTCACCTCAAAACAGAGAAAAAGGAAGGAAGCATGATCAACAAGAAAGATCACCACTTTCACTAATAAGCAACACTGGTTTCAGAATCTGCAGGCCTGTGGGGATGTTCGCATGGCCCCAATTGCCTGCTCTTGCTGCTGCTACTGATACTAATGCTTCTTCGCCAAGTCACAGACAAGCCTACCCATCCCCTTTTCCAGTCAAGCCACTTGCAGCTAAGCGTCCTCTTGGCTTGACGTTTCCCTTCACCATCATACCCGAAGAAGCTCCCAAGAATCTCTTCAACGTTTGAAGTTGTCACTGGAAACTGATGCATCAGATCTTACTTTCCCTACAAGTAAGCTGATGTGAACTGGTAAGGTCTCTTCCATGAAATATATAATAACTTACAAGCGAGCAGGTATTTAAAAGTACCACTTATATTTATATAAGGAACTATATTTATGGGAATAATTTGGCAACTTnTGAAATTATTCCTCTTTAATTTAGGGATTTTACGTCTCTGGTTATTAATTATATATAGAGAGAGATGATTTGAAATAGAGAGGCTTATCATAGGAATATATTCTTTTGAAAGACAGGGATCATCATATTCTGTATTACTGAACAATTTCTATAATGATACAGTTATATATATATATATATACTTATTATTCAATTCCTAGCGCTTTTCATTTTAAATATATTATTTTCGTGTAGTTGATTAATTTTGAAAAACTTGTATTACGCATATGAATTATGTCCCGTTGATCTATAAAAATCATATnTGCGATTAAGCACAAACTATAAAAGTATGTTTAAGTTCCTGCGGGTTGACCAGTTTCACTTTAAAATCTTGGTCTTTGGGATGAGTTTGCCGATAAATTTTGTGACTTATGGTTATCTAATAATACGAATGTTATACTTTCCAAAATTTGAAAAAAACAATATGAATACTTTATTATTATCTTTTTCCTTCCATTTCTCTTCCCGCGTTTTGTTGTTCGACCGATCrrGTAGTACATGTGTTCTAATTTGAACGTCGAGAACCAITAAAGAAGGAAGAAAGAAAAGAAAAAAAAAAACTTnTTCTCATTTCGAGATTTCCTAACCATTTGGTGGTGCAGGTTTAAGTTTCGCTCGCTCTCCTAAAACCAAACGTCCAAACCCGTTCTCTAGACTAGTTCTGCTGCGAAACACGACACACACCAAGTCACCAA'TATTACTTGAATCCACGTCAAATAAACAATGGTCATTCAATATGGTTAATGCAACACTCGAGTAACTTTATnTCAAAGAAATTTGCACAAAGTCATGTTATGATATGGTGTATAATATTTGTGTATATATCCGGCCAAAAAACATAACAAGTTTTTTATAAAAAAAAAAATTAATTATATATCTAAAATATAGAATAGCTAGTAATAAAACTAGTGAGAAACAAATTTAAAACAAATTAAGCAACTATGTTATTTGCCAAATTGACAATTTTAAATATTATGGCGTAtTTAAAAAAAATTAGGAGCCACTTGTGATTTATTTGTATCAACTAGTAAATTTTAAACATAAAAATCATTTATAAATATAAATAAATATTATCATATTTATGTAGAAAGAGTCTCATCAGTCTGATAGTCAATCACTTGTGCGCAAAGAAATTTGACGAAAGGGGTTACAAAAAAATGGCCAGCACAGCATCATCATGTCCCCGACCTTATATTATAAGATTTGTATATTTTATCCATAAATTGTATATAACCGTCGAC實(shí)施例7:三倍體(3n)的突變體的自交種子含有來(lái)自雌配子的二倍體(2n)貢獻(xiàn)在四倍體(4n)和二倍體(2n)野生型擬南芥植林之間進(jìn)行回交。在這兩種情形中，產(chǎn)生的種子都是三倍體。然而，當(dāng)父本是四倍體而母本是二倍體時(shí)，產(chǎn)生的種子較大，而當(dāng)父本是二倍體而母本是四倍體時(shí)種子皺縮。這些結(jié)果在圖10中描述并且每類種子的100粒種子的重量在表2中示出。表2:從多種雜交植林獲得的IOO粒種子的重量種子類型種子重量(ug)二倍體ColumbiaWT種子-2142四倍體Landsbergerecta-3352二倍體Columbiax四倍體La-erng(父本過(guò)量)-3004四倍體La-erx二倍體Columbia(母本過(guò)量)-1302rf7ad的較大類型的種子-3453d"(/的正常類型的種子-2012t/yad的皺縮類型的種子-1379這些發(fā)現(xiàn)再現(xiàn)了當(dāng)前領(lǐng)域已知的那些(ScottRJ等，Development125,3329-3341，1998)。不受任何機(jī)理理論的約綽，父本基因組和(HaigD.和WestobyM.，Am.Nat.Vol.134:147-155，1989)解釋為是由于母本和每個(gè)胚之間的資源分配竟?fàn)幰穑副就ㄟ^(guò)促進(jìn)所有種子之間的資源公平分配來(lái)限制胚的生長(zhǎng)，而每個(gè)胚的適應(yīng)性是通過(guò)獲得更多資源來(lái)增強(qiáng)。根據(jù)HaigD.和WestobyM.，Am.Nat.Vol.134:147-155，1989，在胚中母本表達(dá)的印記基因?qū)⑵鹣拗婆呱L(zhǎng)的作用而父本表達(dá)的基因?qū)⒋龠M(jìn)胚加快生長(zhǎng)。因而，含有額外的父本基因組當(dāng)量的種子將由于有過(guò)量的促進(jìn)胚生長(zhǎng)的基因產(chǎn)物而比正常種子大，而含有額外的母本基因組當(dāng)量的種子將由于有過(guò)量的限制胚生長(zhǎng)的基因產(chǎn)物而比正常種子小。為了了解^^d突變體自交種子中的母本和父本貢獻(xiàn)，對(duì)種子大小進(jìn)行了分析。從突變體植林獲得的自交種子在大小上是不均勻的，并且如圖10中描述的歸類為三種類型大的、正常的和皺縮的。7林獨(dú)立的d7ad突變體植林的大小級(jí)分布在下面示出表3:來(lái)自^Fad突變體植林的種子的大小級(jí)分布<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>從多林植林取樣每種類型的種子，將其萌發(fā)并生長(zhǎng)成植林。每林植林的倍性通過(guò)減數(shù)分裂分散中的染色體計(jì)數(shù)測(cè)定。結(jié)果在下面的表4中示出表4:來(lái)自自交的^^/突變體的每種種子類型的植林的倍性<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>括號(hào)中的數(shù)字表示每種類型中檢驗(yàn)的總植株的百分比這些數(shù)據(jù)顯示，大多數(shù)三倍體在大小上是皺縮的并且構(gòu)成了皺縮類型的種子的大部分。大多數(shù)三倍體是皺縮的這一現(xiàn)象表明，它們由過(guò)量的母本貢獻(xiàn)(2n)產(chǎn)生而不是由過(guò)量的父本貢獻(xiàn)(因而在三倍體中其應(yīng)該是ln)產(chǎn)生。結(jié)合實(shí)施例4中的所有三倍體保留了親本雜合性這一發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)果表明，雜合性的保留是從母本獲得，并因而表明所述三倍體由保留親本雜合性的未減數(shù)雌配子產(chǎn)生。為了證實(shí)cT/a^中的三倍體由2n的母本貢獻(xiàn)產(chǎn)生，我們將d/fld突變體作為雌林與作為雄林的品系ETC60("M/野生型)雜交來(lái)產(chǎn)生Fl種子。所述ETC60品系(在美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/857,539中描述)攜帶有單拷貝的具有卡那霉素抗性基因的Ds轉(zhuǎn)位子。通過(guò)進(jìn)行卡那霉素抗性分離，之后將F1植林與野生型二倍體植林進(jìn)一步雜交，有可能確定雄配子在Fl植林中的倍性作用。將來(lái)自第一次雜交的種子萌芽并且將幼苗轉(zhuǎn)移至土壤中。用卡那霉素抗性基因-特異性引物(KanFSEQIDN0:49和KanRSEQIDNO:50)檢驗(yàn)6林Fl植林的卡那霉素抗性基因的存在，而且用轉(zhuǎn)位子特異性Ds5-2引物(SEQIDNO:45)結(jié)合基因-特異性引物GLTF(SEQIDNO:46)檢驗(yàn)ETC60中的轉(zhuǎn)位子拷貝。所有這6林植抹都是具有卡那霉素抗性的Ds元件陽(yáng)性的，并且還都是如對(duì)含野生型"r^7拷貝的雜交植物所預(yù)期的一樣為能育的。這6林植林的倍性用減數(shù)分裂的染色體分散檢驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)3林植林是具有15條染色體的三倍體，2林植林具有16條染色體，并且l林植林具有17條染色體。這些結(jié)果暗示了雌配子是由未減數(shù)的/超二倍體孢子產(chǎn)生這一可能性。未減數(shù)雌配子通過(guò)單倍體花粉受精將產(chǎn)生(接近)卡那霉素抗性基因是單顯性組合的三倍體(Kkk)。備選地，所述三倍體可能由單倍體雌配子通過(guò)一個(gè)未減數(shù)雄配子或兩個(gè)減數(shù)雄配子受精而產(chǎn)生，在這種情形中，該三倍體將是卡那霉素抗性基因的雙顯性組合UKk)。如果單顯性組合條件的植林與不具有卡那霉素抗性的野生型植抹雜交，那么所得植株中卡那霉素抗性與敏感性的分離比率將是1:1。然而，如果雙顯性組合條件的植林與野生型植林雜交，那么該分離比率應(yīng)該預(yù)期為5:1。將上面獲得的兩林三倍體植林與野生型進(jìn)行雜交并且將獲得的種子為卡那霉素抗性的分離打分。表5中顯示的結(jié)果表明卡那霉素抗性為1:1分離，排除了多精受精，并且表明所述三倍體由未減數(shù)雌配子產(chǎn)生。表5:雜交植林中KanK表型的分離<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>*由于種子是三倍體親本與二倍體親本的雜交產(chǎn)物，一些種子由于非整倍性而不能萌芽。**1:1比率的擬合優(yōu)度的顯著性檢驗(yàn)是排除了未萌發(fā)的種子而進(jìn)行計(jì)算。***5:1比率的擬合優(yōu)度的顯著性檢驗(yàn)是通過(guò)把KaW類型中未萌發(fā)的種子包括在內(nèi)而進(jìn)行計(jì)算。理論上，只有50%未萌發(fā)的種子應(yīng)包括在任一類型中(基于獲得的Kana和KanS幼苗的比率)，但是為了增加顯著水平，我們將全部未萌發(fā)的種子批包括在KanK類型中。這避免了這樣的情況即使我們將所有未萌發(fā)的種子批包括在了KaW類型中，5:1比率的擬合優(yōu)度也不是顯著性的，并因而強(qiáng)烈支持了贊成只有1:1比率的情況。S乂2檢驗(yàn)為顯著的，表明沒(méi)有遵循所給出的比率NS乂2檢驗(yàn)為不顯著的，表明遵循了所給出的比率實(shí)施例8:來(lái)自楊樹(shù)(毛果楊)的/W/基因和編碼序列來(lái)自楊樹(shù)的基因的另一個(gè)實(shí)例可在http://www,ornl.gov/sci/ipgc找到。cDM序列的編碼部分的翻譯提供了一個(gè)氨基酸序列，用圖11中.與擬AtDyad同系物毛果楊如http://www,ornl.gov/sci/ipgc中的基因組區(qū)域(SEQIDNO:24)內(nèi)含子包括第一個(gè)ATG上游的2444bpcattcgttatggctaacggagtcactgggccttacatgcatccacagaceaggtgccggagtgctggtgcaaaaccaatttattgaamctgaacaattggagaGgaaataaatgtctttacttcttcaaacccttgatttaaaagtaaatgtattatcttttattgatttttttattcaattcetagaattagtagcttgaagaatttattaaatttatcagataaatgagagggatatacccttaaaatcgtcaaaaataaatctcaatttacttataaattgaagaataccttc加aaaataaaataaaattgcgtgccatccctctttagtagattttggcgctactogtgtggtgtgggtacagagaagaatattaatatacccgagctggaactagaaggtoacccgccatatccaatgaggcaatcccgaacctctcccacaagcaagcatcegccacgtggteagaagctacagaggttatgacctggctaaacgattggctaccaggaaccaatggcCcctcaaaggccatagataaata助tc^aagagccagtttctttagctctcaaotctotcaaccatctatacaacatttccagaggcaacaagactcgggaggggtaaaacggtaaaatgggagacgttactgtagaggagggagggggggaccagaatccaggteacgtgaggcgcatcccgtctggtaataatcattactatttttttctotctttatagcagaaatgcaccaccatcgttggtttcacaacagaaaaaactccctcccccttctctctgcgttttctctcaagctgttttttcttgctctccaaacaatocatoaeaagtagcttttgaaacagaaattgaaaaaaaaaggtctogttttatattta,gctgtttaattttcaacctgatttttttcatgtgcatt助ttaattaatgctggtgtagttactctttggotggttgaatcggtgctggtactggataaaacatctcaaaaggaatgaeccatttgcatgtcattaaggggtgcatgtgtttgaatgaggaa加aaac幼gtcctgacatgagtatgcattttcctgtggttaacagatataggttgtttggctcctggaagattctcaaaattgagatttcaagctcaaaagtgtttttgatacactttccaagcttcatgatctttaatttaccagtggtgtttttcctagttagtgtactttaaaggtcgcataatgatcggtagtacttagotttgattttgcattcccgttogcttcttcttgttttcagtctctgcgtaccaacaatatagagattotcctggctgtgcaagaatcactatatctatctatctatctatcaggccttaaccttgctttcttttctgatGaatccttgtgtttatg汰ttgattaatgagattaattgtatgtttgcttcaaatgattatcttatatatagtctgattttccctttctttaatcatgtccatatatgtttattcgccggggggccgggaaggacgagaggtaGgactagctagtattaacttgtgcagttgaaactgtttctctatgtgcagaagatgactaccatggagctggttgatgttgcagtgatagaccacccatoggtgagtttgttctctcttctcctcaatcccactcccactctccactcccc幼ccaccacaccectttctttctgttactcctctatttctcttctcgtaacccacgcgctcttttatctctcaaatcaagtcgctgattactagtctactaaagttttcaaatactcaaccgaattcctaatctttgtctcacgctcacacacataccaaatccacacgcgGgtcccctacaatttgttacgcuaatcasiaocGcgctctacacatccttggtgcccaagtaagtgaaatgatgattttacataacaaaaaccacataattattatgctatgta恥ggtatattotatacattctctatcgagtattgcacacgaggggcttatgcataoataaatcctcaccccttttaaaggagaagggcaatacagtga加ggttgtgcttgtgaaaatgcaggaaataaaaaggaggcagaactccgaggacgccgatagaaggctttttttgggcggacattgcctgcabacccaacatttaccacagcaccaccatttggtaata加gtaacacacacgcacacacgcccgagc助caaat加tccctcttttttatccc加gtttcctctctctctctctetctctctcacttgatttctctottctgatttgctgattttttttactgctcgtactagctagctagctctactcctatagctcacagtactgcaagtacgtogtactactgcagctgcte加gtectagtagtagct/irgrcJCrC^C4A4^aXGGg7TgrG4rGGTATTnTTATACAATTCAACAATATTCTTAAACCCGGCTCAACATTTmTCTCTCTGCnTAAAATTTGTTGG丁GTTTGTTTCTGCTTGAATAAATATCTCAGGTO^4reA4A4G4CG4GG4ra4a4(rC<image>imageseeoriginaldocumentpage57</image>ATTCGTTCAAATAAGAAATTCCTGGGTGATTGCATGATCCACATCATTGAAAGATGGTAGTAACAAACTGACCATCTGATGCATGTATCTATTCTAGATAATAAGTTGATGCATAAATTGCCATGAAACCATTTGAGAAGCTGTTATATTTAGAGGCTTOATATGGGAGTGTTGCTTATTCCAGACTAGATTnTGCAATTATTTAGTTCAATTTAAAGCTCAAAATCCCACATTAAATAGTTTCATAAATGAT,GAATOTrcTGGCAGTGGATTTCCGTTGTCCTTGGTAGTACTTTCTAATCTGGACAGCATTTATATTGTAACAATGATACGCTTAATGATGATCTTAGGATGAATTGGTTAGTTATGAAnTAGTTGTCCTTACAGTGCAACCJGGGAGGCTTGGCTGCATTTATTGTTGTAGCATTTAATTATGCATTGAACGCGGTCATTATTGTGATGATGGAAATATTTAATTGATGCAGgA4a4/L4rggJO^GCrA4A44CC4GL4Grr(7rG4C:C4CC4<7Zd7TgCC4ygCC14CroTATGTGTACTTATCAAATCTCAATTTCAATTCATACCCATATTTTAGTGATACTATCATAGTATACAAGTTGACTCCTmTCATnrCTGTATGTnTACACAG7TCggJCCC4C4/14Gv4A4G(G471C7Ta7GTOG^gC4C^4rCX4/lA4gggGrZ4^ACAATCTATAATAATAATAGTAGTAGTAATAATGGCTAGTTTATTATGCTAGAGTAGTTATTAGTTAAACCCCTGGAAAAACATTGATTAGGTTGGGnTCACTTAATGCTTTCCCTGTCTTTGGGCAAGGAATCTTCTTAACATAGTTATATACATATGGCATATACAAGGCACAAAGAGCTTTTAGCGTATAGGAAAA數(shù)據(jù)庫(kù)中的轉(zhuǎn)錄體/CDS(2493bp)(SEQIDNO:25)atgtcgttttccacgctaagagctcttgtttctgatcaaaataaggaattctctgattactctttgttttccatgctt幼t幼tgaagacccagctgagcatattaaagtgagctctttttatgaagttgatcactccaagctgcctcata幼tcccctgatcaactcaacaaaacccgggttgtgatggtgaatgaaaagaccaggatgagagtctcgctgaggtttccaagcatcaattctotaagatgttacttoaatgagattgaagctattaattacaag^aagacatgaaaacgaagaagcagcagctaccagcattcgacgagaaatacattataggatcagaagttgcaggggaagctotttataggagaatctcttctoaagaaatggcagacaagagttactcatggagtttctggatggttaaacatccttGggtttcacctcgaaaagtgtcatacccacGtacaagtactcatgttaataaatttgttggtgcaaggaaggtgtctotcatgtctgagctoaacgggacaggcatggttaagtggggtcagcgcGggcaggtcaggttottggctaaacacgtagaggataaacgtgaaatagtgattgcatcgaaggatttgattaaaagegaagaagagaaagacagtgatggtagtgatgatgacacagacgatgaggacgaggaggaggtcgatgttaagttagtagtaaacaagtcaagtgaagctaaaaggaaattacgtaagagaaagtgtcaaggtgggtctggtattagcaaattatcaccaaaa幼gaaaaggcgtaaaattgaaaagaagaaccagattgtggtctataggcaaaagaagaacaaactcatcaagaattotattgacagatggtctgcggggaggtataaattggctgaggaaaacatgttaaaggtaatgaaagagcaaaatgctgtgtttcgacgcccaattttaaggccagaattgagagctgaggcacggaagttgattggggatactgggctgttagaccacttgttgaagcatatgtcaggg幼ggtggctccgggaggagaagagagattcagaaggaggcataacgcagatggagcaatggagtattggctggagaaggGtgatttggttgatatcaggaaagaggctggtgtgcaggatcc誠(chéng)ggacacctccacctgggtggaaacctggtgataatcctagtc鄉(xiāng)atccagtttgtgctagagagatcaaggaactcagagaagaaattgctaaaattaaaggggagatggaggcaatggtgtctaaaaaacacggggaggaattagcaatggtggeagcaccgaattattctcctacaagtcaggacatggagcatgacaacttcttaattccactgaaggaaatgtacattgatttggtgaataagaaggtaaagatggaggaacaactaaaggaaatttcagaatctttgtatgggatgaaggaagaaatggagaagctaaaaaccagagtggagaaatcaaacagagcagaatc助ctgaaaagccagctttattaatgggctcaacagagtcaatcacgccagcaggaactggaagaaaggggaaaggagtaatgcatcaggaaaaagaagcaacggttttaggggaatcagcacaagaacaatgcaagtcatcatcaggaggcatoatagcaccaagaacagaatcaccagcaccaacggaggacagggcagca將gatagagaggctgaaaagcgggtttagaatatgcaagcccca鵬aagtttcctgtggccggatatgactaccttaacccctcaccctcaggttgtggtcctactagaagacctcattgcggtacaaacacctccctcagtgtcctccactacaccaaaacaatctcacttcctctttgctcctccatctcaaacccatacaccccaccgtactttccctgtgaagcca加gctgagagaaggcctgtcaccattccccaatccacagctgccaGgactccaaccagctgtcctccccttgatcaaatgactcactcccagtatgagaatagcageatttccacttotaGtaccatcaccaccactaccaaaacccctctcat咖ccttaatgagccactgaataccaatoaaactgatgattatggattgttttatgggtctcagtctcatgctgaagcctctcctcaccctgtcacttaccaaagaagacatcatcaaaatgtgaccaccagtattgccatgccaagtttgggacccaca幼gaaagggatgatgagccaatgggaggaaggtgatcggagaaaaggaatgataaggtactgtgagcagtgtgagcagcaacagggatgctoctotgcctcttccattgcatcttottccttgccaatgggaaaggggacttggttggctctggctacttctaaggcttccgtggagcaeaaatctaaaaggggttoa如數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)序列(830aa)(SEQIDNO:26)〉eugene3.00030791[Poptrl:554158]MSFSTLRALVSDQNKEFSDYSLFSMLNNEDPAEHIKVSSFYEVDHSKLPHKSPDQLNKTRWMVNEKTRMRVSLRFPSINSLRCYFNE正AINYKKDMKTKKQQLPAFDEKYIIGSEVAGEALYRRISSQEMADKSYSWSFWMVKHPSVSPRKVSYPPTSTHVNKFVGARKVSLMSELNGTGMVKWGQRRQVRFLAKHVEDKREIVIASKDLIKSEEEKDSDGSDDDTDDEDEEEVDVKLWNKSSEAKRKLRKRKCQGGSGISKLSPKKKRRKIEKKNQIVVYRQKKNKLIKNSIDRWSAGRYKLAEENMLKVMKEQNAWRRPILRPELRAEARKLIGDTGLLDHLLKHMSGKVAPGGEERFRRRHNADGAMEYWLEKADLVDIRKEAGVQDPYWTPPPGWKPGDNPSQDPVCAREIKELREEIAKDCGEMEAMVSKKHGEELAMVAAPNYSPTSQDMEHDNFLIPLKEMYIDLVNKKVKMEEQLKEISESLYGMKEEMEKLKTRVEKSNRAESTEKPALLMGSTESITPAGTGRKGKGVMHQEKEATVLGESAQEQCKSSSGGIIAPRTESPAPTEDRAAKIERLKSGFRICKPQGSFLWPDMTTLTPHPQWVLLEDLIAVQTPPSVSSTTPKQSHFLFAPPSQTHTPHRTFPVKPLAERRPVTIPQSTAATrPTSCPPLDQMTHSQYENSSISTSTTnTTTKTPLINLNEPLNTNQTDDYGLFYGSQSHAEASPHPVTYQRRHHQNVTTSIAMPSLGPTKKG畫(huà)SQWEEGDRRKGMIRYCEQCEQQQGCSSASSIASSSLPMGKGTWLALATSKASVEHKSKRG*實(shí)施例9:玉米ZW"多核苷酸和多肽的鑒定在網(wǎng)站(www.plantgdb.org)上用TBLASTN和水稻扁"蛋白(SEQIDNO:51)作為查詢序列搜索玉米基因組顯示推定的Z""基因存在于對(duì)應(yīng)重疊群ZmGSStucll-12-04.1016.l(SEQIDNO:52)和ZmGSStucll-12-04.1016.2(SEQIDNO:53)的玉米基因組區(qū)域內(nèi)。用GENSCAN(http:〃genes.mit.edu)結(jié)合手動(dòng)編輯注解該區(qū)域?qū)е麓_定了可以與水稻Zr^7多肽序列比對(duì)(圖12)的推定的玉米多肽序列。本發(fā)明包括使用所述玉米多肽序列和編碼所述多肽的多核苷酸序列。將從玉米獲得的多肽序列定位至通過(guò)下面的核苷酸坐標(biāo)顯示的重疊群核苷酸序列。還顯示了組裝的部分由所述重疊群序列編碼的ZmZW"多肽序列。ZmGSStucll-12-04.1016.1(SEQIDNO:52)坐標(biāo)和概念性翻譯5335ESKDGDPR..........GVKRYI4882;4724EQLLCK.........DYSSLK4662;4142EKYQRA....QVLCLK4080;3805DMCEN……EVSSFK3743;3605EKYEHI..…FLSFK3522;3413DQLWAL......GLTRRDV2865:2697DTSSS….,LATPSYC2563;玉米的組裝的多肽(SEQIDNO:54)ESKDGDPRHGKDRWSAERYAAAEKSLLNIMRSRDARFGAPVMRQVLREEARKHIGDTGLLDHLLKHMAGRVPEGSVHRFRRRHNADGAMEYWLEPAELAEVRKQAGVSDPYWVPPPGWKPGDDVSLVAGDELVKRQVEELTEEVNGVKRYTEQLLCKDDGDFGAERDYSSLKEKYQRAVRANEKLEKQVLCLKDMCENWQMNGELKKEVSSFKEKYEHIADKNDKL卿VTYLSSSFLSFKDQLVVALKLELAPSEAVPRTALFVASGEQMTGTVIQGGQDRAERKSSFRVCKPQGKFLLPSMASGMTIGRGASSTCPAAATPGPGIPRSTSFPSMPGLPRSSRGPVEVVAAASGLDEHVMFGAHFSTPPSASSTNDAAKLQLSLPSPRSPLQPQKLFDTVTAAASGFSPQKLMHFSGLTRRDVDTSSSSSGACGSGLLEGKRVLFDADAGGISAVGTELALATPSYCZmGSStucll-12-04.1016.2(SEQIDNO:53)坐標(biāo)和概念性翻譯774MSLFIS757;574KPQVKK......PTYHA418;315GAFYEID......SIRVVK237;144VSECTNT……SNHAAR1;玉米的組裝多肽(SEQIDNO:55)MSLFISKPQVKKYYFKKKTSSSHSRNGKDDVNHDSTIQPRSPLSRQSLTFDAIPTYHAGAFYEIDHDKLPPKSPIHLKSIRVVKVSECTNLDrrVKFPSLQALRSFFSSYPAPGTGPELDERFVMSSNHAAR實(shí)施例10:孤雌生殖的一般方法最佳輻射量的確定1.從與待使用的母本植林相同的種或近緣種的父本植林收集花藥并用劑量范圍包括l、5、10、20、30、50、70、100、150、200krad的電離輻射進(jìn)行輻射。2.給去雄的花或來(lái)自雌抹植物的雌花授粉，所述雌林植物因?yàn)閿y帶有一個(gè)或多個(gè)隱性表型標(biāo)記或者DNA標(biāo)記(微衛(wèi)星、CAPS或RAPD)方面與經(jīng)放射的花粉親本不同。對(duì)于每種劑量的電離輻射，優(yōu)選將10-50朵花用于授粉。3.收集授粉了的花的種子并合并來(lái)自用接受相同輻射量的花粉授粉的花的種子。4.讓種子萌芽并生長(zhǎng)成植林，這樣對(duì)于每一劑量的輻射產(chǎn)生了大約20-100林植林。5.關(guān)于表型標(biāo)記或DNA標(biāo)記對(duì)植林的基因型打分并計(jì)算出與母本相似的植抹的比例。6.選擇產(chǎn)生了高比例的有活力植林以及高比例的與母本相似的植抹這兩者的最佳組合的劑量。在d/ad突變植物中誘導(dǎo)孤雌生殖1.用使用如上描述確定的合適電離輻射劑量輻射的花粉給^rad突變體植林授粉。2.收集種子。3.使種子萌芽并生長(zhǎng)成植林。孤雌生殖植林的鑒定1.關(guān)于由母本攜帶的隱性表型標(biāo)記給植林打分。將顯示隱性表型的植林歸類為孤雌生殖植林。另外，可以通過(guò)從植物組織分離DM，之后分析DNA的多態(tài)性標(biāo)記來(lái)關(guān)于DNA標(biāo)記給植林打分。將顯示這樣的標(biāo)記模式的植林歸類為孤雌生殖植株，所述標(biāo)記模式表現(xiàn)母本的特征并且缺少父本的標(biāo)記帶。因而可以計(jì)算出來(lái)自授粉試驗(yàn)的孤雌發(fā)育的植林的比例。2.可以檢驗(yàn)孤雌生殖植林的對(duì)母本來(lái)說(shuō)是雜合的標(biāo)記。保留了對(duì)母本d7acr突變體親本來(lái)說(shuō)是雜合的所有標(biāo)記的雜合性的那些植林是無(wú)融合生殖的植林?？捎糜诓煌衩追N的可能的分子標(biāo)記的參考文獻(xiàn)在下面列出小麥www.gramene，org1.Torada等，(2006).SSR-basedlinkagemapwithnewmarkersusinganintraspecificpopulationofcommonwheat.TheorApplGenet.2006Apr;112(6):1042-51。2.Song等，(2005).Developmentandmappingofmicrosatel1ite(SSR)markersinwheat.TheorApplGenet.2005Feb;110(3):550-60。水稻www.gramene.org1.Harushima等，(1998).Ahigh-densUyricegeneticlinkagemapwith2275markers..."Genetics148:479-494。2.Causse等，(1994).Saturatedmolecularraapofthericegenomebasedonaninterspecificbackcrosspopulation.Genetics.1994Dec;138(4):1251-74。玉米Coe等，(2002)."Accesstothemaizegenome:anintegratedphysicalandgeneticmap".PlantPhysiol.128:9-12。www.gramene.org大麥www,gr詣en6,orgWenzl等，(2006).Ahigh-densityconsensusmapofbarleylinkingDArTmarkerstoSSR，RFLPandSTSlociandagriculturaltraits.BMCGenomics.2006Aug12;7(1):206。燕麥www,gramene.orgDeKoeyer等,(2004).Amolecular1inkagemapwithassociatedQTLsfromahullessxcoveredspringoatpopulation.TheorApplGenet.2004May;108(7):1285-98。珍珠粟www,gr詣ene,orgAnintegratedgeneticmapandanewsetofsimplesequencerepeatmarkersforpearlmillet,Pennisetumglaucum。TheorApplGenet.2004Nov;109(7):1485-93。高梁Chittenden等，(1994)."AdetailedRFLPmapofSorghumbicolor…"Theor.Appl.Genet.87:925-933。甘藍(lán)Bohuon等,(1998)."ComparisonofaBrassicaoleraceageneticmapwiththegenomeofArabidopsisthaliana".Genetics150:393-401。芥菜Pradhan等，(2003).Ahigh-densitylinkagemapinBrassicajuncea(Indianmustard)usingAFLPandRFLPmarkers.TheorApplGenet.2003Feb;106(4):607-14。油菜Piquemal等,(2005),Constructionofanoilseedrape(BrassicanapusL.)geneticmapwithSSRmarkers.TheorApplGenet.2005Nov;111(8):1514-23。蕪青Kole等，(1997).GeneticlinkagemapofaBrassicaraparecombinantinbredpopulation.J.Hered.88:553-557。棉花Rong等,(2004)."A3347-locusgeneticrecombinationmap..."Genetics166:389-417。番癡Zhang等，(2002).AmolecularlinkagemapoftomatodisplayingchromosomallocationsofresistancegeneanalogsbasedonaLycopersiconesculentumxLycopersiconhirsutumcross.Genome2002Feb;45(1):133-46。癡子Doganlar等，(2002)Acomparativegeneticlinkagemapofeggplant(Solanummelongena)anditsimplicationsforgenomeevolutioninthesolanaceae.Genetics161(4):1697-711。辣椒Genomemappingincapsicumandtheevolutionofgenomestructureinthesolanaceae.Genetics152(3):1183-202。馬鈴薯Tanksley等，(1992).Highdensitymolecularlinkagemapsofthetomatoandpotatogenomes.Genetics132(4):1141-1160。大豆Ferreira等，(2000).SoybeangeneticmapofRAPDmarkersassignedtoanexistingscaffoldRFLPmap.J.Hered.91(5):392-396。楊樹(shù)Yin等,(2001).PreliminaryinterspecificgeneticmapsofthepopulusgenomeconstructedfromRAPDmarkers.Genome2001Aug;44(4):602-9。Tuskan等，(2004).Characterizationofmicrosatel1itesrevealedbygenomicsequencingofPopulustrichocarpa.CanadianJ.ForestRes.34(1):85-93。用質(zhì)粒pBI101.3::DyadAGR轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株DH5ct的樣品已經(jīng)存放在了InternationalDepositoryAuthority、MicrobialTypeCultureCollectionandGeneBank(MTCC,InstituteofMicrobialTechnology(IMTECH)，CouncilofScientificandIndustrialResearch(CSIR)，Sector-39A，Chandigarh-160036，India)。該樣品于2006年12月1曰存放并且具有InternalReferenceNoBI507。包含至少2500粒《Md突變體(作為雄林)與野生型雌林植物的F2代雜種的種子并且d7ad突變體分離的樣品已經(jīng)由美國(guó)菌種保藏中心(Manassas，VA20108，USA)保藏。該樣品于2006年12月1日發(fā)送并且具有InternalReferenceNoISDYF2C。一種包含至少2500粒種子(源自品系no.33)的樣品已經(jīng)由美國(guó)菌種保藏中心(Manassas,VA20108,USA)保藏，所述種子對(duì)d/ai/和DyadAGR插入物來(lái)說(shuō)是純合的并且其響應(yīng)地塞米松表現(xiàn)為條件不育。該樣品于2006年12月1曰發(fā)送并且具有InternalReferenceNo.33-5DYGR。在這里引入了多篇科學(xué)期刊和專利文獻(xiàn)的文章。每篇這樣的文章由此以全文引用的方式并入本文并且通過(guò)這樣的引用來(lái)用于所有目的。權(quán)利要求1.一種植株，所述植株包含dyad等位基因純合的基因組并且在所述植株細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)條件性表達(dá)DYAD蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植林，其中所述植林變成條件性雌性能育。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植林，其中所述植林對(duì)所述植林產(chǎn)生的種子中保留母本雜合性來(lái)說(shuō)是條件性的。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植林，其中所述基因組包含至少一個(gè)拷貝的編碼與類固醇激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的蛋白的多核苷酸。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植林，其中所述類固醇激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是糖皮質(zhì)激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植林，其中所述tfyacT等位基因是這樣的等位基因，其中在氨基酸位置508-572處截短了的ZM"蛋白得以表達(dá)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的植林，其中所述^^d等位基因包含具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的多核苷酸，或具有在37匸的40%甲酰胺、1MNaCl、1MSDS的條件下與多核苷酸SEQIDN0:1、SEQIDNO:23或SEQIDN0:25的互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，或其等價(jià)序列。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植林，其中所述"M"蛋白是由含有SEQIDNO:4或SEQIDNO:17或SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的核苷酸序列的多核苷酸編碼，或由在371C的40%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS的條件下與SEQIDNO:1或SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸編碼，或由其等價(jià)序列編碼。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的植林，其中所述"MZ蛋白是由含有SEQIDNO:4或SEQIDNO:17或SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的核苷酸序列的多核苷酸編碼，或由在37X:的40%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS的條件下與SEQIDNO:1或SEQIDNO:23或SEQIDNO:25的互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸編碼，或由其等價(jià)序列編碼。10.—種用于產(chǎn)生保留有母本雜合性的種子的方法，所述方法包括i)用父本植林的花粉給d/ad純合的母本植林授粉，或者讓所述^a^純合的母本植抹自交；和ii)獲得所述經(jīng)授粉的母本植抹的種子。11.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述種子具有正常的大小或者大小皺縮。12.根據(jù)權(quán)利要求10所迷的方法，其中步驟i)中使用的所述花粉已經(jīng)受過(guò)輻射。13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中在步驟i)中使用的所述花粉是能育的并且步驟H)中獲得的所述種子是三倍體。14.一種獲得種子的方法，所述種子具有的胚基因組是^rsd等位基因純合的并且可提供這樣的植抹，在所述植林細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)條件性表達(dá)"W"蛋白，所述方法包括i)讓^rsd等位基因雜合或純合并且包含在細(xì)胞核內(nèi)條件性表達(dá)/M"蛋白的表達(dá)構(gòu)建體的第一植株自交，并且進(jìn)行選擇以獲得dj^d和所述表達(dá)構(gòu)建體純合的第二植林。ii)獲得所述第二植林的種子或所述第二植林的后代植林的種子并選擇大小正?；虬櫩s的那些種子。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第二植林在由所述第二植林產(chǎn)生的種子的胚中條件性保留母本雜合性。16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述第二植抹是條件性雌性不育的。17.—種用于獲得植抹的方法，所述植林是^rs^等位基因純合的并且在所述植林的細(xì)胞的細(xì)胞核中條件性表達(dá)"Wi蛋白，所述方法包括i)讓tf/acT等位基因雜合或純合并且包含在細(xì)胞核內(nèi)條件性表達(dá)zr^蛋白的表達(dá)構(gòu)建體的第一植林自交，并且進(jìn)行選擇以獲得crwi/和所述表達(dá)構(gòu)建體純合的第二植株。ii)將所述選擇的第二植林引入至所述"r力"蛋白在其下得以表達(dá)的條件。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第二植林條件性保留由所述T2植林產(chǎn)生的種子的胚中的母本雜合性。19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第二植林是條件性雌性不育的。20.所述權(quán)利要求1所述的植林的種子或組織。21.—種種子，所述種子通過(guò)權(quán)利要求10所述的方法獲得。22.—種三倍體種子，所述三倍體種子通過(guò)權(quán)利要求13所述的方法獲得。23.—種用于維持^Ka(/純合的植物系的方法，所述方法包括讓權(quán)利要求所述1的植林在足以表達(dá)所述"W"蛋白的條件下繁殖。24.—種用于維持fZ/ac/純合的植物系的方法，所述方法包括讓權(quán)利要求4所述的植林在足以表達(dá)所述"WZ7蛋白的條件下繁殖。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述條件包括施用類固醇激素給所述植株。26.—種用于獲得含有一個(gè)拷貝的在細(xì)胞核中條件性表達(dá)的Z7M/基因的植林的方法，所述方法包括i)讓含有在所述植林的細(xì)胞核內(nèi)條件性表達(dá)ZM"蛋白的表達(dá)構(gòu)建體的第一植林自交，或者讓兩林所述第一植林雜交以獲得第二植林，并且選擇表現(xiàn)具有縮短的長(zhǎng)角果或皺縮的果實(shí)或減小的結(jié)實(shí)率的第二植林，ii)將所述選擇的第二植林引入至所述""/蛋白在其下表達(dá)的條件。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述第一植林對(duì)"M/來(lái)說(shuō)是野生型的，是^Fad雜合或^rad純合的。28.—種用于獲得在所述植林細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)條件性表達(dá)野生型"M/蛋白的植林的方法，所述方法包括用含有在所述植林細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)條件性表達(dá)野生型"r^蛋白的構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化植林細(xì)胞。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述植林是^FS^純合的植林。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述植林是(/yaf/雜合的植抹o31.—種植抹，所述植林對(duì)在所述植株的細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)提供條件性表達(dá)野生型ZW/蛋白的構(gòu)建體是純合的。32.—種表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體賦予了/a/基因在植林細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)的條件性表達(dá)。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的構(gòu)建體，其中所述植林細(xì)胞是大孢子母細(xì)胞。34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的構(gòu)建體，其中所述"M"基因與類固醇激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的構(gòu)建體，其中所述類固醇激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域是糖皮質(zhì)激素受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。全文摘要本發(fā)明涉及DYAD基因、其突變體以及它們用于產(chǎn)生保留了母本植株的雜合性的植株的用途。本發(fā)明還包括組成性或條件性地具有dyad表型并因而維持了母本雜合性的植株、植株組織和植株種子。本發(fā)明可用于以無(wú)融合生殖的植株的方式遺傳所需的雜種表型以及可用于增加植株基因型的倍性，基因型的倍性的增加可以產(chǎn)生生物量增加的植株。文檔編號(hào)C07K14/415GK101379080SQ200680052139公開(kāi)日2009年3月4日申請(qǐng)日期2006年12月8日優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日發(fā)明者I·斯蒂吉,M·P·A·馬里木圖,R·馬魯塔沙拉姆申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究會(huì)